SK285726B6 - Hydroxylácia compactinu na pravastatin s použitímmikromonospór - Google Patents
Hydroxylácia compactinu na pravastatin s použitímmikromonospór Download PDFInfo
- Publication number
- SK285726B6 SK285726B6 SK49-2002A SK492002A SK285726B6 SK 285726 B6 SK285726 B6 SK 285726B6 SK 492002 A SK492002 A SK 492002A SK 285726 B6 SK285726 B6 SK 285726B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- compound
- formula
- strain
- micromonospora
- ncaim
- Prior art date
Links
- 241000187708 Micromonospora Species 0.000 title claims abstract description 21
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 title claims description 13
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 title description 74
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 72
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 title description 72
- AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N mevastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=CCC[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N 0.000 title description 20
- VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N Compactin Natural products OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(CO)OC2Oc3cc(O)c4C(=O)C(=COc4c3)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C(O)C1O VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 18
- AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N SJ000287055 Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 18
- BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N mevastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C21 BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 18
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 title description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 claims abstract description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims abstract description 4
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 31
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 22
- -1 amine salt Chemical class 0.000 claims description 21
- 241000187722 Micromonospora echinospora Species 0.000 claims description 13
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 9
- 241000187723 Micromonospora sp. Species 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 241000218923 Micromonospora megalomicea Species 0.000 claims description 6
- 241000218940 Micromonospora rosaria Species 0.000 claims description 6
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 4
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 11
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 9
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 9
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 8
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 7
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 7
- OQARDMYXSOFTLN-PZAWKZKUSA-N pravastatin lactone Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@@H](O)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 OQARDMYXSOFTLN-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 6
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 6
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 6
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 5
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 5
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 5
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.CCOC(C)=O LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 3
- OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;hydrate Chemical compound O.CC(C)=O OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 3
- BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N 0.000 description 2
- 102100029077 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Human genes 0.000 description 2
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000544912 Melanoides Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002143 fast-atom bombardment mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 2
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N iso-butyl acetate Natural products CC(C)COC(C)=O GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M isocaproate Chemical compound CC(C)CCC([O-])=O FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid methyl ester Natural products COC(=O)CC(C)C OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 2
- PDBXRGUGLTUAAD-ABPOPGQRSA-M sodium;(3r)-7-[(1s,2s,8s,8ar)-2-methyl-8-[(2s)-2-methylbutanoyl]oxy-1,2,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]-3-hydroxyheptanoate Chemical class [Na+].C1=C[C@H](C)[C@H](CCCC[C@@H](O)CC([O-])=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)CCC=C21 PDBXRGUGLTUAAD-ABPOPGQRSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- UQZSVIGPZAULMV-DKWTVANSSA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UQZSVIGPZAULMV-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- WLAMNBDJUVNPJU-BYPYZUCNSA-N 2-Methylbutanoic acid Natural products CC[C@H](C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutyric acid Chemical compound CCC(C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOGXUPUEYLGSAS-UHFFFAOYSA-N 2-phenylacetic acid;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.OC(=O)CC1=CC=CC=C1 IOGXUPUEYLGSAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710158485 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical group C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 241000178285 Streptomyces carbophilus Species 0.000 description 1
- 241000938054 Streptomyces lanatus Species 0.000 description 1
- 241000187418 Streptomyces rochei Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000187175 Streptomyces violaceus Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical group O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007613 bennett's agar Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- LAWOZCWGWDVVSG-UHFFFAOYSA-N dioctylamine Chemical compound CCCCCCCCNCCCCCCCC LAWOZCWGWDVVSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002168 ethanoic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOZILQFLQYBIIY-INTXDZFKSA-N mevinic acid Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)CCC=C21 BOZILQFLQYBIIY-INTXDZFKSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- NKAAEMMYHLFEFN-UHFFFAOYSA-M monosodium tartrate Chemical compound [Na+].OC(=O)C(O)C(O)C([O-])=O NKAAEMMYHLFEFN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006877 oatmeal agar Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229940096701 plain lipid modifying drug hmg coa reductase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229960001495 pravastatin sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N sodium ethoxide Chemical compound [Na+].CC[O-] QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/29—Micromonospora
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Opisuje sa mikrobiálny spôsob prípravy zlúčeniny vzorca (I) zo zlúčeniny všeobecného vzorca (II), vktorom R znamená ión alkalického kovu alebo amóniový ión, pomocou submerznej kultivácie kmeňa, ktorý je schopný 6beta-hydroxylovať zlúčeninu vzorca (II) pri aeróbnej fermentácii a separovaním a prečistením produktu vzorca (I) vytvoreného v priebehu biologickej konverzie. Uvedená fermentácia zahŕňa kroky kultivácie kmeňa Micromonospora, ktorý je schopný 6beta-hydroxylovať zlúčeninu všeobecného vzorca (II) - kde R má definovaný význam - pri teplote 25 až 32 °C na živnom médiu obsahujúcom využiteľné zdroje uhlíka, dusíka a minerálnej soli, potom dávkovania substrátu, ktorý sa má transformovať, do rozvinutej kultúry, následne hydroxylovanie substrátu až do ukončenia biologickej konverzie, potomseparovanie zlúčeniny vzorca (I) z kultivačného prostredia a, v prípade potreby, jej prečistenie.
Description
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka nového mikrobiálneho spôsobu na prípravu pravastatinu.
Ešte presnejšie sa tento vynález týka mikrobiálneho spôsobu na prípravu pravastatinu vzorca
(i) zo zlúčeniny všeobecného vzorca (II)
v ktorom R znamená ión alkalického kovu alebo amóniový ión, s mikroorganizmom, pričom uvedeným mikroorganizmom je prokaryot z rodu Micromonospora, ktorý je schopný hydroxylovať zlúčeninu všeobecného vzorca (II) v polohe 6β.
Doterajší stav techniky
Hypercholesterolémia sa pokladá za hlavný rizikový faktor pri aterosklerotickom ochorení, predovšetkým pri koronárnom ochorení srdca. Počas posledných dvoch dekád sa intenzívne skúmal 3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzým A reduktáza (HMG-CoA reduktáza EC. 1.1.1.34) ako hlavný rýchlosť-limitujúci enzým pri syntéze cholesterolu. Zistilo sa, že mevinolin a príbuzné zlúčeniny biologicky syntetizované s použitím zvolených kmeňov rozličných druhov húb sú kompetitívnymi inhibítormi tohto enzýmu [Endo, A. a kol.. J. Antibiotics 29, 1346 - 1348 (1976); Endo, A. a kol., FEBS Lett. 72, 323 - 326 (1976); Kuo, C. H. a kol., J. Org. Chem. 48, 1991 - 1998 (1983)].
Pravastatin je taktiež členom rodiny inhibítorov HMGCoA reduktázy. Pravastatin sa najskôr našiel ako minoritný metabolit compactinu v moči psov (Tanaka, M. a kol., nepublikované výsledky) počas metabolických štúdií compactinu [Arai, M. a kol. Sankyo Kenkyusho Nempo, 40, 1 - 38 (1988)].
Hlavnou charakteristickou vlastnosťou pravastatinu ako hydroxylovaného produktu compactinu je jeho tkanivová selektivita. Toto liečivo silne inhibuje syntézu sterolu v pečeni a v tenkom čreve, ale slabo v iných orgánoch. Je výhodné, že pravastatin vykazuje nižšiu toxicitu ako iné inhibítory HMG-CoA reduktázy.
Bolo publikované, že mikrobiálna hydroxylácia compactinu sa môže uskutočniť do rozličného stupňa s použitím niektorých druhov kmeňov, ktoré patria k viacerým rozmanitým rodom húb a s použitím kmeňov druhov aktinomycét, ktoré patria do rodu Nocardia, Actinomadura a Streptomyces, okrem iných Streptomyces toseochromogenes a Streptomyces carbophilus (americké patentové dokumenty US 5,179,013, US 4,448,979, US 4,346,227, US 4,537,859, japonský patentový dokument č. 58,010,572).
Problém s použitím húb na produkciu pravastatinu z compactinu je v tom, že tieto organizmy vo všeobecnosti nie sú tolerantné na vyššie koncentrácie compactinu v kvapalnom kultivačnom médiu, pravdepodobne z dôvodu ich fungicídnej aktivity [Serizawa, N. a kol., J. Antibiotics 36, 887 - 891 (1983)]. Ukázalo sa, že v Streptomyces carbophilus sa pri hydroxylácii compactinu na pravastatin požaduje cytochrómový P450 systém [Matsuoka, T. a kol., Eur. J. Biochem. 184. 707 - 713 (1989)], Obťažnosť genetického zlepšenia schopnosti hydroxylácie s použitím takéhoto enzýmu je v tom, že to skôr komplex proteínov než jednoduchý proteín.
Podstata vynálezu
Naše výskumy sa zamerali na nájdenie aktinomycétového kmeňa, ktorý by produkoval pravastatin zo solí kyslej formy compactinu s vyšším výťažkom a pri použití vyšších koncentrácií substrátu pri biologickej konverzii, než ako sú, jc to známe z doterajších patentových dokumentov.
V priebehu skríningu, ktorý zahrňoval približne 6000 aktinomycét, väčšinou našich vlastných izolátov, ale tiež pôvodné kmene z medzinárodných zbierok, sa pre ďalšie štúdie zvolilo päť Streptomyces a päť Micromonospora, pretože sa preukázali ako schopné hydroxylovať sodnú soľ kyslej formy compactinu na pravastatin. Týchto desať aktinomycétových kmeňov, z ktorých osem kmeňov bolo taxonomicky identifikovaných na úrovni druhu v našom laboratóriu, bolo nasledovných:
Streptomyces violaceus (podľa Kämpfer a kol, 1991), kmeň č. 1/43.
Streptomyces rochei (Berger a kol., 1949; Waksman a Lechevalier, 1953), kmeň č. 1/41.
Streptomyces resistomyciflcus (Lindenbein, 1952), kmeň č. 1/44.
Streptomyces sp., kmeň č: 1/28. Streptomyces lanatus (Frommer, 1959), kmeň č. 1/16. Micromonospora sp., kmeň č. IDR-P3.
Micromonospora purpurea (Luedemann a Brodsky, 1964), kmeň č. IDR-P4.
Micromonospora echinospora (Luedemann a Brodsky, 1964), kmeň č. IDR-P5.
Micromonospora megalomicea (Weinstein a kol, 1969), kmeň č. IDR-P6.
Micromonospora rosaria (Horan a Brodsky, 1986), kmeň č. IDR-P7.
Keďže až doteraz nie sú v literatúre žiadne údaje o schopnosti Micromonospora konvertovať soli kyslej formy compactinu na pravastatin, dôkladne sme preštudovali nielen túto špeciálnu enzymatickú schopnosť, ale tiež taxonomickú pozíciu týchto uvedených kmeňov Micromonospora.
Taxonomická pozícia kmeňov 1DR-P3, -P4, -P5, -P6 a
-P7 na generickej úrovni
Všetky tieto kmene produkovali dobre vyvinuté mycéliá, pozostávajúce z rozvetvenej hýfy s priemerom približne
0,4 až 0,7.pm. Aerálne mycélium nie je prítomné alebo sa vyskytuje len v stopách. Nepohyblivé spóry vznikali na sporofóroch samostatne. Hýfy mycélia substrátu sú grampozitívne a nie sú rezistentné proti kyseline. Kmene č. IDR P 3 až P7 sú aeróbne, chcmo-organotrofickč a citlivé na hodnotu pH menej ako 6,0. Steny obsahujú mezo-dia-minopimelovú kyselinu. Uvedené diagnostické vlastnosti - ako kľúčové charakteristiky - jasne demonštrujú, že tieto monosporické aktinomycétové kmene sú typickými členmi rodu Micromonospora.
Taxonomický opis Micromonospora sp., kmeň č. IDR-Pj
Mikromorfologické vlastnosti: Mycélium substrátu pozostáva z dobre vyvinutých, viac zakrivených než rovných, monopodiálne rozvetvených vlákien. Spóry na sporofóroch sú jednoduché, guľovité s priemerom približne 1,8 pm a dispergované viac alebo menej na vláknach hýfy. Spóry sú buď prichytené (bez stopky) alebo na konci krátkych sporofór. V materských kultúrach sa spóry nepozorovali na hýfach pravdepodobne preto, že uvoľňovanie zrelých spór je veľmi rýchle.
Kultivačno-makromorfologické vlastnosti:
Czapekov sacharózový agar: Rast média, kolónie majú červenkastú farbu pokrytú bodkovanými čiernymi sporulačnými oblasťami.
Glukózo-asparagínový agar: Rast sa zaznamenal ako bodový a vyvýšený, červenkastohnedé alebo čierne kolónie. Červenkasté prelínavé pigmenty.
Živný agar: Priemerný rast, vyvýšený, červenkastohnedé alebo čierne kolónie. Červenkastý exopigment v médiu.
Agar z kvasinkového extraktu - sladového extraktu (ISP Med.2): Dobre vyvinuté, vyvýšené a zvrásnené hnedé kolónie, pokryté sčasti s čiernymi sporulačnými oblasťami alebo s „pseudo-aerálnym mycéliom’ (toto sa objavuje ako ohraničený belavý alebo sivastý blok). Hnedastý alebo hnedasto-červený rozpustný pigment.
Agar z anorganických solí - škrobu (ISP Med. 4): Rast média červenkastohnedých vyvýšených a zvrásnených kolónií. Svetlo červenkastý rozpustný pigment.
Glycerol-asparagínový agar (ISP Med. 5): Rast len v stopách, nie celkom biele alebo svetlooranžové sfarbenie, ploché kolónie, svetlo ružový rozpustný pigment.
Využiteľnosť zdroja uhlíka: Dobrý rast na a pozitívna využiteľnosť L-arabinózy, D-galaktózy, D-fruktózy, D-glukózy, D-xylózy, laktózy, melibiózy, sacharózy, D-manitolu, dulcitolu, glycerolu and inozitolu. Rast s L-ramnózou, D-rafinózou a inulínom bol mierne lepší ako na negatívnom kontrolnom médiu.
Využiteľnosť zdroja dusíka: Rast s kvasinkovým extraktom a NZ-amínom, žiadna alebo slabá využiteľnosť NaNOý.
Ďalšie fyziologicko-biochemické vlastnosti: Celulóza a škrob sa hydrolyzovali, mlieko sa silne rozkladalo. Test redukcie dusíka bol negatívny. Nepozoroval sa žiaden rast na zemiakových rezkoch bez uhličitanu vápenatého (pH 5,8 až 6,0). Nepozorovala sa žiadna produkcia melanoidového pigmentu.
Tento kmeň č. 1DR-P3 druhu Micromonospora sa izoloval zo vzorky kalu z jazera Balaton (Maďarsko).
Systematické zaradenie: Boli by potrebné ďalšie porovnávacie štúdie na objasnenie presného taxonomického zaradenia tohto kmeňa medzi druhy rodu Micromonospora. Na základe určitých vlastností sa javí nie ako nemožné, že kmeň IDR-P3 môže predstavovať nové druhy s rámci rodu Micromonospora.
Diferenciálno-diagnostický opis a identifikácia kmeňov Micromonospora IDR-P4, -P5, -Pe a -P7
Kmeň IDR-P4
Na uvedených diagnostických médiách, vo všeobecnosti, dobrý rast, oranžové až oranžovočervené, červené, niekedy žlté alebo ružovo sfarbené kolónie. Rozpustné pigmenty a aerálne mycélium sa neprodukovali. Počet samostatných spór je relatívne nízky. Vyskytujú sa na sporofóroch terminálne. Mycélium substrátu pozostáva z dobre rozvetvených hýf. Aerálne mycélium chýba. Žiaden rast na D-melibióze, rafmóze, manitole, glycerole, laktóze, L-ramnóze, ale dobrý rast na D-arabinóze, glukóze, D-xylóze a slabý rast na D-galaktóze a D-fŕuktóze. Na základe týchto konvenčných diagnostických vlastnosti sme identifikovali tento kmeň ako člena druhov Micromonospora purpurea (Luedemann a Brodsky, 1964).
Kmeň IDR P5
Tento kmeň produkuje prevažne samostatné sporofóry a guľovité tmavohnedé až čierne spóry (s priemerom 0,8 až
1,5 pm), ktoré až do dozretia pevne prilipnú k sporofórom. Podľa našich pozorovaní s použitím elektrónového mikroskopu, na povrchu týchto spór sa dajú pozorovať bradavičnaté štruktúry alebo výrastky („tupé ostne (blunt spines)” podľa Vol. 4 Bergey's Manual of Syst. Bact. 1989, str. 2448), čo je veľmi charakteristické pre spóry Micromonospora echinospora. Inak sú kultivačno-morfologické a fyziologické diagnostické vlastnosti tohto kmeňa tiež veľmi podobné vlastnostiam M. echinospora. Farba dobre vyvinutých kolónií na štandardnom diagnostickom médiu je oranžovohnedá alebo tmavopurpurová. Sporulačná vrstva je čierna alebo purpurovočiema, voskovitá. Aerálne mycélium chýba. Melanínový pigment sa netvorí. Mlieko sa rozkladá. Dobrý rast na D-xylóze, D-arabinóze, D-glukóze a sacharóze, ale žiadny rast s L-ramnózou, rafmózou, D-galaktózou, D-fŕuktózou, D-melibiózou a glycerolom. Domnievame sa, že tento kmeň je typickým členom Micromonospora echinospora.
Kmeň IDR-P6
Na väčšine diagnostických médií stredný až slabý rast. Oranžové alebo oranžovočervené kolónie pozostávali z dlhých rozvetvených vlákien (priemer približne 0,6 pm) a limitovaný počet samostatných, guľovitých, tmavo sfarbených spór (s priemerom 0,6 až 1,0 pm). Neprodukuje aerálne mycélum, v určitých médiách sa vytvorili slabo červenkasté alebo ružovo sfarbené rozpustné pigmenty. Na tyrozínovom agare sa neprodukovali melanoidové pigmenty. Na základnom médiu sa týmto kmeňom využívali nasledujúce zdroje uhlíka: D-xylóza a D-fruktóza; len slabo: D-melibióza, manitol a galaktóza, ale žiaden alebo len sporadický rast sa pozoroval s glycerolom, L-ramnózou, laktózou a rafmózou (pozri tiež Kawamoto, I. a kol.: Agric. Biol. Chem., 47, 203 - 215, 1983). Kmeň č. IDR-P6 vykazoval značnú podobnosť s druhmi Micromonospora megalomicea, (Weinstein, 1972) a pokladáme ho za člena toho druhu.
Kmeň IDR-P7
Dobrý alebo stredný rast na Bennettovom agare, Czapekovom sacharózovom agare, glukózo-asparaginovom agare, živnom agare, na agare z ovsenej múky, agare zcmiaky-dextróza a podobne. Farba vegetatívnych myceliálnych pigmentov sa pohybovala v rozsahu od červenkastohnedej po purpurovohnedú. Na určitých médiách sa vytvorili vinovočervené difúzne pigmenty. Na povrchu kolónií sa často tvorili čierne škvrny. Vegetatívne hýfy (so stredným priemerom.5 pm) sa intenzívne rozvetvovali. Spóry (s priemerom 1,4 až 1,7 pm) sa tvorili samostatne, prirastené (bez stopky) alebo na krátkych sporofóroch a vyskytovali sa pozdĺž dĺžky hýfy. Rast a sporulácia predstavovali otvorený plnostenný typ podľa Luedemanna. Tento kmeň využíval nasledujúce zlúčeniny ako jediný zdroj uhlíka v médiách: D-glukózu, laktózu, D-manitol, L-ramnózu, sukrózu a D-xylózu,: Dulcitol, glycerol, D-melibióza a D-rafmóza sa nevyužívali. Identifikovali sme kmeň č. IDR-P7 ako typický člen Micromonospora rosaria (Horan a Brodsky, 1986).
Uvedené kmene Micromonospora sa uložili v Národnej zbierke poľnohospodárskych a priemyselných mikroorganizmov (the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM), Budapešť, Maďarsko, pod uvedených číselnými označeniami:
NCAIM (P) B 001268
NCAIM (P) B 001271
NCAIM (P) B 001272
Micromonospora sp. IDR-P3
Micromonospora purpurea
IDR-P4
Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR P5 Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P6 . NCAIM (P) B 001273
Micromonospora rosaria IDR-P7 NCAIM (P) B 001274
Na základe uvedeného, predložený vynález sa týka nového mikrobiálneho spôsobu prípravy pravastatinu vzorca (I)
(I) zo zlúčeniny všeobecného vzorca (II)
(II), v ktorom R znamená ión alkalického kovu alebo amóniový ión, pomocou submerznej kultivácie kmeňa, ktorý je schopný 6[!-hydroxylovať zlúčeninu vzorca (II) pri aeróbnej fermentácii a separovaním a prečistením zlúčeniny vzorca (I) vytvorenej v priebehu biologickej konverzie, ktorý zahrnuje kroky
a) kultivácie kmeňa druhu patriaceho ku rodu Micromonospora, ktorý je schopný δβ-hydroxylovať zlúčeninu vzorca (II) - kde R má definovaný význam - na živnom médiu obsahujúcom asimilovateľné zdroje uhlíka a dusíka a minerálne soli pri teplote 25 až 32 °C, následne
b) dávkovanie substrátu, ktorý sa má transformovať, do rozvinutej kultúry, potom
c) hydroxylovanie substrátu až do ukončenia biologickej konverzie, potom
d) separovanie zlúčeniny vzorca (I) z kultivačného prostredia a, v prípade potreby, jej prečistenie.
Do rozsahu predloženého vynálezu patria „divé kmene“ a všetky mutanty druhov patriacich do rodu Micromonospora, ktoré sú schopné hydroxylovať sodnú soľ kyslej formy compactinu na pravastatin.
Podľa výhodného uskutočnenia predloženého vynálezu pravastatin sa produkuje s kmeňom Micromonospora zvoleným zo skupiny zahrnujúcej druh Micromonospora IDR-P3 [NCAIM (P) B 001268], Micromonospora purpurea IDR-P4 [NCAIM (P) B 001271], Micromonospora echinospora IDR-P5 [NCAIM (P) B 001272], Micromonospora megalomicea IDR P6 [NCAIM (P) B 001273] a Micromonospora rosaria 1DR-P7 [NCAIM (P) B 001274].
Podľa najvýhodnejšieho uskutočnenia predloženého vynálezu sa pravastatin produkuje kmeňom Micromonospora sp. IDR-P3 [NCAIM (P) B 001268].
Postup podľa predloženého vynálezu sa môže uskutočňovať spôsobom fermentácie in situ, to znamená, že hydroxylácia sa uskutočňuje s účasťou aktívne rastúcej kultúry Micromonospora.
Hydroxylácia sa môže uskutočniť pomocou pretrepávania kultúry vtrepačkovej banke alebo pomocou prevzdušňovania a pretrepávania vo fermentoroch potom, ako sa zlúčenina vzorca (II) pridá k rastúcim kultúram. V takýchto prípadoch sa môže použiť protipeniace činidlo. Primeraná hustota kultúry tohto kmeňa sa môže dosiahnuť použitím vhodného média obsahujúceho využiteľné zdroje uhlíka a dusíka; anorganické soli, ako aj stopové prvky.
Napríklad glukóza, glycerol, dextrín, škrob, ramnóza, xylóza, sacharóza a rozpustný škrob sa osvedčili ako asimilovateľné zdroje uhlíka, zatiaľ čo sójová múčka, kukuričný výluh, peptón, kvasinkový extrakt, mäsový extrakt, citrát amónny a síran amónny sa osvedčili ako dobré zdroje dusíka. Anorganické soli, ako je uhličitan vápenatý, fosforečnan sodný, fosforečnan draselný a podobne, sa môžu pridať ku kultivačnému médiu. Výhodnými médiami na rast tohto zvoleného kmeňa sú médiá opísané v príkladoch.
Biologická konverzia compactinu na pravastatin sa môže uskutočniť s použitím rozličných metód fermentácie, ako je napríklad kultivácia v dávkach, kultivácia v podávaných dávkach. Výhodne sa používa pretrepávaná kvapalná submerzná kultúra. Výhodná teplota predstavuje približne 25 °C až 37 °C, predovšetkým výhodne približne 25 °C až 32 °C.
Výhodná hodnota pH je približne 6,0 až 9,0, predovšetkým výhodne približne 7,0 až 8,5. Výhodné podmienky pretrepávania predstavujú približne 200 rpm (otáčok za minútu) až 400 rpm, predovšetkým výhodne približne 250 rpm.
Predložený vynález poskytuje spôsob konvertovania kyslej sodnej soli compactinu na pravastatin. Kyslá sodná soľ compactinu sa môže podľa tohto vynálezu použiť v akejkoľvek koncentrácii, ktorá poskytne produkciu pravastatinu. Výhodne predstavuje koncentrácia compactinu medzi 0,1 a 10 g/liter, predovšetkým výhodne medzi približne 0,3 a 3,0 g/liter.
Predložený vynález je treba chápať tak, že zahrnuje akékoľvek percento konverzie compactinu na pravastatin s použitím kmeňov Micromonospora spp., najmenej 30 % a predovšetkým výhodne najmenej približne 90 %.
V priebehu fermentácie sa kompozícia kultivačného prostredia kontroluje pomocou metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Podľa metódy HPLC sa vzorka prostredia dvojnásobne zriedi s metanolom, centriSK 285726 B6 fúguje sa a supematant sa použije na ďalšiu analýzu. Parametre systému HPLC, ktoré sa použijú na analýzu sú: analytické HPLC zariadenie Waters; náplň kolóny: Waters Novapack C18 5 pm; meranie pri vlnovej dĺžke 237 nm; injektovaný objem 10 pl; prietoková rýchlosť 0,6 až 0,9 ml/min lineárny gradient; použije sa gradientové eluovanie, elučné činidlá: rozpúšťadlo A = acetonitril - 0,1 M NaH2PO4 vo vode (25 : 75), rozpúšťadlo B = acetonitril - voda (pH 2 s H3PO4) (v pomere 70 : 30).
Parametre gradientového eluovania:
| Cas (min.) | Prietoková rýchlosť (ml/min.) | Elučné činidlo A (%) | Elučné činidlo B (%) |
| 0 | 0,6 | 100 | 0 |
| 2 | 0,7 | 100 | 0 |
| 12 | 0,9 | 0 | 100 |
| 21 | 0,9 | 0 | 100 |
| 22 | 0,9 | 100 | 0 |
| 27 | 0,7 | 100 | 0 |
Retenčné časy: pravastatin (Na-soľ) 10,6 min; compactin (kyslá Na-soľ) 19,5 min; pravastatin (laktónová forma) 17,3 min, compactin (laktónová forma) 23,5 min.
Na izoláciu pravastatinu sa môže použiť akýkoľvek známy postup, napríklad extrakcia- reextrakcia, aniónová ionexová chromatografia, vyzrážanie.
Na získanie produktu z prostredia je výhodné vziať do úvahy skutočnosť, že počas biologickej konverzie vzniká pravastatin v kyslej forme, teda môže sa izolovať zfiltrátu prostredia pomocou adsorpcie na kolóne aniónovej ionexovej živice. Je výhodné, ak sa na izoláciu produktu použije silne zásaditá aniónová ionexová živica, ktorou je polystyrénový-divinylbenzénový polymér nesúci kvartéme amóniové aktívne skupiny, napríklad živice Dowex Al 400 (OH ), Dowex 1 x 2 (OH ), Dowex 2x4 (OH), Amberlitc IRA 900 (OH ). Produkt adsorbovaný na ionexovej živici sa môže eluovať z kolóny s použitím vodnej kyseliny octovej alebo chloridu sodného obsahujúceho zmes acetón - voda, výhodne s použitím 1 % chloridu sodného obsahujúceho zmes acetón - voda (v pomere 1:1). Frakcie obsahujúce pravastatin sa spoja a acetón, ktorý je v eluáte sa oddestiluje vo vákuu. Hodnota pH koncentrátu sa adjustuje s 15 % kyselinou sírovou na rozsah od 3, 5 do 4,0 a okyslený vodný roztok sa extrahuje s použitím etylacetátu. Z etylacetátového extraktu sa pravastatin môže extrahovať s použitím 1/10 a 1/20 pomeru objemu 5 % hydrogenuhličitanu sodného alebo slabo alkalickej vody (pH 7,5 až 8,0). Zistilo sa, že pravastatin sa môže získať v čistej forme z získaného alkalického vodného extraktu pomocou stĺpcovej chromatografie na neiónovej adsorpčnej živici. Výhodným spôsobom je, že najskôr sa etylacetát rozpustený vo vodnej fáze odstráni pomocou vákuovej destilácie z alkalického vodného extraktu a potom sa vodný extrakt nanesie na kolónu Diaion HP-20. Pravastatin adsorbovaný na kolóne sa prečistí eluovaním s vodným acetónom, v ktorom sa obsah acetónu postupne zvyšuje, potom sa chromatografické frakcie obsahujúce pravastatin ako jedinú zložku spoja a zahustia sa vo vákuu. Koncentrát sa prečistí s aktívnym uhlím a lyofilizuje sa, potom sa kryštalizuje zo zmesi etanol - etylacetát, pričom sa získa pravastatin v kvalite prijateľnej na farmaceutické použitie.
Po ukončení biologickej konverzie sa pravastatin môže extrahovať buď z fermentačného prostredia alebo z filtrátu získaného po separácii hmoty mycélia. Posledne uvedené sa môže odstrániť buď filtráciou alebo centrifugovaním, ale výhodné je, predovšetkým v priemyselnom meradle, usku točniť extrakciu celého prostredia. Pred extrakciou sa hodnota pH buď fermentačného prostredia alebo filtrátu prostredia adjustuje na 3,5 až 3,7 s minerálnou kyselinou, výhodne so zriedenou kyselinou sírovou. Extrakcia sa uskutoční s esterom kyseliny octovej s 2 až 4 atómami uhlíka obsahujúcim alifatický alkohol, výhodne s etylacetátom alebo s izobutylacetátom. Etylacetátový extrakt sa premyje vodou a vysuší sa s bezvodým síranom sodným. Potom sa pripraví z pravastatinu laktónový derivát. Uzavretie laktónového kruhu sa uskutoční vo vysušenom roztoku etylacetátu pri laboratórnej teplote, pri kontinuálnom miešaní vyvolaním tvorby laktónu s katalytickým množstvom kyseliny trifluóroctovej. Uzavretie laktónového kruhu sa overí pomocou analýzy chromatografiou na tenkej vrstve (TLC). Po ukončení tvorby laktónu sa etylacetátový roztok premyje najskôr s 5 % vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a potom s vodou a odparí sa vo vákuu. Zmes sa prečisti chromatografiou na silikagélovej kolóne s použitím zmesi etylacetát - «-hexán ako elučného činidla, s postupným zvyšovaním obsahu etylacetátu. Pravastatin sa pripraví z laktónu pravastatinu hydrolýzou pri laboratórnej teplote v acetóne s ekvivalentným množstvom hydroxidu sodného. Po ukončení tvorby sodnej soli pravastatinu sa pravastatin vyzráža s acetónom. Zrazenina sa potom odfiltruje a premyje s acetónom a «-hexánom a vysuší vo vákuu, potom sa kryštalizuje zo zmesi etanol - etylacetát.
Zistilo sa, že chromatografia na géli Sephadex LH-20 sa dá výhodne použiť na prečistenie pravastatinu. Pomocou tejto metódy sa môže pripraviť pravastatin s vynikajúcou čistotou 99,5 % (merané pomocou HPLC).
V priebehu našich experimentov sa zistili nasledujúce zistenia: z extraktu organického rozpúšťadla, výhodne z extraktu etylacetátu alebo z extraktu izobutylacetátu prostredia alebo filtrátu prostredia kmeňa Micromonospora sp. IDR-P3, ktorý je schopný 6p-hydroxylovať zlúčeninu všeobecného vzorca (II), sa pravastatin môže vyzrážať vo forme kryštalickej soli so sekundárnymi amínmi. Okrem toho sa zistilo, že na tvorbu soli sú vhodné niektoré sekundárne amíny obsahujúce alkylové, cykloalkylové, aralkylové alebo arylové substituenty. Spomedzi nich boli zvolené vhodné netoxické sekundárne aminy, napríklad dioktylamín, dicyklohexylamín, dibenzylamín. Izolácia medziproduktov solí organických sekundárnych amínov, napríklad soli dibenzylamínu, sa uskutočnila pridaním dibenzylamínu v množstve 1,5 ekvivalentu vztiahnuté na obsah pravastatinu extraktu, potom sa extrakt zahustil destiláciou vo vákuu na 5 % svojho pôvodného objemu, následne sa do koncentrátu pridalo ďalšie množstvo dibenzylamínu v pomere 0,2 ekvivatentu. Kryštalická soľ dibenzylamínu sa z koncentrátu vyzrážala. Kryštalický surový produkt sa prefiltroval a vysušil vo vákuu a prečistil sa s aktívnym uhlím v roztoku metanolu alebo acetónu. Potom sa rekryštalizáciou prečisteného produktu z acetónu môže získať chromatograficky čistý medziprodukt dibenzylamínovej soli pravastatinu.
Organické sekundárne amínové soli pravastatinu sa môžu transformovať na pravastatin s použitím hydroxidu sodného alebo alkoxidu sodného, výhodne etoxidu sodného.
Izolácia pravastatinu prostredníctvom medziproduktu soli sekundárneho amínu je jednoduchším postupom než akýkoľvek z doteraz známych postupov izolácie. V priebehu spôsobu sa netvoria artefakty a separácia pravastatinu z vedľajších produktov biologickej konverzie a z rozličných metabolických produktov biologicky syntetizovaných pomocou hydroxylácie mikroorganizmu sa môže výhodne vyriešiť.
Spôsob podľa predloženého vynálezu je znázornený pomocou nasledujúcich príkladov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Spóry sa získali z povrchu 7 až 10 dňovej šikmej kultúry kmeňa Micromonospora sp. IDR-P3 [NCAIM (P) B 001268 rozpustného škrobového agaru (SM) a suspendovali sa v 5 ml sterilnej destilovanej vody. Táto suspenzia sa potom použila na naočkovanie 100 ml sterilného TI inokulačného média v 500 ml Erlenmeyerovej banke.
Zloženie SM média
Rozpustný škrob 10,0g
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0.25 g
KCI 0,2g
MgSO4 x 7 H2O 0,2g
Agar 15,0g v 1000 ml destilovanej vody
Hodnota pH média sa pred sterilizáciou adjustovala na 7,0 a zmes sa sterilizovala pri teplote 121 °C počas 25 minút.
Zloženie TI média
Rozpustný škrob 20,0 g
Kvasinkový extrakt 10,0 g v 1000 ml vodovodnej vody
Hodnota pH sa pred sterilizáciou adjustovala na 7,0 a spracovávala sa za tepla pri 121 °C počas 25 minút.
Vyvíjajúca sa kultúra sa pretrepávala na rotačnej trepačke (250 rpm; rozkmit: 2,5 cm) počas 3 dní pri teplote 32 °C, potom sa jej 5 ml alikvotný podiel použil na naočkovanie desiatich Erlenmeyerových baniek s objemom 500 ml, z ktorých každá obsahovala 100 ml TT média sterilizovaného pri teplote 121 °C počas 25 minút.
Zloženie TT média
Zemiakový škrob 30,0 g
Sójová múčka 30,0 g
CaCO35,0 g
CoCl2 x 6 H2O 2,0mg
Palmový olej2,0 g v 1000 ml vodovodnej vody
Hodnota pH sa pred tepelnou sterilizáciou adjustovala na 7,0.
Inkubácia sa uskutočnila pri teplote 32 °C počas 72 hodín, potom sa do každej banky pridalo 50 mg kyslej sodnej soli compactinu v destilovanej vode a v kultivácii sa pokračovalo počas 96 hodín. Miera konverzie kyslej sodnej soli compactinu na pravastatin, ktorá sa merala pomocou HPLC, predstavovala 82 %.
Po ukončení fermentácie sa kultúry spojili a zo získaného spoločného fermentačného prostredia, ktoré obsahovalo 410 mg pravastatinu, sa jeho izolácia uskutočnila nasledovne: Fermentačné prostredie sa centrifúgovalo pri 2500 rpm počas 20 minút. Supematant prostredia a myceliálna masa sa oddelili, potom sa posledne uvedené resuspendovalo v 250 ml vody a získaná suspenzia sa miešala počas jednej hodiny a potom sa prefiltrovala. Hodnota pH spojeného centnfúgovaného prostredia a filtrátu sa adjustovali s použitím 15 % kyseliny sírovej na 4,0, potom sa kyslý filtrát extrahoval s 3 x 300 ml etylacetátu. Spojené etylacetátové extrakty sa premyli s 300 ml vody, vysušili sa s bezvodým síranom sodným a zahustili vo vákuu na objem
100 ml. Potom sa laktón pravastatinu pripravil z pravastatinu pridaním kyseliny trifluóroctovej v katalytickom množstve pri laboratórnej teplote pri kontinuálnom miešaní. Tvorba laktónu pravastatinu sa monitorovala pomocou TLC metódy: adsorbent: Kieselgel 60 F254 DC (Merck) hliníková fólia; vyvolávači roztok: zmes acetón - benzén - kyselina octová (v pomere 50 : 50 : 1,5); detekcia: s reagentom fosfomolybdénovej kyseliny. Hodnota Rf laktónu pravastatinu predstavovala 0,7. Po ukončení tvorby laktónu sa etylacetát premyl s 2 x 20 ml 5 % vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, potom sa premyl s 20 ml vody, vysušil sa s bezvodým síranom sodným a odparil sa vo vákuu. Získalo sa 0,5 g odpareného zvyšku, ktorý sa chromatografoval na kolóne obsahujúcej 10 g adsorbenta Kieselgel 60 (priemer kolóny : 1,2 cm, výška lôžka adsorbenta: 17 cm). Na eluovanie sa použila zmes etylacetát - n-hexán, pričom sa obsah etylacetátu postupne zvyšoval. Laktón pravastatinu sa eluoval z kolóny so zmesou 60 % etylacetátu - 40 % n-hexánu. Frakcie obsahujúce laktón pravastatinu sa spojili a odparili sa vo vákuu. Získaný zvyšok, ktorý obsahoval 230 mg laktónu pravastatinu, sa rozpustil v 5 ml acetónu a potom sa za miešania pridalo 110 molámych percent hydroxidu sodného v 1 M etanolového roztoku. V miešaní roztoku sa pokračovalo počas pol hodiny pri laboratórnej teplote. Potom sa roztok zahustil na objem 2 ml a ku koncentrátu sa pridali 4 ml acetónu. Zmes sa udržiavala pri teplote + 5 °C cez noc. Zrazenina sa odfiltrovala, premyla sa s 2 ml acetónu a potom s 2 ml n-hexánu a vysušila sa vo vákuu pri laboratórnej teplote. Výsledný surový pravastatin sa rozpustil v etanole, prečistil sa s aktívnym uhlím, potom sa kryštalizoval zo zmesi etanol - etylacetát. Týmto spôsobom sa získalo 170 mg pravastatinu.
Teplota topenia 170 až 173 °C (rozklad) [a]D 2 = + 156 ° (c = 0,5, vo vode).
Ultrafialové absorpčné spektrum (20 pg/ml, v metanole): Zmax = 231 , 237, 245 nm (log ε = 4,263; 4,311; 4,136).
Infračervené absorpčné spektrum (KBr): vOH 3415, vCH 2965, vC=O 1730, vCOO' 1575 cm’1.
’H-NMR spektrum (D2O, δ, ppm): 0,86, d, 3H (2-CH3); 5,92, dd, J = 10,0 a 5,4 Hz, 1H (3-H): 5,99, d, J = 10,0 Hz, 1H (4-H); 5,52, br, 1H (5-H); 4.24, m, 1H (6-H); 5,34, br, 1H (8-H); 4,06, m, 1H (β-Η), 3,65, m, 1H (δ-Η); 1,05, d, 3H (2’-CH3); 0,82, t, 3H (4'-H3).
13C-NMR spektrum (D2O, δ, ppm): 15,3, q (2-CH3,); 139,5, d (C-3); 129,5, d (C-4); 138,1, s (C-4a); 127,7, d (C-5); 66,6, d (C-6); 70,1, d (C-8); 182,6, s (COO ); 72,6, d (C-β); 73,0, d (C-δ); 182,0, s (C-ľ); 18,8, q (2'-CH3); 13,7, q (C4')·
Pozitívne FAB hmotnostné spektrum (charakteristické ióny): [M+Na]+ 469; [M+H]+ 447. Negatívne FAB hmotnostné spektrum [charakteristické ióny): [M-H]’ 445, [MNa]’423, m/z 101 [2-metyl-butánová kyselina -H]'.
Príklad 2
Desať Erlenmeyerových baniek s objemom 500 ml, z ktorých každá obsahovala 100 ml biokonverzného médium MTb sa naočkovali sinokulačnou kultúrou pripravenou, ako je opísané v príklade 1, potom sa inkubovali pri teplote 28 °C počas 96 hodín a do každej banky sa pridalo 50 mg kyslej sodnej soli compactinu v destilovanej vode, hydroxylácia sa potom uskutočnila počas 72 hodín, keď sa ku kultúram pridalo ďalších 50 - 50 mg substrátu v destilovanej vode a vo fermentácii sa pokračovalo počas 72 hodín.
Zloženie biokonverzného médium MT]
Zemi akový škrob 10,Og
Dextróza 20,0 g
Sójová múčka 10,0g
Kvasinkový extrakt 10,0 g
CaCO3 5,0g
Slnečnicový olej 2,0g v 1000 ml vodovodnej vody
Hodnota pH biokonverzného média sa pred sterilizáciou adjustovala na 7,0. Zmes sa sterilizovala pri teplote 121 °C počas 25 minút.
Po ukončení obdobia biologickej konverzie sa kultúry spojili a pravastatin sa izoloval z celkového prostredia v súlade s nasledujúcim postupom:
Spojené prostredie, ktoré obsahovalo 750 mg pravastatinu, podľa skúšky pomocou HPLC, sa centrifúgovalo pri 2500 rpm počas 20 minút. Separovaná hmota mycélia sa miešala s 250 ml vody počas jednej hodiny, potom sa prefiltrovala. Centrifúgované prostredie a filtrát sa spojili a pH výsledného roztoku sa adjustovalo na hodnotu 3,5 - 4,0, s 15 % kyselinou sírovou, potom sa roztok extrahoval s 3 x 300 ml etylacetátu. Potom sa k etylacetátovému extraktu pridalo 150 molámych percent dibenzylaminu - vztiahnuté na obsah pravastatinu. Etylacetátový extrakt sa odparil na približne 30 ml objemu a suspenzia sa udržiavala cez noc pri teplote 0 až 5 °C. Vyzrážaná kyslá dibenzylamínová soľ pravastatinu sa odfiltrovala a premyla sa na filtri s chladným etylacetátom a n-hexánom, napokon sa vysušila vo vákuu. 1,1 g surovej kyslej dibenzylamínovej soli pravastatinu sa rozpustilo v 33 ml acetónu pri teplote 62 až 66 °C a roztok sa prečistil s 0,1 g aktívneho uhlia počas pol hodiny. Následne sa aktívne uhlie z roztoku odstránilo filtráciou. Kryštály vyzrážané z prečisteného roztoku sa znova rozpustili pri uvedenej teplote, potom sa roztok udržiaval cez noc pri teplote + 5 °C. Zrazenina sa odfiltrovala, premyla sa s chladným acetónom a n-hexánom a vysušila sa vo vákuu. Získaná kyslá dibenzylamínová soľ pravastatinu (0,7 g) sa suspendovala v 10 ml etanolu, potom sa pridalo 110 molámych percent hydroxidu sodného vo forme 1 M vodného roztoku. V miešaní alkalického roztoku sa pokračovalo počas pol hodiny pri laboratórnej teplote. Po ukončení tvorby sodnej soli sa pridalo 30 ml vody a pH roztoku sa neutralizovalo a potom sa etanol oddestiloval vo vákuu. Vodný koncentrát sa chromatografoval na kolóne naplnenej s 50 ml živice Diaion HP 20 (priemer kolóny: 1,5 cm, výška živicového lôžka 28 cm). Kolóna sa eluovala so zmesou acetón - deionizovaná voda, pričom koncentrácia acetónu sa zvyšovala v 5 % krokoch. Pravastatin sa eluoval z kolóny 15 % acetónom obsahujúcim zmes acetón - deionizovaná voda. Frakcie sa analyzovali s použitím metódy TLC, ktorá je uvedená v príklade 1. Hodnota Rf pravastatinu predstavovala 0,5. Frakcie obsahujúce pravastatin sa spojili a obsah acetónu sa odparil vo vákuu. Lyofílizáciou vodného zvyšku sa získalo 390 mg chromatograficky čistého pravastatinu.
Príklad 3
4,5 litre TT/1 média sa v laboratórnom fermentore sterilizovalo pri teplote 121 °C počas 45 minút a potom sa naočkovalo s 500 ml inokulačnej trepanej kultúry pripravenej, ako je opísané v príklade 1, následne sa zmes inkubovala pri teplote 32 °C, prevzdušnila sa s 250 1 sterilného vzduchu/hodinu a miešala sa s použitím miešadla s plochými lopatkami pri 300 rpm. V inkubácii sa pokračovalo počas 72 hodín a ku kultúre sa pridalo 2,5 g kyslej sodnej soli compactinu. Po 48-hodinovom období biologickej konverzie sa substrát compactinu celkom spotreboval z fermentačného prostredia, potom sa do kultúry pridalo ďalších
2,5 g kyslej sodnej soli compactinu. Druhá dávka compactinu sa spotrebovala v rozsahu 24 hodín. Miera konverzie kyslej sodnej soli compactinu na pravastatin predstavovala pri spôsobe biologickej konverzie približne 90 %.
Zloženie biokonverzného média TT/2
| Glukóza | 75,0 g |
| Rozpustný škrob | 50,0 g |
| Sójová múčka | 50,0 g |
| Kvasinkový extrakt | 50,0 g |
| Peptón | 5,0 g |
| NaNO3 | 20,0 g |
| CaCO3 | 25,0 g |
v 4500 ml vodovodnej vody
Príklad 4
4,5 litre TT/1 fermentačného média sa v laboratórnom fermentore sterilizovalo pri teplote 121 °C počas 45 minút a potom sa naočkovalo s 500 ml inokulačnej trepanej kultúry pripravenej, ako je opísané v príklade 1, následne sa zmes inkubovala pri teplote 28 °C, prevzdušnila sa s 200 1 sterilného vzduchu/hodinu a miešala sa s použitím miešadla s plochými lopatkami pri 400 rpm.
Zloženie biokonverzného média TT/1
| Glukóza | 125,0 g |
| Zemiakový škrob | 25,0 g |
| Sójová múčka | 50,0 g |
| Kvasinkový extrakt (Gistex) | 50,0 g |
| Peptón | 50,0 g |
| CoCl2 x 6 H2O | 10,0 mg |
| Slnečnicový olej | 10,0 g |
| v 4500 ml vodovodnej vody |
Hodnota pH biokonverzného média sa pred sterilizáciou adjustovala na 7,0.
V kultivácii sa pokračovalo pri teplote 28 °C počas 96 hodín. Potom sa pridalo 2,5 g kyslej sodnej soli compactinu v sterilnom prefiltrovanom vodnom roztoku kultúry. Na piaty deň fermentácie sa kyslá sodná soľ compactinu úplne spotrebovala z fermentačného prostredia. Nadávkovanie substrátu sa potom zopakovalo denne počas ďalších 3 dní v dávkach 2,5 g/deň. Substrát kyslej sodnej soli compactinu sa postupne spotreboval počas štyroch dní a kompletne sa konvertoval na pravastatin. Podľa výsledkov meraní HPLC na konci fermentačného obdobia sa z 10 g substrátu compactinu vyprodukovalo 9 g pravastatinu.
Po ukončení biologickej konverzie sa pravastatin pripravený v koncentrácii 1800 pg/ml izoloval nasledovne: 5 litrov kultivačného prostredia sa centrifúgovalo pri 2500 rpm počas 20 minút. Potom sa k separovanej myceliálnej mase pridali 2 litre vody a suspenzia sa miešala počas jednej hodiny a prefiltrovala sa. Tieto dva filtráty sa spojili a nechali sa prejsť prietokovou rýchlosťou 500 ml/hodinu ccz kolónu obsahujúcu 300 g (540 ml) živice Dowex Al 400 (OH) (priemer kolóny: 4 cm, výška živicového lôžka: 43 cm), živicové lôžko sa potom premylo s 1 litrom deionizovanej vody. Následne sa kolóna eluovala s 1 litrom zmesi acetón - voda (v pomere 1 : 1), obsahujúcej 10 g chloridu sodného, pričom sa zachytilo 50 ml frakcií. Frakcie sa analyzovali s použitím metódy TLC uvedenej v príklade 1. Frakcie obsahujúce produkt sa spojili a acetón sa oddestiloval vo vákuu. Hodnota pH koncentrátu sa adjustovala na
3,5 až 4,0 s použitím 15 % kyseliny sírovej, potom sa koncentrát extrahoval s 3 x 250 ml etylacetátu. Ku spojenému etylacetátovému extraktu sa pridalo 40 ml deionizovanej vody, pH sa adjustovala na hodnotu 7,5 až 8,0 s použitím 1 M hydroxidu sodného. Po 15 minútach miešania sa vodná a etylacetátová fáza oddelili, etylacetátový roztok sa extrahoval s 2 x 40 ml deionizovanej vody, ako je uvedené. Spojený alkalický vodný roztok sa potom zahustil na objem 50 ml a chromatografoval sa na kolóne naplnenej so 600 ml
Diaion HP2O (Mitsubishi Co., Japan), neiónovej adsorbčnej živice (priemer kolóny: 3,8 cm, výška živicového lôžka: 53 cm). Kolóna sa premyla so 600 ml deionizovanej vody, potom sa eluovala so zmesou acetón - deionizovaná voda, kde koncentrácia acetónu sa zvyšovala v 5 % krokoch, pričom sa zachytilo 50 ml frakcií. Eluát sa analyzoval s použitím metódy TLC uvedenej v príklade 1. Pravastatin sa eluoval z kolóny s použitím zmesi acetón - deionizovaná voda, obsahujúcej 15 % acetónu. Frakcie obsahujúce pravastatin ako jedinú zložku sa spojili a roztok sa zahustil vo vákuu na objem 150 ml. Následne sa ku zahustenému vodnému roztoku pridalo 0,6 g aktívneho uhlia a pravastatin sa prečistil pri laboratórnej teplote počas jednej hodiny. Aktívne uhlie sa následne odfiltrovalo a filtrát sa lyofilízoval. Výsledných 6,5 g lyofilizovaného pravastatinu sa kryštalizovalo dvakrát zo zmes etanol a etylacetát. Zrazenina sa odfiltrovala a premyla sa s 20 ml etylacetátu a 20 ml n-hexánu a vysušila sa vo vákuu pri laboratórnej teplote. Takto sa získalo 4,6 g chromatograficky čistého pravastatinu.
Príklad 5
Suspenzia spór sa pripravila s 5 ml sterilnej destilovanej vody z povrchu 10-dňovej šikmej kultúry rozpustného škrobového agaru, ako je opísané v príklade 1, kmeňa Micromonospora echinospora ssp. echinospora 1DR-P5 [NCAIM (P) B 001272] - ktorá bola schopná όβ-hydroxylácie kyslej sodnej soli compactinu - a získaná suspenzia spór sa použila na naočkovanie 100 ml inokulačného média TI sterilizovaného v 500 ml Erlenmeyerovej banke. Zloženie média TI bolo, ako je opísané v príklade 1. Inokulované médium sa pretrepávalo na rotačnej trepačke (250 rpm, rozkmit 2,5 cm; počas 3 dní pri teplote 28 °C, potom sa alikvotné časti 5 ml vyvinutej kultúry prenieslo do 100 - 100 ml biokonverzného média TT/1 sterilizovaného v 500 ml Erlenmeyerových bankách počas 25 minút pri teplote 121 °C. Zloženie média TT/1 je opísané v príklade 4. Banky sa pretrepávali na rotačnej trepačke (250 rpm; rozkmit 2,5 cm) počas 3 dni pri teplote 25 °C, potom sa ku kultúram pridalo 10 - 10 mg substrátu compactinu (kyslá sodná soľ compactinu) v sterilnom prefiltrovanom vodnom roztoku a vo fermentácii sa pokračovalo počas 168 hodín.
Na konci biologickej konverzie sa obsah pravastatinu vo fermentačnom médiu stanovil s použitím metódy HPLC. Priemerná koncentrácia pravastatinu predstavovala 40 pg/ml.
Príklad 6
Fermentácia, dávkovanie substrátu a biologická konverzia sa uskutočnili s kmeňom IDR-P6, [NCAIM (P) B 001273] Micromonospora megalomicea ssp. nigra, ako bolo opísané v príklade 5. Obsah pravastatinu vo fermentačnom prostredí sa stanovil s použitím metódy HPLC. Na konci biologickej konverzie predstavoval obsah pravastatinu v médiu 50 pg/ml.
Príklad 7 ml alikvotných podielov inokulačnej kultúry kmeňa IDR-P4 [NCAIM (P) B 001271] Micromonospora purpnrea, pripraveného, ako je opísané v príklade 1, sa použilo na naočkovanie 100 - 100 ml TT/14 média rozdeleného v 500 ml Erlenmeyerových bankách a sterilizovalo sa počas 25 minút pri teplote 121 °C.
Zloženie média TT/14
Zemiakový škrob5,0 g
Glukóza 25,0 g
Kvasinkový extrakt (GISTEX) 15,0g
Peptón 15,0g
CaCO3 1,0g v 1000 ml vodovodnej vody
Hodnota pH biokonverzného média sa pred sterilizáciou adjustovala na 7,0.
Banky sa pretrepávali na rotačnej trepačke (250 rpm, rozkmit 2,5 cm) počas 3 dní. Dávkovanie substrátu, biologická konverzia a stanovenie obsahu pravastatinu sa uskutočnilo, ako je opísané v príklade 5. Na konci biologickej konverzie predstavoval obsah pravastatinu vo fermentačnom prostredí 40 pg/ml.
Príklad 8
Fermentácia, dávkovanie substrátu a biologická konverzia sa uskutočnili s kmeňom IDR-P7, [NCAIM (P) B 001274] Micromonospora rosaria, ako bolo opísané v príklade L Na konci biologickej konverzie sa vo fermentačnom prostredí s použitím metódy HPLC stanovilo 350 pg/ml pravastatinu.
Claims (7)
1. Mikrobiálny spôsob prípravy zlúčeniny vzorca (1) (I) zo zlúčeniny všeobecného vzorca (II) v ktorom R znamená ión alkalického kovu alebo amóniový ión, pomocou submerznej kultivácie kmeňa Micromonospora, ktorý je schopný όβ-hydroxylovať zlúčeninu vzorca (II) pri aeróbnych podmienkach a separovaním a prečistením zlúčeniny vzorca (I) vytvorenej v priebehu biologickej konverzie, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky
a) kultivácie kmeňa Micromonospora, ktorý je schopný 6β-hydroxylovať zlúčeninu vzorca (II) - kde R má definovaný význam - pri teplote 25 až 32 °C na živnom médiu obsahujúcom využiteľné zdroje uhlíka a dusíka a minerálne soli, následne
b) dávkovania substrátu, ktorý sa má transformovať, do rozvinutej kultúry, potom
SK 285726 Β6
c) hydroxylovanie substrátu až do ukončenia biologickej konverzie, potom
d) separovanie zlúčeniny vzorca (I) z kultivačného prostredia a, v prípade potreby, jej prečistenie.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že sa použije kmeň Micromonospora sp. 1DR-P3 uložený v Národnej zbierke poľnohospodárskych a priemyselných mikroorganizmov (the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM), Budapešť, Maďarsko, pod číslom NCAIM (P) B 001268 alebo jeho mutantný kmeň, ktorý je schopný 60-hydroxylovať zlúčeninu všeobecného vzorca (II).
3. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa použije kmeň Micromonospora purpurea IDR-P4 uložený v Národnej zbierke poľnohospodárskych a priemyselných mikroorganizmov (the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM), Budapešť, Maďarsko, pod číslom NCAIM (P) B 001271 alebo jeho mutantný kmeň, ktorý je schopný ββ-hydroxylovať zlúčeninu všeobecného vzorca (II).
4. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že sa použije kmeň Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P5 uložený v Národnej zbierke poľnohospodárskych a priemyselných mikroorganizmov (the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM), Budapešť, Maďarsko, pod číslom NCAIM (P) B 001272 alebo jeho mutantný kmeň, ktorý je schopný 6[l-hydroxylovať zlúčeninu všeobecného vzorca (II).
5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa použije kmeň Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P6 uložený v Národnej zbierke poľnohospodárskych a priemyselných mikroorganizmov (the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM), Budapešť, Maďarsko, pod číslom NCAIM (P) B 001273 alebo jeho mutantný kmeň, ktorý je schopný 6β-hydroxylovať zlúčeninu všeobecného vzorca (II).
6. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že sa použije kmeň Micromonospora rosaria IDRP7 uložený v Národnej zbierke poľnohospodárskych a priemyselných mikroorganizmov (the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM), Budapešť, Maďarsko, pod číslom NCAIM (P) B 001274 alebo jeho mutantný kmeň, ktorý je schopný ββ-hydroxylovať zlúčeninu všeobecného vzorca (II).
7. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 6, v y značujúci sa tým, že zlúčenina vzorca (I) pripravená počas fermentácie sa separuje z kultivačného prostredia adsorpciou na aniónovej ionexovej živici alebo extrakciou s organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou, následne sa pripraví jej laktónový derivát alebo jej sekundárna amínová soľ ako medziprodukt, alebo sa alkalický vodný extrakt získaný z extraktu organického rozpúšťadla fermentačného prostredia prečistí s použitím chromatografie na neiónovcj adsorbčnej živici.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9902352A HUP9902352A1 (hu) | 1999-07-12 | 1999-07-12 | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
| PCT/HU2000/000066 WO2001004340A1 (en) | 1999-07-12 | 2000-06-29 | Hydroxylation of compactin to pravastatin by micromonospora |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK492002A3 SK492002A3 (sk) | 2005-03-04 |
| SK285726B6 true SK285726B6 (sk) | 2007-07-06 |
Family
ID=89998701
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK49-2002A SK285726B6 (sk) | 1999-07-12 | 2000-06-29 | Hydroxylácia compactinu na pravastatin s použitímmikromonospór |
| SK61-2002A SK612002A3 (en) | 1999-07-12 | 2000-07-11 | Microbial process for preparing pravastatin |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK61-2002A SK612002A3 (en) | 1999-07-12 | 2000-07-11 | Microbial process for preparing pravastatin |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6905851B1 (sk) |
| EP (3) | EP1327689A1 (sk) |
| JP (2) | JP4531315B2 (sk) |
| KR (2) | KR100479837B1 (sk) |
| CN (2) | CN1399686A (sk) |
| AP (1) | AP1405A (sk) |
| AT (1) | ATE243262T1 (sk) |
| AU (2) | AU773633B2 (sk) |
| BG (1) | BG65109B1 (sk) |
| BR (1) | BR0013156A (sk) |
| CA (2) | CA2379015A1 (sk) |
| CZ (2) | CZ297009B6 (sk) |
| DE (1) | DE60003424T2 (sk) |
| DK (1) | DK1190087T3 (sk) |
| ES (1) | ES2200891T3 (sk) |
| HR (1) | HRP20020028B1 (sk) |
| HU (1) | HUP9902352A1 (sk) |
| IL (2) | IL147583A0 (sk) |
| IS (1) | IS2138B (sk) |
| MX (1) | MXPA02000356A (sk) |
| NO (1) | NO20020119L (sk) |
| NZ (1) | NZ516563A (sk) |
| OA (1) | OA12150A (sk) |
| PL (2) | PL353493A1 (sk) |
| PT (1) | PT1190087E (sk) |
| RU (2) | RU2235780C2 (sk) |
| SK (2) | SK285726B6 (sk) |
| TR (1) | TR200200726T2 (sk) |
| UA (1) | UA67854C2 (sk) |
| WO (2) | WO2001004340A1 (sk) |
| YU (1) | YU2002A (sk) |
| ZA (1) | ZA200200273B (sk) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI9800046A (sl) | 1998-02-18 | 1999-08-31 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za pridobivanje inhibitorjev HMG-CoA reduktaze visoke čistosti |
| HUP9902352A1 (hu) * | 1999-07-12 | 2000-09-28 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
| ATE342717T1 (de) | 1999-11-30 | 2006-11-15 | Teva Gyogyszergyar Zartkoeruee | Verfahren zur rückgewinnung von statinverbindungen aus einer fermentationsbrühe |
| US7001919B2 (en) | 1999-12-14 | 2006-02-21 | Teva Gyogyszergyar Reszvenytarsasag | Forms of pravastatin sodium |
| PL361230A1 (en) * | 2000-10-05 | 2004-10-04 | Biogal Gyogyszergyar Rt. | Pravastatin sodium substantially free of pravastatin lactone and epi-pravastatin, and compositions containing same |
| JP3236282B1 (ja) * | 2000-10-16 | 2001-12-10 | 三共株式会社 | プラバスタチンを精製する方法 |
| DE60218822T2 (de) * | 2001-02-09 | 2007-07-12 | Unilever N.V. | Nahrungsmittel enthaltend sojaprotein und statin |
| JP2003026634A (ja) * | 2001-07-17 | 2003-01-29 | Mercian Corp | プラバスタチンナトリウム塩の製造方法 |
| US6716615B2 (en) | 2002-02-27 | 2004-04-06 | Yung Shin Pharmaceutical Ind. Co., Ltd. | Strains of saccharaothrix, process for producing pravastatin using the strains and isolation process of (HMG)-CoA reductase |
| EP1452602A1 (en) * | 2003-02-25 | 2004-09-01 | Antibiotic Co., | Method for production of pravastatin by fermentation |
| CN1244688C (zh) * | 2003-07-09 | 2006-03-08 | 上海天伟生物制药有限公司 | 生产普伐他汀钠的微生物和方法 |
| CA2546377A1 (en) | 2003-11-24 | 2005-06-09 | Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag | Method of purifying pravastatin |
| EP2247737B1 (en) * | 2008-02-06 | 2018-06-20 | Biocon Limited | Fermentation medias and processes thereof |
| RU2522806C1 (ru) * | 2012-11-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Усовершенствованный способ очистки правастатина |
| JP6441599B2 (ja) * | 2014-07-14 | 2018-12-19 | 合同酒精株式会社 | プラバスタチンの製造法 |
| CN114031496A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-02-11 | 广东蓝宝制药有限公司 | 一种高纯度普伐他汀1,1,3,3-四甲基丁胺的制备方法 |
| CN114133331A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-04 | 广东蓝宝制药有限公司 | 一种回收获得高纯度普伐他汀酯的方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK149080C (da) | 1980-06-06 | 1986-07-28 | Sankyo Co | Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af ml-236b-carboxylsyre |
| JPS5810572A (ja) | 1981-07-07 | 1983-01-21 | Sankyo Co Ltd | Ｍｌ−２３６ｂ誘導体およびその製造法 |
| JPS5889191A (ja) | 1981-11-20 | 1983-05-27 | Sankyo Co Ltd | ３−ヒドロキシ−ｍｌ−２３６ｂ誘導体の製造法 |
| JPS59175450A (ja) * | 1983-03-24 | 1984-10-04 | Sankyo Co Ltd | Ｍｌ−２３６ｂ誘導体 |
| US5179013A (en) * | 1987-02-02 | 1993-01-12 | Sankyo Company, Limited | Cytochrome P-450 enzymes |
| JPH06253853A (ja) * | 1993-03-09 | 1994-09-13 | Asahi Chem Ind Co Ltd | マクロライド抗生物質生合成遺伝子を含有するｄｎａ |
| US6043064A (en) * | 1993-10-22 | 2000-03-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Enzymatic hydroxylation process for the preparation of HMG-CoA reductase inhibitors and intermediates thereof |
| JPH08149986A (ja) * | 1994-09-28 | 1996-06-11 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 |
| JPH0889277A (ja) * | 1994-09-28 | 1996-04-09 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 |
| US5942423A (en) * | 1995-06-07 | 1999-08-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Conversion of compactin to pravastatin by actinomadura |
| SI20072A (sl) * | 1998-09-18 | 2000-04-30 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za pridobivanje inhibitorjev HMG-CoA reduktaze |
| US6682913B1 (en) * | 1999-02-03 | 2004-01-27 | Institute For Drug Research Ltd. | Microbial process for preparing pravastatin |
| HUP9902352A1 (hu) * | 1999-07-12 | 2000-09-28 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
| IN191580B (sk) * | 1999-12-17 | 2003-12-06 | Ranbaxy Lab Ltd |
-
1999
- 1999-07-12 HU HU9902352A patent/HUP9902352A1/hu unknown
-
2000
- 2000-06-29 NZ NZ516563A patent/NZ516563A/xx unknown
- 2000-06-29 TR TR2002/00726T patent/TR200200726T2/xx unknown
- 2000-06-29 AP APAP/P/2002/002404A patent/AP1405A/en active
- 2000-06-29 BR BR0013156-3A patent/BR0013156A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-06-29 IL IL14758300A patent/IL147583A0/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 OA OA1200200015A patent/OA12150A/en unknown
- 2000-06-29 CZ CZ20020119A patent/CZ297009B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 EP EP03075550A patent/EP1327689A1/en not_active Withdrawn
- 2000-06-29 PL PL00353493A patent/PL353493A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-06-29 AT AT00944121T patent/ATE243262T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 YU YU2002A patent/YU2002A/sh unknown
- 2000-06-29 AU AU58355/00A patent/AU773633B2/en not_active Ceased
- 2000-06-29 JP JP2001509543A patent/JP4531315B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 DE DE60003424T patent/DE60003424T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 KR KR10-2002-7000475A patent/KR100479837B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 SK SK49-2002A patent/SK285726B6/sk unknown
- 2000-06-29 MX MXPA02000356A patent/MXPA02000356A/es active IP Right Grant
- 2000-06-29 US US10/030,726 patent/US6905851B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 ES ES00944121T patent/ES2200891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 UA UA2002010326A patent/UA67854C2/uk unknown
- 2000-06-29 CN CN00811127A patent/CN1399686A/zh active Pending
- 2000-06-29 PT PT00944121T patent/PT1190087E/pt unknown
- 2000-06-29 CA CA002379015A patent/CA2379015A1/en not_active Abandoned
- 2000-06-29 WO PCT/HU2000/000066 patent/WO2001004340A1/en active IP Right Grant
- 2000-06-29 RU RU2002103376/13A patent/RU2235780C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 DK DK00944121T patent/DK1190087T3/da active
- 2000-06-29 EP EP00944121A patent/EP1190087B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 CN CNA2004100493556A patent/CN1590555A/zh active Pending
- 2000-07-11 JP JP2001508931A patent/JP2003528576A/ja active Pending
- 2000-07-11 PL PL00364872A patent/PL364872A1/xx unknown
- 2000-07-11 CA CA002373544A patent/CA2373544A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-11 IL IL14758800A patent/IL147588A0/xx unknown
- 2000-07-11 KR KR1020027000486A patent/KR20020060150A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-07-11 CZ CZ2002127A patent/CZ2002127A3/cs unknown
- 2000-07-11 WO PCT/US2000/019384 patent/WO2001003647A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-07-11 SK SK61-2002A patent/SK612002A3/sk unknown
- 2000-07-11 EP EP00950379A patent/EP1198448A4/en not_active Withdrawn
- 2000-07-11 AU AU63492/00A patent/AU6349200A/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-01-10 NO NO20020119A patent/NO20020119L/no not_active Application Discontinuation
- 2002-01-10 HR HR20020028A patent/HRP20020028B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-01-11 IS IS6227A patent/IS2138B/xx unknown
- 2002-01-11 ZA ZA200200273A patent/ZA200200273B/xx unknown
- 2002-01-14 BG BG106302A patent/BG65109B1/bg unknown
-
2004
- 2004-05-13 RU RU2004114667/13A patent/RU2004114667A/ru not_active Application Discontinuation
- 2004-12-16 US US11/014,658 patent/US20050124051A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK285726B6 (sk) | Hydroxylácia compactinu na pravastatin s použitímmikromonospór | |
| JP2003528576A5 (sk) | ||
| US6682913B1 (en) | Microbial process for preparing pravastatin | |
| EP1154979B1 (en) | Microbial process for preparing pravastatin | |
| HU225936B1 (en) | Hydroxylation of compactin to pravastatin by micromonospora | |
| EP1491522A1 (en) | Microbial process for preparing pravastatin | |
| JP2003277358A (ja) | 新規ｋ９９−５０４１物質およびその製造法 |