DE3611168C2

DE3611168C2 - Hydroxybenzoesäurephenylester, deren Herstellung und deren Verwendung als physiologisch wirksame Substanzen

Info

Publication number: DE3611168C2
Application number: DE3611168A
Authority: DE
Inventors: Satoshi Yaginuma; Masashi Awata; Masaki Takada; Kenji Kinoshita
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1985-04-02
Filing date: 1986-04-01
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2006-04-02
Also published as: GB2174696A; GB2174696B; FR2579599B1; DE3611168A1; FR2579599A1; GB8608046D0; US4801697A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Hydroxybenzoesäurephenylester, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als physiologisch wirksame Substanzen.

Es ist bekannt, daß cyclisches Adenosin-3′,5′-monophos phat (das nachstehend als cycl. AMP bzw. c-AMP bezeichnet wird) im lebenden Organismus als sogenannter "zweiter Bote" für Zellmembran-Funktion sowie auf Zellwachstum oder Dif ferenzierung zu wirken vermag. Ein Enzym, das den Abbau von c-AMP zu 5′-Adenosinmonophosphat (nachstehend als 5′-AMP bezeichnet) katalysiert, ist cyclisches Adenosin- 3′,5′-monophosphat-phosphodiesterase (nachstehend als PDE bezeichnet), und ein Inhibitor für PDE kann den c-AMP- Spiegel in vivo erhöhen. Es ist bekannt, daß dadurch zahlreiche Effekte bewirkt und/oder beeinflußt werden können, beispielsweise Dilatation der Bronchien, Kon traktilität des Herzmuskels, Spannung von glatter Musku latur und Freisetzung von Hormonen.

Man kennt schon aus Mikroorganismen hergestellte PDE- Inhibitoren, beispielsweise PDE-I und PDE-II (Agr. Biol. Chem., 42 (7), 1331-1336 (1978)), Terferol (J. Antibiotics, 37 (1), 6-9 (1984)), CC-1065 (ebenda, 33 (8), 902-903 (1980)) und Reticulol (ebenda, 28 (7), 558-560 (1975)), hergestellt aus Streptomyces. Auch mittels Bakterien gewonnene Substanzen sind bereits bekannt, beispielsweise APD-I, APD-II und APD-III (ebenda, 36 194-196 (1983)). Es sind weiterhin synthetische Chemikalien, zum Beispiel Theophyllin und Papaverin, als PDE-Inhibitoren bekannt. Diese werden beispielsweise als Bronchodilatatoren und Vasodilatatoren eingesetzt.

Es ist im Hinblick auf medizinische Behandlungsmöglich keiten außerordentlich wichtig, Mikroorganismen zu finden, die physiologisch aktive Substanzen zu produzieren vermögen, und besonders wichtig für die medizinische An wendung und für Forschungszwecke zur Untersuchung von c-AMP ist es, daß man daraus einzelne Zellen zu reinen Kulturen zu vermehren in der Lage ist, aus denen sich PDE-Inhibitoren gewinnen lassen.

Erfindungsgemäß wurden überraschend chemische Substanzen nämlich Hydroxybenzoesäurephenylester gefunden, die sich durch Mikroorganismen ge winnen lassen, und die als physiologisch aktive Substanzen verwendet werden können, welche Hemmwirkung gegen PDE-Aktivität aufweisen. Ein Verfahren zur Herstellung der neuen Substanzen besteht darin, daß man eine Kultur eines Mikroorganismus der Art Nodulisporium sp. M 5220 FERM P-8133 züchtet und daraus die aktiven Bestandteile isoliert, die als Hydroxybenzoesäurephenylester identifiziert wurden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind dementsprechend Hydroxybenzoesäurephenylester der nachstehenden allgemeinen Formel (I)

worin R für einen β-D-Glucopyranosyl-, β-D-Galaktopyrano syl-, 6′-O-Acetyl-β-D-glucopyranosyl- oder 6′-O-Acetyl- β-D-galaktopyranosyl-Rest oder für ein Wasserstoffatom oder für ein Salz davon steht. Ein erfindungsgemäßes Verfahren zu deren Herstellung ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Hydroxybenzoesäurephenylester-produzierenden Mikroorganismus der Art Nodulisporium sp. M 5220 FERM P-8133 züchtet und aus der Kultur den o. g. Ester isoliert.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Verbindungen als physiologisch aktive Stoffe, die als Inhi bitoren gegen PDE-Aktivität zu wirken vermögen.

In der nachstehenden Tabelle ist die Zuordnung der Reste R in der Formel (I) zu einzelnen Abkürzungen für die Substanzen veranschaulicht, die eine bessere Übersichtlichkeit gewähren sollen.

Benennung der Substanz
R
TPI-1
β-D-Glucopyranosyl
TPI-2	β-D-Galaktopyranosyl
TPI-3	6′-O-Acetyl-β-D-glucopyranosyl
TPI-4	6′-O-Acetyl-β-D-galaktopyranosyl
TPI-5	Wasserstoff

Ein erfindungsgemäßer und physiologisch aktiver Hydroxybenzoesäure phenylester der nachstehenden Formel (II)

worin R′ für einen β-D-Glucopyranosyl-, einen β-D-Galakto pyranosyl-, einen 6′-O-Acetyl-β-D-glucopyranosyl- oder einen 6′-O-Acetyl-β-D-galaktopyranosyl-Rest steht, läßt sich mittels eines Mikroorganismus der Spezies M 5220 gewinnen. Dieser Mikroorganismus hat die folgenden taxonomischen Eigenschaften.

(1) Morpholigsche Eigenschaften

Es wurden die folgenden Beobachtungen auf Czapek-Agar-Nähr boden, Malzextrakt-Agar-Nährboden und Kartoffel-Glucose- Agar-Nährboden gemacht.

Das vegetative Myzel hat einzelne haarartige Form oder nebeneinander liegende Fadenform, ist gelblich, gestreckt, 2,5-3 µm dick und hat glatte Oberfläche. Die Conidio phoren haben eine Abmessung von 50-130×2,5-3,0 µm, sind farblos bis hellgelb, verzweigt, mit Septen und glatter Oberfläche. Die Conidien-Zellen sind singulär oder spiralförmig mit 2-3 Spiralen am Kopf der Conidiophore, haben eine Größe von 6-20×2,0-2,5 µm und sind farb los bis hellgelb. Ein Typus der Conidien-Formation ist Sympodulosporae. Gebildete Conidien haben eine Größe von 3,0-5,0×2,0-2,8 µm, sind unicellular und haben glatte Oberfläche.

(2) Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Medien

Es wurden auf verschiedene Medien, auf denen 10 Tage lang bei 26°C gezüchtet wurde, die folgenden Beobachtungen ge macht. Die Farbangaben entsprechen denjenigen in dem Methuen Handbook of Colour von A. Kornerup und J. H. Wanscher, 3. Edition, Eyre Methuen, London (1978).

(i) Czapek-Agar-Medium

Langsames Wachstum mit einem Durchmesser von 11-13 mm bei einer 10 Tage-Kultur bei 26°C. Die Kolonien sind flach, etwas samtartig bis leicht baumwollartig. Sie haben dunkelgrüne Färbung (30F6). Die Kanten sind glatt. Es ent steht kein Exudat und kein austretendes Pigment. Die Färbung der Rückseite ist dunkelgrün (27F5).

(ii) Malzextrakt-Agar-Medium

Langsames Wachstum mit einem Durchmesser von 15-17 mm bei einer 10 Tage-Kultur bei 26°C. Die Kolonien sind dick gewölbt, leicht baumwollartig. Sie haben dunkelgrüne Färbung (27F5) und glatte Kante. Es entsteht kein Exudat und kein austretendes Pigment. Die Färbung der Rückseite ist dunkelgrün (27F3).

(iii) Kartoffel-Glucose-Agar-Medium

Langsames Wachstum mit einem Durchmesser von 15-16 mm bei einer 10 Tage-Kultur bei 26°C. Die Kolonien sind dick gewölbt, leicht baumwollartig. Sie haben dunkelgrüne Färbung (27F3) und glatte Kante. Es entsteht kein Exudat und kein austretendes Pigment. Die Färbung der Rückseite ist dunkelgrün (27F3).

(3) Physiologische Eigenschaften
(i) Wachstums-pH-Wert:\|1-9,5
Optimal-pH-Wert:	3-7
(ii) Wachstums-Temperatur:	13-40°C
Optimal-Temperatur:	25-30°C

Gemäß den zuvor illustrierten taxonomischen Eigenschaften gehört die vorliegende Spezies, da sie die Eigenschaften hat, asexuelle Sporen und Myzel mit Septen zu bilden, zu Deuteromycotina. Weiterhin handelt es sich bei der vor liegenden Spezies, bei der der Typus der Conidien-Bildung Sympodulosporae ist, die Conidiophoren gut verzweigt und die Conidien-bildenden Zellen häufig spiralförmig sind, um eine zur Gattung Nodulisporium gehörende Art.

Diese zuvor beschriebene Spezies wird als Nodulisporium sp. M 5220 bezeichnet. Sie wurde hinterlegt beim Fermenta tion Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan, unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-8133.

Der physiologisch aktive Hydroxybenzoesäurephenylester der Formel (II) läßt sich durch Züchtung gewinnen, beispielsweise dadurch, daß man einen den o. g. Ester der Formel (II) produzierenden Mikro organismus der Art Nodulisporium sp. M 5220 FERM P-8133 züchtet und aus der gezüchteten Masse Hydroxybenzoesäurephenylester der Formel (II) isoliert.

Für die Züchtung des Spezies kann man beim erfindungsge mäßen Verfahren die gebräuchlichen Mittel für Pilzkulturen einsetzen.

Die Kulturmedien können eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Quelle für verwertbaren Stickstoff und erforderlichenfalls anorganische Salze und Vitamine ent halten. Beispiele für Kohlenstoff-Quellen sind Saccharide, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Lactose, Galaktose, Dextrin, Stärke, Glycerin und Sorbit, und pflanzliche Öle, wie Sojabohnenöl, einzeln oder in Kombi nation. Beispiele für Stickstoff-Quellen sind Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenpulver, Baumwoll saatpulver, Maisquellwasser, Malzextrakt, Casein, Amino säuren, Harnstoff, Ammoniumsalze und Nitratsalze, einzeln oder kombiniert. Weiterhin können erforderlichenfalls anorganische Salze von Magnesium, Calcium, Natrium, Kalium, Eisen und Mangan, sowie Vitamine wie Vitamin B und Calcium pantothenat zugesetzt werden.

Vorteilhaft wird mit flüssigem Kulturmedium als Schüttel kultur oder belüftete Kultur gearbeitet. Zweckmäßig liegt der pH-Wert des Mediums bei pH 3-7 und die Temperatur bei 25-30°C. Die Züchtungszeit im flüssigen Medium beträgt in der Regel 2-10 Tage, jedoch kann eine maxi male Anhäufung von Hydroxybenzoesäurephenylester der Formel (II) innerhalb von 5 Tagen erreicht werden, und zweckmäßig beendet man das Züchtungsverfahren in diesem Punkt. Die Kulturbedingungen, wie beispielsweise die Zusammensetzung des Mediums, die Temperatur, die Zeit und dergleichen können je nach Art des Spezies oder sonstiger Verhältnisse modifiziert werden, so daß eine maximale Ausbeute und optimale Qualität erreicht werden. Antischaummittel, wie Silikonöl, pflanzliches Öl oder Tenside können sofern erforderlich zugesetzt werden.

Der Ester der Formel (II) ist in der Kulturbrühe enthalten und wird zweckmäßig durch Zugabe von Filterhilfsmittel, wie beispielsweise Celite®, Perlite® und Hyflosupercel® in eine Kulturbrühe oder durch Zentrifu gieren isoliert.

Die Abtrennung bzw. Isolation des Esters der Formel (II) aus dem Kulturfiltrat kann durch Extraktion mit mit Wasser nicht mischbarem organischem Lösungsmittel, wie bei spielsweise Ethylacetat, Butylacetat oder Butanol und Konzentrieren des Extraktes vorgenommen werden, und man erhält auf diese Weise rohen Ester der Formel (II). Die weitere Reinigung kann durchgeführt werden durch Kom bination von Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Silikagel, aktivem Aluminiumoxid, aktiver Kohle oder nichtionischer Adsorptionsharze, Verteilungschromatographie mit vertauschten Phasen unter Verwendung von Alkyl- gebundenem Silikagel und Gelfiltration unter Verwendung von Gelfiltrationsträger. Beispielsweise kann man rohen Ester der Formel (II) an einer Säule aus Silikagel oder Aluminiumoxid adsorbieren und mit einem Mischlösungsmittel wie beispielsweise Chloroform-Isopropanol-Essigsäure, Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure oder Ethylacetat- Methanol-Essigsäure eluieren. Die aktive Fraktion kann man mittels Silikagel-Dünnschichtchromatographie untersuchen oder unter Verwendung von Rinderherz-PDE einer Prüfung auf Inhibitor-Aktivität unterziehen.

Bei einer solchen Säulenchromatographie kann jede der Substanzen TPI-1, TPI-2, TPI-3 und TPI-4 isoliert werden.

TPI-5, die Substanz, bei der es sich um eine Verbindung der Formel (I) handelt, in der R Wasserstoff bedeutet, und die der nachstehenden Formel (III) entspricht

kann in der Weise herge stellt werden, daß man den Ester der Formel (II) oder dessen Salz mit Glykosidase oder deren Modifikation behandelt und dabei enzymatisch die Glykosid-Bindung spaltet.

Beispiele für verwendbare Glykosidasen sind β-Glucosidase für TPI-1 oder TPI-3 und β-Galaktosidase für TPI-3 oder TPI-4. Als Glykosidase kann ein beliebiges solches Enzym tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs ver wendet werden. Solche β-Glucosidase und β-Galaktosidase ist im Handel erhältlich. Mikrobielle Enzyme sind Exo- und Endo-Enzyme. Ein Exo-Enzym kann man aus der bei der Züchtung der das Enzym produzierenden Mikroorganismen-Art anfallenden Kulturbrühe durch übliche Reinigungsverfahren gewinnen. Will man Endo-Enzyme einsetzen, kann man die mikrobiellen Zellen als solche verwenden. Behandelte mikrobielle Zellen, beispielsweise getrocknete Zellen, die man durch Dehydratation mit mit Wasser nicht mischbarem organischem Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton, Methanol oder Ethanol, Zerkleinern oder mikrobiellen Zellen durch eine Zellen-Mahleinrichtung oder Ultraschall und Bildung eines Zell-Lysates durch Behandeln mit Cetylpyri dinchlorid und Tensid gewinnen kann, oder Enzyme, die aus diesen behandelten Zellen mittels üblicher Reinigungsver fahren gewonnen worden sind, können für die erfindungs gemäßen Zwecke benutzt werden.

Unter einem wie oben erwähnten modifizierten Enzym sind zahlreiche Materialarten zu verstehen, vorausgesetzt, daß sie Glykosidase-Aktivität haben. Weiterhin gehören dazu immobilisierte Enzyme oder immobilisierte Zellen.

Immobilisiertes Enzym oder Zellen kann man mit üblichen Mitteln zubereiten. Beispielsweise kann man eine Methode benutzen, bei der das Enzym an dem Träger durch kovalente Bindung, ionische Bindung oder Adsorption immobilisiert wird, oder man kann sich einer Methode bedienen, bei der das Enzym oder die Zellen durch Vernetzung immobilisiert werden. Man kann mittels einer Einschlußmethode arbeiten, wobei das Enzym oder die Zellen mittels semipermeabler Membran in Mikrokapseln oder in leere Fasern eingeschlossen werden. Wenn man immobilisiertes Enzym oder Zellen be nutzt, kann man die Reaktion kontinuierlich durchführen.

Die zuvor erwähnte enzymatische Reaktion wird zweckmäßig bei einem optimalen pH-Wert durchgeführt. Die Reaktions temperatur sollte auch den optimalen Bedingungen entsprechen und im allgemeinen bei 25-37°C liegen. Die Reak tionszeit läßt sich dadurch bestimmen, daß man das produ zierte TPI mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) oder Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) prüft, und man beendet die Reaktion zweckmäßig dann, wenn maximale Akkumulation vonn TPI-5 erreicht ist.

Das so erhaltene enzymatische Reaktionsmedium wird an gesäuert, dann wird mit mit Wasser nicht mischbarem or ganischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat, Butylacetat oder Butanol extrahiert, und der Extrakt wird konzentriert, und daraus wird rohes TPI-5 erhalten. Die weitere Reinigung läßt sich durch Chromatographie, Gel filtration und ähnliche Verfahren in gleicher Weise wie für den Ester der Formel(II) angegeben vornehmen.

Aus rohem Hydroxybenzoesäurephenylester kann in gebrächlicher Weise ein Salz dieses Esters gewonnen werden, jedoch wird die Zubereitung eines Salzes vorteilhaft nach der Reinigung vorgenommen. Bevor zugte Salze sind Alkalisalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalisalze, wie Calcium- und Magnesiumsalze sowie Alu minium- und sonstige Metallsalze, das Ammoniumsalz, Salze von bekannten basischen Aminosäuren oder Salze von bekannten organischen Aminen.

die physico-chemischen Eigenschaften von TPI sind nach folgend veranschaulicht.

[TPI-1]

(1) Farbe und Zustand: weißes Pulver
(2) Natur: saure Substanz
(3) Elementaranalyse (C₃₄H₄₈O₁₂ · 3/2 H₂O):
gefunden:
C 60,43%, H 7,48%;
berechnet:
C 60,44%, H 7,56%
(4) Molekularformel: C₃₄H₄₈O₁₂
(5) Molekulargewicht (FAB Massenspektrum): 648
(6) Spezifische Rotation: (α)-20.6° (c=1.0, MeOH)
(7) UV-Absorptionsspektrum: (Fig. 1)
in MeOH o. saurem MeOH;
λ_max (nm): 253 (E^1% 250), 311 (Schulter)
in alkal. MeOH:
λ_max (nm): 240 (Schulter), 300 (E^1% 350)
(8) IR-Absorptionsspektrum: (KBr) (Fig. 2)
3400, 2930, 2850, 1720, 1590, 1470, 1430, 1370, 1340, 1250, 1170, 1140, 1060 cm^-1
(9) ¹H-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 100 MHz):
δ (ppm): 0.88(t,3H), 0.90(t,3H), 1.31(m,20H), 1.61(m,4H), 2.68(t,2H), 2.94(t,2H), 3.40-4.00(5H), 4.89(d,1H), 6.42(d,1H), 6.61(d,d,2H), 6.71(d,1H)
(10) ¹³C-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 25 MHz):
174.1(s), 168.2(s), 164.2(s), 161.8(s), 158.4(s), 156.0(s), 149.1(s), 145.2(s), 116.5(d), 116.1(s), 113.5(s), 112.1(d), 109.3(d), 103.4(d), 102.7(d), 78.6(d), 78.4(d), 75.3(d), 71.6(d), 63.0(t), 37.2(t), 35.2(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.0(t), 31.1(t), 30.9(t), 30.6(t), 30.6(t), 24.0(t), 24.0(t), 14.8(q), 14.8(q)
(11) Löslichkeit:
löslich: in niedrigem Alkohol wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, wäßrigem Alkali;
unlöslich: in Hexan, Benzol und Petroläther
(12) Farbreaktion:
positiv: Kaliumpermanganatreaktion, Ferri chloridreaktion, Jodreaktion und Molisch-Reaktion;
negativ: Ninhydrin-Reaktion und Jodoformreaktion

(13) Dünnschichtchromatographie: Silikagel

(Fließmittel)
(Rf)
Chloroform-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)
0,25
Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)	0,36
Ethylacetat-Aceton-Essigsäure: (6 : 6 : 0,1)	0,17
Chloroform-Methanol-Essigsäure: (10 : 2 : 0,1)	0,38

[TPI-2]

(1) Farbe und Zustand: weißes Pulver
(2) Natur: saure Substanz
(3) Elementaranalyse (C₃₄H₄₈O₁₂ · H₂O):
gefunden:
C 61,97%, H 7,56%;
berechnet:
C 61,26%, H 7,51%
(4) Molekularformel: C₃₄H₄₈O₁₂
(5) Molekulargewicht (FAB Massenspektrum): 648
(6) Spezifische Rotation: (α)-12.6° (c=0.9, MeOH)
(7) UV-Absorptionsspektrum: (Fig. 31)
in MeOH o. saurem MeOH;
λ_max (nm): 253 (E^1% 230), 311 (Schulter)
in alkal. MeOH:
λ_max (nm): 240 (Schulter), 300 (E^1% 325)
(8) IR-Absorptionsspektrum: (KBr) (Fig. 4)
3400, 2930, 2850, 1720, 1600, 1470, 1410, 1320, 1240, 1170, 1140, 1050 cm^-1
(9) ¹H-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 100 MHz):
δ (ppm): 0.87(t,3H), 0.89(t,3H), 1.31(m,20H), 1.60(m,4H), 2.68(t,2H), 2.94(t,2H), 3.50-4.00(5H), 4.88(d,1H), 6.42(d,1H), 6.64(d,d,2H), 6.74(d,1H)
(10) ¹³C-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 25 MHz):
174.1(t), 168.2(s), 164.2(s), 161.8(s), 158.4(s), 156.0(s), 149.1(s), 145.2(s), 116.5(d), 116.1(s), 113.5(s), 112.1(d), 109.2(d), 104.1(d), 102.8(d), 77.4(d), 75.3(d), 72.7(d), 70.5(d), 62.7(t), 37.2(t), 35.2(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.0(t), 31.1(t), 31.0(t), 30.6(t), 30.6(t), 24.0(t), 24.0(t), 14.8(q), 14.8(q)
(11) Löslichkeit:
löslich: in niedrigem Alkohol wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, wäßrigem Alkali;
unlöslich: in Hexan, Benzol und Petroläther
(12) Farbreaktion:
positiv: Kaliumpermanganatreaktion, Ferri chloridreaktion, Jodreaktion und Molisch-Reaktion;
negativ: Ninhydrin-Reaktion und Jodoformreaktion

(13) Dünnschichtchromatographie: Silikagel

(Fließmittel)
(Rf)
Chloroform-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)
0,19
Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)	0,21
Ethylacetat-Aceton-Essigsäure: (6 : 6 : 0,1)	0,14
Chloroform-Methanol-Essigsäure: (10 : 2 : 0,1)	0,22

[TPI-3]

(1) Farbe und Zustand: weißes Pulver
(2) Natur: saure Substanz
(3) Elementaranalyse:
gefunden:
C 61,93%, H 7,36%;
berechnet:
C 62,59%, H 7,30%
(4) Molekularformel: C₃₆H₅₀O₁₃
(5) Molekulargewicht (FAB Massenspektrum): 690
(6) Spezifische Rotation: (α)-19.6° (c=0.6, MeOH)
(7) UV-Absorptionsspektrum: (Fig. 5)
in MeOH;
λ_max (nm): 252 (E^1% 184), 310 (Schulter)
(8) IR-Absorptionsspektrum: (KBr) (Fig. 8)
3400, 2925, 2850, 1720, 1650, 1600, 1460, 1240, 1130, 1040 cm^-1
(9) ¹H-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 100 MHz):
δ (ppm): 0.88(t,3H), 0.90(t,3H), 1.31(m,20H), 1.61(m,4H), 2.08(s,3H), 2.68(t,2H), 2.94(t,2H), 3.20-4.00(m,3H), 4.00-4.60(m,2H), 4.35(d,1H), 6.44(d,1H), 6.59(d,d,2H), 6.73(d,1H)
(10) ¹³C-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 25 MHz):
174.2(s), 173.1(s), 167.9(s), 164.4(s), 161.7(s), 158.3(s), 156.0(s), 149.2(s), 145.2(s), 116.5(d), 116.3(s), 113.3(s), 112.1(d), 109.4(d), 103.3(d), 103.0(d), 78.3(d), 75.8(d), 75.2(d), 71.8(d), 65.0(t), 37.2(t), 35.2(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.3(t), 32.9(t), 31.1(t), 30.9(t), 30.6(t), 30.6(t), 24.0(t), 24.0(t), 21.0(q), 14.8(q), 14.8(q)
(11) Löslichkeit:
löslich: in niedrigem Alkohol wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, wäßrigem Alkali;
unlöslich: in Hexan, Benzol und Petroläther
(12) Farbreaktion:
positiv: Kaliumpermanganatreaktion, Ferri chloridreaktion, Jodreaktion und Molisch-Reaktion;
negativ: Ninhydrin-Reaktion und Jodoformreaktion

(13) Dünnschichtchromatographie: Silikagel

(Fließmittel)
(Rf)
Chloroform-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)
0,54
Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)	0,51
Ethylacetat-Aceton-Essigsäure: (6 : 6 : 0,1)	0,35
Chloroform-Methanol-Essigsäure: (10 : 2 : 0,1)	0,52

[TPI-4]

(1) Farbe und Zustand: weißes Pulver
(2) Natur: saure Substanz
(3) Elementaranalyse:
gefunden:
C 62,35%, H 7,57%;
berechnet:
C 62,59%, H 7,30%
(4) Molekularformel: C₃₆H₅₀O₁₃
(5) Molekulargewicht (FAB Massenspektrum): 690
(6) Spezifische Rotation: (α)-13.3° (c=0.4, MeOH)
(7) UV-Absorptionsspektrum: (Fig. 6)
in MeOH;
λ_max (nm): 252 (E^1% 172), 310 (Schulter)
(8) IR-Absorptionsspektrum: (KBr) (Fig. 8)
3420, 2930, 2860, 1730, 1660, 1610, 1470, 1240, 1140, 1040 cm^-1
(9) ¹H-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 100 MHz):
δ (ppm): 0.87(t,3H), 0.90(t,3H), 1.31(m,20H), 1.61(m,4H), 2.03(s,3H), 2.68(t,2H), 2.95(t,2H), 3.20-4.00(m,3H), 4.00-4.60(m,2H), 4.87(d,1H), 6.43(d,1H), 6.60(d,d,2H), 6.73(d,1H)
(10) ¹³C-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 25 MHz):
174.2(s), 173.0(s), 168.0(s), 164.2(s), 161.8(s), 158.4(s), 156.0(s), 149.1(s), 145.2(s), 116.5(d), 116.1(s), 113.5(s), 111.9(d), 109.4(d), 103.7(d), 102.9(d), 75.2(d), 74.7(d), 72.5(d), 70.4(d), 64.9(t), 37.2(t), 35.2(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.0(t), 31.1(t), 31.0(t), 30.6(t), 30.6(t), 24.0(t), 24.0(t), 21.0(q) 14.8(q), 14.8(q)
(11) Löslichkeit:
löslich: in niedrigem Alkohol wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, wäßrigem Alkali;
unlöslich: in Hexan, Benzol und Petroläther
(12) Farbreaktion:
positiv: Kaliumpermanganatreaktion, Ferri chloridreaktion, Jodreaktion und Molisch-Reaktion;
negativ: Ninhydrin-Reaktion und Jodoformreaktion

(13) Dünnschichtchromatographie: Silikagel

(Fließmittel)
(Rf)
Chloroform-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)
0,46
Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)	0,43
Ethylacetat-Aceton-Essigsäure: (6 : 6 : 0,1)	0,29
Chloroform-Methanol-Essigsäure: (10 : 2 : 0,1)	0,48

[TPI-5]

(1) Farbe und Zustand: weißes Pulver
(2) Natur: saure Substanz
(3) Elementaranalyse:
gefunden:
C 69,30%, H 7,72%;
berechnet:
C 69,11%, H 7,87%
(4) Molekularformel: C₂₈H₃₈O₇
(5) Molekulargewicht: 486
(6) UV-Absorptionsspektrum: (Fig. 7)
in MeOH;
λ_max (nm): 271 (E^1% 389)
305 (E_{1 cm} 243)
(7) IR-Absorptionsspektrum: (KBr) (Fig. 8)
3320, 2920, 2850, 1650, 1600, 1580, 1450, 1300, 1240, 1200, 1140, 1060 cm^-1
(8) ¹H-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 100 MHz):
δ (ppm): 0.85(t,3H), 0.88(t,3H), 1.27(m,20H), 1.60(m,4H), 3.02(t,t), 6.32(S,2H), 6.62(d,1H), 6.74(d,1H), 11.27(S,1H)
(9) ¹³C-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 25 MHz):
174.7(s), 169.3(s), 166.3(s), 165.3(s), 161.4(s), 155.0(s), 150.0(s), 149.5(s), 116.2(d), 111.5(d), 109.0(d), 108.7(s), 104.2(s), 101.8(d), 37.3(t), 36.7(t), 32.3(t), 31.9(t), 31.9(t), 31.9(t), 29.9(t), 29.9(t), 29.3(t), 29.2(t), 22.8(t), 22.8(t), 14.2(q), 14.2(q)
(10) Löslichkeit:
löslich: in niedrigem Alkohol wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Chloroform, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, wäßrigem Alkali;
unlöslich: in Hexan, Benzol und Petroläther
(11) Farbreaktion:
positiv: Kaliumpermanganatreaktion, Ferri chloridreaktion, Jodreaktion und Molisch-Reaktion;
negativ: Ninhydrin-Reaktion und Jodoformreaktion

(12) Dünnschichtchromatographie: Silikagel

(Fließmittel)
(Rf)
Chloroform-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)
0,87
Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)	0,68
Ethylacetat-Aceton-Essigsäure: (6 : 6 : 0,1)	0,78
Chloroform-Methanol-Essigsäure: (10 : 2 : 0,1)	0,77

Neben den oben angegebenen physico-chemischen Eigenschaften haben die Substanzen TPI-1, TPI-2, TPI-3, TPI-4 und TPI-5 die in Formel (I) illustrierte chemische Struktur.

Die erfindungsgemäßen Hydroxybenzoesäurephenylester sind chemische Verbindungen, die vollständig verschieden sind von bis her bekannten PDE-Inhibitoren, hergestellt durch Mikroor ganismen. Die bekannten PDE-Inhibitoren PDE-I, PDE-II, CC-1065, APD-I, APD-II und APD-III sind Stickstoff-enthaltende Substanzen, und Reticulol und Terferol sind Verbin dungen mit den Molekularformeln C₁₁H₁₀O₅ bzw. C₁₉H₁₆O₅. Alle diese Verbindungen sind verschieden von den erfin dungsgemäßen Substanzen.

Der erfindungsgemäße Ester hat eine starke PDE-inhibierende Wirkung. Die Inhibitor-Aktivität von TPI auf Rinderherz- PDE wird nachstehend veranschaulicht.

(Methode)

Zu einem Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurden 40 mM Tris-HCl- Pufferlösung (pH 7,5), 2 mM Magnesiumchlorid, 0,4 mM c-AMP, PDE (30 µg Protein) und Hydroxybenzoesäurephenylester zugegeben, und es wurde 30 Minuten lang bei 30°C bebrütet. Durch Zusatz von 55%iger Trichlor essigsäure (0,1 ml) wurde die Reaktion abgestoppt, und das produzierte 5′-AMP wurde mittels HPLC (Säule: 4×150 mm, Migrationsschicht: 10 mM KH₂PO₄ (pH 2,0)-MeOH (10 : 1), Migrationsgeschwin digkeit: 1,5 ml/Min., Detektor: 262 mµ) gemessen. Das Inhibierungsverhältnis wird mittels folgender Gleichung berechnet:

Inhibierungs-Verhältnis=(A-B)/A×100 (%)
worin
A: die Menge an 5′-AMP ohne Hydroxybenzoesäurephenylester und
B: die Menge an 5′-AMP mit Hydroxybenzoesäurephenylester bedeuten.

IC₅₀, eine Konzentration an Hydroxybenzoesäurephenylester, die ein Inhibierungs verhältnis von 50% gibt, wird nachfolgend veranschaulicht.

(Ergebnis)
Substanz
IC₅₀-Konzentration (µg/ml)
TPI-1
2,8
TPI-2	5,4
TPI-3	2,8
TPI-4	3,5
TPI-5	2,3
Papaverin	25
Nicardipin	6,0
Theophyllin	470

Wenn TPI-1 in einer Menge von 100 mg/kg in den Peritoneal sack von Mäusen injiziert wurde, wurde kein Todesfall fest gestellt.

Wie zuvor gezeigt, hat der erfindungsgemäße Ester eine starke inhibierende Aktivität gegen PDE und eine niedrige Toxizität. Es ist daher brauchbar als Bronchodilatator, als herzstärkendes Mittel, als Entspannungsmittel für glatte Muskulatur und als die Hormonausschüttung stimu lierendes Mittel.

In den folgenden Beispielen, die keine Einschränkung der Erfindung bedeuten, ist die vorliegende Erfindung noch weiter illustriert.

Beispiel 1

Ein Medium (pH 6,5, 100 ml, 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert), das 2% Glucose, 1% Pepton, 1% CSL, 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat und 1% Celite® enthielt und sich in einem 500 ml Erlenmeyerkolben befand, wurde mit der in einer Drahtöse vorhandenen Menge an Mikroorganismus der Art Nodulisporium sp. M 5220 FERM P-8133 beimpft. Es wurde 4 Tage lang bei 26°C bebrütet und so die Saatkultur gewonnen. Die Saatkultur wurde in 3%igem Volumenverhältnis auf ein Medium (pH 7,0, 100×100 ml), das 5% Glucose, 2% Pharmamedien, 0,5% CSL, 0,1% Kalium monohydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat, 0,5% Calcium carbonat, 0,0005% Ferrosulfat, 0,0002% Zinksulfat, 0,0001% Kobaltchlorid, 0,0003% Mangansulfat und 0,0002% Kupfer sulfat enthielt, übergeimpft. Die Fermentation wurde auf einer rotierenden Schütteleinrichtung 5 Tage lang bei 26°C durchgeführt. Die Kulturbrühe (10 Liter) wurde zentrifu giert; es wurde die überstehende Lösung (8,5 Liter) ge wonnen. Zu der überstehenden Lösung wurde Ethylacetat (5 Liter) zugegeben, der pH-Wert wurde durch tropfenweise Zugabe von 2 n HCl auf pH 2 eingestellt, und es wurde die Ethylacetatschicht (4,5 Liter) gewonnen. Zu der Ethyl acetatschicht wurde Wasser (3 Liter) zugegeben, und der pH-Wert wurde durch Zusatz von konz. wäßrigem Ammoniak auf pH 9 eingestellt, und so wurde der Hydroxybenzoesäurephenylester in die wäßrige Schicht übergeführt. In die wäßrige Schicht (3 Liter) wurde Ethylacetat (2 Liter) eingegeben, der pH-Wert wurde mit 2 n HCl, die unter Rühren zugegeben wurde, auf pH 2 eingestellt, und es wurde die Ethylacetatschicht (annähernd 2 Liter) gewonnen. Die Ethylacetatschicht wurde durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zu einem bräunlichen Pulver (annähernd 6 g) eingedampft.

Beispiel 2

Das Pulver an rohem Hydroxybenzoesäurephenylester (6 g), das gemäß Beispiel gewonnen worden war, wurde in Methanol (30 ml) gelöst und mit Silikagel-Pulver (4 g) vermischt. Es wurde gerührt und im Vakuum wurde konzentriert und das Methanol entfernt. Das Gemisch wurde auf eine Silikagel-Säule (400 ml), die zuvor mit einem Mischlösungsmittel aus Chloroform-Isopro panol-Essigsäure (10 : 2 : 0,1) beschickt worden war, aufge bracht, und es wurde mit dem gleichen Mischlösungsmittel eluiert. Jede 20 g-Fraktion wurde mittels TLC mit Chlo roform-Isopropanol-Essigsäure (10 : 4 : 0,1) als Laufmittel geprüft. Die Flecken, die Rf=0,54, Rf=0,46, Rf=0,25 und Rf=0,19 zeigten und die durch UV-Absorption unter Verwen dung einer Manasule®-Lampe oder durch Ent färbungsreaktion mit Kaliumpermanganat nachgewiesen worden waren, wurden fraktioniert. Die Fraktionen Nr. 13-28 enthielten TPI-3 (Rf=0,54) und TPI-4 (Rf=0,46), die Frak tionen Nr. 71-122 enthielten TPI-1 (Rf=0,25) und die Fraktionen Nr. 123-187 enthielten TPI-1 (Rf=0,25) und TPI-2 (Rf=0,19).

Die Fraktionen Nr. 13-28 wurden gesammelt, im Vakuum auf 20 ml konzentriert, auf eine Silikagel-Säule (200 ml), die zuvor mit einem Gemisch aus Ethylacetat-Aceton-Essig säure (10 : 6 : 0,1) beschicht worden war, aufgegeben, und es wurde mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Das Eluat wurde fraktioniert zu je 20 g-Fraktionen, durch Silikagel- TLC mit einer Mischung aus Ethylacetat-Aceton-Essigsäure (6 : 6 : 0,1) als Laufmittel untersucht, und die Fraktionen, die Flecken entsprechend Rf=0,35 und Rf=0,29 enthielten, wurden gesammelt. Die Fraktionen Nr. 35-40, die Substanz mit Rf=0,35 enthielten, wurden gesammelt und im Vakuum bis zu annähernd 3 ml konzentriert. Zu dem Rück stand wurde n-Hexan gegeben, und es wurde TPI-3 als Substanz ausgefällt. Die TPI-3-Substanz wurde mit n-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, und so wurde TPI-3 (20 mg) gewonnen.

Die Fraktionen Nr. 48-69, die Stubstanz mit Rf=0,29 enthielten, wurden gesammelt und im Vakuum auf annähernd 3 ml konzentriert. Zu dem Rückstand wurde n-Hexan zugegeben, und es wurde TPI-4 als Substanz ausgefällt. Diese Substanz wurde mit n-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, und so wurde TPI-4 (15 mg) gewonnen.

Beispiel 3

Die Fraktionen Nr. 71-122, die TPI-1 mit Rf=0,25 enthielten, wurden gesammelt und im Vakuum bis auf 20 ml konzentriert. Durch Zugabe von Ethylacetat wurde auf 200 ml aufgefüllt. Weiterhin wurde Wasser (200 ml) zugegeben, und es wurde stark gerührt. Die Ethylacetatschicht wurde im Vakuum bis auf annähernd 10 ml konzentriert. Dazu wurde n-Hexan gegeben, und so wurde TPI-1 ausgefällt. Die Aus fällung wurde auf ein Glasfilter aufgebracht, es wurde mit n-Hexan gewaschen und im Vakuum konzentriert, und so wurde gereinigtes TPI-1 (1,8 g) gewonnen.

Die Fraktionen Nr. 123-187, die TPI-1 (Rf=0,25) und TPI-2 (Rf=0,19) enthielten, wie sie gemäß Beispiel 2 ge wonnen worden waren, wurden gesammelt und im Vakuum einge dampft. Der Rückstand, der in Methanol (20 ml) gelöst wurde, wurde gut mit Silikagel-Pulver (2 g) vermischt. Nachdem das Methanol im Vakuum entfernt worden war, wurde das Gemisch auf eine Säule aus Silikagel (200 ml), die zuvor mit Chlo roform-Methanol-Essigsäure (10 : 2 : 0,1) beschickt worden war, aufgebracht, und es wurde mit dem gleichen Lösungsmittelge misch eluiert. Jede Fraktion (20 g) wurde mittels Silika gel-TLC untersucht; dabei wurde als Laufmittel Chloroform- Isopropanol-Essigsäure (10 : 4 : 0,1) verwendet, und die Sub stanz-Flecken wurden durch UV-Absorption unter Verwendung einer Manasule®-Lampe und Entfärbungsreaktion des Kaliumper manganats sichtbar gemacht. Die Fraktionen Nr. 54-130, die lediglich eine Substanz mit Rf=0,19 enthielten, wurden gesammelt und im Vakuum bis auf 20 ml konzentriert. Es wurden Ethylacetat (200 ml) und Wasser (200 ml) hinzugegeben, und es wurde stark gerührt. Das Ethylacetat wurde sepa riert und im Vakuum bis auf 10 ml konzentriert. Dann wurde n-Hexan dazu gegeben, und TPI-2 ausgefällt. Das TPI-2 wurde mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, und so wurde TPI-2 (600 mg) gewonnen.

Beispiel 4

Wie in Beispiel 3 beschrieben gewonnenes TPI-1 (50 mg) wurde in 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 6,5, 4 ml) gelöst, und dazu wurde β-Glucosidase (4,5 E/mg, 4 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde 7 Tage lang bei 26°C bebrütet, und dabei wurden annähernd 50% des TPI-1 in TPI-5 umgewandelt. Mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf pH 3 eingestellt, und es wurde im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Silikagel-Säule (28 ml), die zuvor mit einem Ge misch aus Chloroform-Methanol-Essigsäure (20 : 1 : 0,1) be schickt worden war, aufgegeben, und es wurde mit dem gleichen Mischlösungsmittel eluiert. Das Eluat wurde in je 5 g- Fraktionen gewonnen, und die Fraktionen Nr. 28-31 wurden gesammelt und konzentriert. Es wurde mit n-Hexan gewaschen, und im Vakuum zur Trockene eingedampft, und man erhielt TPI-5 als weißes pulverförmiges Produkt (15 mg).

In der beiliegenden Zeichnung zeigt

Fig. 1 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-1,

Fig. 2 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-2,

Fig. 3 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-1,

Fig. 4 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-2,

Fig. 5 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-3,

Fig. 6 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-4,

Fig. 7 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-5,

Fig. 8 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-3,

Fig. 9 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-4 und

Fig. 10 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-5.

Claims

1. Hydroxybenzoesäurephenylester der allgemeinen Formel worin R für einen β-D-Glucopyranosyl-, β-D-Galaktopyranosyl-, 6′-O-Acetyl-β-D- glucopyranosyl-, oder 6′-O-Acetyl-β-D-galaktopyranosyl-Rest oder ein Wasserstoffatom oder ein Salz davon steht.

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 der allgemeinen Formel worin R′ einen β-D-Glucopyranosyl-, β-D-Galaktopyranosyl-, 6′-O-Acetyl-β-D- glucopyranosyl- oder 6′-O-Acetyl-β-D-galaktopyranosyl-Rest oder ein Salz davon bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man einen eine solche Verbindung produzierenden Mikroorganismus der Art Nodulisporium sp. M 5220 FERM P-8133 züchtet und die produzierte Verbindung daraus isoliert und erforderlichenfalls zu dem Salz der Verbindung umwandelt.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 der Formel dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel worin R′ für einen β-D-Glucopyranosyl-, β-D-Galaktopyranosyl-, 6′-O-Acetyl-β-D- glucopyranosyl- oder 6′-O-Acetyl-β-D-galaktopyranosyl-Rest oder für ein Salz davon steht, mit Glykosidase oder modifizierter Glykosidase in einem wäßrigen Medium behandelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Glykosidase β- Glucosidase oder β-Galaktosidase einsetzt.

5. Verwendung der chemischen Verbindung nach Anspruch 1 als physiologisch aktive Verbindung zur Inhibierung von PDE-Aktivität.