JP4531315B2 - ミクロモノスポラによるコンパクチンのプラバスタチンへのヒドロキシル化 - Google Patents
ミクロモノスポラによるコンパクチンのプラバスタチンへのヒドロキシル化 Download PDFInfo
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Description
(技術分野)
本発明はプラバスタチンの調製のための新規な微生物工程に関する。
【0002】
(背景技術)
さらにとりわけ、本発明は、一般式(II)の化合物(式中Rはアルカリ金属またはアンモニウムイオンを表す)から、式(I)
【0003】
【化2】
【0004】
のプラバスタチンを調製するための微生物工程に関し、前記微生物は、ミクロモノスポラ(Micromonospora)属からの原核生物であり、6β位にて前記一般式(II)の化合物をヒドロキシル化できるものである。
【0005】
高コレステロール血症は、アテローム性動脈硬化症疾患、とりわけ冠状心臓疾患に対する主要なリスク因子として認識されてきた。過去20年間、コレステロール生合成における主要律速酵素として3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−コエンザイムA リダクターゼ(HMG−CoAリダクターゼ EC.1.1.1.34)が多数研究されてきた。異なる真菌種の選択株によって生合成されたメビノリンおよび関連する化合物が、この酵素の競合的阻害剤として明らかになった(Endo,A.,et al.,J.Antibiotics 29,1346−1348(1976);Endo,A.et al.,FEBS Lett.72,323−326(1976);Kuo,C.H.et al.,J.Org.Chem.48,1991−1998(1983))。
【0006】
プラバスタチンもまた、HMG−CoAリダクターゼ阻害剤のファミリーの一員である。最初に、プラバスタチンは、コンパクチンの代謝研究の過程で、イヌにおけるコンパクチンの主要な尿代謝物として(Tanaka,M.etal.,未発行)発見された(Arai,M.et al.,Sankyo Kenkyusho Nempo,40,1−38(1988))。
【0007】
コンパクチンのヒドロキシル化産物としてのプラバスタチンの主要な特徴的特性は、その組織選択性である。この薬物は、肝臓および腸においてステロール合成を強く阻害するが、しかし他の器官ではその阻害は弱い。プラバスタチンが他のHMG−CoAリダクターゼ阻害剤よりも毒性が低いことが利点である。
【0008】
コンパクチンの微生物的ヒドロキシル化が、多くの異なる真菌種に属するいくつかの種株によって、および他のストレプトマイシス ロセオクロモジェネス(Streptmyces roseochromogenes)およびストレプトマイシス カルボフィラス(Streptomyces carbophilus)の中で、ノカルディア(Nocardia)、アクチノマデュラ(Actinomadura)およびストレプトマイシス(Streptomyces)種に属する放線菌種の株によって、種々の程度で実施できることが報告されてきた(米国特許第5,179,013号、米国特許第4,448,979号、米国特許第4,346,227号、米国特許第4,537,859号、日本特許第58,010,572号)。
【0009】
コンパクチンからのプラバスタチンの産出のために真菌を用いる際の問題は、おそらくその抗真菌活性のために、これらの微生物が一般的に、液体培養培地中のより高い濃度のコンパクチンに対して耐性ではないことである(Serizawa,N.et al.,J.Antibiotics 36,887−891(1983))。ストレプトマイシス カルボフィラス(Streptmycescarbophilus)において、シトクロームP450系が、コンパクチンのプラバスタチンへのヒドロキシル化に必要であることが示された(Matsuoka,T.et al.,Eur.J.Biochem.184,707−713(1989))。そのような酵素の使用によるヒドロキシル化能の遺伝的改善の難しさは、それが単一のタンパク質というよりもタンパク質の複合体であることにある。
【0010】
本発明者らの検討は、先行特許明細書で公知であるものよりも、より高い収率で、そしてより高い基質濃度を適用することで、コンパクチンの酸性形態の塩からプラバスタチンを産出する可能性のある放線菌類株を発見することに焦点を当てた。
【0011】
約6000の放線菌類のスクリーニング(その大部分は本発明者らが単離したが、International strain collectionより認証された株も含む)を行い、5つのストレプトマイシス(Streptomyces)および5つのミクロモノスポラ(Micromonospora)をさらなる検討のために選択した。これらの菌は、コンパクチンの酸性形態のナトリウム塩をプラバスタチンへとヒドロキシル化できることが証明された。これらの10の放線菌類株、このうち8株が本発明者らの研究室にて種レベルで分類学的に同定されたものであるが、は以下であった。
【0012】
ストレプトマイセス ビオラセウス(Streptomyces violaceus)(Kampfer et al,1991による)、株番号1/43
ストレプトマイセス ロカイ(Streptomyces rochei)(Berger et al.,1949;Waksman and Lechevalier,1953)、株番号1/41
ストレプトマイセス レジストマイシフィカス(Streptomyces resistomycificus)(Lindenbein,1952)株番号1/44
ストレプトマイセス sp.(Streptomyces sp.)株番号1/28
ストレプトマイセス ラナトゥス(Streptomyces lanatus)(Frommer,1959)、株番号1/16
ミクロモノスポラ sp.(Micromonospora sp.)株番号IDR−P3
ミクロモノスポラ プルプレア(Micromonospora purpurea)(Luedemann and Brodsky,1964)株番号IDR−P4
ミクロモノスポラ エキノスポラ(Micromonospora echinospora)(Luedemann and Brodsky,1964)株番号IDR−P5ミクロモノスポラ メガロミセア(Micromonospora megalomicea)(Weinstein et al,1969)株番号IDR−P6
ミクロモノスポラ ロサリア(Micromonospora rosaria)(Horan and Brodsky,1986)株番号IDR−P7
【0013】
現在まで、文献で、ミクロモノスポラ(Micromonospora)のコンパクチンの酸性形態の塩をプラバスタチンに変換する能力におけるデータが存在しないので、本発明者らは、この特定の酵素的能力だけでなく、これらの上記で列記したミクロモノスポラ(Micromonospora)の株の分類学的位置をも徹底的に研究した。
【0014】
遺伝的レベルでの株IDR−P3 、−P4 、−P5 、−P6 および−P7 の分類学的位置
直径約0.4〜0.7μmの分岐菌糸と比較して、これらのすべての株は、よく発達した菌糸体を産出した。気中菌糸体は存在しないか、または痕跡のみで現れる。運動能力のない胞子が別々に胞子柄上にうまれる。培養基菌糸体の菌糸はグラム陽性であり、抗酸性ではない。株番号IDR P3 〜P7 は好気性、化学有機栄養性で6.0以下のpHに感受性である。細胞壁はメソ‐ジアミノピメリン酸を含む。以上で列記した、鍵となる特性としての診断特性は、これらの単胞子放線菌類株がミクロモノスポラ(Micromonospora)属の典型的な一員であることを明らかに示唆している。
【0015】
ミクロモノスポラ sp.(Micromonospora sp.)株番号IDR−P3 の分類学的説明
微小形態学的特性:培養基菌糸体は、発達した、直線というよりもより湾曲した、形態学的に分岐した糸状体からなる。胞子柄上の胞子は、直径およそ1.8μmの単一の、球状であり、菌糸状糸状体に多少均一に分散している。胞子は無柄か、または単胞子柄の末端上にある。両方の培養液において、おそらく成熟胞子の放出がとても速いので、胞子は菌糸上で観察されなかった。
【0016】
培養−マクロ形態学的特性:
チャペック‐スクロース寒天:中程度の増殖、コロニーは、点様黒色胞子形成領域に覆われた赤茶色である。
グルコース‐アスパラギン寒天:増殖は、点様で、高さがあり、赤茶色または黒色コロニーとして記録された。赤茶けた拡散性色素。
栄養寒天:並の増殖、高さのある赤茶けた茶色または黒色コロニー。培地中に赤茶けた外色素。
酵母抽出物‐麦芽抽出寒天(ISP Med.2):かなり増殖、高さのある、ひだのある茶色コロニーで、黒色胞子形成領域または「疑似気中菌糸体」(これは制限された白っぽい、または灰色がかったブルームとして現れる)によって部分的に覆われる。茶色がかった、または茶色がかった赤色の可溶性色素。
無機塩‐デンプン寒天(ISP Med.4):中程度の増殖、赤色がかった茶色の高さのあるひだ性のコロニー。明赤色がかった可溶性色素。
グリセロール‐アスパラギン寒天(ISP Med.5):痕跡のみの増殖、オフホワイトまたは明褐色着色な平坦コロニー。薄バラ色の可溶性色素。
炭素供給源利用:L−アラビノース、D−ガラクトース、D−フルクトース、D−グルコース、D−キシロース、ラクトース、メリビオース、スクロース、D−マンニトール、ダルシトール、グリセロールおよびイノシトール上での良好な増殖およびその陽性利用。L−ラムノース、D−ラフィノースおよびイヌリンでの増殖は、陰性対照培地上よりもわずかによかった。
窒素供給源利用:酵母抽出物およびNZ−アミンでの良好な増殖、NaNO3 は全く利用されなかったか若干しか利用されなかった。
【0017】
他の生理学的−生化学的特性:セルロースおよびデンプンがヒドロキシル化され、牛乳が激しく消化された。硝酸塩還元試験は陰性である。炭酸カルシウム(pH5.8〜6.0)なしでのジャガイモ片上では増殖しなかった。メラノイド色素産出はなかった。
【0018】
この株番号IDR−P3 のミクロモノスポラ sp.(Micromonospora sp.)は、Lake Balaton(ハンガリー)の泥試料より単離された。
【0019】
体系的位置:ミクロモノスポラ(Micromonospora)属の間での本株の正確な分類学的位置を明らかにするために、さらなる相対的体系的検討が必要となる。特定の特性に基づけば、株IDP−P3 がミクロモノスポラ(Micromonospora)属内の新規の種を示しているとするのは不可能ではないように思われる。
【0020】
ミクロモノスポラ(Micromonospora)株IDR−P4 、−P5 、−P6 および−P7 の差異的−分析的特徴の説明および同定
株IDR−P4
以上で列記した分析的培地上において、一般的に良好な増殖、オレンジ色〜赤オレンジ色、赤色、時折黄色がかったまたはバラ色に着色したコロニー。可溶性色素および気中菌糸体は産出されない。単胞子の数は比較的少ない。これらは、胞子柄末端上に現れる。培養基菌糸体は、よく分岐した菌糸よりなる。気中菌糸体は存在しない。D−メルビオース、ラフィノース、マンニトール、グリセロール、ラクトース、L−ラムノース上では増殖せず、しかしD−アラビノース、グルコース、D−キシロース上ではよく増殖し、D−ガラクトースおよびD−フルクトース上では若干増殖した。これらの従来の分析的特徴に基づき、本研究者らは、本株をミクロモノスポラ プルプレア(Micromonospora purpurea)(Luedemann and Brodsky,1964)の一員として同定した。
【0021】
株IDR−P5
本株は、成熟まで、主として単担胞子体および胞子柄に強く接着する球状暗茶色〜黒色胞子(直径0.8〜1.5μm)を産出する。本発明者らの電子顕微鏡観察に従うと、これらの胞子の表面上において、いぼ状の構造または成長(Bergey’s Manual of Syst.Bac.のVol.4、1989、ページ2448に従うと「短く太いとげ」)が観察され、これはミクロモノスポラ エキノスポラ(Micromonospora echinospora)の胞子の特徴である。一方、本株の培養−形態学的および生理学的診断的特性もM.エキノスポラ(M. echinospora)のものととても類似している。標準の分析用培地上でよく発達したコロニーの色は、褐色−茶色または暗紫色である。胞子形成層は黒色または紫色がかった黒色であり、蝋状である。気中菌糸体は存在しない。メラニン色素は産出されない。牛乳は分解される。D−キシロース、D−アラビノース、D−グルコースおよびスクロース上でよく増殖するが、しかしL−ラムノース、ラフィノース、D−ガラクトース、D−フルクトース、D−メリビオースおよびグリセロールでは増殖しない。本発明者らは、本株をミクロモノスポラ エキノスポラ(Micromonospora echinospora)の典型的な一員として見なす。
【0022】
株IDR−P6
主な分析用培地上で、中程度〜弱い増殖。長い分岐した糸状体(直径およそ0.6μm)および限定数の単独、球状、暗黒色胞子(直径0.6〜1.0μm)からなる褐色〜褐赤色コロニー。気中菌糸体は産出されない。特定の培地において、弱い赤みかかった、またはバラ色の可溶性色素が形成される。チロシン寒天上では、メラノイド色素は産出されなかった。基礎培地上では、以下の炭素供給源:D−キシロースおよびD−フルクトースが本株によって利用され、D−メリビオース、マンニトールおよびガラクトースは若干だけ利用され、しかしグリセロール、L−ラムノース、ラクトースおよびラフィノースでは増殖が観察されないか、散在性増殖しか観察されなかった(Kawamoto,I.et al.:Agric.Biol.Chem.,47,203−215,1983も参照のこと)。株番号IDR−P6 は、ミクロモノスポラ メガロミセア(Micromonospora megalomicea)属(Weinstein,1972)と明らかに類似性を示しており、本発明者らは、これをこの種の一員と考察する。
【0023】
株IDR−P7
ベネット寒天、チャペックスクロース寒天、グルコース−アスパラギン寒天、栄養寒天、オートミール寒天、ジャガイモ−デキストロース寒天等上で、良好〜中程度の増殖。栄養菌糸体色素の色は、赤色がかった茶色〜紫色がかった茶色の範囲である。特定の培地上で、ワインレッド拡散性色素が形成される。コロニーの表面上に黒色のスポットがよく産出される。栄養菌糸(平均直径:0.5μm)が強く分岐している。胞子(直径1.4〜1.7μm)が単独で、無柄か、または短菌糸体上に存在し、菌糸の長さに沿って現れる。増殖および胞子形成は、Luedemannのオープンウェブ型である。本株によって、以下の化合物、D−グルコース、ラクトース、D−マンニトール、L−ラムノース、スクロースおよびD−キシロースが培地中の炭素供給源としてのみ利用され、ズルシトール、グリセロール、D−メリビオースおよびD−ラフィノースは利用されない。本発明者らは、株番号IDR−P7 を、ミクロモノスポラ ロサリア(Micromonospora rosaria)(Horan and Brodsky,1986)の典型的な一員として同定した。
【0024】
以上に示したミクロモノスポラ(Micromonospora)株は、下記の与えられた番号指定において、ハンガリー、ブタペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに寄託された。
【0025】
【0026】
以上に基づき本発明は、一般式(II)の化合物(式中Rはアルカリ金属、またはアンモニアイオンを意味する)から、式(I):
【0027】
【化3】
【0028】
のプラバスタチンを調製するための新規の微生物工程に関し、前記工程は、好気性条件下で、式(II)の化合物を6β−ヒドロキシル化可能なミクロモノスポラ(Micromonospora)を液内培養し、生物変換の過程において形成された式(I)の化合物を分離および精製することによるものであって、以下のステップ:
a)式(II)(式中Rは上記で定義)の化合物を6β−ヒドロキシル化可能なミクロモノスポラ株を、利用可能な炭素‐および窒素供給源および無機塩を含む栄養培地上で培養すること、その後
b)増殖した培養液中に変換すべき基質の添加すること、次いで
c)生物変換が完了するまで前記基質をハイドロキシル化させること、次いで
d)培養培地から式(I)の化合物を分離し、望むならばこれを精製すること
からなるものである。
【0029】
本発明の範囲は、コンパクチンの酸性形態のナトリウム塩をプラバスタチンにヒドロキシル化することが可能な、ミクロモノスポラ属に属する種の野生型種および全ての変異体まで広がる。
【0030】
本発明の好ましい実施様態によれば、プラバスタチンは、Micromonospora sp.IDR−P3 [NCAIM(P)B 001268]、Micromonospora purpurea IDR−P4 [NCAIM(P)B 001271]、Micromonospora echinosporaIDR−P4 [NCAIM(P)B 001272]、Micromonospora megalomicea IDR−P6 [NCAIM(P)B 001273]、およびMicromonospora rosaria IDR−P7 [NCAIM(P)B 001274]からなる群より選択したミクロモノスポラ株で産出される。
【0031】
本発明の最も好ましい実施様態によれば、プラバスタチンは、Micromonospora sp.株IDR−P3 [NCAIM(P)B 001268]で産出される。
【0032】
本発明は、in situ発酵方法によって実施することができ、すなわち、ヒドロキシル化は活発に増殖しているミクロモノスポラ培養液の関与によって達成される。
【0033】
ヒドロキシル化は、攪拌フラスコ培養等の攪拌或いは発酵器内の給気および攪拌を使用するで実施されて得て、そこで式(II)の化合物が増殖している培養液に添加される。そのような場合、泡止め薬剤を使用してもよい。本株の培養液の適切な密度は、使用可能な炭素および窒素供給源、無機塩並びにトレース要素を含む好ましい培地の使用によって達成できた。
【0034】
たとえば、グルコース、グリセロール、デキストリン、デンプン、ラムノース、キシロース、スクロースおよび可溶性デンプンが同化可能な炭素供給源として証明されており、一方で、ダイズミール、トウモロコシ浸透液、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、クエン酸アンモニウムおよび硫酸アンモニウムがよい窒素供給源として証明されている。炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどのような無機塩を培養培地に加えてよい。本選択株の増殖のために好適な培地は、実施例に記述した。
【0035】
コンパクチンのプラバスタチンへの生物変換は、異なる発酵技術、たとえばバッチ培養、給餌バッチ培養によって実施することができる。好ましくは、攪拌した液体沈降培養液を使用する。好ましい温度は、約25℃〜37℃であり、最も好ましいのは25℃〜32℃である。
【0036】
好ましいpHは約6.0〜9.0であり、最も好ましいのは約7.0〜8.5である。好ましい振とう条件は約200rpm〜400rpmであり、最も好ましくは約250rpmである。
【0037】
本発明は、コンパクチン酸ナトリウム塩をプラバスタチンに変換するための方法を提供する。コンパクチン酸ナトリウム塩は、結果としてプラバスタチンを産出するであろう任意の濃度で本発明で使用できる。好ましくは、コンパクチン濃度は、0.1〜10g/リットルの間であり、より好ましくは約0.3〜3.0g/リットルの間である。
【0038】
本発明は、少なくとも30%、最も好ましくは少なくとも約90%で、ミクロモノスポラ spp.(Micromonospora spp.)の株による、コンパクチンのプラバスタチンへの変換の任意のパーセンテージをカバーすることを意味している。
【0039】
発酵の工程において、培養培地の組成は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)方法によって制御される。HPLC方法にしたがって、培地の試料はメタノールによって2倍に希釈し、遠心し、上清を解析のために使用する。解析に使用するHPLC系のパラメータは以下である。ウォータース(Waters)解析HPLC器具、カラムパッケージング:Waters Novapack C18 5μm、237nmにて測定、注入容量 10μl、流速0.6〜0.9ml/分直線勾配、勾配溶出を使用、溶出液、溶媒A=アセトニトリル−0.1MのNaH2 PO4 、水中にて(25:75)、溶媒B=アセトニトリル−水(H3 PO4 にてpH2)(70:30)。
勾配溶出のパラメータ
【0040】
【表1】
【0041】
保持時間:プラバスタチン(Na塩) 10.6分、コンパクチン(酸Na塩)19.5分、プラバスタチン(ラクトン形態) 17.3分、コンパクチン(ラクトン形態) 23.5分。
【0042】
任意の公知の方法、たとえば抽出−再抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー、沈殿をプラバスタチンを単離するために使用できる。
【0043】
培養液からの産物の回収に関して、生物変換の間に、プラバスタチンはその酸性形態で生成されることを考慮することは有効であり、したがって、陰イオン交換樹脂カラム上におけるその吸着によって培養液の濾液より単離することができる。産物の単離に関して、たとえばDowex Al 400(OH- )、Dowex 1×2(OH- )、Dowex 2×4(OH- )、AmberliteIRA 900 (OH- )樹脂などの四級アンモニウム活性基を含むポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマーである強塩基陰イオン交換樹脂を使用することが都合がよい。イオン交換樹脂上に吸着した産物は、水性酢酸または塩化ナトリウム含有アセトン−水混合液によって、好ましくは1%塩化ナトリウム含有アセトン−水(1:1)混合液によってカラムより抽出できる。プラバスタチン含有画分をあわせ、溶出液中に存在するアセトンを吸引して除去する。濃縮物のpHを15%硫酸にて3.5〜4.0の範囲内に調整し、水性化した水溶液を酢酸エチルにて抽出する。酢酸エチル抽出物より、プラバスタチンを1/10および1/20容量比の5%炭酸水素ナトリウムまたは弱アルカリ水(pH7.5〜8.0)で抽出できる。プラバスタチンが、非イオン性吸着樹脂上のカラムクロマトグラフィーによって、上記で得られたアルカリ水性抽出液より純粋な形態で回収できることが示された。有利な方法として、水相に溶解したすべての酢酸エチルをまずアルカリ水性溶出液より吸引蒸留にて除去し、次いで水性抽出液をDiaion HP−20カラム上にのせる。このカラム上に吸着したプラバスタチンを、アセトン含量を徐々に増加させる水性アセトンで溶出して精製し、次いで単一成分としてプラバスタチンを含むクロマトグラフィー画分をあわせ、吸引下で濃縮する。濃縮物を木炭で浄化し、凍結乾燥し、次いでエタノール−酢酸エチル混合液より結晶化し、薬理学的適用に許容可能な純度のプラバスタチンを得る。
【0044】
生物変換が終了した後、プラバスタチンを発酵培養液、または菌糸集団の分離の後に得た濾液のいずれかから抽出できる。後者は、濾過または遠心のいずれかによって取り出せるが、これはとりわけ全培養液抽出をおこなうための工業的スケールで都合がよい。抽出の前に、発酵培養液または培養液の濾液のいずれかのpHを、無機物酸、好ましくは希釈した硫酸にて3.5〜3.7に調整する。抽出を脂肪族アルコールを含む2〜4炭素原子を有する酢酸エステルにて、好ましくは酢酸エチルまたは酢酸イソブチルによっておこなう。酢酸エチル抽出物を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥させる。次いでラクトン誘導体をプラバスタチンより調製する。ラクトン環閉環を、室温にて乾燥酢酸エチル溶液中で連続攪拌の下、触媒量のトリフルオロ酢酸によいラクトン形成を誘導させて実施する。ラクトン環閉環を、薄層クロマトグラフィー解析(TLC)にて確認する。ラクトン形成が終了した後、酢酸エチル溶液をまず5%水性炭酸水素ナトリウム溶液、次いで水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引下で蒸発させる。残余物を、溶出液として酢酸エチル−n−ヘキサンの混合液を使用して(酢酸エチル含量を徐々に増加させる)、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製する。プラバスタチンは、当量の水酸化ナトリウムを用いて、アセトン中で室温での加水分解によりプラバスタチンラクトンより調製する。プラバスタチンナトリウム塩形成が完了したならば、プラバスタチンをアセトンにて沈殿させる。次いで沈殿物を濾過し、アセトンおよびn−ヘキサンにて洗浄し、吸引下乾燥させ、次いでエタノール−酢酸エチル混合液より結晶化する。
【0045】
Sephadex LH−20ゲル上のクロマトグラフィーが、プラバスタチンを精製するために都合よく適用可能であることがわかった。この方法を適用することで、(HPLC測定)99.5%の純度を超えるプラバスタチンを生成できる。
【0046】
本発明者らの実験の過程において、以下の発明が認識された。一般式(II)の化合物を6β−ヒドロキシル化可能であるミクロモノスポラsp.(Micromonospora sp.)IDR−P3 株の培養液または培養液濾液の有機溶媒抽出液から、好ましくは酢酸エチルまたは酢酸イソブチル抽出液から、プラバスタチンを二級アミンを用いて結晶性塩として沈殿させることができる。さらに、塩形成のために、アルキル−、シクロアルキル−、アラリキル−、またはアリール−置換基を含むさまざまな二級アミンが好ましいこともわかった。適切な無毒性二級アミン、たとえばジオクチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミンを選択した。有機二級アミン塩中間体、たとえばジベンジルアミン塩の単離を、抽出物のプラバスタチンの含量について1.5当量で、ジベンジルアミンを加えることで実施し、引き続きこの抽出物を吸引蒸留にて出発量の5%まで濃縮し、次いでさらなる量のベンジルアミンを0.2当量比で濃縮物に加える。この結晶性ジベンジルアミン塩を濃縮物より沈殿させる。この結晶性未精製産物を濾過し、吸引下で乾燥させ、メタノールまたはアセトン溶液中で木炭にて浄化する。次いで、浄化産物のアセトンからの再結晶により、クロマトグラフィー的に純粋なプラバスタチンジベンジルアミン塩中間体を得ることができる。
【0047】
プラバスタチン有機二級アミン塩は、水酸化ナトリウムまたはナトリウムアルコキシド、好ましくはナトリウムエトキシドによってプラバスタチンに変換できる。
【0048】
二級アミン塩中間体を介したプラバスタチンの単離は、任意の既に公知の単離手順よりもより簡単な手順である。手順の間、人工物は形成されず、そして生物変換の副産物から、さらに微生物のヒドロキシル化によって生合成された種々な代謝産物からのプラバスタチンの分離が都合よく解決されうる。
【0049】
本発明による工程は、以下の実施例にて表される。
【0050】
【実施例】
実施例1
胞子を、ミクロモノスポラ sp.(Micromonospora sp.)IDR−P3 [NCAIM(P)B 001268]株の7〜10日齢の、可溶性デンプン寒天(SM)傾斜培養の表面より得て、5mlの無菌蒸留水中に懸濁させた。次いでこの懸濁液を使用し、500mlエルレンマイヤーフラスコ中の100mlの無菌TI接種培地に接種させた。
【0051】
SM培地の組成
可溶性デンプン 10.0g
Na2 HPO4 1.15g
KH2 PO4 0.25g
KCl 0.2g
MgSO4 ×7H2 O 0.2g
寒天 15.0g
1000mlの蒸留水中
【0052】
滅菌前にこの培地のpHを7.0に調整し、混合液を121℃にて25分間滅菌した。
【0053】
TI培地の組成
可溶性デンプン 20.0g
酵母抽出物 10.0g
1000mlの水道水中
【0054】
滅菌前にこの培地のpHを7.0に調整し、混合液を121℃にて25分間滅菌した。
【0055】
増殖培養液をロータリー振とう器(250r.p.m.、振幅2.5cm)上で3日間、32℃にて振動させ、次いでこれからの5ml分液を使用して、121℃にて25分間滅菌した100mlのTT培地をそれぞれ含んでいる500ml用量の10個のエルレンマイヤーフラスコに接種させた。
【0056】
TT培地の組成
ジャガイモデンプン 30.0g
ダイズミール 30.0g
CaCO3 5.0g
CoCl2 ×6H2 O 2.0mg
ヤシ油 2.0g
1000mlの水道水中
【0057】
加熱滅菌前に、pHを7.0に調整した。
【0058】
インキュベーションを32℃にて72時間実施し、50mgのコンパクチン酸ナトリウム塩を蒸留水中でそれぞれのフラスコに加え、培養を96時間実施した。HPLCにて測定したコンパクチン酸ナトリウム塩のプラバスタチンへの変換率は82%であった。
【0059】
発酵が終了した後、培養液をまとめ、410mgのプラバスタチンを含んだ、得られた回収発酵液からのプラバスタチンの単離を以下のように実施した。発酵液を2500r.p.m.にて20分間遠心した。液の上清および菌糸体集団を分離し、次いで後者を250mlの水中に再懸濁させ、得られた懸濁液を1時間攪拌し、濾過した。合わせた遠心液および濾液のpHを15%硫酸にて4.0に調整し、次いで酸性濾液を3×300mlの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、300mlの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引下で100mlの容量まで濃縮した。次いで、プラバスタチンラクトンを、連続攪拌下、室温にて、触媒量のトリフルオロ酢酸を加えることでプラバスタチンより調製した。プラバスタチンラクトンの形成をTLC法:(吸収剤にKieselgel 60 F245 DC(Merck)アルミニウムホイル、展開溶媒にアセトン−ベンゼン−酢酸(50:50:1.5)混合液、検出にホスホノ−モリブデン酸薬剤)にて制御した。プラバスタチンのRf値は0.7であった。ラクトン形成の完了後、酢酸エチルを2×20mlの5%水性炭酸水素ナトリウムにて洗浄し、次いで20mlの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにで乾燥させ、吸引下蒸発させた。0.5gの蒸発残余物を得、これを10gのKiesekgel 60 吸着剤含有カラム(カラムの直径:1.2cm、吸収ベッドの高さ:17cm)上でクロマトグラフした。溶出のために、酢酸エチル−n−ヘキサン混合液を使用し、そこで酢酸エチル含量は徐々に増加させた。プラバスタチンラクトンは60%酢酸エチル−40%n−ヘキサンの混合液でカラムより溶出された。プラバスタチンラクトン含有画分をあわせ、吸引下で蒸発させた。230mgのプラバスタチンラクトンを含むこの得られた残余物を、5mlのアセトン中に溶解し、次いで攪拌下、110モル%の水酸化ナトリウムを1M エタノール性溶液中で加えた。溶液の攪拌を室温にて30分間続けた。続いて、この溶液を2ml容量まで濃縮し、4mlのアセトンをこの濃縮液に加えた。混合液を+5℃にて一晩維持した。沈殿物を濾過し、2mlのアセトン、続いて2mlのn−ヘキサンで洗浄し、室温にて吸引下乾燥させた。得られた未精製プラバスタチンをエタノール中に溶解し、木炭にて浄化し、次いでエタノール−酢酸エチル混合液より結晶化した。この方法により170mgのプラバスタチンを得た。
【0060】
融解点 170−173℃(decomp.)
[α]2 D =+156°(c=0,5、水中)。
紫外線吸収スペクトル(20μg/ml、メタノール中):λmax=231、237、245nm(logε=4.263;4.311;4.136)。
赤外線吸収スペクトル(KBr):νOH 3415、νCH 2965、νC=0 1730、νCOO- 1575cm-1。
1H−NMRスペクトル(D2 O、δ、ppm):0.86、d、3H(2−CH3 );5.92、dd、J=10.0および5.4Hz、1H(3−H);5.99、d、J=10.0Hz、1H(4−H);5.52、br、1H(5−H);4.24、m、1H(6−H);5.34、br、1H(8−H);4.06、m、1H(β−H)、3.65、m、1H(δ−H);1.05、d、3H(2’−CH3 );0.82、t、3H(4’−H3 )。
【0061】
13C−NMRスペクトル(D2 O、δ、ppm):15.3、q(2−CH3 );139.5、d(C−3);129.5、d(C−4);138.1、s(C−4a);127.7、d(C−5);66.6、d(C−6);70.1、d(C−8);182.6、s(COO- );72.6、d(C−β);73.0、d(C−δ);182.0、s(C−1’);18.8、q(2’−CH3 );13.7、q(C−4’)。
ポジティブFAB質量スペクトル(特性イオン):[M+Na]+ 469;[M+H]+ 447。
ネガティブFAB質量スペクトル(特性イオン):[M−H]- 445、[M−Na]- 423、m/z 101[2−メチル−ブチル酸−H]- 。
【0062】
実施例2
それぞれ100mlのMT1生物変換培地を含有する500ml容量の10個のエルレンマイヤーフラスコに、実施例1で記述したように調製した接種培養液を接種させ、次いで28℃にて96時間インキュベートし、50mgのコンパクチン酸ナトリウム塩をそれぞれのフラスコに蒸留水中で加え、次いでヒドロキシル化を、さらに50〜50mgの基質を蒸留水中で培養液に加えて72時間実施し、発酵を72時間続けた。
【0063】
MT1生物変換培地の組成
ジャガイモデンプン 10.0g
デキストロース 20.0g
ダイズミール 10.0g
酵母抽出物 10.0g
CaCO3 5.0g
ヒマワリ油 2.0g
1000mlの水道水中
【0064】
滅菌前に生物変換培地のpHを7.0に調整した。この混合液を121℃にて25分間滅菌した。
【0065】
生物変換期間が終了した後、培養液を統合し、プラバスタチンを以下の手順に従って、回収液より単離した。HPLCアッセイにしたがって750mgのプラバスタチンが含まれる統合液を、2500r.p.m.にて20分間遠心した。分離した菌糸体集団を1時間、250mlの水で攪拌し、次いで濾過した。遠心した液および濾液を合わせ、得られた溶液のpHを、15%硫酸にて3.5〜4.0値に調整し、次いでこの溶液を3×300mlの酢酸エチルで抽出した。次いでプラバスタチン容量に対して計算した150モル%のジベンジルアミンを酢酸エチル抽出液に加えた。酢酸エチル抽出液を約30ml容量まで蒸発させ、懸濁液を0〜5℃にて一晩維持した。沈殿したプラバスタチン酸ジベンジルアミン塩を濾過し、冷却酢酸エチルおよびn−ヘキサンを用いて濾紙上で洗浄し、最終的に吸引下で乾燥させた。1.1gの未精製プラバスタチン酸ジベンジルアミン塩を、62〜66℃の温度で、33mlのアセトン中に溶解させ、この溶液を30分間、0.1gの木炭にて浄化した。次いで木炭を濾過によってこの溶液より除去した。浄化した溶液から沈殿した結晶を再び上記温度にて溶解させ、次いで溶液を+5℃にて一晩維持した。沈殿物を濾過し、冷アセトンおよびn−ヘキサンで洗浄し、吸引下乾燥させた。得られたプラバスタチン酸ベンジルアミン塩(0.7g)を10mlのエタノール中に懸濁させ、次いで110モル%の水酸化ナトリウムを、1M水溶液を供給することにて溶液に加えた。このアルカリ溶液の攪拌を室温にて30分間続けた。ナトリウム塩の形成が完了した後、30mlの水を加え、溶液のpHを中性にし、次いでエタノールを吸引下蒸留した。水性濃縮液を、50mlのDiaion HP 20樹脂(カラムの直径、1.5cm、樹脂ベッドの高さ、28cm)で満たしたカラム上でクロマトグラムした。カラムをアセトン−脱イオン水混合液で溶出し、ここでアセトンの濃度を5%段階にて増加させた。プラバスタチンは、15%アセトン含むアセトン−脱イオン水混合液にて溶出された。画分を、実施例1で示したTLC方法にて解析した。プラバスタチンのRf値は0.5であった。プラバスタチンを含む画分をあわせ、アセトン含有物を吸引下で蒸発させた。水性残余物の凍結乾燥によって、クロマトグラフィー的に純粋なプラバスタチン390mgが得られた。
【0066】
実施例3
研究室発酵器中の4.5リットルのTT/2培地を121℃にて45分間滅菌し、実施例1で記述したように調製した500mlの接種攪拌培養液を接種させ、次いで32℃にてインキュベートし、250lの滅菌空気/時間で空気にさらし、300r.p.m.にて平坦刃攪拌器にて攪拌した。インキュベーションを72時間続け、2.5gのコンパクチン酸ナトリウム塩を本培養液に加えた。生物変換期間の48時間後に、コンパクチン基質が発酵溶液より消費され、そこでさらに2.5gのコンパクチン酸ナトリウム塩を再び本培養液に加えた。コンパクチンの第二用量は24時間以内に消費された。コンパクチン酸ナトリウム塩のプラバスタチンへの変換率は、本生物変換工程において約90%であった。
【0067】
TT/2生物変換培地の組成
グルコース 75.0g
可溶性デンプン 50.0g
ダイズミール 50.0g
酵母抽出物 50.0g
ペプトン 5.0g
NaNO3 20.0g
CaCO3 25.0g
4500mlの水道水中
【0068】
実施例4
研究室発酵器内で、4.5リットルのTT/1発酵培地を121℃にて45分間滅菌し、実施例1で記述したように調製した接種攪拌培養液を500mlに接種し、次いで28℃にてインキュベートし、200lの蒸留空気/時間で空気にさらし、400r.p.mにて平坦刃攪拌器にて攪拌した。
【0069】
TT/1生物変換培地の組成
グルコース 125.0g
ジャガイモデンプン 25.0g
ダイズミール 50.0g
酵母抽出物(Gistex) 50.0g
ペプトン 50.0g
CoCl2 ×6H2 O 10.0mg
ヒマワリ油 10.0g
4500mlの水道水中
【0070】
滅菌前に、生物変換培地のpHを7.0に調整した。
【0071】
培養を28℃にて96時間続けた。この時点で、2.5gのコンパクチン酸ナトリウム塩を、滅菌濾過水溶液中でこの培養液に加えた。発酵の5日目までに、コンパクチン酸ナトリウム塩が発酵培養液より完全に消費された。次いで、基質添加を毎日さらに3日間、2.5g/日の割合で続けた。コンパクチン酸ナトリウム塩基質は、4日の間徐々に消費され、完全にプラバスタチンに変換された。発酵期間の最後の、10gのコンパクチン基質からのHPLC測定の結果により、9gのプラバスタチンが産出された。
【0072】
生物変換が終了した後、1800μg/mlの濃度にて形成されたプラバスタチンを以下のように単離した。5リットルの培養液を2500r.p.m.にて20分間遠心した。次いで2リットルの水を分離した胞子集団に加え、この懸濁液を1時間攪拌し、濾過した。これらの2つの濾液を統合し、500ml/時間の流速にて、300g(540ml)のDowex Al 400(OH- )樹脂を含むカラム(カラムの直径、4cm、樹脂ベッドの高さ、43cm)に通し、次いで樹脂ベッドを1リットルの脱イオン水にて洗浄した。その後、カラムを10gの塩化ナトリウムを含む1リットルのアセトン−水(1:1)混合液にて、50ml画分を回収して溶出した。画分を実施例1にて示したTLC方法にて解析した。産物を含む画分をあわせ、アセトンを吸引下で蒸発させた。この濃縮液のpHを、15%硫酸にて3.5〜4.0値まで調整し、次いで3×250mlの酢酸エチルで溶出した。40mlの脱イオン水を合わせた酢酸エチル抽出液に加え、pHを1M水酸化ナトリウムにて7.5〜8.0まで調整した。15分攪拌後、水相および酢酸エチル相を分離し、次いで上述したように、酢酸エチル溶液を2×40mlの脱イオン水にて抽出した。次いでアルカリ水性溶液を合わせ、50ml容量まで濃縮し、600mlのDiaion HP20(Mitsubishi Co.、Japan)非イオン吸着樹脂で満たしたカラム(カラムの直径、3.8cm、樹脂ベッドの高さ、53cm)上でクロマトグラフした。カラムを600mlの脱イオン水にて洗浄し、次いでアセトン−脱イオン水混合液で溶出し、ここで、アセトンの濃度を5%段階で増加させ、50ml画分を回収した。溶出液を実施例1で示したようにTLCで解析した。プラバスタチンは、15%のアセトンを含むアセトン−脱イオン水混合液にてカラムより溶出された。単一成分としてプラバスタチンを含む画分をあわせ、この溶液を吸引下で150mlの容量まで濃縮した。続いて、0.6gの木炭をこの濃縮した水溶液に加え、プラバスタチンを室温にて1時間浄化した。次いで木炭を濾過し、濾液を凍結乾燥させた。得られた6.5gの凍結乾燥プラバスタチンを、エタノールと酢酸エチルの混合液より2回結晶化させた。沈殿物を濾過し、20mlの酢酸エチルおよび20mlのn−ヘキサンで洗浄し、室温にて吸引下乾燥させた。このようにしてクロマトグラム的に純粋なプラバスタチン4.6gが得られた。
【0073】
実施例5
胞子懸濁液を、コンパクチン酸ナトリウム塩の6β−ヒドロキシル化に適用可能であるミクロモノスポラ エキノスポラ ssp.エキノスポラ(Micromonospora echinospora ssp.echinospora)IDR−P5 [NCAIM(P)B 001272]株の10日齢の可溶性寒天斜面培養の表面より、実施例1で記述したように5mlの無菌蒸留水を用いて調製し、得られた胞子懸濁液を使用して、500mlのエルレンマイヤーフラスコ中で滅菌した100mlの接種培地に接種させた。培地TIの組成は、実施例1に記載した。接種した培地をロータリー振とう器にて3日間、28℃にて振とうし(250r.p.m.、2.5cm振幅)、次いで増殖した培養液の5ml分液を、500mlのエルレンマイヤーフラスコ中で121℃にて25分間滅菌した100−100mlの生物変換培地TT/1内に移した。培地TT/1の組成は実施例4に記述した。フラスコをロータリー振とう器上で3日間、25℃で振とうし(250r.p.m.、25cm振幅)、次いで10−10mgのコンパクチン基質(コンパクチン酸ナトリウム塩)を、滅菌濾過した水溶液中で、この培養液に加え、次いで発酵を168時間続けた。
【0074】
生物変換の終わりに、発酵培養液のプラバスタチン含量をHPLC法にて測定した。この時点で、平均プラバスタチン濃度は40μg/mlであった。
【0075】
実施例6
発酵、基質添加および生物変換を、実施例5で記述したように、ミクロモノスポラ メガロミセア spp.ニグラ(Micromonospora megalomicea spp.nigra)の株IDR−P6 [NCAIM(P)B001273]にて実施した。発酵培養液のプラバスタチン含量をHPLC法にて測定した。生物変換の終了時点で、この培養液のプラバスタチン含量は50μg/mlであった。
【0076】
実施例7
実施例1で記述したように調製したミクロモノスポラ プルプレア(Micromonospora purpurea)の株IDR−P4 [NCAIM(P)B 001271]の接種培養液の5mlの分液を使用し、500mlエルレンマイヤーフラスコ中に分配し、121℃にて25分間滅菌した100−100mlのTT/14培地にまいた。
【0077】
TT/14培地の組成
ジャガイモデンプン 5.0g
グルコース 25.0g
酵母抽出物(GISTEX) 15.0g
ペプトン 15.0g
CaCO3 1.0g
1000mlの水道水中
【0078】
滅菌前に生物変換培地のpHを7.0に調整した。
【0079】
フラスコを3日間、ロータリー振とう器上で振とうした(250r.p.m.、2.5cm振幅)。基質添加、生物変換およびプラバスタチン含量の測定を実施例5にて記述したように実施した。生物変換の終了時点で、発酵培養液のプラバスタチン含量は40μg/mlであった。
【0080】
実施例8
発酵、基質添加および生物変換を、実施例1で記述したように、ミクロモノスポラ ロサリア(Micromonospora rosaria)の株IDR−P7 [NCAIM(P)B 001274]にて実施した。生物変換終了時点で、HPLC法により、350μg/mlのプラバスタチンが発酵培養液中で測定された。
Claims (8)
- 一般式(II)の化合物(式中Rはアルカリ金属、またはアンモニアイオンを意味する)から、式(I):
前記工程は、好気性条件下で、式(II)の化合物を6β−ヒドロキシル化可能なミクロモノスポラ(Micromonospora)を液内培養し、生物変換の過程において形成された式(I)の化合物を分離することによるものであって、以下のステップ:
a)式(II)(式中Rは上記で定義)の化合物を6β−ヒドロキシル化可能なミクロモノスポラ株を、25〜32℃にて、利用可能な炭素‐および窒素供給源および無機塩を含む栄養培地上で培養すること、その後
b)増殖した培養液中に変換すべき基質を添加すること、次いで
c)生物変換が完了するまで前記基質をヒドロキシル化させること、次いで
d)培養培地から式(I)の化合物を分離すること
を含む微生物工程。 - さらに、前記ステップd)で得られた式(I)の化合物を精製することを含む、請求項1に記載の工程。
- 番号NCAIM(P)B 001268のもとで、ハンガリー、ブタペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに寄託されたミクロモノスポラsp.(Micromonospora sp.)IDR−P3株、または一般式(II)の化合物を6β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項1または2に記載の工程。
- 番号NCAIM(P)B 001271のもとで、ハンガリー、ブタペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに寄託されたミクロモノスポラ プルプレア(Micromonospora purpurea)IDR−P4株、または一般式(II)の化合物を6β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項1または2に記載の工程。
- 番号NCAIM(P)B 001272のもとで、ハンガリー、ブタペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに寄託されたミクロモノスポラ エキノスポラssp.エキノスポラ(Micromonospora echinospora ssp. echinospora)IDR−P5株、または一般式(II)の化合物を6β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項1または2に記載の工程。
- 番号NCAIM(P)B 001273のもとで、ハンガリー、ブタペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに寄託されたミクロモノスポラ メガロミセア ssp.ニグラ(Micromonospora megalomicea ssp.nigra)IDR−P6株、または一般式(II)の化合物を6β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項1または2に記載の工程。
- 番号NCAIM(P)B 001274のもとで、ハンガリー、ブタペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに寄託されたミクロモノスポラ ロサリア(Micromonospora rosaria)IDR−P7株、または一般式(II)の化合物を6β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項1または2に記載の工程。
- 前記式(I)の化合物を培養液から分離する工程であって、この化合物を陰イオン交換樹脂上で吸着させ、または水と混じらない有機溶媒で抽出し、続いて中間物としてのこのラクトン誘導体またはこの二級アミン塩を調製し、或いは発酵液の有機溶媒抽出液から得られたアルカリ水溶抽出液を非イオン吸着樹脂上のクロマトグラフィーを用いて精製することにより行う、請求項1〜7のいずれか1項に記載の工程。
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