KR20020048927A - 마이크로모노스포라를 이용한 콤팩틴의프라바스타틴으로의 히드록시화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 호기성 발효로 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는 균주를 액내 배양시키고 생전환 도중에 형성되는 화학식 Ⅰ 의 산물
화학식 Ⅰ
을 분리정제함으로써, 화학식 Ⅱ 의 화합물
화학식 Ⅱ
로부터 화학식 Ⅰ 의 화합물을 미생물적으로 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다. 후자의 분리정제 방법은 다음 단계를 포함한다 :
a) 이용가능한 탄소원, 질소원 및 미네랄염을 함유하는 보통 배지 상에서 화학식 Ⅱ(여기에서 R 은 상기한 바와 같다)의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는 마이크로모노스포라 균주를 25 - 32 ℃ 로 배양한 다음 ;
b) 발육된 배양균 내로 형질전환시키기 위해 기질을 가하고 ;
c) 생전환이 끝날 때까지 기질을 히드록시화한 다음 ;
d) 배양 육즙으로부터 화학식 Ⅰ 의 화합물을 분리하고, 필요에 따라 이것을 정제한다.
Description
본 발명은 프라바스타틴의 신규한 미생물적 제조방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-위치에서 히드록시화할 수 있는 마이크로모노스포라속의 원핵 생물을 이용하여 다음 화학식 Ⅰ 을 갖는 프라바스타틴
을 화학식 Ⅱ 의 화합물
로부터 미생물적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
콜레스테롤과잉혈증은 죽상동맥경화증 질환, 특히 관상 심장병의 주요 위험 인자인 것으로 인식되어 왔다. 지난 20 년간 콜레스테롤 생합성의 주요 양-제한 효소로서 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A 환원효소(HMG-CoA 환원효소 EC. 1.1.1. 34)가 광범위하게 연구되어 왔다. 상이한 균류 종의 선택 균주에 의해 생합성되는 메비놀린 및 관련 화합물은 이 효소의 경쟁적 저해제인 것으로 밝혀졌다[Endo, A. 등의 J. Antibiotics 29, 1346 - 1348 (1976) ; Endo, A. 등의 FEBS Lett. 72, 323 - 326 (1976) ; Kuo, C.H. 등의 J. Org. Chem. 48, 1991 - 1998 (1983) 참조].
프라바스타틴은 또한 HMG-CoA 환원효소 저해제군의 한 멤버이기도 하다. 프라바스타틴은 처음에는 콤팩틴의 대사 연구 도중에 개에서 콤팩틴의 소량의 뇨 대사산물(Tanaka, M 등의 미공개 문헌)로 발견되었다 [Arai, M. 등의 Sankyo Kenkyusho Nempo, 40, 1 - 38 (1988) 참조].
콤팩틴의 히드록시화 산물로서의 프라바스타틴의 주된 특성은 조직 선택성이다. 이 약물은 간과 장에서 스테롤 합성을 강력하게 저해하지만, 다른 기관에서는 약하게 저해한다. 프라바스타틴은 다른 HMG-CoA 환원효소 저해제보다 낮은 독성을 갖는 것이 바람직하다.
콤팩틴의 미생물적 히드록시화는 균류의 여러 상이한 속에 속하는 종 중 몇몇 균주에 의해 다양한 정도로 이루어지기도 하고 노카르디아속, 악티노마두라속 및 스트렙토마이세스속에 속하는 악티노마이시즈류의 균주, 그 중에서도 스트렙토마이세스 로제오크로모게네스 및 스트렙토마이세스 카르보필러스에 의해 이루어질 수 있다[미국 특허 번호 제 5,179,013 호, 미국 특허 번호 제 4,448,979 호, 미국 특허 번호 제 4,346,227 호, 미국 특허 번호 제 4,537,859 호, 일본 특허 번호 제 58,010,572 호 참조].
콤팩틴으로부터 프라바스타틴을 생산하기 위해 균류를 이용하는 것에 관한 문제점은 이들 유기체가 일반적으로 그것의 항균류 활성으로 인해액체 배양 배지에서 보다 고농도의 콤팩틴에 대하여 내성이 없다는 것이다[Serizawa, N 등의 J. Antibiotics 36, 887 - 891 (1983) 문헌 참조]. 스트렙토마이세스 카르보필러스의 경우, 시토크롬 P450 시스템은 콤팩틴이 히드록시화되어 프라바스타틴이 되는 데 필요한 것으로 나타났다[Matsuoka, T. 등의 Eur. J. Biochem. 184, 707 - 713 (1989) 참조]. 이러한 효소를 이용하여 히드록시화하는 능력을 유전적으로 개선시키는 데 있어서 그것이 단일 단백질이 아니라 단백질 복합체이므로 어려움이 있다.
조사는 이전의 특허 명세서에서 공지된 기질 농도보다 생전환시 더 높은 기질 농도를 가하여 보다 높은 수득량을 얻을 수 있도록 콤팩틴의 산 형태의 염으로부터 프라바스타틴을 생산하는 악티노마이시즈류 균주를 발견하는 데 초점을 맞추었다.
스크리닝 중에, 약 6000 여개의 악티노마이시즈류를 포함하여 인터내셔널 스트레인 콜렉션즈의 신빙성 있는 균주 중 5 종의 스트렙토마이세스와 5 종의 마이크로모노스포라를 선택하여 더 깊이 연구하였는데, 이는 이들이 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염을 프라바스타틴으로 히드록시화할 수 있는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 이들 10 개의 악티노마이시즈류 균주는 다음과 같으며, 이 중 8 개의 균주는 우리의 라보라토리에서 종 수준으로 분류학적으로 확인하였다 :
스트렙토마이세스 비올라세우스(Kampfer 등의 1991), 균주 No. 1/44.
스트렙토마이세스 로차이(Berger 등의 1949 ; Waksman 및 Lechevalier, 1953), 균주 No. 1/41.
스트렙토마이세스 레지스토마이시피쿠스(Lindenbein, 1952), 균주 No. 1/44.
스트렙토마이세스 sp. 균주 No. 1/28.
스트렙토마이세스 라나투스(Frommer, 1959), 균주 No. 1/16.
마이크로모노스포라 sp. 균주 No. IDR-P3.
마이크로모노스포라 푸르푸레아(Luedemann 및 Brodsky, 1964), 균주 No. IDR-P4.
마이크로모노스포라 에키노스포라(Luedemann 및 Brodsky, 1964), 균주 No. IDR-P5.
마이크로모노스포라 메갈로미세아(Weinstein 등의, 1969), 균주 No. IDR-P6.
마이크로모노스포라 로자리아(Horan 및 Brodsky, 1986), 균주 No. IDR-P7.
이제까지, 콤팩틴의 산 형태의 염을 프라바스타틴으로 전환시키는 마이크로모노스포라의 능력을 기술한 문헌에 관한 기록이 없으므로, 특정 효소의 능력은 물론 상기 열거한 마이크로모노스포라 균주의 분류학적 위치에 관하여 철저히 연구하였다.
속 수준에서의 IDR-P
3
,-P
4
,-P
5
,-P
6
및 -P
7
균주의 분류학적 위치
이들 모든 균주는 직경이 약 0.4 - 0.7 ㎛ 인 가지난 균사로 이루어진 잘 발달된 균사체를 생산하였다. 기균사는 존재하지 않거나 미량으로 발생한다. 부동 포자가 포자병에서 생성된다. 기생 균사체의 균사는 그람-양성이며 비항산성이다. 균주 No. IDR P3- P7은 호기성이며 화학 - 유기영양성이고, pH 6.0 이하에 민감하다. 벽은 메소 - 디아미노피멜린산을 함유한다. 상기 나열한 특정 목적-핵심적인 특징-은 분명히 입증되며, 이들 단포자성 악티노마이시즈류 균주는 마이크로모노스포라속의 전형적인 멤버이다.
마이크로모노스포라속 균주 IDR-P
3
의 분류학적 기술
미소형태학적 성질 : 기생 균사체는 단족성으로 가지난 잘 발달된 필라멘트로 구성되는데, 이 필라멘트는 곧기 보다는 좀 구부러져 있다. 포자병의 포자는 단일 포자이며, 직경이 약 1.8 ㎛ 인 구형이고 균사 필라멘트 상에 보다 고르게 또는 덜 고르게 분산되어 있다. 육즙 배양액내에서, 균사 상에 포자는 관찰되지 않았으며, 이는 성숙한 포자가 매우 신속하게 방출되기 때문일 것이다.
배양상 - 거대형태학적 성질 :
차펙 - 수크로스 한천(Czapek-sucrose agar) : 배지 성장, 콜로니는 점 같이 생긴 흑색 포자형성 부위로 덮인 적색을 띤다.
글루코스 - 아스파라긴 한천 : 성장은 점 같이 생긴 성장하는 적갈색 또는 흑색 콜로니로 측정하였다. 적색의 확산성 색소.
보통 한천 : 적당히 성장한 적갈색 또는 흑색의 콜로니. 배지내 적갈색 엑소색소(exopigment).
효모 엑기스 - 맥아 엑기스 한천(ISP 배지 번호 2) : 잘 발달되고 성장하며 주름진 갈색 콜로니, 흑색 포자형성 부위 또는 "슈도 - 기균사체" (제한된 흰색 또는 회색이 도는 꽃 모양으로 나타남)로 부분적으로 덮임. 갈색 또는 적갈색 가용성 색소.
무기염 - 전분 한천(ISP 배지 번호 4) : 적갈색의 성장하는 주름진 콜로니의 성장 배지. 밝은 적색 가용성 색소.
글리세롤 - 아스파라긴 한천(ISP 배지 번호 5) : 미량으로만 성장하며 회색이 도는 흰색 또는 밝은 오렌지색의 평평한 콜로니, 밝은 장미빛의 가용성 색소.
탄소원 이용 : L-아라비노스, D-갈락토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, 락토스, 멜리비오스, 수크로스, D-만니톨, 둘시톨, 글리세롤 및 이노시톨 상에서 잘 자라며 적극적으로 이용함. L-람노스, D-라피노스 및 인슐린으로 성장시킨 것은 음성 대조 배지에서 보다 약간 더 잘 성장하였다. 질소원 이용 : 효모 엑기스와 NZ-아민에서 잘 성장하며 NaNO3를 전혀 또는 거의 이용하지 않음.
기타 생리학적-생화학적 성질 : 셀룰로스와 전분은 가수분해되며, 밀크는 잘 소화된다. 질산 환원 실험은 음성이다. 탄산칼슘(pH 5.8 - 6.0) 없이 포테이토 절편상에서는 성장하지 않음. 멜라노이드 색소를 생산하지 않음.
이러한 마이크로모노스포라 sp. 의 균주 No. IDR-P3은 헝가리의 레이크 발라톤의 진흙 시료에서 분리하였다.
조직적 위치 : 마이크로모노스포라속에 속하는 종 중 이 균주의 정확한 분류학적 위치를 밝히기 위해서는 조직적인 비교 연구가 더 필요할 것이다. 특정 성질에 근거하여, 균주 IDR-P3이 마이크로모노스포라속에 속하는 새로운 종을 나타내는 것은 불가능하지는 않을 것이다.
마이크로모노스포라 균주 IDR-P
4
, -P
5
, -P
6
및 P
7
의 확인 및 특징
균주 IDR-P
4
상기에 열거한 특징 배지에서 잘 자란 콜로니는 오렌지색에서 오렌지 레드, 적색, 때로는 노란색이나 장미빛을 띤다. 가용성 색소 및 기균사체는 생산되지 않는다. 고립성 포자의 수는 비교적 낮다. 이것은 정기적으로 포자병에 발생한다. 기생 균사체는 적절히 가지난 균사로 이루어진다. 기균사체는 존재하지 않는다. D-멜리비오스, 라피노스, 만니톨, 글리세롤, 락토스, L-람노스에서는 성장하지 않지만, D-아라비노스, 글루코스, D-크실로스에서는 잘 성장하며, D-갈락토스 및 D-프럭토스에서는 미세하게 성장한다. 이러한 일반적인 특징을 근거로, 우리는 마이크로모노스포라 푸르푸레아종 (Luedemann 및 Brodsky, 1964 참조)의 한 멤버인 이 균주를 확인하였다.
균주 IDR-P
5
이 균주는 주로 성숙할 때까지 포자병에 단단하게 부착되어 구형의 암갈색에서 흑색으로 변하는 포자(직경이 0.8 - 1.5 ㎛ 임)와 고립성 포자병을 생산한다. 전자현미경 관찰에 의해 이러한 포자의 표면상 혹 모양의 구조와 성장(Bergey's Manual of Syst. Bact. 1989, p2448, Vol. 4 "blunt spines")을 관찰할 수 있으며, 마이크로모노스포라 에키노스포라의포자 특성을 나타낸다. 다른 점에서, 이 균주의 배양상 - 형태학적·생리적 특징은 엠. 에키노스포라의 특징과 매우 유사하다. 표준적인 특징 배지 상에서 잘 발육된 콜로니의 색은 오렌지 - 갈색 또는 진보라색이다. 포자형성층은 흑색이거나 흑자주 또는 납빛이다. 기균사체는 존재하지 않는다. 멜라닌 색소는 생산되지 않는다. 밀크는 소화된다. D-크실로스, D-아라비노스, D-글루코스 및 수크로스에서는 잘 성장하지만 L-람노스, 라피노스, D-갈락토스, D-프럭토스, D-멜리비오스 및 글리세롤에서는 성장하지 않는다. 이 균주는 마이크로모노스포라 에키노스포라의 전형적인 멤버인 것으로 간주된다.
균주 IDR-P
6
대부분의 특정 배지에서는 원만하게 성장하거나 그 성장이 약하다. 오렌지색 또는 오렌지 레드 콜로니는 가지난 긴 필라멘트(직경이 약 0.6 ㎛ 임) 및 한정된 수의 구형의 진한 색을 띤 고립성 포자(직경이 0.6 - 1.0 ㎛ 임)로 구성된다. 기균사체는 생산되지 않는다. 특정 배지에서 연한 적색 또는 장미빛의 가용성 색소가 형성된다. 티로신 한천에서는 멜라노이드 색소가 생산되지 않았다. 기초 배지에서는 이 균주에 의해 다음의 탄소원이 사용되었다 : D-크실로스 및 D-프럭토스 ; D-멜리비오스, 만니톨 및 갈락토스에서는 성장이 약하지만, 글리세롤,L-람노스, 락토스 및 라피노스에서는 성장이 전혀 관찰되지 않거나 가끔씩 성장이 관찰된다(Kawamoto, I 등의 Agric. Biol. Chem., 47, 203 - 215, 1983 참조). 균주 No. IDR-P6는 마이크로모노스포라 메갈로미세아종 (Weinstein, 1972 참조)과 상당히 유사한 것으로 나타났으며, 이것을 이 종의 한 멤버로 간주한다.
균주 IDR-P
7
베네트 한천, 차펙 수크로스 한천, 글루코스-아스파라긴 한천, 보통 한천, 오트밀 한천, 포테이토 - 덱스트로스 한천 등에서는 잘 성장하거나 원만히 성장한다. 영양 균사체 색소의 색은 적갈색에서 자줏빛 갈색을 띤다. 특정 배지에서 포도주빛 확산성 색소가 형성된다. 콜로니의 표면에서 종종 흑점이 생성된다. 영양 균사(평균 직경이 0.5 ㎛ 임)는 집약적으로 가지나 있다. 포자(직경이 1.4 - 1.7 ㎛ 임)는 하나씩 생기고 고착성이거나 짧은 포자병에 생성되며 균사의 길이를 따라 발생한다. 성장과 포자형성은 Luedemann 의 개방웹 형태이다. 이 균주가 배지에서 유일한 탄소원으로 이용하는 화합물은 다음과 같다 : D-글루코스, 락토스, D-만니톨, L-람노스, 수크로스 및 D-크실로스. 둘시톨, 글리세롤, D-멜리비오스 및 D-라피노스는 이용하지 않는다. 이 균주는 마이크로모노스포라 로자리아(Horan 및 Brodsky, 1986)의 전형적인 멤버로 균주 No. IDR-P7이라 확인하였다.
상기 언급한 마이크로모노스포라 균주는 1998년 10월 13일(IDR-P3) 및 1999년 4월 12일(IDR P4- P7)에 하기의 기탁번호로 헝가리 부다페스트 소재 내셔널 콜렉션 오브 애그리컬쳐럴 앤드 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(NCAIM)에 기탁하였다 :
상기 내용을 근거로, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 호기성 발효로 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는 균주를 액내 배양시키고 생전환 도중에 형성되는 화학식 Ⅰ 의 화합물
화학식 Ⅰ
을 분리정제함으로써, 화학식 Ⅱ 의 화합물
화학식 Ⅱ
로부터 화학식 Ⅰ 의 프라바스타틴을 미생물적으로 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다 :
a) 동화가능한 탄소원, 질소원 및 미네랄염을 함유하는 보통 배지 상에서 화학식 Ⅱ(여기에서 R 은 상기한 바와 같다)의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는 마이크로모노스포라속에 속하는 종의 균주를 25 - 32 ℃ 로 배양한 다음 ;
b) 발육된 배양균 내로 형질전환시키기 위해 기질을 가하고 ;
c) 생전환 말기까지 기질을 히드록시화한 다음 ;
d) 배양 육즙으로부터 화학식 Ⅰ 의 화합물을 분리하고, 필요에 따라 이것을 정제한다.
본 발명의 범주에는 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염을 프라바스타틴으로 히드록시화할 수 있는 마이크로모노스포라속에 속하는 야생 균주 및 모든 돌연변이종이 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 프라바스타틴은 마이크로모노스포라 sp. IDR-P3[NCAIM 제 (P) B 001268 호], 마이크로모노스포라 푸르푸레아 IDR-P4[NCAIM 제 (P) B 001271 호], 마이크로모노스포라 에키노스포라 IDR-P5[NCAIM 제 (P) B 001272 호], 마이크로모노스포라 메갈로미세아 IDR-P6[NCAIM 제 (P) B 001273 호] 및 마이크로모노스포라 로자리아 IDR-P7[NCAIM 제 (P) B 001274 호] 중에서 선택한 마이크로모노스포라 균주에서 생산한다.
본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 프라바스타틴은 마이크로모노스포라 sp. 균주 IDR-P3[NCAIM 제 (P) B 001268 호]에서 생산한다.
본 발명은 능동적으로 성장하는 마이크로모노스포라 배양물이 히드록시화에 관계하는 원위치 발효 방법으로 실시할 수 있다.
화학식 Ⅱ 의 화합물을 성장 배지에 가할 때 발효기의 통기 및 교반에 의하거나 진탕 - 플라스크 배양 등의 교반을 이용하여 히드록시화를 실시할 수 있다. 이런 경우에는 소포제를 이용할 수 있다. 이 균주의 적당한 배양액 밀도는 이용가능한 탄소원과 질소원, 무기염 및 미량 원소를 함유하는 적당한 배지를 사용함으로써 맞출 수 있다.
예를 들어 글루코스, 글리세롤, 덱스트린, 전분, 람노스, 크실로스, 수크로스 및 가용성 전분은 동화가능한 탄소원인 것으로 밝혀졌으며, 대두분, 옥수수 침지액, 펩톤, 효모 엑기스, 고기 추출물, 시트르산 암모늄 및 황산 암모늄은 질소원으로 유용하다. 탄산칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨 등의 무기염을 배양 배지에 가할 수 있다. 이러한 선택 균주의 성장에 바람직한 배지는 실시예에 기술한 것들이다.
콤팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환은 회분 배양법, 유가 배양법 등 여러 상이한 발효 기술로 실시할 수 있다. 바람직하게, 교반 액체 액내 배양을 사용한다. 바람직한 온도는 약 25 ℃ 내지 37 ℃ 이고, 가장 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 32 ℃ 이다.
바람직한 pH 는 약 6.0 내지 9.0 이고, 가장 바람직하게는 약 7.0 내지 8.5 이다. 바람직한 진탕 조건은 약 200 rpm 내지 400 rpm 이고, 가장 바람직하게는 약 250 rpm 이다.
본 발명은 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염을 프라바스타틴으로 전환시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염은 프라바스타틴을 생산할 수 있는 조건이라면 어떤 농도로도 사용할 수 있다. 바람직하게, 콤팩틴의 농도는 0.1 내지 10 g/리터이고, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 3.0 g/리터이다.
본 발명은 마이크로모노스포라 ssp. 의 균주에 의해 콤팩틴을 프라바스타틴으로 적어도 30 %, 가장 바람직하게는 적어도 약 90 % 생전환시키는 것을 포함하고자 한다.
발효 도중에, 배양 육즙 조성물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 조절한다. HPLC 에 의해, 육즙 시료는 메탄올로 2 배 희석하여 원심분리한 다음 상청액을 분석한다. 분석에 사용하는 HPLC 시스템의 파라미터는 다음과 같다 : 워터스 분석 HPLC 장비 ; 컬럼 충진 : 워터스 노바팩 C185 ㎛ ; 237 ㎚ 에서 측정 ; 주입 부피 10 ㎕ ; 유량 0.6 - 0.9 ㎖/분 선형 경사 ; 경사 용리를 사용한다, 용리액 : 용매 A = 아세토니트릴 - 물내 0.1 M NaH2PO4(25 : 75), 용매 B = 아세토니트릴 - 물(H3PO4로 pH 2 로 조절)(70 : 30).
경사 용리 파라미터 :
체류 시간 : 프라바스타틴(나트륨염) 10.6 분 ; 콤팩틴(산 나트륨염) 19.5 분 ; 프라바스타틴(락톤 형태) 17.3 분, 콤팩틴(락톤 형태) 23.5 분.
프라바스타틴을 분리하기 위해 추출 - 재추출, 음이온 교환 크로마토그래피, 침강 등의 모든 공지된 방법을 이용할 수 있다.
육즙으로부터 생성된 산물을 회수하기 위해서는 생전환하는 동안에 프라바스타틴이 그것의 산성 형태로 형성됨을 고려하는 것이 유리하며 따라서 음이온 교환 수지 컬럼 상에서의 흡착에 의해 육즙의 여액으로부터 상기 산물을 분리할 수 있다. 상기 산물을 분리할 경우에는 강력한 염기성 음이온 교환 수지를 사용하는 것이 유리하며 상기 수지는 4 차 암모늄 활성기[예를 들어, Dowex Al 400 (OH-), Dowex 1×2 (OH-), Dowex 2×4 (OH-), Amberlite IRA 900 (OH-) 수지]를 함유한 폴리스티렌 - 디비닐벤젠 중합체이다. 아세톤 - 물 혼합물을 함유한 수성의 아세트산 또는 염화 나트륨, 바람직하게는 아세톤 - 물 (1 : 1) 혼합물을 함유한 1 % 염화 나트륨에 의해 컬럼으로부터 이온 교환 수지 상에 흡착된 산물을 용출시킬 수 있다. 분획을 함유한 프라바스타틴을 혼합하고 용출액에 존재하는 아세톤은 진공에서 증류시켰다. 15 % 황산으로 농축물의 pH 범위를 3.5 - 4.0 으로 조절하였고 아세트산 에틸로 산성화된 수용액을 추출하였다. 아세트산 에틸 추출물로부터 5 % 탄산 수소 나트륨 또는 약 알칼리수(pH 7.5 - 8.0)의 1/10 및 1/20 부피 비율로 프라바스타틴을 추출할 수 있다. 비이온성 흡착 수지 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 수득한 상기의 알칼리성의 수용성 추출물로부터 순수한 형태의 프라바스타틴을 발견할 수 있었다. 편리한 방법으로서 제일 먼저 수용액 상에서 용해시킨 아세트산 에틸을 알칼리성의 수용성 추출물로부터 진공 증류에 의해 제거하고나서 수용성 추출물을 Diaion HP - 20 컬럼에 적하하였다. 컬럼에서 흡수된 프라바스타틴을 수용성 아세톤으로 용리시켜 정제하였고 여기에서 아세톤 함량을 점차적으로 증가시켰으며, 그리고나서 단일 성분의 프라바스타틴을 함유한 크로마토그래피 분획을 진공 하에서 혼합하고 농축시켰다. 숯을 이용하여 농축물을 정제하고 냉동 건조시켰으며 에탄올 - 아세트산 에틸 혼합물로부터 결정화하여 약학적 사용에 이용가능한 품질의 프라바스타틴을 수득하였다.
생전환이 완료된 후에 발효액 또는 균사체 집단의 분리 후에 수득한 여액으로부터 프라바스타틴을 추출할 수 있다. 여과 또는 원심분리에 의해 후자를 제거하였으며 특히 공업 규모에서는 완전 육즙 추출을 사용하는 것이 유리하다. 추출하기 전에 발효액 또는 육즙의 여액의 pH 를 무기산, 바람직하게는 희석된 황산으로 3.5 - 3.7 로 조절하였다. 지방족 알콜(바람직하게는 아세트산 에틸 또는 아세트산 이소부틸)을 함유한 2 - 4 탄소 원자로 된 아세트산 에스테르로 추출물을 처리하였다. 아세트산 에틸 추출물을 물로 세척하고 무수의 황산 나트륨으로 건조시켰다. 그리고나서 락톤 유도체를 프라바스타틴으로부터 제조하였다. 실온에서 락톤 고리 형성을 무수의 아세트산 에틸 수용액에서 시행하였으며 이때 촉매량의 트리플루오로 - 아세트산으로 락톤의 형성을 유도하기 위해 연속적으로 교반시켰다. 얇은 막 크로마토그래피 분석(TLC)으로 락톤 고리 형성을 검사하였다. 락톤 형성 후에 처음에는 아세트산 에틸 용액을 5 % 탄산 수소 나트륨 수용액으로 세척한 다음에 물로 세척하였으며 무수의 황산 나트륨으로 건조시키고 진공에서 증발시켰다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제한 잔여물은, 아세트산 에틸 함량을 점차적으로 증가시키면서 아세트산 에틸 - n - 헥산의 용출 혼합물의 형태로 사용한다. 실온에서 수산화 나트륨의 당량으로 아세톤에서 가수분해에 의해 프라바스타틴 락톤으로부터 프라바스타틴을 제조하였다. 프라바스타틴의 나트륨염이 형성되었을 때, 프라바스타틴을 아세톤으로 침전시켰다. 침전물을 여과하고 아세톤 및 n - 헥산으로 세척하였으며 진공에서 건조시킨 다음에 에탄올 - 아세트산 에틸 혼합물로부터 결정화하였다.
프라바스타틴을 정제하는데 세파덱스 LH - 20 겔 상에서의 크로마토그래피를 사용하는 것이 적절함을 알 수 있었다. 이러한 방법을 적용함으로써 99.5 % 이상의 순도(HPLC 로 측정)를 나타내는 프라바스타틴을 제조할 수 있다.
본 발명의 하기 실시예 과정 중에서 다음을 알 수 있었다 : 유기 용매 추출물, 바람직하게는 육즙의 아세트산 에틸 또는 아세트산 이소부틸 추출물 또는 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β - 히드록시화할 수 있는 마이크로모노스포라 sp. IDR-P3균주의 육즙 여액으로부터 이차 아민에 의해 프라바스타틴을 결정 형태로 침전시킬 수 있다. 알킬-, 시클로알킬-, 아랄킬- 또는 아릴- 치환기를 함유한 몇몇 이차 아민이 염 형성에 적합함을 또한 발견하였다. 편의상 비 - 독성 이차 아민을 다음 중에서 선택하였다 : 예를 들어, 디옥틸아민, 디시클로헥실아민, 디벤질아민. 유기 이차 아민 염의 중간물질(예를 들어, 디벤질아민 염)의 분리는 추출물의 프라바스타틴 함량과 관련된 1.5 당량의 디벤질아민을 첨가함으로써 시행하였고, 그 다음에 추출물을 원 부피의 5 % 로 진공 증류시켜 농축시켰으며 디벤질아민의 다른 양을 0.2 당량 비율로 농축물에 첨가하였다. 농축물로부터 결정성의 디벤질아민 염을 침전시켰다. 결정성의 조(粗)산물을 여과하고 진공에서 건조시켰으며 메탄올 또는 아세톤 용액에서 숯으로 정제하였다. 크로마토그래피를 이용하여 아세톤으로부터 정제된 산물의 재결정으로 순수한 프라바스타틴의 디벤질아민 염 중간물질을 수득할 수 있었다.
프라바스타틴의 유기 이차 아민 염을 수산화 나트륨 또는 알콕시화 나트륨, 바람직하게는 에톡시화 나트륨에 의해 프라바스타틴으로 변형시킬 수 있다.
이차 아민 염 중간물질에 의한 프라바스타틴의 분리는 이전에 공지된 어떤 분리 과정 보다 단순한 과정이다. 이 과정 중에는 인공적 산물이 형성되지 않으며 생전환의 부산물 및 히드록시화된 미생물에 의해 생합성된 다양한 대사 산물로부터의 프라바스타틴의 분리로 편리하게 문제를 해결할 수 있다.
본 발명의 따른 과정을 하기 실시예에 나타내었다.
실시예 1
마이크로모노스포라 sp. IDR-P3[NCAIM 제 (P) B 001268 호] 균주를 가용성의 전분 한천(SM) 배지에서 사면 배양하여 7 - 10 일 째에 표면에서 포자를 수득하였고 멸균 증류수 5 ml 에서 재현탁하였다. 500 ml 삼각 플라스크에서 100 ml 의 멸균한 Tl 종균 배지를 접종하기 위해 이러한 현탁액을 사용하였다.
멸균하기 전에 배지의 pH 를 7.0 으로 조절하였으며 혼합물을 25 분 동안 121 ℃ 에서 멸균시켰다.
멸균하기 전에 pH 를 7.0 으로 조절하고 25 분 동안 121 ℃ 에서 열 처리하였다.
발육된 배양균을 32 ℃ 에서 3 일 동안 회전 진탕기(250 rpm ; 및 진폭 2.5 ㎝) 상에서 진탕시킨 다음에 그것으로부터 5 ml 분취량은 25 분동안 121 ℃ 에서 멸균시킨 100 ml 의 TT 배지를 함유한 10 개의 삼각 플라스크 각각의 500 ml 부피를 접종시키는데 사용하였다.
가열 멸균시키기 전에 pH 를 7.0 으로 조절하였다.
32 ℃ 에서 72 시간 동안 항온시킨 다음에 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염 50 ㎎ 을 증류수가 담겨진 각각의 플라스크에 첨가하였고 96 시간 동안 배양하였다. HPLC 에 의해 측정된 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염의 프라바스타틴으로의 전환율은 82 % 이다.
발효가 끝난 후에 배양물을 410 ㎎ 의 프라바스타틴을 함유하는 축적된 발효액으로부터 수득하여 수집하고 다음과 같이 프라바스타틴을 분리하였다 : 발효액을 20 분 동안 2500 rpm 에서 원심분리하였다. 육즙의 상청액과 균사체의 집단을 분리한 다음에 후자를 250 ml 의 물에서 재현탁시켰으며 수득한 현탁액을 1 시간 동안 교반한 다음에 여과하였다. 혼합하여 원심분리한 육즙과 여액의 pH 를 15 % 황산에 의해 4.0 으로 조절하고 산성의 여액을 3×300 ml 의 아세트산 에틸로 추출하였다. 혼합한 아세트산 에틸 추출물을 300 ml 의 물로 세척하고 무수의 황산 나트륨으로 건조시켰으며 진공 하에서 100 ml 의 부피로 농축시켰다. 실온에서 연속적인 교반 하에 촉매량의 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 프라바스타틴으로부터 프라바스타틴 락톤을 제조하였다. 프라바스타틴 락톤의 형성은 TLC 방법에 의해 조절된다 : 흡착제 : Kieselgel 60 F254DC(머크에서 입수) 알루미늄박 ; 전개 용매 : 아세톤 - 벤젠 - 아세트산(50 : 50 : 1.5) 혼합물 ; 포스포 - 몰립덴산 시약으로 검출. 프라바스타틴 락톤의 Rf값은 0.7 이다. 락톤이 완전하게 형성된 후에, 아세트산 에틸을 2×20 ml 의 5 % 수성의 탄산 수소 나트륨으로 세척한 다음에 20 ml 의 물로 세척하였으며 무수의 황산 나트륨으로 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 0.5 g 의 증발 잔여물을 수득하였으며 이를 컬럼(컬럼의 지름 : 1.2 ㎝, 흡착제 베드의 높이 : 17 ㎝)에 함유된 10 g 의 Kieselgel 60 흡착제 상에서 크로마토그래피하였다. 용출시키기 위해 아세트산 에틸 - n - 헥산 혼합물을 사용하였으며 이때 아세트산 에틸 함량을 점차적으로 증가시켰다. 프라바스타틴 락톤을 컬럼으로부터 60 % 아세트산 에틸 - 40 % n - 헥산의 혼합물로 용출시켰다. 프라바스타틴 락톤을 함유한 분획을 혼합하고 진공 하에서 증발시켰다. 230 ㎎ 의 프라바스타틴 락톤을 함유하여 수득한 잔여물을 5 ml 의 아세톤에 용해시킨 다음에 교반하면서 110 몰 % 의 수산화 나트륨을 1 M 에탄올 용액에 첨가하였다. 실온에서 반 시간 동안 용액을 계속해서 교반하였다. 연속적으로, 그 용액을 2 ml 부피로 농축시켰으며 아세톤 4 ml 를 농축물에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 +5 ℃ 에서 유지하였다. 침전물을 여과하고 2 ml 의 아세톤 다음에 2 ml 의 n - 헥산으로 세척하고 실온에서 진공 하에 건조시켰다. 결과적으로 생성된 비정제 프라바스타틴을 에탄올에 용해시켰으며 숯으로 정제한 다음에 에탄올 - 아세트산 에틸 혼합물로부터 결정화하였다. 이러한 과정에서 170 g 의 프라바스타틴을 수득하였다.
융점 170 - 173 ℃ (decomp.)
[α]2 D= +156˚(c = 0,5, 물에서).
자외선 흡수 스펙트럼 (20 ㎍/ml, 메탄올에서) : λmax= 231, 237, 245 ㎚(logε = 4.263 ; 4.311 ; 4.136).
적외선 흡수 스펙트럼 (KBr) : νOH 3415, νCH 2965, νC=0 1730, νCOO-1575 ㎝-1.
1H-NMR 스펙트럼(D2O, δ, ppm): 0.86, d, 3H (2-CH3); 5.92, dd, J = 10.0 및 5.4 ㎐, 1H (3-H); 5.99, d, J = 10.0 ㎐, 1H (4-H); 5.52, br, 1H (5-H); 4.24, m, 1H (6-H); 5.34, br, 1H (8-H); 4.06, m, 1H (β-H), 3.65, m, 1H (δ-H); 1.05, d, 3H (2'-CH3); 0.82, t, 3H (4'-H3).
13C-NMR 스펙트럼(D2O, δ, ppm): 15.3, q (2-CH3); 139.5, d (C-3); 129.5, d (C-4); 138.1, s (C-4a); 127.7, d (C-5); 66.6, d (C-6); 70.1, d (C-8); 182.6, s(COO-); 72.6, d (C-β); 73.0, d (C-δ); 182.0, s (C-1'); 18.8, q (2'-CH3); 13.7, q (C-4').
양성 FAB 질량 스펙트럼 (특성 이온) : [M+Na]+469; [M+H]+447.
음성 FAB 질량 스펙트럼 (특성 이온) : [M-H]-445, [M-Na]-423,m/z101 [2 - 메틸 - 부티르산 - H]-.
실시예 2
실시예 1 에 서술된 바와 같이 제조한 종균 배양물로 500 ml 부피의 10 개의 삼각 플라스크에 함유된 100 ml 의 MT1생전환 배지를 접종시킨다음에 96 시간 동안 28 ℃ 에서 배양하고 50 ㎎ 의 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염을 증류수가 담겨진 각각의 플라스크에 첨가하였으며, 다른 50 - 50 ㎎ 의 기질을 증류수에서 배양물에 첨가하고 72 시간 동안 발효시켰을 때 히드록시화 반응을 72 시간 동안 시행하였다.
멸균 전에 생전환 배지의 pH 를 7.0 으로 조절하였다. 그 혼합물을 25 분 동안 121 ℃ 에서 멸균시켰다.
생전환 기간이 끝난 후에, 배양액을 수집하고 하기의 과정에 따라 축적된 육즙으로부터 프라바스타틴을 분리하였다 : HPLC 검정에 의해 750 ㎎ 의 프라바스타틴을 함유한 수집한 육즙을 20 분 동안 2500 rpm 에서 원심분리하였다. 분리된 균사체 집단을 250 ml 의 물로 교반한 다음 여과하였다. 원심분리한 육즙과 여액을 혼합하고 결과적으로 생성된수용액의 pH 를 15 % 황산으로 3.5 - 4.0 수치로 조절한 다음에 용액을 3×300 ml 의 아세트산 에틸로 추출하였다. 프라바스타틴 함량을 계산하여 150 몰 % 의 디벤질아민을 아세트산 에틸 추출물에 첨가하였다. 아세트산 에틸 추출물을 약 30 ml 부피로 증발시키고 현탁액을 0 - 5 ℃ 에서 밤새 유지하였다. 침전된 프라바스타틴산 디벤질아민염을 여과하고 여과기 상에서 냉각시킨 아세트산 에틸 및 n - 헥산으로 세척하였으며 최종적으로 진공에서 건조시켰다. 1.1 g 의 비정제 프라바스타틴산 디벤질아민염을 62 - 66 ℃ 에서 33 ml 의 아세톤에 용해시켰으며 그 용액을 반 시간 동안 0.1 g 의 숯으로 정제하였다. 상기 숯은 용액으로부터 여과하여 제거하였다. 정제된 용액으로부터 침전시킨 결정체를 상기 온도에서 재용해시킨 다음에 그 용액을 밤새 +5 ℃ 에서 유지하였다. 침전물을 여과하고 냉각시킨 아세톤 및 n - 헥산으로 세척하였으며 진공에서 건조시켰다. 수득한 프라바스타틴산 디벤질아민염을 10 ml 의 에탄올에 현탁시킨 다음에 110 몰 % 의 수산화 나트륨을 1 M 의 수용액을 공급한 용액에 첨가하였다. 알칼리성 용액을 실온에서 반 시간 동안 계속해서 교반하였다. 나트륨염 형성이 완료된 후에 30 ml 의 물을 첨가하고 용액의 pH 를 중화시켰으며 진공에서 에탄올을 증류시켰다. 수성의 농축물을 50 ml 의 Diaion HP 20 수지로 충진된 컬럼(컬럼의 지름 : 1.5 ㎝, 수지 베드의 높이 : 28 ㎝) 상에서 크로마토그래피하였다. 아세톤의 농도를 5 % 단계로 증가시킨 아세톤 - 탈이온수 혼합물로 컬럼을 용리시켰다. 아세톤 - 탈이온수 혼합물을 함유한 15 % 아세톤에 의해 컬럼으로부터 프라바스타틴을 용리시켰다. 실시예 1 에 기재된 TLC 방법으로 분획을 분석하였다. 프라바스타틴의 Rf값은 0.5 이다. 프라바스타틴을 함유한 분획을 혼합하고 아세톤 함량을 진공에서 증발시켰다. 수성의 잔여물을 동결 건조시킴으로써 390 ㎎ 의 순수한 프라바스타틴을 크로마토그래피에 의해 수득하였다.
실시예 3
실험 발효기에서 4.5 리터의 TT/2 배지를 45 분 동안 121 ℃ 에서 멸균시키고 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조한 500 ml 의 종균 진탕 배양물로 접종시킨 후에 32 ℃ 에서 배양하고 250 l 의 무균 공기/h 로 포화시켰으며 300 rpm 에서 평날 교반기(flat blade stirrer)로 교반하였다. 72 시간 동안 배양하고 2.5 g 의 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염을 배양액에 첨가하였다. 생전환시킨지 48 시간 후에, 콤팩틴 기질이 발효액으로부터 완전히 소모되었으며 2.5 g 의 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염을 다시 배양액에 첨가하였다. 콤팩틴의 두 번째 투여량은 24 시간 이내에 소모되었다. 생전환 과정에서 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염의 프라바스타틴으로의 전환율은 약 90 % 이다.
실시예 4
실험 발효기에서 4.5 리터의 TT/1 발효 배지를 45 분 동안 121 ℃ 에서 멸균시키고 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조한 500 ml 의 종균 진탕 배양물로 접종시킨 후에 28 ℃ 에서 배양하고 200 l 의 무균 공기/h 로 포화시켰으며 400 rpm 에서 평날 교반기로 교반하였다.
멸균 전에 생전환 배지의 pH 를 7.0 으로 조절하였다.
96 시간 동안 28 ℃ 에서 배양하였다. 이때 멸균 여과된 수용액에서 2.5 g 의 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염을 육즙에 첨가하였다. 발효시킨지 5 일 째에 발효액으로부터 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염이 완전히 소모되었다. 그리고나서 기질 유가(substrate feeding)를 추가하여 3 일 동안 매일 2.5 g/일 분량으로 반복하였다. 마지막 발효 기간에 HPLC 측정의 결과에 따라 10 g 의 콤팩틴 기질로부터 9 g 의 프라바스타틴을 제조하였다.
생전환시킨 후에 1800 ㎍/ml 의 농도에서 형성된 프라바스타틴을 다음과 같이 분리하였다 : 20 분 동안 2500 rpm 에서 5 리터의 배양 발효액을 원심분리하였다. 그런다음에 2 리터의 물을 분리한 균사체 집단에 첨가하고 현탁액을 1 시간 동안 교반하고 여과하였다. 이러한 두 여액을 합하여 300 g (540 ml)의 Dowex Al 400 (OH-) 수지를 함유한 컬럼(컬럼의 지름 : 4 ㎝, 수지 베드의 높이 : 43 ㎝) 상에서 500 ml/시 유량으로 통과시킨 다음에 수지 베드는 1 리터의 탈이온수로 세척하였다. 그 후에 50 ml 분획을 수집하여 10 g 의 염화 나트륨을 함유한 1 리터의 아세톤 - 물 (1 : 1) 혼합물로 컬럼을 용리시켰다. 실시예 1 에 기재된 TLC 방법에 의해 분획을 분석하였다. 산물을 함유한 분획을 혼합하고 아세톤을 진공에서 증류시켰다. 농축물의 pH 를 15 % 황산에 의해 3.5 - 4.0 으로 조절한 다음에 3×250 ml 의 아세트산 에틸로 추출하였다. 40 ml 의 탈이온수를 혼합한 아세트산 에틸 추출물에 첨가하고 1 M 의 수산화 나트륨에 의해 pH 를 7.5 - 8.0 으로 조절하였다. 수용액을 15 분 동안 교반한 후에 아세트산 에틸 상을 분리하고 이전에 기재된 대로 아세트산 에틸 용액을 2×40 ml 의 탈이온수로 추출하였다. 혼합한 알칼리성 수용액을 50 ml 부피로 농축시켰으며 600 ml 의 Diaion HP 20 (일본에 소재하는 미추비시 코포레이티드에서 입수) 비 이온성 흡착 수지로 충진된 컬럼(컬럼의 지름 : 3.8 ㎝, 수지 베드의 높이 : 53 ㎝)상에서 크로마토그래피하였다. 컬럼을 600 ml 의 탈이온수로 세척한 후에 아세톤 - 탈이온수 혼합물로 용리시켰으며 이때에 50 ml 분획을 수집하였으며 아세톤의 농도는 5 % 단계로 증가시켰다. 실시예 1 에 기재된 TLC 방법에 의해 용출액을 분석하였다. 15 % 의 아세톤을 함유한 아세톤 - 탈이온수 혼합물에 의해 컬럼으로부터 프라바스타틴을 용리시켰다. 단일 성분으로서 프라바스타틴을 함유한 분획을 혼합하고 그 용액을 150 ml 부피로 진공에서 농축시켰다. 연속적으로, 0.6 g 의 숯을 농축된 수용액에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 프라바스타틴을 정제하였다. 그리고나서 숯을 여과하고 그 여액을 동결 건조시켰다. 결과적으로 생성된 동결 건조시킨 6.5 g 의 프라바스타틴을 에탄올과 아세트산 에틸의 혼합물로부터 두 번 결정화하였다. 침전물을 여과하고 20 ml 의 아세트산 에틸 및 20 ml 의 n - 헥산으로 세척하였으며 실온의 진공에서 건조시켰다. 따라서 크로마토그래피에 의해 4.6 g 의 순수한 프라바스타틴을 수득하였다.
실시예 5
실시예 1 에 기재된 바와 같이, 마이크로모노스포라 에키노스포라 ssp. 에키노스포라 IDR-P5[NCAIM 제 (P) B 001272 호] 균주를 가용성의 전분 한천 배지에서 사면 배양하여 10 일 째에 표면으로부터 5 ml 의 멸균 증류수로 포자 현탁액을 제조하였으며 (상기 균주는 콤팩틴의 산 형태의 나트륨염을 6β - 히드록시화할 수 있음) 수득한 포자 현탁액은 500 ml 의 삼각 플라스크에서 멸균시킨 100 ml 의 종균 Tl 배지를 접종시키는데 사용되었다. Tl 배지의 조성은 또한 실시예 1 에 기재되어 있다. 접종시킨 배지를 회전 진탕기(250 rpm , 진폭 2.5 ㎝) 상에서 28 ℃ 에서 3 시간 동안 진탕시킨 뒤에 121 ℃ 에서 25 분 동안 500 ml 의 삼각 플라스크에서 멸균시킨 100 - 100 ml 의 TT/1 생전환 배지에 발육된 배양균의 5 ml 분취량을 옮겨 놓았다. TT/1 배지의 조성은 실시예 4 에 기재되어 있다. 회전 진탕기(250 rpm , 진폭 2.5 ㎝) 상에서 3 일 동안 25 ℃ 에서 플라스크를 진탕시킨 다음에 10 - 10 ㎎ 의 콤팩틴 기질(콤팩틴의 산 형태의 나트륨염)을 멸균 수용액을 첨가한 육즙에 첨가하였으며 168 시간 동안 발효를 지속시켰다.
생전환 마지막 부분에 발효액 중 프라바스타틴의 함량은 HPLC 방법에 의해 측정하였다. 이때에 프라바스타틴의 평균 농도는 40 ㎍/ml 였다.
실시예 6
실시예 5 에 기재된 바와 같이, 마이크로모노스포라 메갈로미세아ssp. 니그라의 균주 IDR-P6[NCAIM 제 (P) B 001273 호]을 발효, 기질 유가 및 생전환시켰다. 발효액 중 프라바스타틴의 함량은 HPLC 방법에 의해 측정하였다. 생전환 마지막 부분에 육즙 중 프라바스타틴의 함량은 50 ㎍/ml 였다.
실시예 7
실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조한 마이크로모노스포라 푸르푸레아의 균주 IDR-P4[NCAIM 제 (P) B 001271 호]의 종균 육즙 중 5 ml 의 분취량은 500 ml 삼각 플라스크에서 분배된 100 - 100 ml 의 TT/14 배지를 접종시키는데 사용하였으며 121 ℃ 에서 25 분 동안 멸균시켰다.
멸균 전에 생전환 배지의 pH 를 7.0 으로 조절하였다.
플라스크를 3 일 동안 회전 진탕기(250 rpm , 진폭 2.5 ㎝) 상에서 진탕시켰다. 실시예 5 에 기재된 바와 같이 프라바스타틴 함량의 기질 유가, 생전환 및 측정을 시행하였다. 생전환 마지막 부분에 발효액 중 프라바스타틴 함량은 40 ㎍/ml 였다.
실시예 8
실시예 1 에 기재된 바와 같이, 마이크로모노스포라 로자리아의 균주 IDR-P7[NCAIM 제 (P) B 001274 호]을 이용하여 발효, 기질 유가 및 생전환을 시행하였다. 생전환 마지막 부분에 발효액에서 HPLC 방법에 의해 350 ㎍/ml 의 프라바스타틴을 측정하였다.
Claims (7)
- 다음 단계를 포함하는, 호기성 조건하에서 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는 마이크로모노스포라 균주를 액내 배양시키고 생전환 도중에 형성되는 화학식 Ⅰ 의 화합물화학식 Ⅰ을 분리정제함으로써, 화학식 Ⅱ 의 화합물화학식 Ⅱ로부터 화학식 Ⅰ의 화합물을 미생물적으로 제조하는 방법 :a) 이용가능한 탄소원, 질소원 및 미네랄염을 함유하는 보통 배지 상에서 화학식 Ⅱ(여기에서 R 은 상기한 바와 같다)의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는 마이크로모노스포라 균주를 25 - 32 ℃ 로 배양한 다음 ;b) 발육된 배양균 내로 형질전환시키기 위해 기질을 가하고 ;c) 생전환이 끝날 때까지 기질을 히드록시화한 다음 ;d) 배양 육즙으로부터 화학식 Ⅰ 의 화합물을 분리하고, 필요에 따라 이것을 정제한다.
- 제 1 항에 있어서, 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재 내셔널 콜렉션 오브 애그리컬쳐럴 앤드 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈에 NCAIM 제 (P) B 001268 호로 기탁한 마이크로모노스포라 sp. IDR-P3균주 또는 그것의 돌연변이 균주를 가함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재 내셔널 콜렉션 오브 애그리컬쳐럴 앤드 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈에 NCAIM 제 (P) B 001271 호로 기탁한 마이크로모노스포라 푸르푸레아 IDR-P4균주 또는 그것의 돌연변이 균주를 가함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재 내셔널 콜렉션 오브 애그리컬쳐럴 앤드 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈에 NCAIM 제 (P) B 001272 호로 기탁한 마이크로모노스포라 에키노스포라 ssp. 에키노스포라 IDR-P5균주 또는 그것의 돌연변이 균주를 가함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재 내셔널 콜렉션 오브 애그리컬쳐럴 앤드 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈에 NCAIM 제 (P) B 001273 호로 기탁한 마이크로모노스포라 메갈로미세아 ssp. 니그라 IDR-P6균주 또는 그것의 돌연변이 균주를 가함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 화학식 Ⅱ 의 화합물을 6β-히드록시화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재 내셔널 콜렉션 오브 애그리컬쳐럴 앤드 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈에 NCAIM 제 (P) B 001274 호로 기탁한 마이크로모노스포라 로자리아 IDR-P7균주 또는 그것의 돌연변이 균주를 가함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 수지에 흡착시키거나 물과 혼합되지 않는 유기 용매로 추출한 다음 그것의 락톤 유도체 또는 2 차 아민염을 중간체로 제조하거나, 또는 비-이온성 흡착 수지를 이용한 크로마토그래피에 의해 발효 육즙의 유기 용매 추출물로부터 수득한 알칼리성 수성 추출물을 정제함으로써 배양 육즙으로부터 발효 도중에 형성되는 화학식 Ⅰ 의 화합물을 분리함을 특징으로 하는 방법.
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