AT200725B - Verfahren zur Gewinnung LLD-aktiver Vitaminsubstanzen - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Gewinnung LLD-aktiver Vitaminsubstanzen 
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung wertvoller Vitaminprodukte durch Kultivieren ausgewählter Stämme von Pilzen (Fungi), wobei in den Nährböden Substanzen mit   Vitamin-B12-   Wirkung erhalten werden, die das Wachstum von Lactobacillus lactis Dorner fördern und als Nahrungsergänzungsstoffe wichtig sind. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung LLD-aktiver Vitaminsubstanzen ist dadurch gekennzeichnet, dass ein wässeriges, assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthaltendes Nährmedium mit Hilfe von LLD-Aktivität erzeugenden Mikroorganismen der Gruppe der Myxomyceten, 
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 Feststoffe aufweist, worauf das LLD-aktive Material aus der Gärbrühe durch Eindampfen derselben oder durch einen Adsorptionsprozess gewonnen wird. 



   Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ist insbesondere Streptomyces griseus, vorzugsweise ein Streptomycin oder Grisein produzierender Stamm desselben, geeignet. 



   Das gebildete LLD-wirksame Material kann aus der   Gärbrühe   durch Behandeln mit Aktivkohle abgetrennt werden, wobei man das Adsorbat bei vermindertem Druck und niedriger Temperatur trocknet oder aus dem Kohleadsorbat mit einem Lösungsmittel eluiert und   das LLD-wirksame Eluat   bei vermindertem Druck zu einem Konzentrat eindampft bzw. das erhaltene flüssige Konzentrat der Gefriertrocknung unterwirft. Man kann aber auch vor der Behandlung mit Aktivkohle die erhaltene Gärbrühe zunächst mit einem das Streptomycin adsorbierenden Ionenaustauschharz behandeln und dieses mitsamt dem adsorbierten Streptomycin von der Brühe abtrennen.

   Eine weitere zweckmässige Ausbildungsform des Verfahrens besteht darin, dass das aus der Gärbrühe gewonnene LLD-wirksame Material zwecks Anreicherung des Vitamins   B12   einer chromatographischen Fraktionierung unterworfen wird. 



   Das durch Adsorption an Aktivkohle erhaltene trockene Konzentrat mit LLD-Aktivität aus einer durch Züchtung des Grisein erzeugenden Stammes von Streptomyces griseus erhaltenen Gärbrühe kann weiter gereinigt werden, indem es mit Methanol extrahiert wird, die methanolische Lösung durch eine Kolonne mit aktivierter Tonerde geleitet, die Kolonne mit frischem Methanol eluiert, das an LLD-Aktivität reiche Eluat nach Einengung durch Zusatz von Aceton ausgefällt und der Niederschlag von rohem Vitamin By gewonnen wird. Schliesslich kann die Reinsubstanz in der Weise erhalten werden, dass das erhaltene rohe Vitamin B12 in Äthanol gelöst, durch Zusatz von Aceton ausgefällt und das gereinigte Produkt aus wässerigem Aceton unter Gewinnung von reinem kristallinem Vitamin   B12 umkristallisiert   wird. 



   Die durch das erfindungsgemässe Verfahren erhaltenen Vitaminsubstanzen können für verschiedene Zwecke verwendet werden, z. B. zur Anreicherung von Tiernahrung mit einem mangelhaften Gehalt an Tier-Proteinfaktor. 



   Zur Bestimmung der Wirksamkeit der erfindungsgemäss gewonnenen Vitaminprodukte dient gewöhnlich der Lactobacillus-lactis-Dorner-Test (LLD) unter den von Shorb (J. Biol. Chem. 169,   455-6)   beschriebenen Versuchsbedingungen, wobei als willkürlicher Standard (1000 Einheiten/mg) diejenige Menge eines gereinigten Leberextraktes festgelegt wird, welche zur Erzielung der Hälfte des maximalen Wachstums von LLD benötigt wird. Reines kristallines Vitamin B12 hat etwa 11 Millionen LLD-Einheiten/mg. Es findet als Antiperniciosafaktor Verwendung. Rohe Konzentrate haben als Zusatz zum Tierfutter Bedeutung erlangt. 

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   Es ist schon lange bekannt, dass vegetabilische Tierfuttermittel, insbesondere Hühnerfutter, einen Mangel an einem oder mehreren Faktoren aufweisen, die für die maximale Wachstumsgeschwindigkeit der Tiere unerlässlich sind. Ein solcher Faktor wird gewöhnlich in den Geweben des Huhns aufgespeichert und durch das Ei auf das Kücken übertragen. Daher soll Hennen ein Futter verabreicht werden, das diesen Faktor enthält, um genügende Brutfähigkeit der Eier und die Lebensfähigkeit der ausgebrüteten Kücken zu sichern. 



   Vollwertige Futtermittel für Hühner enthielten den Tierproteinfaktor (im nachfolgenden mit APF bezeichnet) bisher in der Form von tierischen Proteinprodukten wie Lebermehl, Fischmehl, Fischextrakte u. dgl. Diese Zusätze sind in den benötigten Mengen oft schwer zu beschaffen und ihr hoher Preis verteuert dieHühnerzucht erheblich. Die genannten Produkte haben zudem den Nachteil, dass sie verhältnismässig geringe und wechselnde Mengen des benötigten APF enthalten. Eine ergiebigere und billigere Quelle dieses wichtigen Bestandteiles der Nahrung bedeutet daher einen wertvollen Fortschritt. 



   Eingehende Versuche haben gezeigt, dass die durch Kultivieren von gewissen Pilzstämmen in wässerigen Nährmedien erhaltenen LLD-wirksamen Gärbrühen eine reiche Quelle einer wachstumsfördernden Substanz darstellen, welche praktisch dem sogenannten"Tier-Proteinfaktor"in der Förderung des Wachstums von Kücken gleichartig ist. Es wurde ferner gefunden, dass aus den genannten Gärungsrückständen ein reines Vitamin B12 isoliert werden kann und bei einer an APF unzureichenden Ration der Zusatz von nur   0, 0000030/0   Vitamin   B12   eine maximale Wachstumsgeschwindigkeit bei Kücken ermöglicht. Man braucht zu diesem Zweck das Vitamin B12 nicht in reiner Form aus der Brühe zu isolieren, sondern es können auch Konzentrate mit einem entsprechenden Gehalt an LLD-wirksamen Substanzen als Futterzusatz verwendet werden.

   Beim erfindungsgemässen Verfahren werden Pilzstämme kultiviert, welche Gärungsflüssigkeiten liefern, deren feste Bestandteile eine Wirksamkeit von ungefähr 140 LLD-Einheiten/mg aufweisen. Es können leicht Konzentrate hergestellt werden, welche 2000 LLD-Einheiten/mg oder mehr enthalten, während die bisherigen reichsten APF-hältigen Produkte, wie Fischmehl und Fischextrakte, nur etwa   1 - 3   LLD-Einheiten/mg zeigen. 
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 kg Futter. Ein Konzentrat von 2000 LLD-Einheiten/mg liefert einen Gehalt von 330000 LLD-Einheiten je kg Futter bei einem Zusatz von 165 mg des Konzentrates zu 1 kg Futter   (0, 01650/0).   



   Es ist bekannt, dass verschiedene wasserlösliche Gärprodukte als Nahrungszusatz verwendet werden können, hauptsächlich wegen ihres Gehalts an Riboflavin und andern Vitaminen bekannter Struktur, wie   Biotin,   Pantothensäure usw. Solche Zusätze enthalten aber nur geringe Mengen LLD-wirksamer Substanzen, wie z. B. die löslichen Rückstände der Butylgärung mit ungefähr 4 LLD-Einheiten/mg und die löslichen Bestandteile der Getreideschlempe mit weniger als 1 LLD-Einheit/mg, und eignen sich daher auch nicht zur Gewinnung von Konzentraten, die für das Anreichern von an APF unzureichendem Futter dienen sollen. 



   Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignete Mikroorganismen sind Myxomyceten, Schizomyceten und Eumyceten (Smith und Raistrick "An introduction to industrial mycology", London, Edward Arnold    & Co.,   1938), insbesondere gewisse Stämme der Gattung Streptomyces griseus, welche auch für die Herstellung der Antibiotica Streptomycin und Grisein verwendet werden können ; aber auch andere Streptomyceten wie Strept. albidoflavus, Strept. colombiensis nov.   sp., Strept.   roseochromogenus und Strept. antibioticus weisen Stämme auf, welche hohe Ausbeuten an LLD-wirksamen Substanzen liefern. Ausgewählte Stämme von Clostridium tetanomorphum, Clostridium cochlearium, Clostridium flabelliferum und Clostridium butyricum sind ebenfalls für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet.

   Andere Fungi, welche sich für die technische Herstellung von Gärbrühen mit mindestens 20 LLD-Einheiten/mg Feststoffe als brauchbar erwiesen haben, sind Torula, Eremothecium ashybii und Escherichia coli. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren kann an die Herstellungsverfahren der Antibiotica Streptomycin und Grisein angeschlossen werden, bei welchen nach Abtrennung einer verhältnismässig geringen Menge des   Antibioticum   grosse Mengen Gärflüssigkeit anfallen. Bisher war es nicht bekannt, dass diese Rückstände noch ein nützliches Produkt enthalten und dass daraus   Konzentrate von hoher LLD-Wirksamkeit   erfindungsgemäss gewonnen werden können. 



   Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens können die üblichen Nährflüssigkeiten, die eine Kohlenstoffquelle, z. B. Kohlehydrate wie Dextrose, Maltose, Xylose, Invertzucker, Getreideauszüge u. dgl., eine Stickstoffquelle, z. B. Ammoniumsalze, Aminosäuren oder proteinhältige Produkte wie Sojabohnen, Hafer, Hefeextrakte, Abbauprodukte von Kasein mit Trypsin, Fleischextrakt, Blutmehl, fein gemahlene 

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 Trockenrückstände von tierischen Geweben, die frei von Haaren, Klauen, Horn, Blut, Darm- und Mageninhalt sind und mehr als 4,4% Phosphor enthalten, ferner Fischmehl und Fischextrakte, lösliche Bestandteile der Schlempe u. dgl., anorganische Salze und gegebenenfalls auch Wachstumsfaktoren enthalten, verwendet werden. Gegebenenfalls können auch kohlehydratfreie Nährmedien verwendet werden, wobei die Proteine bzw.

   Aminosäuren sowohl als Kohlenstoff- wie auch als Stickstoffquelle dienen. 



   Die Kultur der Mikroorganismen erfolgt in üblicher Weise, wobei der Gehalt der Gärbrühe an LLDEinheiten durch den Lactobacillus-lactis-Dorner-Test fortlaufend kontrolliert wird. Am Ende der Gärperiode kann die Flüssigkeit eingedampft werden, wobei der erhaltene Rückstand ohne weitere Behandlung als Zusatz zu Futtermitteln verwendet werden kann, um diese mit APF anzureichern. Vorzugsweise wird die Gärflüssigktit jedoch filtriert und den eingangs beschriebenen Adsorptions- bzw. Reinigungsoperationen unterworfen, wobei, je nach dem gewünschten Verwendungszweck, die dabei erhaltenen mehr oder weniger gereinigten Adsorbate bzw. Konzentrate als Futterzusatz Verwendung finden können. 



   B e i s p i e l 1: Ein Gärbehälter von 15,2 m3 Inhalt wird mit 23 kg konzentriertem Fleischextrakt (etwa   701lu   feste Bestandteile), 143 kg eines Trypsinabbauproduktes von Kasein, 72, 5 kg Natriumchlorid, 
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 gFerrosulfat-heptahydrat, 144gKobaltonitrat-hexahydrat,beschickt, die Mischung 30 Minuten bei 1200 C sterilisiert, dann auf etwa   28    C abgekühlt und mit 1130 l der Kultur eines Grisein erzeugenden Stammes von Streptomyces griseus beimpft. Nach 48stündiger Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 280 C unter Belüftung mit ungefähr 140 m3 Luft pro Stunde wird die Brühe durch Zusatz von Phosphorsäure auf PH = 3 eingestellt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser ausgewaschen, die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt und durch Zusatz von Natronlauge leicht alkalisch gemacht und nochmals filtriert.

   Die so erhaltene Gärflüssigkeit mit einem PH = 7,8 enthält 1,   7%   feste Bestandteile und 2400   LLD-Einheiten/cm3.   



   A. Trockenpräparat aus Streptomyces   griseus-Gärflüssigkeit :  
379 l der filtrierten Gärflüssigkeit werden bei verringertem Druck und einer Temperatur unter 400 C auf ungefähr 22,7   l   eingedampft und durch Zerstäubungstrocknung in ein Trockenpräparat mit ungefähr   3%   Feuchtigkeit und einer Wirksamkeit von ungefähr 140 LLD-Einheiten/mg übergeführt. 
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 :13,2 m3 der gleichen Gärflüssigkeit werden mit 72, 5 kg Aktivkohle 30 Minuten verrührt.

   Das Adsorbat wird durch Filtrieren abgetrennt, in 378   l   Wasser suspendiert und nochmals filtriert. 195 g des feuchten Kohleadsorbates mit einem Wassergehalt von etwa   50%   werden im Vakuum bei 450 C ungefähr 20 Stunden getrocknet, wobei 99 g trockenes Kohleadsorbat mit einer Wirksamkeit von 470 LLD-Einheiten/mg erhalten werden. 



   C. Aus dem Eluat des Kohleadsorbats gewonnenes Konzentrat :
Der Rest des gewaschenen feuchten Kohleadsorbats, entsprechend 72, 4 kg Aktivkohle, wird durch Verrühren mit 632 1   25% igem   Pyridin eluiert. Der eluierte Filterkuchen wird auf der Filterpresse zuerst mit 150   l     25% igem wässerigem   Pyridin während 20 Minuten ausgezogen und dann noch mit 150   l     25% igem wässerigem   Pyridin nachgewaschen. 2/3 der Gesamtmenge der vereinigten Waschflüssigkeiten werden bei vermindertem Druck auf 24 l eingedampft, wobei die Dampftemperatur unter 350 C beträgt. 



  Das konzentrierte Eluat zeigt eine Wirksamkeit von ungefähr 250000 LLD-Einheiten/cm3. Eine Teilmenge von 150 cm3 liefert bei der Gefriertrocknung 14, 1 g eines Produktes mit einer Aktivität von 2800 LLD-Einheiten/mg. 



   D. Kristallines Vitamin   B12 :  
Ein aus 3,2   m3 Gärbrühe   gemäss C gewonnenes festes Konzentrat wird mit Methanol extrahiert und der alkoholische Extrakt durch eine Kolonne mit aktiver Tonerde geleitet. Die Kolonne wird mit frischem Methanol eluiert, wobei die Fraktionen mit starker LLD-Aktivität vereinigt und eingeengt werden. Zu der konzentrierten alkoholischen Lösung wird Aceton zugesetzt und das ausgefällte rohe Vitamin By abfiltriert.

   Das Rohprodukt wird durch Ausfällen aus einer Äthanollösung mit Aceton und nachfolgendem Umkristallisieren aus wässerigem Aceton gereinigt.   Ausbeute : 106   mg kristallines Vitamin   B12'  
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäss herstellbaren Konzentrate bzw. des kristallinen Vitamins   B12   als Nahrungszusatz mit APF-Wirkung wird durch Fütterungsversuche illustriert, bei welchen das Wachstum von Kücken unter einer APF-Mangelkost verglichen wird mit dem Wachstum bei derselben Kost mit Zusatz der genannten Konzentrate oder kristallinem Vitamin   Bzw   

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   Kücken-Fütterungsversuche :   
Einen Tag alte Kücken von Hennen, die eine APF-Mangelkost erhielten, werden auf folgender Grunddiät gehalten :

   
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<tb> 
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 70,0 <SEP> % <SEP> CuSO4 <SEP> . <SEP> 5H2O <SEP> 0,0015 <SEP> %
<tb> Dextrose, <SEP> techn. <SEP> 7,9 <SEP> ZnCl2 <SEP> 0,00125
<tb> Cellulose <SEP> 5,0 <SEP> L-Arginin <SEP> 0, <SEP> 50
<tb> Weizenkeimöl <SEP> 4,5 <SEP> L-Cystein <SEP> 0,20
<tb> Calciumglukonat <SEP> 2,5 <SEP> Cholin <SEP> 0,20
<tb> Glycin <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> Inosit <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 
<tb> DL-Methionin <SEP> 0,9 <SEP> p-Aminobenzoesäure <SEP> 0,03
<tb> CaC03 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> Nicotinsäure <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 
<tb> K2HPO4 <SEP> 1,612 <SEP> Ca-Pantothenat <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP> 
<tb> KHzP04 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> Riboflavin <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP> 
<tb> NaCl <SEP> 0,838 <SEP> Thiamin <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP> 
<tb> MgSO4.

   <SEP> 7H2O <SEP> 0,51 <SEP> Pteroyl-glutaminsäure <SEP> 0,0004
<tb> CAPO4 <SEP> Hp <SEP> 0, <SEP> 375 <SEP> Menadion <SEP> 
<tb> Ferricitrat <SEP> 0,138 <SEP> (2-Methyl-1,4-naphthochinon) <SEP> 0,0004
<tb> MnS04. <SEP> 4HO <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> Biotin <SEP> 0, <SEP> 00004 <SEP> 
<tb> KJ <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP> Vitamin <SEP> A <SEP> + <SEP> D-Pulver <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 
<tb> Pyridoxin <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP> 
<tb> 
 
Nach 5tägiger Ernährung mit obiger Grunddiät wurden annähernd gleichgewichtige Gruppen von je 7 Kücken ausgewählt.

   Eine Gruppe wurde weiterhin ausschliesslich auf die angegebene Grunddiät gesetzt ; die andern erhielten die Grunddiät mit einem der folgenden Zusätze : 
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<tb> 
<tb> Diät <SEP> Nr. <SEP> Ergänzung <SEP> Menge <SEP> des <SEP> Zusatzes <SEP> Zugesetzte <SEP> LLD- <SEP> Zahl <SEP> der
<tb> in <SEP> % <SEP> der <SEP> Gesamtdiät <SEP> Einheiten <SEP> je <SEP> kg <SEP> Futter <SEP> Kücken
<tb> C <SEP> 1068 <SEP> keine <SEP> 7
<tb> C <SEP> 1093 <SEP> krist.

   <SEP> Vitamin <SEP> Bu2 <SEP> 0,000003 <SEP> % <SEP> 330000 <SEP> 7
<tb> C <SEP> 1094 <SEP> Konzentrat <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 3% <SEP> 420000 <SEP> 7
<tb> (getrocknete <SEP> Strept.griseus-Brühe)
<tb> C <SEP> 1095 <SEP> Konzentrat <SEP> B <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP> 470000 <SEP> 7
<tb> (getrocknetes <SEP> Kohleadsorbat <SEP> der <SEP> Strept.griseus-Brühe)
<tb> C <SEP> 1096 <SEP> Konzentrat <SEP> C <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 560000 <SEP> 7
<tb> (lyophilisiertes
<tb> wässeriges <SEP> PyridinEluat <SEP> von <SEP> Strept.griseus-Kohleadsorbat)
<tb> 
 Die Wachstumsgeschwindigkeit der Kückengruppen ist in folgender Tabelle zusammengestellt :

  
Mittleres Körpergewicht in g 
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<tb> 
<tb> Diät <SEP> Nr. <SEP> Kückenalter <SEP> in <SEP> Tagen <SEP> Gegenüber <SEP> der <SEP> C-1068-Diät
<tb> 5 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 15 <SEP> 17 <SEP> erhöhte <SEP> Gewichtszun <SEP> ahme
<tb> im <SEP> Alter <SEP> von <SEP> 17 <SEP> Tagen
<tb> C <SEP> 1068 <SEP> 49,9 <SEP> 57,3 <SEP> 59,7 <SEP> 67,6 <SEP> 66,2 <SEP> 66,5 <SEP> C <SEP> 1093 <SEP> 49,9 <SEP> 58,7 <SEP> 67,0 <SEP> 79,3 <SEP> 107,3 <SEP> 125,8 <SEP> 59,3
<tb> C <SEP> 1094 <SEP> 49,9 <SEP> 58,9 <SEP> 65,9 <SEP> 77,9 <SEP> 92,4 <SEP> 117,8 <SEP> 51,3
<tb> C <SEP> 1095 <SEP> 49,9 <SEP> 60,4 <SEP> 67,3 <SEP> 82,5 <SEP> 108,7 <SEP> 126,7 <SEP> 60,2
<tb> C <SEP> 1096 <SEP> 49,9 <SEP> 58,6 <SEP> 67,9 <SEP> 83,1 <SEP> 102,6 <SEP> 122,6 <SEP> 56,1
<tb> 
 

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Diese Versuche zeigen deutlich,

   dass das Wachstum der Versuchskücken durch den Zusatz der LLD- aktiven Substanzen zur APF-Mangeldiät bedeutend gefördert wird. 



   Beispiel 2 : In einem Gärgefäss von 15, 2 m3 Inhalt wird eine Mischung von 45 kg konzentriertem
Fleischextrakt, 143 kg eines Trypsinabbauproduktes von Kasein, 72, 5 kg Natriumchlorid, 20   l   eines Schaumverhütungsmittels und 13,200   l   Wasser wie im Beispiel 1 fermentiert und die neutrale filtrierte
Gärflüssigkeit 30 Minuten mit 43, 5 kg Aktivkohle verrührt. Das Kohleadsorbat wird von der Flüssigkeit abgetrennt, durch Suspension in etwa 380   l   Wasser gewaschen und wieder filtriert. Das gewaschene Ad- sorbat wird 30 Minuten mit 359 1 25%igem wässerigem   a-Picolin   verrührt, filtriert und der Filterkuchen auf der Filterpresse mit 113   l     25%obigem   wässerigem a-Picolin 30 Minuten ausgewaschen.

   Das Eluat wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 22,7   l   einge- dampft, wobei die Dampftemperatur unter 350 C gehalten wird. Die Lösung wird mit 227   l   Methanol versetzt und der ausgefällte inerte Niederschlag abfiltriert. Aus dem Filtrat werden die LLD-aktiven
Bestandteile durch Zusatz der Methanollösung zu 6811 Äther ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum bei 300 C getrocknet. Ausbeute : 860 g eines Trockenpräparates mit einer mikrobiologischen Wirksamkeit von 1500 LLD-Einheiten/mg. 



   Die Wirksamkeit dieses Materials als APF-Quelle im Vergleich mit rohem Leberextrakt und mit kristallinem Vitamin   B12 geht   aus nachstehenden Fütterungsversuchen an Kücken hervor. 



    Kücken-Fütterungsversuche :   
Der Versuch wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass der Gehalt der Grundkost an Sojabohnenmehl   zo   und an Dextrose 37,9% betrug. 
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<tb> 
<tb> 



  Diät <SEP> Nr. <SEP> Ergänzung <SEP> Zusatz <SEP> in <SEP> % <SEP> Zahl <SEP> der
<tb> der <SEP> Gesamtdiät <SEP> Kücken
<tb> C <SEP> 1014 <SEP> keine <SEP> 7 <SEP> 
<tb> C <SEP> 1014 <SEP> keine <SEP> 7 <SEP> 
<tb> C <SEP> 1055 <SEP> roher <SEP> Leberextrakt <SEP> 1% <SEP> 7
<tb> C <SEP> 1059 <SEP> Konzentrat <SEP> Strept.griseus-Brühe <SEP> 0, <SEP> 0227% <SEP> 7
<tb> C1057 <SEP> Kristallines <SEP> Vitamin <SEP> B12 <SEP> 0, <SEP> 000003 <SEP> % <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 
 Die Wachstumsgeschwindigkeit der verschiedenen Gruppen war wie folgt :

   
 EMI5.2 
 
 EMI5.3 
 
<tb> 
<tb> Diät <SEP> Nr. <SEP> Alter <SEP> der <SEP> Kücken <SEP> in <SEP> Tagen <SEP> Gegenüber <SEP> der <SEP> C-1014-Diät
<tb> 5 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 15 <SEP> 18 <SEP> erhöhte <SEP> Gewichtzunahme
<tb> im <SEP> Alter <SEP> von <SEP> 18 <SEP> Tagen
<tb> C <SEP> 1014 <SEP> 50,4 <SEP> 60,1 <SEP> 66,0 <SEP> 77,9 <SEP> 93,9 <SEP> 113,0 <SEP> # <SEP> 114,8 <SEP> C <SEP> 1014 <SEP> 50,4 <SEP> 59,4 <SEP> 66,9 <SEP> 78,4 <SEP> 97,1 <SEP> 116,7 <SEP> # <SEP> Durchschnitt <SEP> C <SEP> 1055 <SEP> 50,4 <SEP> 60,2 <SEP> 68,3 <SEP> 83,5 <SEP> 105.7 <SEP> 133,2 <SEP> 18, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> C <SEP> 1059 <SEP> 50,4 <SEP> 62,4 <SEP> 71,6 <SEP> 84,7 <SEP> 109,1 <SEP> 135,6 <SEP> 20,8
<tb> C <SEP> 1057 <SEP> 50,4 <SEP> 51,3 <SEP> 68,7 <SEP> 83,4 <SEP> 107,7 <SEP> 132,6 <SEP> 17,8
<tb> 
 
Diese Versuche zeigen deutlich,

   dass das Wachstum der Kücken durch den Zusatz, im Vergleich mit Kücken auf einer APF-Mangeldiät bedeutend gefördert wird, und dies sowohl mit dem Konzentrat als dem kristallinen Vitamin B12. Ferner zeigen die Versuche, dass die erreichte Wachstumszunahme ungefähr dieselbe ist wie bei Zusatz von   190   rohem Leberextrakt zur Nahrung,   d. h.   einer der besten bisher bekannten Quellen des APF. 



   Beispiel 3 : 40 cm3 eines Nährmediums folgender   Zusammensetzung : Pfeiffers Trockenhefe 2%,   Kobaltnitrat   0, 0005% ;. destilliertes   Wasser ad   locplo,   werden in einer 250 cm3-Flasche sterilisiert, mit 

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