FI70925B - Foerfarande foer framstaellning av 3-hydroxy-ml-236b-derivater - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av 3-hydroxy-ml-236b-derivater Download PDF

Info

Publication number
FI70925B
FI70925B FI823978A FI823978A FI70925B FI 70925 B FI70925 B FI 70925B FI 823978 A FI823978 A FI 823978A FI 823978 A FI823978 A FI 823978A FI 70925 B FI70925 B FI 70925B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
nocardia
ferm
compound
brown
microorganism
Prior art date
Application number
FI823978A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI70925C (fi
FI823978A0 (fi
FI823978L (fi
Inventor
Akira Terahara
Minoru Tanaka
Original Assignee
Sankyo Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sankyo Co filed Critical Sankyo Co
Publication of FI823978A0 publication Critical patent/FI823978A0/fi
Publication of FI823978L publication Critical patent/FI823978L/fi
Publication of FI70925B publication Critical patent/FI70925B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI70925C publication Critical patent/FI70925C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/365—Nocardia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/872—Nocardia

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

70925 1 Menetelmä 3-hydroksi-ML-236B-johdannaisten M-4 ja M-4' valmistamiseksi Förfarande för framställning av 3-hydroxy-ML-236B-clerivaten M-4 och M-4' 5 Tämä keksintö käsittää menetelmän kaavan (I) mukaisen lääkeaineena käyttökelpoisen yhdisteen: 10
^ ...OH
hooc^ y‘
HCX J
H O £··% 15 '0 ΗΪ O) CH3fA|A>^3 HO^ 20 (missä 'VvAA.0H edustaa ryhmää "Ji**0H tai >M»iuoh), sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen ja esterien sekä vastaavien suljetun renkaan omaavlen laktonlen valmistamiseksi, saattamalla yhdiste 25 ML-236B, joka on kaavan II mukainen
..-OH
HOOCT ^-* 30 · 0%/
νϊ T-H
9 H I on 35 2 70925 1 (ML-236B)-karbokeyylihappo tai sen suola, kosketukseen hydroksylointient-syymin kanssa.
ML-236B, joka voi esiintyä happomuodossa ("ML-236B-karboksyylihappo") 5 tai laktonimuodossa ("ML-236B-laktoni"), on kuvattu GB patenttijulkaisussa 1.453.425, Ja, laktonimuodossaan, sillä on kaava:
10 O^J
-rVS
A A. /ch3
15 flT
Myöhemmin GB patenttijulkaisussa 1.555.831 on kuvattu erilaisia 20 ML-236B:n suoloja ja estereitä. ML-236B:n ja sen suolojen ja estereiden havaittiin Inhiboivan kolesterolin biosynteesiä kilpailemalla 3-hydroksi- 3-metyyliglutaryylikoentsyymi-A:n reduktaasin kanssa, mikä on reaktio-nopeutta määräävä entsyymi kolesterolin biosynteesissä; näiden yhdisteiden havaittiin siten osoittavan erittäin merkittävää kykyä alentaa seeru-25 min kolesterolitasoa.
Myöhemmin tiettyjä 3-hydroksi-ML-236B:n johdannaisia eristettiin ML-236B-laktouin eläinten aineenvaihdunnan tuotteina, ja samanlaisia johdannaisia havaittiin tuotettavan ML-236B-laktonln ja -karboksyylihapon tai niiden 30 suolojen tai estereiden entsymaattlsella hydroksylolnnilla, mikä oli saatu aikaan suvun Absldia, Cunninghamella, Syncephalastrum, Streptomyces, Mucor, Rhizopus, Zygorhynchus, Circinella, Actlnomucor, Gongronella, Phycomyces, Mortierella, Pycnoporus ja Rhizoctonla mikro-organismeilla. A. Terahara ja M. Tanaka julkaisivat nämä menetelmät US-patentlssa 4.346.227, jota 35 vastaava patenttihakemus jätettiin 5. heinäkuuta 1981, ja siten tuotettuja yhdisteitä kuvataan tuossa patenttihakemuksessa M-4:ksi, M-4':ksi, TsoM-4:-ksi ja IsoM-4':ksi. Näillä yhdisteillä havaittiin olevan kykyä inhiboida 3 70925 1 kolesterolin biosynteesiä» mikä on vähintään verrannollinen itse ML-236B:n inhibointikyvyn kanssa ja mikä joissakin tapauksissa olennaisesti ylittää sen.
5 ML-236B:llä ja sen johdannaisilla käsittäen M-4- ja M-41-yhdisteet on siten terapeuttista merkitystä veren hyperlipemian hoitamisessa ja val-timonkovetustaudin ennaltaehkäisyssä.
Tekniikan tasona mainitaan myös FI-patenttien 66.427 ja 67.231 sekä FI-10 hakemuksen 802357 esittämät läheistä rakennetta olevat yhdisteet.
Me olemme nyt keksineet, että M-4:ä ja M-4':ä voidaan myös valmistaa ML-236B:stä ja sen erilaisista johdannaisista käsittelemällä suvun Nocardia mikro-organismilla tai sen soluttomalla, entsyymiä sisältävällä 15 uutteella. Suvun Nocardia mikro-organismien käytöllä on se etu verrattuna US-patentissa 4.346.227 esitettyihin mikro-organismeihin nähden, että substraattina käytettävää ML-236B-yhdistettä voi olla reaktioliuok-sessa paljon suurempana konsentraatloua kuin jos käytetään aiemman kaltaisia mikro-organismeja. Tämä on kalkkein hännnästyttävlntä, sillä 20 ML-236B-yhdisteiden on havaittu omaavan fungisidisia ja antibioottisia ominaisuuksia.
Näin ollen tämä keksintö on tunnettu siltä, että hydroksylointientsyyml on valmistettu suvun Nocardia mikro-organismilla; jos on tarpeellista, 25 altistamalla saatu tuote yhteen tai useampaan reaktioon, joka on hydro-lyysi, suolan muodostus, esterölnti tai laktonlsointl; ja eristämällä tuote reaktioseoksesta.
Kaavan (I) yhdistettä, jossa SΙΛ/ΙΑ. OH on OH, kutsutaan 30 (M-4)-karboksyylihapoksi, ja vastaavat suolat ja esterit tunnetaan (M-4)-karboksylaatteina. Kaavan (I) yhdiste, missä SVWL OH on OH, lyhennetään (M-41)-karboksyylihapoksi, ja vastaavat suolat ja esterit lyhennetään (M-4')-karbokeylaareiksi.
35 4 70925 1 Suljetun renkaan omaavla laktoneja, jotka vastaavat kaavan (I) yhdisteitä, voidaan kuvata kaavalla (Ia): h3C'^y o h> (Ta> 10 »Tipu
H CT
15 missä /VW> OH edustaa ryhmää -*·βθΗ tai ja ne tunnetaan vastaavasti (M-A)-laktonlna ja (M-VJ-laktonlna.
Suljetun renkaan omaavaa laktonla, joka vastaa kaavan (TI) ML-236B-20 karboksyyllhappoa, voidaan kuvata kaavalla (Ila):
.....OH
25 y' H O [x. dia)
hSH
ja se tunnetaan ML-236B-laktonina.
35 5 70925 1 Suvun Nocardia parempina pidettyjä lajeja käytettäväksi tämän keksinnön menetelmässä ovat Nocardia autotrophica, Nocardia asteroldes, Nocardia farclnica ja Nocardia coeliaca, erityisesti Nocardia autotrophica. Näistä lajeista seuraavia kantoja pidetään parempina: 5
Nocardia autotrophica FERM P-6181 (SANK 62781);
Nocardia autotrophica subsp. canberrica nov. PERM P-6182 (SANK 62881); Nocardia autotrophica subsp. amethystine nov. FERM P-6183 (SANK 62981); 10 Nocardia autotrophica IFO 12743 (SANK 91279);
Nocardia asteroides IFO 3424 (SANK 62065);
Nocardia farcinica ATCC 3318 (SANK 64265) ja Nocardia coeliaca ATCC 17040 (SANK 63665).
15 Yllä mainituista suvuista Nocardia autotrophica IFO 12743, Nocardia asteroides IFO 3424, Nocardia farclnica ATCC 3318 ja Nocardia coeliaca ATCC 17040 tunnetaan kaikki lajeina, joita on vapaasti ja yleisesti saatavissa vastaavalta vi.ljelmäkokoelmalta, so. the Institute for Fermentation, Osaka, Japani (IFO) tai the American Type 20 Culture Collection, USA (ATCC), annetuilla talletusnumerollia.
Nocardia autotrophica kannat, joita merkitään talletusnumerollla FERM P-6181, FERM P-6182 ja FERM P-6183, ovat kaikki tämän mikro-organismin uusia kantoja, jotka on hiljakkoin eristetty maa-aineksesta ja jotka on 25 16. lokakuuta 1981 liitetty kokoelmaan Fermentation Research
Institute:ssa, Ibaraki-Ken, Japani (FERM).
Vastikään eristettyjen mikro-organismien morfologiset ja fysiologiset ominaisuudet määritettiin käyttäen tavanomaista väliainetta ja 30 Shirlingin ja Gottliebin kuvaamia menetelmiä International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966) yhdessä useiden lisä-testien kanssa. Havaintoja viljelmästä tehtiin inkuboinnin jälkeen 28°C:8sa 2 viikkoa. Käytetyt värien nimet merkittiin "Guide to Colour Standard"-käsikirjan mukaan (Nippon Shikisai Kenkyushorn, Tokio, 35 Japani, julkaisema käsikirja). Viljelmien omineisuuksia verrattiin ak-tlnomysetaalien erilaisten tunnettujen Actinomycetes lajien ominaisuuksiin, joita Wakeman kuvaa teoksessa "The Actinomycetes, Voi. 2", Shir- 6 70925 1 ling ja Gottlieb julkaisussa "The ISP Report" ja joita kuvataan "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. painoksessa ja muussa viimeaikaisessa kirjallisuudessa, joka käsittelee suvun Nocar-dlaceae taksonomiaa. Uusia mikro-organismeja merkitään niiden FERM-5 talletusnumeroilla.
Taulukossa 1 on esitetty edellä mainittujen uusien mikro-organismien morfologisia ominaisuuksia.
10 TAULUKKO 1
FERM FERM FF.RM
P-6181 P-6182 P-6183 15_____________
Itiöketjun morfologia RF RF RF
Haaroittuminen vaatimaton vaatimaton vaatimaton
Fragmentoltuminen kyllä kyllä kyllä
Segmentoituneiden rihmojen 20 (hyphae) pintarakenne (itiöt) sileä, sileä, sileä, kiiltävä kiiltävä kiiltävä
Muut elimet solmukoh- solmu- ei tla, pesä- kohtia kemäistä 25 kasvustoa (tangles) ----- — - - ------- * - ' . j—....
RF - Rectus Flexlbills 30
Kalkki uudet kannat osoittivat hyvää kasvua vaihteleviesa väliaineissa.
Kannalla FERM P-6181 oli valkoisia plntarihmastoja (aerial mycelia) väriltään kellanharmaasta vaalean kellanoransslln kasvuston päällä. Tle-35 tylssä liuoksissa havaittiin vaalea, kellanruskea, liukoinen pigmentti, mutta vain vähäisessä määrin.
7 70925 1 Kannalla FERM P-6182 oli ruskean valkoisesta vaalean kellanoransslln värisiä pintarlhmaetoja harmahtavan kellanruskean kasvuston päällä. Mitään liukoista pigmenttiä el havaittu.
5 Kannalla FERM P-6183 oli väriltään ruskean valkoisesta vaalean kellanoransslln värinen kasvusto, ja violetlnruskeita täpliä havaittiin, kun viljely edistyi. Rusehtavan harmaita pintarilimastoja oli mukana kalkkien väliaineiden päällä paitsi hiiva-mallas-väliaineella.
10 Viljelmien ominaisuudet 14. viljelypäivänä 28°C:ssa eri väliaineissa on esitetty taulukossa 2. Taulukossa käytetyt lyhenteet ovat seuraa-vat: G * kasvusto; 15 AM pintarihmasto; R « kääntöpuoli; SP - liukoinen pigmentti.
20 25 30 35 1 TAULUKKO 2 8 70925 Väliaine FERM P-6181 FERM P-6182 FFIRM P-6183 5 ________________________________________________________
Hiiva- G Erittäin hyvä, Erittäin hyvä, Erittäin hyvä, mallas- vaalean kellan- ruskea (6-4-1) ruskean valkeasta agari ruskea (6-7-9) (2-9-8) harmah- (ISP 2) tavan punarus- 10 keaan (4-3-5) AM Runsas, Runsas, Jälkiä, valkoinen rusehtavan valkoinen valkoinen (2-9-7) 15 R Kiilloton, Ruskea (4-4-7) Ruskean valkeasta kellanoranssi (2-9-8) harmahta- (8-8-8) van punaruskeaan (4-3-5) SP Kellanruskea Ei lainkaan Ei lainkaan 20 (8-7-9)
Kaura- G Hyvä, vaalean Erittäin hyvä, Erittäin hyvä, jauho- ruskea (2-8-9) vaalean kellan- tumman punaruskea agari oranssi (2-9-9) (4-3-4) 25 (ISP 3) AM Kohtalainen, Runsas, vaalean Kohtalainen, hiu- valkea kellanruskea kan vaalean pu- (2-9-9) nainen (2-8-4) R Kellertävän Vaalean kellan- Ruskean violetti 30 ruskea (4-7-9) ruskea (4-8-9) (3-3-2) SP Vaalean kellan- Ei lainkaan F.i lainkaan ruskea (4-8-9) 35 1 TAULUKKO 2 (jatkuu) 9 70925 - - - ------- ------------ — i Väliaine FERM P-6181 FERM P-6182 PERM P-6183 5 _________________________________________________________________ Tärkkelys/ Γ. Hyvä, keller- Niukka, ke Her- Erittäin hyvä, epäorg. tävän harmaa tavan harmaa ruskean violetti suola (2-9-10) (1-9-10) (3-3-2) - agari AM Kohtalainen, Runsas, vaalean Hyvä, kiiltävän 10 (ISP 4) valkoinen kellanoranssi ruskean harmaa (2-9-9) (2-8-2) R Vaalean keltai- Vaalean kellan- Tumman punaruskea nen (3-9-10) oranssi (2-9-9) (4-3-4) SP Ei lainkaan Ei lainkaan Ei lainkaan 15 __________________________________________________________________________ . Glyseriini/ G Hyvä, vaalean Hyvä, harmahta- Erittäin hyvä, asparagiini ruskea (2-8-9) van kellan- vaalean ruskeasta -agari ruskea (4-5-7) (2-9-9) ruskean (ISP 5) violettiin (3-3-2) 20 AM Runsas, Runsas, ruskean Runsas, valkoinen valkoinen valkoinen (1-8-6) R Vaalean kellan- Ruskea (4-4-6) Vaalean kellanruskea (6-8-9) oranssista (2-9-9) 25 harmahtavan puna ruskeaan (4-3-6) SP Vaalean kellan- Ei lainkaan Ei lainkaan ruskea (6-9-11) 30 Ty rosiini- G Erittäin hyvä, Erittäin hyvä, Hyvä harmahtavan agari vaalean keltai- harmahtavan ruskea (4-6-6) (ISP 7) sen oranssi kellanruskea (3-8-8) (4-5-7) AM Runsas Runsas, ruskean Jälkiä, 35 valkoinen valkoinen valkoinen (2-9-7) _____________ 10 1 TAULUKKO^ (jatkuu) 70925 Väliaine FERM P-6181 FERM P-6182 FFRM P-6183 5 ________________________________________________________________ R Kellertävän Kirkkaan Vaalean kellan- harmaa (1-9-10) ruskea (6-5-7) oranssista (2-9-9) ruskeanviolettiin i (3-3-2) | 10 SP J Vaalean kellan- Ki lainkaan F.i lainkaan j I ruskea (6-7-9) |
j ‘ I
Sakkaroosi- G | Hyvä, vaalean Heikko, Heikko, nitraatti- j kellanruskea vaalean kellan- vaalean kellan- 15 agari I (2-9-9) ruskea (2-9-9) oranssi (2-9-9) i i AM j Kohtalainen, Runsas, Kohtalainen, ! valkoinen ruskean valkoi- valkoinen - nen (2-9-7) R Kellertävän Ruskean valkoi- Vaalean kellan- 20 I I harmaa (1-9-10) nen (1-9-6) oranssi (2-9-9) j SP 1 Fi lainkaan Ki lainkaan Ei lainkaan |
Glukoosi/ G Erittäin hyvä, Hyvä, harmahta- Erittäin hyvä, asparagiini 'vaalean kellan-jvan kellan- vaalean kellan- 25 -agari 'oranssi (2-9-9)!ruskea (4-5-7) oranssista (2-9-9) I ruskean violettiin ! (3-3-2) AM Kohtalainen, Runsas, kiiltä- Kohtalainen, ! valkoinen vän ruskean valkoinen _ i 30 | valkoinen ; (1-7-6) R , Vaalean kellan- Harmahtavan Vaalean kellan- ruskea (4-8-9) punaruskea oranssista (2-9-9) (4-3-6) harmahtavan puna- 35 ruskeaan (4-3-6) SP Vaalean kellan- Ei lainkaan Ei lainkaan ruskea (4-8-9) 1 TAULUKKO 2 (jatkuu) π 70925 Väliaine FFRM P-6181 FF.RM P-6182 FF.RM P-6183
Ravinto- G Hyvä, keller- Erittäin hyvä, Hyvä vaalean kel- agari tävän harmaa vaaleau kellan- lanoranssi (2-9-9) (2-9-10) ruskea (6-8-9) AM Kohtalainen, Vaalean kellan- Jälkiä, valkoinen Ί0 valkoinen oranssi (2-9-9) R Kellertävän Vaalean kellan- Vaalean kellan- harraaa (4-9-10) ruskea (6-8-9) oranssi (2-9-9) SP Ei lainkaan F.i lainkaan Ei lainkaan 15 Vesi- G Heikko, keller- Heikko, Heikko, vaalean agari tävän harmaa väritön ke 1lanoranssi (1-9-10) (2-9-9) AM Kohtalainen, Runsas, Kohtalainen, valkoinen valkoinen valkoinen 20 R Kellertävän Vaalean kellan- Vaalean kellan- harmaa (1-9-10) oranssi (2-9-9) oranssi (2-9-9) SP Ei lainkaan Ei lainkaan Ei lainkaan
Peruna/ G Heikko, keller- Heikko, Heikko, vaalean 25 porkkana- tävän harmaa väritön kellanoranssi 1 uute (1-9-10) (2-9-9) -agari AM Kohtalainen Kohtalainen, Kohtalainen, valkoinen valkoinen valkoinen 30 R Kellertävän Vaalean kellan- Vaalean kellan- harmaa (1-9-10) oranssi (2-9-9) oranssi (2-9-9) SP Ei lainkaan Ei lainkaan Ei lainkaan 35 12 70925 1 Uusien kantojen fysiologiset ominaisuudet on esitetty taulukossa 3. Tumman pigmentin muodostuinlskoe tehtiin seuraavlssa kolmessa väliaineessa: 5 Väliaine 1: Tryptoni-hlivauute-lihaliemi (ISP 1); Väliaine 2: Peptoni-hilvauute-rauta-agari (ISP 6); Väliaine 3: Tyrosiinlagarl (ISP 7).
TAULUKKO 3 10
FERM FERM FERM
P-6181 P-6182 P-6183 15 Nitraatin pelkistys - - Tärkkelyksen hydrolyysl - -
Urean hajoaminen + +
Lysoteyymien kestävyys +
Tumman pigmentin muodostus 20 Väliaine 1 - - Väliaine 2 - - Väliaine 3 -
Happojen tuottaminen arablnoosista + - + 25 ksyloosista + +
raffinoosista + NG
- - negatiivinen; 30 + = positiivinen; NG « el kasvustoa.
Hiilihydraattien hyväksikäyttö uusilla kannoilla on esitetty taulukossa 4. Käytetty väliaine oli Pridham-Cottlieb-agaria (ISP 9), ja 35 määritys tehtiin viljelyn jälkeen 28°C:ssa 14 päivän ajan.
70925 1 TAULUKKO 4
FERM PERM FF.RM
5 P-6181 P-6182 P-6183 D-glukoosi + + + D-arablnooei +-+ D-ksyloosl +-+ 10 D-fruktoosi +++ L-ramnoosi +-+
Inositoli +++
Sakkaroosi + --
Raffinoosi +-- 15 D-mannitoli +++
Vertailu --- + = hyödynnetty; 20 + => hiukan hyödynnetty; - e ei hyödynnetty.
Paperikromatografia-analyyseja tehtiin kunkin kolmen, uuden suvun hap-pohydrolyysituotteelle B. Beckerin et ai. {^Applied Microbiology, 13, 25 236 (1965)J ja M.P. LeChevalier'n et ai. [[H. Prauset, "The Actino- mycetales", 311 (1970)J menetelmän mukaan. Meso-2,6-diaminopimeeli-happoa löydettiin soluseinlstä, ja arabinoosia ja galaktoosia löydettiin koko solun sakkarilnln aineosina, mikä siten varmistaa sen, että kullakin suvulla olivat solun osat tyyppiä TV-A.
30 Näiden taksonomisten tutkimusten tulokset osoittavat, että kaikki kannat kuuluvat sukuun Nocardla. Nocardlan tunnetuista lajeista uusien kantojen ominaisuudet ovat lähimpänä Nocardla autotrophican ominaisuuksia International Journal of Systematic Bacteriology, 30, 337 (1980) 35 paitsi ainoastaan niiden erojen kohdalla, jotka on esitetty taulukossa 5. Taulukossa merkit ja lyhenteet ovat samoja kuin vastaavissa taulukoissa 1-4 annetut.
14 70925 1 TAULUKKO 5 FERM FERM FERM Nocardia 5 Koe P-6181 P-6182 P-6183 autotrophica___
Kasvuston AM valkoinen valkoisesta valkoi- valkoisesta värit vaalean koisesta vaalean kellan- rusehta- keltaiseen 10 oranssiin van har maaseen C kellertävän harmahtavan ruskean vaalean kel- barmaasta kellan- violetti täisestä vaalean kel- ruskea kellertävän 15 lan oranssiin harmaaseen
Urean hajoaminen + - + +
Kestävyys 20 lyeotsyymille - + - -
Happojen tuotto: arablnooslsta + - + + ksyloosista + - + + 25 raffinoosista + - NG -
Hyväksikäyttö: arabinoosl + - + + ksyloosi + _ + + 30 ramnoosl + - + + sakkaroosi + - - + raffinoosi + + 35 Kanta FERM P-6181 ja Nocardla autotrophica muistuttivat toisiaan morfo logisilta, kasvuetollisiltä ja fysiologisilta ominaisuuksiltaan, ja siten pääteltiin, että tämä kanta kuului lajiin Nocardia autotrophica.
15 70925 1 Kanta FERM P-6182 poikkesi Nocardla autotrophlcasta urean hajottamisessa, kestävyydessä lysotsyymeille, happojen tuottamisessa hiilihydraateista ja hiilihydraattien hyväksikäytössä. Kuitenkaan nämä erot eivät ole riittäviä, jotta kanta FERM P-6182 tulisi käsittää uudeksi lajiksi; 5 sen tähden sitä pidetään Nocardla autotrophican uutena alalajina. Vastaavasti tämä kanta nimettiin Nocardla autotrophica subsp. canberrica subsp. nov.:kel.
Subsp. FERM P-6183 poikkesi Nocardla autotrophlcasta kasvustonsa värissä 10 ja ramnoosln, sakkaroosin ja raffinoosln hyväksikäytössä. Samoin nämä erot eivät olleet riittäviä, jotta tämä kanta tulisi käsittää uudeksi lajiksi, ja siksi sitä pidetään Nocardla autotrophican alalajina. Se on nimetty Nocardla autotrophica subsp. amethystlna subsp. nov.:ksl.
15 Suvun Nocardla erilaisista mikro-organismeista, joita voidaan käyttää keksinnön menetelmässä, me erityisesti pidämme parempana käyttää näitä kolmea uutta kantaa, toisin sanoen Nocardla autotrophica FERM P-6181, Nocardla autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 tai Nocardla autotrophica subsp. amethystlna FERM P-6183.
20 Tämän keksinnön entsymaattinen hydroksylolntiprosessi voidaan suorittaa saattamalla ML-236B-yhdlste kosketukseen sukuun Nocardla kuuluvan mikro-organismin kanssa tai sen soluttaman, entsyymiä sisältävän uutteen kanssa.
25 Tämän keksinnön prosessi suoritetaan mieluummin jollakin kolmesta tavasta: (a) lisäämällä lähtöyhdlstettä ML-236B viljelmän väliaineeseen muunta- 30 van mikro-organismin viljelyn aikana, ja sitten jatkamalla viljelyä; (b) kokoamalla muuntavan mikro-organismin viljelmää, ja saattamalla kerätyt solut kosketukseen lähtöyhdlsteen ML-236B kanssa; tai 35 (c) valmistamalle solutonta, entsyymiä sisältävää uutetta muuntavan mikro-organismin soluista, ja yhdistämällä tämä uute lähtöyhdis-teen ML-236B kanssa.
i6 70925 1 Suvun Nocardia muuntavan mikro-organismin viljely voi tapahtua tavanomaisella tavalla tavanomaisessa vlljelmMn väliaineessa, joka sisältää ravintoaineita, jotka sellaisten mikro-organismien kanssa käytettäväksi hyvin tunnetaan. Siten, niinkuin hyvin tiedetään, sellainen 5 viljelmän väliaine sisältää assimiloituvan hiilen ja assimiloituvan typen lähteen ja usein epäorgaanisia suoloja. Esimerkit assimiloituvan hiilen lähteistä käsittävät glukoosin, sakkaroosin, tärkkelyksen, glyseriinin, hirssigelatiinin, melassit ja soijapapu öljyn. Esimerkit assimiloituvan typen lähteistä käsittävät soijapavun kuiva-aineen 10 (mikä käsittää karkeat ja hienot soijapapujauhot) , vehnänalkion, liha-uutteet, peptonin, maissiniiotusveden, kuivatun hiivan ja ammonium-suolat, kuten ammoniumsulfaatin. Jos on tarpeen, voidaan myös epäorgaanisia suoloja, kuten natriumkloridia, kaliumkloridia, kalsiutnkarbo-naattia tai fosfaatteja, sisällyttää mukaan.
15
Myös, jos halutaan, voidaan käyttää muita lisäaineita, jotka kykenevät edistämään hydroksylointientsyymin tuotantoa, sopivina kombinaatioina. Erityinen viljelytekniikka ei ole kriittinen keksinnön menetelmälle, ja mitä tahansa tavanomaisesti mikro-organismien viljelyyn käytettyä 20 tekniikkaa voidaan käyttää yhtäläisesti tämän keksinnön kanssa. Yleensä tietenkin käytettävä tekniikka valitaan ottamalla huomioon teollinen tehokkuus. Siten liuosviljelyä pidetään parempana, ja syväviljely-menetelmä on mukavin teolliselta näkökannalta.
25 Viljely suoritetaan tavallisesti aerobisissa olosuhteissa ja alueella 20-37°C olevassa lämpötilassa, vielä mieluummin 26-28°C:ssa.
Menetelmä (a) toteutetaan lisäämällä lähtöyhdistettä ML-236B viljelyvä-llalneeseen viljelyn kuluessa. Viljelyn aikana täsmällinen kohta, jol-30 loin lähtöyhdisteita lisätään, vaihtelee riippuen viljelyvälineestä, vällaineseoksesta, viljelyväliaineen lämpötilasta ja muista tekijöistä, mutta se on mieluummin sinä aikana, jolloin mikro-organismin hyd-rokeylointikapasiteetti alkaa lisääntyä, ja tämä on tavallisesti 2 tai 3 päivää mikro-organismin viljelyn aloittamisen jälkeen. Lisättävän 35 ML-236B-yhdisteen määrä on mieluummin 0,01-5,0 paino-% väliaineesta, vielä mieluummin 0,05-0,5, esim. 0,05-0,1, paino-Z. ML-236B-yhdisteen lisäämisen jälkeen viljelyä jatketaan aerobisesti tavallisesti lämpö- i7 70925 1 tilassa, joka on yllä esitettyjen rajojen sisällä. Viljelyä jatketaan tavallisesti 3-5 päivän ajan ML-236B-yhdlsteen lisäämisen jälkeen.
Menetelmässä (b) mikro-organismin viljely tapahtuu ensin olosuhteissa, 5 joissa saavutetaan maksimi hydrokaylointikapasiteetissa; tämä kapasiteetti saavuttaa tavallisesti maksimin 4-5 päivän välillä viljelyn aloittamisen jälkeen, vaikka tämä ajanjakso on vaihteleva riippuen väliaineen luonteesta ja lämpötilasta, mikro-orpanistnin lajista ja muista tekijöistä. Viljelmän hydroksylointikapasiteettia voidaan tark-10 käillä ottamalla näytteitä viljelmästä sopivin väliajoin, määrittämällä näytteiden hydroksylolntlkapasiteetti saattamalla ne kosketukseen ML-236B-yhdisteen kanssa vakio-olosuhteissa ja määrittämällä saatujen yhdisteiden M-4 ja M-4' määrä sekä merkitsemällä tämä kapasiteetti ajan suhteen kaaviona. Kun hydroksylolntlkapasiteetti on saavuttanut maksi-15 mipisteensä, viljely lopetetaan, ja mikrobisolut kerätään. Tämä voi tapahtua sentrlfugolmalla, suodattamalla tai samankaltaisilla erottelu-menetelmillä. Siten kerätyt viljeltävän mikro-organismin kokonaiset solut mieluummin pestään sitten sopivalla pesuliuoksella, kuten fysiologisella suolaliuoksella tai sopivalla puskuriliuoksella.
20
Suvun Nocardia mikro-organismin kerättyjen solujen saattaminen yhteen yhdisteen KL-236B kanssa suoritetaan yleensä vesiliuoksessa, esimerkiksi fosfaattlpuskurllluoksessa pH-arvossa 5-9. Reaktiolämpötila on mieluummin rajojen 20-45°C sisällä, vielä mieluummin 25-3U°C. ML-236R-25 yhdisteen konsentraatio reaktiolluoksessa on mieluummin alueen 0,01- 5,0 paino-% sisällä. Aika, joka sallitaan reaktiolle, on mieluummin 1-5 päivää, vaikka tämä voi vaihdella riippuen ML-23f>B-yhdisteen kon-sentraatiosta reaktloseoksessa, reaktlolämpötilasta, mikro-organismin hydroksylointikapasiteetiata (mikä voi tietenkin vaihdella lajista 30 lajiin ja mikä myös, kuten yllä kerrottiin, riippuu viljelyajasta) ja muista tekijöistä.
Soluton, entsyymiä sisältävä uute, jota käytetään menetelmässä (c), voidaan saada hajoittamalla koko mikro-organismin solut, jotka on saa-35 tu niin kuin kuvattiin menetelmän (b) yhteydessä, fysikaalisin tai kemiallisin keinoin, esimerkiksi jauhamalla tai ultraäänikäsittelyllä hajoitetun solumassan aikaansaamiseksi tai käsittelemällä pinta-aktiivi- ie 70925 1 eella aineella tai entsyymillä soluliuokeen tuottamiseksi. Lopullinen soluton uute yhdistetään sitten lähtöyhdisteen ML-236B kanssa samoissa olosuhteissa, kuten kuvattiin yllä menetelmän (b) yhteydessä.
5 Muuntoreaktion loppuunsaattamisen jälkeen millä tahansa yllä mainitulla menetelmällä voidaan haluttu yhdiste suoraan eristää, erottaa tai puhdistaa tavanomaisin keinoin. Esimerkiksi erottaminen ja puhdistaminen voidaan suorittaa suodattamalla reaktloseos, uuttamalla saatu suodos veteen liukenemattomalla orgaanisella liuottImellä (kuten etyy-10 lisulfaatilla), tislaamalla liuotin uutteesta, viemällä saatu raaka-tuote kromatografiapylvääseen (esimerkiksi silikageeli tai aluminium-oksidi) ja eluolmalla pylvästä sopivalla elucntilla.
Milloin mikro-organismilla muunnettu yhdiste M-4 tai M-4' ei ole tuon 15 yhdisteen haluttu muoto, voidaan konversloreaktlon tuote sitten saattaa yhteen tai useampaan jatkoreaktioon, kuten hydrolyysiin, suolan muodostamisreaktioon, esteröintiin tai laktonlsointlin, tavanomaisilla menetelmillä, kuten tässä jäljempänä kuvataan. Sellaiset llsäreak-tiot voidaan sovittaa yllä kuvattujen erottelu- ja puhdistusvaibeita 20 ennen, niiden jälkeen tai niiden aikana, mieluummin näiden vaiheiden aikana.
Keksinnön menetelmässä aktiivisella hydroksylointientsyymillä ei ole itsessään vaikutusta ML-236B-yhdisteen karboksyyliryhmään, ja siten, 25 kun muut tekijät ovat samat, ML-236B-laktoni antaisi (M-4)- ja/tai (M-4’)-laktonia, ML-236B-karboksyylihappo antaisi (M-4)- ja/tai (M—4*) — karboksyylihappoa ja ML-236B-karboksyylihapon suola tai esteri antaisi (M-4)- ja/tai (M-4')-karboksyylihapon samaa suolaa tai esteriä. Kuitenkin tähän voidaan vaikuttaa muilla tekijöillä, erityisesti reaktio-30 seoksen pH-arvolla, tavalla, mikä on ennustettavissa tavallisilla kemian laeilla. Lähtöyhdiste ML-236B voi olla kaavan (TI) vapaa ML-236B-karboksyylihappo, sen vastaava kaavan (ITa) laktoni tai suola (esim. metalli-, aminohappo- tai amiinin suola) tai sen esteri (erityisesti alkyylieeteri).
Parempina pidettyjä metalllsuoloja ovat suolat alkallmetallien kanssa, kuten natrium tel kalium, suolat maa-a.1 kallmetal 1 ien kanssa, kuten 35 i9 70925 1 kalsium, tai suolat muiden metallien kanssa, kuten magnesium, alumiini, rauta, sinkki, kupari, nikkeli tai koboltti, joista alkalimetalli-, maa-alkalimetalli-, magnesium- ja alumlniumsuoloja pidetään parempina, ja natrium-, kalsium- ja alumlniumsuoloja pidetään parhaimpina.
5
Parempina pidettyjä aminohappoja aminohapon suolojen muodostamiseksi ovat emäksiset aminohapot, kuten arglnllni, lysllnl, hlstldilnl, •<,y$-diaminobutyyrihappo tai ornltllnl.
10 Parempina pidetyt amiinit amlinlsuolojen muodostamiseksi käsittävät t-oktyyliamilnln, dibentsyyllamllnln, dikloorlheksyyllamllnln, morfo-lilnln, D-fenyyliglysilnin alkyyHesterit ja D-glukoosiamlinin.
ML-236B-esterit ovat mieluummin alkyyllestereitä, kuten metyyli-, 15 etyyli-, propyyll-, lsopropyyli-, butyyli-, isobutyyli- tai pentyyli-estereltä, joista metyyliesterlä pidetään parempana. Kuitenkin voidaan käyttää multa estereitä, jos halutaan.
ML-236B:n lähtömateriaaleista pidetään erityisesti parempana alkall-20 metalllsuoloja, esim. natrium- tai kallumsuoloja, natrlumsuolaa pidettäessä parhaimpana, sillä me olemme havainneet, että se antaa yhdisteen ML-236B parhaan muuntumisen toivotuksi M-4- tai M-4'-yhdisteeksi.
Milloin tämän keksinnön entsymaattlsella hydroksylointlmenetelmällä 25 saatu tuote on kaavan (I) karboksyyllhapon suola, voidaan itse vapaa karbokeyylihappo saada säätämällä suodoksen pH arvoon 4 tai alemmas, mieluummin arvoon 3-4. Mitä tahansa orgaanista happoa tai mineraali-happoa voidaan käyttää ottamalla huomioon, ettei sillä ole mitään haittavaikutuksia haluttuun yhdisteeseen. Esimerkit monista hapoista, 30 jotka ovat sopivia, käsittävät trifluorietikkahapon, etlkkahapon, kloorlvetyhapon ja rikkihapon. Tämä karbokeyylihappo voi itse olla haluttu tuote, tai se voidaan saattaa, ja mieluummin saatetaan, jatko-reaktlolhln, kuten jäljempänä kuvataan, valinnan mukaan sellaisten käsittelyjen jälkeen kuin uuttaminen, pesu ja dehydraatio.
Kaavan (I) karboksyyllhappojen metalllsuoloja voidaan saada saattamalla valitun metallin hydroksidia, karbonaattia tai samankaltaista reaktli- 35 20 70 9 2 5 1 vista yhdistettä vesiliuoksessa kosketukseen kaavan (I) karboksyyliha-pon kanssa. Käytettävä vesiliuos on mieluummin vettä tai se voi olla veden ja orgaanisen liuottimen seos, mieluummin alkoholin (kuten meta-noli tai etanoli), ketonln (kuten asetoni), allfaattisen hiilivedyn 5 (kuten heksaani) tai esterin (kuten etyyliasetaatti). Erityisesti me pidämme parempana käyttää hydrofUlisen orgaanisen liuottimen ja veden seosta. Sellaisten reaktioiden annetaan tapahtua tavallisesti ympäristön lämpötilassa, mutta ne voivat tapahtua, jos halutaan, kuumentamalla.
10 Kaavan (I) karboksyyllhappojen amiinisuoloja voidaan saada saattamalla kosketukseen amiini vesiliuoksessa kaavan (I) karboksyylihapon kanssa. Sopivat vesiliuokset käsittävät veden ja veden seokset alkoholien (kuten metanoli tai etanoli), eettereiden (kuten tetrahydrofuraani), nitrii-lien (kuten asetonltrllll) tai ketonien (kuten asetoni) kanssa; me eri-15 tyisesti pidämme parempana käyttää vesipitoista asetonia liuottimena tätä reaktiota varten. Reaktio suoritetaan mieluummin pH:ssa 7-8,5 ja mieluummin ympäristön lämpötilassa tai sen alapuolella, vielä mieluummin lämpötilassa 5-10°C. Reaktio menee heti loppuun. Vaihtoehtoisesti kaavan (I) karboksyylihapon metallisuola (joka on voitu saada niin kuin 20 yllä kuvattiin) voidaan liuottaa vesiliuokseen, minkä jälkeen lisätään halutun amiinin mlneraalihapon suolaa (esimerkiksi kloorivetyhapon suolaa) käyttäen samoja reaktio-olosuhteita kuin jos amiini itse reagoisi kaavan (1) karboksyylihapon kanssa, ja haluttu tuote saadaan sitten suolanvalhtoreaktiolla.
25
Kaavan (1) karboksyyllhappojen aminohapon suoloja voidaan saada saattamalla vesiliuoksessa oleva aminohappo kosketukseen kaavan (1) karboksyylihapon kanssa. Sopivat vesipitoiset liuottimet käsittävät veden ja veden seokset alkoholien (kuten metanoli tai etanoli) tai eetterien 30 (kuten tetrahydrofuraani) kanssa. Reaktio suoritetaan mieluummin kuumentamalla, esimerkiksi lämpötilassa 50-60°C.
Kaavan (I) karboksyyllhappojen eetereltä, mieluummin alkyylestereltä, voidaan saada saattamalla kaavan (I) karboksyylihappo kosketukseen sopi-35 van alkoholin kanssa. Me pidämme parempana suorittaa tämä reaktio hap-pokatalyytin kanssa, esimerkiksi mlneraalihapon (kuten suolahappo tai 2i 70925 1 rikkihappo), Lewis'n hapon (esimerkiksi boriumtrifluoridi) tai ionin-vaihtohartein kanssa.
Tähän reaktioon käytettävä liuotin ei ole kriittinen, kun otetaan huo-5 mioon, ettei se vaikuta reaktiota haittaavasti; sopivat liuottimet käsittävät bentseenln, kloroformin ja eetterit. Vaihtoehtoisesti voidaan haluttu tuote saada saattamalla kaavan (I) karboksyylihappo kosketukseen diatsoalkaanln kanssa, missä alkaaniosa voi olla substituoltu tai subs-tituoimaton. Tämä reaktio toteutetaan tavallisesti saattamalla koske-10 tukseen happo diatsoalkaanln eetterlpitolsen liuoksen kanssa. Seuraavana vaihtoehtona voidaan esteriä saada liittämällä kaavan (1) karboksyyli-hapon metallisuola halogenidin, mieluummin alkyyllhalogenidin, kanssa sopivassa lluottimessa; parempina pidetyt liuottimet käsittävät dimetyy-liformamidin, tetrahydrofuraanin, dlmetyylisulfoksldln ja asetonin.
15 Kaikki reaktiot esterien tuottamiseksi suoritetaan mieluummin lähes ympäristön lämpötilassa, vaikka jos reaktlomenetelmän luonne vaatii, voidaan reaktiot suorittaa kuumentamalla.
Kaavan (I) karboksyyllhappojen laktoneja voidaan saada saattamalla 20 kaavan (1) karboksyylihappo kosketukseen katalyyttisen määrän kanssa happoa, joka voi olla orgaaninen tai epäorgaaninen. Me pidämme parempana käyttää sellaisia orgaanisia ja mineraallhappoja kuin trifluorietikka-happo, suolahappo ja rikkihappo. Tämä reaktio suoritetaan mieluummin suunnilleen ympäristön lämpötilassa.
25
Esimerkit yhdisteiden M-A ja M-A' suoloista ja estereistä, jotka on valmistettu keksinnön menetelmällä, sisältävät yllä annetut ML-236B:n suolat ja esterit käytettäväksi lähtöaineena.
30 Siten saadut johdannaiset M-A ja M-A' voidaan eristää, erotella tai puhdistaa tavanomaisilla keinoilla, esimerkiksi adsorptiolla kantaja-aineelle (kuten aktiivihiili tai slllkageell) tai ioninvaihtokromato-grafialla tai geelisuodatuksella Sephadex-pylväällä (tavaramerkki) tai uuttamalla orgaanisella liuottimelle, kuten eetterillä, etyyllasetaa-35 tiliä tai kloroformilla; jos halutaan, ja sitä tavallisesti pidetään parempana, voidaan käyttää näiden tekniikkojen yhdistelmää.
22 70925 1 Isomeerit M-4 ja M-4' voidaan erotella toisistaan joko konversioreak-tion loppuunsaattamisen jälkeen tai missä tahansa sopivassa kohdassa reaktioiden aikana tai yllä kuvattujen erottelu- tai puhdistusprosessien aikana.
5
Keksintöä kuvataan edelleen seuraavilla esimerkeillä.
Esimerkki 1 10 Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183:n soluja ympättiin vinopintaviljelmältä platinasilmukan avulla jokaiseen kahteenkymmeneen 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, joista jokainen sisälsi 100 ml viljelyliuosta, jolla oli seuraava kokoonpano (prosentit ovat paino/ tilavuus): 15
Glukoosi 1,0%
Peptoni 0,2%
Lihauute 0,1%
Hiivauute 0,1% 20 Maissinliotusvesi 0,3%
Vesijohtovesi loput (pH:ta ei säädetty)
Viljelmää ravisteltiin 26°C:esa ja 220 r.p.rarssä kahden päivän ajan, 25 missä ajassa lisättiin natrium-(ML-236B)-karboksylaattia loppukonsen-traatioon 0,05% (paino/tilavuus) asti. Inkubointia jatkettiin 26°C:ssa ja 220 r.p.m:ssä seuraavat 5 päivää.
Viljelyn loppuun saattamisen jälkeen reaktioseos suodatettiin, ja suo-30 doksen pH säädettiin arvoon 3 lisäämällä trifluorietikkahappoa. Happamaksi tehty suodos uutettiin sitten kolme kertaa kullakin kerralla 1 litran kanssa etyyliasetaattia, mikä antoi uutteet, jotka sisälsivät (M-4)- ja (M-4')-karboksyylihapon seosta. Otettiin näytteitä näistä uutteista, ja niihin käytettiin ohutkerroskromatograflaa silika-35 geelilevyllä Art 5715 (valmistanut Merck / Co. Tnc.), kehitettiin 50:50:3-tllavuussuhteessa bentseenin, asetonin ja etikkahapon seosta. (M-4)-karboksyylihapon Rf-arvo oli 0,45, ja (M-4')-karboksyylihapon 23 70925 1 Rf-arvo oli 0,46.
Koko loppu-uute pestiin kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, minkä jälkeen lisättiin ekvivalentti moolimäärä diatsometaanin eetteripitois-5 ta liuosta huoneenlämpötilassa. Seoksen annettiin seistä 30 minuuttia, minkä jälkeen se haihdutettiin kuivaksi alipaineessa. Jäännös laitettiin Lobarin kolonniin (Si 60, valmistanut Merck / Co. Inc., koko A), mitä sitten eluoltiin 1:1 tilavuussuhteise]la seoksella bentseeniä ja etyyliasetaattia. Saatiin erotellut fraktiot, jotka sisälsivät metyyii-10 (M-4)-karboksylaattia ja metyyli-(M-4')-karboksylaattia. Nämä fraktiot konsentroitiin haihduttamalla alipaineessa, mikä antoi 320 g metyyli-(M-4)-karboksylaattia ja 11 mg metyyli-(M-4’)-karboksylaattia, molemmat värittömien Öljyjen muodossa.
15 Korvaamalla diatsometaani yllä kuvatussa menettelyssä muilla sopivilla diatsoalkaaneilla voidaan saada muita (M-4)-karboksyylihapon ja (M-4')-karboksyylihapcn estereitä.
Metyyli-(M-4)-karboksylaatln fysikaalisia ominaisuuksia 20 kuvataan seuraavaksi.
Ydinmagneettinen resonanssispektri (deuteriumkloroformissa käyttäen tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, 200 MHz:ssa), & ppm: 25 0,88 (3H, tripletti, J * 7,3 Hz); 0,89 (3H, dupletti, J - 6,5 Hz); 1,12 (3H, dupletti, J * 6,8 Hz); 1,1-1*7 (10H, multipletti); 30 2,34 (1H, sekstetti, J « 7 Hz); 2,3-2,5 (2H, multipletti); 2,49 (2H, dupletti, J * 6,4 Hz); 2,58 (1H, multipletti); 3,72 (3H, singletti); 35 3,78 (1H, multipletti); A,25 (1H, kvintetti, J - 7 Hz); 4,40 (1R, multipletti); 24 70925 1 5,42 (1H, multipletti); 5,56 (1H, multipletti); 5.90 (1H, dupletti dupletelsta, J ·= 9,8 ja 5,6 Hz); 5,99 (1H, dupletti, J = 9,8 Hz), 5
Massaspektri: Silyloinnin jälkeen N ,Q-bis(trimetyylisilyyli)t:rif lnori-asetamidilla tehtiin mittaus käyttäen D-300 -tyyppistä laitetta, Jonka on valmistanut Nihon Electronics Co.
10 M/e: 654 (M+), 552, 462, 372, 290, 272, 233, 231.
Ultraviolettiabsorptiospektri (etanoli) λ nm: max 230,1, 237,3, 246,4.
15 Infrapuna-absorptiospektri (ohut kalvo) ^max cm 3400, 2950, 1730.
Ohutkerroskromatografia: Silikageelilevyllä Art 5715, valmistanut Merck / Co. Inc., käyttäen 1:1 tilavuussuhteessa bentseenln ja aseto-20 nln seosta kehityslluoksena.
Rf-arvo: 0,88.
Seuraavaksi kuvataan mgtyyli-(M-4*)-karboksylaatin fysikaalisia ominaisuuksia.
25
Ydinmagneettinen resonansslspektri (deuteriumkloroformlssa käyttäen tetrametyylisilaanla sisäisenä standardina, 60 MHz:ssa) S ppm: 30 3,70 (3H, singletti); 5,50 (1H, leveä singletti); 5,75 (1H, leveä singletti); 5.90 (1H, kvartetti); 6,01 (1H, dupletti).
Ultraviolettiabsorptiospektri (metanoli) Λ nm: max 230, 238, 246.
35 25 70925 1 Infrapuna-absorptlospektri (ohut kalvo) ^max cm *: 3400, 1730.
Massaspektri: Silyloinnin jälkeen N,Q~hls(trimetyyllsllyyll)trifluorl-5 asetamldilla tehtiin mittaus käyttäen D-300-tyyppistä laitetta, jonka on valmistanut Nihon Electronic Co.
M/e: 654 (M+).
Alkuaineanalyysi: 10 Laskettu Co.Hoo0,:lie: C, 65,73%; H, 8,73%.
Zh jo / Löydetty: C, 65,55%; H 8,79%.
Esimerkki 2 15 Esimerkissä 1 kuvattu menettelytapa toistettiin, mikä antoi 1,9 litraa konversioreaktlon seosta. Tämän seoksen pH asetettiin sitten arvoon 3,0 lisäämällä trlfluorletikkahappoa, minkä jälkeen seosta uutettiin kolme kertaa, kullakin kerralla 1 litralla etyyliasetaattia, mikä antoi fraktion, joka sisälsi sekä (M-4)-karboksyylihappoa että (M-4')-20 karboksyylihappoa.
Tämä uute pestiin sitten kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, minkä jälkeen se kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla. Sitten lisättiin katalyyttinen määrä trifluorletikkahappoa laktonisoinnin alkaan-25 saamiseksi. Saatu seos pestiin sitten 5%:11a (paino/tilavuus) natrium-vetykarbonaatin vesiliuoksella, minkä jälkeen se kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla, ja sitten ee haihdutettiin kuivaksi, mikä antoi laktonifraktion.
30 Tämä laktonifraktlo laitettiin Lobarln kolonniin (Si 60, valmistanut
Merck / Co. Inc., koko A) Ja eluoitiln 7:3 tilavuuesuhtelsella bentsee-nin ja asetonin seoksella, mikä antoi erotetut fraktiot, jotka sisälsivät (M-4)-laktonia ja (M-4')-laktonia. Nämä fraktiot uudelleenkiteytet-tiin erikseen etyyliasetaatilla, mikä antoi 270 mg (M-4)-laktonia ja 35 8 mg (M-4')-laktonia.
Seuraavaksi esitetään (M-4)-laktonln fysikaalisia ominaisuuksia.
26 70925 1 Ydinmagneettinen resonanssispektri (deuteriumkloroformissa käyttäen tetrametyylisilaania sisäisenä standardina» 100 MHz:saa) 6 ppm: 5 4,38 (1H, multipletti); 4.41 (1H, multipletti); 4,62 (1H, multipletti); 5.41 (1H, multipletti); 5,58 (1H, multipletti); 10 5,90 (1H, kvartetti); 6,01 (1H, dupletti).
Ultraviolettiabsorptiospektri (metanoli) Tv nm: 230, 236,7, 244,6.
15
Infrapuna-absorptiospektri (ohut kalvo) U cm 3400, 2950, 1725.
Ohutkerroskromatografia: Silikageelilevyllä Art 5715, valmistanut 20 Merck / Co. Inc., käyttäen 50:50:3 tilavuussuhteessa bentseenin, asetonin ja etikkahapon seosta kehitysliuoksena.
Rf-arvo: 0,62.
Seuraavaksi kuvataan (M-4*)-laktonin fysikaalisia ominaisuuksia.
25
Ydinmagneettinen resonanssispektri (deuteriumklorofomissa käyttäen tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, 100 MHz:ssa) S ppm: 30 4,25 (1H, multipletti); 4,60 (1H, multipletti); 5,50 (1H, multipletti); 5,75 (1H, multipletti); 5,90 (1H, kvartetti); 35 6,01 (1H, dupletti).
27 709 2 5 1 Ultraviolettiabsorptiospektri (metanoli) Λ χ nm: 230, 237, 245.
Infrapuna-absorptiospektri (KBr) ^max cm 5 3500, 1720.
Massaspektrl: M/e 406 (M+), 304, 286.
Optinen kiertokyky: 10 = = p>66, metanoli).
Sulamispiste: 141-143°C.
Alkuaineanalyysi: 15 Laskettu c23H34°6:lle: C, 67,95%; H, 8,43%.
Löydetty: C, 68,05%; H, 8,37%.
Ohutkerroskromatografia: Silikageelilevyllä Art 5715, valmistanut Merck / Co. Inc., käyttäen 1:1 tilavuussuhteessa bentseenin ja aseto-20 nin seosta kehityslluoksena.
Rf-arvo: 0,64.
Esimerkki 3 25 Esimerkissä 1 kuvattu menettelytapa toistettiin uuttamiseen asti, ja tämä mukaan lukien, kolmella etyyliasetaattierällä, mikä antoi uutteen, joka sisälsi sekä (M-4)-karboksyylihappoa että (M-4')-karboksyylihappoa.
Tämä uute siirrettiin sitten välittömästi 5%reen (paino/tilavuus) nat-30 riumvetykarbonaatln vesiliuokseen, ja seoksen pH asetettiin arvoon 7,0 lisäämällä 2N kloorivetyhappoa. Seos adsorboitiin sitten Dlalon HP-20-kolonniin (valmistanut Mitsubishi Chemical Industries). Kolonnia pestiin vedellä ja sitten eluoitiin 50 tilavuus-Zrlla vesipitoisella asetonilla, mikä antoi fraktion, joka sisälsi natrium-(M-4)-karboksylaattia. Tämä 35 pakastekuivattiin, mikä antoi 200 mg natrium-(M-4)-karboksylaattia.
28 70925 1 Seuraavaksi on kuvattu natrlum-(M-4)-karboksylaatin fysikaalisia ominaisuuksia.
Ydinmagneettinen resonanssispektri (deuterlummetanoliesa kHyttöen tetru-5 metyylisilaania sisäisenä standardina, 200 MHz:ssa) & ppm: 0,91 (3H, tripletti, J = 7,5 Hz); 0,92 (3H, duplettl, J = 7 Hz); 10 1*12 (3H, dupletti, J - 7 Hz); 1.1- 1,8 (10H, multipletti); 2,25 (1H, dupletti dupleteista, J >* 15 / 7,6 Hz); 2,34 C1H, dupletti dupleteista, J ** 15 / 5,5 Hz); 2.2- 2,4 (3H, multipletti); 15 2,48 (1K, multipletti); 3,68 (1H, multipletti); 4,07 (1H, multipletti); 4,28 (1H, multipletti); 5,36 (1H, multipletti); 20 5,48 (1H, dupletti dupleteista, J *= 3 / 2 Hz); 5,88 (1H, dupletti dupleteista, J 9,6 /5,3 Hz); 5,98 (1H, dupletti, J - 9,8 Hz).
Ultraviolettiabsorptiospektri (metanoli) ^max nm: 25 230,0, 237,2, 245,0.
Infrapuna-absorptiospektri (KBr) u cm 3400, 2900, 1725, 1580.
30 Ohutkerroskromatografla: Silikageelllevyllä Art 5715, valmistanut
Merck / Co. Inc., käyttäen 50:50:3 tilavuussuhteessa bentseenin, asetonin ja etyyliasetaatin seosta kehityslluoksena.
Rf-arvo: 0,45.
35 il 70925 29 1 Esimerkki 4
Esimerkeissä 1-3 kuvatut menettelytavat toistettiin, mutta käyttäen kantaa Nocardia autotrophica FERM P-6181 kannan Nocardia autotrophlca 5 subsp. amethystine FERM P-6183 tilalla; saatiin: 150 mg metyyli-(M-4)-karboksylaattia; 37 mg metyyli-(M-4')-karboksylaattia; 140 mg (M-4)-laktonia; 30 mg (M-4')-laktonia; ja 110 mg natrium-(M-4)-karboksylaattia. Kussakin tapauksessa tuotteiden ominaisuudet olivat samat esimerkeissä 1-3 saatujen vastaavien yhdisteiden kanssa.
10
Esimerkki 5
Silmukal1 itien viljelmää Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 ympättiin kuhunkin kahteenkymmeneen 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, 15 joista jokainen sisälsi 100 ml liuosta, jolla oli seuraava kokoonpano (prosentit ovat paino/tilavuus):
Glyseriiniä 0,5%
Sakkaroosia 2,0% 20 Soijapapujauhoja 1,0%
Puristettua hiivaa 1,0%
Maissinliotusvettä 0,5%
Kobolttikloridia 0,001%
Vesijohtovettä loput 25 (pH 7,0)
Viljelmän ravistelua jatkettiin 26°C:ssa ja 220 r.p.mtssä 2 päivää, missä ajassa lisättiin natrium-(ML-236B)-karboksylaattia lopulliseen konsentraatioon 0,05% (paino/tilavuus) asti. Viljelyä jatkettiin sit-30 ten 26°C:ssa ja 220 r.p.m:ssä seuraavat 5 päivää. Konversiorenktion seos suodatettiin sitten, ja suodoksen pH asetettiin arvoon 3,0 lisäämällä kloorivetyhappoa. Seos uutettiin sitten kolme kertaa, kullakin kerralla 1 litralla etyyliasetaattia, mikä antoi uutteen, joka sisälsi sekä (M-4)-karboksyylihappoa että (M-4’)-karboksyyllhappoa, joiden 35 osoitettiin ohutkerroskromatografiällä olevan identtisiä esimerkin 1 vastaavien tuotteiden kanssa.
30 70925 1 Tätä uutetta käsiteltiin sitten edelleen, kuten esimerkissä 1 kuvattiin, mikä antoi 180 mg metyyli-(M-4)-karboksylaattia ja 110 mg metyyli-(M-4')-karboksylaattia.
5 Esimerkki 6
Esimerkissä 5 kuvattu menettelytapa toistettiin (M-4)-karboksyylihap-poa ja (M-4')-karboksyylihappoa sisältävän uutteen valmistukseen asti, ja käsittäen myfis valmistuksen. Tätä uutetta käsiteltiin sitten niin 10 kuin esimerkissä 2 kuvattiin, mikä antoi 170 mg (M-4)-laktonia ja 90 mg (M-4')-laktonia.
Esimerkki 7 15 Silmuksilinen viljelmää Nocardia autotrophica subsp. amethystina PERM P-6183 ympättiin kymmeneen 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, joista jokainen sisälsi 100 ml liuosta, jolla oli seuraava kokoonpano (prosentit ovat paino/tilavuue): 20 Glukoosia 1,0%
Peptonla 0,2%
Lihauutetta 0,1%
Hiivauutetta 0,1%
Vesijohtovettä loput 25 (pH:ta ei säädetty).
Viljelmää ravisteltiin 26°C:ssa ja 220 r.p.m:ssä 5 päivän ajan, minkä jälkeen kaikki mikrobisolut kerättiin erottamalla sentrifuugil-la. Kerätyt solut pestiin 0,1 M fosfaattipuskuriiiuoksella (pH 7,0), 30 ja sitten ne jälleen kerättiin ja suspendoitlln 900 ml:aan 0,1 M fos-faattipuskuriliuosta. Tähän suspensioon lisättiin natrium-(ML-236B)-karboksylaattia konsentraatioksi 0,5 g/100 ml, ja sitten seosta in-kuboitiin 26°C:ssa ja 220 r.p.mtssä 5 päivää. Tämän ajan päätyttyä konversioseos suodatettiin, Ja sen pH asetettiin arvoon 3,0 lisäämäl-35 lä kloorivetyhappoa. Seos uutettiin sitten kolme kertaa, kullakin kerralla 1 litralla etyyliasetaattia, mikä antoi uutetta, joka sisälsi (M-4)-karboksyylihappoa ja (M-4')-karboksyylihappoa, jotka tunnistet- 3i 709 2 5 1 tiin ohutkerroskromatografisesti ja joiden osoitettiin olevan samoja kuin esimerkin 1 vastaavat tuotteet.
Esimerkki 8 5
Esimerkissä 2 kuvattu menettelytapa toistettiin, paitsi että käytettiin taulukossa 6 lueteltuja mikro-organismeja; saadun (M-4)-laktonin määrä on sellainen kuin taulukossa esitetään.
10 TAULUKKO 6
Mikro-organismi (M-4)-laktonin määrä (mg) 15 Nocardla farclnlca ATCC 3318 7
Nocardla coellaca ATCC 17040 5
Nocardla autotrophlca IFO 12743 10
Nocardla asteroldes IFO 3424 15 20
Esimerkki 9
Soluja Nocardla autotrophlca subsp. amethystine FERM P-6183 ympättiin vinopintavlljelmältä platlnasllmukalla jokaiseen kahteenkymmeneen 25 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, joista jokainen sisälsi 100 ml viljely- liuosta, jolla on esimerkissä 7 annettu kokoonpano. Viljelmää ravisteltiin sitten 26°C:88a ja 220 r.p.m:ssä 2 päivän ajan, missä ajassa lisättiin natrium-(ML-236B)-karboksylaattia loppukonsentraatioksi 0,4Z (paino/tilavuus). Inkubointia jatkettiin 26°C:ssa ja 220 r.p.m:ssä 30 seuraavat 5 päivää. Esimerkissä 2 kuvattu menettelytapa toistettiin sitten, mikä antoi 2,9 g (M-4)-laktonla.
35

Claims (8)

32 70925
1. Menetelmä kaavan (I) mukaisen lääkeaineena käyttökelpoisen yhdisteen: 5 HOOC^ γ H O Πχ 1° I L π (I) η2ο^ί; 9 h I
15 Her (missä λπΑΛοη edustaa ryhmää *^·ββ OH tai f/f IM OH), sen farma-20 seuttisesti hyväksyttävien suolojen ja esterien sekä vastaavien suljetun renkaan omaavien laktonlen valmistamiseksi, saattamalla yhdiste ML-236B, joka on kaavan II mukainen 25 .OH hooca y • H <«>
30 H3C/T 9 h? I I f 1 JZHz 35 33 7 0 9 2 5 1 (ML-236B)-karboksyylihappo tai sen suola, kosketukseen hydrokeylointient-syymln kanssa, tunnettu silti, että hydroksylointlentsyyml on tuotettu suvun Nocardla mikro-organismi11a; jos on tarpeen, viemällä saatu tuote yhteen tai useampaan reaktioon, joka on suolan muodostus, 5 esteröinti tai laktonlsolntl; ja eristämällä tuote reaktloseokseeta.
1 Patenttivaatimukset
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että kyseinen ML-236B-yhdlste saatetaan kosketukseen hydroksylolntlentsyymln kanssa viljelemällä suvun Nocardla mlkro-organlsmla liuoksessa, joka 10 sisältää ML-236B-yhdlstettä.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suvun Nocardla mlkro-organlsmln kokonaiset solut saatetaan kosketukseen ML-236B-yhdlsteen kanssa. 15
4. Patenttivaatimuksen 1,2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että mainittu mikro-organismi on Nocardla auto- trophica, Nocardla asteroldes, Nocardla farclnlca tai Nocardla coellaca. 20
5. Patenttivaatimuksen 1,2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että kyseinen mikro-organismi on: Nocardla autotrophlca FERM P-6181 25 Nocardla autotrophlca subsp. canberrlca FERM P-6182 Nocardla autotrophlca subsp. amethystine FERM P-6183 Nocardla autotrophlca IFO 12743 Nocardla asteroldes IFO 3424 Nocardla farclnlca ATCC 3318 ja 30 Nocardla coellaca ATCC 17040.
6. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että valmistetaan yhdiste M-4, missä edustaa ryhmää -^41 OH. 35 34 70925
7. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste M-4', missä rWirvjpil, edustaa ryhmää HMUOH.
8. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (I) mukaisen yhdisteen natriumsuola. 10 15 20 25 30 35 35 70925
FI823978A 1981-11-20 1982-11-19 Foerfarande foer framstaellning av 3-hydroxy-ml-236b-derivaterm-4 och m4' FI70925C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP56186641A JPS5889191A (ja) 1981-11-20 1981-11-20 ３−ヒドロキシ−ｍｌ−２３６ｂ誘導体の製造法
JP18664181 1981-11-20

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI823978A0 FI823978A0 (fi) 1982-11-19
FI823978L FI823978L (fi) 1983-05-21
FI70925B true FI70925B (fi) 1986-07-18
FI70925C FI70925C (fi) 1986-10-27

Family

ID=16192138

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI823978A FI70925C (fi) 1981-11-20 1982-11-19 Foerfarande foer framstaellning av 3-hydroxy-ml-236b-derivaterm-4 och m4'

Country Status (18)

Country Link
US (1) US4537859A (fi)
JP (1) JPS5889191A (fi)
KR (1) KR880002483B1 (fi)
AT (1) AT387585B (fi)
AU (1) AU551720B2 (fi)
BE (1) BE895080A (fi)
CA (1) CA1186647A (fi)
CH (1) CH651065A5 (fi)
DE (1) DE3242849A1 (fi)
DK (1) DK159328C (fi)
ES (1) ES517542A0 (fi)
FI (1) FI70925C (fi)
FR (1) FR2516935A1 (fi)
GB (1) GB2111052B (fi)
IT (1) IT1191235B (fi)
NL (1) NL194373C (fi)
SE (1) SE453996B (fi)
ZA (1) ZA828535B (fi)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3682557D1 (de) * 1985-09-13 1992-01-02 Sankyo Co Hydroxy-ml-236b-derivate, deren herstellung und anwendung.
US5116870A (en) * 1986-06-23 1992-05-26 Merck & Co., Inc. HMG-CoA reductase inhibitors
US4940727A (en) * 1986-06-23 1990-07-10 Merck & Co., Inc. Novel HMG-CoA reductase inhibitors
USRE36481E (en) * 1986-06-23 2000-01-04 Merck & Co., Inc. HMG-CoA reductase inhibitors
US4833258A (en) * 1987-02-17 1989-05-23 Merck & Co., Inc. Intermediates useful in the preparation of HMG-COA reductase inhibitors
EP0306263B1 (en) * 1987-09-02 1992-03-18 Merck & Co. Inc. Novel hmg-coa reductase inhibitors
US4997848A (en) 1987-10-27 1991-03-05 Sankyo Company, Limited Octahydronaphthalene oxime derivatives for cholesterol synthesis inhibition
US4997755A (en) * 1988-04-15 1991-03-05 Merck & Co., Inc. HMG-CoA reductase inhibitors produced by Nocardia sp. (MA 6455)
EP0337548A3 (en) * 1988-04-15 1991-08-14 Merck & Co. Inc. HMG-COA reductase inhibitors produced by nocardia SP. (MA6455)(ATCC 53695)
US4963538A (en) * 1988-06-29 1990-10-16 Merck & Co., Inc. 5-oxygenated HMG-CoA reductase inhibitors
US4970231A (en) * 1989-06-09 1990-11-13 Merck & Co., Inc. 4-substituted HMG-CoA reductase inhibitors
US5041562A (en) * 1989-06-09 1991-08-20 Merck & Co., Inc. 3-keto HMG-CoA reductase inhibitors
US5001241A (en) * 1989-06-09 1991-03-19 Merck & Co., Inc. 3-KETO HMG-CoA reductase inhibitors
US5010105A (en) * 1989-06-09 1991-04-23 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
US4937259A (en) * 1989-06-09 1990-06-26 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
US4965200A (en) * 1989-06-23 1990-10-23 Merck & Co., Inc. Process for the preparation of 3-keto, 5-hydroxy simvastatin analogs
US4997849A (en) * 1989-06-23 1991-03-05 Merck & Co., Inc. Microbial transformation of simvastatin
US5112857A (en) * 1990-09-04 1992-05-12 Merck & Co., Inc. Hmg-coa reductase inhibitor metabolites
NZ250609A (en) * 1992-12-28 1995-07-26 Sankyo Co Hexahydronaphthalene esters and ring closed lactones; preparation and medicaments
US6043064A (en) * 1993-10-22 2000-03-28 Bristol-Myers Squibb Company Enzymatic hydroxylation process for the preparation of HMG-CoA reductase inhibitors and intermediates thereof
US5942423A (en) 1995-06-07 1999-08-24 Massachusetts Institute Of Technology Conversion of compactin to pravastatin by actinomadura
SI9800144A (sl) * 1998-05-21 1999-12-31 LEK, tovarna farmacevtskih in kemičnih izdelkov, d.d. Nov biotehnološki postopek pridobivanja 3-hidroksi-ML-236B derivatov poznanih kot M-4 in M-4'
SI20305A (sl) * 1999-08-06 2001-02-28 LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. Kristali natrijeve soli pravastatina
CZ20012622A3 (cs) 1999-01-20 2002-01-16 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Proces přípravy inhibitorů HMG-CoA reduktázy
US7049111B1 (en) * 1999-01-29 2006-05-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing HMG-CoA reductase inhibitor
US6682913B1 (en) * 1999-02-03 2004-01-27 Institute For Drug Research Ltd. Microbial process for preparing pravastatin
HUP9902352A1 (hu) * 1999-07-12 2000-09-28 Gyógyszerkutató Intézet Kft. Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására
CN1468098A (zh) * 2000-10-05 2004-01-14 �ݰ¸Ƕ�ҩ�����޹�˾ 基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠和包含普伐他汀钠的组合物
JP3236282B1 (ja) * 2000-10-16 2001-12-10 三共株式会社 プラバスタチンを精製する方法
JP2003093045A (ja) * 2001-09-26 2003-04-02 Godo Shusei Co Ltd 有用変換微生物
WO2003088900A2 (en) * 2002-04-16 2003-10-30 Merck & Co., Inc. Solid forms of salts with tyrosine kinase activity
US20040198800A1 (en) * 2002-12-19 2004-10-07 Geoffrey Allan Lipoxygenase inhibitors as hypolipidemic and anti-hypertensive agents
US20040132771A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-08 Pfizer Inc Compositions of choleseteryl ester transfer protein inhibitors and HMG-CoA reductase inhibitors
DE60331873D1 (de) 2002-12-20 2010-05-06 Pfizer Prod Inc Dosierungsform enthaltend einen CETP-Hemmer und einen HMG-CoA Reduktase Hemmer
KR100470078B1 (ko) * 2003-06-12 2005-02-04 씨제이 주식회사 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환할 수 있는 스트렙토마이세스 종(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.)ＣＪＰＶ 975652 및 그를 이용한 프라바스타틴의 제조방법
EP1673336B1 (en) 2003-08-21 2014-06-04 Merck Canada Inc. Cathepsin cysteine protease inhibitors
US20050101927A1 (en) * 2003-09-11 2005-05-12 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Absorbent products comprising a moisturizing and lubricating composition
WO2005051298A2 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Metabasis Therapeutics, Inc. Novel phosphorus-containing thyromimetics
TWI252253B (en) * 2004-01-09 2006-04-01 Chinese Petroleum Corp A novel Pseudonocardia sp RMRC PAH4 and a process for bioconverting compactin into pravastatin using the same
US20110217412A1 (en) * 2004-07-30 2011-09-08 Jinis Biopharmaceuticals Co. Cholesterol lowering supplement and low cholesterol egg produced by using the same
KR100637762B1 (ko) * 2004-07-30 2006-10-23 주식회사 지니스 저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 가금류용 사료첨가제 및 이를 이용한 저콜레스테롤 란의 생산방법
TWI307360B (en) 2004-12-03 2009-03-11 Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag Process for constructing strain having compactin hydroxylation ability
WO2006062876A2 (en) 2004-12-09 2006-06-15 Merck & Co., Inc. Estrogen receptor modulators
EP1855674B1 (en) 2005-03-02 2014-07-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Composition for inhibition of cathepsin k
ATE550019T1 (de) 2005-05-17 2012-04-15 Merck Sharp & Dohme Cis-4-ä(4-chlorophenyl)sulfonylü-4-(2,5- difluorophenyl)cyclohexanepropansäure zur behandlug von krebs
PE20070427A1 (es) * 2005-08-30 2007-04-21 Novartis Ag Compuestos derivados de benzimidazoles sustituidos como inhibidores de tirosina quinasas
GB0603041D0 (en) 2006-02-15 2006-03-29 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic compounds
TW200813039A (en) 2006-04-19 2008-03-16 Novartis Ag 6-O-substituted benzoxazole and benzothiazole compounds and methods of inhibiting CSF-1R signaling
CA2664113C (en) 2006-09-22 2013-05-28 Merck & Co., Inc. Use of platencin and platensimycin as fatty acid synthesis inhibitors to treat obesity, diabetes and cancer
US20110218176A1 (en) 2006-11-01 2011-09-08 Barbara Brooke Jennings-Spring Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
PL2109608T3 (pl) 2007-01-10 2011-08-31 Msd Italia Srl Indazole podstawione grupą amidową jako inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy)-(PARP)
WO2008106692A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Pim kinase inhibitors and methods of their use
KR20100017866A (ko) 2007-05-21 2010-02-16 노파르티스 아게 Ｃｓｆ－１ｒ 억제제, 조성물 및 사용 방법
CA2690191C (en) 2007-06-27 2015-07-28 Merck Sharp & Dohme Corp. 4-carboxybenzylamino derivatives as histone deacetylase inhibitors
EP2489656A1 (en) 2007-12-21 2012-08-22 Ligand Pharmaceuticals Inc. Selective androgen receptor modulators (sarms) and uses thereof
EP2265725B1 (en) * 2008-04-25 2014-07-30 Amorepacific Corporation Method for preparing 7,5,3',4'-tetrahydroxyisoflavone using a biotransformation system
US20120046364A1 (en) 2009-02-10 2012-02-23 Metabasis Therapeutics, Inc. Novel Sulfonic Acid-Containing Thyromimetics, and Methods for Their Use
WO2010114780A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of akt activity
BR112012008849A2 (pt) 2009-10-14 2015-09-22 Schering Corp composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto
EP2584903B1 (en) 2010-06-24 2018-10-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel heterocyclic compounds as erk inhibitors
CN103068980B (zh) 2010-08-02 2017-04-05 瑟纳治疗公司 使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（CTNNB1）基因表达的抑制
SI2606134T1 (sl) 2010-08-17 2019-08-30 Sirna Therapeutics, Inc. RNA-INTERFERENČNO POSREDOVANO ZAVIRANJE IZRAŽANJA GENA VIRUSA HEPATITISA B (HBV) Z UPORABO KRATKE INTERFERENČNE NUKLEINSKE KISLINE (siNA)
US8883801B2 (en) 2010-08-23 2014-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted pyrazolo[1,5-a]pyrimidines as mTOR inhibitors
WO2012030685A2 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Schering Corporation Indazole derivatives useful as erk inhibitors
EP2615916B1 (en) 2010-09-16 2017-01-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused pyrazole derivatives as novel erk inhibitors
DK2632472T3 (en) 2010-10-29 2018-03-19 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERRING NUCLEIC ACIDS (SINA)
WO2012087772A1 (en) 2010-12-21 2012-06-28 Schering Corporation Indazole derivatives useful as erk inhibitors
EP2675440B1 (en) 2011-02-14 2020-03-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Cathepsin cysteine protease inhibitors
IN2013MN02170A (fi) 2011-04-21 2015-06-12 Piramal Entpr Ltd
EP2770987B1 (en) 2011-10-27 2018-04-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel compounds that are erk inhibitors
EP3919620A1 (en) 2012-05-02 2021-12-08 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
JP6280554B2 (ja) 2012-09-28 2018-02-14 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． Ｅｒｋ阻害剤である新規化合物
PL2925888T3 (pl) 2012-11-28 2018-03-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Kompozycje i sposoby do stosowania w leczeniu nowotworów
WO2014100065A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted imidazopyridines as hdm2 inhibitors
WO2014120748A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Merck Sharp & Dohme Corp. 2,6,7,8 substituted purines as hdm2 inhibitors
US20160194368A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
CN105593230B (zh) 2013-10-08 2018-07-06 默沙东公司 组织蛋白酶半胱氨酸蛋白酶抑制剂
WO2015051479A1 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Cathepsin cysteine protease inhibitors
US10441567B2 (en) 2014-01-17 2019-10-15 Ligand Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for modulating hormone levels
WO2015120580A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 Merck Sharp & Dohme Corp. Cathepsin cysteine protease inhibitors
JO3589B1 (ar) 2014-08-06 2020-07-05 Novartis Ag مثبطات كيناز البروتين c وطرق استخداماتها
US10975084B2 (en) 2016-10-12 2021-04-13 Merck Sharp & Dohme Corp. KDM5 inhibitors
US10947234B2 (en) 2017-11-08 2021-03-16 Merck Sharp & Dohme Corp. PRMT5 inhibitors
WO2020033284A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
US11993602B2 (en) 2018-08-07 2024-05-28 Merck Sharp & Dohme Llc PRMT5 inhibitors
BR112022012032A2 (pt) 2019-12-17 2022-09-06 Merck Sharp & Dohme Llc Inibidores de prmt5
WO2024180169A1 (en) 2023-03-02 2024-09-06 Carcimun Biotech Gmbh Means and methods for diagnosing cancer and/or an acute inflammatory disease

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3392171A (en) * 1964-03-20 1968-07-09 Upjohn Co 4-morpholino-4'-hydroxy bicyclohexyls
US3281330A (en) * 1964-03-20 1966-10-25 Upjohn Co Microbiological process for the oxygenation of cycloalkanes
MX7065E (es) * 1980-06-06 1987-04-10 Sankyo Co Un procedimiento microbiologico para preparar derivados de ml-236b

Also Published As

Publication number Publication date
ATA425182A (de) 1988-07-15
AU9061082A (en) 1983-05-26
DK159328C (da) 1991-02-25
DK159328B (da) 1990-10-01
ES8402350A1 (es) 1984-01-16
US4537859A (en) 1985-08-27
NL8204505A (nl) 1983-06-16
BE895080A (fr) 1983-03-16
SE8206580D0 (sv) 1982-11-18
SE453996B (sv) 1988-03-21
GB2111052B (en) 1985-05-09
DK516182A (da) 1983-05-21
AT387585B (de) 1989-02-10
SE8206580L (sv) 1983-05-21
DE3242849C2 (fi) 1989-01-05
ES517542A0 (es) 1984-01-16
FI70925C (fi) 1986-10-27
FR2516935B1 (fi) 1985-02-08
IT1191235B (it) 1988-02-24
DE3242849A1 (de) 1983-06-01
KR840002451A (ko) 1984-07-02
JPS5889191A (ja) 1983-05-27
CA1186647A (en) 1985-05-07
FI823978A0 (fi) 1982-11-19
CH651065A5 (de) 1985-08-30
GB2111052A (en) 1983-06-29
FR2516935A1 (fr) 1983-05-27
FI823978L (fi) 1983-05-21
IT8268359A0 (it) 1982-11-22
ZA828535B (en) 1983-10-26
KR880002483B1 (ko) 1988-11-19
NL194373C (nl) 2002-02-04
AU551720B2 (en) 1986-05-08
JPH0371116B2 (fi) 1991-11-12
NL194373B (nl) 2001-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI70925B (fi) Foerfarande foer framstaellning av 3-hydroxy-ml-236b-derivater
Iwai et al. Production of deoxyfrenolicin and a new antibiotic, frenolicin B by Streptomyces roseofulvus strain AM-3867
US5153124A (en) Hydroxyl-ml-236b derivatives, their preparation and use
US4421687A (en) Macbecin derivatives
US4421688A (en) Macbecin derivatives
EP0404581A3 (en) Process for the preparation of 3-keto, 5-hydroxy simvastatin analogs
US4540517A (en) Antibiotic TAN-420
US4199514A (en) Compound, frenolicin B which is useful as an antibiotic
GB2106111A (en) Macbecin derivatives and their production
US5719179A (en) Compound GEX1
US4997755A (en) HMG-CoA reductase inhibitors produced by Nocardia sp. (MA 6455)
US4351769A (en) Antibiotic composition of matter
US5272174A (en) Hydroxy-ML-236B derivatives, their preparation and use
EP0381478A1 (en) Process for the preparation of 6-alpha-hydroxymethyl lovastatin derivatives
Bava et al. Biotransformation of spirolaxine by Absidia cuneospora and Trametes hirsuta: formation of β-glycosyl and β-xylosyl derivatives
EP0337548A2 (en) HMG-COA reductase inhibitors produced by nocardia SP. (MA6455)(ATCC 53695)
US4247703A (en) Microbiological modification of antibiotic A23187 esters
US4287302A (en) Microbiological modification of antibiotic A23187 esters
JPH0538283A (ja) 新規微生物
JPH0365347B2 (fi)
JPS62190094A (ja) ３”，６’−ジヒドロキシ−ｍｌ−２３６ｂ誘導体及びその製法
JPH0827143A (ja) Ｕｃｆ７６化合物

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired

Owner name: SANKYO COMPANY LIMITED