Verfahren zur Anreicherung von Aneurin in pflanzlichen Mikroorganismen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Aneurin in pflanzlichen Mikroorganismen, und zwar in solchen, die für Nährzwecke geeignet sind.
Durch Zugabe von Aneurin zur gärenden Hefe kann der Vitamin-B,- Gehalt der Hefe beträchtlich gesteigert werden. Aneurin ist aber für diesen Zweck ein verhältnismässig kostspieliges Ausgangsmaterial.
Gemäss der vorliegenden Erfindung er folgt die Anreicherung von Aneurin in pflanzlichen Mikroorganismen in der Weise, dass man auf die Mikroorganismen Pyrimidin- und Thiazolderivate, zweckmässig in äqui- molaren Mengen, einwirken lässt.
Der Zusatz kann dabei bei der Züchtung der betreffen den Mikroorganismen erfolgen, also beispiels weise bei der Züchtung von Hefen im Lüf tungsverfahren, unter Verwendung der ver schiedenartigsten Nährlösungen, wie Melasse, Würzen und Maischen aus Getreide, Kartof feln und andern stärkehaltigen Rohstoffen, Zuckerlösungen aus Rohrzucker, Glukose oder dergleichen, Holzzuckerlösungen, Sulfit- ablaugen und andern technischen zuckerhal tigen Abwässern. Der Zusatz der Pyrimidin- und der Thiazolderivate kann aber auch bei der Vergärung der vorstehend erwähnten zuckerhaltigen Lösungen vorgenommen wer- den.
Auch nach stattgehabter Gärung oder Züchtung kann die Zugabe der genannten Derivate erfolgen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die Pyrimidin- und die Thiazolderivate mit den Mikroorganismen in Wasser zusammen gebracht, wobei man zweckmässig durch Rüh ren oder Schütteln ein Absitzen der Mikro organismen verhindert. Das Verhältnis zwi schen Wasser und Mikroorganismen kann in weiten Grenzen schwanken. Hefe z. B. kann man in dickbreiig-wässrigem Zustand ver arbeiten.
Ein für die Durchführung des erfin dungsgemässen Verfahrens geeigneter Mikro organismus ist insbesondere die Torula utilis. Aber auch mit Presshefe konnte eine erheb liche Aneurin-Anreicherung erzielt werden. Das neue Verfahren ist nicht auf die Ver wendung von Hefen beschränkt, auch Pilze, wie beispielsweise Oidium lactis und En- domyces vernalis, asperg_ illus oryzae, können benutzt werden.
Aus den zugesetzten Pyrimidin- und Thi- azolderivaten synthetisieren die betreffenden MikroorganismenAneurin, das grösstenteils in Form von Vitamin-B,-Pyrophosphorsäure (Cocarboxylase) entsteht; gleichzeitig werden erhebliche Mengen Vitamin B, gespeichert. Gegenüber dem bekannten Verfahren, bei dem das fertige Aneurin der gärenden Hefe zugesetzt wird, hat das erfindungsgemässe Verfahren den Vorteil, dass von wesentlich billigeren Ausgangsstoffen ausgegangen wer den kann.
In erster Linie kommt zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens die An wendung von 2-Methyl-4-amino-5-oxymethyl- pyrimidin und 4-Methyl-5-oxäthyl-thiazol in Betracht. Diese Substanzen stehen den bei der Spaltung vonAneurin anfallendenBruch- stücken am nächsten, wobei jedoch erwähnt sei, dass Aneurin in vitro aus diesen Verbin dungen nicht ohne weiteres synthetisiert wer den kann.
Besonders zweckmässig ist es, zur Durchführung des erfindungsgemässen Ver fahrens solche Pyrimidin- und Thiazolderivate zu benutzen, die leichter als die vorstehend erwähnten Derivate zugänglich sind, die also bei der Reaktionsfolge, die zur chemischen Synthese des Aneurin führt, als Ausgangs stoffe dienen.
Als derartige Pyrimidinderi- vate seien beispielsweise 2-Methyl-4-amino-5-nitrilo-pyr imidin, 2-blethyl-4-amino-5-aminomethyl-pyrimidin, 2-Methyl-4-amino-5-carbomino-methyl- pyrimidin, 2-Methyl-4-hal-5-pyrimidyl-essigester oder 2-Methyl-4-oxy-5-pyrimidyl-essigester erwähnt. Geeignete Thiazolderivate sind u. a.:
4-141:ethyl-5-äthoxyäthyl-thiazol und 4-Methyl-ss-halogenäthyl-thiazol und insbesondere 4-Methyl-ss-chloräthyl-thiazol. Die zur Anwendung gelangenden Mengen von Pyrimidin- und Thiazolderivaten können ; innerhalb weiter Grenzen geändert werden. Bei relativ hohen Konzentrationen werden die behandelten Mikroorganismen ausserordent lich vitaminreich, jedoch erfolgt dabei die Ausnützung der Ausgangskomponenten weni- ; ger rationell.
Eine grössere Menge derselben verbleibt unverbraucht in der Flüssigkeit, je doch kann man die von den Mikroorganismen befreite Flüssigkeit mit oder ohne Ergänzung der verbrauchten Menge an Pyrimidin- und an Thiazolderivaten mit weiteren Mikroorga nismen erneut zum Ansatz bringen. Bei An wendung von verhältnismässig hohen Konzen trationen wird ein grösserer Teil des anfal lenden Aneurins als freies Aneurin erhalten, während der in Cocarboxylase übergeführte Anteil geringer ist.
Wendet man die Pyri- midin- und Thiazolderivate in relativ nied riger Konzentration an, dann ist ihre prozen tuale Ausnützung günstiger und der Anteil an phosphoryliertemAneurin (Cocarboxylase) höher. Der absolute Vitamingehalt der betref fenden vorbehandelten Mikroorganismen ist dann aber vergleichsweise niedriger.
Für die in der Zelle erfolgende Umwandlung von Aneurin in Aneurinpyrophosphat (Cocarbo- xylase) spielt übrigens die zugesetzte bezw. vorhandene Menge an organisch gebundenem. und anorganischem Phosphat eine Rolle.
Das in den Mikroorganismen angespei- cherte Aneurin kann in üblicher Weise iso liert werden. In manchen Fällen wird ein Teil des Aneurins an die umgebende Flüssig keit abgegeben, was insbesondere bei der Ver arbeitung von Presshefe der Fall ist. Auch dieses Aneurin kann in bekannter Weise als Konzentrat oder in reinem Zustande gewon nen werden.
Im folgenden soll die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens an Hand von einigen Ausführungsbeispielen näher erläu tert werden.
<I>Beispiel 1:</I> Bei der üblichen Züchtung von Torula utilis in Holzzucker (vergl. Fink und Krebs, Biochem. Zeitschrift 302, 1, 1939) nach dem Lüftungsverfahren wurden. 7 mg 4-Methyl- 5-oxäthyl-thiazol und 7 mg 2-Methyl-4- amino-5-oxymethyl-pyrimidin zugegeben.
Aus 12,0 Torula-Stellhefe <B>(23,2%</B> Trockensub- stanzgehalt, mit 21y Vitamin B, in 1 g Trok- kensubstanz) wurden 56,3 g Erntehefe erhal ten (21,0% Trockensubstanz), die 208 y Vit amin B,. pro 1 g Trockensubstanz, davon 162 y in Form von Cocarboxylase enthielt. Gegen über der Ausgangshefe wurde also eine Vit- amin-B,,-Anreicherung auf 1000,% erzielt.
Der Gehalt an Cocarboxylase hatte sich etwa verneunfacht.
<I>Beispiel 2:</I> 10 g Torula utilis mit einem Vitamin-B,.- Gehalt von 20 y in 1 g Trockensubstanz wur den in 200 cm' einer Lösung, die 20 g Glu cose und ein übliches Nährsalzgemisch ent hielt, unter Zugabe von 2800 y Thiazol- und 2800 y Pyrimidinderivat aufgeschwemmt und mehrere Stunden der Gärung überlassen.
Die so vorbehandelte und gewaschene Hefe ent hielt 749 y Vitamin B,. in 1 g Trockensub stanz, davon<B>97%</B> in phosphorylierter Form als Cocarboxylase. Der -Vitamin-B,-Gehalt dieser Hefe war also auf das 35fache der Ausgangshefe gestiegen.
Bei einem ähnlichen Ansatz, der aber nur der oben zugesetzen Thiazol- und Pyrimi- i dinmengen enthielt, betrug der Vitamin gehalt der angereicherten Hefe 241 y/1 g Trockensubstanz, das ist das 12fache der Ausgangshefe.
Wurden in der von der angereicherten Hefe abgetrennten Gärflüssigkeit nochmals 10 g Hefe aufgeschwemmt und wiederum der Gärung überlassen, so resultierte wieder eine Vitamin-B,,-angereicherte Hefe, die das 10- bezw. 25fache der Ausgangshefe an Vitamin B,, zumeist in der phosphorylierten Form, enthielt.
<I>Beispiel 3:</I> 10g Br ennereihefe mit einem Vitamin- B,-Gehalt von 35 y pro 1 g Trockensubstanz s wurden in 200 cm' einer Lösung, die 20 g Melasse und ein übliches Nährsalzgemisch enthielt, unter Zugabe von je 7 mg Thiazol- und Pyrimidinderivat aufgeschwemmt und der Gärung überlassen. Die so vorbehandelte Hefe enthielt 1087 y Vitamin B,. pro 1 g Trockensubstanz. Der Vi-tamin-BI-Anreiche- rungseffekt betrug also hierbei 3000%, be zogen auf die Ausgangshefe.
<I>Beispiel</I> 10 g Torula utilis mit einem Vitamin gehalt von 21 y in 1 g Trockensubstanz wur den in 200 cm' Leitungswasser unter Zugabe von je 7 mg Thiazol- und Pyrimidinderivat aufgeschwemmt und einige Stunden geschüt telt. Die so vorbehandelte und gewaschene Hefe enthielt 1151 y Vitamin B,. pro 1 g Hefetrockensubstanz. Der Anreicherungs effekt betrug also mehr als 5000%, bezogen auf die Ausgangshefe.
Der gleiche Anreicherungseffekt wurde auch dann erzielt, wenn die Wassermenge auf 1/4 der obigen verringert wurde, so dass der Hefeansatz ziemlich dickbreiig war. Die so vorbehandelte Hefe enthielt 1181y Vit amin B,. in 1. g Trockensubstanz und war somit auf etwa das 60fache der Ausgangs hefe angereichert.
Ein ähnliches Ergebnis wurde erhalten, wenn nur '/" der obigen Thiazol- und Pyrimidinmengen zugesetzt wurden. Die Hefe enthielt in diesem Falle 497 y Vitamin B, in 1 g Trockensubstanz, das ist also etwa 25mal mehr als die Ausgangshefe.
<I>Beispiel 5:</I> 220 em@ sterile 6 % ige Malzwürze wurden mit 715, y Thiazol- und 690 y Pyrimidinderi- vat versetzt und mit Oidium lactis beimpft. Der nach einigen Tagen geerntete Pilz ent hielt 180 y Vitamin B, pro 1 g Trockensub stanz, während er ohne Zugabe im sonst gleichen Kontrollansatz nur 65 y enthielt. Es war also eine Anreicherung im Vitamin-B,- Gehalt auf rund das dreifache erzielt worden.
<I>Beispiel 6:</I> 220 cm' sterile 6 % ige Malzwürze wurden mit 715<I>y</I> Thiazol- und 690<I>y</I> Pyrimidin- derivat versetzt und mit Endomyces vernalis beimpft. Der nach einigen Tagen geerntete Pilz enthielt 92 y Vitamin B, pro 1 g Trok- kensubstanz, während er im gleichen Kon- trollansatz, aber ohne Zusätze, nur 18 y auf wies.
Es war also eine Anreicherung im Vitamin-B,-Gehalt auf rund das fünffache eingetreten.
Beispiel 220 cmj sterile 6%ige Malzwürze wurde mit 715<I>y</I> Thiazol- und 690<I>y</I> Pyrimidinderi- vat versetzt und mit Aspergillus oryzae be- impft. Der nach einigen Tagen geerntete Pilz enthielt 153 y Vitamin B1 pro 1 g Trolt- kensubstanz, während er im gleichen Kon- trollansatz nur 18 y enthielt.
Es wurde also eine Vitamin-B,-Anreicherung auf das rund achtfache' erzielt.
Wurde in der von der angereicherten Hefe abgetrennten Flüssigkeit nochmals neue Ausgangshefe aufgeschwemmt, so resultierte wieder eine fast ebenso beträchtlich ange reicherte Hefe, da die zugesetzten Mengen an Thiazol- und Pyrimidinderivaten beim ersten Mal nicht erschöpft worden waren. Der An reicherungseffekt gelang sogar mit fast der gleichen Wirkung ein drittes Mal.