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Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines Antibiotikums Die vorliegende
Erfindung bezieht sich auf ein neues wertvolles Antibiotikum, das die Bezeichnung
P. A. 105 trägt, und insbesondere auf seine Herstellung durch Gärung, auf
Verfahren zu seiner Gewinnung und Konzentration aus rohen Lösungen, z. B. aus Gärbrühen,
auf Verfahren zu seiner Reinigung und zur Herstellung seiner Salze. Die Erfindung
umfaßt einerseits die verdünnten Formen, wie rohe Konzentrate, und andererseits
die reinen kristallinen Formen des Antibiotikums. Diese neuartigen Produkte sind
besonders vorteilhaft für die Bekämpfung krankheitserregender, besonders grampositiver
Mikroorganismen.
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Das neue Antibiotikum bildet sich beim Züchten unter bestimmten Bedingungen
eines neuen Stanuns einer als Streptomyces antibioticus bekannten Mikroorganismenart.
Dieser Stamm wurde in einer Kultur auf einer für die Identifizierung solcher Mikroorganismen
gewöhnlich' benutzten Nährlösung festgestellt. Eine Kultur dieses Mikroorganismus
wurde in der »American Type Culture Collection« in Washington D. C. (Amerika)
unter der Bezeichnung ATCC 11891 hinterlegt. Die Identifizierung dieses neuen Stammes,
der in der Sammlung des Anmelders als Jsolat Nr. 15j84-I« bezeichnet wurde, wurde
an Hand des »Manual of Determinative Bacteriology« von Bergey, 6. Auflage
(1948), vorgenommen.
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Die Merkmale der Kulturen des neuen Stammes des Streptomyces antibioticus
sind in der folgenden Tabelle
zusammengestellt. Wenn nichts anderes
angegeben ist, beruhen die Versuchsergebnisse aüf sechs Wiederholungsversuchen,
die :z Wochenlang bebrütet worden waren. Die mit R bezeichneten Farbbezeichnungen
entsprechen der von Ridgway in »Color Standards and Nomenclature« angegebenen Farbangaben.
| Tabelle I |
| Streptomyces antibioticus |
| ATCC 11891 |
| arbe |
| Nährlösung Wachstums- Bemerkungen |
| stärke Myzelbildung an der Luft LösHches |
| und Sporenbildung Pigment |
| Glukose-Asparagin Agar mäßig weißes Luft-Myzel, mittelbraunbis
Rückseite braun, |
| geringe Sporen- dunkelbraun Konidienfäden in |
| bild.ung Büscheln; keine |
| Spiralen; Sporen |
| o,65 x I /.t |
| Gelatine ............. mäßig Grau, wachsartiges (Junkelbraun
gute Verflüssigung |
| Myzel; keine Sporen- |
| bildung |
| Entrahmte Milch (z8') mäßig sahneartiger weißer dunkelbraun
keine Koagulation; |
| Ring Hydrolyse, keine |
| Änderung des |
| p]I-Wertes |
| Glukose-Agar ......... mäßig- hellbraun, wachsartiges
hellbrann Rückseite hellbraun |
| durchs ichtiges Bak- |
| terienwachstum, |
| keine Sporenbildung |
| Calciummalat.... .... genng bis weißes Luft-Myzel; keines
Rückseite sahneartig |
| mäßig geringe Sporenbil- weiß, digeriertes |
| dung, gräulich-weiß- Calciummalat |
| Synthetisches Agar .... gering mausgraue (R) keines
Rückseite weiß bis |
| Sporenbildung hellgrau |
| Nähr-Agar ........... ; gering hellbraun, wachsartiges
mittelbraun Rückseite hellbra-un |
| durchsichtiges Bakte- |
| rienwachstum |
| Emersons Agar ....... gering bis hellgrau bis gelb,
wachs- dunkelbraun Rückseite hellbraun |
| mäßig artiges runzliges |
| Myzel; keine Sporen- |
| bildung |
| Cellulose, ............. gering weiß, Luft-Myzel hellbraun
- |
| Traubenzucker-Nitrat- |
| brühe ....... ...... gering keines Nitrate wurden nicht |
| reduziert |
| Kartoffelscheiben ...... mäßig Fast dämmergran (R),
dunkelbraun |
| Sporenbildung bis schwarz |
| Stärkeplättchen ....... gering gelb bis braun, wachs-
keines Rückseite dunkelgelb |
| artiges Bakterien- bis, grau; keine Hy- |
| wachstum; Sporen- drolyse |
| bildung, beinahe |
| Hathigrau (R) |
Einige der kennzeichnenden Unterschiede zwischen dem neuen Stamm Nr. 15 784-1 und
der Beschreibung des
S. autibioticus in Bergeys »Manual« sind in Tabelle
11 zusammengestellt.
Tabelle II Nährlösung Stamm ATCC
11
891 Beschreibung nach Bergey Gelatine
............. graues, wachsartiges
Myzel; keine dunkelbraunes Bakterienwachstuni auf der Sporen Oberfläche, mit Flecken
aus grauem Luft-Myzel Lackmus-Milch
....... (in entrahmter Milch, kein Lack-
'dicker, bräunlicher Ring auf der Milchobermus); sahneartiger bis dunkel- fläche;
mausgraues Luft-Myzel mit grünbrauner Ring; Koagulation und licher Färbung, die
wachsenden Kulturen Hydrolyse werden braun; keine Koagulation der Milch; keine Klärung
Alle Nährlösungen, die organische Stoffe enthalten
............. lösliches
hellbraunes bis dunkel- lösliches tiefbraunes Pigment braunes Pigment Der Stamm
des im »Manual« von B erg ey beschriebenen
S. antibiotieus liefert das Antibiotikum
»Aktinomycin«, das, wie aus den folgenden Angaben hervorgeht, von dem Antibiotikum
»P.
A. io5« eindeutig verschieden ist.
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Die sich auf die Herstellung von P. A. 105 beziehende vorliegende
Erfindung ist nicht auf die Verwendung dieses besonderen Mikroorganismus beschränkt,
noch auf solche Organismen, die der obigen Beschreibung entsprechen, da diese hier
nur zur Erläuterung dienen soll. Tatsächlich umfaßt die Erfindung auch die Verwendung
von biologischen Varianten, die sich von dem beschriebenen Organismus auf verschiedene
Weise, so z. B. durch Einwirkung von Röntgenstrahlen, ultravioletten Strahlen, Stickstofflost
u. dgl., herleiten können.
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Das Antibiotikum P. A. 105 ist hochwirksam gegenüber einer
großen Anzahl von Mikroorganismen. Wie bereits erwähnt, ist seine Wirksamkeit gegen
grampositive Organismen besonders hervorzuheben. Gegen gramnegative Organismen ist
es zwar auch wirksam, jedoch in etwas geringerem Maße. Die folgende Tabelle zeigt
das antibiotische Spektrum von P. A. io5 gegenüber verschiedenen gramnegativen
und grampositiven Mikroorganismen. Die Versuche hierüber wurden durchgeführt, indem
man Nährlösungen, die verschiedene Konzentrationen des reinen Antibiotikums enthielten,
mit der jeweiligen Bakterienart impfte.
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Die in Tabelle III angegebene, gerade noch eine Hemmwirkung ausübende
niedrigste Konzentration ist diejenige niedrigste Konzentration des Antibiotikums
(in y/cm3), bei der das Wachstum der Mikroorganismen gerade noch verhindert wurde.
Da die höchste für diesen Versuch angewandte Konzentration ioo y/cm2 betrug, ist
dort, wo die Konzentration offenbar iooy/ccm überstieg, für die »gerade noch Hemmwirkung
ausübende geringste Konzentration« kein genauer Wert angegeben. Die Versuche wurden
unter normalen Bedingungen durchgeführt.
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Tabelle IV bringt die Ergebnisse ähnlicher in einem anderen Laboratorium
durchgeführter Versuche mit verschiedenen weiteren Organismen oder Stämmen, die
sich von den in Tabelle III genannten unterscheiden, und zeigt ferner das Spektrum
von P.
A. 105.
| Tabelle III |
| Spektrum des P. A. 105 |
| Gerade noch Hemmwirkung |
| Organismus ausübende niedrigste |
| gramnegative Organismen Konzentration an P.
A. io,5 |
| V/Ccm |
| Brucella bronchiseptica .... 25 |
| A. aerogenes 2 ........... > 100 |
| E. coli 21 ................ > 100 |
| Proteus Sp. i ............ > 100 |
| Ps. aeruginosa 173 ........ > 100 |
| SahnoneRa Typhosa 344 - - - > 100 |
| K. pneumoniae 132 ....... > 100 |
| S. paratyphia A 134 ...... > 100 |
| B 139 ...... > 100 |
| Listeria monocytogenes ... 3,12 |
| Neisseria gonorrheae ...... 6,25 |
| catarrhalis ....... 3J2 |
| meningitidis ..... 6,25 |
| grampositive Organismen |
| Strep. faecalis igi ........ 1,56 |
| Micrococcus pyogenes |
| var. aureus 5 ........... o,ig |
| --og ......... <o,ig |
| M. pyogenes var. albus 3 - - o,78 |
| B. subtilis 2ig ........... 0,39 |
| Diplococcus pneumoniae, |
| Type I ................ 6,?,5 |
| Type I, ATCC .......... <O,-ig |
| TypeIII ............... 3J2 |
| Type V -. . . r# s 3J2 |
| Erysioelothrix u 10- |
| pathiae, 15 A .......... 0,3 |
| E-i ............ 0,7 |
| G-2 ........... 0,7 |
| G-3 ........... 0,5 |
| Comybacterium xerose 6,25 |
| Clostridium perfringens ... |
| sporogenes .... 1,5 |
| tetani ........ 1,5 |
| Bacillus anthracis ........ 0,7 |
| Pilze |
| Candida albicans 8 ........ >IOO |
Bei diesen Versuchen betrug die Höchstkonzentration des Antibiotikums
goo y/ccm.
| Tabelle IV |
| Spektrum. von P. A. 105, weitere Akroorganismen |
| Gerade noch Hemmwirkung |
| Organismus ausübende niedrigste |
| gramnegative Organismen Konzentration an P,
A* io5 |
| .Y/c- |
| E. coli .................. 225 |
| E. coli .................. 450 |
| E. typhosa .............. 225 |
| Salmonella sp . ........... 450 |
| Aerobacter aerogenes ..... 225 |
| S. paratyphosa ........... >goo |
| Klebsiella pneumoniae ..... 225 |
| Bracella bronchisepticus ... 7 |
| B. pyocyaneus ......... ; . >goo |
| NA II SM Resist .......... 112 |
| NA IV S. typhosa ........ 112 |
| E. typhi-murium ......... 225 |
| S. typhi-murium .......... 225 |
| S. newport ............... 450 |
| S. enteritidis ............. 225 |
| S. cholera suis ............. 225 |
| Proteus vulgaris .......... goo |
| Gerade noch Hemmwirkung |
| Organismus ausübende niedrigste |
| grampositive Organismen Konzentration an P.
A. io5 |
| Y/Ccm |
| Strep. hemo . ............. <I,7 |
| D. pneumoniae ........... <I,7 |
| Staph, h ................. <I,7 |
| B. subtilis ................ <I '7 |
| Enterococcus ............ <I,-7 |
| Cl. welchii ............... 7 |
| Staph. aureus 235 ........ <1,7 |
| Pilze |
| Monilia albicans .......... >goo |
Das neue Antibiotikum erwies sich auch als hochwirksam gegen solche Organismen,
die gegenüber den üblichen im Handel erhältlichen An#i#ioticis widerstandsfähig
waren. Zum Beispiel wurden zur Ermittlung der gerade noch eine Henunwirkung ausübenden
geringsten Konzentration gewisse aus klinischen Fällen isolierte widerstandsfähige
Stämme von Micrococcus pyogenes, Abart aureus, in der angegebenen Weise der Wirkung
des Antibiütü<#ums P.
A. io5 ausgesetzt. Zum Vergleich wurde die gerade
noch eine Hen:unwirkung ausübende geringste Konzentration mehrerer anderer bekannter
Antibiotika ebenfalls ermittelt. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle V angegeben.
| Tabelle V |
| Benutztes'Antibiotikum |
| Gerade noch Hemmwirkung ausübende geringste Konzentration in
y/'Ccm. |
| M. Pyogenes Oxytetra- Chlortetra- Chlor- Baci- |
| var. aureus P. A. io5 cyclin* cyclin amphenicol
tracin Neomycin Penicillin Polymycin |
| Stamm |
| 1 0,78 > ioo ioo 6,25 56 3,12 6o,o > 250 |
| 2 3J2 > Ioo 56 6,25 28 3J2 15,0 > 250 |
| 3 456 > ioo 50 6,25 28 1,56 7,5 > 250 |
| 4 1,56 > WO 100 12,5 14 25,00 60,0 > 250 |
| 5 1,56 > ioo 50 6,25 14 1,56 15,0 > 250 |
| 6 3,12 > WO 50 12,5 28 50,00 7,50 > 250 |
| 7 0,78 > ioo iooTH 6,25 28 0,78 6o,o
> Z50 |
| 8 1,56 > ioo ioo 6,25 14 1,56 3,75 > 250 |
| 9 0,78 > 100 5oTH IM 56 1,56 > 60,0 > 7.50 |
| io 0,78 > ioo > ioo 6,25 14 3J2 6o,o > 250 |
| II o,78 0,78 0,39 3,i2TH 28 6,o
3,75 > 250 |
| 12 0,78 > ioo > ioo 6,25 14 < o,78
> 6o,o > 250 |
| 13 0,78 > 100 50 6,25 28 3J2 0,47 > 250 |
| 14 0,78 > ioo > 100 6,25 14 < 0,78 6o,o
> 250 |
| 15 1,56 > ioo iooTH IM 7 < 0,78 0,93 > 250 |
| 16 1,56 > ioo 50 6,--5 56 < o,78 15,0 > 250 |
| 17 0,78 > ioo ioo 3,12 28 3,12 6o,o
> 250 |
| 18 0,78 > ioo ioo 3,i2TH 14- IM 6o,o > 250 |
| TH Teilweise Hemmung |
| *) Wird im Handel unter der Bezeichnung »Terramycin«
geführt |
Abgesehen davon, daß diese Versuche die gute Wirksamkeit des neuen
Antibiotikums gegen diese widerstandsfähigen Stämme erkennen lassen, zeigen sie
auch, daß das Antibiotikum P.
A. 105 sich tatsächlich von Oxytetracyclin,
Chlortetracyclin, Chloramphenicol, Bacitracin, Neomycin, Penicillin und Polymycin
nachweisbar unterscheidet.
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Wie ferner aus Tabelle VI zu ersehen ist, die die Ergebnisse von mit
Mycobakterien unternommenen Versuchen wiedergibt, erwies sich das Antibiotikum P.
A. 105 auch als wirksam gegen eine Anzahl dieser Bakterien. Als Versuchsnährboden
wurden in diesem Fall Reagenzgläser mit flüssiger Dubos-Nährlösung verwendet. Das
Antibiotikum wurde der Nährlösung in den in der ersten Spalte der Tabelle angegebenen
Konzentrationsstufen zugegeben. Die solche Konzentrationen des Antibiotikums enthaltenden
Gläser mit der Nährlösung wurden dann mit Kulturen der verschiedenen genannten Mycobakterien
geimpft, deren Benennung am Kopfe jeder Spalte der Tabelle angegeben ist. Der Versuch
ging dami so vor sich, daß die Gläser bei sterilen Bedingungen 36 Stunden
lang bebrütet und darauf zum Nachweis der erfolgten oder nicht erfolgten von Mycobakterie-n-Entwicklung
beobachtet wurden. Das Ausbleiben des Bakterienwachstums in den Gläsern am Ende
der Versuchszeit ist durch das Zeichen (-), die erfolgte Entwicklung durch das Zeichen
(+) angegeben.
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Im Tierversuch erwies sich das Antibiotikum P.
A. io5 als verhältnismäßig
wenig giftig. Wurde das Antibiotikum z. B. in Wasser gelöst Mäusen intravenös gegeben,
dann betrug der LD,-Wert etwa
| Tabelle VI |
| Wirksamkeit von P. A. 105 gegen Mycobakterien |
| v/CCM ranae phlei smeg- 607 |
| matis |
| 25,0 - |
| 12,5 |
| 6,25 |
| 3,12 |
| 1,56 |
| 0,78 + + + + |
| 0,39 + + + + |
| o,ig + + + 4. |
15 mg/20
9 Maus. Bei andersartiger Verabreichung verhält sich das
Mittel ähnlich.
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Das Antibiotikum P.
A. io5 zeigte schließlich auch einen hohen
Wirkungsgrad in vivo gegen verschiedene krankheitserregende Organismen. Mäuse von
etwa gleichem Gewicht wurden intraperitoneal mit gewissen Stämmen der Strept. haeniolyticus,
D. pneumoniae und M. pyogenes var. aureus infiziert und 21/, Tage lang durch
täglich zweimalige subkutane Injektionen von je
5 mg Antibiotikum behandelt.
Die Wirksamkeit des Antibiotikums P.
A. :io5 gegen diese Bakterien ist bei
den so behandelten Mäusen aus Tabelle VII klar zu erkennen, die das prozentuale
Verhältnis der -überlebenden behandelten und unbehandelten Mäuse vergleicht.
| Tabelle VII |
| Wirksamkeit des Antibiotikums P. A, 105 in vivo |
| Organismus Tier Behandelt un- Überlebend, 0/0-Satz, nach |
| behandelt 48 Std. 1 96 Std. 7 Tage |
| Strept. haem. C 203 Mv ..... Behandelt
ioo 100 100 |
| Unbehandelt 0 0 0 |
| D. pneumoniae 1/230 ...... Behandelt
ioo ioo 100 |
| Unbehandelt 0 0 0 |
| M. pyogenes var. aureus |
| No. 235 ................. Behandelt ioo 100 100 |
| Unbehandelt 20 20 20 |
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Züchtung des Mikroorganismus
S. antibioticus, wobei man vorzugsweise mit wäßrigen Nährlösungen bei etwa
24 bis
30' unter submersem Rühren und Belüftung arbeitet. Die für das Verfahren
geeigneten Nährlösungen sollen Kohlehydrate, wie Zucker, Stärke, Glycerin, Maismehl
usw., eine Quelle für organischen Stickstoff, wie Kasein, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl,
Weizenkleber, Baumwollsamenmehl, Milchalbumin, enzymatisch aufgelöstes Kasein, Trypton,
eine Quelle für Wuchsstoffe, wie lösliche Destillationsrückstände, Hefeextrakte,
Melassegärungsschlempe usw., sowie Mineralsalze, wie Natrium chlorid, Kaliumphosphat,
Natriumnitrat, Magnesiumsulfat usw., und Spurenmetalle, wie Kupfer, Zink und Eisen,
enthalten. Schäumen die Nährmedien während der Gärung zu sehr, dann kann man der
Gärlösung noch Schaumverhütungsmittel, z. B. Pflanzenöle, zufügen. Der p,1-Wert
der Gärung bleibt meist ziemlich unverändert; falls jedoch Veränderungen auftreten,
kann man der Nährlösung ein Puffersalz zugeben, z. B. Caleiumcarbonat.
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Der Impfstoff zur Herstellung des Antibiotikums P. A. 105 durch
Züchtung des S. antibioticus kann auf
Nährlösungen wie Emersons
Agar oder Rinderlactose in Kulturen auf schrägen Nährböden erhalten werden. Zwecks
Entwicklung submerser Kulturen,kann man entweder Schüttelkolben oder größere Behälter
mit dieser Vorkultur impfen, oder man verteilt die Kultur aus dem Schüttelkolben
später in dem großen Behälter. Das Wachstum des AÜkroorganismus, erreicht gewöhnlich,
in 2 bis 3 Tagen seinen Höhepunkt. jedoch können Änderungen der benutzten
Geräte- in der Rühr-und Belüftungsgeschwindigkeit usw. die Schnelligkeit beeinflussen,
mit der die höchste Wirksamkeit erreicht wird. Im allgemeinen werden zur Herstellung
des Antibiotikums etwa 24 Stunden bis 4 Tage benötigt. Die Belüftungsgeschwindigkeit
der Nährlösung in für submerse Kultur eingerichteten größeren Behältern wird auf
etwa % bis 2 Raumteile freier Luft je Raumteil Flüssigkeit in der
Minute gehalten. Zum Rühren können die in der Gärungsindustrie allgemein üblichen
Vorrichtungen benutzt werden. 'Natürlich müssen während der Übertragung des Impfstoffes
und der Kulturen des lvtkroorganismus durchweg aseptische Bediiigungen herrschen.
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Nach dem Wachstum des -#Mikroorganismus kann
man das
Myzel, das im allgemeinen recht üppig und kräftig ist, von der Gärbrühe mit
verschiedenen gebräuchlichen Geräten, wie Filterpressen, Zentrifugen usw., abtrennen.
Das Antibiotikum P. A. 1:05 kann dann auf verschiedene Weise aus der Gärbrühe
gewonnen werden. Man kann aber auch die Brühe so wie sie ist, als Ganzes in getrocknetem
Zustand verwenden. Ebenso kann man das Antibiotikum auf verschiedene Weise weiter
reinigen, z. B. kann man die Verbindung aus der wäßrigen Lösung bei neutralen oder
leicht alkalischen, vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa io liegenden p_H-Werten
mit einer Reihe verschiedener mit Wasser nicht inischbarer organischer Lösungsmittel,
zu denen -die Äther, aromatische Kohlenwasserstoffe, Ester, Ketone, niedere Alkohole
und Halogenkohlenwasserstoffe gehören, extrahieren. Hierzu gehören Diäthyläther,
Benzol, Tolüol, Äthylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon, Butanol und Chloroform.
Selbst bei sauren pn-Werten läßt sich mit einigen dieser Lösungsmittel eine- gewisse
Menge des Antibiotikums ausziehen. Dies gilt besonders für' die mit Wasser nicht
mischbaren Alkohole, wie Bütanol, die Pentanole usw. Das Antibiotikum kann aus den
meisten Lösungsmitteln mit angesäuertem Wasser wieder zurückextrahiert werden, und
zwar vorzugsweise bei pE,-Werten unter etwa 2,5.
Zweckmäßig konzentriert man
jedoch den Lösungsmittelauszug vor der Rückextraktion mit dem angesäuerten Wasser.
Durch Einstellung des pE[-Werts auf neutrale oderalkalische Reaktion kann das Antibiotikum
dann nochmals in eines der obengenannten Lösungsmittel iurückextrahiert werden.
Nach Trocknung und Konzentration der so erhaltenen Lösung kristallisidirt# das Antibiotikum
in langen weißen. Nadeln `aus# 'Es kann durch Abkühlen einer damite hergestellten'
Lösung - in heißem Äthylacetat, Chloroform, # Methylenchlorid oder Äthylenchlorid
umkristallisiert werden. Weitere für den Fachmann naheliegende Gewinnungsv#erfahren
sind. die Absorp-Uon an, Aktivkohle mitrdarauffolgendem Auswaschen, dk# Behandlung
mit Ionenaustauscher-Harzen und die chromatographische Entwicklung aus Tofierdesäulen.
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Das Antibiotikum P. A. io5 ist eine basische, weiße amorphe
organische Verbindung, die in verdünnten wäßrigen Säuren löslich und in Wasser mäßig
löslich ist. In einer Reihe organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Aceton
und Butanol, ist es sehr leicht löslich. Es ist unlöslich in Hexan, Tetrachlorkohlenstoff
und Di-n-butyläther. Eine wäßrige Lösung der Verbindung ist bei Zimmertemperatur
innerhalb eines weiten p.II-Bereichs mehrere Stunden lang beständig. Beim Erhitzen
in saurer Lösung zersetzt es, sich jedoch vollständig. In trockenem Zustand oder
in wasserfreien Lösungsmitteln gelöst ist es dagegen beständig. Der Schmelzpunkt
des kristallinen wasserfreien Hydrochlorids des Antibiotikums liegt bei etwa 12,5
bis 128'. Im ultravioletten Bereich zeigt sein Absorptionsspektrum eine breite Spitze
geringer Intensität bei etwa 286 bis 289 my (io mg in io ccm Methanol).
Wird die Base des Antibiotikums in Chloroform gelöst, dann zeigt sie im Infrarot
eine Anzahl charakteristischer Absorptionsspitzen, von denen die bemerkenswertesten
Frequenzen folgende sind (in rezipro'ken Zentimetern): 3510, 2gio, 28go, 2840,
2590, 1710, 1615, i46o, 1385, 1335, 1305, 1280, 1190, 1160, 1145, 1110, 1075,
1050,
ioo5, 985, 96o, 935, 895, 885 und 86o. Das wasserfreie
Hydrochlorid zeigt auch, wenn es, in einem Kaliumbromidkügelchen suspendiert ist,
eine Reihe von charakteristischen Spitzen i ' m Ultrarot mit folgenden wichtigeren-
Frequenzen. j38o, 2930, 288o, i-7io, 1640, 1465, 138o, 1330, 1250,
1190, 116o, 1115, 1075, 1055, 1010, 1000, 985, 935, 865 und
828. Das Infrarotspektrum wird in den Zeichnungen genauer dargestellt. Das
in Methanol gelöste Hydrochlorid (o, i "/,) hat eine optische Drehung von [a] 15
= - 8o'. D
Das durch die ebullioskopische Bestimmung festgestellte
Molekulargewicht der Base des Antibiotikums P. A. 105 betrug etwa 715.
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Eine Probe des aus Äthylacetat umkristallisierten kristallihen Hydrochlorids
des P. A. 105 wurde bei ioo' 18 Stunden getrocknet, wonach ein Gewichtsverlust
von 5 % festzustellen war. Der getrocknete Stoff wurde analysiert und enthielt
die folgenden Elemente in den angegebenen Gewichtsverhältnissen: Kohle ..........................
57,63% Wasserstoff .................... 8,73 "/,) Stickstoff .............
- w ...... -. I,87% Chlor (ionisch) .................. 4,3004
Sauerstoff (als Rest) ............. 27,4704
Dies entspricht der wahrscheinlichen
empirischen Formel C 3, H67 N 0". - H Cl. für das wasserfreie
Hydrochlorid. Das Hydrochlorid kommt auch in verschiedenen hydratisierten Formen
vor, z. B. als Dihydrat entsprechend der wahrscheinlichen Formel C171-117N0"
- HCI - 2 H,0.
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Das Antibiotikum P. A. 105 unterscheidet sich, wie aus den
- oben beschriebenen Eigenschaften und auf Grund von papierchromatographischen
Messungen hervorgeht, durch diese seine - Eigenschaften eindeutig von -anderen
Antibiotika. Für äie Anwendung geeignete
Salze des Antibiotikums
können nach in der Technik üblichen Verfahren, z. B. durch Behandlung der Base mit
der entsprechenden Säure in. wäßriger Lösung oder unter wasserfreien Bedingungen
hergestellt werden. Zum Beispiel kann man das Chlorhydrat durch Auflösen der Base
in Aceton und Einleiten von Chlorwasserstoff in die Lösung herstellen. Andere Säuren,
wie Schwefel- und Phosphorsäuren, ergeben die entsprechenden sauren Salze des Antibiotikurns.
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Durch die folgenden Beispiele soll die Erfindung weiter veranschaulicht,
jedoch nicht eingeschränkt werden, Beispiel I AufeinerSchrägkulturdesS.antibioticusATCC1189i
wurden unter genau geregelten Bedingungen auf Emerson-Agar Sporen entwickelt, mit
denen eiKe Nährlösung der folgenden Zusammensetzung geimpft wurde: Dextrosehydrat
..................... io
g
Sojabohnenmehl
...................
io
g
Natriumchlorid
.................... 59
Lösliche Destillationsrückstände
...... 59
Calciumcarbonat
.................... i g
Das Nährlösungsgemisch
wurde mit Wasser auf 1
1 verdünnt, mit Calciumhydroxyd auf einen pH-Wert von
7 eingestellt, und durch Hitze sterilisiert. Darauf wurde die Nährlösung
gekühlt und mit den Sporen unter aseptischen Bedingungen versetzt. Der Organismus
wurde nun bei etwa
25' in Schüttelkolben 2 Tage lang gezüchtet. Das entstehende
Gemisch aus Brühe und Myzel wurde dann in eine sterile Nährlösung gegeben, die das
Zwanzigfache des Rauminhalts des ersten Gemisches aufwies und die folgende Zusammensetzung
besaß:
| Dextrosehydrat ................ io g/Liter |
| Natriumchlorid ............... 5g - |
| Gärrest aus der Alkoholgewinnung |
| durch Getreidegärung ........ 5g - |
| Maisstärke ................... iog - |
| Sojabohnenmehl .............. iog - |
Diese Nährlösung wurde erst mit Calciumhydroxyd auf einen pl,-Wert von
7 eingestellt, mit i
g Calciumcarbonat je Liter versetzt und dann
in der üblichen Weise sterilisiert, worauf die Brühe und das Myzel aus dem Schüttelkolben
zugegeben wurden. Nachdem die letzteren in der neuen Nährlösung verteilt worden
waren, wurde das Gemisch gerührt und unter sterilen Bedingungen
3 Tage belüftet.
Hierauf betrug die Konzentration des Antibiotikums in der Brühe 70,y/ccm. Das Myzel
wurde durch Filtration entfernt und zweimal mit
je 1/, seines Volumens Methylisobutylketon
ausgezogen. Die vereinigten Lösungsmittelphasen wurden im Vakuum auf
1/"
ihres Volumens eingeengt. Das Antibiotikum wurde dann daraus mit Wasser extrahiert,
das mit Schwefelsäure auf einen pu-Wert von etwa
2, eingestellt worden war.
Die wäßrige Phase wurde abgeschieden, mit Benzol zwecks Entfernung des Methylisobutylketons
gewaschen und auf einen p11-Wert von
6,5 eingestellt. Darauf wurde das Antibiotikum
mehrere Male mit Äth-ir ausgezogen, und der erhaltene Auszug wurde über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet. Beim Abdestillieren des Äthers blieb das Antibiotikum
in Gestalt langer weißer Nadeln zurück; es wurde schließlich noch aus heißem Äthylacetat
umkristallisiert. Das so erhaltene umkristallisierte Produkt erwies sich, wie in
den oben beschriebenen Versuchen angegeben, als hoch wirksam gegenüber einer Anzahl
verschiedener Mycobakterien und grampositiver Mikroorganismen. Beispiel II Eine
andere Gärnährlösung wurde aus den folgenden Stoffen hergestellt:
| Sojabohnenmehl ................... 15 g |
| Dextrosehydrat .................... 2o9 |
| Maisstärke ......................... io 9 |
| Natriumehlorid .................... 5 g |
| Lösliche Destillationsrückstände ...... 5 g |
| Enzymatisches Proteinhydrolysat .... 59 |
Nach Zugabe dieser Stoffe zu 1
1 Wasser wurde der PH-Wert der entstehenden
Mischung mit Calciumhydroxyd auf
7 bis
7,-- eingestellt.
5 g Calciumcarbonat wurden zugefügt, um während der Gärung als Puffer zu
dienen. Die Nährlösung wurde nun im Autoklav behandelt und unter sterilen Bedingungen
mit
S. antibioticus-Impfstoff, der nach dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren
hergestellt worden war, bestreut. Nachdem die geimpfte Nährlösung 2 Tage lang unter
sterilen Bedingungen bei etwa
28' belüftet und gerührt worden war, enthielt
die filtrierte Brüht- iooy Antibiotikum P.
A. 105 auf i ccm Lösung.
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Natürlich sind von dieser Arbeitsweise noch Ab-
wandlungen möglich,
die dem Geist der Erfindung entsprechen und in den Bereich des beifolgenden Anspruchs
fallen.