DE1262194B - Verfahren zur Herstellung von Lycopin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C12d

Deutsche Kl.: 6 b-16/03

Nummer: 1262194

Aktenzeichen: R 40642IV a/6 b

Anmeldetag: 14. Mai 1965

Auslegetag: 7. März 1968

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Erzeugung von Lycopin durch Fermentation.

Es ist bekannt, Lycopin aus verschiedenen pflanzlichen oder mikrowellen Quellen zu erhalten, doch ist auf Grund der in diesen verschiedenen Quellen angetroffenen geringen Gehalte und des Vorhandenseins zahlreicher anderer Carotinoide die Extraktion und Reinigung des Lycopins stets schwierig.

Es ist auch bekannt, daß die Submerszüchtung ίο von gewissen Mikroorganismen die Herstellung beträchtlicher Mengen an Carotinoiden erlaubt. Insbesondere ist es möglich, /3-Carotin mit ausgezeichneten Ausbeuten durch Submersfermentation von Mikroorganismen des Genus Choanephora oder Blakeslea zu erhalten. In verschiedenen Veröffentlichungen sind die Bedingungen beschrieben, die die Produktion von /J-Carotin begünstigen. B a r η e 11 und Mitarbeiter (Science, 1956, Bd. 123, S. 141) haben gezeigt, daß die Produktion von /i-Carotin durch gleichzeitige Züchtung von entgegengesetzten Formen ein und derselben Species verbessert wird. Diese Untersuchung wurde dann auf die Züchtung von entgegengesetzten Formen verschiedener Species ausgedehnt (C. H e s s e 1 tine, Mycologia, 1957, Bd. 49, S. 449). Die Züchtungsmedien wurden ebenfalls untersucht, und es hat sich gezeigt, daß die Zugabe von vollständigem oder hydrolysiertem Getreidekorn, pflanzlichen ölen, oberflächenaktiven Mitteln, Antioxydantien und Verdickungsmitteln die Ausbeute an /J-Carotin erhöht (R. Anderson und Mitarbeiter, J. Agr. Food. Chem., 1958, Bd. 6, S. 543; A. C i e g 1 e r und Mitarbeiter, App. Microb., 1959, Bd. 7, S. 94 und 98).

Schließlich haben Mackinney und Mitarbeiter (J. Am. Chem. Soc, 1952, Bd. 74, S. 3456) gezeigt, daß die Zugabe von ß-Jonon zu einer ruhenden Kultur eines Phycomyces die Bildung von jS-Carotin auf Kosten anderer Carotinoidfarbstoffe stark erhöht. Anderson und Mitarbeiter haben die gleiche Wirkung bei bewegter Kultur von Blakeslea und Choanephora festgestellt (a.a.O.). Dieser Vorläufer kann durch andere Produkte, wie beispielsweise 2,2,6-Trimethylcyclohexanon oder gewissen funktionellen Derivaten von diesem (französisches Patent 1 325 656 und dessen Zusatz 82 529) oder 2,2,6 - Trimethyl -1 - acetyleyclohexen (französiches Patent 1 377 523) ersetzt werden.

Weiterhin ist aus der USA.-Patentschrift 3 097 146 ein Verfahren zur Herstellung von Lycopin mit Hilfe der +- und —-Formen von Blakeslea tuspora bekannt.

Verfahren zur Herstellung von Lycopin

Anmelder:

Rhöne-Poulenc S. A., Paris

Vertreter:

Dr. F. Zumstein, Dr. E. Assmann,

Dr. R. Koenigsberger

und Dipl.-Phys. R. Holzbauer, Patentanwälte,

8000 München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:

Leon Ninet,

Jacques Albert Renaut, Paris;

Robert Charles Frangois Tissier,

Maisons Alfort, Seine (Frankreich)

Beanspruchte Priorität:

Frankreich vom 14. Mai 1964 (974 548)

Es wurde nun gefunden, daß das Einbringen von gewissen stickstoffhaltigen Substanzen in die zur Erzeugung von ß-Carotin geeigneten Züchtungsmedien ermöglicht, die Bildung dieses letzteren zugunsten der Bildung von Lycopin zu inhibieren. Man erhält dann Medien, die Lycopin in erhöhten Mengen, wie sie bisher unbekannt waren, enthalten und mehr oder weniger vollständig frei von jeglichem anderen Carotinoidprodukt sind. Die Extraktion und Reinigung des Lycopins ist dann erheblich erleichtert.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Lycopin durch aerobe Fermentation einer Kultur der + - und —Formen von Blakeslea tuspora in einem hierfür üblichen Nährmedium und unter den für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium eine fünf- oder sechsringheterocyclische Verbii dung, die im Molekül die Gruppierung

(Tc

•N

aufweist, wie beispielsweise Imidazol, Pyridin, Morpholin und deren Substitutionsderivate, zusetzt.

809 517/223

Diese stickstoffhaltigen Substanzen können dem Kulturmedium in Mengen von 0,01 bis 4 g/1 zu Beginn oder im Verlauf der Fermentation einmal oder mehrere Male zugesetzt werden. Vorzugsweise nimmt man die Zugabe zu Beginn der Züchtung vor. Gleichgültig, welche Menge zugegeben wird und zu welchem Zeitpunkt die Zugabe dieser Produkte erfolgt, ist es zweckmäßig, die Züchtung 6 bis 10 Tage nach der Beimpfung fortzusetzen, um die maximale Produktion an Lycopin zu erzielen, Das Züchtungsmedium kann variieren, doch enthält es im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, Antioxydantien, oberflächenaktive Mittel und Verdickungsmittel.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate^ wie beispielsweise Glucose, Dextrine, Stärke oder tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl, Sojaöl oder Baumwollsamenöl, verwenden. Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig: Sie können chemische Verbindungen oder komplexe Substanzen sein, die den Stickstoff hauptsächlich in proteinischer Form enthalten, wie beispielsweise Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Sojamehle, Arachismehle, Hefeextrakte, lösliche Schlempebestandteile und Maisquellwasser.

Unter den zugesetzten Mineralstoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkaliphosphate.

.Unter den Wachstumsfaktoren ist der am häufigsten verwendete das Vitamin Bi oder Thiamin. Unter den Antioxydantien kann man das N,N'-Diphenyl - ρ - phenylendiamin, das 2,2,4 - Trimethyl-6-äthoxy-l,2-dihydrochinolin, die Ascorbinsäure oder die Sorbinsäure nennen.

Die oberflächenaktiven Mittel sind vorzugsweise von der nichtionischen Art, wie beispielsweise. Derivate von Sorbit mit Fettsäuren oder Produkte auf der Basis von Äthylenoxydkondensaten. Unter den Verdickungsmitteln sind die am häufigsten verwendeten Stärke, Carboxymethylcellulose und Agar.

Das so hergestellte Züchtungsmedium wird anschließend mit einer Kultur von + - und —Formen von Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) beimpft.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

50 Beispiel 1

Man stellt ein Züchtungsmedium A wie folgt her: 500 ecm Wasser mit einem Gehalt von 60 g löslichen Schlempebestandteilen werden 15 Minuten zum Sieden gebracht. Nach Abkühlen setzt man die folgenden Substanzen zu:

Stärke , 60 g

Sojaöl 35 ecm

Baumwollsamenöl 35 ecm ,

Hefeextrakt Ig

Monokaliumphosphat 0,5 g

Mangansulfatmonohydrat 0,1 g

Thiaminhydrochlorid 0,01 g

Man füllt mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1000 ecm auf. Das Gemisch wird mit einigen Tropfen 10 η-Natronlauge auf pH 6,3 eingestellt, in 300 ccm-Erlenmeyer-Kolben in einer Menge von 50 ecm je Kolben verteilt und dann 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben 0,5 ecm einer sterilen 5%igen Lösung von 2,2,4 - Trimethyl - 6 - äthoxy -1,2 - dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.

Auf die gleiche Weise wie das Medium A werden die Medien B, C und D hergestellt, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation außer Leuchtpetroleum und Antioxydans die unten angegebenen Imidazolmengen in Form wäßriger, mit verdünnter Salzsäure neutralisierter und steril filtrierter Lösungen zugibt:

Medium B:

0,1 ecm einer sterilen 2,5%igen Lösung von Imidazol in Wasser.

Medium C:

0,25 ecm einer sterilen 20%igen Lösung von

Imidazol in Wasser.
Medium D:

1 ecm einer sterilen 20%igen Lösung von Imidazol in Wasser.

Jeder Kolben mit den Medien A, B, C und D wird anschließend mit 5 ecm einer bewegten Kultur, die die zwei Formen + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) enthält und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend auf einen Drehtisch, der mit 220 Drehungen je Minute rotiert wird, in einen Brutschrank bei 26 ⁰C gebracht.

Nach 2tägiger Inkubation werden in jeden Kolben steril 0,5 ecm Leuchtpetroleum zugegeben. Die Züchtungen werden unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch acht weitere Tage fortgesetzt. Nach dieser Zeitspanne ist die Produktion an ^-Carotin oder Lycopin in allen Kolben maximal.

Die Bestimmung des ß-Carotins und Lycopins wird wie folgt durchgeführt: Das Mycel wird durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann über Nacht im Vakuum bei 35⁰C getrocknet. Das Trockenmycel wird anschließend mit Hexan extrahiert. Der Extrakt wird schließlich an Aluminiumoxyd chromatographiert. Die das /J-Carotin und das Lycopin enthaltenden Fraktionen· werden getrennt gesammelt.

ß-Carotin und Lycopin, die so voneinander getrennt sind, werden spektrophotometrisch gegen eine Vergleichsprobe bestimmt.

Die obigen Züchtungen ergaben die folgenden Ergebnisse:

	Imidazol	Produktionen	η Milligramm
Medien	in g/l	je Liter	Maische
	0	Lycopin	/i-Carotin
A	0,05	30	670
B	1	560	410
C	4	750	20
D	545	0

B eisp i e1 2

Man stellt ein Züchtungsmedium E wie folgt her: 500 ecm Wasser mit einem" Gehalt von 75 g löslichen Schlempebestandteilen werden 15 Minuten zum Sieden

gebracht. Nach Abkühlen setzt man die folgenden Substanzen zu:

Stärke 60 g

Sojaöl 30 ecm

Baumwollsamenöl 30 ecm

Tween 80 5 g

Hefeextrakt Ig

Monokaliumphosphat 0,5 g

Mangansulfatmonohydrat 0,1 g

Thiaminhydrochlorid 0,01 g

Man füllt mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1000 ecm auf. Der pH-Wert des Gemisches wird auf 6,3 eingestellt, und das Medium wird in 300-ccm-Erlenmeyer-Kolben verteilt und wie im Beispiel 1 sterilisiert.

Nach der Sterilisation setzt man steril jedem Kolben 0,5 ecm einer sterilen l%igen Lösung von 2,2,4 - Trimethyl - 6 - äthoxy -1,2 - dihydrochinolin in Leuchtpetroleum zu.

Nach dieser Zugabe werden die Kolben in zwei gleiche Gruppen geteilt: Die erste Gruppe wird belassen wie sie ist; in jeden Kolben der zweiten Gruppe bringt man 1 ecm einer neutralen und sterilen 5%igen Lösung von Imidazol in Wasser ein.

Die Kolben werden anschließend wie im Beispiel 1 beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation bringt man in jeden Kolben der ersten Gruppe 0,5 ecm Leuchtpetroleum und 1 ecm einer neutralen und sterilen 5%igen Lösung von Imidazol in Wasser und in jeden Kolben der zweiten Gruppe 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein.

Nach Vornahme dieser Zugaben werden die Züchtungen noch 8 Tage unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung fortgesetzt.

Die wie im Beispiel 1 durchgeführte Bestimmung des /i-Carotins und des Lycopins ergab die folgenden Produktionen:

Zugabe von Imidazol
in g/l

Bei der Beimpfung ...
Nach 2 Züchtungstagen

Produktionen in mg/1
Lycopin /i-Carotin

590
540

25
75

Nach Vornahme dieser Zugaben werden die Züchtungen bei den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch 8 Tage fortgesetzt.

Die wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführte Bestimmung des /3-Carotins und des Lycopins ergab die folgenden Produktionen:

Beispiel 3

Die Züchtungsmedien A und C, die sich nur durch das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit von Imidazol unterscheiden, werden wie im Beispiel 1 hergestellt und beimpft. Nach 2tägiger Inkubation unter den oben beschriebenen Bedingungen werden die Kolben, die jedem Züchtungsmedium entsprechen, in zwei gleiche Gruppen geteilt: Ai und Aa, Ci und C₂. In jeden Kolben werden dann steril die folgenden Zusätze zugegeben:

Gruppe Ai:

0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Gruppe A2:

50 mg /i-Jonon, gelöst in 0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Gruppe Ci:

0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Gruppe Ca:

50 mg ß-Jonon, gelöst in 0,5 ecm Leuchtpetroleum.

	Imidazol	ji-Jonon	Produktionen in mg, I	/i-Carotin
Gruppe	in g/l	in g/l	Lycopin	670
Ai	0	0	30	20
Ci	1	0	750	1220
A2	0	1	25	45
C2	1	1	715

Beispiel 4

In 300-ccm-Erlenmeyer-Kolben stellt man das im Beispiel 1 beschriebene Züchtungsmedium A und ein Züchtungsmedium F mit den gleichen Bestandteilen wie das Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation außer Leuchtpetroleum und Antioxydans 150 mg Carbonyldiimidazol-(l,l) in fester Form zugibt.

Die Kolben mit den Medien A und F werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation setzt man steril jedem Kolben 0,5 ecm Leuchtpetroleum zu und führt die Züchtung unter den gleichen Bedingungen bezüglich Bewegung und Temperatur noch weitere 8 Tage fort. Das ^-Carotin und das Lycopin werden wie im Beispiel 1 bestimmt.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Medien

A
F

Carbonyldiimidazo! in g/l

Produktionen in mg/1
Lycopin /i-Carotin

0 20

3 400

Beispiel 5

555
O

Man stellt das Züchtungsmedium A wie im Beispiel 1 her. Ferner stellt man Medien G und H mit den gleichen Bestandteilen wie des Mediums A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation außer Leuchtpetroleum und Antioxydans 2-Methylimidazol einbringt:

0,1 ecm einer sterilen wäßrigen 0,5%igen Lösung in die Kolben mit dem Medium G,

0,5 ecm einer sterilen wäßrigen 2°/i>igen Lösung in die Kolben mit dem Medium H.

Die Kolben mit den Medien A, G und H werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation bringt man steril in jeden Kolben 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein und setzt die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Bewegung und Temperatur noch weitere 8 Tage fort. Bei der in der gleichen Weise wie oben durchgeführten Bestimmung des ß-Carotins und des Lycopins wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

ι Γ

Medien 2-Methylim'idazol

0,01

0,2

Produktionen	in mg/I
Lycopin	/i-Carotin
40	900
855	180
760	0

B e i s ρ i e 1 6

In SOO-ccm-Erlenmeyer-Kolben stellt man das im Beispiel 1 beschriebene Medium A her. Die Medien K und L werden in der gleichen Weise wie das Medium A zubereitet, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation außer dem Antioxydans und dem Leuchtpetroleum Kreatinin in den unten angegebenen Mengen einbringt:

Medium K:

0,5 ecm einer sterilen l%igen Kreatininlösung in Wasser.

Medium L:

1 ecm einer sterilen 15%igen Kreatininlösung in Wasser.

Die Kolben mit den Medien A, K und L werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und 10 Tage lang inkubiert, einschließlich der Zugabe von Leuchtpetroleum nach 2 Züchtungstagen. Die erhaltenen Produktionen an ß-Carotin und Lycopin sind die folgenden:

20

Medien	Kreatinin
	in g/l
A	0
K	0,1
L	3

Produktionen in mg/1
Lycopin ^-Carotin

20
640
780

555

510

55

35

40

45

Beispiel 7

In SOO-ccm-Erlenmeyer-Kolben bereitet man das im Beispiel 1 beschriebene Medium A. Ferner werden Medien M und N in der gleichen Weise wie das Medium A hergestellt, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation außer dem Leuchtpetroleum und dem Antioxydans Pyridin in der unten angegebenen Menge zugibt:

Medium M:

0,5 ecm einer sterilen l%igen Lösung von Pyridin in Wasser.

Medium N:

1 ecm einer sterilen 15°/oigen Lösung von Pyridin in Wasser.

Die Kolben mit den Medien A, M und N werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und 10 Tage lang inkubiert, einschließlich der Zugabe von Leuchtpetroleum nach 2 Züchtungstagen. Die Produktionen an /3-Carotin und Lycopin sind die folgenden:

65

Medien	Pyridin	Produktionen in" mg/1	/f-Carotin
	in g/l	Lycopin	555
A	0	20	680
M	0,1	140	25
N	3	760

Beispiel 8

Man stellt das Züchtungsmedium A wie im Beispiel 1 her. Ferner werden die Medien P und R in der gleichen Weise wie das Medium A hergestellt, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation außer dem Leuchtpetroleum und dem Antioxydans Morpholin in den unten angegebenen Mengen einbringt:

Medium P: .

0,5 ecm einer sterilen l%igen Lösung von

Morpholin in Wasser.
Medium R:

1 ecm einer sterilen 15%igen Lösung von Morpholin in Wasser.

Die Kolben mit den Medien A, P und R werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und 10 Tage lang inkubiert, einschließlich der Zugabe von Leuchtpetroleum nach 2 Tagen. /?-Carotin und Lycopin werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bestimmt. Es wurden die folgenden Produktionen erhalten:

Medien	Morpholin	Produktionen	in mg/1
	in g/l	Lycopin	/i-Carotin
A	0	20	555
P	0,1	30	790
R	3	115	225

Beispiel 9

Man verteilt in 300-ccm-Erlenmeyer-Kolben 50 ecm Züchtungsmedien A, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind, oder Züchtungsmedien S und SA, die mit den gleichen Bestandteilen wie das Medium A hergestellt sind, wobei jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation außer dem Leuchtpetroleum und dem Antioxydans die folgenden Zugaben vorgenommen werden:

1 ecm einer sterilen 5%igen Lösung von 1-Äthyl-2-methylimidazol in Wasser in die Kolben

mit dem Medium S und 1 ecm einer sterilen 5%igen Lösung von 2-[Pyridyl-(4)]-imidazol in Wasser in die Kolben mit dem Medium SA.

Die Kolben mit den drei Medien werden anschließend unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation setzt man jedem Kolben mit den Medien A, S und SA steril 0,5 ecm Leuchtpetroleum zu und setzt die Züchtung weitere 9 bis 10 Tage unter den gleichen Bedingungen bezüglich Bewegung und Temperatur fort. Dann werden /S-Carotin und Lycopin wie im Beispiel 1 bestimmt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Medien	Zugaben Art	Menge in g/l	Produktk Lycopin	>nen in mg/I 0-Carotin
A			35	935
S	1-Äthyl- 2-methylimid- azol	1	865	20
SA	2-[Pyridyl-(4)]- imidazol	1 .	990	15:

Beispiel 10

30 1 ecm einer sterilen 5%igen Lösung von 2-Acetylaminoimidazol in Wasser in die Kolben

mit dem Medium TA;
1 ecm einer sterilen 5%igen Lösung von 1-Methylimidazol in Wasser in die Kolben mit dem Medium TB.

Die Kolben mit den Medien T, TA und TB werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 12tägiger Züchtung ohne weitere Zugabe werden ß-Carotin und Lycopin wie im Beispiel 1 bestimmt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

	Zugaben	Menge in g/l	Produktionen in mg/1	/!-Carotin
Medien				1080
	Art	1	Lycopin	95
T			40
TA	2-AcetyI-		860
	aminoimid-	1		60
	azol
TB	1-Methylimid-	820
	ii/ol

50

Beispiel 11

Man stellt das Züchtungsmedium T, das im Beispiel 10 beschrieben ist, und ein Züchtungsmedium TC mit den gleichen Bestandteilen wie das Medium T her, wobei man jedoch in jeden Kolben dieses Mediums nach der Sterilisation außer dem Leuchtpetroleum und dem Antioxydans 0,1 ecm einer sterilen 5%igen Lösung von 2-Isopropylimidazol in Wasser einbringt.

Die Kolben mit den Medien T und TC werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach lOtägiger Züchtung ohne weitere Zugabe bestimmt man das ß-Carotin

60

IO

Man stellt ein Züchtungsmedium T wie folgt her: 500 ecm Wasser mit einem Gehalt von 75 g löslichen Schlempebestandteilen werden 15 Minuten zum Sieden gebracht. Nach Abkühlen setzt man die folgenden Substanzen zu:

Stärke 70 g

Sojaöl 40 ecm

Baumwollsamenöl 40 ecm

Monokaliumphosphat 0,5 g

Mangansulfatmonohydrat 0,2 g

Thiaminhydrochlorid 0,01 g

Man füllt mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1000 ecm auf. Der pH-Wert des Gemisches wird auf 6,3 eingestellt, und das Medium wird in 300-ccm-Erlenmeyer-Kolben in einer Menge von 50 ecm je Kolben verteilt und wie im Beispiel 1 sterilisiert.

Nach der Sterilisation setzt man steril jedem Kolben 1 ecm einer sterilen 2,5%igen Lösung von 2,2,4 - Trimethyl - 6 - äthoxy -1,2 - dihydrochinolin in Leuchtpetroleum zu.

Man stellt ferner ein Medium TA und ein Medium TB mit den gleichen Bestandteilen wie denjenigen des Mediums T her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation außer dem Leuchtpetroleum und dem Antioxydans die folgenden Zusätze einbringt:

und das Lycopin wie im Beispiel 1. Die Ergebnisse waren die folgenden:

Medien

T
TC

2-Isopropylimidazol g/l

0,1

Produktionen in mg/I
Lycopin /5-Carotin

40
845

985
0

Beispiel 12

Man stellt das Züchtungsmedium A wie im Beispiel 1 her. Ferner stellt man ein Züchtungsmedium V und ein Medium W mit den gleichen Bestandteilen wie denjenigen des Mediums A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach Sterilisation außer dem Leuchtpetroleum und dem Antioxydans noch folgende Zusätze einbringt:

0,5 ecm einer sterilen lO°/oigen Lösung von 2,4-Dimethylpyridin in Wasser in die Kolben mit dem Medium V;

0,5 ecm einer sterilen 10%igen Lösung von 2,4,6-Trimethylpyridin in Wasser in die Kolben mit dem Medium W.

Die Kolben mit den Medien A, V und W werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation bringt man in jeden Kolben mit den drei Medien steril 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein und setzt die Züchtungen noch weitere 8 Tage unter den gleichen Bedingungen bezüglich Bewegung und Temperatur fort.

Nach der wie im Beispiel 1 durchgeführten Bestimmung des jÖ-Carotins und des Lycopins wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

	Zugaben	Menge in g/l	Produktionen in mg/1	fi-Carotin
Medien				410
	Art	1	Lycopin	35
A			25
V	2,4-Dimethyl-	1	850	30
	pyridin
W	2,4,6-Trime	800
	thylpyridin

Beispiel 13

Man stellt das Züchtungsmedium A wie im Beispiel 1 her. In der gleichen Weise stellt man die Medien X und Y her, wobei man in jeden Kolben nach der Sterilisation außer dem Leuchtpetroleum und dem Antioxydans die folgenden Zusätze einbringt :

Medium X:

0,5 ecm einer sterilen 10%igen Lösung von 2,6-Dimethylpyridin in Wasser.

Medium Y:

0,5 ecm einer sterilen 10%igen Lösung von 2-Methylpyridin in Wasser.

Jeder Kolben mit den Medien A, X und Y wird unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2 Züchtungstagen bringt man in jeden Kolben steril 0,5 ecm Leuchtpetroleum ein und setzt die Züchtungen noch

809 517/223

8 Tage unter den gleichen Bedingungen bezüglich Bewegung und Temperatur fort.

jS-Carotin und Lycopin werden wie im Beispiel 1 bestimmt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

	Zugaber	Art	Menge in g/l	Produktionen in mg/1	14	,8-Carotin
Medien			Lycopin	720
A	2,6-Dimethyl- pyridin 2-Methyl- pyridin	-1 1	15	15 0
X Y	Bei	spiel	920 800

Man stellt das Züchtungsmedium T, das im Beispiel 10 beschrieben ist, und ein Züchtungsmedium TD mit den gleichen Bestandteilen wie das Medium T her, wobei man bei letzterem in jeden Kolben nach der Sterilisation außer dem Leuchtpetroleum und dem Antioxydans 0,2 ecm einer sterilen 25%igen Piperidinlösung in Wasser einbringt.

Die Kolben mit den Medien T und TD werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach lltägiger Züchtung ohne weitere Zugabe bestimmt man das erzeugte ^-Carotin und Lycopin wie im Beispiel 1. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

25

3° sierten 10%igen wäßrigen Imidazollösung. Zur anderen Hälfte der Kolben wird nichts hinzugegeben, und ihre Mischung dient als Vergleichsmischung.

Jeder Kolben wird mit 7,5 ecm einer bewegten Kultur, die die Formen (+) und (—) des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und NRRL 2457) enthält und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kultur wird auf einem Drehtisch, der mit 220 Umdrehungen pro Minute rotiert, bei 26 ⁰C inkubiert.

Der pH-Wert jeder Kultur wird während der gesamten Fermentation durch Zugabe einer 1 n-Natriumhydroxydlösung auf ungefähr 7,2 bis 7,4 gehalten.

Nach 6 Züchtungstagen wird der Inhalt des Kolbens zur Analyse folgender Behandlung unterworfen: Das Mycel wird durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in einer Trockenapparatur über Nacht im Vakuum bei 35⁰C getrocknet. Das Trockenmycel wird anschließend mit Hexan extrahiert. Der Extrakt wird auf einer Aluminiumoxydsäule chromatographiert und die Fraktionen, die das /5-Carotin und das Lycopin enthalten, werden getrennt aufgefangen und durch Spektrophotometrie quantitativ bestimmt.

Bei den obigen Züchtungen wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Imidazol

Medien

T
TD

Piperidin
in g/l

0
1

Produktionen in mg/1 Lycopin /i-Carotin

40 1030

35 lg/1
0

pH-Wert am
Ende der
Züchtung

7,3 7,3

Produktion in Milligramm je Liter Maische

Lycopin

236
9,35·

/3-Carotin

3,15 79

740 205

Die im folgenden aufgeführten Vergleichsbeispiele zeigen den wesentlichen Fortschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens insbesondere gegenüber der USA.-Patentschrift 3 097 146.

Diese.Vergleichsversuche zeigen die sehr selektive Wirkung des Imidazols auf die Lenkung der Carotinoidsynthese zur Lycopinbildung und damit die Vorteile des erfindungsgemäßen Zusatzes bei beliebigen Züchtungsbedingungen.

Vergleichsbeispiele

Beispiel A (entspricht Beispiel 2 der USA.-Patentschrift 3 097 146). Man stellt das Züchtungsmedium wie folgt her:

Maisquellwasser 14 g

K2HPO4 5,5 g

Glucose 44 g

CaCO₃ Ig

Sojaöl 20 ecm

Aqua dest. zur Auffüllung auf ... 11

Das Gemisch wird in 300-ccm-Erlenmeyer-Kolben in einer Menge von 50 ecm je Kolben verteilt und dann 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen beträgt der pH-Wert des Mediums 7,2.

In die Hälfte der Kolben bringt man unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben 0,5 ecm einer durch Filtration über einen bakteriologischen Filter sterili-

Beispiel B (entspricht Beispiel 8 der genannten

USA.-Patentschrift). Man stellt das Züchtungsmedium wie folgt her:
40

Pepton 5 g

Fleischextrakt 1,5 g

Hefeextrakt 1,5 g

Glucose Ig

NaCl 3,5 g

K₂HPO₄ 3,7 g

KH₂PO₄ 1,32 g

ölsäure 10 ecm

Stärke ·. 40 g

Aqua dest. zur Auffüllung auf ... 11

Das Gemisch wird in Erlenmeyer-Kolben aufgeteilt und der Versuch unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen ausgeführt. Mit dem auf diesem Medium durchgeführten Züchtungen wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

g0 Imidazol	pH-Wert am Ende der Züchtung	Produktion in je Liter Lycopin	Milligramm vTaische /i-Carotin
lg/1 0	7,5 7,45	145 13	0,9 60

65 Beispiel C (entspricht einem modifizierten Beispiel 2 der genannten USA.-Patentschrift). Man stellt das Züchtungsmedium wie folgt her:

Claims (1)

13 14

Maisquellwasser 14 g Patentanspruch:

KH₂PO₄ 5,5 g

Maisstärke 50 g Verfahren zur Herstellung von Lycopin durch

(an Stelle von 44 g Glucose) aerobe Fermentation einer Kultur der Formen

CaCO₃ Ig 5 ( + ) und ( —) von Blakeslea trispora in einem

Sojaöl 20 ecm hierfür üblichen Nährmedium und unter den

Aqua dest. zur Auffüllung auf ... 11 für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet,

Das Gemisch wird auf Erlenmeyer-Kolben auf- daß man dem Nährmedium eine fünf- oder geteilt und der Versuch unter den im Beispiel 1 io sechsringheterocyclische Verbindung, die im Molebeschriebenen Bedingungen ausgeführt. kül die Gruppierung

Mit den auf diesem Medium durchgeführten

Züchtungen wurden die folgenden Ergebnisse erzielt: '" ~\

C-N

aufweist, wie Imidazol, Pyridin, Morpholin oder deren Substitutionsderivate, zusetzt.

Imidazol pH-Wert am
Ende der
Fermentation Produktion ir
je Liter
Lycopin Milligramm
Maische
fi-Carotin ig/i
0 7,2
7,25 252
7,3 4,1
58,5

In Betracht gezogene Druckschriften: USA.-Patentschrift Nr. 3 097 146.

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