JPH06261765A - マクロライド抗生物質の生合成遺伝子を含有するｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 少なくともマクロライド抗生物質生産性放線
菌由来のマクロライド生合成遺伝子、例えばマイシナマ
イシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのアミノ
酸をコードする新規なＤＮＡ、該ＤＮＡ配列を保持する
プラスミド。 【効果】 マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼ遺伝子はこの遺伝子をベクタープラスミド
上にクローニングすることにより、このクローニングベ
クター系を用いてマイシナマイシンＩＩ生産菌に遺伝子
導入することができ、本遺伝子を導入された菌株は本酵
素活性の上昇によりそのマイシナマイシン生産力価を上
昇することが期待される。また本遺伝子をストレプトマ
イセス属に属するマクロライド抗生物質生産菌に導入す
ることにより、従来生産菌が生産し得なかった新規のマ
クロライド抗生物質を生産する新種放線菌の育種を可能
とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、少なくともマクロライ
ド抗生物質生産性放線菌由来のマクロライド生合成遺伝
子、例えばマイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼ遺伝子を含有する少なくとも図１に示すア
ミノ酸をコードする新規なＤＮＡ、該ＤＮＡ配列を保持
するプラスミドに関する。

【０００２】

【従来の技術】放線菌は多種多用の抗生物質や生理活性
物質等の二次代謝産物の生産菌として醗酵工業の分野で
は古くから重要な位置を占めており、種々の菌株改良技
術によりその生産性の改良が行なわれてきた。また近年
では有用二次代謝産物の生産性向上や新活性物質の創製
等、放線菌改良研究の１つとしてＤＮＡ組換え実験系の
確立が望まれており、現在までに放線菌の特定菌種では
宿主−ベクター系が確立されている。例えばマクロライ
ド抗生物質の生産に関与する遺伝子として、タイロシン
生合成遺伝子（特開昭６２−２７５６８６号公報）、ス
ピラマイシン生合成遺伝子（特開平２−３９８８９号公
報）、カルボマイシン生合成遺伝子（特開平２−７２８
８０号公報）、エリスロマイシン生合成遺伝子〔Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７２ Ｎ
ｏ. ５、２３７２−２３８３（１９９０）〕等の放線菌
遺伝子がクローニングされている。

【０００３】マイシナマイシンはミクロモノスポラ属放
線菌ミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５菌
株の生産する抗生物質であり、マイシナマイシンＩ、マ
イシナマイシンＩＩ、マイシナマイシンＩＩＩ、マイシ
ナマイシンＩＶおよびマイシナマイシンＶとして示され
る、１６員環の環状ラクトンおよび２個の糖残基からな
るマクロライド抗生物質であり〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、３３ Ｎｏ．４、３６４−
３７６（１９８０）〕、作用機構として細菌のリボソー
ムに結合し蛋白質合成阻害を引き起こすことによりグラ
ム陽性の菌種を始め、マイコプラズマ等にすぐれた抗菌
活性を示す抗生物質であり、その内マイシナマイシンＩ
Ｉが動物薬として使用されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ミクロモノスポラ属放
線菌も抗生物質を始めとする生理活性物質を生産する工
業的に有用な微生物であるが、この微生物を遺伝子工学
的に育種改良する試みとしての抗生物質生合成遺伝子ク
ローニング例はミクロモノスポラ・オリボアステロスポ
ラにおけるアミノ配糖体抗生物質アストロマイシン生合
成遺伝子のクローニング例〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２３６Ｎｏ. １、３９
−４８（１９９２）〕が報告されているが、マクロライ
ド抗生物質生産性のミクロモノスポラ属に属する微生物
の該抗生物質生合成遺伝子のクローニングについての報
告は無い。

【０００５】マイシナマイシン生合成遺伝子はベクター
プラスミド上にクローニングすることにより、このクロ
ーニングベクター系を用いてマイシナマイシンＩＩＩ−
Ｏ−メチルトランスフェラーゼ欠損株およびマイシナマ
イシンＩＩ生産株に本遺伝子を導入することができ、本
遺伝子を導入された菌株はマイシナマイシンＩＩ生産性
を回復し、さらに本酵素活性が上昇することによりマイ
シナマイシンＩＩの生産力価を上昇することを少なくと
も目的の１つとする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の点
に臨み、鋭意研究を行なった結果、先にマイシナマイシ
ン耐性遺伝子ｍｙｒＢ（特願平５−１４６４９号明細
書）を取得し、更にこれを用いることによってマイシナ
マイシンＩＶ水酸化酵素遺伝子（特願平５−４７６３８
号明細書）を得るとともに、本発明のマイシナマイシン
ＩＩＩをマイシナマイシンＩＶへ変換するマイシナマイ
シンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有す
るミクロモノスポラ・グリセオルビダ由来のマクロライ
ド抗生物質生合成遺伝子を含有したＤＮＡまたはそのＤ
ＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡおよびその組換え体
で形質転換された形質転換体を取得することに成功し
た。マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェ
ラーゼ活性を有しない微生物、例えばエシェリヒア・コ
リに該ＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入することに
より係る遺伝子が発現し、このマイシナマイシンＩＩＩ
−Ｏ−メチルトランスフェラーゼはマイシナマイシンＩ
ＩＩからマイシナマイシンＩＶへの変換を触媒する酵素
であって、該ＤＮＡを含有する組換えプラスミドを工業
生産に用いられる例えばミクロモノスポラ・グリセオル
ビダに導入することによりその遺伝子の増幅効果によっ
て、変換効率のよい株または単位基質（マイシナマイシ
ンＩＩＩ）あたりの変換時間の短い株の造成が期待でき
ることを見いだした。

【０００７】本発明は、上記の知見に基づいて完成され
たもので、少なくとも図１に示すアミノ酸配列をコード
するＤＮＡおよびこのＤＮＡ配列を含有するプラスミド
である。まず図１にマイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子のコードするアミノ酸配列
を、アミノ末端を先頭にして示す。図１にて表されるア
ミノ酸配列のアミノ末端側またはカルボキシル末端側
は、アミノ酸残基またはポリペプチド残基を含む場合で
あってもよく、アミノ末端であるＳｅｒの上流にはさら
に一個または複数のアミノ酸残基を有してもよく、その
アミノ酸残基またはポリペプチド残基としては、開始コ
ドンに相当するＭｅｔを始めとするアミノ酸残基や、シ
グナル様ペプチドが挙げられ、またカルボキシル末端側
Ａｌａの下流にはさらに一個以上のアミノ酸残基を有し
てもよい。Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａ
ｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓ
はシステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミ
ン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅ
はイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、
Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒ
ｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、
Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌは
バリンである。

【０００８】図２にマイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列を暗号配列の上
流の５’末端を先頭にして示す。マイシナマイシンＩＩ
Ｉ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子はそのコード
するアミノ酸配列のアミノ末端側またはカルボキシル末
端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めた各
アミノ酸に対応する一連の塩基コドンのうちいずれか一
個またはそれ以上のコドンを有するＤＮＡであってもよ
く、例えば図１０、１１にて示されるＤＮＡが図２のＤ
ＮＡを含む断片として簡便に利用できる。マイシナマイ
シンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の解
読鎖の配列は周知の塩基対の法則（ＡとＴが対になりＣ
とＧが対になる）によって得ることができる。配列中、
Ａはデオキシアデニル、Ｃはデオキシシチジル、Ｇはデ
オキシグアニル、Ｔはチミジル残基を示す。ＤＮＡ配列
には、本発明の理解を容易にするため番号を付した。

【０００９】本発明におけるマイシナマイシンＩＩＩ−
Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子はマクロライド抗
生物質生産能を有する微生物より得ることができる。例
えばミクロモノスポラ属放線菌であって、具体的にはミ
クロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５（Ｍｉｃ
ｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｉｄａＡ
１１７２５、ＦＥＲＭ ＢＰ−３２０２）等が用いられ
る。

【００１０】遺伝子の供与体である微生物に由来するＤ
ＮＡは次のようにして採取される。例えば、液体培地で
約２−３日間通気培養し、得られる培養物を遠心分離し
て集菌し、次いでこれを溶菌させることによってマイシ
ナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝
子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては例え
ばリゾチームやアクロモペプチダーゼ等の細胞壁溶解酵
素による処理が施され、他の酵素やラウリル硫酸ナトリ
ウム等の界面活性剤が併用される。このようにして得ら
れた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従っ
て、例えばフェノール抽出による除蛋白処理、プロテア
ーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿、遠
心分離等の方法を適宜組み合わせることにより行なうこ
とができる。

【００１１】抗生物質生産に関与する遺伝子は遺伝子群
を形成していることが知られており、さらには自己耐性
遺伝子の近傍領域に存在することが知られている〔Ｍａ
ｌｐａｒｔｉｄａ、Ｆ. ｅｔ ａｌ. 、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３０９、４６２−４６４（１９８４）〕。このため
生合成遺伝子をクローニングするためにはＤＮＡ断片を
耐性遺伝子と生合成遺伝子群を同時に含有するためにあ
る程度以上の分子量にする必要がある。そのため適当な
断片化が可能な制限酵素を選ぶことが必要であり、また
反応条件を変化させ部分消化させることによって好まし
いＤＮＡ断片を得ることができる。

【００１２】得られたＤＮＡ断片は、公知の方法（例え
ばアガロース電気泳動およびショ糖密度勾配法）によっ
て分離される。組換えＤＮＡの調製はこの分野における
通常の方法〔例えばＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ. 、ｅｔ ａ
ｌ. 、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８２）〕に準じて行なわれ、ベクター、
制限酵素等の種類に応じて適当な反応条件が選択され
る。

【００１３】本発明においては、ミクロモノスポラ・グ
リセオルビダＡ１１７２５から得られた染色体ＤＮＡを
制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにより部分消化し、約３５ｋｂｐ
−４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を分画し回収した。本発明の
宿主微生物としてはエシェリヒア・コリが用いられる。
ベクターとしてはエシェリヒア・コリで複製可能でかつ
選択マーカーを有するプラスミドベクター、コスミドベ
クター等が使用される。本発明ではコスミドベクターｐ
ＪＢ８を用い前述で得られたミクロモノスポラ・グリセ
オルビダＡ１１７２５染色体ＤＮＡをｐＪＢ８に結合し
た。結合産物をイン・ビトロ・パッケージング法により
ラムダファージ粒子に挿入し、得られたファージ粒子を
エシェリヒア・コリに形質導入することでミクロモノス
ポラ・グリセオルビダＡ１１７２５の遺伝子ライブラリ
ーを構築した。

【００１４】得られた遺伝子ライブラリーからマイシナ
マイシン耐性遺伝子を含有するＤＮＡ断片を有するクロ
ーンを選別することができる。マイシナマイシン耐性遺
伝子としてはすでにｍｙｒＢをクローニングしその有用
性が示されているが（特願平５−１４６４９号）、上記
で得られた遺伝子ライブラリーからマイシナマイシン耐
性遺伝子ｍｙｒＢの近傍領域をクローニングすることが
できる。すなわちこのライブラリーにｍｙｒＢを含有す
るＤＮＡ断片の放射性プローブをハイブリダイズするこ
とにより、ｍｙｒＢの一部または全部を含むＤＮＡ領域
を保持するクローンを得ることができる。

【００１５】その結果、得られたｍｙｒＢを含有するＤ
ＮＡ断片を保持する組換えプラスミドは制限酵素等によ
り適当な欠失を導入されたり、あるいは他のベクターへ
組換えられること（サブクローン化）により小型化する
ことができる。さらにプラスミド上にクローニングされ
たミクロモノスポラ・グリセオルビダ由来の遺伝子はエ
シェリヒア・コリ細胞内においてエシェリヒア・コリの
ベクターに保持されるプロモーター領域を利用し、また
はミクロモノスポラ・グリセオルビダに由来するプロモ
ーターにより発現することが可能である。そこで上記の
ようにして得られた組換えプラスミドによる形質転換体
からマイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェ
ラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングすること
ができる。

【００１６】マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトラ
ンスフェラーゼ活性の測定は公知の方法であるマクロシ
ン−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性測定法〔Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒ. ，２０、３７０−３７７（１９８１）〕に従い行な
った。本発明において、形質転換体中に発現したマイシ
ナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性
は菌体を破砕し無細胞抽出液を調製した後、基質である
マイシナマイシンＩＩＩにメチル基供与体であるＳ−ア
デノシルメチオニンからメチル基を転移する事で生成す
るマイシナマイシンＩＶを検出することで行なった。マ
イシナマイシンＩＶの確認は、薄層クロマトグラフィー
法を用いた生物検定や、さらに基質として放射性Ｓ−ア
デノシルメチオニンを用いた場合はラジオオートグラフ
ィーによって標品の移動度と比較することで行なった。
また高速液体クロマトグラフィー、融点、紫外吸収スペ
クトル、赤外吸収スペクトル、Ｘ線回析、マススペクト
ル等による解析により生成物質が同定される。

【００１７】その結果、図５に示されるプラスミドｐＳ
Ｆ９３０２を有する形質転換体にマイシナマイシンＩＩ
Ｉ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性が見いだされ
た。さらにプラスミドｐＳＦ９３０２に含有されるＤＮ
Ａ断片を制限酵素を用い小型化し、解析を行なったとこ
ろ、マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェ
ラーゼ活性発現に必要な領域はプラスミドｐＵ８Ｃ１Ｆ
に含有される、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切り出さ
れる約１. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片上に存在すると特定さ
れた。

【００１８】このようにして得られる本発明ＤＮＡの塩
基配列はＳｃｉｅｎｃｅ、２１４、１２０５−１２１０
（１９８１）に示されているジデオキシ法で解読し決定
することが出来る。マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含有
する約１. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列は、組換え
プラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓを移入して得られた形質転換体
エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＵ８Ｃ１Ｓ株＜工業
技術院生命工学工業技術研究所・受託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１３４５２＞を培養して調製した一本鎖ＤＮＡを鋳
型として図１０、１１の通り決定することができる。さ
らに決定されたＤＮＡ塩基配列中からオープンリーディ
ングフレームを検索することによりマイシナマイシンＩ
ＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の翻訳領域
を図２のように求め、かつこの塩基配列にコードされて
いる酵素のアミノ酸配列を図１に示す。

【００１９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらによって何ら限定されるもので
はない。

【００２０】

【実施例１】 ＜ミクロモノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５ 由
来ゲノムＤＮＡの調製＞ミクロモノスポラ・グリセオル
ビダＡ１１７２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２０２）を１０
ｍｌの１７２Ｆ培地 〔グルコース（和光純薬工業社
製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、可溶性
でんぷん（和光純薬工業社製）１０ｇ、カシトン（ディ
フコ社製）５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ（和光純薬工業
社製）２．５ｇ、およびＣａ( ＮＯ₃)₂ ・４Ｈ₂ Ｏ（和
光純薬工業社製）２ｇを蒸留水にて１ｌとし、ｐＨ７.
２に調製したもの、１２０℃で２０分間高圧滅菌する〕
に接種して２８℃で２日振騰培養した。次にこの培養液
５ｍｌを５０ｍｌの０. ２％のグリシン（和光純薬工業
社製）を含む１７２Ｆ培地に接種して、さらに２８℃で
２日間振騰培養した。

【００２１】培養菌体を、４℃、３, ０００ｒｐｍにて
１０分間遠心分離し、沈査を０. ３Ｍシュークロース
（和光純薬工業社製）５０ｍｌにて洗浄した。その後、
再び４℃、３, ０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、
ＳＴＥ緩衝液〔５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（以下トリスと略す）塩酸緩衝液（ｐＨ８.
０）（シグマ社製）、３５ｍＭ エチレンジアミン４酢
酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）（和光純薬工業社製）、２
５％シュークロース〕２０ｍｌにて懸濁し、最終濃度が
各々リゾチーム（生化学工業社製）２ｍｇ／ｍｌ、アク
ロモペプチダーゼ（和光純薬社製）１ｍｇ／ｍｌになる
ように添加して、３７℃にて１時間反応させた。その
後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（和光純
薬工業社製）を２ｍｌ添加後、３７℃にて５分間放置
し、フェノール・クロロホルム混液〔５００ｍｌのクロ
ロホルム（和光純薬工業社製）と５００ｇのフェノール
（和光純薬工業社製）および１．０ｇの８−ヒドロキシ
キノリン（ナカライテスク社製）をよく混合した後２０
０ｍｌの蒸留水を加えて振って得た下層を用いる〕２２
ｍｌを加えて攪拌した（以後この操作をフェノール抽出
と言う）。この溶液を、１８℃、１０, ０００ｒｐｍに
て１０分間遠心分離し、上層を１００ｍｌのビーカーに
とり、エタノール４４ｍｌを静かに流し入れた。更にこ
の液を、滅菌した細いガラス棒でかきまぜながらクロモ
ゾームＤＮＡを巻き取り、標品であるミクロモノスポラ
・グリセオルビダＡ１１７２５ のゲノムＤＮＡを得
た。

【００２２】得られた染色体ＤＮＡをＴＥ緩衝液〔１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ〕に溶解した。そのＤＮＡの２０μｇを制限酵素Ｓ
ａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）１０ｕで添付のマニュアルに
記載された条件により部分消化した後、シュークロース
密度勾配遠心により３５−４５ｋｂｐ長のＤＮＡを分画
し回収した。

【００２３】

【実施例２】 ＜コスミドライブラリーの作成＞ （１）イン・ビトロ パッケージング 実施例１で得られたＳａｕ３ＡＩで部分分解したミクロ
モノスポラ・グリセオルビダＡ１１７２５のゲノムＤＮ
Ａ１０μｇをアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ：宝酒
造社製）〔１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕１
０ｕで６５℃、１時間処理して切断末端を脱リン酸化し
た後（以後この操作をＢＡＰ処理と言う）、フェノール
抽出を２回繰り返した。１８℃、５分間、１５, ０００
ｒｐｍの遠心分離により得られた上層に１／１０容の３
Ｍ酢酸ナトリウムを加え２倍容のエタノールを加えて混
合し、−１１０℃にて２０分間放置した。４℃、１０分
間、１５, ０００ｒｐｍの遠心分離で得られるペレット
を７０％エタノールで洗浄し、真空下乾燥した（以後こ
の操作をエタノール沈殿と言う）。また２μｇのコスミ
ドｐＪＢ８（アマシャムジャパン社製）をそれぞれ別々
のチューブで４ｕの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩまたは４ｕ
の制限酵素ＳａｌＩ（共に宝酒造社製）で添付のマニュ
アルに示された方法で完全に切断し、それぞれを４ｕの
ＢＡＰで処理した。その後、フェノール抽出を２回繰り
返し、遠心分離で得られた水層をエタノール沈殿し切断
されたプラスミド断片を回収した。それぞれの制限酵素
で切断されたプラスミドを４ｕの制限酵素ＢａｍＨＩ
（宝酒造社製）により添付のマニュアルに示された方法
で完全に消化した後、電気泳動によりアガロースゲルか
らそれぞれ約５. ４ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片および約２. ３ｋｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断
片を透析チューブ内に溶出した。回収されたＤＮＡ断片
を含んだ溶液をフェノール抽出した後にエタノール沈殿
しＤＮＡ断片を回収した（以後この操作をアガロースゲ
ルからの回収と言う）。

【００２４】このようにして得られた各コスミド断片と
ＢＡＰ処理したミクロモノスポラ・グリセオルビダゲノ
ムＤＮＡの部分切断断片とを１つの容器に加え、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社製）〔６６ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、６６０μＭのＡＴＰ（ベーリン
ガー・マンハイム社製）〕３５０単位で、最終体積２０
μｌとして１６℃、１６時間ライゲーションした（以後
この操作をライゲーションと言う）。

【００２５】上記で得られたライゲーション溶液をイン
・ビトロ パッケージングキット（アマシャムジャパン
社製）を用い、添付のマニュアルに従ってパッケージン
グした。 （２）エシェリヒア・コリ ＤＨ１への形質導入 エシェリヒア・コリ ＤＨ１をＬ培地〔バクトトリプト
ン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ
１０ｇを蒸留水１ｌに溶解し１２０℃で２０分間高圧滅
菌する〕で３７℃、１６時間培養した。１００μｌの培
養液を０. ２％のマルトース（和光純薬工業社製）を含
むＬ培地１０ｍｌに植菌し３７℃で４時間振騰培養した
後３, ０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により細胞を
回収し、氷冷した１０ｍＭのＭｇＳＯ₄ を５ｍｌ加えて
懸濁した。

【００２６】この懸濁液６００μｌに上記で得られたパ
ッケージング溶液の希釈液３００μｌを混合し、３７℃
で１５分間静置した。その後１０ｍｌのＬ培地を加えて
３７℃で１時間振騰培養した。この培養液の１部をアン
ピシリンナトリウム（和光純薬工業社製）５０μｇ／ｍ
ｌを含むＬ培地に塗布し３７℃で１６時間培養し形質導
入コロニーを多数得た。

【００２７】

【実施例３】 ＜ｍｙｒＢをプローブとしたコロニーハイブリダイゼイ
ション＞ （１）放射性ＤＮＡプローブの作製 ｍｙｒＢ遺伝子を含有する約２. ６ｋｂｐのＤＮＡ断片
を１μｇのプラスミドｐＣ２４（特願平５−１４６４９
号、ＦＥＲＭ−１３３９３として寄託した菌株から常法
により抽出することができる）より制限酵素ＥｃｏＲＩ
（宝酒造社製）およびＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化する
ことにより切り出した。得られたＤＮＡ断片を〔α−³²
Ｐ〕ｄＣＴＰ（１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、３，０００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ、０. ３７ＭＢｑ／μｌ）（アマシャムジ
ャパン社製）とランダムプライマーラベリングキット
（宝酒造社製）を用い、添付のマニュアルに従って放射
性プローブを得た。すなわち、２本鎖ＤＮＡを熱処理に
より変性させ、数種の非特異的オリゴヌクレオチドとア
ニーリングさせた後、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ存在下でＫ
ｌｅｎｏｗ ＦｒａｇｍｅｎｔによりＤＮＡ合成反応を
行なわせることで放射活性を有するｍｙｒＢを含むＤＮ
Ａ断片を合成した。

【００２８】 （２）ｍｙｒＢ遺伝子含有クローンのスクリーニング 実施例２により得たコスミドライブラリーを、ナイロン
メンブレンフィルター( アマシャムジャパン社製、Ｈｙ
ｂｏｎｄ−Ｎ＋）にレプリカし、このフィルターを別の
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ平板寒天培
地上に、コロニーの付着した面が上になるように重ね、
３７℃で１６時間培養した。培養後、このフィルターを
アルカリ変性溶液〔０. ５ＮのＮａＯＨ、１. ５ＭのＮ
ａＣｌ〕で湿らせた濾紙の上にコロニー面が上になるよ
うに重ね５分間静置した。次にこのフィルターを中和溶
液〔０. ５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７. ２）、０.
００１ＭのＥＤＴＡ、１. ５ＭのＮａＣｌ〕で湿らせた
濾紙上に移し５分間静置した。この操作を再度繰り返し
た後に２×ＳＳＰＥで湿らせた濾紙上に移し、５分間静
置した後フィルターを自然乾燥した。このフィルターを
ハイブリダイゼーション溶液〔５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅ
ｎｈａｒｔ’ｓ溶液、０. ５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍ
ｌのサケ精子ＤＮＡ〔ファルマシア社製、使用直前に１
０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を１００℃、１０分間加温
し、直ちに氷で急冷し変性させた〕に浸し、６５℃で１
２時間保温した。ただし上記の溶液は以下の保存溶液を
希釈して用いた。 ２０×ＳＳＰＥ：３. ６ＭのＮａＣｌ、０. ２Ｍのリン
酸緩衝液（ｐＨ７. ７)、０. ０２ＭのＥＤＴＡ １００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液：２％ （Ｗ／Ｖ）
フィコール（分子量４００，０００、ファルマシア社
製）、２％ （Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドン（分子量
３６０，０００）、２％ （Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン
（ベーリンガー・マンハイム社製） 保温後、上記で調製された放射性ＤＮＡプローブを加
え、６５℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００２９】ハイブリダイゼーションの後、フィルター
を室温で洗浄液１〔２×ＳＳＰＥ、０. １％ＳＤＳ〕を
用いて１０分間ずつ２回洗った。さらに洗浄液２〔１×
ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ〕で１０分間ずつ２回洗浄し
た後フィルターを自然乾燥した。乾燥したフィルターを
Ｘ線フィルム（富士写真フィルム社製、ＮｅｗＲＸＯ−
Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオ
グラフィーを行った。オートラジオグラフィー終了後、
フィルムを現像し、ポジティブシグナルを示すコロニー
を複数取得した。そのうちの１クローンが保持するプラ
スミドｐＣＭＢ２０について制限酵素切断により解析
し、図３に示した。

【００３０】

【実施例４】 ＜プラスミドｐＳＦ９３０１、ｐＳＦ９３０２の構築＞
抗生物質生合成遺伝子は自己耐性遺伝子の近傍に存在し
ている事が知られているため耐性遺伝子ｍｙｒＢを含有
し制限酵素ＳａｃＩで切り出される約８.６ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片上にマイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子が存在するかを検討した。

【００３１】２μｇのプラスミドｐＣＭＢ２０を４ｕの
制限酵素ＳａｃＩで完全に消化した後にアガロースゲル
より約８. ６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。一方１μ
ｇのプラスミドｐＵＣ１１９を２ｕの制限酵素ＳａｃＩ
で完全に消化した後にフェノール抽出し遠心分離により
得られた水層から切断されたｐＵＣ１１９を回収した。
得られたｐＵＣ１１９切断物と上記で得た約８. ６ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を混合しライゲーションした後に、重定
らの方法〔細胞工学２、６１６−６２６（１９８３）〕
によってコンピテントセルとしたエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９を形質転換し図４、５に示すそれぞれ断片の
挿入方向の違うプラスミドｐＳＦ９３０１，ｐＳＦ９３
０２（それぞれ約１１．８ｋｂｐ）を構築した。

【００３２】

【実施例５】 ＜ｐＳＦ９３０１、ｐＳＦ９３０２による形質転換株の
マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラー
ゼ活性の測定＞ （１）無細胞抽出液の調製 実施例４で得られたプラスミドｐＳＦ９３０１、ｐＳＦ
９３０２による形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍ
ｌを含む１０ｍｌのＬ培地で３７℃、１４時間生育させ
た。この前培養液０. ２ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリン、５０μｇ／ｍｌのイソプロピル−β−Ｄ- チオ
- ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を含む１０
ｍｌの同じ培地に接種し３７℃で６時間培養した。培養
菌液から遠心分離により菌体を回収し、Ｔ１５緩衝液
〔５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、５ｍＭ
のＥＤＴＡ、１５％グリセロール、２ｍＭの２−メルカ
プトエタノール、１μｇ／ｍｌロイペプチン（シグマ社
製）、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ（シグマ社製）〕で
洗浄した後に同じ緩衝液で懸濁した。この菌懸濁液を超
音波破砕機により氷冷下で処理し菌体を破砕した。得ら
れた破砕液を１５, ０００ｒｐｍの遠心分離により菌体
破砕物を除去し上清を無細胞抽出液（１ｍｇ／ｍｌ蛋白
質）とした。

【００３３】（２）マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチ
ルトランスフェラーゼ活性の検出 上記で得られた無細胞抽出液１００μｌを１００μｌの
ＯＭＴ溶液〔５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７.
２）、４０ｍＭのＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、１５％グリセ
ロール、２０ｍＭジチオスレイトール、５０μＭのＳ−
アデノシル−Ｌ−（メチル− ³Ｈ）−メチオニン（１
８. ５ＧＢｑ／ｍｍｏｌ、３７ＭＢｑ／ｍｌ、アマシャ
ムジャパン社製）、１００μｇ／ｍｌマイシナマイシン
ＩＩＩ〕と混合した。３０℃、１５分間保温した後に３
５％ホルムアルデヒド溶液を５０μｌ加えることで反応
を停止した。さらに４０μｌの６ＮのＮａＯＨを添加し
た後４００μｌの酢酸エチルを加え、激しく混合した。
その後遠心分離により得られた酢酸エチル層を回収し、
その内の１００μｌを５ｍｌの液体シンチレーター（ア
トムライト：ＮＥＮ社製）に添加し、シンチレーション
カウンター（ＬＳＣ−７００：アロカ社製）でマイシナ
マイシンＩＩＩに取り込まれた ³Ｈ放射活性を測定し
た。

【００３４】（３）マイシナマイシンＩＶの同定 上記で ³Ｈの取り込みの認められたサンプルの酢酸エチ
ル層についてさらに解析し、マイシナマイシンＩＶの生
成を確認した。酢酸エチル層１００μｌ分をシリカゲル
薄層プレート（６０Ｆ２５４：メルク社製）に保持さ
せ、クロロフォルム：メタノール：アンモニア水＝１５
０：１０：１の組成の移動相で展開した。約１５ｃｍ展
開した後に風乾し各サンンプルのレーン毎に切り離し
た。さらにこのプレートを１０ｍｍ×５ｍｍの大きさに
切断し、それぞれをバイアル瓶に入れた。メタノール１
ｍｌで薄層プレートからマイシナマイシンを溶出した後
アトムライト５ｍｌを加え、シンチレーションカウンタ
ーで放射活性を測定し、放射活性を示す物質のＲｆ値を
求めた。

【００３５】また同じ薄層プレート上に標品のマイシナ
マイシンＩＶを保持させ、同様に展開、風乾した後に５
０％硫酸を噴霧し加熱することで呈色するマイシナマイ
シンＩＶのスポットを検出した。標品マイシナマイシン
ＩＶのＲｆ値と上記で得られた放射性マイシナマイシン
ＩＶのＲｆ値を比較することでマイシナマイシンＩＶを
同定した。

【００３６】その結果、表１に示す通り、プラスミドｐ
ＳＦ９３０２による形質転換体がマイシナマイシンＩＩ
Ｉ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有しており、
ｐＳＦ９３０１による形質転換体は活性を有していなか
った。この結果はマイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチル
トランスフェラーゼをエシェリヒア・コリにおいて発現
するためにはベクターに由来するプロモーターを必要と
することを示しているため、以後の組換えプラスミド構
築はベクターに対する方向性を考慮して行なった。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【実施例６】 ＜マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラ
ーゼ領域の特定−１＞実施例５で示したようにマイシナ
マイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ領域は
プラスミドｐＳＦ９３０２に含有されるＤＮＡ断片上に
存在することが明かと成ったため、この活性発現に必要
な領域をさらに限定した。 （１）ｐＣＭＢＣ１Ｈの構築 実施例３で得られた１μｇプラスミドｐＣＭＢ２０を２
ｕの制限酵素ＣｌａＩ（宝酒造社製）で添付のマニュア
ルの方法に従い完全に消化した後約２０ｋｂｐのＤＮＡ
断片をアガロースゲルから回収した。得られたＤＮＡ断
片溶液をフェノール抽出した後に遠心分離して得られた
水層からエタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。
この沈渣を１０μｌのポリメラーゼバッファー〔６７ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ８）、６. ７ｍＭのＭ
ｇＣｌ₂ 、１６. ６ｍＭの（ＮＨ ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール 、６. ７μＭのＥＤＴＡ、０.
０１６７％牛血清アルブミン、３３０μＭのそれぞれｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ（シグマ社製）〕
に懸濁しＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２ｕを
加え、３７℃、３０分間保温した。この反応液をフェノ
ール抽出した後にエタノール沈殿し、制限酵素処理で生
じた突出末端が埋められ平滑末端と成ったＤＮＡ断片を
回収した。

【００３９】上記で得られた沈渣を１μｇのＨｉｎｄＩ
ＩＩリンカー〔ｄ（ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ）〕（宝酒造社
製）を含むライゲーション溶液に溶解し、ライゲーショ
ンした。このライゲーション反応溶液をＨｉｎｄＩＩＩ
で消化した後に末端がＨｉｎｄＩＩＩ末端となった約２
０ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースから回収した。一
方、１μｇのプラスミドｐＴＹＳ５０７（特願平５−４
３６１７号、プラスミドｐＴＹＳ５０７を保持した菌株
はＦＥＲＭ Ｐ−１３４５４として寄託されている）を
２ｕの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した後にＢＡＰ処
理した。この溶液をフェノール抽出した後に遠心分離し
て得られた上層からエタノール沈殿により切断されたｐ
ＴＹＳ５０７を回収した。得られたプラスミド切断物と
アガロースから回収した末端をＨｉｎｄＩＩＩ末端に改
変したＣｌａＩ断片をライゲーションした後、実施例２
に示した方法でエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９に形質
導入した。得られたアンピシリン耐性菌はプラスミドｐ
ＣＭＢ２０のＣｌａＩ切断末端がＨｉｎｄＩＩＩと成っ
たＤＮＡ断片を含有する図６に示すプラスミドｐＣＭＢ
Ｃ１Ｈ（約４４ｋｂｐ）を有していた。さらに詳細な解
析の結果、得られたプラスミドが含有するＤＮＡ断片は
若干の欠失が起こっており、目的としたＤＮＡ断片より
も図３における挿入断片内のＨｉｎｄＩＩＩ部位側が約
５ｋｂｐ程短いものであった。

【００４０】（２）プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓの構築 プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｈを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全
に消化し、コスミドベクターが内部に含まれる約３２.
５ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。
このＤＮＡ断片をライゲーション後エシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９を形質転換しｐＣＭＢＣ１ＨからＥｃｏＲ
Ｉ断片の欠失した、約３. ３ｋｂｐのＤＮＡ断片を有す
る図７に示すプラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓ（約３２. ５ｋ
ｂｐ）を構築した。

【００４１】（３）プラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓ、プラスミ
ドｐＵ８Ｃ１ＧＨ、プラスミドｐＵ８Ｃ１Ｆの構築 プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓを制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、アガロースゲルから約
３. ３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。一方プラスミド
ｐＵＣ１１８を同様に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩで完全に切断した。その後、上記で得られた約
３. ３ｋｂｐのＤＮＡ断片と完全に切断したｐＵＣ１１
８をライゲーションし、そのライゲーション溶液でエシ
ェリヒア・コリ ＪＭ１０９を形質転換して図８に示す
プラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓ（約６．５ｋｂｐ、ＦＥＲＭ
Ｐ−１３４５２）を構築した。

【００４２】またプラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓでエシェリヒ
ア・コリ ＪＭ１１０を形質転換し、得られた形質転換
体からプラスミドを調製した。得られたプラスミドｐＣ
ＭＢＣ１Ｓを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＦｂａＩで
完全に消化し、アガロースゲルから約２. ７ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収した。一方プラスミドｐＵＣ１１８を制
限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し
た後反応液をフェノール抽出した。遠心分離により得ら
れた水層からエタノール沈殿により切断したｐＵＣ１１
８を回収した。上記で回収された約２. ７ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片と完全に消化したｐＵＣ１１８をライゲーション
した。そのライゲーション溶液によりエシェリヒア・コ
リ ＪＭ１０９を形質転換し図９に示すプラスミドｐＵ
８Ｃ１ＧＨ（約５. ９ｋｂｐ）を得た。

【００４３】またプラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化し、アガロース
ゲルから約１. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。一方
プラスミドｐＵＣ１１８を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＩで完全に消化した後反応液をフェノール抽出し
た。遠心分離により得られた水層からエタノール沈殿に
より切断したｐＵＣ１１８を回収した。上記で回収され
た約１. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片と完全に消化したｐＵＣ
１１８をライゲーションした。そのライゲーション溶液
によりエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９を形質転換しプ
ラスミドｐＵ８Ｃ１Ｆ（約４. ６ｋｂｐ）を得た。

【００４４】上記で得られたそれぞれプラスミドｐＵ８
Ｃ１Ｓ、ｐＵ８Ｃ１ＧＨ、ｐＵ８Ｃ１Ｆを有する形質転
換体を実施例５に示した方法によりマイシナマイシンＩ
ＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を測定したと
ころプラスミドｐＵ８Ｃ１ＳおよびプラスミドｐＵ８Ｃ
１Ｆを有する形質転換体はマイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ
−メチルトランスフェラーゼ活性を有していたがプラス
ミドｐＵ８Ｃ１ＧＨによる形質転換体には活性はなかっ
た。

【００４５】

【実施例７】 ＜マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子の塩基配列の決定＞実施例６に示した様にマ
イシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
遺伝子はプラスミドｐＵ８Ｃ１Ｆに含有される約１. ４
ｋｂｐのＤＮＡ断片上にコードされることが明かとなっ
た為この領域の塩基配列を決定した。実施例６で得られ
たプラスミドｐＵ８Ｃ１ＳおよびプラスミドｐＵ８Ｃ１
Ｓと同様のフラグメントを有しマルチクローニングサイ
トに対する方向性のみ異なるプラスミドｐＵ９Ｃ１Ｓ
（約６. ５ｋｂｐ）を、ベクタ−としてｐＵＣ１１９を
用いるほかは、実質的にｐＵ８Ｃ１Ｓの構築法と同様に
して構築した。これらのプラスミドによる形質転換体を
ビエイラらの方法〔Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ．ａｎｄ Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ、Ｊ．、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、１５３、３−１１（１９８７）〕に従って
培養し、１本鎖ＤＮＡを調製してシークエンス用鋳型と
して用いた。さらにこれら鋳型一本鎖ＤＮＡの塩基配列
情報をもとに新たな１７塩基残基からなり鋳型一本鎖Ｄ
ＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、シークエ
ンスのプライマーとして使用した。プライマー用オリゴ
ヌクレオチドはアール・エル・レッシンジャーらの方法
〔Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｗ．Ｂ．Ｌｕｒｓｆｏ
ｒｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔ
ｙ、９８、３６５５（１９７６）〕に基づきＤＮＡシン
セサイザー（ベックマン社製：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍ１ ｐｌｕｓ）を用い作製した。

【００４６】ＤＮＡシークエンスの方法は基本的にはサ
ンガーのｄｉｄｅｏｘｙ鎖末端法〔Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．
ｅｔ ａｌ. 、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４、５４６３−５４６７（１９７
７）〕に従い、Ｂｃａ−ＢＥＳＴシークエンスキット
（宝酒造社製) 及び〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰを用い、添付
のマニュアルの方法により決定した。決定したＤＮＡ配
列を図１０、１１に示す。その塩基配列についてビブら
の報告〔Ｍ．Ｊ．Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ. 、Ｇｅｎｅ、
３０、１５７−１６６（１９８４）〕に従って検討した
結果、オープンリーディングフレームが存在することが
明かとなった。決定したオープンリーディングフレーム
を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図１２、１３に示した。
さらにこの結果により、マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−
メチルトランスフェラーゼ遺伝子として決定された塩基
配列を図２に示し、その塩基配列がコードするアミノ酸
配列を図１に示した。

【００４７】

【発明の効果】本発明のマイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−
メチルトランスフェラーゼ遺伝子はこの遺伝子をベクタ
ープラスミド上にクローニングすることにより、このク
ローニングベクター系を用いてマイシナマイシンＩＩ生
産菌に遺伝子導入することができる。本遺伝子を導入さ
れた菌株は本酵素活性の上昇によりそのマイシナマイシ
ン生産力価を上昇することが期待される。また本遺伝子
をストレプトマイセス属に属するマクロライド抗生物質
生産菌に導入することにより、従来生産菌が生産し得な
かった新規のマクロライド抗生物質を生産する新種放線
菌の育種を可能とする。さらに本遺伝子をＤＮＡプロー
ブとして使用することにより、各種微生物から同様の酵
素活性を有する酵素に対する遺伝子をクローニングする
ことができる。また遺伝子クラスターをなしている抗生
物質生合成遺伝子中の類似遺伝子をクローニングするこ
とにより、そのクラスター中に含まれる新規遺伝子をク
ローニングすることができる等既知物質の収量の増大、
並びに新規抗生物質および抗生物質誘導体の開発を目的
とする多くの有用な用途を提供する。

【００４８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミクロモノスポラ グリセオルビダ（Ｍｉｃｒ
ｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｇｒｉｓｅｏｒｕｂｉｄａ） 株名Ａ１１７２５ 配列の特徴 ４６７−１２２５ 配列 GAATTCTGAC GGGAAGTATT GCATCGACAG GAATCACATA GCAACAGTGT GGTTTGGATC 60 ACACCCGGGT GTGTGATCTC AACCGGAGAA CGCCCTGTAC GCAGACAGGA CTAAGACGTC 120 CATCGCCACC CGCATCCGCA TACAACACTG CATTGGGATA TGTCAATATG TTGAAACATG 180 TTTGAAGAAA CGCCCCCACC GTTGGACGAC CACCTCGGCC CCGGGGTAGG CTCGCGTGAT 240 GCCCGACACG GCGACGAATA GACGGACACA TCCTGCGATG TTCCCGAAAC TCGTCGAGTG 300 TCGCCGCTGA GCTGTGCAGA CAACGTGGCT GCGAAACCGA TGCGGTGATG TTTCTCGGGG 360 TTCAGCGCAT CCAGGACCGG AGTCGTGTCC CCGGTCAACC CGGACGCAAC AGGGCAACGG 420 CCGCAGCCTG AGTCGCCCAC CAGGCAAGGA GGTATTTCTG CCC ATG AGC CCG TCG 475 Ser Pro Ser 1 ACC GGA GTG GAA CTC TAC CTG GAC CTG CTG AAG AGA ACG GTC TCG AAC 523 Thr Gly Val Glu Leu Tyr Leu Asp Leu Leu Lys Arg Thr Val Ser Asn 5 10 15 TTC ATC TAC CAG GAC GCC ACT CAC GTG GCC GGC CTG ATC ACC GAG GCC 571 Phe Ile Tyr Gln Asp Ala Thr His Val Ala Gly Leu Ile Thr Glu Ala 20 25 30 35 GCG TTC GTC GAA GAG GCC AGG GAG TCG GGC GAG GAT TAT CCG ACC GTG 619 Ala Phe Val Glu Glu Ala Arg Glu Ser Gly Glu Asp Tyr Pro Thr Val 40 45 50 GCG CAC ACC ATG ATC GGA ATG AAA CGG CTG AAC AAC CTC CAA CAC TGC 667 Ala His Thr Met Ile Gly Met Lys Arg Leu Asn Asn Leu Gln His Cys 55 60 65 GTC GAA AGC GCC CTG CGG GAC GGC GTT CCC GGC GAC GTG CTG GAG ACC 715 Val Glu Ser Ala Leu Arg Asp Gly Val Pro Gly Asp Val Leu Glu Thr 70 75 80 85 GGC GTC TGG CGG GGC GGG GCC TGC ATC TTC GCC CGC GGC ATC CTC AAG 763 Gly Val Trp Arg Gly Gly Ala Cys Ile Phe Ala Arg Gly Ile Leu Lys 90 95 100 GCG TAC GAC GTC CGT GAC CGG ACG GTG TGG GTC GCC GAC TCG TTC CAG 811 Ala Tyr Asp Val Arg Asp Arg Thr Val Trp Val Ala Asp Ser Phe Gln 105 110 120 GGC TTC CCG AAG ATC ACC GAC GAC GAC CAC CCG ATG GAC GCG GAG ATG 859 Gly Phe Pro Lys Ile Thr Asp Asp Asp His Pro Met Asp Ala Glu Met 125 130 135 AAC CTC CAC CAG TAC AAC GAG GCG GTC GAT CTG CCG ACC AGC CTG GCT 907 Asn Leu His Gln Tyr Asn Glu Ala Val Asp Leu Pro Thr Ser Leu Ala 140 145 150 ACC GTC CAG CGG AAC TTC AGC CGC TAC GGT CTC CTC GAC GAC CAG GTG 955 Thr Val Gln Arg Asn Phe Ser Arg Tyr Gly Leu Leu Asp Asp Gln Val 155 160 165 170 CGG TTC CTG CCC GGC TGG TTC AAG GAC ACC ATG CCC ACC GCG CCG TTC 1003 Arg Phe Leu Pro Gly Trp Phe Lys Asp Thr Met Pro Thr Ala Pro Phe 175 180 185 GAA CGG CTC GCG GTA CTC CGG ATG GAC GGC GAC TCC TAC GGC GCC ACC 1051 Glu Arg Leu Ala Val Leu Arg Met Asp Gly Asp Ser Tyr Gly Ala Thr 190 195 200 ATG GAC GTG CTC ACC CAC GCC TAC CCG AGA CTG TCC CCC GGC GGT TTC 1099 Met Asp Val Leu Thr His Ala Tyr Pro Arg Leu Ser Pro Gly Gly Phe 205 210 215 GCG ATC ATC GAC GAC TAC TGC ATC CCC GCC TGC CGG GAG GCC GTC CAC 1147 Ala Ile Ile Asp Asp Tyr Cys Ile Pro Ala Cys Arg Glu Ala Val His 220 225 230 GAG TAC CGT GAC CGG CAC GGC ATC TCC GAC GAG ATC GTC GAG ATC GAC 1195 Glu Tyr Arg Asp Arg His Gly Ile Ser Asp Glu Ile Val Glu Ile Asp 235 240 245 250 CGG CAG GGT GTC TAC TGG CGT CGC TCG GCC TGACGTTCCC GGTCCACTGC 1245 Arg Gln Gly Val Tyr Trp Arg Arg Ser Ala 255 260 CGGCGGTCGG GTCGATCCGG CCCGACCACC GGCGCCTGTC ACCACACGAC CGGCAGCTCG 1305 AGTGGGCCAC GCAGCAACAT CCCTTCGCTC CACCGCAGCT GCGTCTCGGG AATCCCCAGC 1365 CGGATCC 1372

【図面の簡単な説明】

【図１】マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランス
フェラーゼ遺伝子のコードするアミノ酸配列を示す図で
ある。

【図２】マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトランス
フェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す図である。

【図３】プラスミドｐＣＭＢ２０の制限酵素切断点およ
び機能地図を示す図である。

【図４】プラスミドｐＳＦ９３０１の制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図５】プラスミドｐＳＦ９３０２の制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図６】プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｈの制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図７】プラスミドｐＣＭＢＣ１Ｓの制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図８】プラスミドｐＵ８Ｃ１Ｓの制限酵素切断点およ
び機能地図を示す図である。

【図９】プラスミドｐＵ８Ｃ１ＧＨの制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図１０】プラスミドｐＵ８Ｃ１Ｆの制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図１１】プラスミドｐＵ９Ｃ１Ｓの制限酵素切断点お
よび機能地図を示す図である。

【図１２】マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を
示す図である。

【図１３】マイシナマイシンＩＩＩ−Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の図１２に続
く塩基配列を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:29） (Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも図１に示すアミノ酸配列をコ
   ードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列をコードするＤ
   ＮＡが図２で示される請求項第１項のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項第１項記載のＤＮＡ配列を含有す
   る組換えプラスミド。
4. 【請求項４】 組換えプラスミドがプラスミドｐＵ８Ｃ
   １Ｓである請求項３記載の組換えプラスミド。