DE943717C

DE943717C - Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines Antibiotikums

Info

Publication number: DE943717C
Application number: DEP12079A
Authority: DE
Inventors: Fred Wilbur Tanner Jun; John Edward Lynch; John Broderick Routien; Ben Arthur Sobin
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1953-06-05
Filing date: 1954-06-04
Publication date: 1956-06-01
Also published as: US2691618A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines neuen wertvollen Antibiotikums, genannt Anisomycin (Warenzeichen Flagecidin), durch Gärung, auf Verfahren zu seiner Gewinnung und Konzentrierung aus rohen Lösungen, wie vergorene Nährungslösungen, und auf Verfahren zu seiner Reinigung. Das neue Antibiotikum ist zur Bekämpfung pathogener Mikroorganismen, insbesondere zur Bekämpfung von Fungi und Protozoen, besonders brauchbar.

Dieses neue Antibiotikum wird während des unter bestimmten geregelten Bedingungen erfolgenden

Wachstums eines neuen Stammes einer als Streptomyces griseolus bekannten Art oder eines neuen Stammes einer anderen als Streptomyces roseochromogenus bekannten Art von Mikroorganismen gebildet. Diese Mikroorganismen Tvurden identifiziert, indem man Kulturen von ihnen .auf die gewöhnlich für solche Identifizierungen verwendeten Medien impfte, dort untersuchte und die Kennzeichen der Kulturen mit denen verglich, die in Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, O.Auflage' (1948), beschrieben wurden. Dieser neue Stamm des S.grise-

olus wurde mit der Bezeichnung Isolat Nr. 14576-4 in die Kulturensammlung der Chas. Pfizer & Co,, Inc. of Brooklyn, N. Y., eingereiht. Eine Kultur davon wurde in der »American Type Culture Collection, Washington, D. C«, als ATTC 11796 aufgenommen.

Der neue Stamm des S.xoseochromogenus wurde mit der Bezeichnung Isolat Nr. 15855-4 bezeichnet.

Die Kennzeichen der Kulturen dieser beiden

Mikroorganismen, die Herstellung des neuen Anti-

biotikums aus ihnen und die Eigenschaften dieses neuen Antibiotikums werden- nachfolgend näher 65 beschrieben. Die Kennzeichen der Kultur des neuen Stammes des S. griseolus sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Wenn nichts anderes erwähnt, beruhen die Ergebnisse auf Versuchen mit sechs gleichen Proben, die 2 Wochen lang bebrütet wurden. 70 Bei Angabe von R beziehen sich die Farben auf Ridgway, »Color Standards and Nomenclature«.

Tabelle I Streptomyces griseolus ATTC 11796

Medium

Wachstum

Luftmycel und Sporenbildung lösliches Pigment

Bemerkungen

Glukoseaspargin-Agar

Gelatine

Magermilch
Glukose-Agar

Nähr-Agar
Calciummalat-Agar
Synthetischer Agar

Emersons-Agar

Zellulose

Dextrosenitratnährlösungen

Kartoffelscheiben

Stärke-Agar

mäßig

gut

schwach

schwach bis mäßig

schwach

mäßig

keines
mäßig

gut
mäßig

Sporenbildung mäßig, fast Benzo-Braun (R)

Kolonien sahnig, weiß wachsartig; keine Sporenbildung, kein Luftmycel

sahnigweißer Ring

weißes, in die Luft gerichtetes Mycel; keine Sporenbildung

dünnes, flaches weißes Luftmycel

weißes Luftmycel, keine Sporenbildung

geringe Sporenbildung, nahezu helles Mausgrau (R)

mäßige Sporenbildung, nahezu Mausgrau (R)

Sporenbildung dunkler als Mausgrau (R)

Sporenbildung fast Benzobraun (R) keine

keine

Korallenrot (R)
Rotbraun

sehr helles Braun

keine

Hellbraun

Mittel- bis
Dunkelbraun

keine

sahnigweiße Rückseite: Sporen grampositiv, Ausmaße 1 bis 1,3 (1,3) X 0,65 (1,0) X i,3 μ; in Spiralen

Verflüssigung mäßig

keine Koagulation;
Hydrolyse; p_H-Wert wechselnd von 6,4 bis 6,9

Rückseite Mittelbraun

Rückseite Sahnigweiß

Calcium-malat digeriert, Rückseite Sahnigweiß _log

Rückseite Sahnigweiß bis leicht Grau

Rückseite Hellbraun

keine Reduktion von Nitraten

gelbes Wachstum unter der Oberfläche, Rückseite Hellbraun, schmale _lao Hydrolysezone

, Der neue Stamm des S, griseolus unterscheidet sich von den beschriebenen Stämmen in verschiedenen Punkten, die in der nachfolgenden Tabelle aufgezählt 135 sind.

Tabelle II

Medium

S. griseolus ATTC 11796 Bergeys Beschreibung

Gelatine

Synthetischer Agar

Glukose-Agar
^1£" Lackmusmilch

Dextrosenitratnährlösungen

Kolonien sahnig, weiß, wachsartig (in Petrischalen)

geringe Sporenbildung, nahezu Mausgrau (R), Wachstum schwäch

gutes Wachstum, weißes Luftmycel, keine Sporenbildung

(auf entrahmter Milch bei 28°) mäßiges Wachstum, sahnigweißer Ring; korallenrotes (R) lösliches Pigment; keine Koagulation; Hydrolyse, p_H wird alkalisch

Keine Reduktion zu Nitriten gelbliche, flockige Häutchen und Sedimente (in Gelatine-Stichkulturen)

Luftmycel zuerst grau, wurde später blaßneutralgrau; farbloses, dünnes Wachstum, Oberflächenwachstum fast ganz auf das Luftmycel
beschränkt

sich ausbreitendes Wachstum; Mitte erhöht, sahnefarben, wurde dunkel

reichliches Wachstum, rotes Häutchen; koaguliert; peptonisiert; wird alkalisch

Nitrite erzeugt

TabeUe III Streptomyces roseochromogenus Reinkultur Nr. 15855-4

Medium.

Wachstum

Farbe

Luftmycel und Sporenbildung lösliches Pigment

Bemerkungen

Glukoseasparginplatten

mäßig

weißes Luftmycel; gelb-wachsartig um den Rand der Kolonie; Sporenbildung nahezu Hellweinrot bis Rehfarben (»Pale Vinaceous Fawn«, R) keine

Gelatineplatten
Magermilch

Glukose-Agar

Nähr-Agar

gut

schwach bis
mäßig

mäßig

schwach bis
mäßig

weißes Luftmycel

hellgelber bis mittelbrauner Ring

Hellbraun, wachsartig; weißes Luftmycel am oberen Ende des Schrägnährbodens; keine Sporenbildung

Hellbraun; wachsartig Dunkelbraun

heller als Haselnußbraun
(» Avellaneous «,

Mittelbraun

Hell- bis Mittelbraun

Kolonie leicht erhöht, Oberfläche faltig;
Rückseite zwischen Aprikosengelb (R) und Cadmiumgelb (R), Spiralen vorhanden; Sporenellipsoid grampositiv, 0,66 bis 0,95 (0,95) X 0,95 bis 1,3 (1,3) μ. Kolonien auf Verdünnungsplatten wechselten von Hellweinrot bis Rehfarben (R) nach Rotbraun bis Weinrot (»Russet
Vinaceoustf, R), Sporenbildung bei örtlicher Hau- ^uo fung, bis zu Hellbraun ohne Sporenbildung

gute Verflüssigung

keine Koagulation, keine ^X15 Hydrolyse; Änderung des p_H-Wertes von 6,5 auf 6,9

Rückseite Hellbraun ₁₂₀

Rückseite Hellbraun

Tabelle III
Streptomyces roseochromogenus Reinkultur Nr. 15855-4

5	Medium	20	Stärkeplatten	30	Wachstum	Farbe	lösliches Pigment	Bemerkungen
Synthetischer Agar 10				schwach	Luftmycel und Sporenbildung	keine	Rückseite nahezu farblos
	25 Dextrosenitrat			Sporenbildung nahezu
Calciummalat	nährlösung	schwach	XvU LUl φ. UIJL UIb Weinrot (R)	keine	Rückseite nahezu farblos
	Emersonscher Agar-		Sporenbildung nahezu
ig Zellulosestreifen	Nährboden	keine	Rehfarben (R)
Kartoffelscheiben		mäßig		Hellbraun
		weißes bis hellgraues
		Luftmycel; Sporen
		bildung Hellweinrot-
	rehfarben (R) bis
	Rotbraunweinfarben
schwach	(R)	keine	schwache bis mäßige
	Sahnigweiß, wachsartig,		Hydrolyse
mäßig	keine Sporenbildung		keine Reduktion zu
			Nitriten
mäßig			Rückseite Hellbraun
	Hellbraun, wachsartig;
	Sporenbildung Wein
	rotrehfarben (R) bis
	Hellweinrotrehfarben
(R)

Die vorstehend genannten Kennzeichen stimmen fast völhg mit der in »Bergeys Manual« gegebenen Beschreibung des Streptomyces roseochromogenus überein.

Es ist zwar bekannt, daß ein anderer Stamm des S. roseochromogenus das Antibiotikum Roseomycin erzeugt; es wurde jedoch klar festgestellt, daß das Antibiotikum Anisomycin von dem Roseomycin verschieden ist, wie sich aus den nachfolgenden Daten ergibt.

Selbstverständlich ist die Erfindung zur Herstellung von Anisomycin nicht auf die vorgenannten oder auf solche Organismen beschränkt, die der vorstehenden nur zum Zwecke der Erläuterung gegebenen Beschreibung entsprechen. Es ist sogar erwünscht und beabsichtigt, Mutanten zu verwenden, die aus den vorstehend beschriebenen Organismen auf verschiedene Weise, z. B. durch Röntgen- oder U.V.Bestrahlung, Stickstofflost u. dgl., erzeugt werden. Das Antibiotikum Anisomycin ist gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen wirksam; wie bereits erwähnt wurde, ist es jedoch gegen pathogene Protozoen und Fungi besonders wirksam. Die folgende Tabelle erläutert das antibiotische Spektrum des Anisomycins durch Versuche, die mit einer Anzahl derartiger Fungi ausgeführt wurden. Diese Versuche wurden durchgeführt, indem man Nährböden, die verschiedene Konzentrationen des reinen Antibiotikums enthielten,

mit dem jeweils angegebenen Mikroorganismus infizierte und die Konzentration feststellte, bei denen Wachstum oder nicht auftrat. Das Antibiotikum wurde in Konzentrationen von 1, 10, 50, 100, 500 und 1000 y/cm³ angewandt. Die Versuche erfolgten unter Normalbedingungen.

Tabelle	IV	S. griseolus)	kein Wachstum	10s
		100
		100
(a) Spektrum von Anisomycin Pathogene Fungi		100
(Anisomycin von		IO	110
		⁶JOO
Organismus		500
			115
Microsporum canis
Microsporum audouini
Histoplasma capsulatum. .·..
Cryptococcus neoformans ...
Trichophyton		120
Phialophora verrucosa
Blastomyces dermatiditis ...
Sporotrichum schenkii
Trichophyton violaceum....	Konzentration
Hormodendron compactum .	Anisomycin y/cm³
Blastomyces brasüiensis	Wachstum
IO
IO
IO
I
100
100
>5oo
>5oo
>5oo
>5oo
>5oo

(b) Spektrum von Anisomycin Pathogene Fungi (Anisomycin von S. roseochromogenus)

Organismus

M. canis

M. audouini

H. capsulatum ...
Crypt. neoformans

T. sulfureum

Ph. verrucosa .

B. dermatiditis ...

Sp, schenkii

T. violaceum ,

H. compactum

B. brasiliensis

Konzentration Anisomycin. y/cm³ kein

Wachstum

50 TW

IO

50 TW

IO 100 100 100 100 106 100

Wachstum

100

50

100 IO

50

500

iooo

IOOO IOOO IOOO

(TW bedeutet teilweise Wachstumshemmung.)

Die pilzhemmende Wirksamkeit des Antibiotikums Anisomycin wird weiter in Tabelle V erläutert, die die niedrigste Konzentration des Antibiotikums zeigt, bei der kein Wachstum der verschiedenen Stämme von Candida albicans mehr erfolgte. Diese Konzentration wird als die »geringste wachstumshemmende Konzentration« in y/cm³ ausgedrückt. Es wurde ein Normalverfahren angewandt, das dem vorstehend für die Werte der Tabelle IV beschriebenen Verfahren ähnlich war. Die pilzhemmende Wirksamkeit des Anisomycins wurde am menschlichen Körper noch nicht gezeigt.

Tabelle V

(a) Spektrum des Anisomycin gegen Candida Albicans (Anisomycin von S. grisoleus)

Candida Albicans
Stamm Nr.

II

13

Geringste wachstumshindernde

Konzentration des Anisomycins

y/cm³

3,12 TW 6,25 TW

3,12

12,5

(b) Spektrum des Anisomycins gegen Candida Albicans (Anisomycin von S. roseochromogenus)

Candida Albicans
Stamm Nr.

II

13

Geringste wachstumshindernde

Konzentration des Anisomycins

y/cm³

3,12

6,25

3,12

6,25

(TW bedeutet teilweise Wachstumshemmung.)

Die antiprotozoische Wirksamkeit des Antibiotikums Anisomycin wurde untersucht, indem man Reagenzgläser, die verschiedene Konzentrationen des Antibiotikums enthielten, mit typischen pathogenen Protozoen, Trichomonas vaginalis und Endamoeba histolytica, impfte und den Grad der Beweglichkeit und/oder des Wachstums der Mikroorganismen nach 48stündiger Bebrütung beobachtete. Zum Vergleich wurden die gleichen Versuche mit dem Antibiotikum Fumagillin durchgeführt, das für seine antiprotozoische Wirksamkeit bekannt ist. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle VI zusammengestellt, g₀ in der die Werte für die Wirksamkeit gegen Trichomonas auf Grund der Bewegungsfähigkeit und des Wachstums angegeben sind; beobachtet auf Objektträgern nach Bebrütung in Reagenzgläsern mit den angegebenen Konzentrationen. Bei der Bewertung der Wirksamkeit gegen Trichomonas bedeutet die Zahl 4+ eine vollständige Hemmwirkung des untersuchten Antibiotikums, d. h. es war weder Beweglichkeit noch Wachstum der Mikroorganismen mehr feststellbar; 3+ bedeutet eine deutliche Wirksamkeit des Antibiotikums oder nur geringe Beweglichkeit und/oder Wachstum; 2+ bedeutet mäßige, 1+ geringe und »—« gar keine Wirksamkeit. Die Wirksamkeit gegen Endamoeben wurde durch Vergleich der Anzahl von Zellen in den zur Kontrolle dienenden Reagenzgläsern mit derjenigen Zellenzahl in den Reagenzgläsern festgestellt, die das Antibiotikum in den angegebenen Konzentrationen enthielten, wobei den Gläsern die Bewertung »-\-<c für vollständige Hemmwirkung und »—« für Unwirksamkeit gegeben wurde.

TabeUe VI.
(a) Wirksamkeit des Anisomycins (von S. griseolus) gegen Protozoen

Antibiotikum

Anisomycin
Anisomycin
Fumagillin*)
Fumagillin

Protozoa

Trichomonas Endamoeba Trichomonas Endamoeba

Wirksamkeit bei Konzentrationen von
7,8y/cm³ I 3,9 y/cm³ I i,o.y/cm³

3 +

2 +

*) Unterhalb von 15,6 y/cm³ wurde keine Wirksamkeit beobachtet.

(b) Wirksamkeit des Anisomycins (von S. roseochromogenus) gegen Protozoen

Antibiotikum

Anisomycm
Anisomycin

Protozoa

Trichomonas Endamoeba Wirksamkeit bei Konzentrationen von 7,8y/cm³ I 3,o.y/cin³ I i,o,y/cni³

Aus der obigen Tabelle ergibt sich, daß das Antibiotikum Anisomycin gegen Trichomonas und Endamoeba hochwirksam ist. Weiterhin. zeigen die Ergebnisse, daß es gegen diese Organismen viel wirkig samer ist als FumagiUin.

Gegen saprophytische Mycobakterien wurde kerne Wirksamkeit des Antibiotikums ■ Anisomycin festgestellt, wenn Konzentrationen des Antibiotikums bis zu ioo y/cm³ auf ihre Wirksamkeit gegen die Arten _ao M. ranae, phlei, smegmatis, Nr. 607, berolinense und butyricum untersucht wurden. Gegen verschiedene grampositive und gramnegative Mikroorganismen wurde nur eine geringe Wirksamkeit festgestellt.

Es zeigte sich andererseits im Tierversuch, daß das Antibiotikum Anisomycin verhältnismäßig wenig giftig ist. Gibt man es Mäusen intravenös als wäßrige Lösung, dann beträgt der LD₀-WeIt etwa 2 mg/20 g Maus.

Nach der Erfindung entsteht das neue Antibiotikum Anisomycin während des Wachstums der Mikroorganismen S. griseolus ATTC 11796 oder S. roseochromogenus Nr. 15855-4 in wäßrigem Nährmedium bei etwa 24 bis 30° und unter submersen Bedingungen unter Rühren und Belüftung. Nährmedien, die für diese Verfahren geeignet sind, enthalten unter anderem Kohlehydrate, wie Zucker, Stärke, Glycerin oder Maismehl, und eine Quelle organischen Stickstoffs, wie Kasein, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Weizengluten, BaumwoUsamenmehl, Kaktalbumin, enzymatische Kaseinabbauprodukt'e, Trypton. Auch eine Quelle von Wuchsstoffen, wie lösliche Destillationsrüekstände, Hefeextrakt, Gärungsrückstände von Melasse, sowie Mineralsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Natriumnitrat, Magnesiumsulfat, und Spurenelemente, "wie Kupfer, Zink und Eisen, können vorteilhaft zugefügt werden.

Gegen übermäßiges Schäumen während der Gärung kann man Schaumverhütungsmittel, z. B. Pflanzenöle, zugeben. Der p_H-Wert der Gärlösung bleibt im allgemeinen ziemlich unverändert; wenn jedoch Schwankungen auftreten, kann man dem Medium auch ein Puffermittel, wie Calciumcarbonat, zusetzen.

Den Impfstoff für die Erzeugung des Antibiotikums Anisomycin durch das Wachstum von S. griseolus oder S. roseochromogenus kann man durch Züchtung von Vorkulturen auf Schrägnährböden aus Emersonschem Agar oder Rindfleisch-Laktose erhalten. Diese Vorkulturen können dazu dienen, um entweder Schüttelkolben oder Impfbehälter für submerses Wachstum damit zu impfen, oder aber die Impfbehälter können aus den Schüttelkolben geimpft werden. Das Wachstum der Mikroorganismen erreicht seinen Höhepunkt gewöhnlich innerhalb von 2 oder

4+ 3+

4 +

3 Tagen. Änderungen der verwendeten Anlage, der Belüftungs- und Rührgeschwindigkeit usw. können die Zeitdauer beeinflussen, innerhalb deren die höchste Wirksamkeit erreicht wird. Im allgemeinen wird die Gärung so lange fortgesetzt, bis das Medium eine erhebliche antibiotische Wirksamkeit erlangt hat; 24 Stunden bis zu 4 Tagen sind hierfür meist ausreichend. Das Medium wird in den Behältern für submerses Wachstum mit einer Geschwindigkeit von etwa ¹Z₂ bis zu 2 Raumteilen Luft je Raumteil Gärlösung der Minute belüftet. Zum Rühren kann man Rührvorrichtungen bekannter Art benutzen, die den Gärungsfachleuten im allgemeinen bekannt sind. Selbstverständlich müssen während der Übertragung des Impfstoffs und ' während des Wachstums der Mikroorganismen aseptische Bedingungen eingehalten werden.

Nach dem Wachstum der Mikroorganismen kann das im allgemeinen üppig wuchernde und feine Mycel durch verschiedene übliche Geräte, wie Filterpressen, Zentrifugen usw., von der Gärlösung abgetrennt werden. Danach gewinnt' man das Antibiotikum aus der Gärlösung auf verschiedene Weise, oder aber man verwendet die ganze Lösung wie sie ist oder trocknet sie. Das Antibiotikum kann auf verschiedene Weise weitergereinigt werden; die Verbindung kann beispielsweise aus der wäßrigen Lösung bei neutralen oder leicht alkalischen p_H-Werten, vorzugsweise bei p_H-Werten zwischen etwa 6 und etwa 10, mit vielen wasserunmischbaren organischen Lösungsmitteln, einschließlich Äthem, aromatischen Kohlenwasserstoffen, Estern, Ketonen, niederen Alkoholen, halogenierten Kohlenwasserstoffen und ■ deren Mischungen ausgezogen werden. Beispiele solcher Lösungsmittel sind Diäthyläther, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon, Butanol und Chloroform. Man kann das Antibiotikum aus den meisten Lösungs- no mittellösungen danach wieder in angesäuertes Wasser, vorzugsweise solches mit einem p_H-Wert unter etwa 2,5, zurückextrahieren. Gegebenenfalls kann der Lösungsmittelauszug vor der Rückextraktion in das angesäuerte Wasser eingeengt werden.

Durch Einstellung des p_H-Wertes auf den Neutralpunkt oder einen alkalischen Wert kann man das Antibiotikum dann wieder in eines der vorstehend angegebenen Lösungsmittel zurückextrahieren. Nach Trocknung des Lösungsmittels und Konzentrieren iao der Lösung kristallisiert das Antibiotikum in langen weißen Nadeln aus. Es kann durch Abkühlung seiner heißen Lösung in Butanol, Äthylacetat, Benzol oder Äthylendichlorid umkristallisiert werden. Andere geeignete Verfahren zur Gewinnung sind die Ab-sorption auf Holzkohle mit anschließendem Aus-

waschen, Behandlung mit Ionenaustauscherharzen und die chromatographische Entwicklung auf Tonerdesäulen.

Das Antibiotikum Anisomycin ist eine basische, weiße organische Verbindung, die in verdünnten wäßrigen Säuren gut, in Wasser aber nur mäßig löslich ist. Sie ist ferner gut löslich in einer Anzahl von organischen Lösungsmitteln, wie Methylalkohol, Aceton, Dioxan und Chloroform, unlöslich dagegen

ίο in Hexan, Cyclohexan, Tetrachlorkohlenstoff und Äther. Die Verbindung bleibt bei Zimmertemperatur mehrere Stunden lang in einem weiten Bereich von p_H-Werten beständig, bei Erhitzung in saurer Lösung ist sie jedoch ziemlich unbeständig. In trockenem Zustand oder gelöst in wasserfreien Lösungsmitteln ist sie dagegen beständig. Die kristalline antibiotische Base schmilzt bei etwa 140 bis 141⁰ und weist im ultravioletten Bereich drei Maxima bei 224, 277 und 283,5 πιμ ^auf (3»34 rog in 25 cm³ Methanol gelöst).

Wenn es in Chloroform aufgelöst wird, zeigt das Antibiotikum eine Anzahl bezeichnender Maxima im infraroten Bereich, deren wichtigste bei den folgenden Frequenzen (in reziproken Zentimetern) liegen: 3545, 3450, 3320, 2890, 2800, 1725, 1610, 1582, 1515, 1470, 1447, 1380, 1320, 1302,. 1242, 1178, 1036 und 962. Das Infrarotspektrum ist des näheren aus den Zeichnungen zu ersehen, von denen Fig. 1 das Spektrum bei Frequenzen zwischen 5000 und 1100 cm-¹ und Fig. ia (i°/_oige Lösung) von 1100 bis 625 cm-¹ zeigt.

Die in Methanol gelöste Base zeigte nach der Einstellung des Gleichgewichts eine Drehung von Mf= — 3°°· In Chloroform gelöst (c, 1 %) beträgt die optische Drehung [α] f = —· 45° 30'.
Eine Probe des Anisomycins aus S. griseolus wurde nach Umkristallisation aus Äthylacetet 3 Stunden lang bei 56⁰ ohne Gewichtsverlust getrocknet. Das getrocknete kristalline Antibiotikum wurde dann analysiert und bestand, wie gefunden wurde, aus den folgenden Elementen in den angegebenen Gewichts-Verhältnissen:

Kohlenstoff., 63,55%

Wasserstoff 7,27 %

Stickstoff 5,20 %

Sauerstoff (als Differenz) 23,98%

Das Molekulargewicht des aus S. roseochromogenus gewonnenen Antibiotikums Anisomycin wurde nach dem Siedeverfahren (ebullioskopisches Verfahren) festgestellt und betrug 276. Eine aus Äthylacetat umkristallisierte Probe dieses Anisomycins wurde 3 Stunden lang bei 56⁰ ohne Gewichtsverlust getrocknet. Das getrocknete kristalline Antibiotikum wurde dann analysiert und bestand aus den folgenden Elementen in den angegebenen Gewichtsverhältnissen: 55

Kohlenstoff 63,51 %

Wasserstoff 7,21 %

Stickstoff 5,22%

Sauerstoff (als Differenz) 24,06 %

Die vorstehenden Analysen entsprechen der wahrscheinlichen empirischen Formel C₁₄Hj₉NO₄ für die Antibiotikumbase.

Das Antibiotikum Anisomycin unterscheidet sich deutlich von anderen Antibioticis durch seine vorstehend beschriebenen Eigenschaften und durch sein Verhalten bei der Papierchromatographie. Brauchbare Salze des Antibiotikums kann man nach bekannten Verfahren herstellen, so durch Behandlung der Base in wäßriger Lösung oder unter wasserfreien Bedingungen mit der erforderlichen Säure. Das Hydrochlorid ist z. B. erhältlich, indem man die Base in Aceton löst und Chlorwasserstoffgas in die Lösung leitet. Andere Säuren, z. B. Schwefel- oder Phosphorsäure, können in gleicher Weise mit der Base zu den entsprechenden Salzen des Antibiotikums umgesetzt werden.

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die jedoch nicht die Erfindung einschränken sollen.

Beispiel 1

Ein Nährmedium wurde aus den folgenden Zusätzen auf 11 Wasser hergestellt.

Glukose (»Cerelose«) 10 g ^8s

Maisstärke 10 g

Hydrolysiertes Kasein (»N-Z Amin B<?) 5 g
Lösliche Melasse-Destillationsrückstände (Curbay BG) 5 g

Sojabohnenmehl 15 g

Natriumchlorid ig

Nach Einstellung der Mischung auf einen p_H-Wert bis 7 mit Kalilauge wurde 1 g Calciumcarbonat zugesetzt und 30 bis 45 Minuten lang zur Sterilisation Dampf durch die Mischung geblasen. Eine auf einem Schrägnährboden gezüchtete Kultur des neuen Stammes des S. griseolus wurde in 100 cm³ dieses Mediums gegeben, das sich in einem 3oo-cm³-Erlenmeyerkolben befand, und damit 45 Stunden lang geschüttelt bis ein gutes Wachstum entstand. Der Impfstoff für eine größere Gärung wurde hergestellt, indem man dem Inhalt des vorgenannten Kolbens 11 des gleichen Mediums in einem 3-l-Kolben unter aseptischen Bedingungen zusetzte und diesen Kolben 48 Stunden lang schüttelte.

190 1 Nährmedium wurden auf die oben beschriebene Weise bereitet, sterilisiert und mit dem so hergestellten Impfstoff geimpft. Die Mikroorganismen wurden dann 3 Tage lang unter submersen Bedingungen mit Belüftung und Rühren gezüchtet. Die Gärbrühe wurde mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen p_H-Wert von etwa 2 eingestellt und zur Entfernung des Mycels mit Supercel filtriert. Danach wurde die Gärlösung mit konzentrierter Natronlauge auf einen p_H-Wert von 9 eingestellt und zweimal mit je 57 1 Chloroform ausgezogen.

Die vereinigten Chloroformauszüge wurden eingeengt und mit Wasser ausgezogen, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf p_H 2 eingestellt worden war. Danach wurde die angesäuerte wäßrige Lösung konzentriert und mit Natronlauge wieder auf den p_H-Wert 9 eingestellt. Das Antibiotikum wurde nun erneut mit Chloroform extrahiert, das danach auf ein Volumen von etwa 50 cm³ eingedampft wurde. Nach dem Zusatz des gleichen Volumens Cyclohexan und

weiterer Eindampfung kristallisierte das rohe Antibiotikum aus und konnte durch Filtration gewonnen werden. Das rohe Antibiotikum wurde durch Auflösen in Äthylacetat, Behandlung der erhaltenen Lösung mit Aktivkohle und Eindampfen der Lösung in dem Äthylacetat bis zur Bildung langer weißer Kristalle des Antibiotikums Anisomycin gereinigt.

Beispiel 2

Eine Kultur des S. roseochromogenus auf Emersonschem Agar wurde unter genau geregelten Bedingungen gezüchtet, um Sporen für die Impfung eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung zu erhalten:

Glukose (»Cerelose«) io g

Sojabohnenmehl io g

Natriumchlorid 5 g

Lösliche Destillationsrückstände

(»Curbay BG«) 5 g

Maisstärke io g

Diese Nährflüssigkeit wurde mit Wasser auf 11 verdünnt, mit Kalilauge auf p_H 7 eingestellt, mit 0,1% Calciumcarbonat als Puffermittel versetzt und in der Hitze sterilisiert. Das Medium wurde dann abgekühlt, worauf man die Sporen unter aseptischen Bedingungen zufügte. Die Mikroorganismen wurden in Kolben unter Schütteln bei etwa 28⁰ 2 Tage lang gezüchtet.

Das so erhaltene. Gemisch aus Gärlösung und Mycel wurde zum Impfen von 57 1 eines sterilen Gärungsmediums benutzt, das etwa die gleiche Zusammensetzung wie oben angegeben hatte, und die Mischung wurde unter sterilen Bedingungen 2 Tage lang bei etwa 28° gerührt und belüftet. Danach wurde das Mycel nach Zusatz von Supercel durch Filtration entfernt, und die Gärlösung wurde im Vakuum auf ein Volumen von 11,4 1 eingeengt. Dieses Konzentrat wurde mehrfach mit Äthylacetat ausgezogen. Die vereinigten Lösungsmittelphasen, die zusammen etwa 57 1 ausmachten, wurden im Vakuum auf 1500 ecm eingeengt und fünfmal mit je 100 cm³ 0,1 n-Salzsäure geschüttelt. Die das Antibiotikum enthaltende saure Lösung wurde mit Natronlauge auf p_H 9 gebracht und dann zehnmal mit je 250 cm³ Äther extrahiert. Der Äther wurde in Vakuum entfernt und das Wasser durch azeotrope Destillation mit Benzol. Beim Konzentrieren der zu destillierenden Flüssigkeit durch Austreibung des Benzols kristallisierte das Antibiotikum, aus und wurde durch Filtration gewonnen. Es wurde dann durch Auflösen in heißem Äthylacetat und anschließende Behandlung mit Aktivkohle und Kühlung der erhaltenen Lösung umkristallisiert. Das in Form langer weißer Nadeln erhaltene kristalline Produkt wurde aus Filter gebracht, getrocknet und nach dem oben angegebenen Verfahren untersucht. Es erwies sich als hochwirksam gegen pathogene Protozoen und Fungi.

Das auf diese Weise hergestellte Antibiotikum ist identisch mit dem nach dem Verfahren des Beispiels 1 beschriebenen Produkt, wie sich durch die Infrarot- und Ultraviolettabsorptionsspektren durch papierchromatographische Untersuchung und durch Bestimmung des Mischschmelzpunktes ergab. Dies wurde auch durch das Mikrobenspektrum und andere physikalische und chemische Daten bestätigt, die man bei Versuchen mit den von den obenerwähnten S. roseochromogenus- und S. griseolus-Stämmen erzeugten Produkten erhielt. Geringe Unterschiede in den vorstehend angegebenen Versuchsdaten liegen innerhalb der Grenzen experimenteller Meßfehler und sprechen in keiner Weise gegen die Indentität.

Man kann auch auf die Abwandlung und Äquivalente zurückgreifen, die in den Rahmen der vorliegenden Erfindung und unter die nachfolgenden Ansprüche fallen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung von Anisomycin, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Streptomyces griseolus ATTC 11 796 oder den Mikroorganismus Streptomyces roseochromogenus Nr. 15855-4 in einem wäßrigen Nährmedium unter 'submersen aeroben Bedingungen züchtet, worauf das neue Antibiotikum aus der Gärlösung gewonnen und gegebenenfalls mit Säuren zu den entsprechenden Salzen umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen bei Temperaturen zwischen etwa 24 und 30⁰ innerhalb etwa ι bis 4 Tagen züchtet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärlösung filtriert und das Antibiotikum mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bei neutralen bis alkalischen p_H-Werten extrahiert wird.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

609 510 5.