JPH06253853A - マクロライド抗生物質生合成遺伝子を含有するｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 少なくともマクロライド抗生物質生産性放線
菌由来のマクロライド生合成遺伝子、例えばマイシナマ
イシンＩＶ水酸化活性を有するポリペプチドのアミノ酸
配列をコ−ドする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡ配列を保持する
プラスミド。 【効果】 マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子は、
この遺伝子をベクタープラスミド上にクローニングする
ことにより、このクローニングベクター系を用いてマイ
シナマイシンＩＩ生産菌に遺伝子導入することができ、
本遺伝子を導入された菌株は本酵素活性の上昇によりそ
のマイシナマイシン生産力価を改善せしめ、また本遺伝
子をストレプトマイセス属に属するマクロライド抗生物
質生産菌に導入することにより、従来生産菌が生産し得
なかった新規のマクロライド抗生物質を生産する新種放
線菌の育種を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は少なくともマクロライド
抗生物質生産性放線菌由来のマクロライド生合成遺伝
子、例えばマイシナマイシンＩＶ水酸化活性を有する少
なくとも図１に示すアミノ酸配列をコ−ドする新規ＤＮ
Ａ、該ＤＮＡ配列を保持するプラスミドに関する。

【０００２】

【従来の技術】放線菌は多種多用の抗生物質や生理活性
物質等の二次代謝産物の生産菌として醗酵工業の分野で
は古くから重要な位置を占めており、種々の菌株改良技
術によりその生産性の改良が行なわれてきた。また近年
では有用二次代謝産物の生産性向上や新活性物質の創製
等、放線菌改良研究の１つとしてＤＮＡ組換え実験系の
確立が望まれており、現在までに放線菌の特定菌種では
宿主−ベクター系が確立されている。例えばマクロライ
ド抗生物質の生産に関与する遺伝子として、タイロシン
生合成遺伝子（特開昭６２−２７５６８６号公報）、ス
ピラマイシン生合成遺伝子（特開平２−３９８８９号公
報）、カルボマイシン生合成遺伝子（特開平２−７２８
８０号公報）、エリスロマイシン生合成遺伝子〔Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７２ Ｎ
ｏ．５、２３７２−２３８３（１９９０）〕等の放線菌
遺伝子がクローニングされている。

【０００３】マイシナマイシンはミクロモノスポラ属放
線菌ミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５菌
株の生産する抗生物質であり、マイシナマイシンＩ、マ
イシナマイシンＩＩ、マイシナマイシンＩＩＩ、マイシ
ナマイシンＩＶおよびマイシナマイシンＶとして示され
る、１６員環の環状ラクトンおよび２個の糖残基からな
るマクロライド抗生物質であり〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、３３ Ｎｏ．４、３６４−
３７６（１９８０）〕、作用機構として細菌のリボソー
ムに結合し蛋白質合成阻害を引き起こすことによりグラ
ム陽性の菌種を始め、マイコプラズマ等にすぐれた抗菌
活性を示す抗生物質であり、そのうちマイシナマイシン
ＩＩは動物薬として使用されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】マイシナマイシン生産
菌の属するミクロモノスポラ属放線菌も抗生物質を始め
とする生理活性物質を生産する工業的に有用な微生物で
あるが、この微生物を遺伝子工学的に育種改良する試み
としての抗生物質生合成遺伝子のクローニング例は殆ど
無く、ミクロモノスポラ・オリボアステロスポラにおけ
るアミノ配糖体抗生物質アストロマイシン生合成遺伝子
のクローニング例〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２３６ Ｎｏ．１、３９−４８
（１９９２）〕が報告されているが、マクロライド抗生
物質を生産するミクロモノスポラ属に属する微生物の該
抗生物質生合成遺伝子のクローニングについての報告は
ない。

【０００５】マイシナマイシン生合成遺伝子はベクター
プラスミド上にクローニングすることにより、このクロ
ーニングベクター系を用いてマイシナマイシンＩＶ水酸
化酵素欠損株およびマイシナマイシンＩＩ生産株に本遺
伝子を導入することができ、本遺伝子を導入された菌株
はマイシナマイシンＩＩ生産性を回復し、さらに本酵素
活性が上昇することによりマイシナマイシンＩＩの生産
力価を上昇することを少なくとも目的の一つとする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の点
に臨み、鋭意研究を行なった結果、先にｍｙｒＢ耐性遺
伝子を取得し、かつこれを用いることによってマイシナ
マイシンＩＶ水酸化酵素をコードするミクロモノスポラ
・グリセオルビダ由来のマクロライド抗生物質水酸化遺
伝子を含有したＤＮＡまたはそのＤＮＡ断片を含有する
組換え体ＤＮＡおよびその組換え体で形質転換された形
質転換体を取得することによって本発明を完成するに至
った。

【０００７】本発明は、少なくとも図１に示すアミノ酸
配列をコードするＤＮＡおよびこのＤＮＡ配列を含有す
る組換えプラスミドである。図１にマイシナマイシンＩ
Ｖ水酸化遺伝子のコードするアミノ酸配列を、アミノ末
端を先頭にして示す。図１にて表されるアミノ酸配列の
アミノ末端側またはカルボキシル末端側は、アミノ酸残
基またはポリペプチド残基を含む場合であってもよく、
アミノ末端であるＴｈｒの上流にはさらに一個または複
数のアミノ酸残基を有してもよく、そのアミノ酸残基ま
たはポリペプチド残基としては、開始コドンに相当する
Ｍｅｔを始めとするアミノ酸残基や、シグナル様ペプチ
ドが挙げられ、またカルボキシル末端側のＴｒｐの下流
にはさらに一個以上のアミノ酸残基を有してもよい。Ａ
ｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎはアスパ
ラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシステイ
ン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌ
ｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはイソロイ
シン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍｅｔはメ
チオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏはプロリ
ン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒｐはト
リプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリンであ
る。

【０００８】図２にマイシナマイシンＩＶ水酸化遺伝子
の塩基配列を暗号配列の上流の５’末端を先頭にして示
す。マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子はそのコー
ドするアミノ酸配列のアミノ末端側またはカルボキシル
末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めた
各アミノ酸に対応する一連の塩基コドンのうちいずれか
一個またはそれ以上のコドンを有するＤＮＡであっても
よく、例えば図１０、１１にて示されるＤＮＡが図２の
ＤＮＡを含む断片として簡便に利用できる。マイシナマ
イシンＩＶ水酸化酵素遺伝子の解読鎖の配列は周知の塩
基対の法則（ＡとＴが対になりＣとＧが対になる）によ
って得ることができる。配列中、Ａはデオキシアデニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｇはデオキシグアニル、Ｔ
はチミジル残基を示す。ＤＮＡ配列には、本発明の理解
を容易にするため番号を付した。

【０００９】本発明におけるマイシナマイシンＩＶ水酸
化酵素遺伝子はマクロライド抗生物質物質生産能を有す
る微生物より得ることができる。例えばミクロモノスポ
ラ属放線菌であって、具体的にはミクロモノスポラ・グ
リセオルビダＡ１１７２５（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏ
ｒａ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｉｄａＡ１１７２５、ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３２０２）等が用いられる。

【００１０】遺伝子の供与体である微生物に由来するＤ
ＮＡは次のようにして採取される。例えば、液体培地で
約２−３日間通気培養し、得られる培養物を遠心分離し
て集菌し、次いでこれを溶菌させることによってマイシ
ナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子を含有する溶菌物を調
製する。溶菌方法としては例えばリゾチームやアクロモ
ペプチダーゼ等の細胞壁溶解酵素による処理が施され、
必要によりプロテアーゼ等の他の酵素やラウリル硫酸ナ
トリウム等の界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物
理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述
溶菌法との組み合わせで行なってもよい。このようにし
て得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法
に従って、例えばフェノール抽出による除蛋白処理、プ
ロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈
殿、遠心分離等の方法を適宜組み合わせることにより行
なうことができる。

【００１１】次に調製された染色体ＤＮＡを制限酵素に
よって切断し断片化する。抗生物質生産に関与する遺伝
子は遺伝子群を形成していることが知られており、さら
には自己耐性遺伝子の近傍領域に存在することが知られ
ている〔Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ、Ｆ. ｅｔ ａｌ．、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３０９、４６２−４６４（１９８４）〕。
このためＤＮＡ断片は耐性遺伝子と生合成遺伝子群を同
時に含有するためにある程度以上の分子量にする必要が
ある。そのため適当な断片化が可能な制限酵素を選ぶこ
とが必要であり、また反応条件を変化させ部分消化させ
ることによって好ましいＤＮＡ断片を得ることができ
る。得られたＤＮＡ断片は、公知の方法（例えばアガロ
ース電気泳動およびショ糖密度勾配法）によって分離さ
れる。

【００１２】本発明においては、ミクロモノスポラ・グ
リセオルビダＡ１１７２５から得られた染色体ＤＮＡを
制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにより部分消化し、約３５ｋｂｐ
−４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を分画し回収した。マイシナ
マイシン耐性遺伝子としてはすでにｍｙｒＢをクローニ
ングしその有用性を示した（特願平５−１４６４９号：
発明の名称「マイシナマイシン耐性を付与する新規遺伝
子ｍｙｒＢ」平成５年２月１日出願日、エシェリヒア・
コリＪＭ１０９／ｐＣ２４株、ＦＥＲＭ Ｐ−１３３９
３）。そのためエシェリヒア・コリを用い、マイシナマ
イシン耐性遺伝子ｍｙｒＢの近傍領域をクローニングす
ることができる。本発明においてはコスミドベクターｐ
ＪＢ８を用い上記の部分消化したミクロモノスポラ・グ
リセオルビダＡ１１７２５の染色体ＤＮＡの遺伝子ライ
ブラリーを作製した。さらにこのライブラリーをｍｙｒ
Ｂを含有するＤＮＡ断片をプローブとすることにより、
ｍｙｒＢ近傍のＤＮＡ領域を得た。

【００１３】組換えＤＮＡの調製はこの分野における通
常の方法〔例えばＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、ｅｔ ａ
ｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８２）〕に準じて行なわれ、ベクター、
制限酵素等の種類に応じて適当な反応条件が選択され
る。

【００１４】本発明の宿主微生物としてはマイシナマイ
シンＩＶ蓄積変異株が用いられる。それゆえマイシナマ
イシン生合成経路を完全な形で有しているマイシナマイ
シンＩＩ生産菌株を親株としてマイシナマイシンＩＶ水
酸化酵素欠損変異株を作製する必要がある。マイシナマ
イシンＩＩはマイシナマイシンＩＶが水酸化されること
を経て合成される化合物であり〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、４３，Ｎｏ．１１、１５０
８−１５１１（１９９０）〕この水酸化酵素が欠損もし
くは変異した変異株においてはマイシナマイシンＩＶが
蓄積する。それゆえマイシナマイシンＩＩ生産菌を親株
に使用することができる。

【００１５】放線菌における突然変異誘発方法はデリッ
クら〔Ｄｅｌｉｃ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｒｅｓ．、９、１６７−１８２（１９６９）〕の方法に
従い、１−メチル−３’−ニトロ−１−ニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）を変異誘発剤として用い生合成変異体を
誘発することができる。マイシナマイシンＩＶ水酸化酵
素欠損変異株は、マイシナマイシンＩＩ生産菌からＮＴ
Ｇ処理した後に生存する菌株の醗酵生産物を高速液体ク
ロマトグラフィー等により解析することで同定される。
本発明においてマイシナマイシンＩＩ生産菌ミクロモノ
スポラ・グリセオルビダＡ１１７２５からマイシナマイ
シンＩＶ水酸化酵素欠損変異株ＢＭ−４−３００１株を
得た。

【００１６】放線菌の形質転換は通常細胞壁を取り除い
たプロトプラストを用いて行なわれる。ストレプトマイ
セス属放線菌においてプロトプラストの形成及びプロト
プラストの菌糸体への再生条件は岡西ら〔Ｏｋａｎｉｓ
ｈｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ. Ｇｅｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．、８０、３８９−４００、（１９７８）〕により詳
細に検討されている。またプロトプラストを用いた放線
菌の形質転換現象はビブら〔Ｂｉｂｂ、ｅｔ ａｌ．、
Ｎａｔｕｒｅ、２７４、３９８−４００（１９７８）〕
により見いだされその後種々の放線菌に応用された。マ
イシナマイシン生産菌ミクロモノスポラ・グリセオルビ
ダＡ１１７２５のプロトプラストの形成及びプロトプラ
ストの菌糸体への再生条件、及びプラスミドＤＮＡによ
る形質転換法は特開平４−２２９１７７号公報により詳
細に述べられている。形質転換はプロトプラストと供与
ＤＮＡ（例えばプラスミドベクタ−等）とをポリエチレ
ングリコールの存在下にて混合することによって行なわ
れる。形質転換頻度が低い放線菌を宿主として用いる場
合、制限修飾系の存在を考慮にいれ、供与ＤＮＡの起源
を変更したり、外来ＤＮＡに対して許容となるべく育種
改良する方法があり、また低頻度ながら得られた形質転
換体からＤＮＡを再調整し、その後目的宿主に形質転換
する方法がとられる。さらに宿主微生物の細胞内にプラ
スミドＤＮＡが予め存在する場合、外来ＤＮＡとの間で
形質転換効率や安定な保持に対する影響が起こることが
あることから、これらを排除するために内在性プラスミ
ドを除去（キュアリング）することなどが行なわれる。

【００１７】本発明においてミクロモノスポラ・グリセ
オルビダＡ１１７２５はエシェリヒア・コリから調製し
た本菌株とのシャトルベクタ−により形質転換した場合
形質転換効率は非常に低いものであり、さらに内在性プ
ラスミドの影響を受け安定な保持がなされないことが観
察された。そこでマイシナマイシンＩＶ水酸化酵素欠損
変異株を効率良く安定に形質転換するために、宿主ミク
ロモノスポラ・グリセオルビダの内在性プラスミドを除
去した。内在性プラスミドの除去は低頻度ながら得られ
た形質転換体を選択圧非存在化で培養した後、選択マー
カーを欠失した菌株をスクリーニングすることで行なっ
た。マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子をクローニ
ングするためには、組換えプラスミドを導入されたマイ
シナマイシンＩＶ水酸化酵素欠損変異株の形質転換株
は、ベクターのマーカーにより一次選択され、次に宿主
として用いた菌株のマイシナマイシンＩＩ生産性の回復
を指標にして選択される。

【００１８】マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子を
含む組換えＤＮＡは形質転換株より抽出、精製され、ｐ
ＣＭＢＥ８Ｓと命名された。本組換えプラスミドは約３
７．２ｋｂｐの塩基対からなり、図４に示される制限酵
素地図を有する。上記で得られたマイシナマイシンＩＶ
水酸化酵素遺伝子を含有するＤＮＡ断片は制限酵素等に
より適当な欠失を導入されたり、あるいは他のベクター
へ組換えられること（サブクローン化）により制限酵素
地図上どの領域が活性発現に必要であるかが調べられ
る。本発明においてｐＣＭＢＥ８Ｓに含有されるＤＮＡ
断片を制限酵素を用い小型化し、解析を行なったとこ
ろ、マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素活性発現に必要な
領域は約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片上に存在すると特定
された。

【００１９】上記のごとく得られた組換えプラスミドを
含む形質転換株はその栄養生理的性質を考慮して培養条
件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行
う。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いら
れるものが広く使用され得る。炭素源としては、資化可
能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュ
ークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、
糖蜜等が使用される。窒素源としては利用可能な窒素化
合物であれば良く、例えばペプトン，肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン加水分解物等が使用される。その他、リ
ン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、
カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類、特定のアミノ
酸、特定のビタミン等が必要に応じて使用される。 培
養温度は微生物が発育し、マイシナマイシンＩＶ水酸化
酵素遺伝子を発現し得る範囲で適宜変更し得るが、好ま
しくは２８〜３０℃程度である。培養時間は、条件によ
って多少異なるが、マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺
伝子の発現が現れる時期を見計らって適当な時期に培養
を終了すればよく、通常１２０−１６８時間程度であ
る。培地ｐＨは菌が発育し、マイシナマイシンＩＶ水酸
化酵素遺伝子を発現し得る範囲で適宜変更し得るが、特
に好ましくはｐＨ７．０〜７．５程度である。

【００２０】培地中に生産された抗生物質は一般的抗生
物質採取法に準じて回収される。培地中または抽出、精
製過程における抗生物質の確認は、ペーパーディスク
法、カップ法等を用いた生物検定や、薄層クロマトグラ
フィー法を用いた生物検定によって行なうことができ
る。また、精製標品（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓ，３３ Ｎｏ．４，３６４−３７６（１
９８０））を用いて、高速液体クロマトグラフィー、融
点、紫外吸収スペクトル、赤外吸収スペクトル、Ｘ線回
析、マススペクトル等による解析により生産抗生物質が
同定される。

【００２１】このようにして得られる本発明ＤＮＡの塩
基配列はＳｃｉｅｎｃｅ、２１４、１２０５−１２１０
（１９８１）に示されているジデオキシ法で解読し決定
することが出来る。マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺
伝子をコードするＤＮＡを含有する約２．７ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片の塩基配列は、組換えプラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓ
を移入して得られた形質転換体エシェリヒア・コリ Ｊ
Ｍ１０９／ｐＵ８Ｃ１Ｓ株＜工業技術院生命工学技術研
究所・受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３４５２＞を培養し
て調製した一本鎖ＤＮＡを鋳型として図１０、１１の通
り決定することができる。さらに決定されたＤＮＡ塩基
配列中からオープンリーディングフレームを検索するこ
とによりマイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子の翻訳
領域を図２の通り求め、かつこの塩基配列にコードされ
ている酵素のアミノ酸配列を図１に示す。

【００２２】

【実施例】 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるもの
ではない。

【００２３】

【実施例１】 ＜ミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５由来
ゲノムＤＮＡの調製＞ミクロモノスポラ・グリセオルビ
ダＡ１１７２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２０２）を１０ｍ
ｌの１７２Ｆ培地〔グルコース（和光純薬工業社製）１
０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、可溶性でんぷ
ん（和光純薬工業社製）１０ｇ、カシトン（ディフコ社
製）５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ（和光純薬工業社製）
２．５ｇ、およびＣａ（ＮＯ₃)₂ ・４Ｈ₂ Ｏ（和光純薬
工業社製）２ｇを蒸留水にて１ｌとし、ｐＨ７．２に調
製したもの、１２０℃で２０分間高圧滅菌する〕に接種
して２８℃で２日振騰培養した。次にこの培養液５ｍｌ
を５０ｍｌの０．２％のグリシン（和光純薬工業社製）
を含む１７２Ｆ培地に接種して、さらに２８℃で２日間
振騰培養した。培養菌体を、４℃、３，０００ｒｐｍに
て１０分間遠心分離し、沈査を０．３Ｍシュークロース
（和光純薬工業社製）５０ｍｌにて洗浄した。

【００２４】その後、再び４℃、３，０００ｒｐｍにて
１０分間遠心分離し、ＳＴＥ緩衝液〔５０ｍＭトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略
す）塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（シグマ社製）、３５ｍ
Ｍエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）
（和光純薬工業社製）、２５％シュークロース〕２０ｍ
ｌにて懸濁し、リゾチーム（生化学工業社製）、アクロ
モペプチダーゼ（和光純薬工業社製）の最終濃度がそれ
ぞれ２ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌになるように添加し
て、３７℃にて１時間反応させた。その後、１０％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（和光純薬工業社製）を
２ｍｌ添加後、３７℃にて５分間放置し、フェノール・
クロロホルム混液〔５００ｍｌのクロロホルム（和光純
薬工業社製）と５００ｇのフェノール（和光純薬工業社
製）および１．０ｇの８−ヒドロキシキノリン（ナカラ
イテスク社製）をよく混合した後２００ｍｌの蒸留水を
加えて振って得た下層を用いる〕２２ｍｌを加えて撹拌
した（以後この操作をフェノール抽出と言う）。この溶
液を、１８℃、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分
離し、上層を１００ｍｌのビーカーにとり、エタノール
４４ｍｌを静かに流し入れた。更にこの液を、滅菌した
細いガラス棒でかきまぜながらクロモゾームＤＮＡを巻
き取り、標品であるミクロモノスポラ・グリセオルビダ
Ａ１１７２５のゲノムＤＮＡを得た。

【００２５】得られた染色体ＤＮＡをＴＥ緩衝液〔１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ〕に溶解した。そのＤＮＡの２０μｇを制限酵素Ｓ
ａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）１０ｕで添付のマニュアルに
記載された条件により部分消化した後、シュークロース
密度勾配遠心により３５−４５ｋｂｐ長のＤＮＡを分画
し回収した。

【００２６】

【実施例２】 ＜コスミドライブラリーの作成＞ （１）イン・ビトロ パッケージング 実施例１で得られたＳａｕ３ＡＩで部分分解したミクロ
モノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５のゲノムＤＮ
Ａ１０μｇをアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ：宝酒
造社製）１０ｕで添付のマニュアルに示された方法によ
り処理して切断末端を脱リン酸化した後（以後この操作
をＢＡＰ処理と言う）、フェノール抽出を２回繰り返し
た。１８℃、５分間、１５，０００ｒｐｍの遠心分離に
より得られた上層に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを
加え２倍容のエタノールを加えて混合し、−１１０℃に
て２０分間放置した。４℃，１０分間、１５，０００ｒ
ｐｍの遠心分離で得られるペレットを７０％エタノール
で洗浄し、真空下乾燥した（以後この操作をエタノール
沈殿と言う）。

【００２７】また２μｇのコスミドｐＪＢ８（アマシャ
ムジャパン社製）をそれぞれ別々のチューブで４ｕの制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩまたは４ｕの制限酵素ＳａｌＩ
（共に宝酒造社製）で添付のマニュアルに示された方法
で完全に切断し、それぞれを４ｕのＢＡＰで処理した。
その後、フェノール抽出を２回繰り返し、遠心分離で得
られた水層をエタノール沈殿し切断されたプラスミド断
片を回収した。それぞれの制限酵素で切断されたプラス
ミドを４ｕの制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）により
添付のマニュアルに示された方法で完全に消化した後、
電気泳動によりアガロースゲルからそれぞれ約５．４ｋ
ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片および約２．３
ｋｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を透析チューブ内に
溶出した。回収されたＤＮＡ断片を含んだ溶液をフェノ
ール抽出した後にエタノール沈殿しＤＮＡ断片を回収し
た（以後この操作をアガロースゲルからの回収と言
う）。

【００２８】このようにして得られた各コスミド断片と
ＢＡＰ処理したミクロモノスポラ・グリセオルビダゲノ
ムＤＮＡの部分切断断片とを１つの容器に加え、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社製）〔６６ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、６６０μＭのＡＴＰ（ベーリン
ガー・マンハイム社製）〕３５０単位で、最終体積２０
μｌとして１６℃、１６時間ライゲーションした（以後
この操作をライゲーションと言う）。上記で得られたラ
イゲーション溶液をイン・ビトロ パッケージングキッ
ト（アマシャムジャパン社製）を用い、添付のマニュア
ルに従ってパッケージングした。 （２）エシェリヒア・コリ ＤＨ１への形質導入 エシェリヒア・コリ ＤＨ１をＬ培地〔バクトトリプト
ン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ
１０ｇを蒸留水１ｌに溶解し１２０℃で２０分間高圧滅
菌する〕で３７℃、１６時間培養した。１００μｌの培
養液を０.２％のマルトース（和光純薬工業社製）を含
むＬ培地１０ｍｌに植菌し３７℃で４時間振騰培養した
後３，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により細胞を
回収し、氷冷した１０ｍＭのＭｇＳＯ₄ を５ｍｌ加えて
懸濁した。

【００２９】この懸濁液６００μｌに上記で得られたパ
ッケージング溶液の希釈液３００μｌを混合し、３７℃
で１５分間静置した。その後１０ｍｌのＬ培地を加えて
３７℃で１時間振騰培養した。この培養液の１部をアン
ピシリンナトリウム（和光純薬工業社製）５０μｇ／ｍ
ｌを含むＬ培地に塗布し３７℃で１６時間培養し形質導
入コロニーを多数得た。

【００３０】

【実施例３】 ＜ｍｙｒＢをプローブとしたコロニーハイブリダイゼイ
ション＞ （１）放射性ＤＮＡプローブの作製 ｍｙｒＢ遺伝子を含有する約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片
を１μｇのプラスミドｐＣ２４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３
９３から常法により抽出することができる）より制限酵
素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＨｉｎｄＩＩＩで完
全に消化することにより切り出した。得られたＤＮＡ断
片を〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、
３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、０．３７ＭＢｑ／μｌ）
（アマシャムジャパン社製）とランダムプライマーラベ
リングキット（宝酒造社製）を用い、添付のマニュアル
に従って放射性プローブを得た。すなわち、２本鎖ＤＮ
Ａを熱処理により変性させ、数種の非特異的オリゴヌク
レオチドとアニーリングさせた後、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴ
Ｐ存在下でＫｌｅｎｏｗ ＦｒａｇｍｅｎｔによりＤＮ
Ａ合成反応を行なわせることで放射活性を有するｍｙｒ
Ｂを含むＤＮＡ断片を合成した。 （２）ｍｙｒＢ遺伝子含有クローンのスクリーニング 実施例２により得たコスミドライブラリーを、ナイロン
メンブレンフィルター(アマシャムジャパン社製、Ｈｙ
ｂｏｎｄ−Ｎ＋）にレプリカし、このフィルターを別の
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ平板寒天培
地上に、コロニーの付着した面が上になるように重ね、
３７℃で１６時間培養した。培養後、このフィルターを
アルカリ変性溶液〔０．５ＮのＮａＯＨ、１．５ＭのＮ
ａＣｌ〕で湿らせた濾紙の上にコロニー面が上になるよ
うに重ね５分間静置した。次にこのフィルターを中和溶
液〔０．５Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、
０．００１ＭのＥＤＴＡ、１．５ＭのＮａＣｌ〕で湿ら
せた濾紙上に移し５分間静置した。この操作を再度繰り
返した後に２×ＳＳＰＥで湿らせた濾紙上に移し、５分
間静置した後フィルターを自然乾燥した。このフィルタ
ーをハイブリダイゼーション溶液〔５×ＳＳＰＥ、５×
Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ
／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ〔ファルマシア社製、使用直前
に１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を１００℃、１０分間
加温し、直ちに氷で急冷し変性させた〕に浸し、６５℃
で１２時間保温した。ただし上記の溶液は以下の保存溶
液を希釈して用いた。 ２０×ＳＳＰＥ：３．６ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍのリン
酸緩衝液（ｐＨ７．７）、０．０２ＭのＥＤＴＡ １００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液：２％（Ｗ／Ｖ）フ
ィコール（分子量４００，０００、ファルマシア社
製）、２％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドン（分子量３
６０，０００）、２％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン（ベ
ーリンガー・マンハイム社製） 保温後、上記で調製された放射性ＤＮＡプローブを加
え、６５℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを室温で
洗浄液１〔２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ〕を用いて１
０分間ずつ２回洗った。さらに洗浄液２〔１×ＳＳＰ
Ｅ、０．１％ＳＤＳ〕で１０分間ずつ２回洗浄した後フ
ィルターを自然乾燥した。乾燥したフィルターをＸ線フ
ィルム（富士写真フィルム社製、ＮｅｗＲＸＯ−Ｈ）に
重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフ
ィーを行った。オートラジオグラフィー終了後、フィル
ムを現像し、ポジティブシグナルを示すコロニーを複数
取得した。そのうちの１クローンが保持するプラスミド
ｐＣＭＢ２０（４７ｋｂｐ）について制限酵素切断によ
り解析し、図３に示した。

【００３１】

【実施例４】 ＜プラスミドｐＴＹＳ５０７の調製＞ミクロモノスポラ
・グリセオルビダＡ１１７２５ＣＮ３／ｐＴＹＳ５０７
（特願平５−４３６１７号明細書、平成５年３月４日、
発明の名称「組換えプラスミドベクター」、プラスミド
ベクターｐＴＹＳ５０７を保持した菌株はＦＥＲＭＰ−
１３４５４として寄託した）をチオストレプトン１０μ
ｇ／ｍｌを含有する１７２Ｆ培地に接種して２７℃で２
〜３日振騰培養した。次にこの培養液５ｍｌをチオスト
レプトン１０μｇ／ｍｌ及び０．２％グリシンを含む５
０ｍｌの１７２Ｆ培地に接種して、さらに２７℃で３日
間振騰培養した。得られた培養液を４℃、３，０００ｒ
ｐｍにて１０分間遠心分離して細胞を回収した。１０．
３％のシュークロース溶液で洗浄後、２ｍｇ／ｍｌのリ
ゾチームを含む１０ｍｌのリティック溶液〔１０．３％
シュークロース、２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、２５ｍＭのＥＤＴＡ〕に懸濁し、３７℃で３
０分間インキュベートした。これに２％ＳＤＳを含有す
る０．３Ｎ水酸化ナトリウム６ｍｌを加えてよく混ぜ、
５５℃で頻繁に攪拌しながら３０分間加温した。

【００３２】室温まで冷却したのち、５分の１容のフェ
ノール・クロロホルム混液を加え、３０秒間激しく撹拌
した。１８℃、３，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離
により得られる上層部分をエタノール沈殿しプラスミド
を回収した。得られたペレットをＴＥ緩衝液８ｍｌに溶
解し、臭化エチジウム（和光純薬工業社製）を終濃度
０．７５ｍｇ／ｍｌになるように加え、さらに塩化セシ
ウム（ナカライテスク社製）８．８ｇを加えた。得られ
た溶液を１８℃、１００，０００×ｇ、１６時間遠心し
た。この密度勾配遠心より共有結合で閉じられた環状の
ＤＮＡは紫外線ランプを照射することによって蛍光を発
する特異的なバンドとして検出された。注射針を使って
このバンドを取り出し、ＴＥ緩衝液で飽和されたイソプ
ロピルアルコールと共に数回振る事によって臭化エチジ
ウムを除去した。得られた溶液を４℃で１００倍量のＴ
Ｅ緩衝液を用い３回透析し、得られた溶液をフェノール
抽出した後遠心分離し得られた上層からエタノール沈殿
によりプラスミドＤＮＡを回収した。この操作により約
２０μｇのプラスミドｐＴＹＳ５０７ＤＮＡが得られ
た。

【００３３】

【実施例５】 ＜プラスミドｐＣＭＢＥ８Ｓ構築＞２μｇのプラスミド
ｐＣＭＢ２０をそれぞれ４ｕの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
およびＥｃｏＲＩで完全に消化した後にアガロースゲル
より約８ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。一方１μｇの
プラスミドｐＴＹＳ５０７をそれぞれ２ｕの制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化した後にフ
ェノール抽出し遠心分離により得られた水層から切断さ
れたｐＴＹＳ５０７を回収した。得られたｐＴＹＳ５０
７切断物と上記で得た約８ｋｂｐのＤＮＡ断片を混合し
ライゲーションした後に、重定らの方法（細胞工学２、
６１６ー６２６、１９８３）によってコンピテントセル
としたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９を形質転換し図
４に示すプラスミドｐＣＭＢＥ８Ｓ（３７．２ｋｂｐ）
を構築した。

【００３４】

【実施例６】 ＜マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素欠損変異株の分離＞
ミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５を１７
２Ｆ培地で対数増殖まで培養した後、滅菌したガラスホ
モジナイザーで菌糸を切断した。この溶液をトリス−マ
レイン酸（和光純薬工業社製）緩衝液（ｐＨ９．０）で
約１×１０⁸ コロニー形成率／ｍｌとなるように希釈
し、ＮＴＧを最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように添加
し、３０℃で６０分間保温した。

【００３５】ＮＴＧ処理後の菌液をＭ寒天培地〔可溶性
でんぷん２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、ＣａＣＯ₃ １ｇ、
ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ４０ｍｇ、およびバクトアガー
（ディフコ社製）１５ｇを蒸留水で９００ｍｌとし１２
０℃、２０分間高圧蒸気滅菌したものに、別に滅菌した
１００ｍｌの”エスサンミート”（７．５％）（味の素
社製）を混合して作製する〕に塗布し、生育した菌株を
１７２Ｆ培地に接種し、２８℃で３日間振騰培養した。

【００３６】十分に生育したこの菌液の５ｍｌを２０ｍ
ｌのマイシナマイシン生産培地〔デキストリン７０ｇ、
グルコース５ｇ、コットンミール２５ｇ、ソイビーンミ
ール５ｇ、ＣａＣＯ₃ ５ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ４ｇ、ＣｏＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ２ｍｇを蒸
留水１ｌに溶解しｐＨ７．２に調整した後高圧滅菌す
る〕に接種し２８℃で７日間振騰培養した。この培養液
を１５，０００ｒｐｍで遠心分離し得られた上清と、当
量のメタノールを混合し１５，０００ｒｐｍで遠心分離
した。得られた上清を高速液体クロマトグラフィー（島
津高速液体クロマトグラフィーＬＣ９Ａ、支持体：ＹＭ
Ｃ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｏｍｎ ４×１５０ｍｍ、Ｓ
−５、１２０オングストローム、移動層：０．１ＭのＮ
ａＨ₂ ＰＯ ₄ ：ＭｅＯＨ：ＣＨ₃ ＣＮ＝４５：２８：１
４）により分析し標準品と保持時間を比較することで解
析した。その結果、約１０００株中１株のマイシナマイ
シンＩＶ水酸化酵素欠損変異株ＢＭ−４−３００１を得
た。

【００３７】

【実施例７】 ＜ミクロモノスポラ・グリセオルビダＴＭ１００９のプ
ラスミドキュアリング、形質転換およびプラスミドの単
離＞マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素欠損変異株の変異
を回復させ、最終産物であるマイシナマイシンＩＩ生産
を回復させる遺伝子をエシェリヒア・コリとのシャトル
ベクターを用いてクローニングするにあたり、エシェリ
ヒア・コリで構築したプラスミドが生合成変異株で制限
修飾系の影響を受けなくすることが必要である。そこで
エシェリヒア・コリで構築したプラスミドで変異株を形
質転換する前に、形質転換が比較的容易で、かつ導入さ
れたプラスミドが安定に保持されるミクロモノスポラ・
グリセオルビダに導入し、その形質転換体からミクロモ
ノスポラ・グリセオルビダの修飾系で修飾されたプラス
ミドを調製することとした。

【００３８】すなわち生合成変異株の元株であるミクロ
モノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５からプラスミ
ドを除去するため、ｐＴＭ１００９（特開平４−２２９
１７７号公報）を保持している菌株ミクロモノスポラ・
グリセオルビダＴＭ１００９（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２０
３）を材料として用い、この菌株からチオストレプトン
耐性消失を指標にプラスミドの除去を行なった。

【００３９】（１）ミクロモノスポラ・グリセオルビダ
ＴＭ１００９のプラスミドキュアリングミクロモノスポ
ラ・グリセオルビダＴＭ１００９を１０ｍｌの１７２Ｆ
培地に接種し２８℃で３日間培養し完全に増殖させた
後、菌液をガラス製ホモジナイザーにより無菌的にホモ
ジナイズすることで菌糸を切断した。得られた菌懸濁液
１０ｍｌのうち１００μｌを新しい１７２Ｆ培地１０ｍ
ｌに接種し十分に生育させた。この操作を５回繰り返し
た後、菌液をＭ寒天培地に塗布しコロニーを生育させ
た。

【００４０】生育したコロニーを滅菌した爪楊枝で、Ｍ
寒天培地およびチオストレプトンを１０μｇ／ｍｌを含
有するＭ寒天培地に取り分け、チオストレプトン感受性
となった菌株を選択した。得られたチオストレプトン感
受性株６株から実施例４の方法に従いプラスミドの単離
を試みたが、プラスミドは検出されなかった。得られた
プラスミド除去株のうちのの１株をミクロモノスポラ・
グリセオルビダＡ１１７２５ＣＮ３とした。

【００４１】（２）ミクロモノスポラ・グリセオルビダ
Ａ１１７２５ＣＮ３の形質転換 実施例５で得られたプラスミドｐＣＭＢＥ８Ｓを以下の
方法で調製したミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１
１７２５ＣＮ３のプロトプラストに導入した。 ２−１）ミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２
５ＣＮ３のプロトプラストの調製 実施例１と同様の方法で培養して得た培養液を１８℃、
３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を回収し
た。１０．３％のシュークロース溶液で洗浄後、２ｍｇ
／ｍｌのリゾチームおよび１ｍｇ／ｍｌのアクロモペプ
チダーゼを含む１０ｍｌのＬ緩衝液〔シュークロース１
０．３ｇ、Ｋ₂ ＳＯ₄ ２５ｍｇおよび微量金属塩溶液
０．２ｍｌを蒸留水で８８ｍｌとし、高圧滅菌する。こ
れに別に高圧滅菌した１ｍｌのＫＨ₂ ＰＯ₄ （０．５
％）、１ｍｌのＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ（３．６８％）、
０．２５ｍｌの１ＭのＭｇＣｌ₂ および１０ｍｌの０．
２５ＭのＴＥＳ（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−
メチル−アミノエタンスルホン酸、ｐＨ７．２）（同仁
化学研究所社製）を加えたもの〕に懸濁し、３７℃で１
時間保温した。１８℃、１，０００ｒｐｍにて２分間遠
心して得られた上清を滅菌した脱脂綿にて濾過した。

【００４２】濾液を１８℃、２，８００ｒｐｍにて１０
分間遠心分離してプロトプラストを回収し、Ｐ緩衝液
〔シュークロース１０．３ｇ、Ｋ₂ ＳＯ₄ ２５ｍｇ、Ｍ
ｇＣｌ ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ２０３ｍｇおよび微量金属塩溶液
（ＺｎＣｌ₂ ４０ｍｇ、ＦｅＣｌ ₃ ・６Ｈ₂ Ｏ２００ｍ
ｇ、ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ１０ｍｇ、ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ
₂Ｏ１０ｍｇ、Ｎａ₂ Ｂ₄ Ｏ₇ ・１０Ｈ₂ Ｏ１０ｍｇ、
（ＮＨ₄ ）₆ Ｍｏ₇ Ｏ₂₄・４Ｈ₂ Ｏ１０ｍｇを蒸留水で
１ｌとしたもの）０．２ｍｌを蒸留水で８０ｍｌとし高
圧滅菌する。これに別に高圧滅菌した１０ｍｌの０．２
５ＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍｌのＣａＣ
ｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ（３．６８％）および１ｍｌのＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ （０．５％）を加えたもの〕にて洗浄後、１ｍｌの
Ｐ緩衝液に懸濁し、プロトプラスト懸濁液とした。 ２−２）ミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２
５ＣＮ３の形質転換とプラスミドｐＣＭＢＥ８Ｓの調製 実施例５で構築したプラスミドｐＣＭＢＥ８Ｓを１μｇ
含むＴＥ溶液２０μｌと、上記で調製したミクロモノス
ポラ・グリセオルビダＡ１１７２５ＣＮ３のプロトプラ
スト懸濁液５０μｌとを加え、さらに５００μｌのＴ緩
衝液〔ポリエチレングリコール１０００（ナカライテス
ク社製）２５ｇおよびシュークロース２.５ｇを蒸留水
で９２ｍｌとし、高圧滅菌する。これに別に高圧滅菌し
た２ｍｌの５ＭのＣａＣｌ₂ 、１．１ｍｌのＫＨ₂ ＰＯ
₄ （０．５％）、および５ｍｌの１Ｍのトリス−マレイ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えたもの〕を素早く加え
て攪拌し、１分間室温で放置した後、Ｐ緩衝液で２倍に
希釈した。

【００４３】希釈液１００μｌずつを１０枚の再生寒天
培地ＭＲ０．１Ｓ〔シュークロース３４．３ｇ、可溶性
でんぷん２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、ＭｇＣｌ₂ ・６Ｈ
₂ Ｏ１０．０ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ４０ｍｇ、微量
金属塩溶液１０ｍｌを蒸留水で６９０ｍｌとし、バクト
アガー２２．０ｇを加えて混合して１２０℃、２０分間
高圧蒸気滅菌する。これに別に高圧滅菌した１００ｍｌ
の”エスサンミート”（７．５％）、１０ｍｌのＫＨ₂
ＰＯ₄ （０．５％）、１００ｍｌのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂
Ｏ（３．６８％）および１００ｍｌの０．２５ＭのＴＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて素早く混合し、２０ｍ
ｌずつプレートにまき、１．５時間クリーンベンチ内で
乾燥させたもの〕に滴下し、それぞれ２．５ｍｌの軟寒
天培地〔シュークロース３４．３ｇ、ＭｇＣｌ₂ ・６Ｈ
₂ Ｏ１０．１２ｇおよびバクトアガー６．５ｇを蒸留水
で８２０ｍｌとし高圧滅菌する。これに別に高圧滅菌し
た８０ｍｌのＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ（３．６８％）およ
び１００ｍｌの０．２５ＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
２）を加えたもの〕を重層して全体にまきひろげ、２８
℃で２日間培養した。その後５０μｇ／ｍｌのチオスト
レプトンを含む軟寒天培地２．５ｍｌを重層し、さらに
２８℃で１４日間培養した。得られたチオストレプトン
耐性の再生株を、チオストレプトンを１０μｇ／ｍｌの
濃度で含むＭ寒天培地に植菌し、５日間、２８℃で培養
し形質転換体を得た。さらに生育した菌の保有するプラ
スミドを実施例４で示した方法で単離し、５０ｍｌの培
養液から約２０μｇのミクロモノスポラ・グリセオルビ
ダの制限修飾系により修飾されたｐＣＭＢＥ８Ｓを得
た。

【００４４】

【実施例８】 ＜ミクロモノスポラ・グリセオルビダＢＭ−４−３００
１のキュアリング＞実施例６で得られたＢＭ−４−３０
０１株を実施例７で調製した組換えプラスミドｐＣＭＢ
Ｅ８Ｓで安定に形質転換するために、ＢＭ−４−３００
１株から内在性プラスミドｐ１１７２５ａを除去した。 （１）ＢＭ−４−３００１のｐＴＭ１００９株による形
質転換 実施例７で示した方法によりプラスミドｐＴＭ１００９
により形質転換を行ないチオストレプトン耐性株を得
た。この形質転換株から実施例４に示した方法によりプ
ラスミドを単離し、ｐＴＭ１００９を確認した。得られ
た菌株をミクロモノスポラ・グリセオルビダＢＭ−４−
３００１／ｐＴＭ１００９とした。

【００４５】（２）ＢＭ−４−３００１／ｐＴＭ１００
９株のプラスミドキュアリング 上記で得られたＢＭ−４−３００１／ｐＴＭ１００９株
を実施例７で示した方法により処理しチオストレプトン
感受性株を５０株単離した。そのうちの６株について実
施例４に示した方法によりプラスミドの単離を試みた
が、すべての株にプラスミドは存在しなかった。このう
ちの１株をミクロモノスポラ・グリセオルビダＢＭ−４
−３００１ＣＮ１とした。さらに実施例６に示した方法
によりこの菌株の生産物を解析し、マイシナマイシンＩ
Ｖが蓄積していることを確認した。

【００４６】（３）ＢＭ−４−３００１ＣＮ１株のプラ
スミドｐＣＭＢＥ８Ｓよる形質転換 上記で得られたプラスミドｐＣＭＢＥ８Ｓにより、マイ
シナマイシンＩＶ水酸化酵素欠損変異株ＢＭ−４−３０
０１ＣＮ１を実施例７に示した方法により形質転換し、
ＢＭ−４−３００１ＣＮ１／ｐＣＭＢＥ８Ｓ株を得た。

【００４７】

【実施例９】 ＜形質転換株ＢＭ−４−３００１ＣＮ１／ｐＣＭＢＥ８
Ｓ株の生産物の解析＞実施例８で得られたＢＭ−４−３
００１ＣＮ１／ｐＣＭＢＥ８Ｓをチオストレプトン１０
μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１７２Ｆ培地で２８℃、３
日間生育させ種菌液とした。この５ｍｌをチオストレプ
トン１０μｇ／ｍｌを含むＰＭ４培地で実施例６に示し
た方法により培養し生産物を解析した。その結果、宿主
の主生産物であるマイシナマイシンＩＶは消失し、野生
株の生産するマイシナマイシンＩＩが生産されていた。
この結果からマイシナマイシンＩＶ水酸化酵素欠損変異
株の変異を相補する領域がｐＣＭＢＥ８Ｓに保持される
ＤＮＡ断片上に存在することが明かとなった。

【００４８】

【実施例１０】 ＜マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子領域の特定ー
１＞実施例９で示したようにマイシナマイシンＩＶ水酸
化酵素遺伝子領域はプラスミドｐＣＭＢＥ８Ｓに含有さ
れるＤＮＡ断片上に存在することが明かとなったため、
この相補領域をさらに特定した。 （１）ｐＣＭＢＣ１Ｈの構築 実施例３で得られた１μｇプラスミドｐＣＭＢ２０を２
ｕの制限酵素ＣｌａＩ（宝酒造社製）で添付のマニュア
ルの方法に従い完全に消化した後約２０ｋｂｐのＤＮＡ
断片をアガロースゲルから回収した。得られたＤＮＡ断
片溶液をフェノール抽出した後に遠心分離して得られた
水層からエタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。
この沈渣を１０μｌのポリメラーゼバッファー〔６７ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.８）、６．７ｍＭのＭ
ｇＣｌ₂ 、１６．６ｍＭの（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール 、６．７μＭのＥＤＴＡ、０．
０１６７％牛血清アルブミン、３３０μＭのそれぞれｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ（シグマ社製）〕
に懸濁しＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２ｕを
加え、３７℃、３０分間保温した。この反応液をフェノ
ール抽出した後にエタノール沈殿し、制限酵素処理で生
じた突出末端が埋められ平滑末端と成ったＤＮＡ断片を
回収した。

【００４９】上記で得られた沈渣を１μｇのＨｉｎｄＩ
ＩＩリンカー〔ｄ（ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ）〕（宝酒造社
製）を含むライゲーション溶液に溶解し、ライゲーショ
ンした。このライゲーション反応溶液をＨｉｎｄＩＩＩ
で消化した後に末端がＨｉｎｄＩＩＩ末端となった約２
０ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースからを回収した。一
方、１μｇのプラスミドｐＴＹＳ５０７を２ｕの制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した後にＢＡＰ処理した。この
溶液をフェノール抽出した後に遠心分離して得られた上
層からエタノール沈殿により切断されたプラスミドｐＴ
ＹＳ５０７を回収した。得られたプラスミド切断物とア
ガロースから回収した末端をＨｉｎｄＩＩＩ末端に改変
したＣｌａＩ断片をライゲーションした後、実施例２に
示した方法でエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９に形質導
入した。得られたアンピシリン耐性菌はプラスミドｐＣ
ＭＢ２０のＣｌａＩ切断末端がＨｉｎｄＩＩＩと成った
ＤＮＡ断片を含有するプラスミドを有していた。さらに
詳細な解析の結果、得られたプラスミドが含有するＤＮ
Ａ断片は若干の欠失が起こっており、目的としたＤＮＡ
断片よりも図３における挿入断片内のＨｉｎｄＩＩＩ部
位側が約５ｋｂｐ程短いものであった。このようにして
図５に示すプラスミドｐＣＭＢＣ１Ｈ（約４４ｋｂｐ）
を構築した。

【００５０】（２）プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓの構築 プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｈを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全
に消化し、コスミドベクターが内部に含まれる約３２．
５ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。
このＤＮＡ断片をライゲーション後エシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９を形質転換しｐＣＭＢＣ１ＨからＥｃｏＲ
Ｉ断片の欠失した、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を有す
る図６に示すプラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓ（約３２．５ｋ
ｂｐ）を構築した。

【００５１】（３）プラスミドｐＣＭＢＣ１ＳによるＢ
Ｍ−４−３００１ＣＮ１株の形質転換 上記で得られた
プラスミドｐＣＭＢＣ１ＳでＢＭ−４−３００１ＣＮ１
を形質転換するために実施例７で示した方法に従ってミ
クロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５ＣＮ３を
形質転換した後、形質転換株より実施例４に示した方法
によりプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミ
ドｐＣＭＢＣ１ＳでＢＭ−４−３００１ＣＮ１株を実施
例７に示した方法により形質転換し、形質転換体ＢＭ４
−３００１ＣＮ１／ｐＣＭＢＣ１Ｓ株を得た。得られた
形質転換体ＢＭ−４−３００１ＣＮ１／ｐＣＭＢＣ１Ｓ
株を実施例６で示した方法により培養した後、その生産
物を解析したところ、マイシナマイシンＩＩが生産され
ていることが確認され、この約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断
片により変異が相補されることが確認された。

【００５２】

【実施例１１】 ＜マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子領域の特定ー
２＞ （１）プラスミドｐＣＭＢＣ１ＧＨの構築 プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓに保持されるＤＮＡ断片をさ
らに短くしその機能単位を特定した。実施例１０で得ら
れた形質転換体ＢＭ−４−３００１ＣＮ１／ｐＣＭＢＣ
ＩＳから調製したプラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＦｂａＩで完全に消化し、アガロ
ースゲルから約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
一方プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した後反応液をフェノー
ル抽出した。遠心分離により得られた水層からエタノー
ル沈殿により切断したｐＵＣ１１９を回収した。上記で
回収された約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片と完全に消化し
たプラスミドｐＵＣ１１９をライゲーションした。

【００５３】そのライゲーション溶液によりエシェリヒ
ア・コリ ＪＭ１０９を形質転換しプラスミドｐＵ９Ｃ
１ＧＨを得た。形質転換体の保持するプラスミドをマニ
アチスらの方法〔Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ. ｅｔ ａｌ、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、３６８−３６
９〕により抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩによって切断し約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をア
ガロースゲルから回収した。一方プラスミドｐＴＹＳ５
０７を同様に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で完全に切断した後フェノール抽出した。遠心分離によ
り得られた水層をエタノール沈殿し切断されたプラスミ
ドを回収し、上記で得られたＤＮＡ断片とプラスミド切
断物をライゲーションした後、エシェリヒア・コリ Ｊ
Ｍ１０９を形質転換して図７に示すプラスミドｐＣＭＢ
Ｃ１ＧＨ（約３１．９ｋｂｐ）を構築した。得られた形
質転換体から実施例４に示した方法に従ってプラスミド
ＤＮＡを調製した。

【００５４】（２）プラスミドｐＣＭＢＣ１ＧＨのＢＭ
−４−３００１ＣＮ１株への導入 上記で得られたプラスミドｐＣＭＢＣ１ＧＨで実施例７
に従いミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５
ＣＮ３を形質転換した。さらに得られた形質転換体から
実施例４に示した方法でプラスミドを調製し、得られた
プラスミドでＢＭ−４−３００１ＣＮ１株を実施例７に
示した方法により形質転換した。

【００５５】さらに上記で得られた形質転換体を実施例
６に示した方法で培養した後、その培養上清を解析し、
マイシナマイシンＩＩが生産されていることを確認し
た。表１に形質転換体ＢＭ−４−３００１ＣＮ１／ｐＣ
ＭＢＣ１ＧＨと宿主として用いたＢＭ−４−３００１Ｃ
Ｎ１にベクタープラスミドを保持させたＢＭ−４−３０
０１ＣＮ１／ｐＴＹＳ５０７のマイシナマイシンＩＶお
よびマイシナマイシンＩＩの生産性を示した。

【００５６】

【表１】

【００５７】

【実施例１２】 ＜マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子の塩基配列の
決定＞実施例１１によりマイシナマイシンＩＶ水酸化酵
素遺伝子領域はプラスミドｐＣＭＢＣ１ＧＨに保持され
るＤＮＡ断片上に存在することが明かとなった為、この
領域の塩基配列を決定した。プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓ
を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで完全に消
化し、アガロースゲルから約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。一方プラスミドｐＵＣ１１８を同様に制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで完全に切断し
た。その後、上記で得られた約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断
片と完全に切断したプラスミドｐＵＣ１１８をライゲー
ションし、そのライゲーション溶液でエシェリヒア・コ
リ ＪＭ１０９を形質転換して図８に示したｐＵ８Ｃ１
Ｓ（約６．５ｋｂｐ：ＦＥＲＭＰ−１３４５２）を構築
した。またプラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓと同様のフラグメン
トを有しマルチクローニングサイトに対する方向性のみ
異なる図９に示したプラスミドｐＵ９Ｃ１Ｓ（約６．５
ｋｂｐ）を、ベクタ−としてｐＵＣ１１９を用いるほか
は、実質的にｐＵ８Ｃ１Ｓの構築法と同様にして構築し
た。

【００５８】得られたプラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓおよびプ
ラスミドｐＵ９Ｃ１Ｓを用い、ビエイラらの方法〔Ｖｉ
ｅｉｒａ，Ｊ．ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３−
１１、１９８７〕に従って形質転換体を培養し、１本鎖
ＤＮＡを調製してシークエンス用鋳型として用いた。さ
らにこれら鋳型一本鎖ＤＮＡの塩基配列情報をもとに新
たな１７塩基残基からなり鋳型一本鎖ＤＮＡに相補的な
オリゴヌクレオチドを合成し、シークエンスのプライマ
ーとして使用した。プライマー用オリゴヌクレオチドは
アール・エル・レッシンジャーらの方法〔Ｒ．Ｌ．Ｌｅ
ｔｓｉｎｇｅｒ，Ｗ．Ｂ．Ｌｕｒｓｆｏｒｄ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ，９８，３６
５５（１９７６）〕に基づきＤＮＡシンセサイザー（ベ
ックマン社製：ＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍ１ ｐｌｕ
ｓ）を用い作製した。

【００５９】ＤＮＡシークエンスの方法は基本的にはサ
ンガーのｄｉｄｅｏｘｙ鎖末端法〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．
ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕ．
Ｓ．Ａ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７）〕に
従い、Ｂｃａ−ＢＥＳＴシークエンスキット（宝酒造社
製)及び〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマシャムジャパン社
製）を用い、添付のマニュアルの方法に従って行い、プ
ラスミドｐＣＭＢＣ１ＧＨに保持されるＨｉｎｄＩＩＩ
−ＦｂａＩ間の約２．７ｋｂｐの領域について塩基配列
を決定した。決定された塩基配列についてビブらの報告
〔Ｍ．Ｊ．Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ、３０、
１５７−１６６（１９８４）〕に従って検討した結果、
オープンリーディングフレームが存在することが明かと
なった。決定したオープンリーディングフレームを含む
ＤＮＡ断片の塩基配列を図１０、１１に示した。さらに
この結果から、マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子
として決定された塩基配列を図２に示し、その塩基配列
がコードするアミノ酸配列を図１に示した。

【００６０】

【発明の効果】本発明のマイシナマイシンＩＶ水酸化酵
素遺伝子はこの遺伝子をベクタープラスミド上にクロー
ニングすることにより、このクローニングベクター系を
用いてマイシナマイシンＩＩ生産菌に遺伝子導入するこ
とができ、本遺伝子を導入された菌株は本酵素活性の上
昇によりそのマイシナマイシン生産力価を改善せしめ
る。また本遺伝子をストレプトマイセス属に属するマク
ロライド抗生物質生産菌に導入することにより、従来生
産菌が生産し得なかった新規のマクロライド抗生物質を
生産する新種放線菌の育種を可能とする。さらに本遺伝
子をＤＮＡプローブとして使用することにより、各種微
生物から同様の酵素活性を有する酵素に対する遺伝子を
クローニングすることができる。また遺伝子クラスター
をなしている抗生物質生合成遺伝子中の類似遺伝子をク
ローニングすることにより、そのクラスター中に含まれ
る新規遺伝子をクローニングすることができる等既知物
質の収量の増大、並びに新規抗生物質および抗生物質誘
導体の開発を目的とする多くの有用な用途を提供する。

【００６１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2171 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：ミクロモノスポラ グリセオルビダ（Micromon
ospora griseorubida) 株名：A11725 配列の特徴 252-1442 配列 GGATCCGTCG GCCCCGACCG CTCGCTCCCT CCGCGCGGCC TGCGATCCGG TCCGCCGAGG 60 GCTCGACGAC GTGGTGGAGG CGCCTGATCC CGGCACGGCG CCCGGAGGAG AGTCGGGAGG 120 TCGTCCGGCC GACACAGGCG CTCCCTCCGG TCGTCAAGGG ATCACGACGG TGGGACCGGA 180 CGTGCGCATC ATGAAAATTG CAATTATGTT CATAGATATG AGGAGGGCTT TCTGGCAGCC 240 TCGGTCGG GTG ACT TCA GCT GAA CCT AGG GCG TAT CCA TTC AAC GAT GTC 290 Thr Ser Ala Glu Pro Arg Ala Tyr Pro Phe Asn Asp Val 1 5 10 CAT GGC TTG ACC CTC GCT GGC CGG TAC GGG GAG TTG CAG GAG ACC GAG 338 His Gly Leu Thr Leu Ala Gly Arg Tyr Gly Glu Leu Gln Glu Thr Glu 15 20 25 CCG GTC AGC CGG GTC CGG CCG CCC TAC GGG GAG GAG GCG TGG CTC GTC 386 Pro Val Ser Arg Val Arg Pro Pro Tyr Gly Glu Glu Ala Trp Leu Val 30 35 40 45 ACC CGG TAC GAG GAC GTC CGG GCC GTG CTC GGT GAC GGA CGC TTC GTC 434 Thr Arg Tyr Glu Asp Val Arg Ala Val Leu Gly Asp Gly Arg Phe Val 50 55 60 CGG GGG CCG TCG ATG ACC CGC GAC GAG CCT CGG ACC CGT CCC GAG ATG 482 Arg Gly Pro Ser Met Thr Arg Asp Glu Pro Arg Thr Arg Pro Glu Met 65 70 75 GTC AAG GGC GGG CTG CTG TCC ATG GAT CCG CCC GAG CAC AGC CGA TTG 530 Val Lys Gly Gly Leu Leu Ser Met Asp Pro Pro Glu His Ser Arg Leu 80 85 90 CGC CGA CTC GTC GTC AAG GCG TTC ACC GCC CGT CGG GCG GAG TCG CTG 578 Arg Arg Leu Val Val Lys Ala Phe Thr Ala Arg Arg Ala Glu Ser Leu 95 100 105 CGG CCC CGT GCC CGC GAG ATC GCG CAC GAG CTG GTC GAT CAG ATG GCG 626 Arg Pro Arg Ala Arg Glu Ile Ala His Glu Leu Val Asp Gln Met Ala 110 115 120 125 GCC ACC GGG CAG CCA GCC GAC CTG GTG GCC ATG TTC GCC CGG CAG TTG 674 Ala Thr Gly Gln Pro Ala Asp Leu Val Ala Met Phe Ala Arg Gln Leu 130 135 140 CCG GTC AGG GTG ATC TGC GAA CTG CTC GGT GTC CCG TCC GCC GAC CAC 722 Pro Val Arg Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala Asp His 145 150 155 GAC CGC TTC ACC CGG TGG TCC GGG GCC TTC CTC TCC ACC GCC GAG GTG 770 Asp Arg Phe Thr Arg Trp Ser Gly Ala Phe Leu Ser Thr Ala Glu Val 160 165 170 ACG GCG GAG GAG ATG CAG GAG GCG GCC GAG CAG GCC TAC GCC TAC ATG 818 Thr Ala Glu Glu Met Gln Glu Ala Ala Glu Gln Ala Tyr Ala Tyr Met 175 180 185 GGC GAC CTC ATC GAC CGA CGT CGG AAG GAA CCG ACC GAC GAT CTG GTG 866 Gly Asp Leu Ile Asp Arg Arg Arg Lys Glu Pro Thr Asp Asp Leu Val 190 195 200 205 AGC GCG CTC GTC CAG GCC CGT GAC CAA CAG GAC TCG TTG TCC GAG CAG 914 Ser Ala Leu Val Gln Ala Arg Asp Gln Gln Asp Ser Leu Ser Glu Gln 210 215 220 GAA CTG CTC GAC TTG GCC ATT GGT CTG CTC GTC GCG GGA TAC GAG AGC 962 Glu Leu Leu Asp Leu Ala Ile Gly Leu Leu Val Ala Gly Tyr Glu Ser 225 230 235 ACG ACG ACC CAG ATC GCG GAC TTC GTG TAT CTC CTG ATG ACC CGA CCG 1010 Thr Thr Thr Gln Ile Ala Asp Phe Val Tyr Leu Leu Met Thr Arg Pro 240 245 250 GAG CTG CGT CGA CAG CTA CTC GAT CGG CCG GAG CTG ATT CCG TCC GCA 1058 Glu Leu Arg Arg Gln Leu Leu Asp Arg Pro Glu Leu Ile Pro Ser Ala 255 260 265 GTC GAG GAG CTG ACG CGG TGG GTG CCG CTG GGG GTG GGA ACG GCG TTC 1106 Val Glu Glu Leu Thr Arg Trp Val Pro Leu Gly Val Gly Thr Ala Phe 270 275 280 285 CCG CGC TAC GCG GTG GAG GAT GTG ACG TTG CGG GGC GTG ACC ATC CGC 1154 Pro Arg Tyr Ala Val Glu Asp Val Thr Leu Arg Gly Val Thr Ile Arg 290 295 300 GCG GGC GAG CCG GTG CTC GCC TCG ACC GGT GCC GCC AAC CGG GAC CAG 1202 Ala Gly Glu Pro Val Leu Ala Ser Thr Gly Ala Ala Asn Arg Asp Gln 305 310 315 GCC CAG TTT CCC GAC GCG GAC CGG ATC GAC GTC GAC CGT ACG CCC AAT 1250 Ala Gln Phe Pro Asp Ala Asp Arg Ile Asp Val Asp Arg Thr Pro Asn 320 325 330 CAG CAT CTC GGG TTC GGA CAC GGC GTC CAC CAC TGC CTC GGC GCT CCT 1298 Gln His Leu Gly Phe Gly His Gly Val His His Cys Leu Gly Ala Pro 335 340 345 CTG GCC CGG GTG GAA CTC CAG GTG GCA CTG GAG GTC CTG CTC CAG CGA 1346 Leu Ala Arg Val Glu Leu Gln Val Ala Leu Glu Val Leu Leu Gln Arg 350 355 360 365 CTG CCA GGG ATC CGG CTG GGG ATT CCC GAG ACG CAG CTG CGG TGG AGC 1394 Leu Pro Gly Ile Arg Leu Gly Ile Pro Glu Thr Gln Leu Arg Trp Ser 370 375 380 GAA GGG ATG TTG CTG CGT GGC CCA CTC GAG CTG CCG GTC GTG TGG 1442 Glu Gly Met Leu Leu Arg Gly Pro Leu Glu Leu Pro Val Val Trp 385 390 395 TGACAGGCGC CGGTGGTCGG GCCGGATCGA CCCGACCGCC GGCAGTGGAC CGGGAACGTC 1502 AGGCCGAGCG ACGCCAGTAG ACACCCTGCC GGTCGATCTC GACGATCTCG TCGGAGATGC 1562 CGTGCCGGTC ACGGTACTCG TGGACGGCCT CCCGGCAGGC GGGGATGCAG TAGTCGTCGA 1622 TGATCGCGAA ACCGCCGGGG GACAGTCTCG GGTAGGCGTG GGTGAGCACG TCCATGGTGG 1682 CGCCGTAGGA GTCGCCGTCC ATCCGGAGTA CCGCGAGCCG TTCGAACGGC GCGGTGGGCA 1742 TGGTGTCCTT GAACCAGCCG GGCAGGAACC GCACCTGGTC GTCGAGGAGA CCGTAGCGGC 1802 TGAAGTTCCG CTGGACGGTA GCCAGGCTGG TCGGCAGATC GACCGCCTCG TTGTACTGGT 1862 GGAGGTTCAT CTCCGCGTCC ATCGGGTGGT CGTCGTCGGT GATCTTCGGG AAGCCCTGGA 1922 ACGAGTCGGC GACCCACACC GTCCGGTCAC GGACGTCGTA CGCCTTGAGG ATGCCGCGGG 1982 CGAAGATGCA GGCCCCGCCC CGCCAGACGC CGGTCTCCAG CACGTCGCCG GGAACGCCGT 2042 CCCGCAGGGC GCTTTCGACG CAGTGTTGGA GGTTGTTCAG CCGTTTCATT CCGATCATGG 2102 TGTGCGCCAC GGTCGGATAA TCCTCGCCCG ACTCCCTGGC CTCTTCGACG AACGCGGCCT 2162 CGGTGATCA 2171

【図面の簡単な説明】

【図１】マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子のコー
ドするアミノ酸配列を示す図である。

【図２】マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子の塩基
配列を示す図である。

【図３】プラスミドｐＣＭＢ２０の制限酵素切断点およ
び機能地図を示す図である。

【図４】プラスミドｐＣＭＢＥ８Ｓの制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図５】プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｈの制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図６】プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓの制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図７】プラスミドｐＣＭＢＣ１ＧＨの制限酵素切断点
および機能地図を示す図である。

【図８】プラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓの制限酵素切断点およ
び機能地図を示す図である。

【図９】プラスミドｐＵ９Ｃ１Ｓの制限酵素切断点およ
び機能地図を示す図である。

【図１０】マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子を含
有するＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。

【図１１】マイシナマイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子を含
有するＤＮＡ断片の図１０に続く塩基配列を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:29） (Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも図１に示すアミノ酸配列をコ
   −ドするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列をコ−ドするＤ
   ＮＡが図２で示される請求項第１項のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項第１項記載のＤＮＡ配列を含有す
   る組換えプラスミド。
4. 【請求項４】 組換えプラスミドがプラスミドｐＵ８Ｃ
   １Ｓである請求項３記載の組換えプラスミド。