AT228394B - Verfahren zur Gewinnung eines vorwiegend 1, 4-Di-(p-hydroxyphenyl)-2, 3-di-isonitrilo-butadien-(1, 3) enthaltenden Antibiotikums - Google Patents

Description

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   Verfahren zur Gewinnung eines vorwiegend   1, 4-Di- (p-hydroxyphenyl) -2, 3-di-isonitrilo-butadien- (1,   3) enthaltenden Antibiotikums 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines vorwiegend   1. 4-Di- (p-hydroxyphenyl) -     -2, 3-di-isonitrilo-butadien- (1, 3) enthaltenden Antibiotikums durch Zilchtung   des Stammes Penicillium notatum WESTLING bzw. seiner Varianten oder Mutanten in Submerskultur. Dieses Antibiotikum besteht aus den Komponenten X, Y, Z, wobei X den zu   50-70% im   Gemisch enthaltenen Hauptanteil ausmacht. 



  Dieser Hauptanteil X ist chemisch als 1,   4-Di- (p-hydroxyphenyl)-2, 3-di-isonitrilo-butadien- (l, 3) defi-   niert worden. Es ist bekannt, dass sich das Antibiotikum durch seine Thermostabilität und polyvalente Wirkung auszeichnet. Zur Herstellung dieses Antibiotikums ist ein Verfahren bekannt, nach dem unter Anwendung eines Czapek-Dox-Nährbodens mit , 5% Hefeautolysatzusatz, Schimmelpilzkulturen im Oberflächenverfahren bis zu einer Alterung des Mycels gezüchtet werden, worauf die Kulturlösung verworfen und die getrocknete Mycelmasse zur Gewinnung des Antibiotikums benutzt wird.

   Dieses Mycel wird mit organischen   Lösungsmitteln, - insbesondere   Äther, Aceton, Alkohol, Äthylacetat und anderem extrahiert und durch Abdestillieren das noch unreine Antibiotikum gewonnen, welches sodann mit Petroläther oder Leichtbenzin gewaschen und mit organischen Lösungsmitteln wie Alkohol, Aceton oder Dioxan heiss gelöst und mit Wasser zur Ausfällung gebracht wird. Das so gereinigte Antibiotikum wird dann in die bekannten Dispensationsformen wie Puder, Salbe, Wundkegel usw. gebracht. 



   Die Eigenart des bekannten Verfahrens bringt nun zunächst den Nachteil mit sich, dass die Oberflächenkultur in einer grossen Anzahl von Glaskolben durchgeführt werden muss, so dass für Nährlösungsabfüllung, Sterilisation, Beimpfung und Abtrennung des gealterten Mycels durch Filtration usw. viele Ar-   beitskräfte.   ein hoher Materialeinsatz   und-Verschleiss   und vor allem grosse temperierte Produktionsräume erforderlich sind. 



   Diese genannten Faktoren bzw. der damit verbundene technische Aufwand lassen hohe Kosten entstehen. Hinzu kommt, dass es nicht immer möglich ist, den Fermentationsprozess über die lange Kulturzeit von 28 Tagen exakt zu kontrollieren und zu steuern, da jedes abgeschlossene biologische System seine eigenen Besonderheiten aufweist. Weiterhin ist das Verfahren insofern ungünstig, als das Antibiotikum erst aus dem Mycel extrahiert werden muss, wobei Verluste durch unvollständige Extraktion entstehen können. Da das Mycel aber nur relativ geringe Antibiotikummengen enthält, ist unter diesen Bedingungen die Extraktion im Verhältnis zur erzielten Ausbeute zeitraubend. Es ist weiterhin der Hinweis bekannt, die Verfahrensweise auch auf die Submerskultur anzuwenden.

   Versuche in dieser Richtung führten jedoch zu keinem Ergebnis, so dass festgestellt werden muss, dass gegenwärtig noch keine Beschreibung eines Verfahrens für die Herstellung dieses Antibiotikums im Submersverfahren erfolgt ist. 
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 Züchtung nach Beimpfung mit einem zu mindestens   200/0   autolysierten vegetativen Impfgut durchgeführt wird und die Aufarbeitung erst nach mindestens   50% igem Zerfall der Mycelmasse erfolgt, wobeidas   durch den Zerfall freigesetzte und in der Kulturlösung ausfallende Antibiotikum zusammen mit Mycelresten und andern festen Bestandteilen abgetrennt und weiter in an sich bekannter Weise verarbeitet wird. 

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   Es wurde nämlich gefunden, dass man bei Verwendung von nach einem beliebigen, bekannten Verfahren angezüchtetem Impfmaterials des Stammes Penicillium notatum WESTLING, das man in zumindestens   20%   autolysierter Form in einer Menge von etwa 5% als Inokulum für eine Hauptkultur verwendet und unter guter Belüftung und   mehrtägigem   Rühren der beimpften Kulturlösung bei einer Temperatur von zirka   297 - 3030 K (24 - 300G)   einen Zerfall des diffus wachsenden Mycels erreicht, der nach zirka 8 Tagen eintritt und der zum Freiwerden und Ausfallen des Antibiotikums in die Kulturlösung führt. 



   Die Beimpfung erfolgt vorteilhaft mit einem zu   40-700/0, vorzugsweise   zu 50% autolysierten Impfmaterial, welches aus einer Vorkultur oder auch aus einer vorangegangenen Hauptkultur stammen kann. 



   Die geerntete Kulturlösung wird durch Filtration, Zentrifugieren oder Absetzenlassen von den festen Bestandteilen getrennt und verworfen. Diese festen Bestandteile bestehen im wesentlichen aus dem ausgefallenenAntibiotikum sowie Mycelresten, unlöslichen Salzen und Eiweissabbauprodukten. Man erhält auf diese Weise ein bedeutend aktiveres Zwischenprodukt, als es das gealterte Mycel aus der Emersproduktion darstellt. Durch den Zerfall des Mycels ist der Rückstand verhältnismässig gering, wodurch die Reindarstellung erleichtert wird. 



   Es wurde weiters gefunden, dass man eine bedeutend höhere Ausbeute erzielen kann, wenn man die Kulturlösung aus dem Kulturtank nach beginnendem Mycelzerfall in grosse Vorratsgefässe ablässt und die Autolyse unter den optimalen Bedingungen spezifischer Fermente bis zum möglichst vollständigen Zerfall der Mycelteile weiterführt. 



   Die Aufarbeitung der abgetrennten Feststoffe, die praktisch nur noch aus Antibiotikum,   Eiweissab-   bauprodukten, unlöslichen Salzen und anderem bestehen, geschieht auf dem beschriebenen Wege. Eine andere Aufarbeitungsmöglichkeit besteht darin, das abgetrennte, ungereinigte Antibiotikum alkalisch zu lösen, die Lösung nach bekannten Verfahren von festen Bestandteilen zu befreien und aus der vorgereinigten Lösung das Antibiotikum durch Adsorption, Neutralisation oder Ausschütteln mit wasserunlöslichen Lösungsmitteln anzureichern und rein darzustellen. 



   Durch vergleichende Testung des. bekannten   1, 4-Di - (p-hydroxyphenyl) -2, 3-di -isonitrilo-butadi -   en- (l, 3) enthaltenden Antibiotikums mit dem erfindungsgemäss hergestellten Antibiotikum konnte die gleiche biologische Wirksamkeit festgestellt werden. Auch die chemischen und physikalischen Eigenschaften sind dieselben. An nachfolgenden Ausführungsbeispielen soll der Gegenstand der Erfindung näher erläutert werden. 



   Beispiel l : Das Sporenmaterial des Stammes Penicillium notatum WESTLING wird nach einer Agar-Passage auf Hirse bei 3000 K   (270C)   angezüchtet und nach zehntägiger Bebrütung zur Beimpfung für je 100 ml Nährlösung, beispielsweise   Czapek-Dox-Lösungin   einer Schüttel-Kultur verwendet. Die so gewonnene, zu mindestens   20%   autolysierte Vorkultur wird zu   5%   als Inokulum für   101   einer Zwischenkultur zugesetzt und davon nach etwa piger Autolyse 51 zur Beimpfung von   1001   Hauptkultur verwendet. 



  Die   Hauptkulturnährlösu g   gleicht der bekannten im Emers-Verfahren benutzten Nährlösung. Bei   3000   K   (27C),   kräftiger Rührung und Belüftung im Verhältnis   l : l   wird nach etwa 8 Tagen ein weitgehender Zerfall des Mycels erreicht, wonach die Fermentation abgebrochen werden kann. Das verunreinigte, in der Kulturlösung ausgefallene Antibiotikum wird durch Filtrieren, Zentrifugieren, oder Absetzenlassen von den flüssigen Nährlösungsbestandteilen getrennt und nach dem bekannten Verfahren gereinigt. Die Ausbeute an reinem Antibiotikum-Komplex (X,   Y.   Z) beträgt 60 g/100 1 Nährlösung. 



     Beispiel 2 :   Zur Herstellung des Impfmaterials und bei der Fermentation wird wie im Beispiel 1 verfahren, jedoch wird nach beginnendem Mycelzerfall, der nach zirka 5 Tagen eintritt, die Subsmerskultur abgelassen und in einem Vorratsgefäss der weiteren Autolyse, die bis zum vollständigen Zerfall des Mycels führt, unterworfen. Die Abtrennung und Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1. 



   Beispiel 3 : Es wird im Fermentations- und Aufarbeitungsprozess wie im Beispiel 1 oder 2 verfahren, mit dem Unterschied, dass ein Teil des zu etwa   50%   autolysierten Mycels der laufenden Hauptkultur als Inokulum für die nachfolgende Kultur verwendet wird. 



   Beispiel 4: Zur Gewinnung des durch   Mycel- bzw. Eiweissabbauprodukte. unlösliche   Salze und anderem verunreinigten Antibiotikums wird wie in den Beispielen 1, 2 und 3 verfahren. Dieses unreine Antibiotikum wird durch Alkalisieren des Rückstandes gelöst, die Lösung von festen Bestandteilen getrennt, und das Rohprodukt durch Neutralisation, Adsorption oder Ausschütteln mit wasserunlöslichen Lösungsmitteln angereichert.

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Gewinnung eines vorwiegend l, 4-Di- (p-hydroxyphenyl)-2, 3-di-isonitrilo-butadien- (l, 3) enthaltenden Antibiotikums durch Züchtung des Stammes Penicillium notatum WESTLING bzw. seiner Varianten oder Mutanten in Submerskultur, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung nach Be- impfung mit einem zu mindestens 20% autolysierten vegetativen Impfgut durchgeführt wird und die Aufarbeitung erst nach mindestens 50% gem Zerfall der Mycelmasse erfolgt, wobei das durch den Zerfall freigesetzte und in der Kulturlösung ausfallende Antibiotikum zusammen mit Mycelresten und andern festen Bestandteilen abgetrennt und weiter in an sich bekannter Weise verarbeitet wird.

   2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass die Beimpfung mit einem zu 40 - 70go, vorzugsweise zu 50% autolysierten Impfmaterial erfolgt, welches aus einer Vorkultur oder auch aus einer vorangegangenen Hauptkultur stammen kann.

   3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung im Kulturgefäss bis zum möglichst weitgehenden Zerfall der Mycelmasse fortgesetzt wird.

   4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur nach Einsetzen des Zerfalls der Mycelmasse in ein Vorratsgefäss abgelassen und darin bis zur möglichst vollständigen Autolyse aufbewahrt wird.