DE2509337A1 - Verfahren zur herstellung von antibiotischen verbindungen des cephamycintyps - Google Patents

Verfahren zur herstellung von antibiotischen verbindungen des cephamycintyps

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DE2509337A1
DE2509337A1 DE19752509337 DE2509337A DE2509337A1 DE 2509337 A1 DE2509337 A1 DE 2509337A1 DE 19752509337 DE19752509337 DE 19752509337 DE 2509337 A DE2509337 A DE 2509337A DE 2509337 A1 DE2509337 A1 DE 2509337A1
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Description

PATENTANWÄLTE O-8000 MÖNCHEN 81 · ARABEUASTRASSE 4 . TELEFON (0811) 9Π087 £ 0 U 3 3 O
Case PP-1027 26 506 Wt/My
MEIJI SEIKA KAISHA LTD. Tokyo / Japan
Verfahren zur Herstellung von antibiotisehen Verbindungen
des Cephamycintyps
Die Erfindung betrifft neue 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-T-methoxy-J-hydroxymethyl-J-cephem-A-carbonsäure-Derivate. Solche Derivate werden erhalten, indem man Verbindungen des Cephamycintyps der Einwirkung eines Esteraseenzyms von Schimmelpilzen unterwirft.
Die Erfindung betrifft eine neue Verbindung und ein neues Verfahren zur Herstellung von antibiotisehen Verbindunden des Cephamycintyps. Die Erfindung betrifft insbesondere . neue Produkte mit der allgemeinen Formel (II) und ein Verfahren zur Herstellung von 7-(5-Amino-5~carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-hydroxymethyl-3-cephem~4-carbonsäure oder deren N-substituiertem Derivat der folgenden allgemeinen Formel (III) und pharmazeutisch annehmbare Salze davon:
HOOC - CH - (CH2)^ - COKH
j
HHIL j
COOH
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worin
R1 ein Wasserstoffatom, eine niedrige Acylgruppe, eine Arylacylgruppe, eine niedrige Alkoxycarbonylgruppe oder eine Arylalkoxycarbonylgruppe bedeutet.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung des Cephamycintyps der folgenden allgemeinen Formel (I):
HOOC-CH-(CH2)j-CONH
CH OCÖC = CH —
worin
R1 die gleiche Bedeutung wie oben besitzt und.
R2 Wasserstoff, eine Sulfogruppe, eine niedrige Acylgruppe oder eine Arylalkoxycarbonylgruppe bedeutet,
der Einwirkung eines Esteraseenzyms von Schimmelpilzen oder eines Fermentationsproduktes, das Esteraseenzym enthält, unterwirft und gegebenenfalls die erhaltene freie Säure .in ihre Salze oder die Salze in die freie Säure überführt.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren, bei dem Cephamycin A (worin R1 = H, R2 = SO,H in der obigen allgemeinen Formel [I] bedeuten) und Cephamycin B (R1 = R2 = H in der allgemeinen Formel [I] bedeuten) wie auch deren N,0-substituierten oder N-substituierten Derivate (R1 und/oder R2 haben die gleiche Bedeutung wie oben in der allgemeinen Formel [I]) der Einwirkung von Esteraseenzym unterwirft (das im folgenden als "Esterase11 bezeichnet wird), das fähig ist, spezifisch auf die Substanzen einzuwirken und 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido) -y-methoxy-J-hydroxymethyl^-cephem-A·- carbonsäure (R1 = H in der obigen allgemeinen Formel [H]) oder das N-substituierte Derivat (R1 besitzt die gleiche Be-
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deutung wie oben, aber ausgenommen Wasserstoff in der allgemeinen Formel [H]) zu bilden, und das so erhaltene Produkt isoliert.
Wenn in den obigen Formeln [i] und [II] R1 und R^ niedrige Acylgruppen bedeuten, so bedeutet dies niedrige Acylgruppen, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthalten und die substituiert sein können, beispielsweise Acetyl-, Propionyl-, Butyl-, Valeryl-Gruppen, eine Arylacylgruppe bedeutet Acylgruppen mit Phenyl-, Naphthyl- oder 5- bis 6-gliedrigen heterocyclischen Gruppen, die substituiert sein können, beispielsweise Benzoyl-, Toluyl-, p-Chlorbenzoyl-, Naphthoyl-, Niconinoyl- bzw. Nicotinoyl-, Furoyl- oder Thenoylgruppen, eine niedrige AlKoxycarbonylgruppe bedeutet eine niedrige Alkoxycarbonylgruppe, die eine Alkyl- bzw. Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, beispielsweise Methoxycarbonyl-, Acetoxycarbonyl, Pro^oxycarbonyl- oder Butoxycarbonylgruppen, eine Arylalkoxycarbonylgruppe Phenyl- oder Naphthyl-methyloxycarbonyl-, 5- bis 6-gliedrige heterocyclische Gruppen, beispielsweise Furylmethyloxycarbonyl-, Thienylmethoxycarbonyl- oder Pyridylmethoxycarbonylgruppen.
Die am meisten bevorzugten Beispiele für R* und Rq sind die folgenden: niedrige Acylgruppen wie Acetyl, Propionyl, Butyryl, Pivaloyl und Trichloracetylj Arylacylgruppen wie Benzoyl, p-Chlorbenzoyl, Isonicotinyl, Phenylacetyl, Phenoxyacetyl; niedrige Alkoxycarbonylgruppen wie Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, n-Butoxycarbonyl, Chlorpropoxycarbonyl; Arylalkoxycarbonylgruppen wie Carbobenzyloxy u.ä»
Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbare Salze" bedeutet Alkali-, Erdalkalimetall-, beispielsweise Natrium-, Kalium-, Calcium- und ähnliche Salze,und Salze organischer Basen, beispielsweise Ammonium- oder Triäthylaminsalze u.a.
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7-(S-Amino-S-carboxyvaleramido) -7-methoxy-3-hydroxyniethyl-3-cephem-4-carbonsäure oder deren N-substituiertes Derivat ist ein wichtiges Zwischenprodukt für die Herstellung von neuen und synthetischen Cephamycinen und diese Verbindungen sind extrem schwierig aus Cephamycinen A und B oder deren Ν,Ο-substituierten Derivaten in hoher Ausbeute durch einfache chemische Verfahren herzustellen. Beispielsweise wird beim Erwärmen einer wäßrigen Lösung aus Cephamycin B eine gewisse Menge an 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure gebildet, aber die Ausbeute davon beträgt im Höchstfall um 10%.
Überraschenderweise wurde ein einfaches Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel [II] in hoher Ausbeute gefunden, wobei man Cephamycin A oder B, die leicht entsprechend dem Verfahren, wie es in der japanischen Patentanmeldung 113 999/1973 beschrieben wird, erhältlich sind, oder die 0,N-substituierten Derivate von Cephamycin B, die leicht entsprechend dem Verfahren, wie es in der japanischen Patentanmeldung 116 791/1973 beschrieben wird, erhältlich sind, als Ausgangsmaterialien verwendet und ein Esteraseenzym, das In einigen kultivierten Brühen vorhanden ist, auf diese Verbindungen einwirken läßt, beispielsweise bekannte Pilze wie Aspergillus fumigatus, Hinterlegungsnummer 2469 im Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, Mucor lipoticus Aac-0102, Hinterlegungsnummer 566 in Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, und Penicillium chrysogenum IAM 7106. Das Enzym ist fähig, die C~3-Esterbindung von Cephamycinen A, B oder dem Ν,Ο-substituierten Derivat davon spezifisch zu spalten.
Obgleich 7- (S-Amino-S-carboxyvaleramido)^- methyl-3-cephem-4-carbonsäure, eine der erfindungsgemäß erhaltenen Verbindungen, auf Seite 126 der japanischen Provisional Patentanmeldung 3286/1971 beschrieben wird und aus einem
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Fermentationsprodukt, Cephamycin C, über fünf chemische Verfahren erhalten wird, ist es wichtig, daß das erfindungsgemäße einstufige Verfahren, das eine enzymatische Reaktion ist, besser ist als das oben beschriebene Verfahren. Die Verbindungen der allgemeinen Formel [II], die erfindungsgemäß erhalten werden, sind alle neue Verbindungen, mit Ausnahme der obigen Carbonsäure.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durchgeführt werden, indem man das Ausgangsmaterial der allgemeinen Formel [I] mit einem Enzymextrakt, den man aus einer Kulturbrühe erhält, umsetzt, dem Filtrat oder dem Fermentationsprodukt eines Schimmelpilzes oder mit einem rohen Pulver aus einem Esteraseenzym oder mit einem gereinigten Pulver des Enzyms in einer wäßrigen Lösung. Die Schimmelpilze, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind gut bekannte Stämme wie Aspergillus fumigatus (Hinterlegungsnummer 2468 in Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Chiba-city, Japan), der bekannte Stamm Mucor lipoticus Aac-0102 (Hinterlegungsnummer 566 in Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Chiba-city, Japan) und der bekannte Stamm Penicillium chrysogenum IAM 7106, der im Institute of Applied Microbiology of Tokyo University gehalten und von dort erhältlich ist.
Für die Herstellung des Esteraseenzyms durch Kultivierung der oben erwähnten Mikroorganismen kann man verschiedene Kulturmedien verwenden, die man üblicherweise für die Kultivierung eines Mikroorganismus einsetzt. Genauer gesagt, kann man Glucose, Saccharose, Glycerin, Stärke, Öle, die für die Kultivierung verwendet werden, u.a. wie Kohlenstoffquellen und Pepton, Bouillon, Mais- bzw. Getreideeinweichflüssigkeit, Fleischextrakt, Fischmehl, entfettete Sojabohnen, Weizenembryo, Kleie u.a. als Stickstoff quellen verwenden und gegebenenfalls kann man andere Zusatzstoffe wie anorganische Salze, Vitamine u.a. zusammen mit den obigen Verbindungen einsetzen.
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Als Kultivierungsverfahren kann üblicherweise submerse Kulturen wie Schüttelkulturen oder gerührte Kulturen unter Belüftung verwenden, aber es können aerobe stationäre Kulturen oder feste Kulturen mit Weizenkleie usw. verwendet werden als leistungsfähiges Kultivierungsverfahren. Bei der Kultivierung ist es bevorzugt, zuerst eine Präverbreitung bzw. Prävermehrung in kleinem Maßstab durchzuführen und dann ein Kulturmedium mit der so gebildeten Impfkultur zu inokulieren. Die Kultivierungstemperatur kann nach Bedarf im Bereich von 20 bis 370C ausgewählt werden, eine Temperatur von 25 bis 28°C ist jedoch üblich und wird bevorzugt verwendet. Die Kultivierungszeit beträgt 3 bis 10 Tage, um die gewünschte Esterase wirksam zu bilden.
Die Esterase wird in einer Kulturbrühe im Falle einer flüssigen Kultur gebildet und wie wird ebenfalls durch leichte Extraktion einer Kulturbrühe mit Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung im Falle einer festen Kultur bei Weizenkleie u.a. erhalten.
Die Esterase, die in einer Kulturbrühe oder deren Extrakt als solche enthalten ist, kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ohne weitere Reinigung verwendet werden. Die Esterase kann auch durch Zugabe eines Alkohols wie Methanol, Äthanol, .Isopropanol usw. oder Aceton ausgefällt werden, mit Ammoniumsulfat ausgesalzen werden oder durch Dialyse oder andere Maßnahmen dialysiert werden, um sie teilweise zu reinigen oder zu konzentrieren, und die so entsalzte Enzymlösung kann durch solche Maßnahmen wie Gefriertrocknung behandelt werden, so daß das Enzym in Form einer Pulverpräparation verwendet werden kann.
Die Esteraseaktivität kann unter Verwendung von Cephamycin A, B oder Äthoxycarbonylcephamycin B als Substrat bestimmt werden. Alle drei oben erwähnten Substrate zeigen antibakterielle Aktivitäten gegenüber Bacillus stearothermophylus-und die
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Esteraseaktivität kann somit durch Umsetzung mit diesen Substraten und anschließender Messung der Verminderung ihrer antibakteriellen Aktivitäten mit einem Bioversuchsverfahren wie mit einer Papierscheibe usw. bestimmt werden; und wenn Cepharaycin B als Substrat verwendet wird, kann es mit Esterase umgesetzt werden, und wenn die Reaktionsmischung der sauren Extraktion mit Äthylacetat unterworfen wird, werden Fragmente der Esterase-Zersetzungsprodukte des Substrats gebildet, nämlich cc-Methoxy-p-hydroxyzimtsäure, diese geht leicht in die Äthylacetatschicht über, und die ultraviolette Absorption der Säure wird so gemessen, und dann kann die Esteraseaktivität leicht bestimmt werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Hydrolyse von Cephamycinen A, B und den O,N-substituierten Derivaten davon mit Esterase wie oben angegeben durchgeführt werden. Die Substratkonzentration kann variieren, abhängig von der Aktivität der verwendeten Esterase usw., aber ein Bereich zwischen 0,1 und 2% ist geeignet, und der ReaktionspH-Wert liegt wirksamerweise zwischen 6,5 und 8,5 und besonders um 7. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von 30 bis 60°C liegen, aber eine Temperatur zwischen 40 und 50°C ist üblicherweise von Vorteil, da eine höhere Temperatur die Esterase inaktiviert. Es ist wirksam, die Reaktionsmischung mit geeigneten Schüttel- oder Rührvorrichtungen zu versehen, während die Umsetzung abläuft. Die Reaktionszeit ist bevorzugt so kurz wie möglich, aber eine längere Zeit ist von Vorteil, um die Enzymreaktion bis zum Ende ablaufen zu lassen, und 4 bis 50 Stunden sind technisch annehmbar* Als Enzymlösung kann das Filtrat verwendet werden, das von der flüssigen Kultur stammt, oder ein Extrakt, der von der festen Kultur stammt, in dem das Substrat in geeigneter Konzentration für die Umsetzung gelöst ist, und alternativ kann ein gereinigtes Enzym oder ein festes Fermentationsprodukt, das das Enzym enthält, in der Lösung des Substrats gelöst oder suspendiert werden. Es ist ebenfalls möglich, kontinuierlich Esterase in
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Form eines Mediums zu verwenden, das das Enzym daran adsorbiert enthält oder in unlöslichem Zustand enthält.
Die modifizierten Verbindungen aus Cephamycinen der allgemeinen Formel [il], die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, können aus der Reaktionsmischung isoliert und wie im folgenden angegeben gereinigt werden.
Bei der Reinigung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure, die aus der Reaktionsmischung von Cephamycinen A oder B stammt, die mit Esterase behandelt wurden, ist bevorzugt ein Adsorptionsverfahren zu verwenden und Adsorptionsmittel wie Anionenaustauschharze, Aktivkohle u.a. einzusetzen, da die erfindungsgemäße Verbindung eine wasserlösliche saure Verbindung ist. Beispielsweise kann das gewünschte Produkt in der Reaktionsmischung an einem Anionenaustauschharz Dowex 1x2 (Cl-Form) oder DEAE-Sephadex A-25 (Cl-Form) adsorbiert werden, mit einer geeigneten Salzlösung eluiert werden und dann über Aktivkohle Chromatographiert werden, Verfahren, die zur Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung bekannt sind. Im Falle der Verbindungen der allgemeinen Fc'jmel [II], worin R1 eine andere Bedeutung als ein Wasserstoffatom besitzt, kann ein Extraktionsverfahren mit einem organischen Lösungsmittel wirksam verwendet werden zusätzlich zu der oben erwähnten Verwendung von Ionenaustauschharzen oder Aktivkohle, Genauer gesagt, wird der pH-Wert der enzyniatisehen Reaktionsmischung mit einer Mineralsäure auf pH 2 bis 4 eingestellt, und dann wird mit Äthylacetat extrahiert, wobei (zuerst) a-Methoxy-p-hydroxyzimtsäure und deren Derivate entfernt werden. Dann wird die wäßrige Schicht so wie sie ist bei dem pH-Wert von 2 bis 4 mit n-Butanol extrahiert und dabei wird das erfindungsgemäße gewünschte Produkt in die n-Butanolschicht extrahiert. Die n-Butanolschicht als solche wird bis zur Trockene konzentriert und dabei erhält man die erfindungsgemäße Verbindung in Form der freien Säure, oder nachdem
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sie zu einer wäßrigen Lösung aus Natriumbicarbonat gegeben wurde, kann die wäßrige Schicht zur Trockene eingedampft werden und man erhält die erfindungsgemäße Verbindung in Form ihres Natriumsalzes. Wird die n-Butanolschicht in eine wäßrige Lösung gegeben, die eine Base wie Kaliumbicarbonat, Ammoniak, Triäthylamin u.a. enthält, wird die erfindungsgemäße Verbindung in Form des entsprechenden Salzes erhalten*
Die morpholQgischen Eigenschaften von Aspergillus fumigatus (Hinterlegungsnummer 2469 in Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology), einem der Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind die folgenden:
(1) Wachstum auf Agarmedium
Auf Malzextrakt-Agarmedium, Kartoffel-Glucose-Agarmedium und Czapek·s-Agarmedium bei 28°C erhält man gezüchtete Kolonien mit den im folgenden angegebenen Durchmessern (mm):
Medium 2 Tage 3 Tage 4 Tage
mm mm mm
Malzextrakt-Agarmedium 16 34 49 Kartoffel-Glucose-Agarmedium 19 35 47 Czapek1s-Agarmedium 11 23 33
Auf dem Malzextrakt-Agarmedium sind die Kolonien flockig und die Oberflächen sind grün bis dunkelgrün. Die Rückseiten der Kolonien sind farblos bis schwachgelb und es werden keine besonderen Färbungen beobachtet.
Morphologische Eigenschaften
Beobachtet man die obigen Medien unter einem Mikroskop,. so stellt man fest, daß die Konidienköpfe zylindrisch geformt sind und dichte Konidien enthalten. Die Konidiophoren sind kurz und glatt und enden mit kolbenartigen Bläschen. Die Sterigma sind einfach an der oberen Hälfte der Bläschen.
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Die Konidien sind sphärisch mit einem Durchmesser von 2,5 bis 4/U und stachelig auf ihrer Oberfläche.
(2) Physiologische Eigenschaften
Die Beziehungen zwischen den Wachstumsdurchmessern (mm) der Kolonien auf Malzextrakt-Agarmedium und den Wachstumsbedingungen (pH, Temperatur) werden im folgenden angegeben.
(a) pH (bei 28°C)
pH 2 Tage
mm		 3 Tage
mm		 ,0) 3 Tage
mm		 4 Tage
mm		 12 Tage
5,0 16 32 0 44 16
7,0 16 34 34 49 -
9,0 14 27 65 40 _
(b) Temperaturen (bei pH 7
Temp.0C 2 Tage
ram		 4 Tage
mm
15 0 0
28 16 49
37 38 78
(3) Verwendung von Kohlenstoffquellen
Die Verwendung von Kohlenstoff quellen auf Czapek's Medium. Positiv: Glucose, Stärke, Saccharose, Mannose, Galactose,
Arabinose, Xylose, Fructose, Dextrin Negativ: Cellulose.
Aus den obigen morphologischen Eigenschaften ergibt sich, daß dieser Stamm zu Genus Aspergillus gehört und zu Aspergillus fumigatus, verglichen mit gut bekannten Stämmen nach "The genus Aspergillus" (1965): Raper & Fennel (Williams & Wilkins Comp., Baltimore). (Weiterhin wird dieser Stamm identifiziert durch synchrone Kultivierung mit Aspergillus gumigatus IFO 7079 als Typ Kultur.)
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
Je 100 ml-Teile eines flüssigen Kulturmediums (pH 6,5), das k% lösliche Stärke, 3% entfettetes Sojabohnenmehl, 0,3% primäres Kaliumphosphat und 0t3% Ammoniumsulfat, enthielt, wurden in drei 500 ml-Volumen Sakaguchi-Kolben gegeben. Nach der Sterilisation in einem Autoklaven bei 120°C während 15 Minuten wird eine Platinschlaufe von je Aspergillus fumigatus (Hinterlegungsnummer 2469 in Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology), Mucor lipolyticus Aac-0102 (Hinterlegungsnummer 566 in Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology) und Penicillium chrysogenum IAM 7106 zugegeben, die auf Kartoffel-Glucose-Agarschrägkulturen inokuliert waren, und dann wurde unter Schütteln bei 28°C 6 Tage in einem Reziprokschüttelgerät kultiviert, wobei man eine Kulturbrühe der entsprechenden Mikroorganismen erhielt.
10 g Weizenkleie und 10 ml Wasser wurden in je drei 500 ml-Vo lumen Erlexinieyericolben vermiscbx. Nach der Sterilisation in einem Autoklaven bei 120°C während 15 Minuten wurde mit je einer Platinschlaufe jeder der oben erwähnten drei Stämme Inokuliert und stationär bei 28°C während 8 Tagen kultiviert. Die Kulturbrühe wurde mit 60 ml Wasser pro Kolben extrahiert und filtriert, und man erhielt ein Extraktionsfiltrat.
Die Kulturbrühe und das Extraktionsfiltrat werden als Enzymlösung verwendet. Ein aliquoter Teil von 1 ml jeder Enzym*· lösung und ein aliquoter Teil von 1 ml jeder Substratlösung, die Cephamycin A, B oder je eines ihrer N,0-substituierten Derivate mit einer Konzentration von 1 000 /Ug/ml enthielt, wurden zugegeben und dann wird der pH-Wert der entstehenden
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Mischung auf 7,0 eingestellt. Die Umsetzung wird bei 400C während 2 Stunden durchgeführt und anschließend wird die verminderte antibakterielle Aktivität mit einem Bioversuchsverfahren mit Papierscheibe verwendet, wobei man eine 'Versuchsplatte aus Bacillus stearothermophylus verwendet, um um die Hydrolysegeschwindigkeit der Esterase zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
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Hydrolyseraten (%) bzw. Hydrolysegeschwindigkeiten von Cephamycinen A, B und deren N,O-substitu-
ierten Derivaten mit einigen Pilzesterasen Enzym Substrat A B C D E F
flüssiges Aspergillus fumigatus (Hinterl.Nr.2469
Kultur- in Fermentation Research Institute of
filtrat Agency of Industrial Science and Techn.) 75 75 90 1QO 55 60 Mucor lypolyticus (Hinterl.Nr.566 in Fermentation Research Institute of Agency of
Industrial Science and Technology; 60 75 60 75 80 35
Penicillium chrysogenum IAM 7106 35 55 /40 / /
J0 Aspergillus fumigatus (Hinterl.Nr.2469 »
er» in Fermentation Research Institute of ^
ω Agency of Industrial Science and Techn.) 90 100 90 100 80 45 u,
^ Mucor lypolyticus (Hinterl.Nr.566 in Fer- ι
ο mentation Research Institute of Agency of
cd Industrial Science and Technology) 70 100 50 100 / /
S Penicillium chrysogenum IAM 7106 45 60 70 60 / /
In der obigen Tabelle haben die Abkürzungen A bis F die folgenden Bedeutungen: A: Cephamycin A D: NjO-Diäthoxycarbonylcephamycin B
B: Cephamycin B E: Ν,Ο-Dipropionylcephamycin B
C; N-Äthoxycarbonylcephamycin A F; Ν,Ο-Dibenzyloxycarbonylcephamycin B
cn σ co co co
Beispiel
Sporen von Aspergillus fumigatus (Hinterlegungsnummer 2469 in Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology) werden zum Inokulieren von 500 ml eines flüssigen Kulturmediums (pH 6,5) verwendet, das 4,0% lösliche Stärke, 3,0% Sojabohnenmehl, 0,3% Kalium, bezogen auf die 4,0% lösliche Stärke, 3,0$ Sojabohnenmehl, 0,3$ primäres Kaliumphosphat und 0,3% Amraoniumsulfat enthält, und dann wird unter Schütteln bei 25°C während 48 Stunden kultiviert. Die so erhaltene Kulturbrühe wird erneut zum Inokulieren von 20 1 des gleichen Mediums verwendet und die Kultivierung erfolgt unter Belüftung und Rühren bei 25°C während 96 Stunden. Nach dem Kultivieren wird die Kulturbrühe filtriert, man erhält 12 1 Filtrat. Zu dem Filtrat fügt man unter Rühren Ammoniumsulfat zur Sättigung bei 0,7 und läßt bei 5°C über Nacht stehen. Der so gebildete Niederschlag wird gesammelt und in 500 ml Leitungswasser gelöst. Unlösliche Materialien werden abfiltriert und das entstehende Filtrat (600 ml) wird gegenüber Leitungswasser bei 50C während 24 Stunden unter Verwendung einer Viskingröhre dialysiert. Die dialysierte Flüssigkeit wird als Enzymlösung verwendet.
Eine Menge von 5 g Cephamycin B (einer Reinheit von 50%) wird in 1 1 der Enzymlösung (pH-Wert auf 7,3 eingestellt) gelöst und die Reaktion wird bei 45°C während 6 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wird die Reaktionsmischung entfärbt, indem man sie durch eine Säule aus dem synthetischen Adsorptionsmittel Amberite XAD-2 (100 ml) leitet, und das abströmende Material wird durch eine Säule mit einem Anionenaustauschharz Dowex 1x2 (Cl-Form (50 ml) geleitet, wobei man das gewünschte Produkt, adsorbiert an dem Harz, erhält. Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 0,05 M wäßriger Lösung aus Natriumchlorid eluiert. Der erste 50 ml-Teil wird verworfen und der nächste 250 ml-Teil wird durch eine Säule aus Aktivkohle (20 ml) geleitet, wobei das gewünschte Produkt an der Aktivkohle adsorbiert wird. Die Säule wird dann mit
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Wasser eluiert, und es werden jeweils 10 ml-Teile des Eluats gesammelt· Die Fraktionen Nr. 5 bis 15 werden gesammelt (160 ml) und gefriergetrocknet, man erhält 770 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido ) ^-methoxy-J-hydroxymethyl-J-cephem-^- carbonsäure (Na-SaIz) als farbloses Pulver. Fp. 165 bis 172°C Analyse: C1^H20N^08SNa
Berechnet: C 42,3596 H 4,71$ N 9,88% Gefunden: 42,91 4,90 9,68
Beispiel 5
Je 100 g Weizenkleie und aliquote Teile von 100 ml Wasser werden in jeweils vier 2 1-Volumen Erlenmeyerkolben gegeben und sterilisiert. Aspergillus fumigatus (Hinterlegungsnr.2469 in Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology ) wird zum Inokulieren verwendet und das Kultivieren erfolgt bei 25°C während 8 Tagen. Ein aliquoter Teil von 600 ml Leitungswasser wird zu jedem kultivierten Kolben gegeben, um bei Zimmertemperatur zu extrahieren. Der entstehende Extrakt wird gesammelt und gegenüber Leitungswasser bei 5°C über Nacht unter Verwendung eines Viskingrohrs dialysiert, und man erhält 2,1 1 dialysierte Flüssigkeit (pH 6,9), die man als Enzymlösung verwenden kann. Eine Menge von 1,7 g Ν,Ο-Diäthoxycarbonylcephamycin B mit einer Reinheit von ungefähr 20%, getrennt hergestellt, wird in ungefähr 20 ml einer wäßrigen Lösung aus Natriumbicarbonat (pH 7*2) gelöst und die entstehende Lösung wird zu 850 ml der oben erwähnten Enzymlösung zugegeben. Die Umsetzung wird unter Rühren bei 45°C während 4 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wird der pH-Wert der Reaktionsmischung auf 3 mit verdünnter Chlorwasserstoff säure eingestellt, und dann wird mit 300 ml Äthylacetat gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wird die wäßrige Schicht, während sie bei einem pH-Wert von 3 gehalten wird, dreimal mit 300 ml n-Butanol extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und zweimal mit einer geringen Wassermenge gewaschen.
5.0 983 8/0952
Der so erhaltene n-Butanolextrakt wird zweimal mit 100 ml verdünnter wäßriger Lösung von Natriumbicarbonat wieder extrahiert. Der neutrale wäßrige Extrakt wird zur Trockene konzentriert, man erhält ungefähr 500 mg rohes Pulver, das N-Äthoxycarbonyl-7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure-natriumsalz enthält· Das so erhaltene Produkt wird in 20 ml Wasser gelöst, an einer Säule (1,6 χ 19 cm) von DEAE-Sephadex A-25 (Cl-Form) adsorbiert, mit 350 ml einer 0,05n wäßrigen Lösung von Natriumchlorid entwickelt und dann mit ungefähr 100 ml einer 0,1η wäßrigen Lösung von Natriumchlorid entwickelt, wobei das gewünschte Produkt eluiert wird. Diese Fraktionen, die eine ultraviolette Absorption (ungefähr 100 ml) zeigen, werden gesammelt, der pH-Wert wird auf 3 mit 1n Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann werden sie dreimal mit 50 ml n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zweimal mit einer geringen Wassermenge gewaschen, der pH-Wert wird mit 30 al verdünnter wäßriger Lösung von Natriumbicarbonat auf 7,0 eingestellt und dann wird erneut extrahiert. Die entstehende wäßrige Lösung wird auf ungefähr 2 ml konzentriert, über einer Säule von Sephadex G-10 (1 χ 50 cm) mit fließendem Wasser entwickelt und die Fraktionen, die eins ultraviolette Absorption zeigen, werden gesammelt und zur Trockene konzentriert, wobei man 72 mg N-Äthoxycarbonyl-7- (S-amino-S-carboxyvaleramido ) ^-methoxy^-hydroxymethyl^-cephem-^carbonsäurenatriumsalz erhält; Fp. 130 bis 1350C.
Analyse: C^
Berechnet: C 43,5% H 4,9% N 8,4% Gefunden : 42,8 4,8 7,9
Beispiel 4
Man arbeitet auf gleiche Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, mit der Ausnahme, daß 1,6 g Ν,Ο-Dibenzyloxycarbonylcephamycin B(einer Reinheit von 40%) anstelle des Ν,Ο-Diäthoxycarbonyl-
509838/0952
cephamycine B verwendet werden. Man erhält 160 mg N-Benzyloxycarbonyl-7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-T-methoxy-S-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure-natriumsalz in Form eines Pulvers; Fp. 155 bis 1600C.
Analyse: C^H^N-zO^QSNa Berechnet: C 49,4% H 4,7% N 7,596 Gefunden : 49,0 4,8 7,3
Beispiel 5
Man arbeitet auf gleiche Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, mit der Ausnahme, daß. 1,3 g Ν,Ο-Dipropionylcephamycin B (einer Reinheit von-20%) anstelle von Ν,Ο-Diäthoxycarbonylcephamycin B verwendet werden. Man erhält 50 mg N-Propionyl-7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)^-methoxy-^-hydroxymethyl-^- cephem-4-carbonsäure-natriumsalz in Form eines Pulvers; Fp. 145 bis 150°C.
Anlayse:
Berechnet: C 44,9 % H 5,0% N 8,7% Gefunden : 44,2 4,7 8,2
509838/0952

Claims (7)

  1. Patentansprüche
    R.. ein Wasserstoff atom, eine niedrige Acylgruppe,
    eine Arylacylgruppe, eine niedrige Alkoxycarbonylgruppe oder eine Arylalkoxycarbonylgruppe bedeutet.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure oder deren N-substituiertem Derivat der folgenden allgemeinen Formel und den pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon
    OCH-
    HOOC -CH-NHR1
    - CONH
    COOH
    worin
    R1, ein Wasserstoffatom, eine niedrige Acylgruppe
    oder eine Arylacylgruppe, eine niedrige Alkoxycarbonylgruppe oder eine Arylalkoxycarbonylgruppe bedeutet,
    dadurch gekennzeichnet , daß man eine Verbindung des Cephamycintyps der folgenden allgemeinen Formel:
    OCH
    HOOC-CH-(CH,),-CONH
    I 23
    NHR1
    CH2OCOC = CH-
    OR.
    iOOH
    OCH,
    509 8 3 8/0952
    worin
    R^ die oben gegebene Bedeutung besitzt und Rp ein Wasserstoffatom, eine Sulfogruppe, eine niedrige Acylgruppe oder eine Arylalkoxycarbonylgruppe bedeutet,
    der Einwirkung von Esteraseenzym von Schimmelpilzen oder eines Fermentationsproduktes, das Esteraseenzym enthält, unterwirft und gegebenenfalls die so erhaltene freie Säure in das Salz oder das Salz in die freie Säure überführt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die folgenden Verbindungen als Ausgangsmaterial verwendet werden:
    (1) Cephamycin A
    (2) Cephamycin B
    (3) N-Äthoxycarbonylcephamycin A
    (4) Ν,Ο-Diäthoxycarbonylcephamycin B
    (5) Ν,Ο-Dipropionylcephamycin B
    (6) NiO-Dibenzyloxycarbonylcephamycin B.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Verbindungen hergestellt werden:
    (1) 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure oder ihr Natriumsalz,
    (2) N-Äthoxycarbonyl-7-(S-amino-S-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure oder ihr Natriumsalz,
    (3) N-Benzyloxycarbonyl-7-(5-amino-5-carboxyvaleramido) ^-metnoxy-S-hydroxymethyl^-cephem^-carbansäure oder ihr Natriumsalz,
    (4) N-Propionyl-7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure oder ihr Natriumsalz.
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  5. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Stämme der folgenden Fungi verwendet werden:
    (1) Aspergillus fumigatus, Hinterlegungsnummer 2469,
    (2) Mucor lipolyticus bzw. lipoticus Aac-0102,
    (3) Penicillium chrysogenum IAM 7106.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Kultivierung "bei einer Temperatur von 30 bis 600C, bevorzugt von 40 bis 500C, bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 während 4 bis 50 Stunden erfolgt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Konzentration des Esteraseenzyms ungefähr 0,1 bis 296 beträgt.
    509838/0952
DE2509337A 1974-03-11 1975-03-04 Verfahren zur Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7methoxy-S-hydroxymethyl-S-cephem^-carbonsäure-Derivaten Expired DE2509337C3 (de)

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