DE1249798B - Verfahren zur Herstellung von ß-Carotin durch aerobe Fermentation - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

C12d ^

Inta.:

Deutsche Kl.:

Nummer: 1249 798 ...

Aktenzeichen: R 41344IV a/6 b

Anmeldetag: 17. August 1965

Auslegetag: 14. September 1967

CI2P 2 3/00

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von ß-Carotin durch Fermentation.

Es ist bekannt, ^-Carotin durch Submersfermentation von Mikroorganismen des Genus Choanephora oder Blakeslea zu erhalten. In verschiedenen Veröffentlichungen sind die Bedingungen beschrieben, die die Produktion von ß-Carotin begünstigen. B a r η e 11 und Mitarbeiter (Science, 1956, Bd. 123, S. 141) haben gezeigt, daß die Produktion von ß-Carotin durch gleichzeitige Züchtung von entgegengesetzten Formen ein und derselben Species verbessert wird. Diese Untersuchung wurde dann auf die Züchtung von entgegengesetzten Formen verschiedener Species ausgedehnt (C. H e s s e 11 i η e , Mycologia, 1957, Bd. 49, S. 449). Die Züchtungsmedien wurden ebenfalls untersucht, und es hat sich gezeigt, daß die Zugabe von vollständigem oder hydrolysiertem Getreide, pflanzlichen ölen, oberflächenaktiven Mitteln, Antioxydantien und Verdickungsmitteln die Ausbeute an ß-Carotin erhöht (R. Anderson und Mitarbeiter, J. Agr. Food Chem., 1958, Bd. 6, S. 543; A. C i e g 1 e r und Mitarbeiter, App. Microb., 1959, Bd. 7, S. 94 und 98).

Schließlich haben Mackinn ey und Mitarbeiter (J. Am. Chem. Soc, 1952, Bd. 74, S. 3456) gezeigt, daß die Zugabe von /i-Jonon zu einer ruhenden Kultur eines Phycomyces die Bildung von ,5-Carotin auf Kosten anderer Carotinoidfarbstoffe stark erhöht. Anderson und Mitarbeiter haben die gleiche Wirkung bei bewegter Kultur von Blakeslea und Choanephora festgestellt (a. a. O.). Der Vorläufer für /5-Carotin, das jS-Jonon, kann auch durch andere Produkte, wie beispielsweise ' 2,2,6-Trimethylcyclohexanön (französische Patentschrift 1 325 656) oder 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen (französische Patentschrift 1 377 523), ersetzt werden. .

Es wurde nun gefunden, daß durch die Zugabe von Isonicotinsäurehydrazid und. gewissen Derivaten davon zum Züchtungsmedium die Produktion. von ' /?-Carotin gesteigert werden kann.

Ausgehend von einem Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von ß-Carotin durch aerobe Züchtung der -f- und —Formen von Blakeslea trispora in Nährmedien und bei Bedingungen, die hierfür üblich sind, setzt man daher dem Nährmedium erfindungsgemäß eine Verbindung der allgemeinen Formel

CONH-NH-R

(I) Verfahren zur Herstellung von ^-Carotin
durch aerobe Fermentation

Anmelder:

Rhöne-Poulenc S. A., Paris _; ,

Vertreter: V

Dr. F. Zumstein, Dr. E. Assmann,

Dr. R. Koenigsberger ^;i :

und Dipl.-Phys. R. Holzbauer, Patentanwälte,

München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:

Leon Ninet,

Jacques Albert Renaut, Paris;

Robert Charles Frangois Tissier, _

Maisons-Alfort, Seine (Frankreich)

Beanspruchte Priorität:
Frankreich vom 17. August 1964 (985 362),
vom 8.JuIi 1965 (23 958)

wobei R ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit bis 8 Kohlenstoffatomen, einen Aralkylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, einen Phenylsulfonylrest oder einen Rest mit der Formel

— C(= NH)NH — C(= NH)NH₂

bedeutet, oder eine Verbindung der allgemeinen Formel

■ CONHN = CH — R' (II)

wobei R' einen Dialkylaminorest oder einen stickstoff- oder sauerstoffhaltigen einkernigen, fünf- oder sechsring-heterocyclischen Rest mit einem Heteroatom bedeutet, zu.

Die erfindungsgemäßen Zusatzstoffe können dem Züchtungsmedium in Mengen von 0,1 bis 10 g je Liter zu Beginn oder im Verlaufe der Fermentation auf einmal oder mehrmals zugegeben werden. Vorzugsweise verwendet man eine Menge zwischen 0,2 und 2 g je Liter und führt die: Zugabe zu Beginn der Züchtung durch. Gleichgültig, welche Menge zugegeben wird und zu welchem Zeitpunkt die Zugabe

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dieses Produktes erfolgt, ist es zweckmäßig, die meyerkolben in einer Menge von 50 ecm je Kolben

Züchtung 6 bis 15 Tage lang nach der Beimpfung verteilt und dann 20 Minuten bei 120° C sterilisiert,

fortzusetzen, um die maximale Produktion an . Nach Sterilisation und Abkühlen bringt man unter

ß-Carotin zu erhalten. Das Züchtungsmedium kann sterilen Bedingungen in jeden Kolben 1 ecm einer

variieren und eine assimilierbare Kohlenstoffquelle 5 sterilen 2,5%igen Lösung von 2,2,4-Trimethyl-

und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe 6-äthoxy-l,2-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein.

und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, Antioxy- Man stellt auch Medien B und C mit den gleichen

dantien, oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel Bestandteilen und in gleicher Weise wie bei Me-

und Vorläufer enthalten. dium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man 10 der Sterilisation des Mediums außer dem AntiKohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Dextrine, oxydans, gelöst in Leuchtpetroleum, die nach-Stärke, oder tierische oder pflanzliche öle, wie bei- folgenden Mengen einer 5%igen sterilen Lösung von spielsweise Schmalzöl, Sojaöl oderBäumwollsamenöl, Isonicotinsäurehydrazid in Wasser zusetzt: verwenden. Die geeigneten assimilierbaren Stickstoff- .. ,. ^ .

quellen sind außerordentlich verschiedenartig: Sie i₅ J^cfllum g <; ; · · · ^Ό>^{1 ccm}

können chemische Verbindungen oder komplexe ^{e ium} ecm

Substanzen sein, die den Stickstoff hauptsächlich in Jeder Kolben mit den Medien A, B und C wird

proteidischer Form enthalten, wie beispielsweise anschließend mit 5 ecm einer gerührten bzw. ge-

Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate. schüttelten Kultur, die die zwei Formen + und — des

Sojamehle, Arachismehle, Hefeextrakte. Distillers' 20 Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und

solubles und Maisquellwasser. NRRL 2457) enthält und 48 Stunden gealtert wurde,

Unter den zugesetzten Mineralstoffen können ge- beimpft. Die Kolben werden anschließend in einem

wisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Brutschrank bei 26° C auf einen Drehtisch gebracht,

Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder der mit 220 Drehungen je Minute rotiert. Nach

Erdalkaliphosphate. 25 . lOtägiger Züchtung unter diesen Bedingungen ist die

Unter den Wachstumsfaktoren ist der am hau- Produktion an ß-Carotin in allen Kolben maximal, figsten verwendete das Vitamin Bi oder Thiamin. Die Bestimmung des ß-Carotins wird wie folgt Unter den Antioxydantien kann man das Ν,Ν'-Di- durchgeführt: Das Mycel wird durch Filtrieren abphenyl-p-phenylendiamin, das 2,2,4-Trimethyl-6-äth- getrennt, mit Wasser gewaschen und dann über oxy4,2-dihydrochinolin, die Ascorbinsäure oder die 30 Nacht im Vakuum bei 35⁰C getrocknet. Das Sorbinsäure nennen. Die oberflächenaktiven Mittel Trockenmycel »wird anschließend mit Hexan extrasind vorzugsweise von nichtionischer Art, wie bei- hiert.

spielsweise Sorbitderivate von Fettsäuren oder Pro- Man trennt das ^-Carotin von den anderen vor-

dukte auf der Basis von Äthylenoxydkondensaten. handenen Carotinoiden durch eine Chromatographie

Unter den Verdickungsmitteln sind die am häufigsten 35 des Extrakts an Aluminiumoxyd ab. Die das /S-Carotin

verwendeten Stärke, Carboxymethylzellulose, Agar. enthaltenden Elutionsfraktionen werden vereinigt,

Als Vorläufer kann man /S-Jonon, 2,2,6-Trimethyl- und der Gehalt wird spektrophotometrisch gegen eine

cyclohexanonoder^jo^-Trimethyl-l-acetylcyclohexen reine /3-Carotinprobe bestimmt,

verwenden. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

süßend *^*$£»Τ^-1&& *° Jgfi £«** f™f? *» »β ^arotin j, Liter

_rB^esleatrispora₍NRRL2456undNRRL2457) ^^S^S

'Se Erhöhung der Produktion an ^-Carotin in J^Lp —γ · V .· · 1630 mg ^-Carotin je Liter

Gegenwart von Verbindungen gemäß der Formel (I) ₄5 S^SisäÄdr^id ?e ^:''

oder (II) ist je nach den Arbeitsbedingungen mehr S^ ^* ° 1950 mg ^Carotin je Liter

oder weniger ausgeprägt: Sie tritt jedoch auf, gleich- er. j

gültig, ob man Antioxydantien oder Vorläufer zu den B e ' ή ' 1 2

Züchtungsmedien zusetzt oder nicht P

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. 5° Man stellt die Züchtungsmedien A und C her und

. . beimpft sie, wie es im Beispiel 1 angegeben ist. Nach

Beispiel 1 der Beimpfung und einer Inkubation von 48 Stunden

Man stellt ein Züchtungsmedium A wie folgt her: unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen

500 ecm Wasser mit einem Gehalt von 75 g Distillers' gibt man steril in jeden Züchtungskolben eine Lösung

Solubles werden 15 Minuten zum Sieden gebracht. 55 von 50 mg /3-Jpnon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum. Man

Nach Abkühlen setzt man die folgenden Substanzen setzt dann die Züchtungen fort und analysiert unter

zu: · den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.

Stärke .^j:.. 70 g Es wurden folgende Ergebnisse erhalten;

Sojaöl ........ _r..... _?........... 40 ecm Medium A (ohne Zusatz) 1050 mg ,S-Carotin je Liter

Baumwollsamenöl 40 ecm 60 _Μβ^ _{c (mjt} ^ _{g IsQ}.

Heieextrakt , y .................. Ig nicotinsäurehydrazidje

Monokaliumphosphat ............ 0,5 g Uter ............... 2050 mg ^Carotin je Liter

Mangansulfat-monohydrat ........0,1g

Thiamin-hydrochlorid ·'·., ■ · · · ·,■'·. ■ ■ QMg, Beispiel 3

Man füllt mit destilliertem Wasser auf 1000 ecm Man stellt das Medium A wie im Beispiel 1 her.

auf. Das Gemisch wird mit einigen Tropfen 10 n-Na^ Man stellt auch Medien D und F mit den gleichen

tronlauge auf pH 6,3 eingestellt, in SOQ-cem-Erlen- Bestandteilen und in der gleichen Weise wie bei

Medium A her, wobei man jedoch in jeden Kolben nach der Sterilisation des Mediums außer dem Antioxydans, gelöst in Leuchtpetroleum, die nachfolgend angegebenen Mengen einer sterilen 5%igen Lösung von 1-Isonicotinoyl-2-isopropylhydrazin in Wasser einbringt:

Medium D 0,1 ecm

Medium F .... 1 ecm

Jeder Kolben mit den Medien A, D und F wird anschließend mit 5 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Kultur, die die zwei Formen + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und NRRL 2457) enthält und 48 Stunden gealtert wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend in einem Brutschrank bei 26° C auf einen Drehtisch gebracht, der mit 220 Drehungen je Minute rotiert. Nach 12tägiger Züchtung unter diesen Bedingungen ist die Produktion an ^-Carotin in allen Kolben maximal.

Die Bestimmung des /S-Carotins wird wie im Beispiel 1 durchgeführt.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Medium A (ohne Zusatz) 1065 mg ,S-Carotin je Liter Medium D (mit 0,1 g

1-Isonicotinoyl-2-iso-

propylhydrazin je Liter 1565 mg ^-Carotin je Liter Medium F (mit 1 g 1-Iso-

nicotinoyl-2-isopropyl-

hydrazin je Liter 2440 mg /S-Carotin je Liter

B ei sρ ie I 4

Man bereitet und beimpft die Züchtungsmedien A und F wie im Beispiel 3. Nach Beimpfen und Inkubation während 48 Stunden unter den in den Beispielen 1 und 3 beschriebenen Bedingungen gibt man steril zu jedem Züchtungskolben mit dem Medium A eine Lösung von 50 mg ß-Jonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum und zu jedem Kolben mit dem Medium F entweder 50 mg /S-Jonon oder 50 mg 2,6,6-Trimethyl-1-acetylcyclohexen (TMACH), jeweils in 0,5 ecm Leuchtpetroleum gelöst. Man setzt die Züchtungen noch 10 Tage fort und analysiert unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Diese Medien, ein Medium F und ein Medium A ohne Zusatz, werden zur gleichen Zeit beimpft und die Kulturen unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen gezüchtet.

Nach 12tägiger Züchtung wird das /S-Carotin, wie im Beispiel 1 angegeben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt. Der /i-Carotin-Produktion des Vergleichsmediums A wurde der Koeffizient 100 zugeordnet. Die Koeffizienten, die den. Medien zukommen, die die nachstehend genannten Isonicotinoylhydrazinderivate gemäß der Erfindung enthalten, zeigen die Erhöhung der Produktion an ß-Carotin, bezogen auf das Vergleichsmedium.

	Medium	Produkt von ß-Carotin	mit TMACH
		in mg/1	lg/1
Bezeich	Zusätze	mit Jonon	^
nung		lg/1
A		1905
F	1-Isonicotinoyl-		3770
	2-isopropyl-
	hydrazin, 1 g/l	3560

Beispiel 5

55

6p

. Man stellt andere Züchtungsmedien in der gleichen Weise wie das Medium F von Beispiel 3 her, wobei man jedoch die Zugabe von l-Isonicotinoyl-2-iso? propylhydrazin durch eine Zugabe von anderen nachfolgend genannten N(2)-substituierten Isonicotinoylhydrazinderivaten in wäßriger Lösung in den nachfolgenden angegebenen Mengen ersetzt,

Verwendetes Isohicotinoylhydrazinderivat	Zugesetzte Menge in g/l	Produktion von /f-Carotin
Keines (Medium A)	—	100
1 -Isonicotinoyl-2-isopropyl- hydrazin [Formel I, R = CH(CHs)2] (Medium F)	1	229
1 -Isonicotinoylaminobiguanid [Formell, R = — C(= NH)NH —ι
LC(= NH)NH2] .......	1	262
1 - Isonicotinoyl - 2 - dimethyl- aminomethylidenhydrazin [Formel II, R'■= —N(CH3)2] ......	1	124

B e i s ρ ie 16

Man stellt Züchtungsmedien wie im Beispiel 5 in der gleichen Weise wie das Medium F von Beispiel 3 her, wobei man jedoch das 1 -Isonicotinoyl-2-isopropylhydrazin durch andere nachfolgend genannte Isonicotinoylhydrazinderivate der Formel I oder II, gelöst 'in Wasser, in den nachfolgend angegebenen Mengen ersetzt.

Die neuen Medien werden gleichzeitig mit einem Medium A, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist, und einem Medium F, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist, beimpft, und die Züchtungen werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. .

Nach 2tägiger Inkubation wird in die Kolben von jedem Medium eine Lösung von 50 mg jS-Jonon in 0,5 ecm Leuchtpetroleum zugegeben. Die Züchtungen werden anschließend noch 10 Tage fortgesetzt. Das /S-Carotin wird dann wie im Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt, wobei ebenfalls wie im Beispiel 5 der Produktion von /i-Carotin in dem Vergleichsmedium A der Koeffizient 100 zugeordnet ist. Die Koeffizienten der anderen Medien entsprechen dann der Steigerung der Produktion an /S-Carotin, bezogen auf dieses Vergleichsmedium.

.,; ;■ .Verwendetes Isonicotinoylhydrazinderivat

Keines (Medium A) ......

-Isonicotinoyl-2-isopropyl-' hydrazin [Formel I,

1-Isonicotinoyl-2-heptylhydrazin [Formel I, R = - CH₂)₆CH₃] ....

l-Isonicotinoyl-2-benzylhydrazin [Formel I, R = - CH₂C₆H₅] ....

-Isonicotinoyl-2-benzolsulfonylhydrazin [Formel I,
R = - SO₂C₆H₅]

1-Isonicotinoylaminobiguanid [Formel I, R = — Q=NH)NH-j

■— C(= NH)NH₂]

-Isonicotinoyl-2-dimethylamino-methylidenhydrazin [Formel II, R' = —

l-Isonicotinoyl-2-[pyridyl-(4)-methyliden]- hydrazin (Formel II,

-Isonicotinoyl-2-furfurylidenhydrazin (Formel II,

l-Isonicotinoyl-2-[2-methyl-3-hydroxy-5-hydroxy- methylpyridyl-(4)-methylidenj-hydrazin (Formel II,

CH₂Om

HO CB₉)

Zugesetzte Vlenge in g/l

0,5

0,5

0,75

0,2

2

Produktion on ß-Carotin

100

187

177

169

164

175

134

150

142

127

B e i s ρ i e 1

In ein Ferrnentationsgefäß von 800 1, das 2001 auf 9O⁰C gebrachtes Wasser enthält, bringt man 22,4 kg Distillers' solubles ein. Das Gemisch wird 10 Minuten bei einer Temperatur von 90⁰C in Bewegung gehalten. Nach Abkühlen auf 3O⁰C setzt man die folgenden Bestandteile zu:

Stärke.... 19,2 kg

Sojaöl 9,61

Baumwollsamenöl 9,6

Mangansulfat-monohydrat ........ 0,064 kg

2,2,4 - Trimethyl - 6 - äthoxy -1,2-dihydrochinolin in 50%iger Lösung

in Äthanol (Gew./Vol.) 0,224 1

Lösung von Thiamin-hydrochlorid in Wasser mit 1 g/l,., 0,160 1

Das Volumen wird mit Wasser auf 285 1 gebracht. Der pH-Wert des Gemisches wird mit 1,11 10 n-Natronlauge auf 6,35 eingestellt. Das Medium wird durch 55minutiges Erhitzen bei 122⁰C mittels Durchleiten von Dampf sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt der pH-Wert 5,85 und das Volumen 310 1.

Man setzt dann steril eine Lösung von 0,192 kg Isonicotinsäurehydrazid in 31 Wasser und dann 6,41 steril filtriertes Leuchtpetroleum zu. Das Fermentationsgefäß wird anschließend mit 321 einer Impfkultur aus Fermentationen der zwei Formen + und — des Stammes Blakesleatrispora (NRRL 2456 und NRRL 2457), die 48 Stunden gealtert ist, beimpft. Die Kultur wird bei 26⁰C unter Bewegung mit einer Turbine mit 210 UpM und Belüftung mit einer Menge von 25 ecm steriler Luft je Stunde entwickelt.
Nach 48stündiger Züchtung setzt man unter sterilen Bedingungen eine sterile Lösung von 0,320 kg ß-Jonon in 1,61 Leuchtpetroleum zu und beginnt mit einer kontinuierlichen Zugabe einer sterilen wäßrigen Lösung von Glucose-monohydrat mit 580 g je Liter. Die Vorrichtung, die die Zugabe der Glucoselösung ermöglicht, wird mit einer Dosierung von 230 ecm je Stunde betrieben. Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen bezüglich Belüftung, Bewegung und Temperatur nach der Zugabe des ß-Jonons noch 5 Tage fortgesetzt. Beim Abbrechen der Züchtung sind 26 1 Lösung, entsprechend 15 kg Glucose-monohydrat, in das Fermentationsgefäß eingeführt.

Das bei der Fermentation erzeugte ^-Carotin wird wie im Beispiel 1 bestimmt. Bei diesem Ansatz wurden 2560 mg ß-Carotin je Liter erhalten.

Mit einem aliquoten Anteil der Fermentationsmaische dieses Ansatzes wurde eine Kristallisation des gebildeten ß-Carotins auf folgende Weise durchgeführt :

7,41 Maische mit einem Gehalt von 19 g /?-Carotin werden filtriert, und das Mycel wird mit Wasser gewaschen, gewonnen und über Nacht im Vakuum bei 45°C getrocknet. Das Trockenmycel wird mit 4500 ecm Methylenchlorid extrahiert und der erhaltene Extrakt auf ein Volumen von 3Q0 ecm eingeengt. Dann werden 300 ecm n-Butanol zu dem Konzentrat zugegeben, um die Kristallisation des /J-Carotins zu bewirken. Die abgesaugten, gewaschenen und getrockneten Kristalle wiegen 15,7 g und enthalten 95% ß-Carotin.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von ^-Carotin durch aerobe Fermentation der +- und —-Formen von Blakeslea trispora in Nährmedien und bei Bedingungen, die hierfür üblich sind, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium eine Verbindung der allgemeinen Formel

   CONHNHR

   wobei R ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest

   mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einen Aralkylrest Formel N' 7— CONHN = GH — R'

   mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, einen Phenyl-

   sulfonylrest oder einen Rest mit der Formel wobei R' einen Dialkylaminorest oder einen ein-

   rv χτυΛχτυ rv xtuyntxj kernigen stickstoff- oder sauerstoffhaltigen fünf-

   — C(- NH)NH C(-NH)NH_{2 5 o}der sechsnng-heterocyclischen Rest mit einem

   bedeutet oder eine Verbindung der allgemeinen Heteroatom bedeutet, zusetzt.

   709 647/176 9. 67 © Bundesdruckerei Berlin