DE810534C - Verfahren zur Erzeugung von Streptomycin - Google Patents

Description

• Verfahren zur Erzeugung von Streptomycin Gegenstand der Erfindung sind Verbesserungen in der Erzeugung von Streptomycin.
• Es ist bekannt, daß Streptomycin durch das Wachstum des Mikroorganismus Streptomyces griseus, der auch unter dem Namen Actinomyces griseus bekannt ist, in geeigneten Kulturmedien erzeugt wird. Schatz, Bugie und Waksman haben in Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 1944, Bd. 55, S. 66, berichtet, daß die Zusammensetzung des Mediums, auf dem der Nfikroorganismus aufwächst, von erheblicher Wichtigkeit ist und daß die Anwesenheit eines Peptons und einer spezifischen, das Wachstum fördernden Substanz, wie Fleischextrakt oder Maisinfusion, für die Erzeugung des Streptomycins notwendig ist. In der britischen Patentschrift 613 469 ist dargelegt, daß man gefunden hat, daß die Verwendung von Proteinhydrolysat und/oder Fleischextrakt die Isolierung der antibiotischen Substanz erschwert und daß daher die Benutzung von Nährböden, die solche Materien enthalten, aus diesem und anderen Gründen unerwünscht ist. Infolgedessen wurde die Verwendung von gewissen pflanzlichen Mehlen, gemahlenes Korn, Mehlinfusionen, z. B. Warmwasserextrakte von Bohnenmehl, Erdnüssen, Baumwollsamen und Leinölsamen, als einzige Quelle von stickstoffhaltigen und das Wachstum fördernden Substanzen in Vorschlag gebracht.
• Diese vorgeschlagenen Zusatzstoffe für die Wachstumsnährböden sind jedoch nicht zufriedenstellend und geben nicht immer dieselben guten Ergebnisse wie die Standardnährböden, die bisher verwendet wurden und die z. B. Bactopepton und Fleischextrakt enthielten. Darüber hinaus sind diese Substanzen verhältnismäßig teuer und nicht immer leicht zu haben.
• Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Erzeugung von Streptomycin, das zum mindesten einen Teil der obenerwähnten Schwierigkeiten beseitigt.
• Die vorliegende Erfindung betrifft daher neue Verfahren oder Verfahrensstufen, deren besondere Ausführungsformen aus den Beispielen später ersichtlich werden sollen und die zeigen, wie die Erfindung praktisch ausgeführt werden soll.
• Es wurde gefunden, daß ein Nährmittel, das leicht zugängliche und billige Bestandteile enthält, mit sehr zufriedenstellendem Erfolg für die Streptomycinerzeugung verwendet werden kann.
• Nach der vorliegenden Erfindung besteht das Verfahren darin, daß ein Stamm von Actinomyces, wie z. B. Streptomyces griseus, in oder auf einem Nährsubstrat gezogen wird, der@Fischmehl enthält.
• Die Erzeugung von Streptomycin kann noch dadurch erhöht werden, daß das Substrat zusätzlich zu dem Fischmehl eine gewisse Menge getrockneter oder autolysierter Hefe oder Hefenextrakt enthält.
• Die Nährlösungen, die nach der Erfindung benutzt werden, kosten nur einen Bruchteil der Standardlösungen, die Baktopepton und Fleischextrakt enthalten. Trotzdem sind die Ausbeuten an Streptomycin, die damit erhalten werden, ebenso gut, wenn nicht besser als die mit den teuren Standardmedien erhaltenen.
• Die Erfindung ist für die Kultur der Streptomvcin erzeugenden Organismen nach den Oberflächen- wie nach dem Tieftank- oder Untertauchverfahren anwendbar, wobei das letztere natürlich das geeignetere ist, da es sich wirtschaftlich besser für die Großerzeugung anpassen läßt.
• Die flüssige Nährlösung, die nach der Erfindung zur Anwendung gelangt, muß die Nährsalze und die assimilierbaren Kohlehydrate enthalten, die für das Wachstum der Organismen wesentlich sind. Anwendbare Nährsalze begreifen Natrium- und Magnesiumchlorid und -sulfate, ferner Eisensulfat und Mischungen dieser Salze ein, wie sie in dieser Technik geläufig sind. Ebenso sind die assimilierbaren Kohlehydrate, die angewendet werden können, ganz allgemein bekannt. Es sind dies beispielsweise Dextrose, Glucose, Melasse, Stärke u. dgl.
• Der Ausdruck Fischmehl, wie er in der Patentbeschreibung und den Patentansprüchen gebraucht ist, soll verdautes Fischmehl, z. .B. mit Pankreatin verdautes Fischmehl, oder unverdautes Fischmehl oder auch Extrakt von Fischmehl umfassen. Das Fischmehl kann aus irgendeiner Art von Fisch hergestellt sein. Es soll hier bemerkt werden, daß die Zusammensetzung des Fischmehls sich mit der Art der verarbeiteten Fische, wie sie gerade erhältlich sind und je nach der Jahreszeit auf den Markt kommen, ändert. Das Fischmehl, das aus weißen Fischen gewonnen wird, eignet sich am besten für die Zwecke der Streptomycinerzeugung, obgleich Fischmehl, das ganz oder teilweise aus anderen Fischsorten hergestellt ist, ebenfalls mit zufriedenstellendem Ergebnis Verwendung finden kann.
• Das Kulturmedium für die Erzeugung von Streptomycin muß natürlich sehr sorgfältig vor dem Gebrauche sterilisiert werden. Dies wird zweckmäßig durch Erhitzen des Kulturmediums in Autoklaven vorgenommen, nachdem alle notwendigen Bestandteile zugesetzt worden sind. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Fischmehl einer vorläufigen Sterilisation zu unterziehen, bevor die anderen Bestandteile des Mediums zugesetzt sind, worauf das Medium sodann vor der Verwendung gründlich sterilisiert@wird. Es ist am zweckmäßigsten, das Kulturmedium im Gärungsgefäße selbst durch Erhitzen der Nährlösung in dem Gärgefäße mit Dampf unter Druck auf Temperaturen von ungefähr 12o° C während 2 oder 3 Stunden zu sterilisieren und sodann das Kulturmedium abzukühlen oder abkühlen zu lassen auf die Temperatur, bei welcher die Vergärung durchgeführt werden soll.
• Der Fischmehlextrakt, der nach der Erfindung Anwendung finden soll, ist am zweckmäßigsten ein wässeriger Extrakt. Vorteilhafterweise verfährt man jedoch derart, daß man an Stelle der gesonderten Herstellung des Extrakts und der Zugabe des fertigen Extrakts zu der Nährlösung diese mit Fischmehl ansetzt und sie darauf sterilisiert und vor dem Gebrauch filtriert, worauf das so filtrierte Medium tatsächlich einen Extrakt aller festen Substanzen, die ursprünglich in dem Kulturmedium vorhanden waren, darstellt.
• Die Menge Fischmehl, die in dem Kulturmedium vorhanden sein soll, kann in verhältnismäßig weiten Grenzen schwanken, wie z. B. zwischen 0,3 bis 2 °;o auf Gewichtsbasis. Es wird aber vdrgezogen, eine Nährlösung zu verwenden, d:e ungefähr 0,70/',Fischmehl enthält. Die zusätzlichen Materialien, wie z. B. Trockenhefe oder autolysierte Hefe oder Hefenextrakt, die in dem Nährmedium enthalten sein können, werden zweckmäßigerweise in Mengen dem Medium einverleibt, die geringer sind als die des Fischmehls. Ein sehr zufriedenstellendes Nährmedium enthält z. B. ungefähr 0,7 Gewichtsteile Fischmehl und ungefähr 0,3 °/o trockene autolysierte Hefe.
• Das Verfahren zur Herstellung von Streptomycin wird, abgesehen von dem neuartigen Nährmedium, in üblicher Weise aasgeführt, und die Temperatur, der pH-Wert, die Arten und Geschwindigkeit der Rührung und alle die anderen Behandlungsmöglichkeiten werden entsprechend den Bedingungen, die- sonst für die Streptomycinerzeugung' bekannt und üblich sind, gewählt.
• Die folgenden Beispiele sollen zeigen, in welcher Weise die Erfindung praktisch ausgeführt werden kann. Sie stellen jedoch keine Beschränkung der Erfindung dar. Die letztere ist in den Patentansprüchen enthalten. Die Prozentzahlen sind Gewichtsprozente, mit Ausnahme derer, bei denen dies ausdrücklich vermerkt ist. Beispiel i Ein wässeriges Nährmedium, das 0,7()/, Fischmehl, 0,30/(, getrocknete autolysierte Hefe, il)/, Glucose, o,50/0 Natriumchlorid, 0,0250,', Magnesiumsulfat, o,ooi °/a Ferrosulfat, Rest Wasser enthält, wurde im Autoklaven sterilisiert und das Medium sodann mit einer Sporenaufschwemmung von Actinomyces griseus geimpft. Die Vergärung wurde nach dem Untertauchverfahren unter aeroben Bedingungen bei 280 C mit lebhafter Rührung und Lüftung mit steriler Luft durchgeführt. Nach Ablauf von 5 Tagen war der Streptomycintiter in der erhaltenen Brühe Z99 Einheiten im Kubikzentimeter. Das erzeugte Streptomycin wurde nach üblichen Verfahrensmethoden getrennt und gereinigt.
• Ein Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie das oben verwendete wurde durch Erhitzen für 3 Stunden bei 12o° C in der gewöhnlichen Weise sterilisiert und das sterilisierte Medium vor der Verwendung filtriert. Das filtrierte Medium wurde geimpft und die Vergärung wie oben beschrieben ausgeführt. Nach Ablauf von 5 Tagen wurde der Streptoniycintiter in der erzeugten Brühe mit 220 Einheiten im Kubikzentimeter festgestellt.
• Wenn ein Nährmedium gleicher Zusammensetzung wie das oben verwendete, mit der Ausnahme, daß das Fischmehl durch die gleiche Menge mit Pankreatin verdauten Fischmehls ersetzt war, zur Anwendung gelangte, während die Vergärung in derselben Weise wie vorher durchgeführt wurde, wurde nach Ablauf von 5 Tagen ein Streptomycintiter in der Brühe von 2o6 Einheiten im Kubikzentimeter gefunden. Beispiel e Eine Reihe von 47 Gärungen wurde mit einem wässerigen Nährmedium der folgenden Zusammensetzung ausgeführt: o,7";', sterilisiertes Fischmehl, 0,3 °;'o getrocknete autolysierte Hefe, 1,o °/o Glucose, o,5 °/o Natriumchlorid, 0,025 °/o Magnesiumsulfat, o,ooZ °;'o Ferrosulfat, Rest destilliertes Wasser.
• Dies wurde sterilisiert und dann mit einer Sporenaufschwemmung von Actinomyces griseus geimpft. Die Vergärungen wurden bei 28° C unter Rühren und Lüftung ausgeführt, wobei die Rührer mit ungefähr 9oo Umdrehungen in der Minute arbeiteten und die Lüftung ein Liter steriler Luft je Liter Nährflüssigkeit in der Minute betrug.
• Nach Ablauf von 5 Tagen war der Streptomycintiter in der erzeugten Brühe im Durchschnitt 318 Einheiten im Kubikzentimeter. -Beispiel 3 Eine wässerige Nährflüssigkeit, die sich wie folgt zusammensetzte: 72 kg Fischmehl, 18 kg Trockenhefe -(autolysiert), 9o kg Glucose, 45 kg Kochsalz, 2,25 kg Magnesiumsulfat und 0,225 kg Schaumverhinderungsmittel Silicone wurde mit Wasser auf gooo Liter aufgefüllt und sterilisiert. Dies Medium wurde mit einer vegetativen Impfkultur von Streptomyces griseus (Stamm D. C. L. 5ooZ) geimpft. Die Vergärung wurde bei 27,7° C durchgeführt nach dem Tauchverfahren und unter aeroben Bedingungen, wobei gut gerührt wurde und die Lüftung ein Volumen steriler Luft auf je ein Volumen Nährflüssigkeit in der Minute betrug. Nach 44 Stunden wurde die Gärung eingestellt, als die Streptomycinerzeugung einen Höhepunkt erreichte und der Streptomvcintiter der erzeugten Brühe 182 Einheiten im Kubikzentimeter betrug. Das erzeugte Streptomycin wurde nach bekannten Methoden isoliert und gereinigt.
• Zum Zwecke eines Vergleichs wurde der folgende Ansatz verarbeitet: 45 kg Bactopepton, 29 kg Fleischextrakt, 9o kg Glucose, 45 kg Kochsalz, 2,25 kg Magnesiumsulfat, 0,225 kg Silicone wurden mit Wasser auf gooo Liter aufgefüllt und sterilisiert. Diese Nährlösung wurde mit einer vegetativen Impfkultur von Streptomyces griseus (D. C. L. Stamm 5ooZ) geimpft. Die Vergärung wurde unter genau den gleichen Bedingungen wie die vorstehend beschriebene bei 27,7° C mit lebhafter Rührung und Lüftung im Ausmaße von einem Volumen steriler Luft für je ein Volumen Nährflüssigkeit in der Minute durchgeführt. Die Gärung wurde nach 5o Stunden eingestellt, als die Streptomycinerzeugung ihren Höhepunkt erreicht hatte und der Streptomycintiter in der hergestellten Brühe 105 Einheiten im Kubikzentimeter betrug. Beispiel 4 Eine wässerige Nährlösung, die 1 °,!o Fischmehl, 1 °/o Glucose, o,5 °/o Kochsalz, 0,025 °/o Magnesiumsulfat, o,oof °/o Ferrosulfat, Rest destilliertes Wasser enthielt, wurde im Autoklaven sterilisiert. Das Medium wurde mit einer io °/oigen vegetativen Impfkultur von Actinomyces griseus geimpft. Die Vergärung wurde bei 28° C unter lebhaftester Rührung und Lüftung durchgeführt. Am Ende von 4 Tagen war der Streptomycintiter der gewonnenen Brühe 179 Einheiten im Kubikzentimeter. Das erzeugte Streptomycin wurde nach bekannten Methoden isoliert und gereinigt.

Claims (5)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Erzeugung von Streptomycin, dadurch gekennzeichnet, daß eine das Fischmehl enthaltende Nährlösung mittels eines Streptomycin erzeugenden Stammes von Streptomyces, wie z. B. Streptomyces griseus, vergoren wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung außer Fischmehl noch autolysierte Hefe oder Hefenextrakt enthält.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung feste Substanzen, im wesentlichen aus Fischmehl, Nährsalzen und assimilierbaren Kohlehydraten bestehend, enthält.
4. 4. Verfahren nach Anspruch Z, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung feste Substanzen, im wesentlichen aus Fischmehl, Hefenextrakt oder autolysierter Hefe, Nährsalzen und assimilierbaren Kohlehydraten bestehend, enthält.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Vergärung nach dem Untertauchverfahren unter aeroben Bedingungen ausgeführt wird.