DE1263661B

DE1263661B - Verfahren zur Herstellung von beta-Carotin

Info

Publication number: DE1263661B
Application number: DER37834A
Authority: DE
Inventors: Leon Ninet; Jacques Renaut; Robert Charles Francoi Tissier; Maisons Alfort
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1963-09-25
Filing date: 1964-05-04
Publication date: 1968-03-21
Also published as: SE306296B; GB1014669A; NL144661B; US3276970A; CH418322A; NL6405259A; DK106427C; BR6458696D0

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C12d

Deutsche Kl.: 6b-16/03

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

1263 661
R 37834 IV a/6 b
4. Mai 1964
21. März 1968

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von ß-Carotin durch Fermentation.

Es ist bekannt, /S-Carotin durch Submers-Fermentation von Mirkoorganismen des Genus Choanephora oder Blakeslea zu erhalten. In verschiedenen Veröffentlichungen sind die Bedingungen beschrieben, die die Produktion von /3-Carotin begünstigen. B a r η e 11 und Mitarb. (Science, 1956, Bd. 123, S. 141) haben gezeigt, daß die Produktion von /S-Carotin durch gleichzeitige Züchtung von entgegengesetzten Formen ein und derselben Species verbessert wird. Diese Untersuchung wurde dann auf die Züchtung von entgegengesetzten Formen verschiedener Species ausgedehnt (C. H e s s e 11 i η e, Mycologia, 1957, Bd. 49, S. 449). Die Züchtungsmedien wurden ebenfalls untersucht, und es hat sich gezeigt, daß die Zugabe von vollständigem oder hydrolysiertem Getreide, pflanzlichen Ölen, oberflächenaktiven Mitteln, Antioxydantien und Verdickungsmitteln die Ausbeute an ^-Carotin erhöht. (R. Anderson und Mitarb., J. Agr. Food. Chem., 1958, Bd. 6, S. 543; A. C i e g 1 e r und Mitarb., App. Microb., 1959, Bd. 7, S. 94 und 98).

Schließlich haben Mackinney und Mitarb. (J. Am. Chem. Soc, 1952, Bd. 74, S. 3456) gezeigt, daß die Zugabe von /9-Jonon zu einer ruhenden Kultur eines Phycomyces die Bildung von /5-Carotin auf Kosten anderer Carotinoidfarbstoffe stark erhöht. Anderson und Mitarb, haben die gleiche Wirkung bei bewegter Kultur von Blakeslea und Choanephora festgestellt (a. a. O.).

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß es von Wert ist, in den Züchtungsmedien das gesamte /3-Jonon oder einen Teil des /3-Jonons durch 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l) (ein weniger fortentwickeltes und daher leichter zugängliches chemisches Produkt als /3-Jonon) zu ersetzen, und daß man eine starke Erhöhung des Ausmaßes der Produktion an /3-Carotin gegenüber Vergleichsmedien ohne Vorläufer erhält.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von/3-Carotin durch aerobe Fermentation einer Kultur der Formen + und — von Blakeslea trispora in einem hierfür üblichen Nährmedium unter üblichen Züchtungsbedingungen ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l) allein oder zusammen mit /3-Jonon zusetzt.

Wie aus dem Vergleichsversuch im nachfolgenden Beispiel 1 ersichtlich, ist das erfindungsgemäße Verfahren dem aus der französischen Patentschrift 1 325 656 bekannten Verfahren, bei dem 2,2,6-Trimethylcyclo-Verfahren zur Herstellung von /?-Carotin

Anmelder:

Rhöne-Poulenc S. A., Paris
Vertreter:

Dr. F. Zumstein, Dr. E. Assmann
und Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte,
8000 München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:

Leon Ninet,

Jacques Renaut, Paris;

Robert Charles Frangois Tissier,

Maisons Alfort, Seine (Frankreich)

Beanspruchte Priorität:

Frankreich vom 25. September 1963 (948 640)

hexanon als Vorläufer verwendet wird, deutlich überlegen.

Wenn man als Vorläufer 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l) allein verwendet, so kann dieses dem Züchtungsmedium in einer Menge von 0,1 bis 10 g/l zu Beginn oder im Verlauf der Fermentation auf einmal oder mehrmals zugegeben werden. Wenn man 2,6,6-Trimethyl -1 - acetylcyclohexen - (1) zusammen mit jß-Jonon verwendet, so beträgt die Menge an ersterem dann 0,1 bis 6 g/l und die Menge an ß-Jonon 0,1 bis 4 g/l. Vorzugsweise verwendet man eine Menge zwischen 0,5 und 2 g/l an 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l) allein oder ein solches Gemisch, daß das Medium 0,3 bis 1,5 g/l an 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l) und 0,2 bis 1 g/l an /3-Jonon enthält, und führt die Zugabe nach 1 bis 3 Züchtungstagen durch. Gleichgültig, welche Menge zugegeben wird und zu welchem Zeitpunkt die Zugabe dieser Produkte erfolgt, ist es zweckmäßig, die Züchtung 6 bis 10 Tage nach der Beimpfung fortzusetzen, um die maximale Produktion an /5-Carotin zu erzielen. Das Züchtungsmedium kann variieren, doch enthält es im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, Antioxydantien, oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel und Vorläufer.

809 519/201

3 4

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man gebracht. Nach Abkühlen setzt man die folgenden SubKohlenhydrate, wie beispielsweise Glucose, Dextrine, siänzen zu: Stärke oder tierische oder pflanzliche Öle, wie bei- stärke 60 s

spielweise Schmalzöl, Sojaöl oder Baumwollsamenöl, Soiaöl 35 ecm

verwenden. Die geeigneten assimilierbaren Stickstoff- 5 _B^_{umwollsamenö}i" ]; ]; ] ] \ ] [ [ ] [ [ ] [ [ [ ] _{35 ccm}

quellen sind außerordentlich verschiedenartig: Sie Polyoxyäthylensorbitanmonooleat

können chermsche Verbindungen oder komplexe Sub- mit etwa 80 Oxyäthylengruppen .... 5 g

stanzen sein, die den Stickstoff hauptsächlich in pro- Hefeextrakt 1ε

teidischer Form enthalten, wie beispielsweise Casein, Λ/Γ_ηηΛ^ΐπ,™^ήϊ,' + λ Ι η-

Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Soja- xo Monokauumphosphat 0,5 g

mehle, Arachismehle, Hefeextrakte, lösliche Brennerei- ^Sff f Ti™/ 0'It

,, , , ji-1 J^a-- ίι Thiamm-hydrochlorid 0,01 g

scnlempebestandteile und Maisquellwasser.

Unter den zugesetzten Mineralstoffen können ge- Man füllt mit destilliertem Wasser auf 1000 ccm auf

wisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende und fügt 4 g Succinimid zu. Das Gemisch wird mit Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali-oder 15 einigen Tropfen 1Ö η-Natronlauge auf pH 6,3 ein-Erdalkaliphosphate. gestellt, in 300-ccm-Erlenmeyerkolben in einer Menge

Unter den Wachstumsfaktoren ist der am häufigsten von 50 ccm je Kolben verteilt und dann 20 Minuten verwendete das Vitamin B₁ oder Thiamin. Unter den bei 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen bringt man Antioxidantien kann man das Ν,Ν'-Diphenyl-p-phe- unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben 0,5 ccm nylendiamin, das ^^-Trimethyl-o-äthoxy-l^-dihy- 20 einer sterilen l%ig^en Lösung von 2,2,4-Trimethyldrochinolin, die Ascorbinsäure oder die Sorbinsäure o-äthoxy-l^-dihydrochinolin in Leuchtpetroleum ein. nennen. Die oberflächenaktiven Mittel sind Vorzugs- Jeder Kolben wird anschließend mit 5 ccm einer geweise von nichtionischer Art, wie beispielsweise Sorbit- rührten bzw. geschüttelten Kultur, die zwei Formen derivate mit Fettsäuren _oder Produkte auf der Basis + und — des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 von Kondensaten von Äthylenoxyd. Unter den Ver- 25 und NRRL 2457) enthält und 48 Stunden gealtert dickungsmitteln sind die am häufigsten verwendeten wurde, beimpft. Die Kolben werden anschließend auf Stärke, Carboxymethylcellulose, Agar. einen Drehtisch, der mit 220 UpM rotiert wird, in

Das 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l) ist auch einem Brutschrank bei 26° C gbracht. Nach 2tägiger mit den bereits vorgeschlagenen folgenden Hilfssub- Inkubation werden die Kolben in drei gleiche Anteile stanzen verträglich: 30 geteilt, und es werden zu jedem Kolben die folgenden

!.Verbindungen mit einer Amidfunktion, d.h. Zugaben unter sterilen Bedingungen zugegeben:

Amide der allgemeinen Formel

Erster Anteil:

RCONR₁R₂ (I) 0,5 ccm Leuchtpetroleum,

in der R ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit 35 Zweiter Anteil·

j -j , . j · 1 .. · ·? ■ 0,5 ecm Leuchtpetroleum,

oder voneinander verschieden sein können, jeweils ein ^v

Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit höchstens Dritter Anteil:

4 Kohlenstoffatomen darstellen, oder Dicarbonsäure- 40 50 mg 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l)

imide der allgemeinen Formel [TMACH], gelöst in 0,5 ccm Leuchtpetroleum.

^ CO ^^ Die Züchtungen werden unter den gleichen Bedin-

R₃ J^NX (II) gungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch

^^ QO 45 weitere 8 Tage fortgesetzt. Nach dieser Zeitspanne ist

die Produktion an /3-Carotin in allen Kolben maximal.

oder Lactame der allgemeinen Formel Die Bestimmung des /S-Carotins wird wie folgt durch

geführt: Das Mycel wird durch Filtrieren abgetrennt,

^ NH mit Wasser gewaschen und dann über Nacht im Va-

R₃ I (ΙΠ) 50 kuum bei 35°C getrocknet. Das Trockenmycel wird

^^ QQ dann mit Hexan extrahiert. Man trennt das /?-Carotin

von den anderen vorhandenen Carotinoiden durch eine

in denen R₃ einen zweiwertigen aliphatischen Kohlen- Chromatographie des Extrakts an Aluminiumoxyd ab. Wasserstoffrest mit höchstens 8 Kohlenstoffatomen Die das /?-Carotin enthaltenden Elutionsfraktionen und X ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder einen 55 werden vereinigt, und der Gehalt wird spektrophoto-Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit höchstens 4 Kohlen- metrisch gegen eine reine /S-Carotinprobe bestimmt. Stoffatomen bedeutet. · Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

2. Dialkylsulfoxyde, deren Alkylreste jeweils maximal 4 Kohlenstoffatome enthalten. Erster Anteil (ohne Vorläufer): Das so hergestellte Züchtungsmedium wird an- 60 H_{50 mg} ß-Carotin pro Liter, schließend mit einer Kultur der Formen -f- und — von

Blakeslea trispora (NRRL 2456 und 2457) beimpft. Zweiter Anteil (mit 1 g 2,2,6-Trimethyl-cyclohexanon

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. pro Liter):

Beispiel 1 _6g ^{1375 m}§ ^"Carotin pro Liter.

Man stellt ein Züchtungsmedium A wie folgt her: Dritter Anteil (mit 1 g 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcycloccm Wasser, das 60 g lösliche Brennereischlempe- hexen-(l) pro Liter): bestandteile enthält, werden 15 Minuten zum Sieden 1870 mg/S-Carotin pro Liter.

Beispiel 2

Man stellt ein Züchtungsmedium B, wie im Beispiel 1 für das Medium A angegeben, her, wobei man jedoch unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben nach Sterilisation und Abkühlen außer dem Antioxydationsmittel in Lösung in Leuchtpetroleum 200 mg Pyrrolidon-(2) einbringt. Die Kolben werden anschließend unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation werden die Kolben in zwei gleiche Anteile geteilt, und in jeden Kolben werden unter sterilen Bedingungen die folgenden Zusätze zugegeben:

Erster Anteil:
0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Beispiel 4

Man stellt das durch Zugabe des Antioxydationsmittels in Leuchtpetroleum vervollständigte Medium C wie im Beispiel 3 beschrieben her. Die dieses Medium enthaltenden Kolben werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation werden die Kolben in sieben gleiche Anteile geteilt, und jeder Kolben erhält unter ίο sterilen Bedingungen die folgenden Zusätze:

Erster Anteil:

50 g TMACH in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum. Zweiter Anteil:

¹S 50 mg TMACH und 10 mg jß-Jonon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Zweiter Anteil: Dritter Anteil:

50 mg 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l) 50 mg TMACH und 20 mg ß-Jonon in Lösung in

[TMACH] in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum. ₂o 0>5 ecm Leuchtpetroleum.

Vierter Anteil:

50 mg TMACH und 30 mg /?-Jonon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Nach Vornahme dieser Zugabe werden die Züchtungen bei den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch weitere 8 Tage fortgesetzt.

Die wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführte 25 Fünfter Anteil:

Bestimmung des /3-Carotins ergibt die folgenden Pro- 50 mg TMACH und 40 mg /?-Jonon in Lösung in

duktionen: 0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Erster Anteil ohne Vorläufer:

1360 mg /3-Carotin pro Liter.
Zweiter Anteil mit TMACH:

1820 mg /3-Carotin pro Liter.

Beispiel 3

Man stellt ein Züchtungsmedium C, wie im Beispiel 1 für das Medium A beschrieben, her, wobei man außer der Stärke, den Ölen und den anderen Bestandteilen 4 g Succinimid pro Liter zugibt. Nach Verteilen in Erlenmeyer-Kolben und Sterilisieren vervollständigt man das Medium außerdem durch eine unter sterilen Bedingungen vorgenommene Zugabe von Antioxydationsmittel in Lösung in Leuchtpetroleum zu jedem Kolben. Die Kolben werden anschließend unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen beimpft und inkubiert. Nach 2tägiger Inkubation werden die Kolben in zwei gleiche Anteile aufgeteilt, und jeder Kolben erhält unter sterilen Bedingungen die folgenden Zugaben:

Erster Anteil:
0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Zweiter Anteil:

50 mg 2,6,6-Trimethyl-l-acetylcyclohexen-(l)
[TMACH] in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Nach Vornahme dieser Zugaben werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch weitere 8 Tage fortgesetzt.

Nach der wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführten Bestimmung des ß-Carotins hat man die folgenden Produktionen erhalten:

Erster Anteil ohne Vorläufer:
1240 mg /3-Carotin pro Liter,

Zweiter Anteil mit TMACH:
1690 mg /?-Carotin pro Liter.

Sechster Anteil:

50 mg TMACH und 50 mg ß-Jonon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum.

Siebter Anteil:

50 mg j8-Jonon in Lösung in 0,5 ecm Leuchtpetroleum.
35

Nach Einbringen dieser Zusätze werden die Züchtungen unter den gleichen Bedingungen bezüglich Temperatur und Bewegung noch weitere 8 Tage fortgesetzt. Nach der wie im Beispiel 1 beschrieben durchgef ührten Bestimmung des /?-Carotins hat man die folgenden Produktionen erhalten:

Nr.	45	1	Vorläufer in	g/l	/J-Carotin in
der Anteile	2	TMACH j jE	J-Jonon	mg/1
3
4	1	0	1780
5° 5	1	0,2	1925
6	1	0,4	2010
7	1	0,6	2185
1	0,8	2205
1	1	2265
0	1	2065

55

60

Beispiel 5

In ein Fermentationsgefäß von 301 aus rostfreiem Stahl bringt man 1275 g lösliche Brennereischlempebestandteile und 111 Wasser ein.

Das Gemisch wird 10 Minuten unter Rühren bei 95°C erhitzt. Nach Abkühlen stellt man den pH-Wert mit 58 ecm 10 η-Natronlauge auf 6,45 ein und vervollständigt das Medium mit folgenden Ausgangsmaterialien:

Maisstärke 750 g

Sojaöl 450 ecm

Baumwollsamenöl 450 ecm

Hefeextrakt 15 g

Monokaliumphosphat 7,5 g

Claims

7 8

Mangansulfat-monohydrat 1,5 g Nach 40stündiger Züchtung bringt man bei den bei-

2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-l,2-dihydro- den Apparaturen Vorrichtungen zur kontinuierlichen

chinolin in 50°/₀iger Lösung Zugabe von hydratisierter Glucose unter den oben be*

in Äthanol 3 ecm schriebenen Bedingungen bezüglich Konzentration und

wäßrige Thiarnin-hydrochloridlösung 5 Dauer in Gang. Zum gleichen Zeitpunkt nimmt man

mit. 0,3 g/l 250 ecm steril die folgenden Zusätze vor:

_ ,_r , . , . „, ».,.-,. _rii In das erste Fermentationsgefäß: 15 g 2,6,6-Trime-

Das Volumen wird mit Wasser auf 151 eingestellt. thyl-l-acetylcyclohexen-(l) [TMACH] in steriler Lö-

Der pH-Wert des Gemisches hegt bra 6,45 Das Me- _{sun in 150 ccm Leucht}p_etroleum (entsprechend 1 g/l);

dram wird während 50 Minuten bei 122 C durch Ein- ίο . , . _ . ._„ ~L , „ . .' .

leiten von Dampf sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt ™^d™ ²^f Fermentationsgef aß: 22,5 g 2,6,6-Tn-

der pH-Wert 5,95 und das Volumen 14,51. Man setzt methyl-l-acetylcyclohexen-(l) m steriler Lösung m

dann unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 45 g ¹⁵° ^ccm Leuchtpetroleum (entsprechend 1,5 g/l).

Succinimid in 350 ccm Wasser und dann 150 ccm steril Die Bestimmung des bei diesen drei Fermentationen

filtriertes Leuchtpetroleum zu. Das Fermentations- 15 erzeugten/3-Carotins wird wie im Beispiel !beschrieben

gefäß wird anschließend mit 1500 ccm einer Impfkultur durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind die fol-

aus einem Fermentationsgefäß, die zwei Formen + und genden:
— des Stammes Blakeslea trispora (NRRL 2456 und

2457) enthält und 49 Stunden gealtert ist, beimpft. Die Arbeitsgang ohne Vorläufer:

Kultur wird bei 26° C unter Bewegung mit einer Tür- 20 770 mg ^-Carotin pro Liter,

bine mit 400 UpM und Belüftung mit einer Menge von _{Arbeitsgang ffiit Zugabe voft TM}ACH (1 g/l):

1,2 m³ steriler Luft je Stunde durchgeführt. ■ . ^v ' '

Nach 40stündiger Züchtung setzt man steril 150 ecm ¹²⁸° ^m§ /»-Carotin pro Liter,

Leuchtpetroleum zu und setzt eine Vorrichtung in Arbeitsgang mit Zugabe von TMACH (1,5 g/l):

Gang, die ermöglicht, der Kultur kontinuierlich zwi- 25 1445 _mg ß-Carotin pro Liter,
sehen dem 2. und 6. Fermentationstag 1000 ccm einer

sterilen wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 450 g Patentanspruch.·
hydratisierter Glucose zuzuführen. Es werden die

gleichen Bedingungen bezüglich Belüftung, Bewegung Verfahren zur Herstellung von /J-Carotin durch

und Temperatur während der 5 Tage, während deren 30 aerobe Fermentation einer Kultur der Formen

die Züchtung fortgesetzt wird, aufrechterhalten. + und — von Blakeslea trispora in einem hierfür

In zwei anderen Fermentationsgefäßen von 301 üblichen Nährmedium unter üblichen Züchtungs-

stellt man in gleicher Weise das oben beschriebene Me- bedingungen, dadurchgekennzeichnet,

dium unter Vervollständigung mit den gleichen Zu- daß man dem Nährmedium 2,6,6-Trimethyl-l-ace-

sätzen her. Das Medium wird mit der gleichen Impf- 35 tylcyclohexen-(l) allein oder zusammen mit jö-Jo-

kultur beimpft, und die Züchtung wird während der non zusetzt,
gesamten Fermentationsdauer (7 Tage) unter den oben

beschriebenen Bedingungen bezüglich Belüftung, Be- In Betracht gezogene Druckschriften:

wegung und Temperatur durchgeführt. Französische Patentschrift Nr. 1 325 656.

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