KR20020060150A - 프라바스타틴의 미생물적 제조 방법 - Google Patents

프라바스타틴의 미생물적 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 단계 (a) 내지 (d)를 포함하고, 발효, 및 생물학적 전환 과정에서 생성된 화학식 (I)의 화합물을 분리 및 정제함에 따른, 하기 화학식 (II)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는 균주의 액내 배양에 의해 화학식 (II) 화합물로부터 화학식 (I) 화합물의 신규한 미생물적 제조 방법에 관한 것이다 :
[화학식 I]
[화학식 II]
(상기 식에서, R+는 알칼리 금속 또는 암모늄 이온을 의미함)
(a) 동화가능한 탄소 및 질소원을 함유하는 영양 배지 상에서 화학식 (II)의 화합물(여기서, R+는 앞서 정의한 바와 같음)을 6β-히드록실화할 수 있는 마이크로모노스포라속 미생물을 25∼32℃에서 배양하는 단계,
(b) 이어서, 상기 배양된 배양물로 형질전환되는 기질을 제공하는 단계,
(c) 이어서, 생물학적 전환이 종료될 때까지 기질을 발효시키는 단계,
(d) 이어서, 상기 배양액으로부터 화학식 (I)의 화합물을 분리하고, 필요에 따라 이것을 정제하는 단계.

Description

프라바스타틴의 미생물적 제조 방법{MICROBIAL PROCESS FOR PREPARING PRAVASTATIN}
고콜레스테롤혈증은 아테롬성 경화성 질병, 구체적으로 관상 동맥 심장 질병에 대한 주된 위험 인자로서 인식되어 있다. 콜레스테롤의 생합성은 고콜레스테롤혈증에 기여하는 주된 인자이다. HMG-CoA 환원 효소는 콜레스테롤의 생합성의 속도 결정 단계에서 HMG-CoA에서 메발로네이트로의 전환을 촉매한다. 지난 20년동안, 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A 환원 효소(HMG-CoA 환원 효소 EC. 1.1.1.34)는 광범위하게 연구되어 왔다. 다른 진균 종류에 의해 생합성된 메비놀린 및 관련 화합물은 이러한 효소의 경쟁적 저해제로서 알려져 있다[Endo, A. et al., J. Antibiotics 29, 1346-1348(1976): Endo. A. et al., FEBS Lett. 72, 323-326(1976) : Kuo, C.H. et al., J. Org. Chem. 48, 2991-1998(1983)].
프라바스타틴은 컴팩틴(compactin), 로바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴 및 아토르바스타틴과 함께 이러한 부류의 HMG-CoA 환원 효소 저해제 중 하나이다. 프라바스타틴은 컴팩틴의 대사 연구 과정에서 컴팩틴의 소량의 카닌(canine) 대사물질로서 최초 분리되었다[Aral, M. et al., Sankyo Kenkyusho Nempo, 40, 1-38(1988)].
조직 선택성은 프라바스타틴의 고유한 특성이다. 프라바스타틴은 간과 소장에서 콜레스테롤 합성을 선택적으로 저해하지만, 기타 장기에서는 콜레스테롤 합성을 단지 약하게 저해한다[Koga, T. et al. Biochim, Biophys. Acta, 1990, 1045, 115-120]. 프라바스타틴은 다른 HMG-CoA 환원 효소 저해제에 비해 보다 독성이 낮다는 이점을 가지고 있다.
컴팩틴은 악티노마이세테스군의 노카르디아속; 마두로마이세테스군의 악티노뮤두라속; 및 스트렙토마이세스군의 기타 종 가운데 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스속 및 스트렙토마이세스 카르보필루스속의 세균 및 다양한 진균속을 사용한 미생물적 히드록실화에 의해 프라바스타틴으로 전환될 수 있는 것으로 보고되었다[미국 특허 제5,179,013호, 제4,448,979호, 제4,346,227호, 제4,537,859호 및 일본 특허 제58-10572호].
프라바스타틴의 제조에 진균을 사용하는 경우 문제점이 있다. 진균류는 일반적으로 배양 배지중에 첨가된 고용량의 컴팍틴을 견디지 못하는데, 이는 컴팍틴의 항진균 활성에 기인하는 것으로 추정된다[Serizawa, N. et al., J. Antibiotics 36, 887-891 (1983)].
시토크롬 P450계는 스트렙토마이세스 카르보필루스 세균에 의한 컴팩틴이 프라바스타틴으로 히드록실화되는 데 필요한 것으로 나타났다[Matsuoka, T. et al., Eur. J. Biochem, 184, 707-713 (1989)]. 시토크롬 P450계를 사용하는 경우의 문제점은 이것의 재조합 DNA 조작이 어렵다는 것인데, 그 이유는 이것이 하나의 단백질이 아니라 단백질 복합체이기 때문이다.
따라서, 고농도의 컴팍틴을 견딜 수 있고, 발효액에서 고농도 및 높은 수율로 프라바스타틴을 생산할 수 있는 프라바스타틴의 개선된 미생물적 제조 방법에 관한 필요성이 있다.
본 발명은 프라바스타틴의 미생물적 제조 방법에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 프라바스타틴의 신규한 미생물적 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 6β 위치에서 하기 화학식 (II)로 표시되는 화합물을 히드록실화할 수 있는 악티노플라네테스군의 마이크로모노스포라속 원핵 생물을 이용하여 화학식 (II)의 화합물로부터 하기 화학식 (I)로 표시되는 프라바스타틴의 제조를 위한 미생물적 방법을 제공한다.
(여기서, R+는 알칼리 금속 또는 암모늄 이온을 나타낸다)
발명의 상세한 설명
본 발명은 프라바스타틴의 신규한 미생물적 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 공지된 미생물계에 의해 가능하였던 것에 비해 보다 유리한 조건하에서 보다 고농도로 프라바스타틴을 생산하는 미생물을 발견하기 위해 수행되었던 축적된 연구의 소산이다. 6,000종 이상의 악티노마이세테 균주를 스크리닝하였다. 이들 가운데, 단지 10종의 미생물만이 컴팩틴 나트륨염을 히드록실화하여 프라바스타틴을 생산할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, 하기 종은 이러한 능력을 가지고 있었다 : 스트렙토마이세스 비올라세우스 No 1/43(Kampfer et al. 1991), 스트렙토마이세스 로체이 No 1/41(Berger et al. 1989), 스트렙토마이세스 레시스토마이시피쿠스 No 1/44(Lindenbein 1952), 스트렙토마이세스 라나투스(Frommer 1959), 스트렙토마이세스 에스피. No 1/28, 마이크로모노스포라 에스피. No IDR-P3, 마이크로스포라 푸르푸레아 No IDR-P4(Luedemann 및 Brodsky, 1964), 마이크로스포라 메갈로르미체아 에스에스피. 니그라 No IDR-P6(Weinstein et al 1969), 마이크로모노스포라 로사리아 No IDR-P7(Horan 및 Brodsky 1986). 마이크로스포라속 종들이 컴팩틴의 산염을 프로바스타틴으로 전환시킬 수 있다는 것은 이미 알려져 있었기 때문에, 우리는 양성으로 스크리닝된 마이크로모노스포라 종을 세밀하게 연구하였다.
마이크로모노스포라는 세균 악티노마이세테스 분류학상 군의 속이다. 악티노마이세탈레스 및 악티노플라네테스의 수프라제네릭(suprageneric) 군 가운데, 마이크로모노스포라속은 악티노플라네스 및 닥틸로스포라지움과 같은 스포란기아(sporangia)를 형성하는 악티노마이세테스와 보다 밀접하게 연관되어 있고, 이것과 연관된 써모모노스포라 및 써모악티노마이세스와 같은 기타 모노스포어 속과는 확연히 구별되는 것으로 밝혀졌다. 악티노플라네테스 속은 유사한 화학분류학적 특성 및 핵산 친화성을 가진다. 이들은 그램-양성이고, 산-내성이 없으며, 또한 비분절화하는, 분지된, 격막이 있는 직경 0.2 내지 1.6 ㎛의 균사로 성장하는 유기체이다. 에어리얼 균사체(aerial mycelium)는 거의 배양되지 않거나, 아주 희소하다. GenusMicromonosporaOrskov, 1923.
마이크로모노스포라 칼시아(Froulerton, 1905)는 잘 발달되고, 분지된, 격벽이 있는 균사(평균 직경이 0.5 ㎛임)를 형성한다. 운동성이 없는 균사는 단일의 정착성으로 형성되거나, 또는 종종 분지된 군집으로 발생하는 짧거나 긴 담포자체(sporosphore) 상에 형성된다. 담포자페 배양은 모노포디얼(monopodial)이거나, 일부 경우 심포디얼(sympodial)이다. 에어리얼 균사체는 없거나, 일부 군집에서는 제한된 백색 또는 회색의 블룸(bloom)으로서 불규칙하게 나타난다. 세포벽은 메소-디아미노파멜린산 및/또는 그것의 3-히드록시 유도체 및 글리신을 포함한다. 자일로스 및 아라비노스는 세포 가수분해물 중에 존재한다. 특징적인 인지질은 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜이노시톨 만노시드이다. 마이크로모노스포라 칼시아는 호기성 미생물(microaerobic)에 대하여 호기성이고, 화학적 유기물 친화성(chemoorganotrophic)이다. 이들은 6.0 이하의 pH에 감수성이있다. 성장은 통상 20 내지 40℃의 온도에서 일어나지만, 약 50℃ 이상에서는 일어나지 않는다. Orskov, 1923.
마이크로모노스포라 속의 유의성있게 다른 몇가지 종들은 6β-위치에서 컴팩틴을 히드록실화할 수 있으므로, 6β-위치에서 컴팍틴을 히드록실화하는 능력은 마이크로모노스포라 속의 종이 널리 공유하는 것으로 보인다. 본 발명의 마이크로모노스포라는 컴팩틴 기질을 프로바스타틴으로 전환시킬 수 있는 야생형 및 돌연변이 균주를 포함한다. 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 보다 상세히 설명하고 구체적인 실시예로서 이를 예시하기 위하여 사용된 바람직한 마이크로모노스포라는 이들의 높은 히드록실화 능력에 대하여 선택되는데, 이것은 컴팩틴 산 나트륨염의 농도 약 0.1 g/L에서 약 90%를 초과할 수 있다. 하기 마이크로모노스포라 균주는 헝가리의 부다페스트에 있는 국립 농업 및 산업 미생물 수집소에 199년 4월 13일 수탁 번호 NCAIM P (B) 001271, 마이크로모노스포라 푸르푸레아 IDR-P4; 수탁 번호 NCAIM P(B) 001272, 마이크로스포라 에키노스포라 에스에스피. 에키노스포라 IDR-P6; 수탁 번호 NCAIM P (B) 001273, 마이크로모노스포라 메갈로미체아 에스에스피. 니그라 IDR-P6; 및 수탁 번호 NCAIM P (B) 001274, 마이크로모노스포라 로사리아 IDR-P7로 기탁되었다.
IDR-P3로 넘버링된 분리된 마이크로모노스포라 종을 1998년 10월 13일 헝가리 부다페스트의 국립 농업 및 산업 미생물 수집소에 수탁 번호 NCAIM P (B)001268로 기탁하였다. 마이크로모노스포라 에스피의 균주 IDR-P3은 헝가리의 발라톤 호수의 진흙 샘플로부터 분리하였다. 대규모 발효에 적합한 조건하에서 고농도의 컴팩틴 나트륨염으로부터 프라바스타틴을 생산하는 것 이외에, 이 종은 기타 구조적으로 연관된 화합물을 매우 극소량 생합성한다. 따라서, 이 종은 프라바스타틴의 산업적 생산에 매우 적합하다.
마이크로모노스포라 IDR-P3배양물의 분류학상의 특성은 다음과 같이 요약된다.
미생물형태학적인 특성 : 기질 균사체는 잘 발달되고, 직선이라기 보다는 곡선의, 분지 필라멘트로 이루어져 있다. 슬라이드 배양에서, 분지 균사(담포자체)의 모노포디알 시스템이 관찰될 수 있다. 균사는 단일의, 구형이고, 직경이 약 1.8 ㎛이며, 균사 필라멘트 상에 고르게 분산되어 있다. 포자는 정착성이거나 짧은 담포자체의 말단상에 존재한다. 액체 배양에서, 포자는 포자 형성 균사상에서 관찰되지 않았는데, 그 이유는 성숙한 포자가 배지 중으로 급속하게 방출되기 때문일 가능성이 있다.
배양-형태학적 특성:
제팍-슈크로스 아가 : 배지 성장, 콜로니들은 점과 같은 흑색 포자 형성 영역으로 덮인 적색을 띈다.
글루코즈-아스파라긴 아가 : 성장은 점과 같고 융기된 적색을 뛴 갈색 또는 흑색 콜로니로서 기록되었다. 적색을 띈 확산가능한 색소.
뉴트리언트 아가 : 양호한 성장, 융기된 적색을 띈 갈색 또는 흑색 콜로니. 배지중에서 적색을 띈 갈색 외부색소(exopigment).
효모 추출액-용융 추출 아가(ISP Med. 2) : 제한된 백색 또는 회색을 띈 블룸으로 나타나는 "슈도에어리얼 균사체" 또는 흑색의 포자 형성 영역으로 부분적으로 덮인 잘 발달된, 융기된, 주름진 갈색 콜로니.
무기 염-전분 아가(ISP Med. 4) : 적색을 띈 갈색의, 융기된, 주름진 콜로니의 배지 성장. 연한 적색을 띄는 가용성 색소.
글리세롤-아스페라진 아가(ISP Med. 5) : 단지 미량으로 성장, 회색이 도는 백색 또는 밝은 오렌지색의 평평한 콜로니, 밝은 장미색의 가용성 색소.
일부 배지 상에서 관찰된 가용성 색소는 특정한 지시약-특성을 가진다 : 산성 pH 범위에서는 황색이고, 염기성 pH 범위에서는 적색의 어두운 색조로 약간 변화된다.
탄소원 이용 : L-아라비노즈, D-셀로비오즈, D-프럭토즈, D-글루코즈, 락토오즈, D-말토오즈, D-만니톨, D-만노즈, 알파-메틸-D-글루코시드, L-람노오즈, D-리보오즈, D-슈크로즈, D-트레할로즈 및 D-자일로즈 상에서의 양호한 성장 및 양성 적인(positive) 이용. 아도니톨, 둘시톨, 미오-이노시톨, 이눌린, D-멜레지토즈, D-라피노오즈는 사용되지 않는다. D-갈락토즈, 글리세롤, D-멜리비오즈 및 D-살리신은 음성 대조군 배지에 비해 보다 조금 낫다.
질소원 사용 : 효모 추출물 및 NZ-아민을 이용한 양호한 성장, L-아스파라긴, L-글루탐산, NH4NO3및 NaNO3는 이용하지 않음.
기타 생리학적-생화학적 특성: 셀룰로즈 및 전분은 가수분해되고, 우유는 강하게 분해된다. 질산 환원 시험 결과는 음성이다. 탄산칼슘이 없는 감자 슬라이스 상에서는 성장하지 않는다(pH 5.8-6.0).
헝가리 부다페스트의 국립 농업 및 산업 미생물 수집소에 기탁된 마이크로모노스포라 균주에 대한 우리의 연구에 기초하여, 본 발명의 바람직한 형태는 하기 단계 (a) 내지 (d)를 포함하고, 발효, 및 생물학적 전환 과정에서 생성된 화학식 (I)의 화합물을 분리 및 정제함에 따른, 하기 화학식 (II)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는 균주의 액내 배양에 의한 화학식 (II) 화합물로부터 화학식 (I) 화합물의 신규한 미생물적 제조 방법에 관한 것이다:
[화학식 I]
[화학식 II]
(상기 식에서, R+는 알칼리 금속 또는 암모늄 이온을 의미함)
(a) 동화가능한 탄소 및 질소원 및 광물염을 함유하는 영양 배지 상에서 화학식 (II)의 화합물(여기서, R+는 앞서 정의한 바와 같음)을 6β-히드록실화할 수 있는 마이크로모노스포라속 미생물을 25 내지 32℃에서 배양하는 단계,
(b) 이어서, 생물학적 전환이 종료될 때까지 기질을 제공하는 단계,
(c) 이어서, 생물학적 전환이 종료될 때까지 기질을 발효시키는 단계,
(d) 이어서, 상기 배양액으로부터 화학식 (I)의 화합물을 분리하고, 필요에 따라 이것을 정제하는 단계.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 프라바스타틴은 마이크로모노스포라 푸르푸레아 IDR-P4[NCAIM P(B) 001271], 마이크로모노스포라 아키노스포라 에스에스피. 에키노스포라 IDR-P6[NCAIM P(B) 001272], 마이크로모노스포라 메갈로미체아 에스에스피. 니그라 IDR-P6[NCAIM P(B) 001273] 및 마이크로모노스포라 로사리아 IDR-P7[NCAIM P(B) 001274]로 이루어진 군 중에서 선택된 마이크로모노스포라 야생형 균주 또는 돌연변이 균주로부터 생산될 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에 따르면, 프라바스타틴은 마이크로모노스포라 에스피. IDR-P3[NCAIM P(B) 001268]를 사용하여 생산된다.
본 발명은 계내(in situ) 발효, 즉 배치 배양 또는 페드-배치 배양 기법을 사용하여 활발하게 성장하는 미생물 존재하에 수행되는 히드록실화에 의해 이루어질 수 있다.
히드록실화는, 화학식 (II)의 화합물을 성장하는 배양물에 첨가할 때, 교반, 예를 들어 쉐이크-플라스크 배양 또는 발효기 내에서 교반 및 공기주입을 이용하여 수행될 수 있다.
미생물은 탄소 및 질소원, 무기염 및 미량 원소를 함유하는 적절한 영양 배지를 사용하여 배양되고, 유지될 수 있다. 동화가능한 탄소원의 예로는 글루코즈, 글리세롤, 덱스트린, 전분, 람노즈, 자일로즈, 수크로즈, 가용성 전분 등이 있다. 동화가능한 질소원의 예로는 대두분, 콘 스팁 리큐어(corn steep liquor), 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 암모늄 시트레이트, 황산 암모늄 등을 포함한다. 탄산칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨 등과 같은 무기염이 또한 배양 배지중에 첨가될 수 있다. 미생물의 성장에 바람직한 배지는 실시예에 기재되어 있다.
배양물은 교반된 액체 배지인 것이 바람직하다. 히드록실화를 수행하기에 바람직한 온도 범위는 약 25℃ 내지 37℃이며, 가장 바람직하게는 약 25℃ 내지 32℃이다. 바람직한 pH 범위는 약 6.0 내지 9.0이고, 가장 바람직하게는 7.0 내지 8.5이다. 바람직한 쉐이킹 조건은 약 200 rpm 내지 400 rpm이며, 가장 바람직하게는 약 250 rpm이다.
임의의 농도의 컴팩틴이 사용되어 프라바스타틴을 생산할 수 있다. 계내 히드록실화에 적합한 컴팩틴 농도는 약 0.1 내지 10 g/리터이고, 더 바람직하게는 약 0.3 내지 3.0 g/리터이다. 컴팩틴에서 프라바스타틴으로의 전환 백분율은 본 발명의 중요한 특징이 아니다. 그러나, 전환은 약 30% 정도 이상이면 바람직하고, 더욱바람직하게는 약 60% 정도 이상, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상이다.
발효액의 조성은 실시예에 기재된 조건을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 기법(HPLC)에 의해 모니터링될 수 있다.
프라바스타틴은 임의의 방법, 예를 들어 추출-재추출, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 침전에 의해 발효액으로부터 분리될 수 있다. 하기 분리 방법은 마이크로모노스포라 생합성의 생성물로서 프라바스타틴을 분리하기에 매우 적합하다. 그러나, 이들 방법은 컴팩틴 및 마이크로모노스포라속의 균주로부터 출발하여 프라바스타틴을 얻는 권장할 만한 방법들을 충분히 개시할 단순한 목적을 위해 제공되었을 뿐, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하지는 않는다.
생물학적 전환이 종료된 후, 프라바스타틴을 발효액, 또는 세균 세포의 분리 후 얻어진 여과액으로부터 추출할 수 있다. 세균 세포는 여과 또는 원심분리에 의해 제거가능하다. 하지만, 산업적 규모에 있어서는 특히 전체 발효액 추출을 수행하는 것이 유리하다. 추출 용매는 물과 전적으로 혼화불가능한 임의의 용매이다. 바람직한 추출 용매는 낮은 수용해도를 가진다. 특히 바람직한 용매는 지방족 알콕실기를 함유하는 2-4개의 탄소 원자를 가진 아세트산 에스테르, 예를 들면 에틸 아세테이트 및 이소부틸 아세테이를 포함한다.
우리의 실험 과정에서, 프라바스타틴은 2차 아민을 사용하여 발효액의 유기 추출물로부터 결정형 염으로 침전될 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 알킬-, 시클로알킬-, 아르알킬-, 또는 아릴-치환체를 함유하는 몇가지 2차 아민이 염의 형성에 특히 적합하다는 것이 밝혀졌다. 이들 가운데, 다음의 2차 아민, 즉 디옥틸아민, 디사이클로헥실아민 및 디벤질아민은, 부분적으로 이들의 낮은 독성에 기인하여, 가장 바람직하다.
프라바스타틴의 유기 2차 아민염을 분리하는 방법은 디벤질아민으로 예시한다. 디벤질아민염의 분리는 추출물 중의 프라바스타틴 함량에 대하여 1.5 당량의 디벤질아민을 첨가한 후 진공 증류에 의해 추출물을 그것의 원래 용적의 5%로 농축시키고, 추가량의 디벤질아민을 0.2 당량비로 상기 농축액에 첨가하는 것에 의해 수행된다. 결정형 디벤질아민염은 상기 농축물로부터 침전된다. 결정형 미정제 생성물을 여과하고, 진공하에서 건조시킨 후 메탄올 또는 아세톤 용액 중에서 목탄으로 정화한다. 프라바스타틴 디벤질아민염은 아세톤에서의 재결정에 의해 추가로 정제될 수 있다.
프라바스타틴 유기 2차 아민염은 수산화나트륨 또는 나트륨 알콕시드에 의해 프라바스타틴으로 전환될 수 있다. 바람직한 나트륨 알콕시드는 나트륨 에톡시드이다.
2차 아민염 중간체를 이용한 프라바스타틴의 분리는 이미 공지된 임의의 분리 방법에 비해 보다 간단한 방법이다. 이 방법에서, 가공물(artifact)은 생성되지 않는다. 생물학적 전환의 부산물로부터, 그리고 히드록실화 미생물에 의해 생합성된 다양한 대사 생성물로부터 프라바스타틴의 분리는 유리하게 해결될 수 있다.
발효액으로부터 프라바스타틴을 분리하는 또다른 방법은 생물학적 전환이 프라바스타틴 산염을 생산한다는 사실을 이용하는 것이다. 따라서, 프라바스타틴은 음이온 교환 수지 컬럼 상에서의 흡착에 의해 발효액으로부터, 바람직하게는 발효액의 여과액으로부터 분리될 수 있다. 4차 암모늄 활성기를 가진 폴리스티렌-디비닐벤젠 중합체와 같은 강한 염기성의 음이온 교환 수지[예를 들면, DowexRAl 400(OH-형태), DowexR1 x 2(OH-형태), DowexR2 x 4(OH-형태), 암베를라이트RIRA 900(OH-형태) 수지]는 발효액으로부터 프라바스타틴 유리산을 흡착하기에 매우 적합하다. 음이온 교환 수지상에 흡착되는 물질은 염화나트륨을 함유하는 물과 아세톤의 혼합물 또는 수성 아세트산에 의해 컬럼으로부터 용출될 수 있다. (1:1) 아세톤:물 혼합물 중 염화나트륨 1% 용액은 특히 바람직한 용출제이다. 프라바스타틴을 함유하는 분획을 합치고, 아세톤을 진공하에서 증류 제거한다. 농축물의 pH는 15% 황산을 사용하여 3.5 내지 4.0 범위로 조정하고, 산성화된 수성 용액은 에틸 아세테이트로 추출한다. 5% 탄산수소나트륨 또는 기타 완화한 알칼리 염기 용액(pH 7.5-8.0) 1/10 내지 1/20 용적비를 사용하여 에틸 아세테이트로부터 프라바스타틴을 재추출한다.
프라바스타틴은 비이온성 흡착 수지 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 알칼리 수성 추출물로부터 순수한 형태로 회수된다. 한가지 방법에서, 추출시에 알칼리성 수성상에 용해된 임의의 잔여 에틸 아세테이트는 진공 증류에 의해 제거되어야 하고, 그후 수성 추출물을 다이아이온 HP-20 컬럼 상에 로딩한다. 컬럼상에 흡착된 프라바스타틴은, 아세톤 함량이 점차적으로 증가하는 수성 아세톤을 이용한 용출에 의해 정제된 후, 단일 성분으로서 프라바스타틴을 함유하는 크로마토그래피 분획을 합쳐 진공하에서 농축한다. 농축물을 목탄으로 정화하여, 동결건조한다. 이어서, 프라바스타틴을 에탄올-에틸 아세테이트 혼합물로부터 재결정하여 약학적 용도에 질합한 질의 프라바스타틴을 얻는다.
프라바스타틴을 분리하는 또다른 방법은 프라바스타틴을 락톤화하여 발효액중에 기타 산성 유기 물질로부터의 분리를 개선시키는 것이다. 추출 전에, 광물산, 바람직하게는 희석 황산을 사용하여 발효액 또는 발효액 여과액의 pH를 3.5 내지 3.7로 조정한다. 이어서, 발효액을 수불혼화성 유기 용매, 바람직하게는 지방족 알콕시기를 함유하는 2-4개의 탄소 원자를 가진 아세트산 에스테르(예를 들어, 에틸 아세테이트 또는 이소부틸 아세테이트)를 사용하여 추출한다. 에틸 아세테이트 추출물을 물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 이어서, 프라바스타틴을 이것의 락톤으로 전환시킨다. 락톤 폐환은 촉매량의 트리플루오로아세트산을 사용하여 지속적으로 교반하면서 드라이 에틸 아세테이트 용액 중에서 실온의 온도로 수행된다. 락톤 폐환은 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링될 수 있다. 락톤이 형성된 후, 에틸 아세테이트 용액을 5% 수성 탄산수소나트륨 용액으로 세척한 후 물로 세척한다. 에틸 아세테이트 용액을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 에틸 아세테이트는 진공하에서 증발시킨다. 잔여물은 에틸 아세테에트 및 헥산의 혼합물로 용출시키며 에틸 아세테이트의 함량이 점차적으로 증가하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제한다.
정제된 프라바스타틴 락톤은, 당량 이상의 수산화나트륨을 사용하여 에탄올 중에서 실온에서 프라바스타틴으로 전환된다. 프라바스타틴 나트륨염이 형성된 후, 프라바스타틴 나트륨을 아세톤으로 침전시킬 수 있다. 침전물을 여과하고, 아세톤과 n-헥산으로 세척하여 진공하에 건조시킨다. 프라바스타틴 나트륨염은 에탄올-에틸 아세테이트 혼합물로부터 결정화되어 약학적 용도에 적합한 질의 프라바스타틴 나트륨을 얻을 수 있다.
프라바스타틴을 분리하는 또다른 방법은 세파덱스 LH-20 겔상에서의 크로마토그래피를 이용하는 것이다. 순도 99.5% 이상의 프라바스타틴(HPLC에 의해 측정함)은 세파덱스 LH-20 겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 제조될 수 있다.
이상 특정한 바람직한 구체예를 사용하여 본 발명을 설명하였으며, 마이크로모노스포라를 이용한 프라바스타틴의 생합성 및 분리 방법은 후술하는 실시예에 의해 보다 상세하게 예시될 것이다.
워터스R에서 제조된 장치를 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")를 수행하였다. HPLC 조건 : 컬럼 충전 워터스 노바팩 C185 ㎛ 역상 충전; UV 검출 : λ = 237 nm; 주입 용적 : 10 ㎕; 유속 : 0.6 내지 0.9 ml/분 직선 구배; 구배 용출: 용매 A = 수 중 아세토니트릴-0.1 M NaH2PO4(25:75), 용매 B = 아세토니트릴-물(H3PO4를 사용하여 pH 2)(70:30). 구배 프로그램은 하기 표 1에 제시된다.
시간(분) 유속(ml/분) 용출제 A(%) 용출제 B(%)
0 0.6 100 0
2 0.7 100 0
20 0.9 0 100
21 0.9 0 100
22 0.9 100 0
27 0.7 100 0
체류 시간 : 프라바스타틴(Na 염)10.6 분; 컴팩틴(산염) 19.5분; 프라바스타틴(락톤 형태) 17.3분; 컴팩틴(락톤 형태) 23.5분.
실시예 1
가용성 전분 아가 배지("SM", 표 2)의 pH를 7.0으로 조정한 후, 121℃에서 25분간 멸균하였다.
SM 배지의 조성
가용성 전분 10.0 g
효모 추출물 5.0 g
Na2HPO4 1.15 g
KH2PO4 0.25 g
KCl 0.2 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
전분 15.0 g
물 1000 ml
이어서, SM 배지에 마이크로모노스포라 에스피. IDR-P3[NCAIM P(B) 001268]을 접종하였다. 증류수(5 ml) 중 포자의 현탁액을 마이크로모노스포라 에스피. IDR-P3[NCAIM P(B) 001268]의 7-10일된 가용성 전분 아가(SM) 사면 배양물에서 얻은 포자로부터 제조하였다.
T1 배지의 pH를 7.0으로 조정하고 121℃에서 25분간 멸균한 후, 상기 현탁액을 사용하여 500 ml 얼렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 내에서 T1 접종 배지(100 ml, 표 3)에 접종하였다.
T1 배지의 조성
가용성 전분 20.0 g
효모 추출물 10.0 g
CaCO3 5.0 g
CoCl2·6H2O 2.0 mg
물 1000 ml
이 배양액을 회전 쉐이커 상에서 32℃의 온도로 3일간 흔들어 주었다(250 r.p.m.; 진폭 : 2.5 cm). 이어서, 5 ml 분량의 이 접종 배양액을 사용하여, 10개의 500 ml 얼렌마이어 플라스크에 접종하였다. 상기 각각의 플라스크는 pH 7.0으로 조정되고 25분간 121℃의 온도에서 멸균된 TT 배지(100 ml, 표 4)를 함유하고 있었다.
TT 배지의 조성
감자 전분 30.0 g
대두분 30.0 g
CaCO3 5.0 g
CoCl2·6H2O 2.0 mg
팜유 2.0 g
물 1000 ml
세균을 32℃에서 72시간동안 배양하였다. 이어서, 컴팩틴 나트륨염(50 mg)을 증류수 중에서 각각의 플라스크에 첨가하고, 32℃에서 추가로 96시간동안 생물학적전환을 지속하였다. 컴팩틴 나트륨염에서 프라바스타틴으로의 전환은 HPLC에 의해 82%로 측정되었다.
발효를 마친 후, 배양물을 혼합하였다. 프라바스타틴은 평균 410 ㎍/ml의 농도로 형성되었다. 프라바스타틴을 하기와 같이 분리하였다. 발효액을 2500 r.p.m.에서 20분간 원심분리하였다. 이 발효액의 상청액 및 세균 세포를 분리하였다. 물(250 ml)을 세균 세포에 첨가하고, 현탁액을 1시간동안 교반한 후 여과하였다. 상청액 및 여과액을 혼합하였다. 15% 황산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정하였다. 산성 여과액/상청액 혼합물을 에틸 아세테이트(3 x 300 ml)로 추출하였다. 합쳐진 에틸 아세테이트 추출액을 물(300 ml)로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 진공에서 100 ml 용적으로 농축시켰다.
프라바스타틴 락톤은 실온에서 계속적으로 교반하면서 촉매량의 트리플루오로아세트산을 첨가함에 따라 프라바스타틴으로부터 제조되었다. 프라바스타틴 락톤의 형성은 TLC[흡착제 : 알루미늄 호일 백킹상의 Kleselgel(실리카겔) 60 F254DC (머크); 현상 용매 : 아세톤:벤젠:아세트산(50:50:1.5); 검출 : 포스포몰리브딘산 시약; Rf(프라바스타틴 락톤) = 0.7]에 의해 모니터링되었다. 락톤화가 종료된 후, 에틸 아세테이트를 5% 수성 탄산수소나트륨(2 x 20 ml)로 세척한 후 물(20 ml)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 에틸 아세테이트를 진공하에 증발시켰다. 잔류물(0.5 g)은, 10 g의 키에셀겔 60 흡착제(컬럼 직경 : 1.2 cm)상에서 증가된 극성의 에틸 아세톤-n-헥산 혼합물로 용출시키는 구배 컬럼 크로마토그래피에의해 분리하였다. 프라바스타틴 락톤을 60% 에틸 아세테이트/n-헥산 혼합물을 사용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 프라바스타틴을 함유하는 분획을 합쳐 진공하에서 증발시켰다. 잔류물(230 mg)을 에탄올(5 ml) 중에서 용해시킨 후, 110 몰% 수산화나트륨을 1M 에탄올 용액으로서 교반하면서 첨가하였다. 실온에서 30분간 교반을 계속하였다. 이어서, 용액을 2 ml 용적으로 농축시켰다. 아세톤(4 ml)을 상기 농축액에 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 +5℃으로 유지시켰다. 침전물을 여과하고, 아세톤(2 ml)으로 세척한 후 n-헥산(2 ml)으로 세척하여 실온에서 진공하에 건조시켰다. 얻어진 미정제 프라바스타틴을 에탄올에 용해시켰다. 이 용액을 목탄으로 정화한 후 프라바스타틴(170 mg)을 에탄올-에틸 아세테이트 혼합물로부터 결정화하였다.
특성:
융점 : 170-173℃(분해)
[α]D 20= +156℃(c = 0,5, 수 중)
자외선 흡수 스펙트럼(20 ㎍/ml, 메탄올 중): λmax= 231, 237, 245 nm(log ε= 4.263; 4.311; 4.136).
적외선 흡수 스펙트럼(KBr):νOH3415, νCH2965, νC-0 1730, νCOO-1575cm-1.
1H-NMR 스펙트럼(D2O, δ, ppm): 0.86, d, 3H(2-CH3); 5.92, dd, J=10.0 및 5.4 Hz, 1H(3-H); 5.99, d, J=10.0 Hz, 1H(4-H); 5.52, br, 1H(5-H); 4.24, m, 1H (6-H); 5.34, br, 1H(8-H); 4.06, m, 1H(β-H), 3.65, m, 1H(δ-H); 1.05, d, 3H(2'-CH3); 0.82, t, 3H(4'-H3).
13C-NMR 스펙트럼(D2O, δ, ppm): 15.3, q(2-CH3); 139.5, d(C-3); 129.5, d(C-4); 138.1, s(C-4a); 127.7, d(C-5); 66.6, d(C-6); 70.1, d(C-8); 182.6, s(COO-); 72.6, d, (C-β); 73.0, d(C-δ); 182.0, s(C-1'); 18.8, q(2'-CH3); 13.7, q(C-4').
양성 FAB 질량 스펙트럼(특징 이온): 469[M+Na]+; 447[M+H]+
음성 FAB 질량 스펙트럼(특징 이온): 445[M-H]-; 423[M-Na]-; m/z 101 [2-메틸-부티르산-J].
실시예 2
생물학적 전환 배지 MT(표 5)의 pH를 7.0으로 조정하고, 121℃에서 25분간 멸균하였다.
MT 생물학적 전환 배지의 조성
감자 전분 10.0 g
덱스트로즈 20.0 g
대두분 10.0 g
효모 추출물 10.0 g
CaCO3 5.0 g
CoCl2·6H2O 2.0 mg
해바라기유 2.0 g
물 1000 ml
각각 MT 생물학적 전환 배지(100 ml)를 함유하는 10개의 500 ml 얼렌마이어 플라스크를 실시예 1에서 제조한 접종 배양물로 접종하여, 28℃에서 96시간동안 배양하였다. 컴팩틴 나트륨염(50 mg)을 최소량의 증류수 중에 용해시키고, 각각의 플라스크에 첨가하였다. 발효를 72시간동안 지속시켰다. 이어서, 증류수 중 추가 50 mg의 컴팩틴 나트륨염을 각각의 배양물에 첨가하고, 발효를 추가로 72시간동안 지속시켰다.
배양물을 합쳐서 프라바스타틴을 하기 절차에 의해 배양액으로부터 분리하였다. HPLC 분석에 의해 프라바스타틴 750 mg을 함유하는 합쳐진 배양물을 2500 r.p.m.으로 20분간 원심분리하였다. 분리된 세균 세포를 물(250 ml)로 1시간동안 교반한 후, 여과하였다. 상청액 및 여과액을 합치고, 15% 황산을 이용하여 얻어진 용액의 pH를 3.5 내지 4.0으로 조정하였다. 용액을 에틸 아세테이트(3 x 300 ml)로 추출하였다. 이어서, 150 몰% 디벤질아민(프라바스타틴 함량으로 계산함)을 에틸 아세테이트 추출물에 첨가하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 약 30 ml 용적으로 증발시키고, 현탁액을 0-5℃에서 밤새 방치하였다. 침전된 프라바스타틴 디벤질암모늄염을 여과하고, 필터상에서 냉 에틸 아세테이트 및 n-헥산으로 세척하여, 진공하에서 건조시켰다. 미정제 프라바스타틴 디벤질암모늄염(1.1 g)을 아세톤(33 ml) 중 62-66℃에서 용해시켰다. 용액을 목탄(0.1 g)으로 30분동안 정화하였다. 목탄을 여과에 의해 용액으로부터 제거하고, 가온한 아세톤(10 ml)으로 세척하였다. 농축물로부터 결정이 침전되었고, 이를 62-66℃에서 다시 용해시켰다. 이 용액을 밤새 5℃에 방치하였다. 침전물을 여과하고, 냉 아세톤 및 n-헥산으로 세척하여 진공하에서 건조시켰다. 이렇게 얻어진 프라바스타틴 디벤질암모늄염(0.7 g)을 에탄올(10 ml) 중에서 현탁시킨 후, 110 몰% 수산화나트륨을 1M 수용액으로서 상기 용액에 첨가하였다. 알카리 용액을 실온에서 30분동안 교반하였다. 물(30 ml)을 첨가하고 용액의 pH를 중성화하였다. 에탄올을 진공하에서 증류 제거하였다. 얻어진 수성 농축물을 50 ml의 디아이온 HP 20 수지(컬럼 직경 : 1.5 cm)로 충전된 컬럼 상에서 농도 구배 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 컬럼을 아세톤-탈이온수 혼합물로 용출시키는데, 아세톤의 농도가 5% 증가하였다. 프라바스타틴은 15% 아세톤-탈이온수 혼합물에 의해 컬럼으로부터 용출될 수 있었다. 분획은 실시예 1에 주어진 TLC 방법에 의해 분석하였다 : Rf(프라바스타틴)=0.5. 프라바스타틴을 함유하는 분획을 합치고, 아세톤을 진공하에서 증발시켰다. 수성 잔류물을 동결건조하여 크로마토그래피적으로 순수한 프라바스타틴(390 mg)을 제조하였다.
실시예 3
TT/2 배지(4.5 L, 표 6)는, 실험용 발효기 중에 121℃에서 45분간 멸균한후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 T1 배지(500 ml) 중 마이크로모노스포라 에스피. IDR-P3접종 쉐이크 배양물로 접종하였다.
TT/2 생물학적 전환 배지의 조성
글루코즈 75.0 g
가용성 전분 50.0 g
대두분 50.0 g
효모 추출물 50.0 g
콩 펩톤 5.0 g
CoCl2·H2O 2.0 mg
CaCO3 5.0 g
물 1000 ml
이어서, 배지를 28℃에서 배양하고, 멸균된 공기 150 L/h를 주입하고, 평평한 블레이드 교반기를 사용하여 300 r.p.m.으로 교반하였다. 발효를 72시간동안 지속하고, 컴팩틴 나트륨염(2.5 g)을 배지에 첨가하였다. 48시간동안 생물학적 전환으로 컴팩틴 기질이 발효액으로부터 소모되었다. 추가의 컴팩틴 나트륨염(2.5 g)을 배지에 첨가하였다. 24시간 후에 제2 용량의 컴팩틴 기질이 소모되었다. 컴팩틴 나트륨염으로부터 프라바스타틴으로의 전환율은 90%였다.
실시예 4
TT/1 발효 배지(4.5 L, 표 7)를 pH 7.0으로 조정하고, 실험용 발효기내 121℃에서 45분간 멸균하였다.
TT/1 생물학적 전환 배지의 조성
글루코즈 125.0 g
가용성 전분 25.0 g
대두분 50.0 g
효모 추출물 50.0 g
콩 펩톤 50.0 g
CoCl2·H2O 2.0 mg
CaCO3 5.0 g
해바라기유 2.0 g
물 1000 ml
TT/1 배지를, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 마이크로모노스포라 에스피. IDR-P3접종물 쉐이크 배양물(500 ml)로 접종하였다. 이어서, 이 배지를 28℃에서 배양하고, 멸균된 공기 150 L/h를 주입하고, 평평한 블레이드 교반기를 사용하여 400 r.p.m.에서 96시간동안 교반하였다. 컴팩틴 나트륨염(2.5 g)을 멸균 여과된 수성 용액으로서 배지에 첨가하였다. 발효는 28℃에서 수행되었다. 5일째 발효에 의해 발효액으로부터 컴팩틴이 소모되었다. 추가로 컴팩틴 나트륨염(7.5 g)을 2일에 걸쳐 2.5 g 분량씩 간헐적으로 첨가하였다. 추가량의 컴팩틴 나트륨염은 최초 첨가시로부터 4일내에 프라바스타틴으로 완전히 전환되었다. 발효 종료시에, 컴팩틴 나트륨염(10 g)이 프라바스타틴으로 전환되었다(9 g, 90%).
1800 ㎍/ml의 프라바스타틴이 다음과 같이 상기 발효액으로부터 분리되었다. 배양액(5 L)을 2500 r.p.m.에서 20분간 원심분리하고, 상청액을 세균 세포로부터 분리하였다. 물(2L)을 상기 분리된 세포에 첨가하고, 얻어진 현탁액을 1시간동안 교반하고 여과하였다. 상청액과 여과액을 합치고, DowexRAl 400(OH-) 수지(300 g,컬럼 직경 : 4 cm)를 함유하는 컬럼에 500 ml/시의 유속으로 통과시켰다. 수지층을 탈이온수(1L)로 세척하였다. 이어서, 컬럼을 10 g의 염화나트륨을 함유하는 아세톤-물 1:1 혼합물(1L)로 용출하여, 50 ml 분획을 수집하였다. 상기 분획을 실시예 1에 제시된 TLC 기법에 의해 분석하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합치고, 아세톤은 진공하에서 증류 제거하였다. 농축물의 pH는 15% 황산을 사용하여 3.5-4.0으로 조정하였다. 농축물을 에틸 아세테이트(2 x 250 ml)로 추출하였다. 탈이온수(40 ml)를 상기 합쳐진 에틸 아세테이트 추출물에 첨가하였다. 수상의 pH를 1M 수산화나트륨으로 7.5-8.0으로 조정하였다. 15분간 교반 후, 수성 및 에틸 아세테이트상을 분리하였다. 수성 알카리 추출을 2회 반복하였다. 합쳐진 알칼리 수용액을 50 ml 용적으로 농축하고, 잔류물을 다이아이온R HP20(미쯔비시 코포레이션, 일본, 600 ml, 컬럼 직경 3.8 cm) 상에서 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 컬럼을 탈이온수(600 ml)로 세척하고, 아세톤-탈이온수 혼합물로 용출시켜, 용출제 중 아세톤의 농도가 5% 증가되었다. 용출물을 50 ml 분획으로 수집하였다. 용출물을 실시예 1에 제시된 TLC 방법에 의해 분석하였다. 프라바스타틴은 15% 아세톤-탈이온수 혼합물 중에서 컬럼으로부터 용출되었다. TLC 측정에 의해 순수한 프라바스타틴을 함유하는 분획을 합치고, 상기 용액을 진공하에서 150 ml의 용적으로 농축시켰다. 농축된 용출물을 실온에서 1시간 목탄(0.6 g)상에서의 교반에 의해 정화하였다. 목탄을 여과 제거하고, 여과액을 동결건조하였다. 얻어진 동결건조 프라바스타틴(6.5 g)을 에탄올과 에틸 아세테이트의 혼합물로부터 2회 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 에틸 아세테이트(20 ml) 및 n-헥산(20 ml)으로 세척한 후, 실온에서진공하에서 건조시켜 크로마토그래피적으로 순수한 프라바스타틴(4.6 g)을 얻었다.
실시예 5
실시예 1의 멸균된 가용성 전분 배지 SM을 마이크로모노스포라 에키노스포라 에스에스피. 에키노스포라 IDR-P5[NCAIM P(B) 001272] 세균 균주로 접종하고, 10일간 배양하였다. 증류수(5 ml) 중 포자 현탁액을 10일된 가용성 전분 배지에서 얻어진 포자로부터 제조하고, 상기 현탁액을 사용하여 500 ml 얼렌마이어 플라스크 내에서 실시예 1의 멸균 T1 접종 배지 100 ml에 접종하였다. 배양물을 회전 쉐이커(250 r.p.m., 2.5 cm 진폭) 상에서 28℃의 온도로 3일간 흔들어 주었다. 이어서, 얻어진 배양물 5 ml 분획을 10개의 500 ml 얼렌마이어 플라스크로 옮겼다. 이들 플라스크 각각은 121℃로 25분간의 가열에 의해 멸균된 생물학적 전환 배지 TT/1 100 ml를 함유하였다. TT/1 배지의 조성은 실시예 3에 기재되어 있다. 플라스크를 회전 쉐이커(250 r.p.m., 2.5 cm 진폭) 상에서 흔들어 주면서 25℃에서 3일간 배양하였다. 컴팩틴 나트륨염(10 mg)을 멸균 여과된 수용액으로서 각각의 플라스크에 첨가하였다. 발효를 25℃에서 168시간동안 지속하였다. 생물학적 전환의 종료시에, 발효액 중 프라바스타틴의 함량은 HPLC 측정에 의해 40 ㎍/ml였다.
실시예 6
접종, 배양, 발효 및 기질 공급은 실시예 5에 기재된 바와 같이 마이크로모노스포라 메갈로미체아 에스에스피. 니그라 IDR-P6[NCAIM P(B) 001273] 세균 균주를 사용하여 수행하였다. 168시간 후 발효액 중 프라바스타틴의 함량은 HPLC에 의해측정하였을 때 50 ㎍/ml였다.
실시예 7
실시예 1의 방법에 따라서 마이크로모노스포라 푸르푸레아 IDR-P4[NCAIM P(B) 001271] 세균 균주의 접종 배양물(5 ml)을 제조하였다. TT/14 배지의 pH를 7.0으로 조정하고 121℃에서 25분간 멸균한 후, 500 ml 얼렌마이어 플라스크 내에서 상기 접종물을 사용하여 TT/14 배지(100 ml, 표 8)에 접종하였다.
TT/14 생물학적 전환 배지의 조성
감자 전분 75.0 g
글루코즈 25.0 g
효모 추출물(Gistex) 15.0 g
콩 펩톤 15.0 g
CaCO3 5.0 g
CoCl2·6H2O 2.0 mg
수도물 1000 ml
이 플라스크를 회전 쉐이커(2.5 r.p.m., 2.5 cm 진폭)상에서 3일동안 흔들어 주었다. 컴팩틴 나트륨염 공급, 생물학적 전환 및 프라바스타틴 함량 측정은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 생물학적 전환 종료시에, 발효액의 프라바스타틴 함량은 HPLC에 의해 측정하였을 때 40 ㎍/ml였다.
실시예 8
접종, 배양, 발효 및 컴팩틴 나트륨염의 공급은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 마이크로모노스포라 로사리아 IDR-P7[NCAIM P(B) 001274] 세균 군주를 사용하여 수행되었다. 생물학적 전환 종료시에, 발효액 중 프라바스타틴 함량은 HPLC에의해 측정하였을 때 350 ㎍/ml였다.
지금까지 본 발명을 특정 바람직한 구체예 및 실시예로서 설명하였으나, 당업자라면 전술한 발명 및 후술하는 특허청구범위를 벗어나지 않는 변경을 충분히 이해할 것이다.

Claims (12)

  1. 하기 단계 (a) 내지 (d)를 포함하고, 발효, 및 생물학적 전환 과정에서 생성된 화학식 (I)의 화합물을 분리 및 정제함에 따른, 하기 화학식 (II)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는 균주에 의한 화학식 (II) 화합물로부터 화학식 (I) 화합물의 미생물적 제조 방법:
    [화학식 I]
    [화학식 II]
    (상기 식에서, R+는 알칼리 금속 또는 암모늄 이온을 의미함)
    (a) 동화가능한 탄소 및 질소원을 함유하는 영양 배지 상에서 화학식 (II)의 화합물(여기서, R+는 앞서 정의한 바와 같음)을 6β-히드록실화할 수 있는 마이크로모노스포라속 미생물을 배양하는 단계,
    (b) 이어서, 상기 배양된 배양물로 형질전환되는 기질을 제공하는 단계,
    (c) 이어서, 생물학적 전환이 종료될 때까지 기질을 발효시키는 단계,
    (d) 이어서, 상기 배양액으로부터 화학식 (I)의 화합물을 분리하고, 필요에 따라 이것을 정제하는 단계.
  2. 제9항에 있어서, 상기 미생물을 약 25 내지 약 37℃의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  3. 제10항에 있어서, 상기 미생물을 약 25 내지 약 32℃의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  4. 제9항에 있어서, 상기 영양 배지가 수성 액체인 방법.
  5. 제9항에 있어서, 상기 영양 배지가 광물 염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제9항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재의 국립 농업 및 산업 미생물 수집소에 수탁 번호 NCAIM P(B) 001268호로 기탁된 마이크로모노스포라 에스피. IDR-P3균주 또는 이것의 돌연변이 균주를 배양하는 것인 방법.
  7. 제9항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재의 국립 농업 및 산업 미생물 수집소에 수탁 번호 NCAIM P(B) 001271호로 기탁된 마이크로모노스포라 푸르푸레아 IDR-P4균주 또는 이것의 돌연변이 균주를 배양하는 것인 방법.
  8. 제9항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재의 국립 농업 및 산업 미생물 수집소에 수탁 번호 NCAIM P(B) 001272호로 기탁된 마이크로모노스포라 에키노스포라 에스에스피. 에키노스포라 IDR-P5균주 또는 이것의 돌연변이 균주를 배양하는 것인 방법.
  9. 제9항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재의 국립 농업 및 산업 미생물 수집소에 수탁 번호 NCAIM P(B) 001273호로 기탁된 마이크로모노스포라 메갈로미체아 에스에스피. 니그라 IDR-P6균주 또는 이것의 돌연변이 균주를 배양하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는, 헝가리 부다페스트 소재의 국립 농업 및 산업 미생물 수집소에 수탁 번호 NCAIM P(B) 001274호로 기탁된 마이크로모노스포라 로사리아 IDR-P7균주 또는 이것의 돌연변이 균주를 배양하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 R+가 나트륨 이온인 방법.
  12. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 발효시에 생성된 화학식 (I)의 화합물은, 이를 음이온 교환 수지상에서 흡착하거나 또는 수불혼화성 유기 용매로 추출한 후, 중간체로서 이것의 락톤 유도체 또는 이것의 2차 아민염을 제조하거나 또는 발효액의 유기 용매 추출물로부터 얻어진 알칼리성 수성 추출물을 비이온성 흡착 수지 상에서 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 배양액으로부터 분리되는 것인 방법.
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