AT210066B

AT210066B - Gewinnung von Vitamin B12 oder Vitamin B12-enthaltenden Futtermitteln

Info

Publication number: AT210066B
Application number: AT612356A
Authority: AT
Original assignee: Benckiser Gmbh Joh A
Priority date: 1955-10-13
Filing date: 1956-10-13
Publication date: 1960-07-11

Description

Gewinnung von Vitamin B12 oder Vitamin Bis-enthaltenden
Futtermitteln
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwertung von Abläufen oder Schlempen der melasseverarbeitenden Industrien mit Hilfe von Mikroorganismen. Ziel der Erfindung ist es, aus biologisch minderwertigen Melasseschlempen ein wertvolles, Vitamin B12 enthaltendes Futter- bzw. Beifuttermittel für die Tierernährung oder Vitamin B12 selbst zu gewinnen.

Die Gewinnung von Vitamin B mit Hilfe eines speziellen Stammes von Bacillus megatherium ist zwar schon bekannt, es werden hiebei jedoch höhere Anforderungen an das zu verwendende Nährmedium gestellt. So werden als Energiequelle vor allem reine Kohlehydrate, wie z. B. Saccharose, Dextrose, Fructose, Maltose und Stärke, oder Polyalkohole, wie Glycerin, Mannit, Sorbit usw., verwendet. Es handelt sich in allen diesen Fällen um teure Ausgangsmaterialien, die zudem noch in relativ hohen Konzentrationen eingesetzt werden müssen. Die erfindungsgemäss zu verwendenden Melasseschlempen stellen im Gegensatz zu den obigen Ausgangsmaterialien ein wertloses Abfallmaterial dar, für das bisher kein geeigneter Verwendungszweck bekannt war und zu dessen Beseitigung zudem erhebliche Kosten aufgewendet werden mussten.

Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 beruht auf der submersen Züchtung von Streptomyces olivaceus in einem wässerigen Nährmedium, welches eine Kohlehydrat- und eine Stickstoffquelle und Kobaltionen enthält. Als Stickstoffquelle soll hier ein Teil der Abläufe von Getreidebrennereien Verwendung finden. Diese sogenanntenGetreideschlempen unterscheiden sich jedoch in ihrer Zusammensetzung grundsätzlich von Melasseschlempen.

Es wurde auch vorgeschlagen, anstatt der Abläufe von Getreidebrennereien Pilzmycelien von der Penicillinherstellung als Stickstoffquelle zu benützen. Die Zusammensetzung von Pilzmycelien der Penicillingärung ist aber eine andere als beispielsweise die von Pilzmycelien der Glucon- oder Citronensäuregärung, da es sich hiebei sowohl um andere Organismen als auch um völlig andere Gärprozesse mit ganz andern Ausgangsmaterialien handelt.

Es ist ferner bekannt, Getreideschlempen als Nährmedium für Mikroorganismen zu verwenden. Für
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B.Fett- und Eiweissbetriebe auf biosynthetischer Grundlage wurde bisher eine solche Möglichkeit nicht gefunden ; infolgedessen wird die Melasseschlempe dieser Betriebe zumeist als schwer zu beseitigendes Abwasser besonderen Behandlungsverfahren unterworfen und sodann teilweise verworfen oder aber nach ihrer Eindampfung verbrannt sowie auf Kaliumcarbonat, Glycerin oder Glutaminsäure verarbeitet. In andern Fällen wird sie als Düngemittel verregnet oder in der ersten Stufe zu Methan und in weiteren Stufen aerob vergoren ; hiezu gehört auch die Behandlung in Rieselfiltern.

Man hat Brennereischlempen auch schon als Nährmedium zum Züchten von Hefe verwendet. Doch hat dieses Verfahren den Nachteil, dass dabei ein sehr hoher Schwefelsäureverbrauch eintritt, da die aus den organischen Salzen freigemachten organischen Säuren von der Hefe verbraucht werden und dadurch der PH- Wert fortlaufend in das alkalische Gebiet verschoben wird, wenn nicht dauernd Schwefelsäure zugesetzt wird, um durch pH-Einstellung das Wachstum der Hefen zu ermöglichen. Es ist ferner vorgeschlagen worden, die Massenzüchtung von mycelbildenden Schimmelpilzen verschiedener Gattungen

unter Verwendung einer Umwälzeinrichtung und eines besonderen Behälters vorzunehmen, wobei erwähnt wird, dass die verschiedensten Substrate für verschiedene Bakterien und Bazillen verwendet werden können.

Es sind auch schon Verfahren zur Modifizierung proteinhaltiger Materialien bekanntgeworden, wobei durch Biosynthese mittels Hefen oder Bakterien der Gruppe Aerobacter wachstumsfördernde Substanzen gebildet werden. Vitamin B12 konnte nach dieser Methode bzw. mittels der hiebei verwendeten Hefen oder Bakterien nicht gewonnen werden.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man aus Abläufen oder Schlempen aller Art der melasseverarbeitenden Industrien, z. B. von Abläufen der Gärungsindustrie, wie Melasseschlempen, Abläufen aus der Citronensäuregärung, Abläufen der Glutaminsäuregewinnung usw., gegebenenfalls nach einer vorhergehenden Sterilisation, durch Vergärung mittels Spalt-, Strahlen- oder Fadenpilzen Vitamin B-hältige Umsetzungsprodukte erhalten kann, aus welchen Vitamin B12 enthaltendes Futtermittel bzw. Vitamin B12 hergestellt werden kann.

Die durch die Erfindung eröffnete Möglichkeit zur Verwertung der genannten Abläufe ist deswegen als überraschend anzusehen, weil nicht vorauszusehen war, dass sich Abläufe aller Art der melasseverarbeitenden Industrien zur Züchtung von solchen Mikroorganismen eignen würden ; Hefen, die vor allem zur Melasseverwertung eingesetzt wurden, nehmen nämlich unter den Mikroorganismen eine Sonderstellung ein und weisen andersgeartete Stoffwechselvorgänge auf.

Das überraschende Moment liegt auch darin, dass die Melasseschlempen als Abläufe der Gärungsindustrie nur wenig assimilierbaren Stickstoff enthalten, da ein grosser Teil hievon durch die zur Vergärung verwendeten Mikroben bereits aufgenommen worden ist und in der Schlempe vorwiegend nur schwer assimilierbarer Betainstickstoff verbleibt ; dennoch werden die in der Melasseschlempe verbleibenden Reststickstoffverbindungen von den Spalt-, Strahlenoder Fadenpilzen, die in Melasseschlempen enthaltenden Medien gedeihen können, zu einem grossen Teil assimiliert und dabei unter Bildung von Vitamin B12 einer wirtschaftlichen Verwertung zugeführt.

Zweckmässigerweise setzt man erfindungsgemäss der Schlempe Autolysate, Plasmolysate, Thermo- lysate und Hydrolysate von Mikroorganismen zu, da sich diese Massnahme für das Wachstum und die physiologische Leistung der Spalt-, Strahlen- und Fadenpilze infolge des Gehaltes der Autolysate, Plasmo- lysate und Thermolysate an hochmolekularen Stickstoffverbindungen und Wirkstoffen, wie z. B. Wuchsstoffen, Vitaminen u. ähnl., günstig auswirkt. Im allgemeinen verwendet man hiebei die Autolysate, Plasmolysate, Thermolysate derjenigen Mikroorganismen, die bei der Vergärung von Melasse entstanden sind. Hiedurch ergibt sich der besondere Vorteil, dass man nicht nur die Schlempen, sondern auch die sonst als unbrauchbar anfallenden Mikroorganismenmassen aus der Melasse Vergärung, z.

B. bei einer Citronensäuregewinnung, einer Verwertung zuführen kann. Man kann ferner bei der Ausübung der Erfindung den Schlempen in an sich bekannter Weise Nährsalze und bzw. oder Spurenelemente zugeben.

Man kann aber auch Autolysate, Plasmolysate oder Thermolysate von Organismen verwenden, die bei andern biologischen Verfahren als Abfall anfallen, wie z. B. bei der Antibiotikagewinnung zurückbleibende Pilzmassen.

Ein besonders wertvolles Beifutter oder Futtermittel wird erhalten, wenn die Schlempen, z. B. aus der Citronensäuregärung, mit einem Streptomyces olivaceus vergoren werden, der eine hohe Vitamin B12- Ausbeute gewährleistet. Man kann zu diesem Zwecke auch Streptomyces aureofaciens einsetzen.

Der Vorteil der Erfindung besteht im wesentlichen also darin, dass bei der Vergärung der Schlempe im Gegensatz zu der Verhefung ein Zusatz von Schwefelsäure nicht mehr erforderlich ist und gegenüber der Verhefung ein wesentlich wertvolleres Beifutter- bzw. Futtermittelprodukt bzw. biologische Wirkstoffe hergestellt werden können.

Die Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung beschränkt sich nicht auf die beispielsweise genannten Schlempen aus der Nahrungsmittelindustrie. Es können auch Schlempen aus der anaeroben Methanvergärung verwendet werden. Auch hiebei ist es zweckmässig, Autolysate, Thermolysate, Plasmolysate, Cytolysate oder Hydrolysate der Mikroorganismen als Zusatz für das Nährmedium mit einzusetzen.

Bei der Methanvergärung wird bekanntlich die organische Substanz, wie z. B. Kohlehydrate oder andere stickstofffreie Kohlenstoffverbindungen, vergast. Während bei der Methanvergärung die stickstofffreien Kohlenstoffverbindungen zu einem sehr grossen Teil in gasförmige Produkte umgeformt werden können, werden solche organische Kohlenstoffverbindungen, die Stickstoff enthalten, auch zersetzt, jedoch verbleibt der Stickstoff als Ammoniumsalz in dem Nährmedium, während der Kohlenstoff zu einem sehr grossen Anteil in gasförmige Produkte übergeführt wird. Daher ist die Methan-Gas-Vergärung dadurch ausgezeichnet, dass Stickstoffverluste praktisch nicht entstehen.

So erweist sich eine derartige Schlempe aus der Methanvergärung auf Grund ihres Stickstoffgehaltes (vorzugsweise als Ammoniumverbindungen) und der vorhandenen Spurenelemente als besonders geeignetes Nährmedium für B -Bildner. Der Aufschluss

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Erfindung2, 31o organische Substanz, 3, 30/0 Asche) werden 15 Minuten bei 1800 C kontinuierlich sterilisiert, auf einen p-Wert von 6 eingestellt und in gleichen oder grösseren Mengen als in den vorstehenden Beispielen angegeben, als Nährsubstrat und gärungsfördernder Zusatz verwendet, mit einer Kultur von Streptomyces olivaceus beimpft und 48 Stunden submers unter aeroben Bedingungen vergoren ;

dabei wird ein Erzeugnis erhalten, dessen Trockensubstanz po beträgt und das ungefähr 0,8 mg Vitamin B12 im Liter enthält ; es-wird zur Verwendung als Futtermittel zur Trockne eingedampft.

Der bei der Methanvergärung entstehende Schlamm wird nach der Autolyse oder Thermolyse den Abläufen zugemischt.

Beispiel 5 : 50 kg frisches, noch feuchtes Pilzmycel (Aspergillus niger) aus der Citronensäuregärung werden mit 50 I Mutterlauge von der Citronensäuregärung versetzt, mechanisch zerkleinert und bei 1800 C sterilisiert. Dieser Mycelbrei wird nun in eine Gärtrommel gebracht und mit 10 1 einer Schüttelkultur von Streptomyces olivaceus beimpft. Nach einer Laufzeit von 2 bis 4 Tagen, während der die Temperatur auf 25 - 300 C gehalten wird, ist der Prozess beendet. Die aufgeschlossene Pilzmasse wird auf einem Walzentrockner vom Wasser getrennt und schliesslich gemahlen. Man erhält etwa 13 kg eines bräunlichen Produkts, das auf Grund seines Gehaltes an wachstumsfördernden Wirkstoffen (Vitamine, Fermente usw. ) ein ausgezeichnetes Futtermittel bzw. Futterzusatzmittel darstellt.

Beispiel 6 : In einem geschlossenen Gefäss mit einem eingebauten langsam laufenden Schaufelrührwerk werden 20 kg abgepresste Pilzmasse (Aspergillus niger) von der submersen Gluconsäuregärung mit 30 l kontinuierlich sterilisierter Melasseschlempe (Brennereischlempe) versetzt und sterilisiert. Die Melasseschlempe ist folgendermassen zusammengesetzt : 4, 5 g Stickstoff im Liter, 1,7 g reduzierende Substanz (als Glucose berechnet) im Liter, 0, 15 g Pug im Liter (Balling 110, PH-Wert 5, 2).

Die erkaltete, dickflüssige Pilzmasse wird hierauf mit 5 l einer Suspension in submerser Kultur herangezüchteten Streptomyces griseus beimpft und 24 - 48. Stunden unter ständigem Rühren und schwacher Belüftung auf einer Temperatur von 28 bis 300 C gehalten. Die aufgeschlossene Pilzmasse wird hierauf abgelassen und getrocknet. Man erhält 7 kg trockenes Material mit einem durchschnittlichen Feuchtigkeitsgehalt von 5%, das als Futtermittel verwendet werden kann.

Beispiel 7 : 4 kg gewaschene, zerkleinerte Pilzdecke (Aspergilluswentii) werden mit 20 1 Melasseablauf von der Citronensäureherstellung, wie sie nach Fällung des Calciumcitrats anfällt (Trockensubstanz- gehalt etwa 10go), und 80 mg Cobaltnitrat versetzt, mit Wasser auf 40 l aufgefüllt und sterilisiert. Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf 6-7 eingestellt. Das erkaltete Medium beimpft man nun mit 5 l einerSubmerskultur vonStreptomyces olivaceus. Die Anzucht des Impfmaterials erfolgt in einer Schüttel- kultur, wobei sich ein Mycel-Melasse-Schlempe-Medium gut eignet.

Das beimpfte Nährmedium wird dann in einem Fermenter unter Rühren und Zuführen von 600 l Luft/Stunde bei 300 C belüftet. Nach 3 - 4 Tagen wird das dickflüssige Medium abgelassen und schonend getrocknet. Man erhält etwa 2,5 kg eines Trockenproduktes mit einem Vitamin B-Gehalt von 10 bis 30 Mikrogramm/Gramm, das als wachstumsförderndes Zusatzfuttermittel Verwendung findet oder zur Gewinnung von Vitamin B verarbeitet werden kann.
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8 : 200 1 Abläufein Beispiel 1 angegeben, behandelt ; die endvergorene Maische mit einem Trockensubstanzgehalt von etwa 4'1/0, von welchem etwa die Hälfte Protein ist, enthält etwa 0, 8 mg Vitamin B12 im Liter.

Soll aus den gemäss den obigen Beispielen erhaltenen Trockenprodukten Vitamin B12 in reiner Form gewonnen werden, so müssen die Mikroben nach etwa 60stündiger Gärzeit bei Verwendung von Streptomyces olivaceus und nach einer 5stündigen Gärzeit bei Bacillus megatherium aus der Gärflüssigkeit abzentrifugiert werden. Aus den Trockenprodukten wird das Vitamin B12 durch Extraktion od. dgl. in bekannter Weise gewonnen.

Beispiel 9 : 50 kg gewaschenes, noch feuchtes Pilzsubstrat von der Citronensäuregärung wird grob zerkleinert, sterilisiert und in einer Gärtrommel mit 5 l einer Submerskultur von Streptomyces olivaceus
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die Temperatur in der rotierenden Gärtrommel auf etwa 25 - 300 C gehalten. Der Aufschlussprozess ist nach 24 - 48 Stunden beendet und die aufgeschlossene Pilzmasse kann nun auf einer Trockenwalze oder irgendeinem andern geeigneten Trockner vomWasser befreit werden. Man erhält ungefähr 10 kg Trockenprodukt, das ein ausgezeichnetes Futtermittel darstellt.

Beispiel 10 : In einem geschlossenen, mit einem Rührwerk versehenen Behälter werden 30 kg zerkleinerte Pilzsubstanz von der Citronensäuregärung sterilisiert und nach dem Erkalten mit 5 1 einer

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das Produkt anaerob einem weiteren Aufschliessungsprozess unterworfen, wobei Vitamin B12 entsteht, das nach bekannten Methoden isoliert wird.

Aus dem Aufschliessungsprodukt lassen sich wertvolle Viehzusatzfuttermittel herstellen.

Beispiel 15 : 25 kg zerkleinerte Pilzdecke (Aspergillus niger), 250 l Melasseschlempe aus der Citronensäureherstellung, die nach Ausfällung der Citronensäure als Calciumsalz erhalten wird, 50 I ent- rahmte Frischmilch (der Milchzusatz kann durch andere geeignete Eiweiss- bzw. Kohlehydratquellen, wie Sojamehl bzw. Molkenpulver, ersetzt werden), 0,5 kg Diammoniumphosphat, 2,5 kg Calciumcarbonat und 200 I Wasser werden durch Kochen sterilisiert und mit 25 1 einer Kultur eines nisinbildenden Stammes von Streptococcus lactis beimpft. Hierauf wird das Medium in einem Fermenter unter langsamem Rühren (etwa 75 Umdr/min) ohne Belüftung bei 30 'C gehalten.

Nach 12-16 Stunden ist der Aufschluss der Pilzdecke sowie die Milchsäuregärung beendet. Die Gärlösung enthält 1000-2000 Einheiten Nisin je ml.

Nach Eindampfung erhält man ein durch seinen Gehalt an Milchsäure und Milchsäurebakterien gutes Silagemittel, das den besonderen Vorzug hat, auf Grund seines Nisingehaltes die im Silo futter gefürchtete Entwicklung von Buttersäurebakterien zu unterdrücken.

Das Trockenprodukt mit dem Antibiotikum Nisin kann auch als wachstumsförderndes Beifuttermittel für die Tieremährung Verwendung finden.

Beispiel 16 : Es wird gemäss Beispiel 15 gearbeitet. Nach Abschluss des Wachstums von Streptococcus lactis beimpft man durch Zugabe in den Fermenter mit 251 einer Kultur von Propionibacterium freudenreichii. Nach einer Gärzeit von 3 bis 4 Tagen unter langsamem Rühren wird der Ansatz getrocknet und ergibt ein Beifuttermittel mit antibiotischer Wirksamkeit (Nisin) und Vitamin B-Aktivität.

Die Verwendung als Silagemittel ist auf Grund des Gehaltes an Propionsäure, Milchsäure und Nisin möglich. Ein besonderer Vorteil besteht darin, dass dieses Silagemittel das Wachstum von Buttersäurebakterien unterdrückt ; die erhaltenen Silofuttermittel enthalten das volle Vitamin B12.

Beispiel 17: Der Aufschluss der Pilz decke (Pilzmycelien von Aspergillus-Arten) in Anwesenheit von Melasseabläufen mit Propionibacterium freudenreichii gelingt auch ohne vorherige Behandlung des Gärsubstrates mit Milchsäurebakterien. Dazu werden 10 kg Pilzmycelien zerkleinert, mit 75 l Gärablauge, 0, 1 kg Diammoniumphosphat und 0, 5-1 kg Calciumcarbonat versetzt, mit Wasser auf 100 1 aufgefüllt und bei 1200 C sterilisiert. Das so vorbereitete Substrat beimpft man mit 5 l einer unter anaeroben Bedingungen herangezüchteten Kultur von Propionibacterium freudenreichii. Hierauf wird das Medium in einem Fermenter unter langsamem Rühren (60-100 Umdr/min) ohne Belüftung bei 300 C gehalten.

Die Verwendung von Propionibacterium freudenreichii hat den Vorteil, dass die Gärung in saurem Milieu (pH-Verlauf etwa von 7 abfallend bis 4,7) vor sich geht und die Gefahr der Infektion durch Fremdorganismen beseitigt ist. Nach 3 - 4 Tagen Gärzeit kann der Ansatz zu einem Zusatzfuttermittel mit beachtlichem Vitamin B12-Gehalt aufgearbeitet werden. Die Ausbeute an Vitamin B12 kann durch Zusatz einer für Propionibacterium freudenreichü vergärbarenKohlenstoffquelle, z. B. Glucose oder Milchsäure, beträchtlich erhöht werden. Zweckmässig ist es, hiezu glucosehaltige Abläufe oder Melassen mit hohem Invertzuckergehalt zu verwenden.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verwendung von Abläufen oder Schlempen der verschiedenen melasseverarbeitenden Industrien, z. B. von Abläufen der Gärungsindustrie, wie Melasseschlempen, Abläufen aus der Citronensäuregärung, Abläufen der Glutaminsäuregewinnung usw., gegebenenfalls in Gegenwart von Autolysaten, Plasmolysaten oder Thermolysaten von Mikroorganismen, zur Gewinnung von Vitamin B12 oder-Vitamin B -enthaltenden Futtermitteln durch Vergärung mit Vitamin B-bildenden Spalt-, Strahlen- oder Fadenpilzen.

Claims

2. Verwendung von Abläufen oder Schlempen nach Anspruch 1, welche in an sich bekannter Weise Nährsalze und bzw. oder Spurenelemente zugesetzt enthalten.

3. Verwendung von Abläufen der anaeroben Methanvergärung und des dabei gleichfalls anfallenden Schlammes nach seiner Autolyse, Thermolyse oder Plasmolyse nach Anspruch 1.

4. Verwendung von Abläufen oder Schlempen nach Anspruch 1 in Gegenwart von Cytolysaten oder Hydrolysaten von Mikroorganismen.

5. Verwendung von Abläufen oder Schlempen nach den Ansprüchen l und 4 in Gegenwart von Cytolysaten, welche unter Verwendung von Streptomyces olivaceus oder Penicillium claviforme gewonnen wurden.