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Verfahren zur Kultivierung von Pilzmaterial
Es wurde ein Verfahren gefunden, halluzinogen wirksame Pilzarten im Laboratorium unter solchen Kulturbedingungen zu züchten, dass dabei aktives Ausgangsmaterial in für die Gewinnung der Wirkstoffe Psilocybin und Psilocin in präparativem Massstab ausreichenden Mengen gebildet wird.
Aus künstlich gezüchtetem Pilzmaterial, erhalten aus Reinkulturen oder aus biologischen Varianten oder Mutanten von Pilzen der Gattungen Psilocybe, Stropharia, Panaeolus, Conocybe, Amanita oder Russula, wurde durch Impfung derselben auf natürlichem oder künstlichem Nährboden undBebrütung dieser Kulturen am Tageslicht oder im Dunkeln bei einer konstanten Temperatur zwischen 18 und 270 bzw. 22 - 260C und nachfolgender Abtrennung des aktiven Pilzmaterials die fllr die Gewinnung der Wirkstoffe Psilocybin und Psilocin in präparativem Massstab technisch brauchbare Menge an aktivem Ausgangsmaterial erhalten.
Das Verfahren wird vorzugsweise folgendermassen ausgeführt :
Zur Züchtung auf natürlichem Substrat wird ein Kompost aus gegorenem Weizenstroh, einem Gemisch vonMaislaub und. stengeln oder Halmen von wilden Gräsern hergestellt, mit fliessendem Wasser reichlich gewaschen, in Tonschalen verteilt und Im Autoklaven sterilisiert. Der Kompost wird mit Mycel aus Pri- märkulturen beimpft, während zirka 2 Wochen bei 24-270Cbebrlitet,. die Kulturen mit sterilem Sand gedeckt und im Glaskasten im Tageslicht bei einer Temperatur von 18-27 C bei einer Konstanthaltung des Feuchtigkeitsgehaltes sich selbst überlassen. Nach 4-5 Wochen erscheinen die Fruchtkörper ; die Ernte erfolgt ab und zu während einem bis zwei Monaten bei beginnender. Sporenbildung.
Da die Gewinnung grösserer Mengen Ausgangsmaterial auf diesem Wege jedoch etwas umständlich ist, wurden andere Züchtungsmethoden ausgearbeitet. Dabei wurde unerwarteterweise gefunden, dass die Pilze in vitro auf nährstoffreichen Substraten an Stelle von Mycel mit Fruchtkörpem fast ausschliesslich aktives Mycel und teilweise Sklerotien in grosser Menge bilden, auf nährstoffarmen dagegen die bekannten Fruchtkörper. Zum Beispiel auf einem Agar-Nährboden (mit 1, 51o Agar) liegt das Optimum für die Fruchtkörperbildung bei einer Konzentration an Malzextrakttrockensubstanz von 0,2 bis 0, 7 lu, das Optimum für die Mycel- und Sklerotienbildung dagegen bei Konzentrationen von 4 bis lolo je nach Pilzart.
Während das Tageslicht für die Fruchtkörperbildung unentbehrlich ist, ist bei Bebrütung der Kulturen im Dunkeln die Sklerotien- bzw. Mycelbildung wesentlich üppiger. Die besten Ausbeuten an aktivem Pilzmaterial (Mycel und Sklerotien) werden erhalten, indem man Oberflächenkulturen mit MalzextraktNährlösungen (Bierwürze oder käufliche Malzextraktpräparate) von 4 bis 10% Gehalt an Trockensubstanz anlegt und diese Kulturen im Dunkeln bei einer konstanten Temperatur zwischen 22 und 260C bebrüten lässt. Für ein gutes Wachstum muss der Nährlösung 0, 20/0 Agar zugesetzt werden : In diesem noch beinahe flüssigen Medium findet der Pilz gerade genügend Halt, um rasch eine gut geschlossene Myceldecke zu bilden.
Der Zusatz von Eisen-II-Salzen ist notwendig, ferner erweisen sich Zusätze von Zink-, Kalium-, Calcium- und Magnesium-Salzen, von Nitrat-, Phosphat- und Sulfat-Ionen sowie von Hefeextrakt oder sogenannten"Cornsteep Solids" (Konzentrat von Maisquellwasser) als sehr vorteilhaft.
Dieses Züchtungsverfahren bedeutet einen grossen technischen Fortschritt, da es ermöglicht, in kürzerer Zeit und unter kleinerem Arbeitsaufwand eine-im Vergleich mit der Züchtung auf natürlichem Substrat - mehr als zehnfache Ausbeute an aktivem Ausgangsmaterial zu erhalten.
Beispiel l : Züchtung von Fruchtkörpern von Psilocybe mexicana Heim. Zur Züchtung auf natürlichem Substrat wird ein Kompost aus gegorenem Weizenstroh hergestellt, mit fliessendem Wasser reich-
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lich gewaschen, in Tonschalen verteilt und im Autoklaven sterilisiert. Der Kompost wird mit Mycel aus Primärkulturen beimpft, während zirka 2 Wochen bei 24-27 C bebrütet, die Kulturen mit sterilem Sand gedeckt und im Glaskasten am Tageslicht bei einer Temperatur von 21-22 C sich selbst überlassen. Nach 4 - 5 Wochen erscheinen die Fruchtkörper ; die Ernte erfolgt ab und zu während einem bis zwei Monaten bei beginnender Sporenbildung.
Beispiel 2: Reinkulturen von Psilocybe semperviva Heim et Cailleux. a) Herstellung des Impfstoffes : Man legt von Basidiosporen des mexikanischen Hutpilzes Psilocybe semperviva Heim et Cailleux Reinkulturen aufBierwürze-Agar an. Zu diesem Zweck werden die von den Lamellen eines reifen Fruchtkörpers abfallenden Sporen auf einer sterilen Unterlage aufgefangen und auf Bierwürze-Agar gebracht und
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gendermassen hergestellt :
Das Mycel wird unter sterilem Leitungswasser mit einem rauhen Spatel abgeschabt, so dass eine Suspension feiner Mycel-Flocken entsteht. Mit dieser Supension werden Erlenmeyer-Kolben beimpft, welche eine Nährlösung und sattelförmige Porzellanfüllkörper, wie sie zur Füllung von Destillationskolonnen gebräuchlich sind, enthalten.
Beste Erfahrungen machten wir mit 300 cm-Erlenmeyern, enthaltend 50 g Sattelfüllkörper (Grösse 1 cm, Gewicht zirka 0, 9 g) und 80 cms Nährlösung, bestehend aus Bierwürze von zirka 4% Trockensubstanz und 0, 2% Agar.
Die Kultur wird bei einer Temperatur von 240C bebrütet ; nach zwei Wochen hat sich auf der Oberfläche eine kompakte Myceldecke gebildet. Die ganze Kultur wird 30 Minuten lang auf der rotierenden Schüttelmaschine geschüttelt, wobei die Sattelfüllkörper durch ihre scharfen Kanten das Mycel zermahlen : Es entsteht dabei eine feine Suspension von Mycelflocken. Der so erhaltene Impfstoff genügt zur Beimpfung von 50 I Nährlösung. b) Herstellung der Kultur : Frische, helle Bierwürze ohne Hopfenzusatz wird mit Leitungswasser auf einen Gehalt von 80/0 an Trockensubstanz verdünnt.
Zu jedem Liter dieser Lösung fügt man :
EMI2.2
<tb>
<tb> FeSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,00417 <SEP> g
<tb> ZnS04'7H20 <SEP> 0, <SEP> 00172g <SEP>
<tb> CA <SEP> (NO <SEP> S) <SEP> 2 <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> KHPO <SEP> 0,0624 <SEP> g
<tb> MgSO <SEP> 4. <SEP> 7Hp <SEP> 0, <SEP> 0624 <SEP> g
<tb> KC1 <SEP> 0,0312 <SEP> g
<tb> Agar-Agar <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
Diese Nährlösung wird in Portionen von je 11 in Penicillinkolben abgefüllt und während 25 Minuten im Autoklaven bei 1080C sterilisiert. Nach dem Erkalten werden die Kolben mit je 2 cms einer Suspension von P. semperviva Heim et Cailleux beimpft. Die erhaltenen Kulturen werden im Dunkeln bei 24-26 C bebrütet. Es bildet sich die unter 2 a) beschriebene Myceldecke.
Beispiel 3 : Gewinnung von Reinkulturen von Psilocybe mexicana Heim. In diesem Beispiel wird eine genaue Beschreibung gegeben über die Kultur des Pilzes Psilocybe mexicana Heim in vitro zur Erzeugung von Mycel und Sklerotien.
Frische, ungehopfte, helle Bierwürze wird mit Leitungswasser verdünnt auf einen Gehalt von 4,0-4, 5je Trockensubstanz. Zu jedem Liter dieser Lösung fügt man
EMI2.3
<tb>
<tb> FeS04'7Hp <SEP> 0, <SEP> 00417 <SEP> g
<tb> ZnS04 <SEP> 7H <SEP> jO <SEP> 0, <SEP> 00172g <SEP>
<tb> Agar-Agar <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g
<tb>
Diese Nährlösung wird in Portionen von 500 cm in Fernbachkolben von je l, 6 l Inhalt abgefüllt und während 25 Minuten im Autoklav bei 1080C sterilisiert. Nach dem Erkalten werden die Kolben mit je 2 cm3 einer Suspension des Pilzes Psilocybe mexicana Heim beimpft. Der Impfstoff wird hergestellt, indem man von Basidiosporen des genannten Hutpilzes Reinkulturen auf Bierwürze-Agar anlegt.
Die yon den Lamellen eines reifen Fruchtkörpers abfallenden Sporen werden auf einer sterilen Unterlage aufgefangen und auf Bierwurze-Agar gebracht und bebrütet.. Aus den Primär-Kulturen, die auf diese Art entstehen, kann man den Impfstoff auf folgende Weise herstellen : Das Mycel wird unter sterilem Leitungswasser mit einem rauhen Spatel abgeschabt, so dass eine Suspension feiner Mycelflocken entsteht. Damit werden Erlenmeyerkolben beimpft, welche eine Nährlösung und sogenannte Sattelfüllkörper aus Porzellan enthalten.
Beste Erfahrungen machten wir mit 300 cm3-Erlenmeyern enthaltend 50 g Sattelfüllkörper (Grösse 1 cm, Gewicht zirka 0, 9 g) und 80 cm3 Nährlösung bestehend aus Bierwürze von zirka 4o Trockensubstanz und 0, Z' ? o Agar. Bei 240C bebrütet, hat sich nach 2 Wochen auf der Oberfläche eine kompakte Myceldecke gebildet. Die ganze Kultur wird während 30 Minuten auf der
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Schüttelmaschine rotiert, wobei die Sattelfüllkörper das Mycel zermahlen, so dass eine feine Aufschwemmung von Mycelflocken entsteht. Der so erhaltene Impfstoff genügt zur Beimpfung von 25 1 Nährlösung.
Die beimpften Kulturen werden im Dunkeln bei 24-26 C bebrütet. Es bildet sich die bereits beschriebene Myceldecke mit sehr zahlreichen Sklerotien, welche im allgemeinen eine Grösse bis zirka 1 cm erreichen (einzelne können wesentlich grösser werden). Zur Abtrennung von Mycel und Sklerotien werden die reifen Kulturen durch ein Gaze-Tuch filtriert, ausgepresst und im Trockenschrank bei 35-40 C getrocknet. Aus einem Ansatz mit 134 Fernbachkolben, enthaltend 67 l Nährlösung, wurden bei der Ernte nach 62 Tagen 1149 g Trockenmaterial (Sklerotien und Mycel) erhalten, das sind 17, 14 g pro l angesetzter Nährlösung.
Beispiel 4 : Reinkulturen von Stropharia cubensis Earle. Eine Nährlösung wird wie folgt hergestellt : Frische, helle Bierwürze ohne Hopfenzusatz wird mit Leitungswasser auf einen Gehalt von 61o an Trockensubstanz verdünnt. Zu jedem Liter dieser Lösung werden zugefügt :
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<tb>
<tb> FeSO". <SEP> 7HP <SEP> 0, <SEP> 0021 <SEP> g
<tb> ZnSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,0009 <SEP> g
<tb> Ca <SEP> (N03 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> KHPO4 <SEP> 0, <SEP> 0624 <SEP> g <SEP>
<tb> MgSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,0624 <SEP> g
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 0312 <SEP> g <SEP>
<tb> Agar-Agar <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
Diese Nährlösung wird wie im Beispiel 2 sterilisiert und pro Liter mit 2 cm3 einer Suspension des Pilzes Stropharia cubensis Earle aus Kambodscha beimpft.
Die Herstellung dieser Impfsuspension geschieht wie im Beispiel 2 a) angegeben. Nach 52tägiger Bebrütung im Dunkeln bei 240C erhält man aus einem Ansatz von 20 I 452 g getrocknetes Pilzmaterial, d. h. 22,6 g pro l.
Beispiel 5: Reinkulturen von Psilocybe caerulescensMurrill var.Mazatecorum Heim. Das Kulturmedium wird vorbereitet, indem man frische, helle Bierwürze ohne Hopfenzusatz mit Leitungswasser auf einen Gehalt von 4, oxo Trockensubstanz verdünnt. Zu jedem Liter dieser Lösung fügt man :
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<tb>
<tb> "Cornsteep <SEP> Solids" <SEP> 10,00 <SEP> g
<tb> FeSO. <SEP> 7HO <SEP> 0, <SEP> 00834 <SEP> g
<tb> Ca <SEP> (OH)2 <SEP> 0,20 <SEP> g
<tb> KlIPO <SEP> 4. <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> g
<tb> NHH <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> Agar-Agar <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> PH <SEP> der <SEP> Lösung <SEP> : <SEP> 5,4
<tb>
Diese Nährlösung wird wie im Beispiel 2 angegeben sterilisiert, mit der Mycel-Suspension einer Reinkultur von Psilocybe caerulescens Murrill var.
Mazatecorum Heim aus Mexico beimpft, und die entstandenen Kulturen im Dunkeln bei 260C bebrütet. Nach 48 Tagen werden pro l Lösung 20,4 g getrocknetes . Pilzmaterial geerntet.
Beispiel 6 : Reinkulturen von Psilocybe Zapotecorum Heim. Frische, helle Bierwürze ohne Hopfenzusatz wird mit Leitungswasser auf einen Gehalt an Trockensubstanz von 4, 5% verdünnt. Zu jedem Liter dieser Lösung werden zugefügt :
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<tb>
<tb> FeSO <SEP> 0,00834 <SEP> g
<tb> "Cornsteep <SEP> Solids" <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> NHOH <SEP> 0,30 <SEP> g
<tb> K2HPO4 <SEP> 0,30 <SEP> g
<tb> Agar-Agar <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> pH <SEP> der <SEP> Lösung <SEP> : <SEP> 5, <SEP> 5.
<tb>
Dieses Kulturmedium wird wie im Beispiel 2 beschrieben sterilisiert und mit der Mycelsuspension einer Reinkultur, welche aus Sporen von reifen Fruchtkörpern von Psilocybe Zapotecorum Heim aus dem "pays chatino", Mexiko, gewonnen wurde, beimpft. Nach 57 Tagen Bebrütung im Dunkeln bei 240C erhält man aus einem Ansatz von 25 1430 g getrocknetes Pilzmaterial, d.h. 17, 2 g pro l.
Beispiel7 :ReinkulturenvonPsilocybeAztecorumHeim.DieNährlösungwirdwiefolgthergestellt:
EMI3.4
<tb>
<tb> Malzextrakt <SEP> 100 <SEP> g
<tb> FeSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,00417 <SEP> g
<tb> ZnSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,00172 <SEP> g
<tb> Ca(NO3)2 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> MgSO <SEP> 7hop <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb>
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<tb>
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP> g <SEP>
<tb> Agar-Agar <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Die Nährlösung wird im Autoklaven während 25 Minuten bei 1080C sterilisiert. 11 wird mit 2 cm3 einer Suspension des Pilzes Psilocybe Aztecorum Heim beimpft. Die Herstellung dieser Impf-Suspension geschieht wie im Beispiel 2 a) angegeben.
Die Kulturen werden im Dunkeln 45 Tage lang bei 24 C bebrütet und wie im Beispiel 2 c) beschrieben geerntet. Ausbeute aus 101 Nährlösung: 86,5 g getrocknetes Mycel.
Beispiel 8 : Herstellung einer Kultur. Eine Nährlösung wird wie folgt hergestellt : Frische Bierwürze (hell, ungehopft) wird mit Leitungswasser verdünnt auf einen Gehalt an Trockensubstanz von 4, 0 bis 4, 5%. Zu jedem Liter dieser Lösung werden zugefügt-.
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<tb>
<tb>
FeSO. <SEP> 7H2ss <SEP> 0, <SEP> 00209 <SEP> g
<tb> ZnSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,00086 <SEP> g
<tb> Ca <SEP> (N0,) <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,0625 <SEP> g
<tb> MgSO4 <SEP> 0,0625 <SEP> g
<tb> KCl <SEP> 0,031 <SEP> g
<tb> Agar-Agar <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
Diese Nährlösung wurde wie in Beispiel 4 sterilisiert und beimpft. Nach 48-tägiger Bebrütung bei 240C wird darauf in einem Ansatz von 55 l eine Ausbeute von 924 g Sklerotien und Mycel (Trockensubstanz) erzielt, das sind 16,6 g pro l.
Beispiel 9 : Herstellung einer Kultur. Eine Nährlösung wird wie folgt hergestellt : Frische Bierwürze (hell, ungehopft) wird mit Leitungswasser verdünnt auf einen Gehalt an Trockensubstanz von 4,0 bis 4, 5%. Zu jedem Liter dieser Lösung werden zugefügt :
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<tb>
<tb> FeSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,00209 <SEP> g
<tb> ZnSO. <SEP> 7H <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 00086g <SEP>
<tb> CA <SEP> (NO <SEP> 3) <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP>
<tb> Agar-Agar <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
Diese Nährlösung wird wie in Beispiel 4 sterilisiert, beimpft und bebrütet. Nach 48 Tagen werden pro Liter Nährlösung 20,5 g getrocknete Sklerotien und Mycel geerntet.
Beispiel 10 : Herstellung einer Kultur. Eine Nährlösung wird wie folgt hergestellt : Frische Bierwürze (hell, ungehopft) wird mit Leitungswasser verdünnt auf einen Gehalt an Trockensubstanz von 4,0 bis 4, 5%. Zu jedem Liter dieser Lösung werden zugefügt :
EMI4.4
<tb>
<tb> FeSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,00209 <SEP> g
<tb> ZnSO. <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 00086 <SEP> g
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> Agar-Agar <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
Die weitere Bearbeitung geschieht wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Ausbeute an getrockneten Sklerotien und Mycel beträgt nach 48 Tagen 15, 9 g pro l Nährlösung.
Beispiel 11 : Herstellung einer Kultur. Eine Nährlösung wird wie folgt hergestellt : Frische Bier-
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bis 4, 5U/o. Zu jedem Liter dieser Lösung werden zugefügt :
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<tb>
<tb> FeSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,00209 <SEP> g
<tb> ZnSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,00086 <SEP> g
<tb> "Cornsteep <SEP> Solids" <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> Agar-Agar'2, <SEP> 0 <SEP> g
<tb>
Die weitereBehandlung geschieht wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Ausbeute an getrockneten Sklerotien und Mycel beträgt nach 48 Tagen 29, 8 g pro l Nährlösung.
Beispiel 12 : Herstellung einer Kultur. Eine Nährlösung wird wie folgt hergestellt :
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<tb>
<tb> Malzextrakt <SEP> 45 <SEP> g
<tb> FeS04'7Hp <SEP> 0. <SEP> 00417g <SEP>
<tb> ZnSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,00172 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Die Nährlösung wird im Autoklav während 25 Minuten bei 1080C sterilisiert. 11 wird mit 10 cm3 i einer Suspension des Pilzes Psilocybe mexicana beimpft. Die Herstellung dieser Impfsuspension geschieht wie in Beispiel 3 beschrieben. Nach dem Beimpfen wird der Pilz in dieser Nährlösung im bewegten Sub-
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mersverfahren bei 24 C gezüchtet. Er bildet Sago-ähnliche Mycelkugeln, wie dies bei der submersen Züchtung von niederen Pilzen bekannt ist.
Nach 30 Tagen wird das Mycel durch Filtration abgetrennt und ergibt eine Ausbeute von 7, 0 g Trockenmycel pro l Nährlösung.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Kultivierung von Pilzmaterial der Gattungen Psilocybe, Stropharia, Pannaeolus, Conocybe, Amanita, Russula oder ihrer biologischen Varianten oder Mutanten, dadurch gekennzeichnet, dass man natürliche oder künstliche Nährböden mit Mycel aus Primärkulturen beimpft, im Tageslicht bzw. im Dunkeln bei einer konstanten Temperatur zwischen 18 und 27 C bzw. 22 und 26 C bebrüten lässt und das aktive Pilzmaterial (Fruchtkörper bzw. Mycel und Sklerotien) abtrennt.