CZ2002119A3 - Způsob hydroxylace kompaktinu na pravastatin za použití mikromonospor - Google Patents
Způsob hydroxylace kompaktinu na pravastatin za použití mikromonospor Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2002119A3 CZ2002119A3 CZ2002119A CZ2002119A CZ2002119A3 CZ 2002119 A3 CZ2002119 A3 CZ 2002119A3 CZ 2002119 A CZ2002119 A CZ 2002119A CZ 2002119 A CZ2002119 A CZ 2002119A CZ 2002119 A3 CZ2002119 A3 CZ 2002119A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- strain
- compound
- formula
- micromonospora
- pravastatin
- Prior art date
Links
- 241000187708 Micromonospora Species 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 title claims description 5
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 title description 73
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 title description 71
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 70
- VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N Compactin Natural products OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(CO)OC2Oc3cc(O)c4C(=O)C(=COc4c3)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C(O)C1O VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 20
- AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N SJ000287055 Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 20
- AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N mevastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=CCC[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N 0.000 title description 20
- BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N mevastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C21 BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims abstract description 4
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 40
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 21
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 21
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 14
- 241000187722 Micromonospora echinospora Species 0.000 claims description 13
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 10
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 241000187723 Micromonospora sp. Species 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 241000218923 Micromonospora megalomicea Species 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 241000218940 Micromonospora rosaria Species 0.000 claims description 4
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- -1 secondary amine salt Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 81
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 18
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 14
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 14
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 11
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 11
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 11
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 8
- PDBXRGUGLTUAAD-ABPOPGQRSA-M sodium;(3r)-7-[(1s,2s,8s,8ar)-2-methyl-8-[(2s)-2-methylbutanoyl]oxy-1,2,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]-3-hydroxyheptanoate Chemical class [Na+].C1=C[C@H](C)[C@H](CCCC[C@@H](O)CC([O-])=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)CCC=C21 PDBXRGUGLTUAAD-ABPOPGQRSA-M 0.000 description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- OQARDMYXSOFTLN-PZAWKZKUSA-N pravastatin lactone Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@@H](O)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 OQARDMYXSOFTLN-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 6
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 6
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 5
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 5
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 4
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N 0.000 description 2
- 102100029077 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Human genes 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 2
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000544912 Melanoides Species 0.000 description 2
- 241000178285 Streptomyces carbophilus Species 0.000 description 2
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002143 fast-atom bombardment mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N iso-butyl acetate Natural products CC(C)COC(C)=O GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M isocaproate Chemical compound CC(C)CCC([O-])=O FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid methyl ester Natural products COC(=O)CC(C)C OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- BOZILQFLQYBIIY-INTXDZFKSA-N mevinic acid Chemical group C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)CCC=C21 BOZILQFLQYBIIY-INTXDZFKSA-N 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 2
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQZSVIGPZAULMV-DKWTVANSSA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UQZSVIGPZAULMV-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 101710158485 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 101100313763 Arabidopsis thaliana TIM22-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 241000938054 Streptomyces lanatus Species 0.000 description 1
- 241000946782 Streptomyces resistomycificus Species 0.000 description 1
- 241000187418 Streptomyces rochei Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000187175 Streptomyces violaceus Species 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007613 bennett's agar Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229930008380 camphor Natural products 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- LAWOZCWGWDVVSG-UHFFFAOYSA-N dioctylamine Chemical compound CCCCCCCCNCCCCCCCC LAWOZCWGWDVVSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002168 ethanoic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006877 oatmeal agar Substances 0.000 description 1
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096701 plain lipid modifying drug hmg coa reductase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229960001495 pravastatin sodium Drugs 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N sodium ethoxide Chemical compound [Na+].CC[O-] QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/29—Micromonospora
Description
Vynález se týká nového mikrobiálního procesu pro přípravu pravastatinu.
Konkrétně je možno uvést, že se předmětný vynález týká mikrobiálního postupu přípravy pravastatinu obecného vzorce (I) :
O) při kterém se vychází ze sloučeniny obecného vzorce (II) :
OD • · · · ve kterém R znamená ion alkalického kovu nebo amonný ion, za použiti mikroorganismu, přičemž tento mikroorganizmus je prokaryotického typu z rodu Micromonospora, který je schopen hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II) na poloze 6β.
Dosavadní stav techniky
Hypercholesterolémie byla rozpoznána j ako hlavní rizikový faktor aterosklerotického onemocnění, konkrétně se to týká koronární srdeční vady. Během posledních dvou dekád byla velice intenzivně studována 3-hydroxy-3-methyl-glutarylkoenzym A reduktáza (HMG-CoA reduktáza
EC. 1.1.1.34) jako hlavní enzym omezující produkci při biosyntéze cholesterolu. V této souvislostí bylo zjištěno, že jako kompetitivní inhibitory tohoto enzymu zde působí mevinolin a další příbuzné sloučeniny biologicky syntetizované vybranými kmeny různých druhů plísní [viz publikace Endo, A. a kol., J. Antibiotics 29,1346-1348 (1976)]; Endo, A. a kol., FEBS Lett. 72, 323-326 (1976);
Kuo, C.H. a kol., J. Org. Chem. 48, 1991-1998 (1983)].
Pravastatin je rovněž členem skupiny HMG-CoA reduktázových inhibitorů. Nejdříve bylo zjištěno, že pravastatin představuje minoritní močový metabolit kompaktinu u psů (Tanaka, M. a kol., nepublikováno) v průběhu metabolických studií kompaktinu [viz. Arai, M. a kol. Sankyo Kenkyusho Nempo, 40, 1-38 (1988)].
Hlavní charakteristickou vlastností pravastatinu jako hydroxylovaného produktu kompaktinu je jeho tkáňová selektivita. Tato látka silně inhibuje syntézu sterolu v jádrech a ve střevu, ale slabě v ostatních orgánech.
V tomto případě je výhodné, jestliže pravastatin vykazuje • · • · 9 ·
99 ·· ·· ·* 9 9 9 9 « 9 · « 9
9 999 9999 9
9 999 9 9 9
9999 9 ·9 999· «· 9999 nižší toxicitu než jiné inhibitory HMG-CoA reduktázy.
V publikacích podle dosavadního stavu techniky bylo uváděno, že mikrobiální hydroxylace kompaktinu je možno dosáhnout v různém rozsahu za použití několika kmenů mikroorganizmů náležících k mnoha různým rodům plísní, přičemž je možno v tomto směru uvést kmeny actinomycete náležící do rodu Nocardia, Actinomadura a Streptomyces, kromě jiného například Streptomyces rosecchromogenes a Streptomyces carbophilus (viz patenty Spojených států amerických č. 5,179,013, 4,448,979, 4,346,227, 4,537,859 a japonský patent č. 58,010,572).
Problém s použitím plísní k výrobě pravastatinu z kompaktinu spočívá v tom, že tyto organizmy obecně nesnáší vysoké koncentrace kompaktinu v kapalném kultivačním prostředí (médiu), pravděpodobně z důvodu jeho antifungálni aktivity [viz publikace Serizawa, N. a kol. J. Antibiotics 36, 887-891 (1983)}. V případě Streptomyces carbophilus bylo zjištěno, že pro hydroxylaci kompaktinu na pravastatin je zapotřebí cytochromového systému P450 [Matsuoka, T. a kol., Eur., J. Biochem. 184, 707-713 (1989)]. Obtížnost genetického zlepšení schopnosti hydroxylace za použití tohoto enzymu spočívá v tom, že se jedná o komplex proteinů spíše než o jediný protein.
Výzkumy podle předmětného vynálezu byly zaměřeny na nalezení kmene actinomycete, který by produkoval pravastatin ze solí acidícké formy kompaktinu s vyšším výtěžkem a při použití vyšší koncentrace substrátu při biokonverzi, než tomu bylo až dosud, jak je to popsáno v dřívějších patentech.
•9 β· 99
9 9 9 0 9 9 <*··
W V .V * V «*·« » • · ··· ··· ···· 9 99 9999 99 9999
Během provádění těchto testů, kdy bylo vyzkoušeno asi 6000 actinomycetů, hlavně isoláty autorů předmětného vynálezu, ale rovněž i autentické kmeny z mezinárodních sbírek kmenů mikroorganizmů, bylo pro další studie vybráno pět kmenů mikroorganizmů Streptomyces a pět kmenů Micromonospora, a sice z toho důvodu, že byly schopné hydroxylovat sodnou sůl acidické formy kompaktinu na pravastatin. Těchto deset kmenů actinomycete, z nichž osm kmenů bylo taxonometricky identifikováno na druhové úrovni v laboratořích autorů předmětného vynálezu, byly následuj ící :
Streptomyces violaceus (podle Kámpfera a kol., 1991), kmen č. 1/43
Streptomyces rochei (Berger a kol., 1949; Vaksman a Lechavalier, 1953), kmen č. 1/41
Streptomyces resistomycificus (Lindenbein, 1952), kmen ě. 1/44,
Streptomyces sp., kmen č. 1/28,
Streptomyces lanatus (Frommer, 1959), kmen č. 1/16,
Micromonospora sp., kmen č. IDR-P^,
Micromonospora purpurea (Luedemann a Brodsky, 1964), kmen č.
idr-p4,
Micromonospora echinospora (Luedemann a Brodsky, 1964) , kmen č. idr-p5,
Micromonospora megalomicea (Veinstein a kol., 1969), kmen č.
idr-p6,
Micromonospora rosaria (Horan a Brodsky, 1986), kmen č. IDR-P?.
Vzhledem k tomu, že až dosud neexistuji data v publikacích podle dosavadního stavu techniky týkající se schopnosti Micromonospora konvertovat soli acidické formy kompaktinu na pravastatin, byly podle předmětného vynálezu provedeny rozsáhlé a intenzivní studie nejenom pokud se týče této konkrétní enzymatické schopnosti, ale rovněž i taxonomické polohy těchto výše uvedených kmenů
Micromonospora .
Taxonomické polohy kmenů IDR-Pj, -P4, -P5 a -Ργ na generické úrovni:
• · « ·«·« · · · · • 4 ♦ · « · · • · · · · * · · ···· · ·» ·«·· ·« ····
Všechny tyto kmeny produkovaly dobře rozvinuté mycelium tvořené rozvětvenými hyfy o velikosti průměru asi 0,4 až 0,7 pm. Aeriální mycelium nebylo přítomno nebo se vyskytovalo pouze ve stopovém množství. Nonmotilové spory se vyskytovaly na sporofořech jednotlivě. Hyfy substrátu mycelia jsou grampozitivní a nejsou kyselinovzdorné (acidorezistentní). Kmeny č. IDR P3-P7 jsou aerobní, chemo-organotropické a senzitivní na pH nižší než 6,0. Stěny obsahují mezo-diaminopimelovou kyselinu. Výše uvedené diagnostické vlastnosti, jako klíčové charakteristické znaky, jasně demonstrují, že tyto monosporické kmeny actinomycete jsou typickými členy rodu Micromonospora.
Taxonomický popis Micromonospora sp., kmen č. IDR-P^:
Mikromorfologické vlastnosti: Substrátové mycelium je tvořeno dobře rozvinutými, spíše zakroucenými než přímými, monopodiálně rozvětvenými vlákny. Spory na sporofořech jsou jednotlivé, sférické o průměru přibližně 1,8 pm a dispergující se více či méně rovnoměrně ve vláknech hyf. Spory jsou buďto přisedlé nebo se vyskytují na konci krátkých sporofor. V kultivačním prostředí nebyly spory na hyfách pozorovány, pravděpodobně vzhledem k tomu, že zralé spory j sou velmi rychle uvolňovány.
9 9 9 '9 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 9 ·· ·«·· ·· ····
Kulturně-makromorfologické vlastnosti:
Czapek-sacharozový agar: průměrný růst, kolonie byly červenavé=ho zabarveni, pokryté tečkovitými černými sporulačními plochami.
Glukózo-asparaginový agar: růst byl zaznamenán jako tečkovítý a vyvýšený, červenavě-hnědé nebo černé kolonie. Červenavě difundovatelné pigmenty.
Nutriční agar: dobrý růst, vyvýšené, červenavě-hnědé nebo černé kolonie. Červenavě-hnědé exopigmenty v médiu.
Extraktový agar kvasnicového sladového výtažku (ISP Med. 2): dobře rozvinuté, vyvýšené a zvrásněné, hnědé kolonie, pokryté částečně černými sporulačními plochami nebo pseudo-aeriálním myceliem (toto se vyskytuje jako omezený bělavý nebo šedavý květ). Hnědavý nebo hnědavě-červený rozpustný pigment.
Agar anorganické soli-škrob (ISP Med. 4): průměrný růst červenavě-hnědých vyvýšených a zvrásněných kolonií. Světle červenavý rozpustný pigment.
Agar glycerol-asparagin (ISP Med. 5): růst pouze ve stopovém množství, šedavě-bílé nebo světle oranžově zbarvené ploché kolonie, světle růžový rozpustný pigment.
Využití uhlíkového zdroje: dobrý růst na tomto zdroji a pozitivní využití L-arabinózy, D-galaktózy, D-fruktózy, D-glukózy, D-xylózy, laktózy, melibiózy, sacharózy, D-mannitolu, dulcitolu, glycerolu a inositolu. Růst za použití L-rhamnózy, D-rafinózy a inulinu byl mírně lepší než na negativním kontrolním médiu.
Využití zdroje dusíku : dobrý růst za použití kvasnicového extraktu a NZ-aminu, žádné nebo malé využití NaNO3.
— 7 — ·· »··♦ ·· ·· ·· ·· • · 9 9 · 9 9 9 9 9 9
9 9 · · 9 9 »
9 9 9 9 999« 9 • · 999 999
9999 9 99 9999 ·· 9999
Další fyziologicko-biochemické vlastnosti: celulóza a škrob byly hydrolyzovány, mléko bylo silně digerováno.
Dusičnanový redukční test byl negativní. Žádný růst na plátcích rajčete bez uhličitanu vápenatého (pH 5,8 až 6,0).
Žádná produkce melanoidního pigmentu.
Systematická poloha : Další komparativní systematické studie byly nezbytné k vyjasnění přesné taxonomické polohy tohoto kmene v rámci druhů rodu Micromonospora. Na základě určitých vlastnosti se nejevilo jako nemožné, že kmen IDR-P^ reprezentuje nové druhy v rámci rodu Micromonospora.
Diferenciálně-diagnostický popis a identifikace kmenů Micromonospora IDR-P4, -P5, -Pg a -P7:
Kmen IDR-P4:
Na výše uvedeném diagnostickém médiu bylo možno pozorovat obecně dobrý růst oranžových až oranžovo-červených až červených, někdy žlutavých nebo růžově zbarvených kolonií. Rozpustné pigmenty a aeriální mycelium nebylo produkováno. Počet solitérních sporů je relativně nízký. Tyto se objevují na sprofořech terminálně.
Substrátové mycelium je tvořeno dobře rozvětvenými hyfy. Aeriální mycelium je nepřítomno. Na D-melibióze, rafinóze, mannitolu, glycerolu, laktóze, L-rhamnóze nebyl zaznamenán žádný růst, al dobrý růst byl pozorován na D-arabinóze, glukóze, D-xylóze a slabý růst byl pozorován na D-galaktóze a D-fruktóze. Na základě těchto běžných diagnostických vlastností byl tento kmen identifikován jako člen druhu Micromonospora purpurea (Luedemann a Brodsky, 1964).
Kmen IDR-P^:
Tento kmen produkuje hlavně solitérní sporofory
99
9 9 9 · 9 ·
9 9 9
9999 9 9 9999 a kulovité tmavě hnědé až černé spory (o průměru v rozmezí od 0,8 do 1,5 pm), které při zrání pevně ulpívají na sporofory. Při pozorování elektronovým mikroskopem je možno na povrchu těchto sporů objevit bradavicovítou strukturu neboli výrůstky (tak zvané hrubé hrbolky v originále blunt spines podle Bergey’s Manual of Syst. Bact. 1989, str. 1448, Vol. 4), což je velice charakteristický znak těchto sporů Micromonospora echinosora. Jinak je možno uvést, že kulturně-morfologické a fyziologické diagnostické vlastnosti tohoto kmene jsou rovněž velice podobné jako u M. echinospora. Zabarvení těchto dobře vyvinutých kolonií na standardním diagnostickém médiu je oranžovo-hnědé nebo tmavě purpurové. Sporulační vrstva je černá nebo purpurově černá, voskovítá. Aeriální mycelium není přítomno. Melaninový pigment není produkován. Mléko je digerováno. Dobrý růst na D-xylóze, D-arabinóze, D-glukóze a sacharóze, ale žádný růst nebyl zaznamenán na L-rhamnóze, rafinóze, D-galaktóze, D-fruktóze, D-melibióze a glycerolu. Tento kmen byl tedy považován za typický člen Micromonospora echinospora.
Kmen IDR-Pg:
Na většině diagnostických médií byl zaznamenán mírný až slabý růst. Oranžové nebo oranžovo-červené kolonie sestávaly z dlouhých rozvětvených vláken (o průměru přibližně 0,6 pm) a omezeného počtu solitérních, kulovitých, tmavě zbarvených sporů (o průměru v rozmezí od 0,6 do 1,0 pm). Nebylo produkováno aeriální mycelium. V případě určitých médií byl pozorována tvorba slabě červenavých nebo růžově zbarvených rozpustných pigmentů. Na tyrosinovém agaru nebyly produkovány melanoidní pigmenty. Na bazálním médiu byly tímto kmenem využity následující zdroje uhlíku:
D-xylóza a D-fruktóza; pouze slabě byly využity:
D-melibióza, mannitol a galaktóza; ovšem žádný nebo pouze ·♦ ···«
99 99
9 9 9 9 9 9 · Φ · · • · · · · φ · «
ΦΦΦΦ Φ ΦΦ 9999 99 9999 sporadický růst byl zaznamenán v případě glycerolu, L-rhamnózy, laktózy a rafínózy (viz rovněž publikace Kawatomoto, I. a kol., Agric Biol. Chem., 47, 203-215,
1983). Kmen č. IDR-Pg vykazoval značnou podobnost jako druhy Micromonospora megalomicea (Veinstein, 1972) a podle předmětného vynálezu byl tedy považován za člen těchto druhů.
Kmen IDR-Ργ:
Dobrý až mírný růst na Bennettově agaru, sacharózovém agaru Czapek, agaru glukóza-asparagin, nutričním agaru, agaru na bázi ovesných vloček, bramborovo-dextrozovém agaru, atd. Zabarvení vegetativních myceliálních pigmentů se pohybuje v rozmezí od červenavě-hnědého až do purpurově-hnědého. Na určitém médiu se tvoří vínově červené difusibilni pigmenty. Na povrchu kolonii se častokrát tvoří černé skvrny. Vegetativní hyfy (střední průměr 0,5 pm) jsou velmi rozvětvené. Spory (o průměru v rozmezí 1,4 až 1,7 pm) vznikají jednotlivě, přisedlé nebo jsou na krátkých sporofořech a vyskytují se podél délky těchto hyf. Růst a sporulace je typu otevřené sítě podle Luedemanna. Tímto kmenem byly využity následující sloučeniny představující jediný zdroj uhlíku v médiu: D-glukóza, laktóza, D-mannitol, L-rhamnóza, sacharóza a D-xylóza. Dulcitol, glycerol, D-melibióza a D-rafinóza nebyly využity. Podle předmětného vynálezu byl tento kmen č. IDR-Ργ identifikován jako typický člen Micromonospora rosaria (Horan a Brodsky, 1986).
Tyto výše uvedené kmeny Micromonospora byly uloženy ve sbírce The National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (NCAIM), Budapešf, Maďarsko, pod následujícími číselnými označeními:
• · ftftftft • ft ftft ftft ftft ftft ft ftftftft ftft·· • · ftftft ftftft ftftftft · ftft ftftftft ftft ftftftft
| Micromonospora | sp. IDR-P^ | NCAIM | (P) | B | 001268 |
| Micromonospora | purpurea IDR-P^ | NCAIM | (P) | B | 001271 |
| Micromonospora | echinospora ssp. | ||||
| echinospora IDR-P$ | NCAIM | (P) | B | 001272 | |
| Micromonospora | megalomicea ssp. | ||||
| nigra IDR-P& | NCAIM | (P) | B | 001273 | |
| Micromonospora | rosari a IDR-Py | NCAIM | (P) | B | 001274 |
Podstata vynálezu
Vzhledem k výše uvedenému se předmětný vynález týká nového mikrobiologického postupu přípravy pravastatinu obecného vzorce (I):
(!) ze sloučeniny obecného vzorce (II) :
(I!) «0 00 00
0 0 0 0
0 0 0 0 00 0000 ·· «000 ve kterém:
R znamená alkalický kov nebo amonný ion, submerzni kultivací kmene, který je schopen όβ-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II) při aerobní fermentaci, přičemž následuje oddělení a čištění takto získané sloučeniny obecného vzorce (I) získané v průběhu biokonverze, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupně:
(a) kultivace kmene druhu náležícího do rodu Micromonospora, který je schopen όβ-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II), ve kterém R má stejný význam jako bylo uvedeno shora, na nutričním médiu obsahující asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku a minerální soli při teplotě v rozmezí od 25 do 32 °C, načež následuje (b) zásobování substrátu, který má být transformován na vyvíjeci kulturu, potom (c) hydroxylace substrátu až do konečného stadia biokonverze, potom (d) oddělení sloučeniny obecného vzorce (I) z tohoto kultivačního prostředí, a v případě potřeby její čištění.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží divoké kmeny a veškeré mutanty druhů náležících do rodu Micromonospora, které jsou schopné hydroxylovat sodnou sůl acidické formy kompaktinu na pravastatin.
Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu se pravastatin vyrobí za pomoci mikroorganizmu kmene Micromonospora vybraného ze skupiny zahrnující Micromonospora sp. IDR-P^ [NCAIM (P) B 001268], Micromonospora purpurea IDR-P^ [NCAIM (P) B 001271] Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P$ [NCAIM (P) B 001272], Micromonospora megalomicea IDR-P^ ·· ···· ·· ·· ·· *tt • · w · · · · · · · ♦ • · · · · · • · · ·* · tt* tttttttt [NCAIM (P) B 001273] Micromonospora rosaria IDR-P^ [NCAIM (P) B 001274],
Podle nejvýhodnějšího provedení postupu podle vynálezu se pravastatin vyrobí za pomoci mikroorganizmu kmene Micromonospora sp. IDR-P^ [NCAIM (P) B 001268].
Postup podle předmětného vynálezu se provádí in šitu provedenou fermentační metodou, to znamená, že hydroxylace se provede za přítomnosti aktivně rostoucí kultury Micromonospora.
Tuto hydroxylaci je možno provést za použití míchání, například jako kultivaci v protřepávané nádobě nebo aerací a mícháním ve fermentorech, přičemž se přidává sloučenina obecného vzorce (II) do rostoucí kultury. V těchto případech je možno použít protipěnící přísady. Adekvátní hustoty kultury tohoto kmene je možno dosáhnout při použití vhodného média obsahující dostupné zdroje uhlíku a dusíku, anorganické soli a rovněž stopové prvky.
Jako asimilovatelné zdroje uhlíku se ukázaly být vhodné například glukóza, glycerol, dextrin, škrob, rhamnóza, xylóza, sacharóza a rozpustný škrob, zatímco sojová moučka, kukuřičný výluh, pepton, kvasnicový extrakt, masný extrakt, citronan amonný a síran amonný se ukázaly být dobrými zdroji dusíku. Do kultivačního média je možno přidat anorganické soli, jako je například uhličitan vápenatý, fosforečnany sodné, fosforečnany draselné, atd. Výhodná média pro pěstování těchto vybraných kmenů jsou uvedena v příkladech.
Biokonverzi kompaktinu na pravastatin je možno provést • φ φφφφ φ · •Φ φφ Φ· φ φ φ · φ φ · · φ φ φ φ φφφ φ • φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φφφφ φ φφ φφφφ φ· φφφφ různými fermentačními metodami, jako je například vsázková kultivace, kultivace typu fed-batch. Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu se používá promíchávaná kapalná submerzní kultura. Výhodná teplota se pohybuje v rozmezí od asi 25 °C do asi 37 °C, v nejvýhodnějším provedení v rozmezí od asi 25 °C do asi 32 °C.
Výhodná hodnota pH je při provádění tohoto postupu podle vynálezu asi 6,0 až asi 9,0, podle nej výhodnějšího provedení asi 7,0 až asi 8,5. Výhodně se proces provádí při podmínkách protřepávání v rozmezí od asi 200 otáček za minutu až asi 400 otáček za minutu, nej výhodněji při asi 250 otáčkách za minutu.
Vynález poskytuje metodu konverze sodné soli acidické formy kompaktinu na pravastatin. Sodnou sůl acidické formy kompaktinu je možno použít při provádění tohoto postupu podle vynálezu v libovolné koncentraci, která vede k výrobě pravastatinu. Ve výhodném provedení se tato koncentrace kompaktinu pohybuje v rozmezí od 0,1 do 10 gramů/litr, podle nejvýhodnějšího provedení v rozmezí od asi 0,3 do asi 3,0 gramů/litr.
Do rozsahu předmětného vynálezu spadá jakákoliv procentuální konverze kompaktinu na pravastatin provedená za použití kmene Micromonospora spp., přinejmenším 30% a podle nejvýhodnějšího provedení přinejmenším asi 90%.
V průběhu fermentace se složení kultivačního prostředí kontroluje metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Při provádění této HPLC metody se zředí vzorek tohoto živného prostředí dvojnásobně methanolem, potom se odstředí a kapalina nad usazeninou se použije k analýze.
·»·· ·« ·· ·· ·· • · · · · · · · » · » ·« ·· · · · · • · · · · ···
Λ ···· · ·· ·♦·· ·· ····
Parametry tohoto HPLC systému použitého pro tuto analýzu jsou: Vatersův přístroj k provedení HPLC metody; náplň kolony: Vatersův Novapack C^g 5 pm; měření při 237 nm; injekční objem 10 μί; průtokové množství 0,6 až 0,9 mililitru/minutu za použití lineárního gradientu; k provedení postupu se použije gradientová eluce, eluenty: rozpouštědlo A = acetonitril, 0,1 M NaH2P04 ve vodě (25 : 75), rozpouštědlo B = acetonitril, voda (pH 2 s H3PO4) (70: 30).
Parametry gradientově eluce:
| Doba (minuty) | Průtokové množství (mililitry/minutu) | Eluent A (%) | Eluent B (%) |
| 0 | 0,6 | 100 | 0 |
| 2 | 0,7 | 100 | 0 |
| 12 | 0,9 | 0 | 100 |
| 21 | 0,9 | 0 | 100 |
| 22 | 0,9 | 100 | 0 |
| 27 | 0,7 | 100 | 0 |
Retenční doba :
pravastatin (Na sůl) 10,6 minuty kompaktin (acidická forma, Na sůl) 19,5 minuty pravastatin (laktonová forma) 17,3 minuty, kompaktin (laktonová forma) 23,5 minuty.
K izolování pravastatinu je možno použít libovolné metody, jako je například extrakce-reextrakce, chromatografická aniontová výměna, srážení, a pod.
• Φ ·«· · φφ »· ·» φφ φ φ Φ ΦΦΦΦ Φ 9 φ · • · ΦΦΦ · Φ φ •••Φ Φ ·· ΦΦΦ· ΦΦ ····
Κ oddělení produktu od živného prostředí je výhodné vzít v úvahu tu skutečnost, že během biokonverze se pravastatin vyskytuje ve své acidické formě, takže je možno jej izolovat z filtrátu živného prostředí pomocí adsorpce v koloně na aniontovýměnnou pryskyřici. K oddělení tohoto produktu je výhodné použít silně bazickou aniontovýměnnou pryskyřici, kterou je polystyren-divinylbenzenový polymer obsahující kvarterní amonium aktivní skupiny, jako jsou například Dowex Al 400 (OH-), Dowex 1x2 (OH-), Dowex 2x4 (OH-), Amberlit IRA 900 (OH-) pryskyřice. Produkt adsorbovaný na tyto iontovýměnné pryskyřice je možno eluovat z kolony vodným roztokem kyseliny octové nebo roztokem chloridu sodného obsahujícího směs acetonu a vody, ve výhodném provedení 1% roztok chloridu sodného obsahující směs acetonu a vody (v poměru 1:1). Frakce obsahující pravastatin se potom spojí a aceton, který se vyskytuje v eluátu, se oddestiluje za použití vakua. Hodnota pH tohoto koncentrátu se potom upraví 15% roztokem kyseliny sírové na hodnotu v rozmezí od 3,5 do 4,0, načež se tento okyselený vodný roztok extrahuje ethylacetátem. Z tohoto ethylacetátového extraktu je možno pravastatin extrahovat 5% hydrogenuhličitanem sodným v objemovém poměru 1/10 až 1/20 nebo slabým roztokem alkalického činidla ve vodě (o hodnotě pH v rozmezí od 7,5 do 8,0). Bylo experimentálně prokázáno, že pravastatin je možno získat v čisté formě z výše uvedeného alkalického vodného extraktu chromatografřekou metodou provedenou v koloně naplněné ne-iontovou adsorpční pryskyřicí. Ve výhodném provedení se tato metoda provede tak, že se nejprve ethylacetát rozpuštěný ve vodné fázi odstraní vakuovou destilací z alkalického vodného extraktu a potom se tento vodný extrakt vloží do kolony Diaion HP-20. Pravastatin
ΦΦ φφφφ • φ • φ φφφφ φ • Φ φφ φ» φφ φφφφ φφφφ • · φφφ φ • · · φ · φ φφ φφφφ φφ »»·· adsorbovaný v koloně se vyčistí eluováním vodným acetonovým roztokem, ve kterém se obsah acetonu postupně zvyšuje, načež se čhromatografické frakce obsahující pravastatin jako jedinou složku, spojí a zkoncentrují ve vakuu. Takto získaný koncentrát se vyčistí aktivním uhlím a potom se lyofilizuje, načež se provede krystalizace ze směsi ethanolu a ethylacetátu, čímž se získá pravastatin v kvalitě přijatelné pro farmaceutické aplikace.
Po dokončení biokonverze je možno pravastatin extrahovat buďto z fermentačního prostředí nebo z filtrátu získaného po oddělení myceliové hmoty. Tuto hmotu je možno odstranit buďto filtrací nebo odstředěním, ovšem výhodné, zejména v průmyslovém měřítku, je provést extrakci celého živného prostředí. Před provedením extrakce se hodnota pH buďto fermentačního média nebo filtrátu tohoto média upraví na hodnotu v rozmezí od 3,5 do 3,7 za pomoci minerální kyseliny, ve výhodném provedení se použije zředěného roztoku kyseliny sírové. Extrakce se provede za použití esteru kyseliny octové obsahujícího 2 až 4 atomy uhlíku obsahujícího alifatický alkohol, ve výhodném provedení se použije ethylacetát nebo isobutylacetát. Tento ethylacetátový extrakt se potom promyje vodou a usuší se bezvodným síranem sodným. Potom se z pravastatinu připraví laktonový derivát. Uzavření laktonového kruhu se provede v suchém ethylacetátovém roztoku při teplotě místnosti, za kontinuálního promíchávání, přičemž se tvorba laktonu vyvolá katalytickým množstvím trifluoroctové kyseliny. Uzavření laktonového kruhu se ověří čhromatografickou analýzou v tenké vrstvě (TLC-metoda). Po dokončení tvorby laktonu se ethylacetátový roztok promyje nejprve 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a potom vodou, načež se usuší bezvodým síranem sodným a odpaří se ve vakuu. Takto získaný »··« *· *· « '» « • · «·« · · · ΜΛ· · ·< 40» »> ·♦*· zbytek se potom vyčistí v chromatografické koloně naplněné silikagelem, přičemž se jako elučního činidla použije směs ethylacetátu v n-hexanu s postupně se zvyšujícím obsahem ethylacetátu. Pravastatin se připraví z pravastatinlaktonu hydrolýzou provedenou při teplotě místnosti v acetonu s ekvivalentním množstvím hydroxidu sodného. Po dokončení tvorby sodné soli pravastatinu se pravastatin vysráží acetonem. Potom se takto získaná sraženina zfiltruje a promyje acetonem a n-hexanem, načež se produkt usuší ve vakuu a potom se vykrystaluje ze směsi ethanolu a ethylacetátu.
Podle předmětného vynálezu bylo zjištěno, že pro vyčištění pravastatinu je výhodné použít chromatografické metody provedené na gelu Sephadex LH-20. Při použití této metody je možno získat pravastatin v čistotě převyšující 99,5% (měřeno metodou HPLC).
V průběhu provádění experimentů byly zjištěny následující vynálezecké znaky: z extraktu organického rozpouštědla, ve výhodném provedení z ethylacetátového nebo isobutylacetátového extraktu živného prostředí nebo z filtrátu živného média kmene Micromonospora sp. IDR-P^, který je schopen 6β-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II), je možno vysrážet pravastatin ve formě krystalické soli se sekundárními aminy. Dále bylo zjištěno, že pro tvorbu soli je vhodné použít několik sekundárních aminů obsahujících alkylové skupiny, cykloalkylové skupiny, aralkylové skupiny nebo arylové skupiny jako substituenty. Výhodně byly z této skupiny látek vybrány netoxické sekundární aminy, jako je například dioktylamin, dicyklohexylamin, dibenzylamin. Oddělení organických sekundárních aminových solí jako meziproduktů, jako je • · · ···· · · · · • · · · β · * * φ · · · < ···· φ • » ··· ··· «··« · ·· ···· ·· ···· například dibenzylaminová sůl, bylo provedeno přidáním dibenzylaminu v 1,5 ekvivalentním množství vztaženo na obsah pravastatinu v extraktu, načež potom se takto získaný extrakt zkoncentruje vakuovou destilací na 5% jeho původního objemu, a potom se přidá další podíl dibenzylaminu do tohoto koncentrátu v 0,2 ekvivalentním poměru. Krystalická dibenzylaminová sůl se potom z tohoto koncentrátu vysráží a usuší ve vakuu, načež se vyčistí aktivním uhlím v methanolovém nebo acetonovém roztoku. Potom je možno po rekrystalizací vyčištěného produktu z acetonu získat chromatograficky čistou dibenzylaminovou sůl pravastatinu jako meziprodukt.
Sůl pravastatinu s organickým sekundárním aminem je možno převést na pravastatin působením hydroxidu sodného nebo alkoxidu sodného, ve výhodném provedení se použije ethoxidu sodného.
Oddělení pravastatinu přes sůl se sekundárním aminem jako meziproduktem je jednodušší postup než až dosud používané oddělovací metody. Během tohoto procesu se nevytváří uměle vzniklé produkty, přičemž je možno takto výhodným způsobem vyřešit problém oddělení pravastatinu od vedlejších produktů vznikajících při biokonverzi a od různých metabolických produktů vznikajících při biosyntéze hydroxylací mikroorganizmu.
Příklady provedení vynálezu
Postup podle předmětného vynálezu bude v dalším blíže vysvětlen s pomocí konkrétních příkladů provedení, přičemž tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.
• · · ·
• · · · · φ
Příklad 1
Podle tohoto příkladu byly spory získány z povrchu 7 až 10 dní starého rozpustného šikmého škrobového agaru (SM) kultury Micromonospora sp. IDR-P^ [kmen NCAIM (P) B 001263], načež následovalo suspendování v 5 mililitrech sterilní destilované vody. Tato suspenze byla potom použita k inokulování 100 mililitrů sterilního média Tl inokula v Erlenmeyerově nádobce o objemu 500 mililitrů.
Složení SM média rozpustný škrob
Na2HP04 kh2po4
KCI
MgSO4 x 7 H20 agar ve
10,0 gramů 1,15 gramu 0,25 gramu 0,2 gramu 0,2 gramu 15,0 gramů vody
1000 mililitrech destilované
Hodnota pH tohoto média byla před provedením sterilizace upravena na 7,0, načež následovala sterilizace, která byla prováděna při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.
Složení TI média rozpustný škrob 20,0 gramů kvasnicový extrakt 10,0 gramů v 1000 mililitrech vody z vodovodu ·· ·· • · 9 • * 99 999 9 « 9 999 9999 ·
9 ··· 999 ···· « 99 9999 99 9999
Hodnota pH byla před provedením sterilizace upravena na 7,0, přičemž tepelné zpracování bylo prováděno při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.
Vyvijecí kultura byla protřepávána na rotační třepačce (250 otáček za minutu a amplituda 2,5 centimetru) po dobu 3 dní při teplotě 32 °C, načež byly 5 mililitrové alikvotní podíly potom použity k inokulování 10 Erlenmeyerových nádob, o objemu 500 mililitrů, každá obsahující 100 mililitrů TT média sterilizovaného při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.
Složení TT média škrob z rajského jablíčka 30,0 gramů sojová moučka 30,0 gramů
CaCOj 5,0 gramů
C0CI2 x 6 H2O 2,0 miligramy palmový olej 2,0 gramy v 1000 mililitrech vody z vodovodu
Hodnota pH byla potom upravena před tepelnou sterilizací na 7,0.
Inkubace byla prováděna při teplotě 32 °C po dobu 72 hodin, načež bylo přidáno 50 miligramů sodné soli acidické formy kompaktinu v destilované vodě do každé nádoby a kultivace byla prováděna po dobu 96 hodin. Stupeň konverze sodné soli acidické formy kompaktinu na pravastatin, zjištěný metodou HPLC, byl 82%.
Po dokončení fermentace byly kultury spojeny a z takto získané shromážděné fermentační živné půdy, která obsahovala
99 9
410 miligramů pravastatinu, bylo oddělení tohoto pravastatinu provedeno následujícím způsobem. Fermentační živné médium bylo odstředěno při 2500 otáčkách za minutu, přičemž odstřeďování bylo prováděno po dobu 20 minut. Kapalina nad usazeninou z tohoto živného média a myceliální hmota byly odděleny, načež byla tato myceliální hmota opětně suspendována ve 250 mililitrech vody a takto získaná suspenze byla potom promíchávána po dobu jedné hodiny a potom byl tento podíl zfiltrován. Hodnota pH takto získaného odstředěného živného média a filtrátu byla upravena pomocí 15% kyseliny sírové na 4,0, načež byl tento acidický filtrát extrahován třemi podíly, každý po 300 mililitrech, ethylacetátu. Ethylacetátové extrakty byly potom spojeny a tento spojený podíl byl potom promyt 300 mililitry vody, usušen bezvodým síranem sodným a zkoncentrován ve vakuu na objem 100 mililitrů.
Pravastatinlakton byl připraven z pravastatinu přidáním kyseliny trifluoroctové v katalytickém množství při teplotě místnosti a za kontinuálního promíchávání. Tvorba pravastatinlaktonu byla kontrolována metodou TLC (chromatografie v tenké vrstvě): adsorbent: Kieselgel 60 ^254 DC (Merck) na aluminiové fólii; vyvíjecí rozpouštědlo: aceton/benzen/kyselina octová (50 : 50 : 1,5); detekce: za použití fosfo-molybdenové kyseliny jako reakčního činidla. Hodnota Rf pravastatinlaktonu byla 0,7. Po dokončení tvorby laktonu byl ethylacetát promyt dvěma podíly, každý po 20 mililitrech, 5% vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, načež byl tento podíl promyt 20 mililitry vody, usušen bezvodým síranem sodným a odpařen za použití vakua. Tímto způsobem bylo získáno 0,5 gramu odpařeného zbytku, který byl potom podroben chromatografickému zpracování v koloně obsahující 10 gramů adsorbentu Kieselgel 60, (průměr kolony : 1,2 centimetru, výška adsorbčního lože: 17 » * ·· · · · » «· *· ·· « · * · c ♦ · · · · * • · · · · · · · ··(· 4 ·· ···· ·· ·«·£ centimetrů) . K eluováni bylo použito směsi ethylacetátu a n-hexanu, ve které se postupně zvyšoval obsah ethylacetátu. Pravastatinlakton byl eluován v této koloně směsí obsahující 60% ethylacetátu a 40 n-hexanu. Frakce obsahující pravastatinlakton byly potom spojeny a odpařeny ve vakuu. Takto získaný zbytek, který obsahoval 230 miligramů pravastatinlaktonu, byl potom rozpuštěn v 5 mililitrech acetonu, načež byl tento podíl potom promícháván a za tohoto promíchávání bylo přidáno 110 mol.% hydroxidu sodného v 1 M ethanolickém roztoku. Míchání tohoto roztoku bylo potom prováděno po dobu další půl hodiny při teplotě místnosti. V dalším postupu byl potom tento roztok zkoncentrován na objem 2 mililitry, načež byly k tomuto koncentrátu přidány 4 mililitry acetonu. Takto získaná směs byla potom udržována při teplotě +5 °C po dobu přes noc. Vysrážený podíl byl potom zfiltrován, promyt 2 mililitry acetonu a potom 2 mililitry n-hexanu a potom byl tento podíl usušen ve vakuu při teplotě místnosti. Výsledný surový pravastatin byl rozpuštěn v ethanolu, vyčištěn aktivním uhlím a potom byl tento produkt krystalován ze směsi ethanolu a ethylacetátu. Tímto způsobem bylo připraveno 170 miligramů požadovaného pravastatinu.
Teplota tání : 170 - 173 °C (za rozkladu) [a]2D = +156° (c = 0,5; ve vod2]
Ultračervené adsorpční spektrum (20 μΙ/ml, v methanolu): lambdam„v = 231, 237, 245 nm (log e= 4,263, 4,311, 4,136)
Infračervené absorpční spektrum (KBr): vOH 3415, vCH 2965, vCOO' 1575 cm·1.
1H-NMR spektrum (D2O, δ, ppm):
0,86, d, 3H (2-CH3);
5,92, dd, J = 10,0 a 5,4 Hz, IH (3H);
5,99, d, J = 10,0 Hz, IH (4-H);
» 0 0 0 · · · 0 • 0 · · 0 0 0 0000 0· »00
5,52, br, 1H (5-H); 4,24, m, 1H (6-H);
5,34, br, 1H }8/H]; 4,06, m, 1H (β-Η); 3,65, m, 1H (δ-Η); 1,05, d, 3H (2’-CH3); 0,82, t, 3H (4’-H3).
i^C-NMR spektrum (D2O, δ, ppm):
15,3, q (2-CH3); 139,5, d (C-3); 129,5, d (C-4);
138.1, s (C-4a); 127,7, d (C-5); 66,6, d (C-6);
70.1, d (C-8); 182,6, s (COO~); 72,6, d (C-β);
73,0, d (C-δ); 182,0, s (C-l’); 18,8, q (2’-CH3);
13,7, q (C-4’).
Pozitivní FAB hmotové spektrum (charakteristické ionty):
[M + Na]+ 469; [M + H]+ 447.
Negativní FAB hmotové spektrum (charakteristické ionty):
[M - H]+ 445; [M - Na]+ 423, m/z 101 [2-methylmáselná kyselina-H]- .
Příklad 2
Podle tohoto příkladu bylo použito 10 Erlenmeyerových nádobek každá o objemu 500 mililitrů, přičemž každá z těchto nádobek obsahovala 100 mililitrů MT^ biokonverzního média, které bylo inokulováno inokulační kulturou připravenou stejným způsobem jako v příkladu 1, načež byla inkubace prováděna při teplotě 28 °C po dobu 96 hodin, a potom bylo do každé z těchto nádob přidáno 50 miligramů sodné soli acidické formy kompaktinu v destilované vodě, načež byla provedena hydroxylace, která byla prováděna po dobu 72 hodin, a po tomto časovém intervalu bylo přidáno dalších 50-50 miligramů substrátu do této kultury v destilované vodě a fermentace potom probíhala po dobu 72 hodin.
• ft · · • » » ft ftft t • · ft • ft ft·
Složení biokonverzního média MT^
| bramborový škrob | 10,0 | gramů |
| dextróza | 20,0 | gramů |
| soj ová moučka | 10,0 | gramů |
| kvasnicový extrakt | 10,0 | gramů |
| CaC03 | 5,0 | gramů |
| slunečnicový olej | 2,0 | gramy |
ve 1000 mililitrech vody z vodovodu
Hodnota pH tohoto biokonverzního média byla potom před sterilizací upravena na 7,0. Tato směs byla potom sterilizována při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.
Po dokončení biokonverzní periody byly kultury spojeny a pravastatin byl oddělen z této shromážděné živné půdy následujícím způsobem.
Spojené živné médium, které obsahovalo 750 miligramů pravastatinu, což bylo zjištěno metodou HPLC, bylo odstřeďováno při 2500 otáčkách za minutu po dobu 20 minut. Oddělená myceliová hmota byla potom promíchávána s 250 mililitry vody po dobu jedné hodiny, načež byl tento podíl zfiltrován. Odstředěné živné médium a filtrát byly spojeny a hodnota pH tohoto výsledného roztoku byla potom upravena na 3,5 až 4,0 za pomoci 15% roztoku kyseliny sírové, načež byl tento roztok extrahován třemi podíly, každý po 300 mililitrech, ethylacetátu. Potom bylo k tomuto ethylacetátovému extraktu přidáno 150 molových % dibenzylaminu, vztaženo na obsah pravastatinu.
Ethylacetátový extrakt byl potom odpařen na objem asi 30 mililitrů a tato suspenze byla udržována po dobu přes noc c
<·» · při teplotě 0 až 5 °C. Takto vysrážená dibenzylaminová sůl acidické formy pravastatinu byla potom zfiltrována a promyta na filtru chladným ethylacetátem a n-hexanem, a nakonec byl tento podíl usušena ve vakuu. Potom bylo 1,1 gramu surové dibenzylaminové soli acidického pravastatinu rozpuštěno ve 33 mililitrech acetonu při teplotě 62 až 66 °C a takto získaný roztok byl potom vyčištěn 0,1 gramu aktivního uhlí, přičemž toto čištění probíhalo po dobu půl hodiny. V dalším postupu bylo aktivní uhlí z roztoku odstraněno filtrací. Krystaly získané vysrážením z tohoto vyčištěného roztoku byly potom znovu rozpuštěny při výše uvedené teplotě a potom byl tento roztok udržován při teplotě +5 °C po dobu přes noc. Získaná sraženina byla potom zfiltrována, promyta chladným acetonem a n-hexanem a potom byla usušena ve vakuu. Takto získaná dibenzylaminová sůl acidické formy pravastatinu (0,7 gramu) byla suspendována v 10 mililitrech ethanolu, načež bylo přidáno k tomuto roztoku přidáno 110 molových % hydroxidu sodného přidáním 1 M vodného roztoku této sloučeniny. Tento alkalický roztok byl potom promícháván po dobu půl hodiny při teplotě místnosti. Po dokončení tvorby sodné soli bylo přidáno 30 mililitrů vody a hodnota pH tohoto roztoku byla upravena na neutrální, načež byl použitý ethanol oddestilován ve vakuu. Vodný koncentrát byl potom zpracován chromatografickou metodou v koloně naplněné 50 mililitry pryskyřice Diaion HP 20 (průměr kolony: 1,5 centimetru, výška lože pryskyřice: 28 centimetrů). Tato kolona byla eluována směsí acetonu a deionizované vody, přičemž koncentrace acetonu se zvyšovala v 5% stupních. Pravastatin byl potom eluován z této kolony za pomoci 15% acetonového roztoku obsahujícího směs acetonu v deionizované vodě. Frakce byly analyzovány metodou TLC (chromatografie v tenké vrstvě) stejným způsobem jako v příkladu 1. Hodnota pravastatinu byla 0,5. Frakce
ΦΦ ··«# *· ·· ♦* φφ ·· · ♦ · · · · » Φ Φ φ Φ · · ·«· · • · · · Φ · · « » Φ
Φ » φ · φ·· φφφ· φ φΦ 4«Φ· ·· ΦΦΦΦ obsahující pravastatin byly potom spojeny a z tohoto podílu byl potom odstraněn podíl acetonu odpařováním ve vakuu. Lyofilizaci tohoto vodného zbytku bylo získáno 390 miligramů chromátograficky čistého pravastatinu.
Příklad 3
Podle tohoto příkladu bylo 4,5 litru TT/2 média, umístěného v laboratorním feriaentoru, sterilizováno při teplotě 121 °C po dobu 45 minut, přičemž bylo inokulováno 500 mililitry inokulační kultury připravené stejným způsobem jako v příkladu 1, načež bylo médium inkubováno při teplotě 32 °C, aerováno 250 litry sterilního vzduchu/hodinu a celý podíl byl promícháván michadlem s plochými lopatkami při 300 otáčkách za minutu. Inkubování potom probíhalo po dobu 72 hodin, načež bylo potom do této kultury přidáno 2,5 gramu sodné soli kompaktinu v acidické formě. Po 48 hodinách, kdy probíhala biokonverze, byl kompaktinový substrát zcela spotřebován z fermentačního živého média a potom bylo do této kultury znovu přidáno 2,5 gramu sodné soli kompaktinu v acidické formě. Tato druhá dávka kompaktinu byla spotřebována v intervalu 24 hodin. Rozsah konverze sodné soli kompaktinu v acidické formě na pravastatin byl při tomto biokonverzním postupu přibližně 90%.
• · • · · · ·· · · 99 99 · ···· · · * · « · 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 · « « 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 9999 ♦ · 1999
Složení TT/2 biokonverzního média
| glukóza | 75,0 | gramů |
| rozpustný škrob | 50,0 | gramů |
| sojová moučka | 50,0 | gramů |
| kvasnicový extrakt | 50,0 | gramů |
| pepton | 5,0 | gramů |
| NaN03 | 20,0 | gramů |
| CaC03 | 25,0 | gramů |
ve 4500 mililitrech vody z vodovodu
Příklad 4
Podle tohoto příkladu bylo 4,5 litru TT/1 fermentačního média, umístěného v laboratorním fermentoru, sterilizováno při teplotě 121 °C po dobu 45 minut, přičemž bylo inokulováno 500 mililitry inokulační kultury připravené stejným způsobem jako v příkladu 1, načež bylo médium inkubováno při teplotě 28 °C, aerováno 200 litry sterilního vzduchu/hodinu a celý podíl byl promícháván míchadlem s plochými lopatkami při 400 otáčkách za minutu.
Složení TT/1 biokonverzního média glukóza bramborový škrob soj ová moučka kvasnicový extrakt (Gistex) pepton
CoCl2 x 6H2O slunečnicový olej
125,0 gramů 25,0 gramů 50,0 gramů 50,0 gramů 50,0 gramů
10,0 miligramů 10,0 gramů ve 4500 mililitrech vody z vodovodu
Před sterilizací byla hodnota pH tohoto biokonverzního média upravena na 7,0.
Kultivace potom pokračovala při teplotě 28 °C po dobu 96 hodin. Potom bylo do této kultury přidáno 2,5 gramu sodné soli kompaktinu v acidické formě ve sterilním zfiltrovaném vodném roztoku. Po pátém dnu provádění fermentace byla sodná sůl kompaktinu v acidické formě zcela spotřebována ve fermentačním živném médiu. Potom bylo zopakováno zásobování substrátu, což bylo prováděno po dobu dalších 3 dní v dávkách 2,5 gramu/den. Tato sodná sůl kompaktinu v acidické formě se postupně spotřebovala během čtyř dnů, přičemž bylo dosaženo kompletní převedení na pravastatin. Podle výsledků HPLC měření (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) provedenému na konci fermentační periody bylo z 10 gramů kompaktinového substrátu vyprodukováno 9 gramů pravastatinu.
Po dokončení biokonverze byl pravastatin získaný v koncentraci 1800 gg/mililitr oddělen následujícím způsobem:
• « • 9 · · * · • 9 9 9 9 9 ♦ · 9 · • 9 9·· 9*9
999· 9 ·· 9999 »· ♦♦·» litrů kultivačního živného média bylo odstřeďováno při 2500 otáčkách za minutu po dobu 20 minut. Potom byly k oddělené myceliální hmotě přidány 2 litry vody a takto získaná suspenze byla potom promíchávána po dobu jedné hodiny a zfiltrována. Tyto dva filtráty byly spojeny a vedeny kolonou naplněnou 300 gramy (540 mililitrů) pryskyřice Dowex Al 400 (0H~) (průměr kolony: 4 centimetry, výška pryskyřicového lože: 43 centimetrů) v průtočném množství 500 mililitrů za hodinu, načež potom bylo toto pryskyřicové lože promyto 1 litrem deionizované vody. Potom byla tato kolona eluována 1 litrem směsi acetonu a vody (v poměru 1 : 1) obsahující 10 gramů chloridu sodného, přičemž byly shromažďovány 50 mililitrové frakce. Tyto frakce byly potom analyzována metodou TLC (chromatografie v tenké vrstvě), stejným způsobem jako v příkladu 1. Frakce obsahující produkt byly potom spojeny a použitý aceton byl oddestilován za použití vakua. Hodnota pH tohoto koncentrátu byla potom upravena na 3,5 až 4 za pomoci 15% kyseliny sírové, načež byl tento podíl extrahován třemi podíly, každý po 250 mililitrech, ethylacetátu. Do tohoto spojeného podílu ethylacetátových extraktů bylo potom přidáno 40 mililitrů deionizované vody, načež byla hodnota pH upravena na 7,5 až 8,0 za pomoci 1 M roztoku hydroxidu sodného. Po 15 minutách promíchávání byly vodná fáze a ethylacetátová fáze odděleny a potom byl ethylacetátový roztok extrahován dvěma podíly, každý po 40 mililitrech, deionizované vody, jak již bylo uvedeno výše. Potom byly spojené alkalické vodné roztoky zkoncentrovány na objem 50 mililitrů a tento podíl byl zpracován chromatografickou metodou v koloně naplněné 600 mililitry neiontové pryskyřice Diaion HP20 (Mitsubishi Co., Japonsko) (průměr kolony: 3,8 centimetru, výška pryskyřicového lože: 53 centimetrů). Tato kolony byla potom promyta 600 mililitry deionizované vody, načež byla eluována ·· tttttttt tt ·4 • tttt ·
4 4
4·4 tt · tttt·· tttt tt* • * · · • · 4 • 44 • · tttt · tt směsmi acetonu a deionizované vody, přičemž koncentrace acetonu v této směsi vzrůstala v 5% přírůstcích a shromažďovány byly frakce po 50 mililitrech. Takto získaný eluát byl analyzován TLC metodou stejným způsobem jako v příkladu 1. Pravastatin byl eluován z kolony směsí acetonu a deionizované vody obsahující 15% acetonu. Frakce obsahující pravastatin jako jedinou komponentu byly spojeny, načež byl tento roztok zkoncentrován ve vakuu na objem 150 mililitrů. V následující fázi bylo k tomuto zkoncentrovanému vodnému roztoku přidáno 0,6 gramu aktivního uhlí a pravastatin byl čištěn při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Potom bylo aktivní uhlí zfiltrováno a filtrát byl lyofilizován. Takto získaných 6,5 gramu lyofilizovaného pravastatinu bylo krystalováno dvakrát ze směsi ethanolu a ethylacetátu. Takto získaná sraženina byla zfiltrována a promyta 20 mililitry ethylacetátu a 20 mililitry n-hexanu a potom byl tento produkt usušen ve vakuu při teplotě místnosti. Tímto způsobem bylo získáno 4,6 gramu chromatograficky čistého pravastatinu.
Příklad 5
Podle tohoto příkladu byla suspenze sporů připravena za použití 5 mililitrů sterilní destilované vody odebrané z povrchu 10 dní staré kultury ze šikmého agaru na bázi rozpustného škrobu, což bylo provedené stejným způsobem jako v příkladu 1, kmene Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P^ [NCAIM (P) B 001272], která je schopna 60-hydroxylace sodné soli kompaktinu v acidické formě, a takto získaná suspenze spor byla použita k inokulování 100 mililitrů inokulačního média TI sterilizovaného v Erlenmeyerově nádobě o objemu 500 mililitrů. Složení tohoto média TI bylo stejné jako je popsáno v příkladu 1.
ΦΦ φφφφ φ · φφφ φφ φφφφ φ* φφφφ
Takto získané inokulované médium bylo potom protřepáváno na rotační třepačce (250 otáček za minutu, amplituda 2,5 centimetru) po dobu 3 dní při teplotě 28 °C, načež byly 5 mililitrové alikvotní podíly této vyvíjecí kultury převedeny do 100-100 mililitrů biokonverzního média TT/1 sterilizovaného v Erlenmeyerově nádobce o objemu 500 mililitrů po dobu 25 minut při teplotě 121 °C. Složení tohoto TT/1 média je popisováno v příkladu 4. Nádoby byly potom protřepávány na rotační protřepávačce (250 otáček za minutu, amplituda 2,5 centimetru) po dobu 3 dní při teplotě 25 °C, načež bylo do této kultury přidáno 10-10 miligramů kompaktinového substrátu (sodná sůl kompaktinu v acidické formě) ve sterilním zfiltrovaném vodném roztoku a potom probíhala fermentace po dobu 168 hodin.
Na konci biokonverze byl obsah pravastatinu ve fermentačním živném médiu stanoven metodou HPLC. V tomto okamžiku byla průměrná koncentrace pravastatinu pg/mílilitr.
Příklad 6
Při provádění postupu podle tohoto příkladu byla fermentace, zásobování substrátu a biokonverze provedeny za použití kmene IDR-Pg [NCAIM (Ρ) B 001273] Micromonospora megalomicea ssp. nigra, stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 5. Obsah pravastatinu ve fermentačním živném médiu byl stanoven metodou HPLC. Na konci biokonverze byl obsah pravastatinu v tomto živném médiu 50 pg/mililitr.
♦ · *· ···· *· ·· • · · · · » φ · φ
Příklad 7
Podle tohoto příkladu bylo 5 mililitrů inokulační kultury kmene IDR-P4 [NCAIM (P) B 001271] Micromonospora purpurea, připravené stejným způsobem jako v příkladu 1, použito k naočkování 100-100 mililitrů TT/14 média připraveného v Erlenmeyerových nádobkách o objemu 500 mililitrů, načež proběhla sterilizace při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.
Složení média TT/14
| škrob z rajských jablíček | 5,0 | gramů |
| glukóza | 25,0 | gramů |
| kvasnicový extrakt (Gistex) | 15,0 | gramů |
| pepton | 15,0 | gramů |
| CaC03 | 1,0 | gram |
v 1000 mililitrech vody z vodovodu
Hodnota pH tohoto biokonverzního média byla potom před sterilizací upravena na 7,0.
Nádoby byly protřepávány na rotační třepačce (250 otáček za minutu, amplituda 2,5 centimetru) po dobu 3 dní. Zásobování substrátu, biokonverze a stanovení obsahu pravastatinu bylo provedeno stejným způsobem jako v příkladu
5. Na konci biokonverze byl obsah pravastatinu ve fermentačním živném médiu 40 pg/mililitr.
0 0 0 0 0 0 0 0
0000 0 ·· ·0
0 0 0
0 0
0 0 0
0 0 •0 0000
Příklad 8
Při provádění postupu podle tohoto příkladu byla fermentace, zásobování substrátu a biokonverze provedeny za použití kmene IDR-Ργ [NCAIM (P) B 00127^] Micromonospora rosaria, stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1. Na konci biokonverze bylo ve ferraentačním živném médiu pomocí metody HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografická metoda) zjištěno 350 gg/mililitr pravastatinu.
«Φ φφφφ φ φφφφ φφφφ φ ♦ · φφφ φ φ φφφ φφφφ φ φ φφφ φφφ φ φφ φφφφ φ* φφφφ £0 6JÍ
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob mikrobiální přípravy sloučeniny obecného vzorce (I):Φ •Φ φφφφ <») ve kterém:R znamená alkalický kov nebo amonný ion, submerzni kultivací kmene Micromonospora, který je schopen όβ-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II) při aerobních podmínkách, přičemž následuje oddělení a čištění takto získané sloučeniny obecného vzorce (I) získané v průběhu biokonverze, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:(a) kultivaci kmene Micromonospora, který je schopenΦΦ φφφφ ·· ·» • · φ φφφφ φ φ · φ · φ φ φ · · · φ · · · · φφφφ φ φφ φφφφ φφ φφ φ φ φ φ • φ · φφφ φ φ φφφφ6β-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II) , ve kterém R má stejný význam jako bylo uvedeno shora, při teplotě v rozmezí od 25 do 32 C na nutričním médiu obsahující získatelné zdroje uhlíku a dusíku a minerální soli, načež následuj e (b) zásobování substrátu, který má být transformován na vyvíjecí kulturu, potom (c) hydroxylaci substrátu až do dokončení biokonverze, potom (d) oddělení sloučeniny obecného vzorce (I) z tohoto kultivačního prostředí, a v případě potřeby její čištění.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije kmen Micromonospora sp. IDR-P^, uložený v The National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešť, Maďarsko, pod číslem NCAIM (P)B 001268 nebo mutant tohoto kmene, který je schopen6β-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II).
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije kmen Micromonospora purpurea IDR-P^, uložený v The National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešť, Maďarsko, pod číslem NCAIM (P)B 001271 nebo mutant tohoto kmene, který je schopen6β-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II).
- 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije kmen Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P$, uložený v The National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešť, Maďarsko, pod číslem NCAIM (P) B 001272 nebo mutant tohoto kmene, který je schopen 6β-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II).♦ ·« • · · ·· ·♦··
- 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije kmen Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P&, uložený v The National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešť, Maďarsko, pod číslem NCAIM (P) B 001273 nebo mutant tohoto kmene, který je schopen όβ-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II).
- 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije kmen Micromonospora rosaria IDR-Ρη, uložený v The National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešť, Maďarsko, pod číslem NCAIM (P)B 001274 nebo mutant tohoto kmene, který je schopen όβ-hydroxylovat sloučeninu obecného vzorce (II).
- 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se sloučenina obecného vzorce (I), vzniklá během fermentace, oddělí z kultivačního prostředí adsorpcí na aniontovýměnné pryskyřici nebo extrakčním postupem za použití organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, přičemž potom následuje příprava laktonového derivátu nebo sekundární aminové soli této sloučeniny jako meziproduktu, nebo vyčištěním alkalického vodného extraktu získaného z extraktu fermentačního živného prostředí na bázi organického rozpouštědla chromatografickým postupem na neiontové adsorbční pryskyřici.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9902352A HUP9902352A1 (hu) | 1999-07-12 | 1999-07-12 | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2002119A3 true CZ2002119A3 (cs) | 2003-02-12 |
| CZ297009B6 CZ297009B6 (cs) | 2006-08-16 |
Family
ID=89998701
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20020119A CZ297009B6 (cs) | 1999-07-12 | 2000-06-29 | Zpusob hydroxylace kompaktinu na pravastatin za pouzití mikromonospor |
| CZ2002127A CZ2002127A3 (cs) | 1999-07-12 | 2000-07-11 | Mikrobiální způsob výroby pravastatinu |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2002127A CZ2002127A3 (cs) | 1999-07-12 | 2000-07-11 | Mikrobiální způsob výroby pravastatinu |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6905851B1 (cs) |
| EP (3) | EP1190087B1 (cs) |
| JP (2) | JP4531315B2 (cs) |
| KR (2) | KR100479837B1 (cs) |
| CN (2) | CN1590555A (cs) |
| AP (1) | AP1405A (cs) |
| AT (1) | ATE243262T1 (cs) |
| AU (2) | AU773633B2 (cs) |
| BG (1) | BG65109B1 (cs) |
| BR (1) | BR0013156A (cs) |
| CA (2) | CA2379015A1 (cs) |
| CZ (2) | CZ297009B6 (cs) |
| DE (1) | DE60003424T2 (cs) |
| DK (1) | DK1190087T3 (cs) |
| ES (1) | ES2200891T3 (cs) |
| HR (1) | HRP20020028B1 (cs) |
| HU (1) | HUP9902352A1 (cs) |
| IL (2) | IL147583A0 (cs) |
| IS (1) | IS2138B (cs) |
| MX (1) | MXPA02000356A (cs) |
| NO (1) | NO20020119L (cs) |
| NZ (1) | NZ516563A (cs) |
| OA (1) | OA12150A (cs) |
| PL (2) | PL353493A1 (cs) |
| PT (1) | PT1190087E (cs) |
| RU (2) | RU2235780C2 (cs) |
| SK (2) | SK285726B6 (cs) |
| TR (1) | TR200200726T2 (cs) |
| UA (1) | UA67854C2 (cs) |
| WO (2) | WO2001004340A1 (cs) |
| YU (1) | YU2002A (cs) |
| ZA (1) | ZA200200273B (cs) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI9800046A (sl) | 1998-02-18 | 1999-08-31 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za pridobivanje inhibitorjev HMG-CoA reduktaze visoke čistosti |
| HUP9902352A1 (hu) * | 1999-07-12 | 2000-09-28 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
| DE04010770T1 (de) | 1999-11-30 | 2005-10-20 | Biogal Gyogyszergyar | Verfahren zur Rückgewinnung von Statinverbindungen aus einer Fermentationsbrühe |
| AU779306B2 (en) | 1999-12-14 | 2005-01-13 | Teva Gyogyszergyar Reszvenytarsasag | Novel forms of pravastatin sodium |
| JP3737801B2 (ja) * | 2000-10-05 | 2006-01-25 | テバ ジョジセルジャール レースベニュタールシャシャーグ | プラバスタチンラクトン及びエピプラバスタチンを実質的に含まないプラバスタチンナトリウム、並びにそれを含む組成物 |
| JP3236282B1 (ja) * | 2000-10-16 | 2001-12-10 | 三共株式会社 | プラバスタチンを精製する方法 |
| ATE356554T1 (de) * | 2001-02-09 | 2007-04-15 | Unilever Nv | Nahrungsmittel enthaltend sojaprotein und statin |
| JP2003026634A (ja) * | 2001-07-17 | 2003-01-29 | Mercian Corp | プラバスタチンナトリウム塩の製造方法 |
| US6716615B2 (en) | 2002-02-27 | 2004-04-06 | Yung Shin Pharmaceutical Ind. Co., Ltd. | Strains of saccharaothrix, process for producing pravastatin using the strains and isolation process of (HMG)-CoA reductase |
| EP1452602A1 (en) * | 2003-02-25 | 2004-09-01 | Antibiotic Co., | Method for production of pravastatin by fermentation |
| CN1244688C (zh) | 2003-07-09 | 2006-03-08 | 上海天伟生物制药有限公司 | 生产普伐他汀钠的微生物和方法 |
| WO2005051372A2 (en) | 2003-11-24 | 2005-06-09 | Teva Gyógyszergyár Zártköruen Muködo Részvénytársaság | Method of purifying pravastatin |
| MX2010008654A (es) * | 2008-02-06 | 2010-10-06 | Biocon Ltd | Medios de fermentacion y procedimientos para los mismos. |
| RU2522806C1 (ru) * | 2012-11-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Усовершенствованный способ очистки правастатина |
| JP6441599B2 (ja) * | 2014-07-14 | 2018-12-19 | 合同酒精株式会社 | プラバスタチンの製造法 |
| CN114031496A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-02-11 | 广东蓝宝制药有限公司 | 一种高纯度普伐他汀1,1,3,3-四甲基丁胺的制备方法 |
| CN114133331A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-04 | 广东蓝宝制药有限公司 | 一种回收获得高纯度普伐他汀酯的方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX7065E (es) | 1980-06-06 | 1987-04-10 | Sankyo Co | Un procedimiento microbiologico para preparar derivados de ml-236b |
| JPS5810572A (ja) | 1981-07-07 | 1983-01-21 | Sankyo Co Ltd | Ｍｌ−２３６ｂ誘導体およびその製造法 |
| JPS5889191A (ja) | 1981-11-20 | 1983-05-27 | Sankyo Co Ltd | ３−ヒドロキシ−ｍｌ−２３６ｂ誘導体の製造法 |
| JPS59175450A (ja) * | 1983-03-24 | 1984-10-04 | Sankyo Co Ltd | Ｍｌ−２３６ｂ誘導体 |
| US5179013A (en) * | 1987-02-02 | 1993-01-12 | Sankyo Company, Limited | Cytochrome P-450 enzymes |
| JPH06253853A (ja) * | 1993-03-09 | 1994-09-13 | Asahi Chem Ind Co Ltd | マクロライド抗生物質生合成遺伝子を含有するｄｎａ |
| US6043064A (en) * | 1993-10-22 | 2000-03-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Enzymatic hydroxylation process for the preparation of HMG-CoA reductase inhibitors and intermediates thereof |
| JPH08149986A (ja) * | 1994-09-28 | 1996-06-11 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 |
| JPH0889277A (ja) * | 1994-09-28 | 1996-04-09 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 |
| US5942423A (en) * | 1995-06-07 | 1999-08-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Conversion of compactin to pravastatin by actinomadura |
| SI20072A (sl) * | 1998-09-18 | 2000-04-30 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za pridobivanje inhibitorjev HMG-CoA reduktaze |
| US6682913B1 (en) * | 1999-02-03 | 2004-01-27 | Institute For Drug Research Ltd. | Microbial process for preparing pravastatin |
| HUP9902352A1 (hu) * | 1999-07-12 | 2000-09-28 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
| IN191580B (cs) * | 1999-12-17 | 2003-12-06 | Ranbaxy Lab Ltd |
-
1999
- 1999-07-12 HU HU9902352A patent/HUP9902352A1/hu unknown
-
2000
- 2000-06-29 CN CNA2004100493556A patent/CN1590555A/zh active Pending
- 2000-06-29 EP EP00944121A patent/EP1190087B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 OA OA1200200015A patent/OA12150A/en unknown
- 2000-06-29 JP JP2001509543A patent/JP4531315B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 RU RU2002103376/13A patent/RU2235780C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 DK DK00944121T patent/DK1190087T3/da active
- 2000-06-29 NZ NZ516563A patent/NZ516563A/xx unknown
- 2000-06-29 AP APAP/P/2002/002404A patent/AP1405A/en active
- 2000-06-29 YU YU2002A patent/YU2002A/sh unknown
- 2000-06-29 CN CN00811127A patent/CN1399686A/zh active Pending
- 2000-06-29 WO PCT/HU2000/000066 patent/WO2001004340A1/en active IP Right Grant
- 2000-06-29 US US10/030,726 patent/US6905851B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 SK SK49-2002A patent/SK285726B6/sk unknown
- 2000-06-29 DE DE60003424T patent/DE60003424T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 AU AU58355/00A patent/AU773633B2/en not_active Ceased
- 2000-06-29 EP EP03075550A patent/EP1327689A1/en not_active Withdrawn
- 2000-06-29 AT AT00944121T patent/ATE243262T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 KR KR10-2002-7000475A patent/KR100479837B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 ES ES00944121T patent/ES2200891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 MX MXPA02000356A patent/MXPA02000356A/es active IP Right Grant
- 2000-06-29 TR TR2002/00726T patent/TR200200726T2/xx unknown
- 2000-06-29 BR BR0013156-3A patent/BR0013156A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-06-29 PT PT00944121T patent/PT1190087E/pt unknown
- 2000-06-29 UA UA2002010326A patent/UA67854C2/uk unknown
- 2000-06-29 IL IL14758300A patent/IL147583A0/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 PL PL00353493A patent/PL353493A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-06-29 CZ CZ20020119A patent/CZ297009B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 CA CA002379015A patent/CA2379015A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-11 JP JP2001508931A patent/JP2003528576A/ja active Pending
- 2000-07-11 CZ CZ2002127A patent/CZ2002127A3/cs unknown
- 2000-07-11 PL PL00364872A patent/PL364872A1/xx unknown
- 2000-07-11 AU AU63492/00A patent/AU6349200A/en not_active Abandoned
- 2000-07-11 SK SK61-2002A patent/SK612002A3/sk unknown
- 2000-07-11 IL IL14758800A patent/IL147588A0/xx unknown
- 2000-07-11 CA CA002373544A patent/CA2373544A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-11 WO PCT/US2000/019384 patent/WO2001003647A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-07-11 KR KR1020027000486A patent/KR20020060150A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-07-11 EP EP00950379A patent/EP1198448A4/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-01-10 NO NO20020119A patent/NO20020119L/no not_active Application Discontinuation
- 2002-01-10 HR HR20020028A patent/HRP20020028B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-01-11 IS IS6227A patent/IS2138B/xx unknown
- 2002-01-11 ZA ZA200200273A patent/ZA200200273B/xx unknown
- 2002-01-14 BG BG106302A patent/BG65109B1/bg unknown
-
2004
- 2004-05-13 RU RU2004114667/13A patent/RU2004114667A/ru not_active Application Discontinuation
- 2004-12-16 US US11/014,658 patent/US20050124051A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2235780C2 (ru) | Гидроксилирование компактина до правастатина с помощью micromonospora | |
| US6682913B1 (en) | Microbial process for preparing pravastatin | |
| JP2003528576A5 (cs) | ||
| EP1154979B1 (en) | Microbial process for preparing pravastatin | |
| JP3854866B2 (ja) | ミコフェノール酸およびその誘導体の製造方法 | |
| HU225936B1 (en) | Hydroxylation of compactin to pravastatin by micromonospora | |
| EP1491522A1 (en) | Microbial process for preparing pravastatin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20080629 |