DE3242849C2

DE3242849C2 -

Info

Publication number: DE3242849C2
Application number: DE3242849A
Authority: DE
Inventors: Akira Dr. Tokio/Tokyo Jp Terahara; Minoru Dr. Chiba Jp Tanaka
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1981-11-20
Filing date: 1982-11-19
Publication date: 1989-01-05
Also published as: NL194373C; FI823978A0; CH651065A5; US4537859A; GB2111052B; ES8402350A1; NL194373B; FI70925B; KR880002483B1; AU551720B2; CA1186647A; ZA828535B; AT387585B; DK516182A; SE453996B; FI70925C; NL8204505A; IT1191235B; JPH0371116B2; AU9061082A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von substituierten 7-Hexahydronaphthyl-3,5-dihydroxyheptansäure-Derivaten, die als M-4 und M-4′ bekannt sind, sowie Salzen und Estern dieser Verbindungen.

ML-236B, das in Form einer Säure (als "ML-236B- Carbonsäure" bekannt) oder eines Laktons (bekannt als "ML-236B-Lakton") existieren kann, ist in der GB-PS 14 53 425 beschrieben. In Form des Laktons hat es die folgende Formel:

In der Folge wurden zahlreiche Salze und Ester von ML-236B beschrieben (GB-PS 15 55 831). Es hat sich gezeigt, daß ML-236B und dessen Salze und Ester die Biosynthese von Cholesterin inhibieren, indem sie mit 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase konkurrieren, welche das geschwindigkeitsbestimmende Enzym für die Biosynthese von Cholesterin dar stellt. Man hat daher festgestellt, daß diese Verbin dungen eine sehr ausgeprägte Wirkung zeigen, den Serum-Cholesterinspiegel zu senken.

In der Folge wurden bestimmte 3-Hydroxy-ML-236B- Derivate als Produkte des Metabolismus von ML-236B- Lakton im tierischen Organismus isoliert, und es zeigte sich, daß die entsprechenden Derivate durch enzymatische Hydroxylierung von ML-236B-Lakton oder -Carbonsäure oder deren Salzen oder Estern gebildet werden, die durch verschiedene Mikroorganismen der Genera Absidia, Cunninghammella, Synce phalastrum, Streptomyces, Mucor, Rhizopus, Zygo rinchus, Circinella, Actinomucor, Congronella, Phycomyces, Mortierella, Pycnoporus und Rhizocto nia hervorgerufen wird. Diese Verfahren sind in der US-PS 43 46 227 von A. Terahara und M. Tanaka beschrieben, und die auf diese Weise hergestellten Verbindungen sind in dieser Patentschrift als M-4, M-4′, IsoM-4 und IsoM-4′ bezeichnet. Diese Verbin dungen haben eine Wirksamkeit zur Inhibierung der Biosynthese von Cholesterin bewiesen, die minde stens vergleichbar und in manchen Fällen wesentlich höher ist als die von ML-236B selbst.

ML-236B und dessen Derivate, einschließlich der Ver bindungen M-4 und M-4′, sind somit von therapeuti schem Wert für die Behandlung der Hyperlipaemie und für die Prophylaxe von Arteriosklerose.

Erfindungsgemäß wurde nun festgestellt, daß die Ver bindungen M-4 und M-4′ auch aus ML-236B und ver schiedenen Derivaten von ML-236B durch Behandlung mit Mikroorganismen des Genus Nocardia oder einem zellfreien, enzymhaltigen Extrakt dieser Mikroor ganismen hergestellt werden können.

Die Verwendung von Mikroorganismen des Genus No cardia hat gegenüber den in der US-PS 43 46 227 beschriebenen Mikroorganismen den Vorteil, daß die als Substrat verwendete ML-236B-Verbindung in dem Reaktionsmedium in einer weit höheren Konzentration angesetzt werden kann, als bei der Verwendung der Mikroorganismen gemäß dem Stand der Technik. Dies ist sehr überraschend, da man gefunden hat, daß die ML-236B-Verbindungen antimykotische und anti biotische Eigenschaften besitzen.

Die Erfdingung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von substituierten 7-Hexahydronaphthyl-3,5-dihydroxyheptansäure-Derivaten der Formel

worin OH für OH oder OH steht, ihrer phar mazeutisch geeigneten Salze, Ester Laktone. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die substituierten 7-Hexahydronaphthyl-3,5- dihydroxyheptansäure-Derivate der Formel

der sogenannten "ML-236B-Carbonsäure", deren Salze, Ester oder Laktone mit einem Hydroxylierungsenzym in Berührung bringt, das von einem der folgeden Mikroorganismen

Nocardia autotrophica IFO 12743
Nocardia autotrophica FERM P-6181 = DSM 2644
Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 = DSM 2645
Nocarida autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183 = DSM 2646

gebildet wurde, das erhaltene Produkt gegebenenfalls einer Hydrolyse, Salzbildung, Veresterung bzw. Laktonisierung oder mehreren dieser Reaktionen un terwirft und das erhaltene Produkt aus dem Reaktionsge misch gewinnt.

Die Erfindung soll nachstehend ausführlicher erläu tert werden.

Die Verbindung der Formel (I), in der OH für OH steht, wird als M-4-Carbonsäure bezeichnet, und die entsprechenden Salze und Ester sind als M-4-Carboxylate bekannt. Die Verbindung der Formel (I), in der OH für OH steht, wird als M-4′-Carbonsäure bezeichnet, und die entsprechenden Salze und Ester werden als M-4′-Carboxylate be zeichnet.

Durch Ringschluß gebildete Laktone, die den Verbin dungen der Formel (I) entsprechen, können durch die Formel (Ia) dargestellt werden

worin OH für OH oder OH steht, und sind als M-4-Lakton bzw. M-4′-Lakton bekannt.

Das Lakton, welches der ML-236B-Carbonsäure der Formel (II) entspricht, kann durch die Formel (IIa) dargestellt werden

und ist als ML-236B-Lakton bekannt.

Für das erfindungsgemäße Verfahren werden folgende Stämme des Genus Nocardia eingesetzt:

Nocardia autotrophica FERM P-6181DSM 2644 (SANK 62781);
Nocardia autotrophica subsp. canberrica subsp. nov. FERM P-6182DSM 2645 (SANK 62881);
Nocardia autotrophica subsp. amethystina subsp. nov. FERM P-6183DSM 2646 (SANK 62981);
Nocardia autotrophica IFO 12743 (SANK 91279).

Der oben angegebene Stamm Nocardia autotrophica IFO 12743 ist ein bekannter Stamm, der von dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) unter der ange gebenen Hinterlegungsnummer frei und für jeden Dritten erhältlich ist.

Die Stämme von Noccardia autotrophica, die durch die Hinterlegungsnummern FERM P-6181, FERM P-6182 und FERM P-6183 identifiziert sind, sind neue Mikroorga nismenstämme, die neu aus Erde isoliert worden sind und am 16. Oktober 1981 bei dem Fermentation Research Institute, Ibaraki-Ken, Japan (FERM) hinterlegt worden sind. Durch das Fermentation Research Institute (FERM) wurden diese Mikroorganismen am 16. Mai 1983 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern DSM 2644, DSM 2645 und DSM 2646. Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften der neu isolierten Mikroorganismen wurden unter An wendung von üblichen Medien und mit Hilfe der von Shirling und Gottlieb beschriebenen Methoden (In ternational Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)) in Verbindung mit verschiedenen zu sätzlichen Tests bestimmt. Die Beobachtung der Kultur erfolgte nach zweiwöchigem Inkubieren bei 28°C. Die angewendeten Farbbezeichnungen wurden nach dem "Guide to Colour Standard" (einem von Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokio, Japan veröffentlichten Handbuch) zugeordnet. Die Eigenschaften der Kulturen wurden mit denen von verschiedenen bekannten Spezies von Actinonmycetes verglichen, die in "The Actinomycetes, Vol. 2" von Waksman, "ISP Report", von Shirling und Gottlieb, "Bergey′a Manual of Determinative Bacte riology", 8. Auflage und anderen neueren Literatur stellen, welche die Taxonomie der Familie Nocardiacease betreffen, beschrieben sind. Die neuen Mikroorganis men sind durch ihre FERM-Hinterlegungsnummern iden tifiziert.

Morphologische Eigenschaften

Tabelle 1

Wachstum auf taxonomischen Medien

Sämtliche der neuen Stämme zeigten gutes Wachstum auf zahlreichen Medien.

Der Stamm FERM P-6181 hatte weiße Luftmyzelien auf einer gelblich-grauen bis blaßgelb-orangen Kultur. In gewissen Medien wurde ein blassgelb-braunes lös liches Pigment beobachtet, jedoch in einer geringen Menge.

Der Stamm FERM P-6182 besaß braun-weiße bis blaßgelb- orange Luftmyzelien auf einer gräulich-gelbbraunen Kultur. Es wurde kein lösliches Pigment beobachtet.

Der Stamm FERM P-6183 zeigte eine braun-weiße bis blaßgelb-orange Kultur, und im Verlauf der Kultivierung wurden braun-violette Flecken beobachtet. Auf allen Medien traten bräunlich-graue Luftmyzelien auf, ausgenommen auf dem Hefe-Malz-Medium.

Die Kultureigenschaften am 14. Tag der Züchtung bei 28°C auf verschiedenen Medien sind in Tabelle 2 ge zeigt. Die in der Tabelle benutzten Abkürzungen werden wie folgt erläutert:

G= Wachstum; AM= Luftmyzel; R= Rückseite (reverse); SP= lösliches Pigment.

Tabelle 2

Physiologische Eigenschaften

Die physiologIschen Eigenschaften der neuen Stämme sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Prüfung der Melanoid-Pigment bildung wurde in den drei folgenden Medien durchgeführt:

Medium 1: Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP 1);
Medium 2: Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 6);
Medium 3: Tyrosin-Agar (ISP 7).

Tabelle 3

Ausnutzung von Kohlenhydraten

Die Ausnutzung von Kohlenhydraten durch die neuen Stämme ist in Tabelle 4 gezeigt. Das verwendete Medium war Pridham-Gottlieb-Agar (ISP 9), und die Bestimmung erfolgte nach 14tägiger Züchtung bie 28°C.

Tabelle 4

Analyse der Zellwand

Säure-Hydrolysate jedes der drei neuen Stämme wurden der Analyse durch Papierchromatographie nach der Methode von B. Becker et al. (Applied Microbiology, 13, 236 (1965)) und der Methode von M. P. Lechevalier et al. ("The Actinomycetales" v. H. Prauser, 311 (1970)) unter worfen. In allen Zellwänden wurde Meso-2,6-diaminopimelin säure aufgefunden, und Arabinose und Galactose wurden als Saccharid-Komponenten der ganzen Zelle festgestellt. Somit wurde bestätigt, daß jeder der Stämme Zellkomponenten des Typs IV-A hatte.

Die Ergebnisse dieser taxonomischen Untersuchungen zeigen, daß alle Stämme dem Genus Nocardia angehören. Die Eigenschaften der neuen Stämme sind unter den bekannten Spezies von Nocardia am ähnlichsten denen von Nocardia autotrophica (International Journal of Systematic Bac teriology, 30, 337 (1980)), mit Ausnahme der in Tabelle 5 gezeigten Unterschiede. In Tabelle 5 werden die glei chen Symbole und Abkürzungen angewendet, wie in den vor stehenden Tabellen 1 bis 4.

Tabelle 5

Der Stamm FERM P-6181 und Nocardia autotrophica glei chen einander in ihren morphologischen, Kultur- und pyhsiologischen Eigenschaften, und es wurde daher an genommen, daß dieser Stamm der Spezies Nocardia auto trophica angehört.

Der Stamm FERM P-6182 unterscheidet sich von Nocardia autotrophica im Hinblick auf die Zersetzung von Harn stoff, die Beständigkeit gegen Lysozym, die Säurebil dung aus Kohlenhydraten und die Ausnutzung von Kohlen hydraten. Diese Unterschiede sind jedoch nicht ausrei chend, um den Stamm FERM P-6182 als neue Spezies anzusehen. Er wird daher als neue Subspezies von Nocardia autotro phica angesehen. Dieser Stamm wurde daher als Nocardia autotrophica subsp. canberrica subsp. nov. bezeichnet.

Der Stamm FERM P-6183 unterscheidet sich von Nocardia autotrophica im Hinblick auf die Kulturfärbung und die Ausnutzung von Rhamnose, Saccharose und Raffinose. Diese Unterschiede reichen in entsprechender Weise ebenfalls nicht aus, um diesen Stamm als neue Spezies zu betrachten, und er wird daher als Subspezies von Nocardia auto trophica angesehen. Dieser Stamm wurde als Nocardia autotrophica subsp. amethystina subsp. nov. bezeichnet.

Wie alle Mikroorganismenstämme, sind auch die neuen Stämme FERM P-6181, FERM P-6182 und FERM P-6183 im Hinblick auf ihre Eigenschaften instabil und werden leicht durch künstliche mutationsauslösende Mittel, wie Ultraviolett strahlung, elektromagnetische Wellen hoher Frequenz, Kernstrahlung und chemische mutagene Mittel mutiert. Alle aus diesen Stämmen erhaltenen Mutanten, welche die gewünschte Aktivität zeigen, können ebenfalls für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Unter den verschiedenen Mikroorganismen des Genus Nocardia, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, wird die Anwendung der drei neuen Stämme besonders bevor zugt, d. h. die Anwendung von Nocarida autotrophica FERM P-6181, Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 oder Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183.

Das erfindungsgemäße enzymatische Hydroxylierungsverfahren kann durchgeführt werden, indem die ML-236B-Verbin dung mit dem gewählten Mikroorganismus des Genus Nocardia oder mit einem daraus erhaltenen zellfreien, enzymhaltigen Extrakt in Berührung gehalten wird.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise nach einer der drei folgenden Verfahrensweisen durchgeführt:

(a) Zugabe der ML-236B-Ausgangsverbindung zu dem Kulturmedium während der Züchtung des die Umwandlung bewirkenden Mikroorganismus und Fort setzen der Züchtung bzw. Kultur;
(b) Gewinnung einer Kultur des die Umwandlung be wirkenden Mikroorganismus und Behandlung der ML-236B-Ausgangsverbindung mit den gewonnenen Zellen; oder
(c) Herstellung eines zellfreien enzymhaltigen Ex trakts aus den Zellen des die Umwandlung bewir kenden Mikroorganismus und In-Berührung-Halten dieses Extrakts mit der ML-236B-Ausgangsverbin dung.

Die Züchtung des die Umwandlung bewirkenden Mikroorganis mus des Genus Nocardia kann mit Hilfe üblicher Methoden in einem gebräuchlichen Kulturmedium erfolgen, das Nähr stoffe enthält, die zur Anwendung für derartige Mikroor ganismen gut bekannt sind. So ist es gut bekannt, daß solche Kulturmedien Quellen für assimilierbaren Kohlen stoff und assimilierbaren Stickstoff sowie häufig anor ganische Salze enthalten. Zu Beispielen für Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff gehören Glucose, Saccharose, Stärke, Glycerin, Millet-Gel, Melassen und Sojabohnenöl. Zu Beispielen für assimilierbare Stickstoffquellen gehören Sojabohnen-Feststoffe (einschließlich Sojabohnen- Schrot und Sojabohnen-Mehl), Weizenkeime, Fleischex trakte, Pepton, Maisquellflüssigkeit, getrocknete Hefe und Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Erforderlichen falls können auch anorgansiche Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat oder Phosphate zu gesetzt werden. Außerdem können gewünschtenfalls andere Zusätze, welche die Produktion von Hydroxylierungsenzymen fördern, in geeigneten Kombinationen eingesetzt werden. Die spezielle Kulturmethode ist für das erfindungs gemäße Verfahren nicht kritisch, und es können daher er findungsgemäß in gleicher Weise beliebige Methoden ange wendet werden, wie sie üblicherweise für die Kultur von Mikroorganismen angewendet werden. Im allgemeinen werden natürlich die angewendeten Methoden unter Berücksichti gung ihrer industriellen Wirksamkeit gewählt. So wird im allgemeinen eine flüssige Kultur bevorzugt, und die Methode der Tiefkultur (Submerskultur) ist vom in dustriellen Standpunkt aus am günstigsten.

Die Züchtung wird normalerweise unter aeroben Bedingun gen und bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 37°C, vorzugsweise von 26 bis 28°C, durchgeführt.

Zur Durchführung von Methode (a) wrid die ML-236B-Aus gangsverbindung im Verlauf der Züchtung zu dem Kulturme dium gegeben. Der genaue Zeitpunkt während der Züchtung, zu dem die Ausgangsverbindung zugesetzt wird, variiert in Abhängigkeit von der zur Züchtung verwendeten Vor richtung, der Zusammensetzung des Mediums, der Tempe ratur des Kulturmediums und anderen Faktoren, erfolgt jedoch vorzugsweise zu dem Zeitpunkt, in welchem die Hydroxylierungs-Fähigkeit des Mikroorganismus anzu steigen beginnt, was normalerweise zwei oder drei Tage nach Beginn der Züchtung des Mikroorganismus ist. Die Menge der zugesetzten ML-236B-Verbindung be trägt vorzugsweise 0,01 bis 5,0 Gew.-% des Mediums, insbesondere 0,05 bis 0,5 Gew.-%, z. B. 0,05 bis 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Medium. Nach der Zugabe der ML-236B- Verbindung wird die Züchtung bzw. Kultur aerob fort gesetzt, was normalerweise bei einer Temperatur in nerhalb der vorstehend beschriebenen Bereiche erfolgt. Die Züchtung wird normalerweise während einer Dauer von drei bis fünf Tagen nach der Zugabe der ML-236B- Verbindung fortgesetzt.

Gemäß Methode (b) wird die Züchtung der Mikroorganismen zuerst unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß de ren maximale Hydroxylierungskapazität erzielt wird. Diese Kapazität erreicht gewöhnlich zwischen vier und fünf Tagen nach Beginn der Züchtung ein Maximum, wenn auch dieser Zeitraum in Abhängigkeit von der Art und der Temperatur des Mediums, der Spezies des Mikroor ganismus und anderen Faktoren variierbar ist. Die Hydroxylierungskapazität der Kultur kann überwacht werden, indem Proben der Kultur in geeigneten Zeit abständen entnommen werden, die Hydroxylierungskapa zität der Proben bestimmt wird, indem diese unter Standardbedingungen mit einer ML-236B-Verbindung in Berührung gehalten werden und die Menge der gebil deten M-4- bzw. M-4′-Verbindung bestimmt wird und diese Menge (Kapazität) als Kurve gegen die Zeit auf getragen wird. Wenn die Hydroxylierungskapazität ihr Maximum erreicht hat, wird die Züchtung unterbrochen, und die Mikrobenzellen werden gewonnen. Dies kann er reicht werden, indem die Kultur der Zentrifugalab scheidung, Filtration oder anderen ähnlichen bekannten Trennmethoden unterworfen wird. Die so gewonnenen ganzen Zellen des gezüchteten Mikroorganismus werden dann vorzugsweise mit einer geeigneten Wasch flüssigkeit, wie physiologischer Kochsalzlösung oder einer geeigneten Pufferlösung, gewaschen.

Der Kontakt der gewonnenen Zellen des Mikroorganismus des Genus Nocardia mit der ML-236B-Verbindung wird im allgemeinen in einem wäßrigen Medium, beispielsweise in einer Phosphatpufferlösung, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 durchgeführt. Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 45°C, insbesondere von 25 bis 30°C. Die Konzentration der ML-236B- Verbindung in dem Reaktionsmedium liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 5,0 Gew.-%. Die Zeit, während der die Umsetzung durchgeführt wird, beträgt vorzugs weise 1 bis 5 Tage, wenn auch die Dauer in Abhängig keit von der Konzentration der ML-236B-Verbindung in dem Reaktionsgemisch, der Reaktionstemperatur, der Hydroxylierungskapazität des betreffenden Mikro organismus (die natürlich von Spezies zu Spezies schwanken kann, und, wie vorstehend erläutert, auch von der Züchtungsdauer abhängt) und anderen Faktoren variieren kann.

Der zellfreie, enzymhaltige Extrakt, der gemäß Methode (c) verwendet wird, kann erhalten werden, indem die vollständigen Mikroorganismenzellen, die in der im Zusammenhang mit Methode (b) beschriebenen Weise erhalten wurden, durch physikalische oder chemische Methoden aufgebrochen werden, beispielsweise durch Mahlen oder Ultraschallbehandlung, um eine zerkleinerte Zellmasse zu erhalten, oder durch Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel oder einem Enzym, wobei eine Lösung von Zellbestandteilen gebildet wird. Der erhal tene zellfreie Extrakt wird dann unter den gleichen Bedingungen, wie sie vorstehend im Zusammenhang mit Methode (b) beschrieben wurden, mit der ML-236B-Aus gangsverbindung in Berührung gebracht.

Nach Beendigung der Umwandlungsreaktion gemäß einer der vorstehend beschriebenen Methoden kann die gewünschte Verbindung mit Hilfe von üblichen Methoden direkt iso liert, abgetrennt oder gereinigt werden. So kann bei spielsweise die Abtrennung und Reinigung durch Filtration des Reaktionsgemisches, Extraktion des erhaltenen Filtrats mit einem wasser-unmischbaren organischen Lösungmittl (wie Ethylsulfat), Abdestillieren des Lösungs mittels aus dem Extrakt, Säulenchromatographie der er haltenen rohen Verbindung (beispielsweise an Kieselgel oder Aluminiumoxid) und Elution der Kolonne mit einem geeigneten Elutionsmittel, durchgeführt werden.

Wenn die durch die Umwandlung mit Hilfe des Mikroorga nismus erhaltene M-4- oder M-4′-Verbindung nicht in der für diese Verbindung gewünschten Form vorliegt, kann das Produkt der Umwandlungsreaktion unter Anwen dung von üblichen Methoden, wie sie nachstehend aus führlicher beschrieben werden, der Hydrolyse, Salz bildung, Veresterung oder Laktonisierung oder mehr als einer dieser Reaktionen unterworfen werden. Diese zusaätzlichen Umsetzungen können vor oder nach den vorstehend beschriebenen Trenn- und Reinigungsstufen oder auch im Verlauf dieser Abtrennungs- und Reinigungs stufen durchgeführt werden, wobei die zusätzlichen Umsetzungen im Verlauf dieser Stufen be vorzugt werden.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aktive Hydro xylierungsenzym hat selbst keine Wirkung auf die Carb oxylgruppe der ML-236B-Verbindung und, wenn daher die anderen Faktoren die gleichen sind, ergibt ML-236B- Lakton M-4- und/oder M-4′-Lakton, ergibt ML-236B- carbonsäure M-4- und/oder M-4′-carbonsäure und ergibt ein Salz oder Ester der ML-236B-carbonsäure das gleiche Salz bzw. den gleichen Ester von M-4- und/oder M-4′- carbonsäure. Dies kann jedoch durch andere Faktoren, speziell den pH-Wert des Reaktionsgemisches, in einer Weise beeinflußt werden, die nach den chemischen Gesetzen vorherzusagen ist.

Die als Ausgangsverbindung verwendete ML-236B-Verbindung kann die freie ML-236B-carbonsäure der Formel (II), das entsprechende Lakton der Formel (IIa) oder ein Salz (beispielsweise eines Metalls, einer Aminosäure oder eines Amins) oder ein Ester (insbesondere ein Alkyl ester) dieser Carbonsäure sein.

Bevorzugte Metallsalze sind Salze mit Alkalimetallen, wie Natrium oder Kalium, Salze mit Erdalkalimetallen, wie Calcium oder Magnesium, oder Salze mit anderen Metallen, wie Aluminium, Eisen, Zink, Kupfer, Nickel oder Kobalt, wobei die Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Magnesium- und Aluminiumsalze bevorzugt werden und das Natrium-, Calcium- und Aluminiumsalz am stärksten bevorzugt sind.

Zu bevorzugten Aminosäuren für die Bildung von Amino säuresalzen gehören basische Aminosäuren, wie Arginin, Lysin, Histidin, α, β-Diaminobuttersäure oder Ornithin.

Zu bevorzugten Aminen zur Bildung von Aminsalzen gehören t-Octylamin, Dibenzylamin, Dichlorhexylamin, Morpho lin, Alkylester von D-Phenylglycin und D-Glucosamin. ML-236B-Ester sind vorzugsweise Alkylester, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl- oder Pentylester, wobei der Methylester bevorzugt wird. Ge wünschtenfalls können jedoch auch andere Ester angewendet werden.

Unter den ML-236B-Ausgangsverbindungen werden die Alka lisalze, z. B. die Natrium- oder Kaliumsalze, spe ziell bevorzugt, und am vorteilhaftesten ist das Natrium salz, da gefunden wurde, daß dieses die beste Umwandlung der ML-236B-Verbindung in die gewünschte M-4- oder M-4′- Verbindung ergibt.

Wenn das durch das enzymatische Hydroxylierungsverfahren gemäß der Erfindung erhaltene Produkt ein Salz der Carbonsäure der Formel (I) ist, kann die freie Carbon säure selbst erhalten werden, indem der pH-Wert des Filtrats auf einen Wert von 4 oder weniger, vorzugs weise auf einen Wert von 3 bis 4, eingestellt wird. Zu diesem Zweck kann jede beliebige organische Säure oder Mineralsäure angewendet werden, vorausgesetzt, daß sie keine schädliche Wirkung auf die gewünschte Verbin dung hat. Zu Beispielen der zahlreichen Säuren, die sich dazu eignen, gehören Trifluoressigsäure, Essig säure, Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure. Die betreffende Carbonsäure kann selbst das gewünschte Pro dukt sein oder kann, was bevorzugt wird, weiteren Reak tionen unterworfen werden, wie nachstehend beschrieben werden soll. Diese Umsetzungen werden gegebenenfalls nach Behandlungen wie der Extraktion, dem Waschen und der Entwässerung durchgeführt.

Metallsalze der Carbonsäuren der Formel (I) können her gestellt werden, indem ein Hydroxid, Carbonat oder eine ähnliche reaktive Verbindung des gewählten Metalls in einem wäßrigen Lösungsmittel mit der Carbonsäure der Formel (I) in Berührung gehalten wird. Das verwendete wäßrige Lösungsmittel ist vorzugsweise Wasser oder kann ein Gemisch aus Wasser mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Alkohol (wie Methanol oder Etha nol), einem Keton (wie Aceton), einem aliphatischen Koh lenwasserstoff (wie Hexan) oder einem Ester (wie Ethyl acetat) sein. Besonders bevorzugt wird die Verwendung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels mit Wasser. Derartige Reaktionen werden normalerweise bei Raumtem peratur durchgeführt; sie können jedoch gewünschtenfalls auch unter Erhitzen vorgenommen werden.

Aminsalze der Carbonsäure der Formel (I) können erhalten werden, indem ein Amin in einem wäßrigen Lösungsmittel mit der Carbonsäure der Formel (I) in Berührung gehalten wird. Zu geeigneten wäßrigen Lösungsmitteln gehören Wasser und Gemische aus Wasser mit Alkoholen (wie Methanol oder Ethanol), Ester (wie Tetrahydrofuran), Nitrile (wie Acetonitril) oder Ketone (wie Aceton). Es wird besonders bevorzugt, als Lösungsmittel für diese Reaktion wäßriges Aceton einzusetzen. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 8,5 und vorzugsweise bei einer Temperatur von Raumtemperatur oder darunter, ins besondere bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 10°C, durchgeführt. Die Reaktion läuft sofort bis zur Vervoll ständigung ab. Wahlweise kann auch ein Metallsalz der Carbonsäure der Formel (I) (welches in der beschriebenen Weise hergestellt worden sein kann) in einem wäßrigen Lösungsmittel gelöst werden, wonach ein Salz des ge wünschten Amins mit einer Mineralsäure (beispielsweise das Hydrochlorid) zugegeben wird, wobei die gleichen Re aktionsbedingungen angewendet werden, wie wenn das Amin selbst mit der Carbonsäure der Formel (I) umgesetzt wird, wobei das gewünschte Produkt durch eine Salz-Austausch reaktion (doppelte Umsetzung) erhalten wird.

Salze der Carbonsäuren der Formel (I) mit Aminosäuren können hergestellt werden, indem eine Aminosäure in wäßriger Lösung mit der Carbonsäure der Formel (I) in Berührung gebracht wird. Zu geeigneten wäßrigen Lösungsmitteln gehören Wasser und Gemische von Wasser mit Alkoholen (wie Methanol oder Ethanol) oder Ethern (wie Tetrahydrofuran). Die Reaktion wird vorzugsweise unter Erhitzen, beispielsweise auf eine Temperatur von 50 bis 60°C, durchgeführt.

Ester, vorzugsweise Alkylester der Carbonsäuren der Formel (I) können durch Umsetzung der Carbonsäure der Formel (I) mit einem geeigneten Alkohol hergestellt werden. Es wird bevorzugt, diese Umsetzung in Gegenwart eines Säurekatalysators, beispielsweise einer Mineral säure (wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure), einer Lewis-Säure (beispielsweise Bortrifluorid) oder eines Ionenaustauscherharzes durchzuführen. Das für diese Reaktion verwendete Lösungsmittel ist nicht kri tisch, vorausgesetzt, daß es die Reaktion nicht störend beeinflußt. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören Benzol, Chloroform und Ether. Wahlweise kann das gewünschte Produkt auch hergestellt werden, indem die Carbonsäure der Formel (I) mit einem Diazoalkan, in welchem die Alkan- Gruppe substituiert oder unsubstituiert sein kann, um gesetzt wird. Diese Reaktion wird normalerweise durch Behandlung der Säure mit einer etherischen Lösung des Diazoalkans vorgenommen. Gemäß einer weiteren Alterantive kann der Ester hergestellt werden, indem ein Metall salz der Carbonsäure der Formel (I) in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem Halogenid, vorzugsweise einem Alkylhalogenid, umgesetzt wird. Zu bevorzugten Lösungs mitteln gehören Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Di methylsuflfoxid und Aceton. Alle Umsetzungen zur Her stellung von Estern werden vorzugsweise etwa bei Raum temperatur durchgeführt, wenn auch diese unter Erhitzen vorgenommen werden können, falls dies durch die Art des Reaktionssystems erforderlich wird.

Laktone von Carbonsäuren der Formel (I) können herge stellt werden, indem die Carbonsäure der Formel (I) mit einer katalytischen Menge einer Säure, und zwar einer organischen oder anorganischen Säure, in Berührung ge bracht wird. Es wird bevorzugt, als organsiche bzw. Mineralsäuren Trifluoressigsäure, Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure anzuwenden. Diese Umsetzung wird vor zugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt.

Zu Beispielen für Salze und Ester der M-4- und M-4′- Verbindungen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Ver fahrens hergestellt werden, gehören die gleichen, wie sie vorstehend als Salze und Ester von ML-236B zur Ver wendung als Ausgangsmaterialien genannt wurden.

Die so erhaltenen M-4- und M-4′-Derivate können mit Hilfe üblicher Methoden isoliert, abgetrennt oder gereinigt werden, beispielsweise durch Adsorption an einem Träger (wie Aktivkohle oder Siliziumdioxidgel), oder durch Ionenaustauschchromatographie, Gel-Filtration an einer Sephadex®-Kolonne oder durch Extraktion mit einem or gansichen Lösungmittel, wie einem Ether, Ethylacetat oder Chloroform, falls dies gewünscht wird. Normaler weise wird bevorzugt, eine Kombination dieser Methoden anzuwenden.

Die Isomeren M-4 und M-4′ können entweder nach Beendi gung der Umwandlungsreaktion oder zu irgendeinem geeig neten Zeitpunkt während der Reaktionen oder während der vorstehend beschriebenen Abtrennungs- oder Reinigungs verfahren voneinander getrennt werden.

Die Erfindung wird nachstehend durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Zellen von Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183DSM 2646 wurden mit Hilfe einer Platinöse aus einer Schrägkultur in jeweils zwanzig 500 ml-Erlenmeyer- Kolben eingeimpft, die jeweils 100 ml eines Kulturme diums der nachstehenden Zusammensetzung enthielten (die Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht/Volumen):

Glucose1,0% Pepton0,2% Fleischextrakt0,1% Hefeextrakt0,1% Maisquellflüssigkeit0,3% LeitungswasserRest
(ph nicht eingestellt)

Dann wurde eine Schüttelkultur während zwei Tagen bei 26°C und unter Schütteln mit 220 Upm durchgeführt, wonach das Natriumsalz von ML-236B-Carbonsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,05% (Gewicht/Volumen) zugesetzt wurde. Die Inkubierung wurde bei 26°C und einer Drehzahl von 220 min^-1 weitere fünf Tage lang fortgesetzt.

Nach Beendigung der Züchtung wurde das Reaktionsgemsich filtriert und der pH-Wert des Filtrats durch Zusatz von Trifluoressigsäure auf einen Wert von 3 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wurde dreimal mit je einem Liter Ethyl acetat extrahiert, wobei Extrakte erhalten wurden, die ein Gemisch aus M-4-Carbonsäure und M-4′-Carbonsäure enthielten. Proben dieser Extrakte wurden entnommen und der Dünnschichtchromatographie an einer Silicagel®- Platte Art. 5715 (hergestellt von Merck & Co. Inc.) unterworfen und mit einem Gemisch aus Benzol, Aceton und Essigsäure in einem Volumenverhältnis von 50 : 50 : 3 entwickelt. Der Rf-Wert der M-4-Carbonsäure betrug 0,45 und der Rf-Wert der M-4′-Carbonsäure betrug 0,46.

Der gesamte restliche Anteil des Extrakts wurde mit einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid gewaschen, wonach eine equimolare Menge einer etherischen Lösung von Diazomethan bei Raumtemperatur zugegeben wurde. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang stehengelasen und danach unter vermindertem Druck zur Trockene einge dampft. Der Rückstand wurde auf eine Lobar-Kolonne (Si 60, hergestellt von Merck & Co. Inc., Größe A) aufgegeben, die dann mit einem Gemisch aus Benzol und Ethylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1 eluiert wurde. Dabei wurden gesonderte Fraktionen erhalten, die M-4- Carbonsäure-methylester und M-4′-Carbonsäure-methyl ester enthielten. Diese Fraktionen wurden durch Ein dampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 320 mg M-4-Carbonsäure-methylester und 11 mg M-4′- Carbonsäure-methylester jeweils in Form von farblosen Ölen erhalten wurden.

Durch Ersetzen des Diazomethans in der vorstehend be schriebenen Verfahrensweise durch andere geeigente Diazoalkane können andere Ester von M-4-Carbonsäure bzw. M-4-′-Carbonsäure erhalten werden.

Physikalische Eigenschaften von M-4-Carbonsäure-methyl ester

Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Deuterochloro form unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standart bei 200 MHz),
δ ppm:

0,88 (3H, Triplett, J = 7,3 Hz);
0,89 (3H, Duplett, J = 6,5 Hz);
1,12 (3H, Duplett, J = 6,8 Hz);
1,1-1,7 (1OH, Multiplett);
2,34 (1H, Sextett, J = 7 Hz);
2,3-2,5 (2H, Multiplett);
2,49 (2H, Duplett, J = 6,4 Hz);
2,58 (1H, Multiplett);
3,72 (3H, Singulett);
3,78 (1H, Multiplett);
4,25 (1H, Quintett, J = 7 Hz);
4,40 (1H, Multiplett);
5,42 (1H, Multiplett);
5,56 (1H, Multiplett);
5,90 (1H, Duplett aus Dupletts, J = 9,8 und 5,6 Hz);
5,99 (1H, Duplett, J = 9,8 Hz).

Massenspektrum

Nach der Silylierung mit N,O-Bis(trimethylsilyl)-tri fluoracetamid wurde die Messung mit Hilfe eines Massen spektrometers, Type D-300, hergestellt von Nihon Electronic Co., durchgeführt.
M/e: 654 (M⁺), 552, 462, 372, 290, 272, 233, 231.

Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Ethanol) g _maxnm: 230,1, 237,3, 246,4.

Infrarot-Absorptionsspektrum (Dünnfilm) ν _maxcm^-1: 3400, 2950, 1730.

Dünnschichtchromatographie

Auf einer Siliciumdioxidgelplatte Art. 5715, herge stellt von Merck & Co. Inc., unter Verwendung eines Gemisches aus Benzol und Aceton im Volumenverhältnis 1 : 1 als Entwicklungslösungsmittel.
Rf-Wert: 0,88.

Physikalische Eigenschaften von M-4′-Carbonsäure methylester

Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Deuterochloro form, unter Verwendung von Tetramethylsilan als in nerem Standard, bei 60 MHz).
δ ppm:

3,70 (3H, Singulett);
5,50 (1H, breites Singulett);
5,75 (1H, breites Singulett);
5,90 (1H, Quadruplett);
6,01 (1H, Duplett).

Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol) λ _maxnm: 230, 238, 246.

Infrarot-Absorptionsspektrum (Dünnfilm) ν _maxcm^-1: 3400, 1730.

Massenspektrum

Nach der Silylierung mit N,O-Bis(trimethylsilyl)- trifluoracetamid wurde die Messung unter Verwendung eines Massenspektrometers, Type D-300, hergestellt von Nihon Electronic Co., durchgeführt.
M/e: 654 (M⁺).

Elementaranalyse für C₂₄H₃₈O₇:

Berechnet:C: 65,73%; H: 8,73%; Gefunden:C: 65,66%; H: 8,79%.

Beispiel 2

Die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensschritte wurden wiederholt, wobei 1,9 Liter eines Reaktrionsge misches erhalten wurden. Der pH-Wert dieses Gemisches wurde dann durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf einen Wert von 3,0 eingestellt, wonach das Gemisch dreimal mit je einem Liter Ethylacetat extrahiert wurde. Auf diese Weise wurde eine Fraktion erhalten, die sowohl M-4- Carbonsäure als auch M-4′-Carbonsäure enthielt.

Dieser Extrakt wurde dann mit einer gesättigten Lösung von Natriumchorid gewaschen und danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Dann wurde eine katalytische Menge an Trifluoressigsäure zugesetzt, um die Laktoni sierung zu bewirken. Das gebildete Gemisch wurde dann mit einer 5%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen, danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und schließlich zur Trockene eingedampft, wobei eine Laktonfraktion er halten wurde.

Diese Laktonfraktion wurde auf eine Labor-Kolonne auf gegeben (Si 60, hergestellt von Merck & Co. Inc., Größe A) und mit einem Gemisch aus Benzol und Aceton im Volu menverhältnis 7 : 3 eluiert, wobei gesonderte Fraktionen, die M-4-Lakton und M-4′-Lakton enthielten, erhalten wurden. Diese Fraktionen wurden getrennt aus Ethylacetat umkristallisiert, wobei 270 mg M-4-Lakton und 8 mg M-4′- Lakton erhalten wurden.

Physikalische Eigenschaften von M-4-Lakton

Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Deuterochloro form, unter Verwendung von Tetramethylsilan als inne rem Standard, bei 100 Hz).
w ppm:

4,38 (1H, Multiplett);
4,41 (1H, Multiplett);
4,62 (1H, Multiplett);
5,41 (1H, Multiplett);
5,58 (1H, Multiplett);
5,90 (1H, Quadruplett);
6,01 (1H, Duplett).

Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol) λ _maxnm: 230, 236,7, 244,6.

Infrarot-Absorptionsspektrum (Dünnfilm) ν _maxcm^-1: 3400, 2950, 1725.

Dünnschicht-Chromatographie

Auf einer Siliziumdioxidgelplatte Art. 5715, herge stellt von Merck & Co. Inc., unter Verwendung eines Gemisches aus Benzol, Aceton und Essigsäure im Vo lumenverhältnis 50 : 50 : 3 als Entwicklungslösungsmit tel.
Rf-Wert: 0,62.

Physikalische Eigenschaften von M-4′-Lakton

Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Deuterochloro form, unter Verwendung von Tetramethylsilan als inne rem Standard, bei 100 MHz).
δ ppm:

4,25 (1H, Multiplett);
4,60 (1H, Multiplett);
5,50 (1H, Mulitplett);
5,75 (1H, Mulitplett);
5,90 (1H, Quadruplett);
6,01 (1H, Duplett).

Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol) λ _maxnm: 230, 237, 245.

Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) ν _maxcm^-1: 3500, 1720.

Massenspektrum: M/e: 406 (M⁺), 304, 286.

Optische Drehung: [a] = +310,9° (c = 0,66, Methanol).

Fp.: 141-143°C.

Elementaranalyse für C₂₃H₃₄O₆:
Berechnet:C: 67,95%, H: 8,43%; Gefunden:C: 68,05%, H: 8,37%.

Dünnschicht-Chromatographie

An einer Siliziumdioxidgelplatte Art. 5715, herge stellt von Merck & Co. Inc., unter Verwendung eines Ge misches aus Benzol und Aceton im Volumenverhältnis 1 : 1 als Entwicklungslösungsmittel.
Rf-Wert: 0,64.

Beispiel 3

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde bis einschließlich der Extraktion mit drei Anteilen an Ethylacetat wiederholt, wobei ein Extrakt gebildet wurde, der beide Verbindungen M-4-Carbonsäure und M-4′- Carbonsäure enthielt.

Dieser Extrakt wurde dann sofort in eine 5%ige (Ge wicht/Volumen) wäßrige Lösung von Natriumhydrogencar bonat gegeben, und der pH-Wert des Gemisches wurde durch Zugabe von 2n Chlorwasserstoffsäure auf einen Wert von 7,0 eingestellt. Das Gemisch wurde dann an einer Diaion HP-20-Kolonne (hergestellt von Mitsubishi Chemical In dustries) adsorbiert. Die Kolonne wurde mit Wasser ge waschen und dann mit 50%igem (Volumen/Volumen) wäßrigem Aceton eluiert, wobei eine Fraktion erhalten wurde, die das Natriumsalz von M-4-Carbonsäure enthielt. Durch Gefriertrocknung dieser Fraktion wurden 200 mg des Natriumsalzes von M-4-Carbonsäure erhalten.

Physikalische Eigenschaften des Natriumsalzes M-4- Carbonsäure

Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Deuteromethanol, unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard, bei 200 MHz).

δ ppm:

0,91 (3H, Triplett, J = 7,5 Hz);
0,92 (3H, Duplett, J = 7 Hz);
1,12 (3H, Duplett, J = 7 Hz);
1,1-1,8 (1OH, Multiplett);
2,25 (1H, Duplett aus Duplettes, J = 15 u. 7,6 Hz);
2,34 (1H, Duplett aus Duplettes, J = 15 u. 5,5 Hz);
2,2-2,4 (3H, Multiplett);
2,48 (1H, Multiplett);
3,68 (1H, Multiplett);
4,07 (1H, Multiplett);
4,28 (1H, Multiplett);
5,36 (1H, Multiplett);
5,48 (1H, Duplett aus Dupletts, J = 3 u. 2 Hz);
5,88 (1H, Duplett aus Dupletts, J = 9,6 u. 5,3 Hz);
5,98 (1H, Duplett, J = 9,8 Hz).

Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol) λ _maxnm: 230,0, 237,2, 245,0.

Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) ν _maxcm^-1: 3400, 2900, 1725, 1580.

Dünnschicht-Chromatographie

An einer Siliziumdioxidgelplatte Art. 5715, herge stellt von Merck & Co. Inc., unter Verwendung eines Ge misches aus Benzol, Aceton und Ethylacetat im Volumen verhältnis 50 : 50: 3 als Entwicklungslösungsmittel.
Rf-Wert: 0,45.

Beispiel 4

Die in Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, wobei jedoch der Stamm Nocardia autotrophica FERM P-6181DSM 2644 anstelle von Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183DSM 2646 verwendet wurde. Auf dieser Weise wurden folgende Verbindungen erhalten: 150 mg M-4-Car bonsäure-methylester, 37 mg M-4′-Carbonsäure-methylester; 140 mg M-4-Lakton, 30 mg M-4′-Lakton und 110 mg M-4- Carbonsäure-natriumsalz. Diese Verbindungen hatten in allen Fällen Eigenschaften, die identisch mit denen der entsprechenden Verbindungen waren, welche in den Beispielen 1 bis 3 hergestellt wurden.

Beispiel 5

In 20 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend je 100 ml eines Mediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung (die Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht/Volumen), wurde jeweils eine Kultur von Nocardia autotrophica subsp. caberrica FERM P-6182DSM 2645 in einer Menge entsprechend einer Platinöse eingeimpft.

Glycerin0,5% Saccharose2,0% Sojabohnen-Mehl1,0% Preßhefe1,0% Maisquellflüssigkeit0,5% Cobaltchlorid0,001% LeitungswasserRest
(pH 7,0).

Eine Schüttelkultur wurde zwei Tage lang bei 26°C unter 220 µpm durchgeführt, wonach ML-236B-Carbonsäure-natrium salz bis zu einer Endkonzentration von 0,05% (Gewicht/Volumen) zugesetzt wurde. Die Züchtung wurde dann bei 26°C und einer Drehzahl von 220 min^-1 weitere fünf Tage fortgesetzt. Das er haltene Reaktionsgemisch wurde filtriert und der pH-Wert des Filtrats wurde durch Zugabe von Chlor wasserstoffsäure auf einen Wert von 3,0 eingestellt. Dann wurde das Gemisch dreimal mit je einem Liter Ethylacetat extrahiert, wobei ein Extrakt erhalten wurde, der beide Verbindungen M-4-Carbonsäure und M-4′-Carbonsäure ent hielt. Durch Dünnschicht-Chromatographie des Extrakts wurde gezeigt, daß diese Verbindungen identisch mit den entsprechenden Produkten aus Beispiel 1 waren.

Der Extrakt wurde dann weiter in gleicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 180 mg M-4-Carbonsäure- methylester und 110 mg M-4′-Carbonsäure-methylester er halten wurden.

Beispiel 6

Die in Beispiel 5 beschriebene Verfahrensweise wurde bis einschließlich der Herstellung des Extrakts, der M-4- Carbonsäure und M-4′-Carbonsäure enthielt, wiederholt. Dieser Extrakt wurde dann in der in Beispiel 2 beschrie benen Weise aufgearbeitet, wobei 170 mg M-4-Lakton und 90 mg M-4′-Lakton erhalten wurden.

Beispiel 7

Kulturen von Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183DSM 2646 in einer Menge von jeweils einer gefüllten Öse wurden in zehn 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingeimpft, die jeweils 100 ml eines Mediums der nachstehenden Zu sammensetzung (Prozentangaben als Gewicht/Volumen) ent hielten:

Glucose1,0% Pepton0,2% Fleischextrakt0,1% Hefeextrakt0,1% Leitungswasser (Rest)
(pH nicht eingestellt)

Eine Schüttelkultur wurde dann bei 26°C und einer Drehzahl von 220 min^-1 fünf Tage lang durchgeführt, wonach die ganzen Mikro benzellen durch Zentrifugalabscheidung gewonnen wurden. Die gewonnenen Zellen wurden mit einer 0,1 m Phosphat pufferlösung (pH 7,0) gewaschen, wiedergewonnen und in 900 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde das Natriumsalz von ML-236B- Carbonsäure bis zu einer Konzentrtion von 0,5 g/100 ml gegeben, und das Gemisch wurde dann fünf Tage lang bei 26°C und unter Schütteln mit einer Drehzahl von 220 min^-1 inkubiert. Nach Beendigung dieses Zeitraumes wurde das Umwandlungsgemisch filtriert und der pH-Wert des Filtrats durch Zusatz von Chlorwasserstoffsäure auf einen Wert von 3,0 einge stellt. Das Gemisch wurde dann dreimal mit je einem Liter Ethylacetat extrahiert, wobei ein Extrakt gebildet wurde, der M-4-Carbonsäure und M-4′-Carbonsäure ent hielt. Die Verbindungen wurden durch Dünnschicht-Chro matographie identifiziert und erwiesen sich als die gleichen wie die jeweiligen Produkte des Beispiels 1.

Beispiel 8

Zellen von Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183DSM 2646 wurden aus einer Schrägkultur mit Hilfe einer Platinöse in jeweils zwanzig 500 ml-Erlenmeyer- Kolben eingeimpft. Jeder dieser Kolben enthielt 100 ml eines Kulturmediums der in Beispiel 7 angegebenen Zu sammensetzung. Dann wurde eine Schüttelkultur bei 26°C und einer Drehzahl von 220 min^-1 während zwei Tagen durchgeführt, wonach das Natriumsalz von ML-236B-Carbonsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,4% (Gewicht/Volumen) zugesetzt wurde. Die Inkubierung wurde weitere fünf Tage bei 26°C und einer Drehzahl von 220 min^-1 fortgesetzt. Dann wurde die in in Bei spiel 2 beschriebene Verfahrensweise wiederholt, wobei 2,9 g M-4-Lakton erhalten wurden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von substituierten 7-Hexahydro naphthyl-3,5-dihydroxyheptansäurederivaten der Formel in der OH für OH oder OH steht, ihrer pharmazeutisch geeigneten Salze, Ester oder Lactone, da durch gekennzeichnet, daß man die substi tuierten 7-Hexahydronaphthyl-3,5-dihydroxyheptansäurederi vate der Formel der sogenannten "ML-236B-Carbonsäure", deren Salze, Ester oder Laktone mit einem Hydroxylierungsenzym in Berührung bringt, das von einem der folgenden MikroorganismenNocardia autotrophica IFO 12743
Nocardia autotrophica FERM P-6181 = DMS 2644
Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 = DMS 2645
Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183 = DMS 2646gebildet wurde, gegebenenfalls das erhaltene Produkt einer Hydrolyse, Salzbildung, Veresterung bzw. Lactonisierung oder mehreren dieser Reaktionen unterwirft und das erhaltene Produkt aus dem Reaktionsgemisch gewinnt.