DE1949719C2 - Mikrobiologische Herstellung von Dextranase - Google Patents
Mikrobiologische Herstellung von DextranaseInfo
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Description
Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch genannte Verfahren.
Teilweise durch Dextranase hydrolysiertes Dextran ist zur Herstellung von Blutserum-Ersatzstoffen verwendet
worden. In letzter Zeit ist Dextranase auf verschiedenen Anwendungsgebieten eingesetzt worden,
so z. B. auf dem Gebiet der Zahnhygiene (z. B. als enzymatische Zubereitung zur Verhinderung von
Zahnkaries oder Zahnsteinablagerung).
Es ist auch bekannt, daß Dextranase durch Kultivierung
von Mikroorganismen gewonnen werden kann, die zur Gattung Penknllium, Aspergillus, Verticillium und
Spicaria sowie Celluvibrio gehören (vgl. z. B. Acta.
Chem. Scand. 3,1405 [1949]; US-PS 27 09 150; J. BacL 64,
513 [1952]; Acta. Chem. Scand. 2, 803 [1948]; und
Canadian Journal of Microbiology 3, 239 [1957] und US-PS 27 42 399).
Nach dem Stand der Technik wurde es angestrebt, Dextran als Blutserum-Ersatzstoff herzustellen. Danach
war man jedoch stets bestrebt, eine Dextranase zu gewinnen, die nur zu einer begrenzten Zersetzung des
Dextrans Anlaß geben sollte, während kein besonderes Interesse an anderen charakteristischen Kennzeichen
dieses Enzyms bestand.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Dextranase
vorzuschlagen, die sich im Hinblick auf ihre Eigenschaften, wie eine besondere Wirksamkeit und Stabilität, z. B.
innerhalb optimaler pH-Bereiche, von der herkömmlichen Dextranase unterscheidet, um für eine derartige
besondere Dextranase neue Anwendungsbereiche zu erschließen, wobei z. B. die Verhinderung von Zahnkaries
oder Zahnsteinablagerungen, die Reinigung von Rohrzucker usw. in Frage kommen soll.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Maßnahmen des Patentanspruchs gelöst.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß diese Arten, deren Dextranase bildende Aktivität bisher nicht
bekannt war, sehr gut zur biochemischen Herstellung von Dextranase in großem Maßstab geeignet sind.
Geeignete Stämme dieser Arten sind bekannt und wemerj in der nachfolgenden Aufstellung beispielsweise
genannt. In dieser Aufstellung sind in der rechten Spalte die Literaturstellen angegeben, in denen die mykologischen
Merkmale der betreffenden Mikroorganismen beschrieben sind. Die Code-Nummern, die angegeben
sind, sind solche der Anmelderin zur genauen Klassifizierung.
Chaetomium spirale F-216-3
Chaetomium gracile F-212-8
Chaetomium gracile F-212-8
(Fermentation Research Institute of Japan, Deposit No. 334)
Journal of General and Applied Microbiology 6, 223-251(1960)
(Fermentation Research Institute of Japan Deposit No. 337)
»Pathogenic microbiology« (part Bacertia),
956-957 (1966), Igakushoin, Japan
Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung in der Praxis wird ein geeigneter Dextranaseerzeugender
Stamm einem flüssigen oder festen Kulturmedium eingeimpft, das verschiedene Nährstoffe
enthält, die üblicherweise für ein künstliches oder ein natürliches Medium verwendet werden. Die Kultivierung
wird dann in der Regel durch Oberflächenkultivierung oder submerse Kultur durchgeführt Geeignete
Nährmedien sind unter anderem beispielsweise Weizenkleie, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Stärke,
Glucose, Saccharose, Ammoniumsulfat Harnstoff und verschiedene andere anorganische Salze. Eine
Zufügung von 1-2% Dextran zum Kulturmedium ist besonders vorteilhaft da eine solche Zugabe in der
Regel die Dextranase-Produktivität bis auf das lOfache
oder noch mehr erhöht, und zwar im Vergleich mit der Kultivierung unter Bedingungen, in denen kein Dextran
vorhanden ist Die geeignete Züchtungstemperatur liegt bei etwa 300C Geeignete pH-Werte liegen im Bereich
von etwa 5,5 bis 7,0. Die Kultivierungszeit schwankt in Abhängigkeit von den sonstigen Kultivierungs-Bedingungen.
In der Regel liegt sie jedoch bei etwa 3 bis 5 Tagen, in welcher Zeit ein maximaler Gehalt der
gewünschten Dextranase erzielt wird.
Die Isolierung und gegebenenfalls Reinigung der Dextranase aus der flüssigen Kulturbrühe kann in der üblichen Weise durchgeführt werden, die zur Gewinnung von Enzymen aus Fermentationsbrühen bekannt ist Beispielsweise kann die durch die Kultivierung erhaltene Kulturbrühe einer der folgenden Behandlungen unterworfen werden; Konzentration unter vermindertem Druck, Aussalzen mit Natriumsulfat oder NaHumchlorid, fraktionierte Ausfällung mit Methanol, Äthanol, Acetor. oder einem ähnlichen Lösungsmittel, Adsorptions-Elutions-Zyklen unter Verwendung eines geeigneten Adsorptions-Materials, Ausfällung unter Verwendung eines Protein-fallenden Mittels, Ausfällung beim isoelektrischen Punkt, Abtrennung von Verunreinigungen mit einem Schwermetall, elektrische Dialyse usw. Diese Behandlungsmethoden können alleine oder in Kombination angewandt werden, wobei eine Dextranase der gewünschten Reinheit erhalten werden kann.
Die Isolierung und gegebenenfalls Reinigung der Dextranase aus der flüssigen Kulturbrühe kann in der üblichen Weise durchgeführt werden, die zur Gewinnung von Enzymen aus Fermentationsbrühen bekannt ist Beispielsweise kann die durch die Kultivierung erhaltene Kulturbrühe einer der folgenden Behandlungen unterworfen werden; Konzentration unter vermindertem Druck, Aussalzen mit Natriumsulfat oder NaHumchlorid, fraktionierte Ausfällung mit Methanol, Äthanol, Acetor. oder einem ähnlichen Lösungsmittel, Adsorptions-Elutions-Zyklen unter Verwendung eines geeigneten Adsorptions-Materials, Ausfällung unter Verwendung eines Protein-fallenden Mittels, Ausfällung beim isoelektrischen Punkt, Abtrennung von Verunreinigungen mit einem Schwermetall, elektrische Dialyse usw. Diese Behandlungsmethoden können alleine oder in Kombination angewandt werden, wobei eine Dextranase der gewünschten Reinheit erhalten werden kann.
Die enzymatische Aktivität von Dextranase kann wie folgt bestimmt werden: 5 ml einer M/20 Acetat-Puff erlösung
(pH 5,1) mit 4,95% Dextran wird mit 0,5 ml einer geeigneten verdünnten Enzym-Lösung versetzt, und die
Versuchsmischung wird bei 4O0C aufbewahrt. Es wird die Zeit gemessen, die erforderlich ist, um die
Anfangsviskosität des Dextrans auf die Hälfte herabzusetzen (diese wird nachfolgend als »Halbwerts-Zerfalls*
' zeit« bezeichnet), Der gemessene Wert ist proportional der enzymatischen Aktivität,
Die technische Fortschrittlichkeit der Erfindung gegenüber dem nächstüegenden Stand der Technik, wie
er durch die US-Patentschrift 27 42 399 repräsentiert wird, ergibt sich aufgrund der nachfolgend beschriebenen
Vergleichsversuche, deren Ergebnisse in der weiter unten folgenden Tabelle zusammengefaßt sind.
Zur Durchführung der Versuche wurde unter Anwendung eines mikrobiologischen Verfahrens Dextranase
hergestellt unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der nachfolgend
angegebenen erfindungsgemäß eingesetzten, Dextranase bildenden Mikroorganismen einerseits:
15
(A) Chaetomium ,uracile
(B) Chaetomium epirale
(C) Sporotrichum asteroides
bzw, gemäß dem Stand der Technik (US-PS 27 42 399) unter Verwendung der folgenden Mikroorganismen
andererseits:
(1) Apsergillus fumigatus
(2) Penicillium funiculosum
(3) Penicillium lilacinunt
(4) Penicillium luteum
(5) Penicillium verruclosum
(6) Spicaria violacea
Eingesetzter | Stabiler pH-Wertbereich | Optimale Temperatur | Bemerkungen |
Mikroq«r£anismus | (0C) | ||
(A) | 5 -10 | 65 | |
(B) | 4-8 | 65 | |
(C) | 5 -10 | 60 | |
(1) | 3-6 | 55 | |
(2) | 6 - 7,5 | 40 | Bbchimica et Bio- |
physica Acta, 309, | |||
:i973) 357-562 | |||
(3) | 6 - 8,5 | 60 | Can. J. Microbiol., 3 |
(1957), 239-247 | |||
(4) | 3,5- 7 | 50 | J. Biochem., 69, |
1113-1121 (1971) | |||
(2) | |||
(3) | 4,J- 7,9 | 40 | J. Bacteriol.,64, |
(5) (6) |
513-519(1952) | ||
Wie aus den vorstehenden Angaben hervorgeht, 40 dem Stand der Technik hergestelltem Dextranase
weist die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eindeutig überlegen, was für den Fachmann keineswegs
vorhersehbar war.
Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren noch näher erläutern.
hergestellte Dextranase nicht nur eine ausgezeichnete Stabilität bei hoher Temperatur, sondern gleichzeitig
auch eine ausgezeichnete Stabilität innerhalb eines breiten pH-Wertbereiches auf und ist somit der gemäß
100 ml eines flüssigen Kulturmediums (auf pH 6,0 eingestellt), welches 1% Kartoffelstärke, 0,5% Maisquellwasser,
03% Pepton und 03% Sojabohnenmehl enthält, wird ohne Dextran oder zusammen mit 1%
Dextran in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben,
sterilisiert und da.nn mit den verschiedenen nachfolgend
genannten Stämmen geimpft. Die Kultivierung erfolgt durch Schüttelkultur bei 3O0C 4 Tage lang. Die
enzymatische Dextranase-Aktivität der so erhaltenen Kulturbrühe wird bestimmt. Die Versuchsergebnisse
der einzelnen Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
Halbwerts-Zcrfallszeit
Ohne Zugabe von Dextran
(keine Verdünnung)
Ohne Zugabe von Dextran
(keine Verdünnung)
Mit Zugabe von Dextran (4fache Verdünnung)
Chaetomium spirale F-216-3
Chaetomium gracile F-212-8
Chaetomium gracile F-212-8
60 Min.
60 Min.
60 Min.
(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung 150 Sek.)
(Wasser als Kontrolle IO Sek.)
15 Min. 15 Min.
Θη festes Kulturmedium wird dadurch hergestellt,
daß Weizenkleie mit der halben Menge Sojabohnenmehl
ohne oder zusammen mit 2% Dextran vermischt werden und dazu eine gleiche Menge Wasser gegeben
wird, wobei eine pastige Masse erhalten wird. Nach Sterilisation wird dieses feste Kulturmedium mit den
verschiedenen nachfolgend genannten Stämmen geimpft Die Kultivierung wird 5 Tage lang nach der
Koji-Kultivierungs-Methqde bei 3O0C durchgeführt.
Die Kultivierungsmasse wird mit Wasser in einer
Menge von 10 oder IQO Teilen der erwähnten festen
Masse extrahiert Der wäßrige Extrakt wird zur Bestimmung der eitzymatjschen Aktivität untersucht
Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengestellt
10
Benutzter Stamm
Halbwerts-Zerfallszeit
Ohne Dextran
(Extraktion
mit 1OX Wasser)
Ohne Dextran
(Extraktion
mit 1OX Wasser)
Mit Dextran
(Extraktion
mit 100 X Wasser)
Chaetomium spirale F-216-3
Chaetomium gracüe F-212-8
Chaetomium gracüe F-212-8
30 Min. 30 Min.
(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung 150 Sek.) (Wasser als Kontrolle 10 Sek.)
13 Min.
16 Min.
16 Min.
Die unter Verwendung von Dextran erhaltene Kultivierungsmasse von Beispiel 2 wird mit Wasser in
einer Menge von 3 Volumteilen pro Volumteil der Masse extrahiert Zu der erhaltenen Enzymlösung wird
Aceton in einer Menge von 3 Volumteilen pro Teil der Enzymlösung gegeben. Der erhaltene Niederschlag
wird durch Filtration abgetrennt und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Eine Enzymprobe
wird so als weißes Pulver erhalten. Die Ausbeute beträgt 3-5% berechnet auf das Gesamtgewicht der
eingesetzten festen Nährmedium-Komponenten. Die enzymatische Aktivität dieser Probe wird wie folgt
festgestellt
Benutzter Stamm
35 Halbwerts-Zerfallszeit
der 0.05% Enzym-Probenlösung
der 0.05% Enzym-Probenlösung
Chaetomium spirale F-216-3 25 Min.
Chaetomium gracile F-212-8 20 Min.
Chaetomium gracile F-212-8 20 Min.
(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung
(V-'asser als Kontrolle
(V-'asser als Kontrolle
150 Sek.) 10 Sek.)
100 ml eines flüssigen Kulturmediums (auf pH 6,0 eingestellt), welches 1% Kartoffelstärke, 0,5% Maisquellwasser,
0,5% Pepion und 0,5% Sojabohnenmehl enthält, wird ohne Zugabe von Dextran oder mit 1%
Dextran Li einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben,
sterilisiert und dann mit dem nachfolgend genanntem Stamm geimpft. Die Kultivierung wird 4 Tage lang als
so Schüttelkultur bei 30° C durchgeführt Die enzymatische Dextranase-Aktivität der Kulturbrühe wird bestimmt.
Die jeweils erhaltenen Versuchsergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.
Benutzter Stamm
Halbwerts-Zerfallszeil
Ohne Dextran
(keine Verdünnung)
Ohne Dextran
(keine Verdünnung)
Mit Dextran
(4fäche
Verdiinnung)
90 Min. 20 Min.
(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischun;·, 150 Sek.)
(Wasser als kontrolle 10 Sek.)
Ein festes Kulturmedium wird dadurch hergestellt, daß Weizenkleie mit seiner halben Menge Sojabohnenmehl
vermischt wird, einmal ohne Zugabe von Dextran und das andere Mal mit 2% Dextran. Dann wird zu
diesem Gemisch die gleiche Menge Wasser gegeben, wobei eine pastige Masse erhalten wird. Nach
Sterilisation wird dieses feste Kulturmedium mit dem
nachfolgend genanntem Stamm geimpft. Die Kultivierung wird nach der Koji-Kultivierungs-Methode 5 Tage
lang bei 30°C durchgeführt. Die Kultiviervngsmasse wird mit Wasser in einer Menge von 10 bzw. 100 Teilen
pro Teil der Masse extrahiert Der wäßrige Extrakt wird auf seine enzymatische Aktivität untersucht. Die
Versuchsergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengestellt.
(HxIr.iktion
mil WX Wasser)
(Extraktion
mit 100X Wasser)
10 Min.
55 Min.
(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung 150 Sek.)
(Wasser als Kontrolle 10 Sek.)
Aktivität wird untersucht, wobei das folgende Ergebnis erhalten wird.
Die in Gegenwart von Dextran erhaltene Kultivierungsmasse von Beispiel 5 wird mit Wasser in einer
der erhaltenen Enzymlösung wird Aceton in einer jn Benutzter Stamm
Menge von 3 Volumteilen pro Teil der Enzym-Lösung gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch
Druck getrocknet. Es wird so als weißes Pulver eine Enzym-Probe erhalten. Die Ausbeute beträgt 3-5%,
berechnet auf das Gesamtgewicht der anfänglichen festen Nährmedium-Komponenten. Die enzymatische
Halbwerts-Zerfallszeit
einer 0.01% Enzym-Proben-Lösuiig
einer 0.01% Enzym-Proben-Lösuiig
(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung 150 Sek.)
(Wasser als Kontrolle 10 Sek.)
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Dextranase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Dextranase erzeugender Stamm von Chaetomium spirale, Chaetomium gracile und/oder Sporotrichum asteroides in einem geeigneten Nährmedium kultiviert und aus dem kultivierten Nährmedium die darin angereicherte Dextranase abgetrennt und gegebenenfalls gereinigt wird.
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JP7202668 | 1968-10-03 | ||
JP8087168 | 1968-11-05 | ||
JP510869 | 1969-01-24 | ||
JP3600469 | 1969-05-10 |
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Publication Number | Publication Date |
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ID=27454231
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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NL (1) | NL6914830A (de) |
SE (1) | SE360380B (de) |
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AU5830373A (en) * | 1972-07-28 | 1975-01-23 | Kenneth Trevor Glasziou | Biological products |
JPS58118509A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-14 | Lion Corp | 口腔用組成物 |
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- 1969-10-01 GB GB48361/69A patent/GB1240620A/en not_active Expired
- 1969-10-02 DE DE1949719A patent/DE1949719C2/de not_active Expired
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GB1240620A (en) | 1971-07-28 |
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DE1949719A1 (de) | 1970-05-06 |
FR2019829A1 (de) | 1970-07-10 |
NL6914830A (de) | 1970-04-07 |
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SE360380B (de) | 1973-09-24 |
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