AT200724B - Verfahren zur Gewinnung von LLD-aktiven Substanzen der Vitamin B12-Gruppe - Google Patents

Description

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 ganismen eine stark toxische Wirkung ausübt und bereits der Zusatz   z. B.   einer Kobaltmenge von mehr als 20 Teilen je 1000000 Teile des Nährmediums in Form von Kobaltnitrat die Bildung der LLD-wirksamen Stoffe verhindert. 



   Die erfindungsgemäss anzuwendenden Mengen von Kobalt können innerhalb des gekennzeichneten Bereiches je nach dem verwendeten Nährmedium und nach der toxischen Wirkung auf den jeweils verwendeten Mikroorganismenstamm schwanken. 
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 zes oder eines kobalthaltigen Komplexes verwendet. 



   Die verwendeten Nährmedien enthalten in üblicher Weise assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff, anorganische Salze und erforderlichenfalls noch Wachstumsfaktoren. Der Kohlenstoff kann in Form von Kohlehydraten, wie Dextrose, Maltose, Xylose, Invertzucker, Maissyrup, der Stickstoff in Form von Ammonsalzen, Aminosäuren oder Proteinen, wie Sojabohnenmehl, Hafer, Hefe, Hefeextrakten, Casein, hydrolysiertem Fleischextrakt, Blutmehl, Fleisch, Knochenmehl, Fischmehlen, löslichen Anteilen von Schlempen, vorhanden sein. Erforderlichenfalls können die Mikroorganismen auch in Abwesenheit von Kohlehydraten in Nährmedien gezüchtet werden, wobei die Proteine (oder Aminosäuren) den von dem Mikroorganismus benötigten Kohlenstoff und Stickstoff liefern. 



   Als geeignete Mikroorganismen haben sich die LLD-wirksamen Stoffe erzeugenden Schizomyceten und insbesondere jene Stämme von Streptomyces griseus erwiesen, die bei der Herstellung von Streptomycin und Grisein verwendet werden, aber auch andere Streptomyceten, wie Streptomyces albidoflavus, Streptomyces colombiensis nov. sp., Streptomyces roseochtomogenus und Streptomyces antibioticus weisen Stämme auf die hohe Ausbeuten an LLD-wirksamen Stoffen ergeben. Gute Ergebnisse können auch unter Verwendung von Clostridium tetanomorphum, Clostridium cochlearium, Clostridium flabelliferum und Clostridium butyricum sowie von Torula, Eremothecium ashbyii und Escherichia coli erzielt werden. 



   Beispiel l : Je 40 cms einer   Zeigen   Lösung von Trockenhefe in destilliertem Wasser, die Kobaltnitrat in Mengen von   0-0,02%Eo   enthalten, werden im Erlenmeyer Kolben durch 1/2stündiges Erhitzen auf 1200 sterilisiert und nach dem Erkalten ungefähr   2, 5 Vol.-%   einer 48stündigen vegetativen Kultur von Streptomyces griseus 25 G in einer Fleischextrakt und tryptisch verdautes Casein enthaltenden Nährlösung beimpft. Nach 4tägigem ständigem Schütteln auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 280 gehalten, werden die Aktivitäten der Gärflüssigkeiten mit Hilfe von Lactobacillus Lactis Dorner ermittelt, Die nachfolgende Tabelle zeigt die Kobaltgehalte der einzelnen Proben und die ermittelten LLD-Einheiten je   cm ?.   
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  Teile <SEP> Kobalt <SEP> per <SEP> LLD-Einheiten/cm3
<tb> Million <SEP> Teile <SEP> Nährlösung <SEP> der <SEP> fermentierten <SEP> Flüssigkeit
<tb> 0 <SEP> 300
<tb> 1 <SEP> 1760
<tb> 2 <SEP> 3000
<tb> 10 <SEP> 4600
<tb> 20 <SEP> 3000 <SEP> 
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Beispiel 2 : Eine Nährlösung, die 8% Fleischeiweiss und Knochenmehl, 0, 5% Chlornatrium und 15 Teile   FeSO. H GDper   Million gelöst in destilliertem Wasser, enthält, wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, sterilisiert, beimpft und fermentiert. Eine zweite Portion des gleichen Mediums wird mit 2 Teilen per Million in Form von Kobaltnitrathydtat versetzt und in gleicher Weise   sterilisiert, beimpftundfermen-   tiert. 
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   B   eispi   el 3 : Ein Fermenter mit einem Inhalt von 11356   l   wird mit einem wässerigen Gemisch von   l%   tryptisch verdautem Casein, 0, 3% Fleischextrakt,   0, 50/0   Chlornatrium,   0, 15% Sojabohnenöl (zur   Verhinderung der Schaumbildung) und 50 Teilen FeSO4. 7H2 0 per Million beschickt. Die sterilisierte Nährlösung wird mit 1040 1 einer vegetativen Kultur eines Grisein produzierenden Stammes von Streptomyces griseus (bezeichnet als 25 G) beimpft und 48 Stunden bei 280 unter submersen Bedingungen fermentiert. Die Gärbrühe wird mit dem   Lactobacillus-Lactis-Dorner-Test   auf LLD-Aktivität geprüft, filtriert und die LLD-aktive Substanz an Aktivkohle adsorbiert.

   Das Kohleadsorbat wird mit einer wässerigen Lösung von Pyridin ausgezogen und der Extrakt unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das erhaltene feste Konzentrat wird mit Methylalkohol ausgezogen, der alkoholische Extrakt durch eine mit aktiver 

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Tonerde beschickte Kolonne geleitet und das aktive Material mit frischem Methylalkohol eluiert. Die
Fraktionen mit ausgeprägter mikrobiologischer Aktivität werden vereinigt und konzentriert. Aus der kon- zentrierten Lösung wird durch Zugabe von Aceton rohes Vitamin   B12     ausgefällt.   Das Rohprodukt wurde durch Lösen in Äthylalkohol und Zugabe von Aceton gereinigt. Das so erhaltene Produkt kann durch Kristallisation aus einem Wasser-Aceton-Gemisch als reines kristallines Vitamin B12 gewonnen werden. 



   Ein zweiter Versuch wird in gleicher Weise, aber unter Zusatz von 2 Teilen Kobalt je Million Teile
Nährlösung durchgeführt. 



   Bei Durchführung des Verfahrens ohne Zusatz von Kobalt enthält die Gärbrühe 173 LLD-Einhei- ten/cm3. Die Ausbeute an Vitamin B12 (Kristallen) beträgt   18, 4 mg.   Bei Zugabe von 2 Teilen Kobalt je Million Teilen Nährlösung enthält die Gärbrühe 2250   LLD-Einheiten/cm3.   Die Ausbeute an kristallinem
Vitamin   B12     beträgt 106, 7   mg. 



   Beispiel 4 : Je 40 cm3 eines wässerigen Nährmediums, das   3%   Sojabohnenmehl,   2'10   Dextrose,   0,     25'oNaCl, 0, 75%   Destillations-Rückstände der Branntweinerzeugung enthielt, werden in 250 cm3 fas- senden Erlenmeyer-Kolben nach Zusatz von 0-12 Teilen Kobalt je Million Teilen Nährmedium in Form von Kobaltnitrat durch 1/2stündiges Erhitzen auf 1200 sterilisiert und danach mit ungefähr   2,5 Vol. -%   einer 48stündigen vegetativen Kultur eines Streptomycin produzierenden Stammes von Streptomyces griseus beimpft. Die beimpften Proben wurden 3 Tage unter ständigem Schütteln auf 270 gehalten. Nach
Vergärung werden die Streptomycin- und LLD-Aktivitäten ermittelt.

   Die Ergebnisse finden sich in nach- folgender Tabelle : 
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<tb> Teile <SEP> Kobalt <SEP> per <SEP> Million <SEP> Streptomycin <SEP> y/cm3 <SEP> LLD <SEP> - <SEP> Einheiten/cm3 <SEP> 
<tb> 0,0 <SEP> 850 <SEP> 300
<tb> 0,5 <SEP> 825 <SEP> 3000
<tb> 1,0 <SEP> 845 <SEP> 3100
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> 650 <SEP> 4200
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> 235 <SEP> 5000
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> < 150 <SEP> 2400
<tb> 8, <SEP> 0 <SEP> < <SEP> 150 <SEP> 2000
<tb> 12, <SEP> 0 <SEP> < <SEP> 150 <SEP> 220 <SEP> 
<tb> 
 
Beispiel 5 : Je 100 cm3 eines Nährmediums, das   18,   5g eines Hirn-Herz-Extraktes1, 85gAgar und 495 cm3 Wasser enthält und   auf pH=7, 0-7, 2   eingestellt ist. werden in 125 cm3 fassenden Erlenmeyer- 
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 7 Tage gehalten. 



   Eine zweite Versuchsreihe wurde unter denselben Bedingungen, aber mit Zusätzen von 10y-Kobaltnitrat-hexahydrat je   cm3 Nährlösung durchgeführt.   



   Die Ergebnisse der Vergleichsversuche, welche nachstehend aufgeführt sind, stellen Durchschnittswerte von je 4 Versuchen dar. 
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  Permentationsperiode <SEP> LLD-Aktivität/cm3
<tb> in <SEP> Tagen <SEP> ohne <SEP> Kobaltzusatz <SEP> 2 <SEP> Teile <SEP> Kobalt <SEP> je
<tb> Million <SEP> Teile <SEP> Nährlösung
<tb> 4 <SEP> 660 <SEP> 4600
<tb> 7 <SEP> 760 <SEP> 6500
<tb> 
 
PATENTANSPRÜCHE : 
1. Verfahren zur Gewinnung von LLD-aktiven Substanzen der Vitamin    -Gruppe,   dadurch   gekend -   zeichnet, dass man in einem üblichen wässerigen Nährmedium, das einen Zusatz von Kobalt, insbesondere in Form von löslichen Salzen in einer nicht toxischen Konzentration von ungefähr   0,0001-0,02%0Kobalt   enthält, einen eine LLD-Aktivität erzeugenden Schizomyceten-Stamm bis zur Erzielung einer wesentlichen Aktivität kultiviert und die Vitamine der   B12-Gruppe   bzw. LLD-aktiven Substanzen aus der Gärbrühe in üblicher Weise entfernt.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gärung im Submersverfahren unter <Desc/Clms Page number 4> aeroben Bedingungen durchgeführt wird.

   3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gärung unter ständigem Rühren und Belüften des gesamten geimpften Nährmediums während 2-7 Tagen bei einer Temperatur von etwa 280 C durchgeführt wird.

   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Anwendung eines Stammes von Streptomyces griseus.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Anwendung eines Streptomycin produzierenden Stammes von Streptomyces griseus.

   6. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Anwendung eines Grisein produzierenden Stammes von Streptomyces griseus.