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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hefeproteinen aus Sulfitablauge und Sulfitablaugeschlempe.
Wie bekannt, werden Sulfitablauge, Waschwasser und Sulfitablaugeschlempe nach Fermentation zu Alkohol als Grundrohstoff für die Herstellung von mikrobiellen Proteinen (Hefeproteinen) bereits seit einigen Jahrzehnten verwendet (z. B. DE-PS Nr. 610657), wobei der Umfang dieser Produktion allerdings immer durch dieMenge an zur Verfügung stehender Sulfitablauge bzw. an Zucker u. a. assimilierbaren Stoffen, beispielsweise Essigsäure, welche in den Grundrohstoffen enthalten sind, begrenzt ist. Infolgedessen ist die Produktion von Hefeproteinen völlig von der Celluloseproduktion und von der Art des Holzkochens abhängig.
Aus diesen Gründen ist es zweckmässig, Proteinproduktionsstätten nur in Cellulosefabriken mit grösserer Produktionskapazität zu errichten, aber selbst in diesen Fällen wird oft nicht die optimale Kapazität erreicht. Wie bereits erwähnt, hängt die Produktion von der Menge der verarbeiteten assimilierbaren kohlenstoffhaltigen Stoffe, in erster Linie der Zucker ab. Diese Menge ist nicht nur durch die Art des Holzkochens, sondern auch durch die Holzqualität gegeben. Da aber bei den Produkten die Celluloseproduktion von primärem Interesse ist, kann es zu Schwankungen in der Zusammensetzung des Grundsubstrates für die Hefe und demzufolge auch zu Schwankungen in der Produktion der Hefeproteine kommen.
Die Sulfitablauge zeichnet
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gend organischen Stoffen ans (etwa 10%), worauf die einzige Möglichkeit zu ihrer Unschädlichmachung beruht, indem sie nämlich eingedickt und verbrannt wird. Auf diese Weise lässt sich das Abwasser 100%zig beseitigen.
Die Gewinnung von Hefeproteinen aus Sulfitablaugen ist unter anderem in den folgenden Literaturstellen beschrieben : DE-PS Nr. 610657 ; US-PS Nr. 2,698, 82S, DE-PS Nr. 910044. Die US-PS Nr. 1,722, 858 beschreibt die Herstellung von Bäckerhefe unter Anwendung der Hefe Saccharomyces cerevisiae auf Kultivationsmitteln, denen Äthylalkohol zugefügt wird. Es ist allgemein bekannt, dass die Hefen des Stammes Saccha- romyces bei der industriellen Fermentationsherstellung des Äthylalkohols eingesetzt werden und die Produktion von Äthylalkohol ihr charakteristisches Merkmal ist. Deshalb war es bei diesem Hefestamm theoretisch schon lange Zeit bekannt, dass Äthylalkohol unter bestimmten Kultivationsbedingungen eingesetzt werden kann.
Diese Tatsache hat die Entwicklung vieler technologischer Verfahren in verschiedenen Varianten zur Folge gehabt. In jedem Fall handelt es sich jedoch um die Herstellung von Bäckerhefe, wo als Hauptsubstrat Melasse verwendet wird.
Die AT-PS Nr. 130438 knüpft an die vorstehenden Erwägungen an, da sie die HerstellungvonHefenbe- schreibt, die einer Alkoholfermentation fähig sind, was überwiegend für den Stamm Saccharomyces gilt. Man lässt diese Hefen in Zuckerlösungen unter schwacher Lüftung eine grössere oder kleinere Menge Äthanol bilden, worauf dieses Äthanol durch die Hefen nach Absonderung des Substrates oder ohne eine solche Absonderung zurweiteren Zellbildung verbraucht wird. Die Patentschrift ist also auf die Gewinnung von Hefe ohne Alkohol gerichtet. Es ist daher allgemein bekannt, dass bei der Herstellung von Bäckerhefe in durchgegorenen Medien eine gewisse Menge Äthylalkohol entsteht. Entsprechend dieser Menge wird die Ausbeute an Hefe herabgesetzt.
Auch in diesem Fall handelt es sich nicht um die Zugabe von Äthylalkohol zum Kultivationsmilieu mit dem Ziel der Produktion von Biomasse.
Die DE-PS Nr. 300662 beschreibt die Herstellung von Bäckerhefe, wobei Äthanol nicht oder nur in sehr kleinen Mengen entstehen soll. Vom Gesichtspunkt der Bäckerhefegewinnung kann diese Patentschrift als grundlegend angesehen werden. Sie geht wieder von der theoretischen Tatsache der Produktion und der Assimilation von Hefen des Stammes Saccharomyces, also der Bäckerhefe aus. Das Prinzip des dort geoffenbarten Verfahrens beruht auf der Verwendung von verdünnten Kultivationsmitteln bei angepasster langsamer Zuleitung weiterenKultivationsmittels. Den Autoren dieser alten Patentschrift waren die Grundlagen und die Abhängigkeiten bei der Produktion von Biomasse nicht bekannt, nämlich eine genügende Versorgung mit Sauerstoff, und die damaligen Methoden machten es auch nicht möglich, diese Zusammenhänge zu verfolgen.
In letzter Zeit steigt die Produktion mikrobieller Proteine aus synthetischen Rohstoffen, vor allem auf Basis von Erdöl, steil an. Einen der Schlüsselrohstoffe stellt dabei synthetisches Äthanol dar ; seine Vortei- le im Vergleich zu den Kohlenwasserstoffrohstoffen sind die Mischbarkeit mit Wasser sowie die Tatsache, dass Äthanol ein gewöhnliches Zwischenprodukt bei der Gärung der Saccharide darstellt. Dieser Grundrohstoff lässt sich auf verschiedene Weise ausnutzen ; meist besteht das Prinzip in der Verwendung eines spezifischen Hefestammes und gegebenenfalls der Adaptierung dieses Stammes in solcher Weise, dass Äthanol mit guten Ausbeuten ausgenutztwerden kann. So wird beispielsweise nach der CS-PS Nr. 109658 die Hefe Candida utillis für eine Kultivierung an Medien, welche synthetisches Rohäthanol enthalten, adaptiert.
Die SU-PS Nr. 206493 beschreibt die Kultivierung der Hefe Hansenula anomala an äthanolhaltigen Medien unter Zusatz von Hefeautolysat. Ferner ist die Kultivierung einer Reihe von proteinbildenden Mikroorganismen an Oxydationsprodukten von Kohlenwasserstoff bekannt, wobei Äthanol den überwiegenden Anteil bildet (FR-PSNr. 1. 597. 233, GB-PS Nr. 1, 231, 058) ; sowie die Kultivierung der Hefe Candida utillis an reinen äthanolhaltigen Substraten unter Gewinnung eines Nahrungsmittels für Menschen (DE-PS Nr. 2154091).
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Einen gewissenNachteil bei der Vergärung äthanolhaltiger Medien stellt die schwierige Abwasseraufbe- reitung dar. Das Abwasser muss durch biologischen Abbau gereinigt werden, was verhältnismässig kostspie- lig ist und etwa 10% der Gesamtinvestitionen einer Hefefabrik ausmacht. Wegen des niedrigen Gehaltes an verbrennbaren Stoffen in diesem Abwasser kommt das Eindicken und Verbrennen nicht in Frage. Das Prinzip und die Neuheit des erfindungsgemässen Verfahrens im Gegensatz zu den Verfahren der genannten Patent- schriften liegt in der gleichzeitigen und augenblicklichen Ausnutzung von Monosacchariden und Äthanol unter speziellenBedingungenbei der kontinuierlichen Kultivation.
Bei der Fermentation bei Mengen an kohlenstoff- haltigen Stoffen nahe Null kommt es dabei zu einer Mikrobiosynthese der Biomasse, unter andern Kultiva- tionsbedingungen kommt es zu einer Diaxie oder Polyauxie. Das Ergebnis beider Varianten der Fermenta- tion ist eine höhere Ausnutzung der kohlenstoffhaltigen Stoffe, z. B. Monosaccharide aus Sulfitablaugen. Die- se Möglichkeit war bei hefeartigen Mikroorganismen, die keinen Alkohol bilden, z. B. bei den Stämmen Can- dida, Cryptococcus u. dgl., bisher nicht bekannt.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass man die Menge an assimilierbaren kohlenstoffhal- tigen Substanzen in der Sulfitablauge und Sulfitablaugeschlempe durch Zusatz von Äthanol bis auf 10% erhöht und unter Einsatz solcher Hefen, welche die ausnutzbaren Stoffe der Sulfitablauge und/oder Äthanol assimi- lieren, vorzugsweise Wuchshefen, z. B. unter Einsatz der asporogenen Hefen der Gattung Candida, fer- mentiert.
Die eingangs genannten Nachteile der Fermentation von Sulfitablauge, insbesondere die Schwankungen in der Zusammensetzung des Grundsubstrates für die Hefen und die Notwendigkeit der biologischen Abwas- serreinigung, werden so behoben. Die Fermentation führt man vorzugsweise unter Anwendung eines an einem
Sulfitrohstoff oder an einem synthetischen Medium mit Äthanol vorkultivierten Inokulums durch. Es ist auch möglich, vor dem Äthanolzusatz den ursprünglichen Gehalt an reduzierenden Stoffen, insbesondere an
Sacchariden, durch mikrobiologische Prozesse auf bis zu 0, 1 Gew.-% herabzusetzen. Die Kultivierung führt man zweckmässig unter Anwendung von Hefen, welche befähigt sind, Äthanol zu assimilieren, vorzugsweise von asporogenen Hefen, wie z. B.
Candida utillis, Candida utillis var. arborea, Torulopsis candida, Cryptococcus albidus var. diffluens oder deren Gemischen durch. Bei einer kontinuierlichen Kultivierung ist es von Vorteil, wenn sie zwei-oder mehrstufig, vorzugsweise mit dazwischen erfolgender Abtrennung, durch- geführt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es, die bisher bestehenden Kapazitätsgrenzen bei der He- feproteinproduktion in Cellulosefabriken zu beseitigen und die optimale Kapazität zu erreichen. Einen weiteren wesentlichenvorteil bietet die Möglichkeit der gemeinsamen Aufarbeitung der Abwässer, deren Menge auf die Abfälle nach Verdampfen und Verbrennen beschränkt ist. Die auf Basis von Äthanol produzierten He- fen erhöhen also die Menge an Abwasser nicht. Die aus beiden Grundrohstoffen erhaltene Biomasse ist vom Standpunkt des Nährwertes aus vorteilhafter als die Hefen aus der Sulfitablauge allein, in erster Linie we- gen des niedrigeren Gehaltes an Aschenbestandteilen und des erhöhten Proteingehaltes.
Ein weiterer Vorteil des neuen Verfahrens ist die Möglichkeit, denselben Hefestamm bzw. ein zentrifugiertes Ansatzkonzentrat von an der Sulfitablauge kultivierten Zellen für die gemeinsame oder aufeinanderfolgende Kultivierung an Äthanol zu verwenden.
Grundsätzlich kann erfindungsgemäss nach zwei Varianten vorgegangen werden : erstens ist es möglich, die Hefekultivierung an der Sulfitablauge mit Äthanolzusatz durchzuführen ; zweitens ist es möglich, die Hefekultivierung an fermentierter und zentrifugierter Sulfitablauge unter Zusatz vonÄthanol undNährstoffendurch- zuführen. Bei dieser Variante kann die ausgenutzte Sulfitablauge rezirkuliert werden.
Bei der ersten Variante wird das Verfahren nach dem Gehalt an assimilierbaren Stoffen in der ursprünglichen Sulfitablauge und nach der Leistung des Fermentors geregelt. Die Fermentation lässt sich kontinuierlich entweder einstufig oder, bei grösseren Produktionskapazitäten, insbesondere unter Anwendung einer Sulfitablauge mit höherem Saccharidgehalt, in zwei oder drei Stufen durchführen. Bei der zweistufigen Fermentation kann auch die Biomasse nach der ersten Stufe entfernt und durch frische Biomasse ersetzt werden.
Bei der Arbeit nach der zweiten Variante ist der technologische Vorgang der Fermentation durch die Leistung des Fermentors gegeben. Dabei dient die mit den Hefen vergorene und zentrifugiert Sulfitablauge eigentlich als Verdünnungsmittel für Äthanol. Es werden die Vorteile eines guten physiologischen Mediums
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Nährstoffe ausgenutzt.
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemässe Verfahren :
Beispiel 1 : Zu 10 l Sulfitrohstoff aus dem Kalziumbisulfitverfahrendes Holzkochens (ein Gemisch von Waschwasser und Sulfitablauge) mit einem Gehalt an reduzierenden Stoffen von 18 g/l wurden 136 ml synthetisches Rohäthanol (90%ig) zugegeben, wodurch der Gesamtgehalt an assimilierbaren Stoffen in dem
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NH4nisch gerührten Labor-Glasfermentor mit einem Inhalt von 30 1 gefüllt, mit 10 1 Medium, durchgeführt, wobei eine Sauerstoff-Lösungsgeschwindigkeit von 200 mMol 0/1. h erzielt wurde. Die Kultivierungstemperatur wurde auf 300C und der pH-Wert durch Zusatz von Ammoniakwasser (25%ig) auf 4, 5 gehalten.
Die Kultivierung dauerte 15 h. Das reife Medium enthielt 3 g/l reduzierende Reststoffe, 16 g/l Hefetrockensubstanz und kein Äthanol. Der erzielte Zuwachs von 140 g Hefetrockensubstanz entspricht einer 50%igen Ausbeute der zur Verfügung stehenden reduzierenden Stoffe und einer 65%igen Ausbeute des absoluten Äthanols.
Beispiel 2 : Zu10 1 Sulfitablauge, in welcher der Gehalt an reduzierenden Stoffen durch Kultivierung einer Mischkultur aus Candida utillis var. arborea und Cryptoeoceus diffluens auf 4 g/l herabgesetzt wurde, wurden 136ml rohes synthetisches Äthanol (90 gew.-% lg), was einer Konzentration von 10 g absol. Äthanol/l Sulfitrohstoff entspricht, 46 g NH Cl, 7 g KCl, 4 g MgC12. 6 H20 und 5 ml 85%iger H3 P04 zugegeben. Die- sem fertigen Nährmedium, vorgelegt in dem in Beispiel 1 beschriebenen Fermentor, wurde ein durch Kul- tivierung einer Mischkultur von Candida utillis var. arborea und Cryptococcus diffluens an Sulfitablauge erhaltenes Inokulum in einer der Anfangskonzentration an Hefetrockensubstanz von 2 g/l entsprechenden Menge zugegeben.
Bei der bei 300C geführten Kultivierung wurde der pH-Wert durch Zusatz von Ammoniakwasser (25%ig) auf 4, 5 gehalten. Nach 3 h Kultivierung, als der Äthanolgehalt im Medium auf 2 g/l gesunken war, wurden dem fermentierten Medium weitere 136 ml rohes synthetisches Äthanol zugesetzt. Die Kultivierung wurde nach 8 h beendet, als der Äthanolgehalt des Mediums unter 0, 5 g/l gesunken war. Das reife Medium enthielt 15 g Hefetrockensubstanz/l. Der erzielte Zuwachs von 124 g an Hefetrockensubstanz entspricht einer Ausbeute von 62% auf Basis des zugesetzten absoluten Äthanols.
Die gereinigte erhaltene Biomasse enthielt in der Trockensubstanz 8, 5% Aschenbestandteile und 51% stickstoffhaltige Stoffe mit einem Verdaulichkeitskoeffizienten von 87%. Der Aminosäuregehalt des Rohproteins betrug :
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<tb> Alanin <SEP> 6, <SEP> 0% <SEP> Lysin <SEP> 7,9%
<tb> Arginin <SEP> 4, <SEP> 1% <SEP> Methionin <SEP> 1, <SEP> 6%
<tb> Asparaginsäure <SEP> 9, <SEP> 2% <SEP> Phenylalanin <SEP> 4, <SEP> 1% <SEP>
<tb> Cystin <SEP> 1, <SEP> 1% <SEP> Prolin <SEP> 3, <SEP> 1% <SEP>
<tb> Glutaminsäure <SEP> 15, <SEP> 2% <SEP> Serin <SEP> 4, <SEP> 7%
<tb> Glycin <SEP> 4,8% <SEP> Threonin <SEP> 4, <SEP> 3%
<tb> Histidin <SEP> 2,4% <SEP> Tryptophan <SEP> 1,5%
<tb> Isoleuein <SEP> 4, <SEP> 3% <SEP> Tyrosin <SEP> 3, <SEP> 2%
<tb> Leucin <SEP> 8, <SEP> 1% <SEP> Valin <SEP> 5,
7%
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Beispiel 3 : Die in Beispiel 2 beschriebene Kultivierung wurde mit dem selben Rohstoff und in dem selben Fermentor wiederholt, mit dem Unterschied, dass als Inokulum die Hefe Candida utillis, gezüchtet in einem synthetischen Medium mit synthetischem Äthanol, verwendet wurde. Die Kultivierung dauerte 7,30 h, und der erzielte Zuwachs der Hefetrockensubstanz entsprach einer Ausbeute von 64%, bezogen auf das zugesetzte absolute Äthanol.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Hefeproteinen aus Sulfitablauge und Sulfitablaugeschlempe unter Zu-
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tigen Substanzen in der Sulfitablauge und Sulfitablaugeschlempe durch Zusatz von Äthanol bis auf 10% erhöht und unter Einsatz solcher Hefen, welche die ausnutzbaren Stoffe der Sulfitablauge und/oder Äthanol assimilieren, vorzugsweise Wuchshefen, z. B. unter Einsatz der asporogenen Hefen der Gattung Candida, fermentiert.
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