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Verfahren zur Herstellung von für die Aufbesserung von tiereiweißarmem
Futter geeigneten Vitaminsubstanzen Die Erfindung betrifft die Herstellung wertvoller
Vitaminprodukte durch Gärung, die als zusätzliche Futtermittel verwertbar sind.
Sie betrifft insbesondere ein Herstellungsverfahren für Stoffe, wie Vitamin B12
und verwandte vitaminähnliche Substanzen, die das Wachstum von Lacto bacillus lactis
Dorner fördern, aus Gärungsrückständen, die bei der Züchtung bestimmter Fungi-Stämme
in Nährmedien erhalten werden.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitaminsubstanzen
durch Züchtung eines Mikroorganismus aus solchen Fungi-Stämmen, die auf einem Nährmedium
Fermentierungsprodukte bilden, die mindestens 2o LLD-Einheiten/mg Feststoffe aufweisen.
Diese Züchtung wird in einem flüssigen Medium und innerhalb einer Zeitspanne durchgeführt,
die zur Erzeugung von Fermentationsflüssigkeit mit einer Wirksamkeit von mindestens
2o LLD-Einheiten/mg Feststoffgehalt des Nährmediums ausreicht. Anschließend werden
aus der Fermentationsflüssigkeit wasserlösliche Feststoffe gewonnen, ohne daß dabei
Verluste an Vitaminen auftreten.
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Die auf diese Weise erhaltenen Vitaminsubstanzen haben verschiedene
Anwendungsbereiche. Einer davon ist die Verbesserung von Futtermitteln, die nur
ungenügende Mengen an Tiereiweißfaktor aufweisen.
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Die Vitaminsubstanzen gemäß Erfindung werden zweckmäßig mit Hilfe
des Wachstumtestes an Lacto bacillus lactis Dorner unter den von Shorb (J. Biol.
Chem. 169, 455/56) beschriebenen Bedingungen auf ihre Aktivität untersucht. Die
Wirksamkeit dieser Vitaminsubstanzen, Fermentationslösungen und mit
ihnen
angereicherte Konzentrate werden mit einem willkürlich auf einen Wert von iooo LLD/mg
festgesetzten Leberstandard in Vergleich gesetzt. Es wurde festgestellt, daß reines
kristallines Vitamin B, eine LLD-Aktivität von etwa ii ooo ooo LLD/mg besitzt.
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Es ist schon seit langem bekannt, daß das gewöhnliche Tierfutter und
insbesondere das Hühnerfutter, das hauptsächlich aus pflanzlichen Stoffen, wie Getreidekörnern;
Sojabohnenmehl, Luzernen u. dgl. besteht und einen entsprechenden Gehalt an Aminosäuren,
Mineralsäuren und Vitaminen bekannter chemischer Zusammensetzung aufweist, zu geringe
Mengen an einem Faktor oder an Faktoren enthält, die für ein möglichst hohes Wachstum
und eine ausreichende Fortpflanzung erforderlich sind. Dieser Faktor wird vorzugsweise
in den Geweben gespeichert und gelangt über das Ei in das Kücken. Hühner müssen
daher ein Futter erhalten, das diesen Faktor enthält, damit die Eier gut ausgebrütet
und die Lebensfähigkeit der ausgebrüteten Kücken gewährleistet wird, sie selbst
ein gutes Wachstum zeigen und eine zu hohe Sterblichkeit vermieden wird.. Es liegt
auf der Hand, daß dieser Faktor für den Geflügelzüchter von großer Bedeutung ist.
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Ein gutes handelsübliches Hühnerfutter enthält diesen sogenannten
»Tiereiweißfaktor« oder »animal protein factor«, der im folgenden kurz mit APF bezeichnet
wird, in Form von Fleischabfallprodukten, Lebermehl, Fischmehl, Fischextraktionsrückstände
u. dgl. Diese Stoffe sind verhältnismäßig knapp. Sowohl die Fleischabfallprodukte
als auch Lebermehl sind teuer und erhöhen daher die Unkosten der Geflügelzucht erheblich.
Außerdem enthalten sie nur verhältnismäßig geringe und wechselnde Mengen an APF.
Es war daher wünschenswert, einen billigeren Ausgangsstoff zu finden, der diesen
wichtigen Nahrungsbestandteil in höherer Konzentration enthält.
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Es wurde gefunden, daß der durch die Züchtung gewisser Fungi-Stämme
in wäßrigen Nährmedien gebildete LLD-wirksame Ferrnentationsrückstand solch ein
konzentriertes Ausgangsmaterial für wachstumsfördernde Mittel darstellt, die auf
das Wachstum von Hühnern im wesentlichen die gleiche Wirkung wie. der »Tiereiweißfaktor«
ausüben. Es wurde weiterhin gefunden, daß man mit Hilfe von Reinigungsoperationen
aus diesen Fermentationsrückständen reines Vitamin. B12 gewinnen kann und daß bei
einer Ration mit mangelndem APF-Gehalt mit einem Zusatz von 0,000 003 °/o
Vitamin B12 eine befriedigende und offensichtlich optimale Wirkung auf das Wachstum
von Hühnern erzielt werden kann.
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Gemäß vorliegender Erfindung ist es nicht nötig, Vitamin B12 in reinem
Zustand aus den Fermentationsflüssigkeiten zu isolieren, da schon Konzentrate dieser
Fermentationsflüssigkeiten in jeweils von ihrem Gehalt an LLD-wirksamen Stoffen
abhängenden Mengen als Zusatzfutter verwendet werden können. Es wurde festgestellt,
daß diese Konzentrate in technischem Maßstab in der Weise hergestellt werden können,
daß man bestimmte Fungi-Stämme in einem wäßrigen Nährmedium züchtet und dann bei
Temperaturen, bei denen die LLD-wirksamen Vitaminsubstanzen noch nicht zersetzt
werden, die flüchtigen Anteile von der Fermentationsflüssigkeit abtrennt. Die Fungi-Stämme
erzeugen bei diesem technischen Verfahren Fermentationsflüssigkeiten mit einem Gehalt
von mindestens 2o LLD-Einheiten/i mg der in ihnen befindlichen Feststoffe. Es wurde
gefunden, daß die wasserlöslichen Feststoffe dieser Fermentationsflüssigkeiten eine
Wirksamkeit von etwa iq.o LLD-Einheiten/mg Feststoffgehalt besitzen können und daß
sich auch Konzentrate mit 2ooo LLD-Einheiten und mehr je mg herstellen lassen. Im
Gegensatz dazu enthalten die bisher APF-reichsten, verfügbaren Rohprodukte, nämlich
Fischextraktionsrückstände und Fischmehl, nur etwa i bis 3 LLD-Einheiten/mg.
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Es ist festzustellen, daß ein APF-armes Geflügelfutter durch Zugabe
von o,ooo 003 % Vitamin B12 mit Bezug auf den Tiereiweißfaktor auf seinen
vollen Nährwert gebracht werden kann und daß dieser Zusatz das Wachstum von Hühnern
im gleichen Maße fördert, wie ein Zusatz von etwa i bis 5 °/o Fischextraktionsrückstände,
Fischmehl u. dgl. Die gleiche Menge Vitamin B12 entspricht einem Gehalt von etwa
330 ooo LLD-Einheiten/kg Futter. Werden 165 mg eines Konzentrats von 2ooo LLD-Einheiten/mg
auf i kg Futter zugesetzt, so enthält i kg Futter 330 ooo LLD-Einheiten.
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Es ist bekannt, daß- verschiedene Gärungsrückstände als Futterzusatz
verwendet worden sind, da sie Riboflavin und andere Vitamine bekannter Struktur,
wie Biotin, Pantothensäure u. dgl., enthalten. Es wurde gefunden, daß diese bisher
verwendeten Stoffe nur geringe Mengen an LLD-wirksamen Substanzen aufweisen; so
enthalten z. B. die Gärungsrückstände von der Butylgärung etwa nur q. LLD-Einheiten/mg,
während Gärungsrückstände von der Getreidedestillation weniger als i LLD-Einheit/mg
enthalten. Daraus geht hervor, daß der Wirkstoffgelhalt der Gärungsrückstände zu
gering ist, als daß es lohnend wäre, Konzentrate zu bilden, mit denen man APF-armes
Futter aufbessern könnte.
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Voraussetzung für die Gewinnung solcher Konzentrate ist, daß die Fermentationsflüssigkeit
einen Gehalt von mindestens 2o LLD-Einheiten/mg der darin befindlichen Feststoffe
hat. Es wurde gefunden, daß zur Erzeugung von Fermentationsflüssigkeiten dieser
Wirkungskapazität die auf Seite 2 des Werkes »Aü Introduction to Industrial Mycology«-von
Smith und Taistrick- (London, Edward Arnold :and Ca: 1938)
genannten Fungi:
die Myxomyceten, Schizoiüyceten und Eumyceten zu verwenden sindu: -Unter diesen
sind die Schizomyceten und insbesondere gewisse Stämme der Species Streptomyces
griseus, die auch zur-Herstellung der Antibiotica Streptomycin und Grisein dienen
können, besonders geeignet. Unter den anderen Species von Streptomyces, wie 'Streptomyces
albidoflavus, Streptomyces colombiensis nov. sp., Streptomyces roseöchromogenus
und Streptomyces antibioticus, gibt es Stämme, die LLD-wirksame Stoffe in hohen
Ausbeuten produzieren. Wiederum andere geeignete Schizomyceten gehören zum .Genus
Clostridium. Dabei zeigte sich, daß bestimmte Stämme von
Clostridium
tetanomorphum, Clostridium cochlearium, Clostridium flabelliferum und Clostridium
butyricum für die Durchführung des. erfindungsgemäßen Verfahrens besonders vorteilhaft
sind. Weitere Mikroorganismen unter den Fungi, die sich für die technische Herstellung
von Gärbrühen mit mindestens 2o LLD-Einheiten/mg der in den Brühen enthaltenen Feststoffe
eignen, sind Torula, Eremothecium ashybii und Esherichia coli.
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Es sei besonders erwähnt, daß man aus jeder angegebenen Fungusart
die Stämme auswählen müß, die Fermentationsflüssigkeiten von der gewünschten LLD-Wirksamkeit
zeigen. Die vorliegende Erfindung beschränkt sich weder auf einen- besonderen Fungus,
noch umfaßt sie jeden Stamm eines bestimmten Fungus. Andererseits hat sich jeder
untersuchte Mikroorganismus, der eine Gärbrühe von mindestens 2o LLD-Einheiten/mg
der Feststoffe der Fermentationsflüssigkeit zu ergeben vermag, für die Herstellung
von Konzentraten, die zur Aufbesserung APF-armen Futters dienen, als geeignet erwiesen.
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Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß
die hier beschriebenen wertvollen Vitaminerzeugnisse aus den bei der Herstellung
der Antibiotica Streptomycin und Griseiri anfallenden Gärabwässern hergestellt werden
können. Die Streptomycin- und Grisein-Fermentationsverfahren können auch mit Maischen
niedriger Konzentration durchgeführt werden, jedoch sind in dem Fall sehr große
Mengen Fermentationsflüssigkeit erforderlich, aus denen nur relativ geringe Mengen
von Streptomycin und Grisein: erhalten werden können. Die Rückstände einer großen
Streptomycin-Fermentationsanlage können datierviele tausend Liter von Gärungsabwässern
j e Tag ausmachen.
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Bisher war es unbekannt, daß diese' Abwässer irgendeine verwertbare
Substanz enthielten. In der Tat ist auch die Gesamtmenge an Vitaminen bekannter
Struktur in diesen Abwässern zu gering, als daß eine Konzentrierung der Abwässer
zu ihrer Gewinnung wirtschaftlich wäre. Infolgedessen stellten diese Streptomycin-Fermentationsflüssigkeiten
im Hinblick auf die kostspielige Beseitigung der Abwässer ein ernstes Problem dar.
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- Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Streptomycinabwässer
nach Entfernung des Antibioticnms Streptömycin mit Hilfe . von Ionenaustauscherharzen
einen Gehalt an Wirkstoffen aufweisen, - der 2o LLD-Einheiten/mg der darin enthaltenen
Feststoffe erheblich übersteigt.
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Es wurde gefunden, daß man aus dieser Flüssigkeit Konzentrate mit
hoher LLD-Wirksamkeitbilden und diese zur Aufbesserung von APF-armem Tierfutter
verwenden kann. In ähnlicher Weise können auch Fermentations-Griseinabwässer nach
der Entfernung von Grisein zu LLD-aktiven -Konzentraten von- Vitamin B12 verarbeitet
werden.
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Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung können die für die Züchtung
von Fungi üblichen wäßrigen Nährmedien verwendet werden. Sie enthalten gewöhnlich
Kohlenstoff und Stickstoff liefernde Substanzen sowie anorganische Salze und erforderlichenfalls
Wachstumsfaktoren. Der Kohlenstoff kann von einem Kohlehydrat, wie Dextrose, Maltose,
Xy= lose, Invertzucker, Glukose u. dgl., geliefert werden. Als Stickstofflieferant
können Ammoniumsalze, Aminosauren oder Proteine, wie Sojabohnen, Hafer, Hefe, Hefeauszüge,
tryptische Caseinhydrolysate, Fleischextrakte, Blutmehl, tierisches Eiweiß und Knochenmehl,
Lachsmehl, Fischmehl, Fischextraktionsrückstände, proteinhaltige Schlempenkonzentrate
u. dgl., verwendet werden. Gegebenenfalls können die Fungi auch in einem Nährmedium
gezüchtet werden, das Proteine (oder Aminosäuren), jedoch keine Kohlehydrate enthält
und wobei die Proteine (oder Aminosäuren) sowohl als Kohlenstoff- wie auch als Stickstofflieferant
für den Mikroorganismus dienen. Die Züchtung wird gewöhnlich im wäßrigen Medium
durchgeführt, statt dessen kann aber auch ein Medium aus Getreidekleie benutzt werden.
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Wird zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein wäßriges
Medium verwendet, dann wird die Flüssigkeit sterilisiert und anschließend mit einer
Kultur des ausgewählten Fungi-Stammes beimpft. Das Gemisch wird so lange bebrütet,
bis die Fermentations-, flüssigkeit einen Gehalt von mindestens 2o LLD-Einheiten/mg
der in der Fermentationsflüssigkeit befindlichen Feststoffe aufweist. Die Bebrütung
wird gewöhnlich submers bei der für jeden besonderen Fungus geeigneten Temperatur
durchgeführt. Die Wirksamkeit (d. h. die ' LLD-Aktivität) der so erhaltenen fermentierten
Flüssigkeit wird mit dem Wachstumtest an Lactobacillus lactis Dorner bestimmt.
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Nach Ablauf der Fernientationszeit kann man die Fermentatiönsflüssigkeit
eindampfen und die so gewonnenen Gärungsfeststoffe ohne weitere Behandlung zur Aufbesserung
von APF-armem Futter verwenden. Es empfiehlt sich jedoch, die Fermentationsflüssigkeit
zu filtrieren und aus dem Filtrat mit einem Adsorptionsmittel, wie Fullererde oder
Aktivkohle, die LLD-wirksamen Stoffe zu adsorbieren. Dieses Adsorbat kann man dann
trocknen und in dieser Form als Futterzusatz verwenden.
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Soll ein adsorptionsmittelfreier Futterzusatz hergestellt werden,
so wäscht man das Adsorbat mit geeigneten Lösungsmitteln, wie wäßrigen oder wäßrigalkoholischen
Lösungen vom Pyridin oder a-Picolin, aus und dampft das gewonnene Eluat zur Trockne
ein. Hierbei wird eine teilweise Reinigung der LLD-wirksamen Bestandteile' erzielt.
Ein in dieser Weise vorbehandeltes Festprodukt stellt ein konzentriertes Ausgangsmaterial
für zur Aufbesserung von APF-armeni Futter geeignete Wuchsstoffe dar. _ Beispiel
1 Ein 15 ooo 1 fassendes Fermentationsgefäß wird niit 43 kg konzentriertem Fleischextrakt
mit etwa 7o °/o Feststoffen, 143 kg tryptischem Caseinhydrolysat, 72,6 kg' Na Cl,
72o g Ferrosulfat-Heptähydrat, 14. g Kobaltnitrat-Hexahydrat, 2ö 1 Sojabohnenöl
und etwa 13 250 1 Wasser beschickt. Die Lösung wird 3o Minuten bei 12o° sterilisiert,
auf etwa 28' abgekühlt und mit 1135 1 einer vegetativen Kultur eines Grisein
produzierenden Stammes von Streptomyces griseus (bezeichnet als 25 G) beimpft. Das
geimpfte Medium
wird etwa 48 Stunden lang bei etwa 28° fermentiert
und hierbei kontinuierlich mit etwa 1415001 Luft/Stunde belüftet. Nach Beendigung
der Fermentation wird die gesamte Fermentationsflüssigkeit mit Phosphorsäure auf
pg 3 angesäuert und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen und das
Filtrat sowie die Waschwässer mit Natriumhydroxyd leicht alkalisch gemacht und wieder
filtriert. Die dabei erhaltene Fermentationsflüssigkeit, welche 1,7 0/0 Feststoffe
enthält, hat einen pli von 7,8 und einen LLD-Gehalt von 240o LLD-Einheiten/ccm.
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A. Trockenfiltrat von S. griseus Fermentationsflüssigkeit 38o 1 einer
Fermentationsflüssigkeit, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde, werden
bei vermindertem Druck und einer Temperatur unterhalb von 40° auf etwa 23 1 eingedampft
und das erhaltene Konzentrat, das eine mikrobiologische Aktivität von etwa 4o ooo
LLD-Einheiten/ccm besitzt, dann der Zerstäubungstrocknung unterworfen. Das getrocknete
Material enthält 3 0/0 Feuchtigkeit und hat eine mikrobiologische Aktivität von
etwa 140 LLD-Einheiten/mg. B. Aktivkohleadsorbat von S. griseus Fermentationsflüssigkeit
13 250 1 der gleichen Fermentationsflüssigkeit, wie sie unter A verwendet
wurde, werden mit etwa 7z,6 kg Aktivkohle 30 Minuten lang verrührt, das Adsorbat
abfiltriert, durch Suspendieren in 38o 1 Wasser gewaschen und erneut abfiltriert.
195 g des feuchten Kohleadsorbats werden im Vakuum bei 45° etwa 2o Stunden lang
getrocknet, wonach 99 g getrocknetes Adsorbat verbleiben, das eine LLD Aktivität
von 47o LLD-Einheiten/mg besitzt.
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C. Aus dem Auszug des Aktivkohleadsorbats gewonnenes Konzentrat Der
Rückstand des gewaschenen (unter B beschriebenen) Kohleadsorbats, bestehend aus
etwa 72,6 kg Aktivkohle, wurde durch etwa 30 Minuten währendes Verrühren
mit 630 1 von 250/0igem Pyridin extrahiert. Der Kuchen wurde zweimal. auf
der Filterpresse gewaschen. Zuerst wurde er 2o Minuten lang mit 150 1 250/0igem
Pyridin und dann ebenfalls 2o Minuten lang mit 1o31 25°/oigem Pyridin im Kreislaufverfahren
behandelt. Zwei Drittel der vereinigten Extrakte und der Waschflüssigkeit wurden
bei vermindertem Druck (Dampftemperatur unter 35°) auf 241 eingeengt.
150 ccm des Konzentrats mit einer Aktivität von etwa 25oo LLD-Einheiten/ccm
wurden einer Gefriertrocknung unterworfen. Dabei erhielt man 14,1 g eines Trockenproduktes
mit einer Aktivität von 28oo LLD-Einheiten/mg.
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Beispiel e Ein 15 000 1 fassendes Fermentierungsgefäß. würde beschickt
mit 43 kg Fleischextraktkonzentrat, -143 kg tryptischem Caseinhydrolysat, 72,6 kg
NaCl, 2o 1 eines Antischaummittels und 13 250 1 Wasser. Das Nährmedium wurde
sterilisiert, beimpft, fermentiert, angesäuert, filtriert und neutralisiert, wie
im Beispiel 1 beschrieben. Die neutrale, filtrierte Fermentationsflüssigkeit (etwa
z5 0001) wurde mit 43,5 kg Aktivkohle etwa 30 Minuten lang verrührt, um die
LLD-aktiven Bestandteile zu adsorbieren. Das Adsorbat wurde abfiltriert, durch Suspendieren
in etwa 38o 1 Wasser gewaschen und wieder abfiltriert. Anschließend wurde das gewaschene
Adsorbat 30 Minuten lang mit 36o 1 250/0igem a-Picolin verrührt und der Auszug
filtriert. Der Filterkuchen wurde auf der Filterpresse durch Kreislaufbehandlung
mit 1r31 250/0igem a-Picolin 30 Minuten lang gewaschen, der Auszug und das
Waschwasser miteinander vereinigt, unter vermindertem Druck (Dampftemperatur unter
35°) auf ein Volumen von 23 1 eingeengt und mit 230 1 Methanol verdünnt.
Nach Entfernung von ausgeschiedenem inertem Material wurden die rohen LLD-aktiven
Bestandteile durch Eingießen der Methanollösung in 68o 1 Äther gefällt, -der Niederschlag
abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb von
30° getrocknet. Erhalten wurden 86o g eines Trockenproduktes mit einer mikrobiologischen
Aktivität von 15oo LLD-Einheiten/mg. Beispiel 3 Es wurde ein Nährmedium hergestellt,
das folgende Bestandteile enthielt: Sojabohnenmehl ................. 3 0/
0 Dextrose ...................... 2 0/0 proteinhaltiges Schlempenkonzentrat ...................
0,75 0/0 NaCl .......................... 0,25 0/0 Kobaltnitrat
........... 1 Teil per Million, bezogen auf Co++ Mit Leitungswasser aufgefüllt
auf Zoo 0/0.
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Das Nährmedium wurde sterilisiert und mit 1o Volumprozent einer vegetativen
Kultur eines Streptomycin erzeugenden Stammes von Streptomyces griseus beimpft,
und die beimpfte Fermentationsflüssigkeit 2 Tage lang bei 27° unter submerser Belüftung
in Bewegung gehalten. Anschließend wurde die Fermentationsflüssigkeit mit Phosphorsäure
auf px 3 angesäuert und durch Diatomeenerde filtriert. Das Filtrat zeigte eine Streptomycinaktivität
von 81o mg/ccm und eine LLD-Aktivität von 270o LLD-Einheiten/ccm (45 LLD-Einheiten/mg
Feststoffe der Fermentationsflüssigkeit).
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230 1 dieser filtrierten Fermentationsflüssigkeit wurden durch
eine Kolonne geleitet, die 6oo g eines carboxylgruppenhaltigen Ionenaustauscherharzes
enthielt. Hierbei wurde das Streptomycin an dem Kunstharz adsorbiert und die streptomycinfreien
Fermentationsflüssigkeiten miteinander vereinigt.
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A. Kohleadsorbat 17 1 der streptomycinfreien Fermentationsflüssigkeit
wurden mit 16oo g Aktivkohle behandelt, wobei die Kohle 75 0/0 der ursprünglich
in der Fermentationsflüssigkeit vorhandenen LLD-aktiven Stoffe adsorbiert. Das Kohleadsorbat
wurde gewaschen und getrocknet. Das Trockenprodukt enthielt etwa 8o ooo LLD-Einheiten/g;
es kann, wie das im Beispiel-i beschriebene Kohleadsorbat, zur Anreicherung von
Futtermitteln Verwendung finden.
B. Fullererdeadsorbat 4o 1 einer
streptomycinfreien Fermentationsflüssigkeit, die in der oben beschriebenen Weise
gewonnen wurde und einen Gehalt von 500 LLD-Einheiten/ccm aufwies, wurde
mit Phosphorsäure auf px 2,5 eingestellt und alsdann mit 6oo g Fullererde behandelt.
Das Fullererdeadsorbat, das go % der ursprünglich in der Brühe vorhandenen LLD-Aktivität
aufwies, wurde gewaschen und getrocknet. Das Trockenprodukt enthielt 30
000 LLD-Einheiten/g. Dieses Erzeugnis kann in der gleichen Weise, wie das
vorstehend beschriebene Kohleadsorbat, zur Aufbesserung tierischer Futtermittel
verwendet werden.
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C. Durch Zerstäubung getrocknetes Konzentrat Ein Anteil von 8o 1 der
gleichen Fermentationsflüssigkeit, welche alsAusgangsmaterial des im AbschnittA
des vorliegenden Beispiels beschriebenen Verfahrens Verwendung gefunden hat, wurde
auf ein Volumen von 121 eingeengt und ein Teil dieses Konzentrats (5740 ccm) der
Zerstäubungstrocknung unterworfen. Dabei erhielt man 335g Trockenprodukt mit einer
mikrobiologischen Aktivität von 14o LLD-Einheiten/mg. Das Produkt kann in gleicher
Weise zur Aufbesserung von Tierfuttermitteln verwendet werden, wie die getrocknete
S. griseus-Fermentationsflüssigkeit des Beispiels i.
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Beispiel 4 Es wird ein Nährmedium hergestellt, das il)/, tryptischen
Caseinhydrolysats, 0,3°/o Fleischextraktkonzentrat und io Teile Kobaltnitrat-Hexahydrat
enthält. Man stellt auf etwa pu 7 ein. 7 Portionen dieses Mediums von je
500 ccm werden in 2-l-Erlenmeyerkolben eingefüllt und 30 Minuten bei
115° sterilisiert. Jede Flasche wird alsdann mit etwa io ccm einer vegetativen Kultur
von Streptomyces roseochromogenus beimpft und während 7 Tagen auf einer Rotations-Schüttelmaschine
fermentiert. Die Flascheninhalte werden alsdann gemischt und filtriert.
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=1 dieser filtrierten Fermentationsflüssigkeit (mit etwa 15oo LLD-Einheiten/ccm)
wird unter vermindertem Druck (Temperatur unter 35°) eingeengt und der Gefriertrocknung
unterworfen. Erhalten werden 6,9 g eines Produktes mit einer Aktivität von etwa
13o LLD-Einheiten/mg. Eine andere Portion der gefilterten Fermentationsflüssigkeit
(etwa 2300 ccm) wird bei PH 7 30 Minuten lang mit 23g Aktivkohle verrührt,
das erhaltene Adsorbat zweimal durch 30 Minuten langes Verrühren mit einer
Mischung von 125 ccm Äthanol, i2,5 ccm Pyridin und 112 ccm Wasser ausgezogen, die
vereinigten Auszüge unter vermindertem Druck (Temperatur unterhalb 35°) eingedampft
und der Gefriertrocknung unterworfen. Erhalten werden 2,3 g eines Produkts mit 44o
LLD-Einheiten/mg. Dieser getrocknete Fermentationsrückstand und der vorstehend beschriebene
Kohleauszug können in gleicher Weise wie die im Beispiel i beschriebenen Produkte
zur Anreicherung von Futtermitteln Verwendung finden. Beispiel 5 Eine Kultur von
Streptomyces albidoflavis wird in der gleichen Weise hergestellt und fermentiert,
wie im Beispiel ,¢ für Streptomyces roseochromogenus beschrieben. Die Fermentationsflüssigkeit
wird mit Phosphorsäure auf PH 3 angesäuert, filtriert und das Filtrat mit Natriumhydroxyd
auf etwa PH 7 eingestellt. 1570 ccm des neutralen Filtrats (enthaltend iooo
Einheiten/ccm; 77 LLD-Einheiten/mg der in der Fermentationsflüssigkeit enthaltenen
Feststoffe) werden 30 Minuten lang mit 15,7 g Aktivkohle verrührt, das Adsorbat
abfiltriert und bei 45° im Vakuum etwa 2o Stunden lang getrocknet. Man erhält einschließlich
Filterhilfe 50,7 g eines getrockneten Adsorbats, dessen Aktivität etwa
30 Einheiten/mg beträgt. Dies entspricht der Aktivität der ursprünglichen
neutralen, filtrierten Fermentationsflüssigkeit und der mit Aktivkohle behandelten
Fermentationsflüssigkeit. Das Adsorbat kann ebenso wie die gemäß Beispiel i erhältlichen
Produkte zur Aufbesserung von Futtermitteln Verwendung finden.
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Beispiel 6 Trockenhefe ............ 2 0/0 Kobaltnitrat
........... io Teile pro Million, bezogen auf C O++,
mit destilliertem
Wasser ergänzt zu ioo %.
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40 ccm dieses Mediums wurden in einer 25o-ccm-Flasche sterilisiert
und mit 5 Volumprozent einer 48 Stunden alten vegetativen Kultur eines Griseus produzierenden
Stammes von Streptomyces griseus (bezeichnet als 25 G) beimpft und bei 28° 72 Stunden
fermentiert. Während der Fermentierung wurde die Flasche ständig auf einer Rotationsschüttehnaschine
in Bewegung gehalten. Nach Beendigung der Fermentationsperiode enthielt die Fermentationsflüssigkeit
48oo LLD-Einheiten/ccm (etwa 22o LLD-Einheiten/mg in der Fermentationsflüssigkeit
enthaltenen Feststoffe).
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Die Fermentationsflüssigkeit kann zur Herstellung fester Konzentrate
mit APF-Aktivität Verwendung finden.
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Beispiel ? Es wurden acht Fermentationsmedien hergestellt, die die
gleichen anorganischen Salze, aber verschiedene stickstoffhaltige Zusatzstoffe enthielten.
Die Zusammensetzung dieser Mischungen waren folgende: NaCl ..................
0,5 0/0 Sojabohnenöl ........... i °/o FeS04 7 H20 ......... 5o Teile
pro Million C O (N O3) 2 - 6 H20 ....... io Teile pro Million Zusatzstoff
gemäß folgender Tabelle.
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Von jedem Medium wurden 40 ccm in einer 25o-ccm-Flasche sterilisiert
und mit 21/2 Volumprozent einer vegetativen Kultur eines griseinproduzierenden Stammes
von Streptomyces griseus beimpft. Die beimpften Fermentationsflüssigkeiten wurden
4 Tage bei 28° unter ständigem Schütteln der Flasche auf einer
Rotations-Schüttelmaschine
fermentiert. Nach erfolgter Fermentierung wurden die Proben geprüft. Die Ergebnisse
sind aus nachstehender Tabelle ersichtlich.
| Zusatzstoffe LLD-Einheiten/ccm LLD-Einheiten/mg |
| Fermentationsflüssigkeit Feststoffe |
| 3 % Trockenhefe ............................. 4300 120 |
| 4 °/o Proteinhydrolysat ........................ 3500
78 |
| 3 °/o Haferflocken .............................. 1400
40 |
| 8 °/o Blutmehl................................ 1700 20 |
| 4 °/o Fischmehl................................ 2500
56 |
| 6 °/o Lachs-Abfallmehl ........................ igoo
29 |
| 2 % Fleischeiweiß und Knochenmehl ............ 590 24 |
| 1 % Fleischextrakt ..:......................... goo 6o |
Diese Fermentationsflüssigkeiten können für die Herstellung fester Konzentrate mit
APF-Aktivität Verwendung finden.
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Beispiel 8 Es wurde ein Medium hergestellt, das die folgenden Bestandteile
enthielt: Extrakt aus Hirn und Herz 3,7 Agar ....................
0,3704
Kobalt
(als Kobaltnitrat) .. 2 Teile pro Mill., mit destilliertem Wasser ergänzt zu ioo
°/o. Das Medium wurde in fünf Portionen von je ioo ccm aufgeteilt, damit fünf Erlenmeyerkolben
(125 ccm) beschickt und die Kolben sowie ihr Inhalt sterilisiert. Anschließend wurde
jeder Kolben mit einer anderen Art von Clostridium beimpft. (Vergleiche die nachfolgende
Tabelle.) Die beimpften Fermentationsflüssigkeiten werden mehrere Tage lang bei
35° anaerobisch fermentiert, und die Fermentationsflüssigkeiten wurden mit Lactobacillus
lactis Dorner auf ihre Aktivitäten geprüft. Die Ergebnisse sind aus der Tabelle
ersichtlich:
| Kultur LLD-Einheiten/ccm LLD-Einheiten/mg |
| Fermentationsflüssigkeit |
| Feststoffe |
| Clostridium tetanomorphum .............. ..... 5000
125 |
| Clostridium cochlearium ....................... 5000 125 |
| Clostridium flabelliferum ...................... 2000 50 |
| Clostridium Butyricum ........................ 4000 ioo |
Jede dieser Fermentationen kann mit Hilfe der im Beispiel s beschriebenen Verfahren
in feste LLD-aktive Konzentrate übergeführt werden und zur Aufbesserung von Futtermitteln
verwendet werden.
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Umfassende Vergleichsversuche, bei denen Kücken mit einer APF-armen
Grunddiät ernährt wurden, haben gezeigt, daß durch Zugabe ganz geringer Mengen von
erfindungsgemäß hergestellten Konzentraten oder von Vitamin B12 zu dem Grundfutter
das Wachstum der Kücken erheblich gesteigert wurde. Weiterhin haben die Vergleichsversuche
gezeigt, daß durch Verfütterung der mit Konzentraten oder Vitamin B12 angereicherten
Grunddiät die gleiche Zunahme am Wachstum erzielt wurde, wie bei Verabreichung der
Grunddiät mit Zusätzen von Rohleberextrakt, der bekanntlich eine der besten bisher
bekannten Quellen für den animalischen Proteinfaktor darstellt.