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Verfahren zur Erzeugung von Streptomycin Gegenstand der Erfindung
sind Verbesserungen in der Erzeugung von Streptomycin.
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Es ist bekannt, daß Streptomycin durch das Wachstum des Mikroorganismus
Streptomyces griseus, der auch unter dem Namen Actinomyces griseus bekannt ist,
in geeigneten Kulturmedien erzeugt wird. Schatz, Bugie und Waksman haben in Proc.
Soc. Exp. Biol. and Med. 1944, Bd. 55, S. 66, berichtet, daß die Zusammensetzung
des Mediums, auf dem der Nfikroorganismus aufwächst, von erheblicher Wichtigkeit
ist und daß die Anwesenheit eines Peptons und einer spezifischen, das Wachstum fördernden
Substanz, wie Fleischextrakt oder Maisinfusion, für die Erzeugung des Streptomycins
notwendig ist. In der britischen Patentschrift 613 469 ist dargelegt, daß man gefunden
hat, daß die Verwendung von Proteinhydrolysat und/oder Fleischextrakt die Isolierung
der antibiotischen Substanz erschwert und daß daher die Benutzung von Nährböden,
die solche Materien enthalten, aus diesem und anderen Gründen unerwünscht ist. Infolgedessen
wurde die Verwendung von gewissen pflanzlichen Mehlen, gemahlenes Korn, Mehlinfusionen,
z. B. Warmwasserextrakte von Bohnenmehl, Erdnüssen, Baumwollsamen und Leinölsamen,
als einzige Quelle von stickstoffhaltigen und das Wachstum fördernden Substanzen
in Vorschlag gebracht.
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Diese vorgeschlagenen Zusatzstoffe für die Wachstumsnährböden sind
jedoch nicht zufriedenstellend und geben nicht immer dieselben guten Ergebnisse
wie die Standardnährböden, die bisher verwendet wurden und die z. B. Bactopepton
und Fleischextrakt enthielten. Darüber hinaus sind diese Substanzen verhältnismäßig
teuer und nicht immer leicht zu haben.
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Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die
Erzeugung von Streptomycin, das
zum mindesten einen Teil der obenerwähnten
Schwierigkeiten beseitigt.
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Die vorliegende Erfindung betrifft daher neue Verfahren oder Verfahrensstufen,
deren besondere Ausführungsformen aus den Beispielen später ersichtlich werden sollen
und die zeigen, wie die Erfindung praktisch ausgeführt werden soll.
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Es wurde gefunden, daß ein Nährmittel, das leicht zugängliche und
billige Bestandteile enthält, mit sehr zufriedenstellendem Erfolg für die Streptomycinerzeugung
verwendet werden kann.
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Nach der vorliegenden Erfindung besteht das Verfahren darin, daß ein
Stamm von Actinomyces, wie z. B. Streptomyces griseus, in oder auf einem Nährsubstrat
gezogen wird, der@Fischmehl enthält.
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Die Erzeugung von Streptomycin kann noch dadurch erhöht werden, daß
das Substrat zusätzlich zu dem Fischmehl eine gewisse Menge getrockneter oder autolysierter
Hefe oder Hefenextrakt enthält.
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Die Nährlösungen, die nach der Erfindung benutzt werden, kosten nur
einen Bruchteil der Standardlösungen, die Baktopepton und Fleischextrakt enthalten.
Trotzdem sind die Ausbeuten an Streptomycin, die damit erhalten werden, ebenso gut,
wenn nicht besser als die mit den teuren Standardmedien erhaltenen.
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Die Erfindung ist für die Kultur der Streptomvcin erzeugenden Organismen
nach den Oberflächen- wie nach dem Tieftank- oder Untertauchverfahren anwendbar,
wobei das letztere natürlich das geeignetere ist, da es sich wirtschaftlich besser
für die Großerzeugung anpassen läßt.
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Die flüssige Nährlösung, die nach der Erfindung zur Anwendung gelangt,
muß die Nährsalze und die assimilierbaren Kohlehydrate enthalten, die für das Wachstum
der Organismen wesentlich sind. Anwendbare Nährsalze begreifen Natrium- und Magnesiumchlorid
und -sulfate, ferner Eisensulfat und Mischungen dieser Salze ein, wie sie in dieser
Technik geläufig sind. Ebenso sind die assimilierbaren Kohlehydrate, die angewendet
werden können, ganz allgemein bekannt. Es sind dies beispielsweise Dextrose, Glucose,
Melasse, Stärke u. dgl.
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Der Ausdruck Fischmehl, wie er in der Patentbeschreibung und den Patentansprüchen
gebraucht ist, soll verdautes Fischmehl, z. .B. mit Pankreatin verdautes Fischmehl,
oder unverdautes Fischmehl oder auch Extrakt von Fischmehl umfassen. Das Fischmehl
kann aus irgendeiner Art von Fisch hergestellt sein. Es soll hier bemerkt werden,
daß die Zusammensetzung des Fischmehls sich mit der Art der verarbeiteten Fische,
wie sie gerade erhältlich sind und je nach der Jahreszeit auf den Markt kommen,
ändert. Das Fischmehl, das aus weißen Fischen gewonnen wird, eignet sich am besten
für die Zwecke der Streptomycinerzeugung, obgleich Fischmehl, das ganz oder teilweise
aus anderen Fischsorten hergestellt ist, ebenfalls mit zufriedenstellendem Ergebnis
Verwendung finden kann.
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Das Kulturmedium für die Erzeugung von Streptomycin muß natürlich
sehr sorgfältig vor dem Gebrauche sterilisiert werden. Dies wird zweckmäßig durch
Erhitzen des Kulturmediums in Autoklaven vorgenommen, nachdem alle notwendigen Bestandteile
zugesetzt worden sind. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Fischmehl einer
vorläufigen Sterilisation zu unterziehen, bevor die anderen Bestandteile des Mediums
zugesetzt sind, worauf das Medium sodann vor der Verwendung gründlich sterilisiert@wird.
Es ist am zweckmäßigsten, das Kulturmedium im Gärungsgefäße selbst durch Erhitzen
der Nährlösung in dem Gärgefäße mit Dampf unter Druck auf Temperaturen von ungefähr
12o° C während 2 oder 3 Stunden zu sterilisieren und sodann das Kulturmedium abzukühlen
oder abkühlen zu lassen auf die Temperatur, bei welcher die Vergärung durchgeführt
werden soll.
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Der Fischmehlextrakt, der nach der Erfindung Anwendung finden soll,
ist am zweckmäßigsten ein wässeriger Extrakt. Vorteilhafterweise verfährt man jedoch
derart, daß man an Stelle der gesonderten Herstellung des Extrakts und der Zugabe
des fertigen Extrakts zu der Nährlösung diese mit Fischmehl ansetzt und sie darauf
sterilisiert und vor dem Gebrauch filtriert, worauf das so filtrierte Medium tatsächlich
einen Extrakt aller festen Substanzen, die ursprünglich in dem Kulturmedium vorhanden
waren, darstellt.
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Die Menge Fischmehl, die in dem Kulturmedium vorhanden sein soll,
kann in verhältnismäßig weiten Grenzen schwanken, wie z. B. zwischen 0,3
bis 2 °;o auf Gewichtsbasis. Es wird aber vdrgezogen, eine Nährlösung zu verwenden,
d:e ungefähr 0,70/',Fischmehl enthält. Die zusätzlichen Materialien, wie z. B. Trockenhefe
oder autolysierte Hefe oder Hefenextrakt, die in dem Nährmedium enthalten sein können,
werden zweckmäßigerweise in Mengen dem Medium einverleibt, die geringer sind als
die des Fischmehls. Ein sehr zufriedenstellendes Nährmedium enthält z. B. ungefähr
0,7 Gewichtsteile Fischmehl und ungefähr 0,3 °/o trockene autolysierte
Hefe.
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Das Verfahren zur Herstellung von Streptomycin wird, abgesehen von
dem neuartigen Nährmedium, in üblicher Weise aasgeführt, und die Temperatur, der
pH-Wert, die Arten und Geschwindigkeit der Rührung und alle die anderen Behandlungsmöglichkeiten
werden entsprechend den Bedingungen, die- sonst für die Streptomycinerzeugung' bekannt
und üblich sind, gewählt.
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Die folgenden Beispiele sollen zeigen, in welcher Weise die Erfindung
praktisch ausgeführt werden kann. Sie stellen jedoch keine Beschränkung der Erfindung
dar. Die letztere ist in den Patentansprüchen enthalten. Die Prozentzahlen sind
Gewichtsprozente, mit Ausnahme derer, bei denen dies ausdrücklich vermerkt ist.
Beispiel i Ein wässeriges Nährmedium, das 0,7()/, Fischmehl, 0,30/(, getrocknete
autolysierte Hefe, il)/, Glucose, o,50/0 Natriumchlorid, 0,0250,', Magnesiumsulfat,
o,ooi °/a Ferrosulfat, Rest Wasser enthält, wurde im Autoklaven sterilisiert und
das Medium sodann mit einer Sporenaufschwemmung von Actinomyces griseus geimpft.
Die Vergärung wurde nach dem Untertauchverfahren unter aeroben Bedingungen bei 280
C mit lebhafter Rührung und Lüftung mit steriler Luft durchgeführt.
Nach
Ablauf von 5 Tagen war der Streptomycintiter in der erhaltenen Brühe Z99 Einheiten
im Kubikzentimeter. Das erzeugte Streptomycin wurde nach üblichen Verfahrensmethoden
getrennt und gereinigt.
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Ein Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie das oben verwendete
wurde durch Erhitzen für 3 Stunden bei 12o° C in der gewöhnlichen Weise sterilisiert
und das sterilisierte Medium vor der Verwendung filtriert. Das filtrierte Medium
wurde geimpft und die Vergärung wie oben beschrieben ausgeführt. Nach Ablauf von
5 Tagen wurde der Streptoniycintiter in der erzeugten Brühe mit 220 Einheiten im
Kubikzentimeter festgestellt.
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Wenn ein Nährmedium gleicher Zusammensetzung wie das oben verwendete,
mit der Ausnahme, daß das Fischmehl durch die gleiche Menge mit Pankreatin verdauten
Fischmehls ersetzt war, zur Anwendung gelangte, während die Vergärung in derselben
Weise wie vorher durchgeführt wurde, wurde nach Ablauf von 5 Tagen ein Streptomycintiter
in der Brühe von 2o6 Einheiten im Kubikzentimeter gefunden. Beispiel e Eine Reihe
von 47 Gärungen wurde mit einem wässerigen Nährmedium der folgenden Zusammensetzung
ausgeführt: o,7";', sterilisiertes Fischmehl, 0,3 °;'o getrocknete autolysierte
Hefe, 1,o °/o Glucose, o,5 °/o Natriumchlorid, 0,025 °/o Magnesiumsulfat, o,ooZ
°;'o Ferrosulfat, Rest destilliertes Wasser.
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Dies wurde sterilisiert und dann mit einer Sporenaufschwemmung von
Actinomyces griseus geimpft. Die Vergärungen wurden bei 28° C unter Rühren und Lüftung
ausgeführt, wobei die Rührer mit ungefähr 9oo Umdrehungen in der Minute arbeiteten
und die Lüftung ein Liter steriler Luft je Liter Nährflüssigkeit in der Minute betrug.
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Nach Ablauf von 5 Tagen war der Streptomycintiter in der erzeugten
Brühe im Durchschnitt 318 Einheiten im Kubikzentimeter. -Beispiel 3 Eine wässerige
Nährflüssigkeit, die sich wie folgt zusammensetzte: 72 kg Fischmehl, 18 kg Trockenhefe
-(autolysiert), 9o kg Glucose, 45 kg Kochsalz, 2,25 kg Magnesiumsulfat und
0,225 kg Schaumverhinderungsmittel Silicone wurde mit Wasser auf gooo Liter
aufgefüllt und sterilisiert. Dies Medium wurde mit einer vegetativen Impfkultur
von Streptomyces griseus (Stamm D. C. L. 5ooZ) geimpft. Die Vergärung wurde bei
27,7° C durchgeführt nach dem Tauchverfahren und unter aeroben Bedingungen, wobei
gut gerührt wurde und die Lüftung ein Volumen steriler Luft auf je ein Volumen Nährflüssigkeit
in der Minute betrug. Nach 44 Stunden wurde die Gärung eingestellt, als die Streptomycinerzeugung
einen Höhepunkt erreichte und der Streptomvcintiter der erzeugten Brühe 182 Einheiten
im Kubikzentimeter betrug. Das erzeugte Streptomycin wurde nach bekannten Methoden
isoliert und gereinigt.
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Zum Zwecke eines Vergleichs wurde der folgende Ansatz verarbeitet:
45 kg Bactopepton, 29 kg Fleischextrakt, 9o kg Glucose, 45 kg Kochsalz, 2,25 kg
Magnesiumsulfat, 0,225 kg Silicone wurden mit Wasser auf gooo Liter aufgefüllt
und sterilisiert. Diese Nährlösung wurde mit einer vegetativen Impfkultur von Streptomyces
griseus (D. C. L. Stamm 5ooZ) geimpft. Die Vergärung wurde unter genau den gleichen
Bedingungen wie die vorstehend beschriebene bei 27,7° C mit lebhafter Rührung und
Lüftung im Ausmaße von einem Volumen steriler Luft für je ein Volumen Nährflüssigkeit
in der Minute durchgeführt. Die Gärung wurde nach 5o Stunden eingestellt, als die
Streptomycinerzeugung ihren Höhepunkt erreicht hatte und der Streptomycintiter in
der hergestellten Brühe 105 Einheiten im Kubikzentimeter betrug. Beispiel 4 Eine
wässerige Nährlösung, die 1 °,!o Fischmehl, 1 °/o Glucose, o,5 °/o Kochsalz, 0,025
°/o Magnesiumsulfat, o,oof °/o Ferrosulfat, Rest destilliertes Wasser enthielt,
wurde im Autoklaven sterilisiert. Das Medium wurde mit einer io °/oigen vegetativen
Impfkultur von Actinomyces griseus geimpft. Die Vergärung wurde bei 28° C unter
lebhaftester Rührung und Lüftung durchgeführt. Am Ende von 4 Tagen war der Streptomycintiter
der gewonnenen Brühe 179 Einheiten im Kubikzentimeter. Das erzeugte Streptomycin
wurde nach bekannten Methoden isoliert und gereinigt.