SU1532585A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 33, кодирующа метилазу S @ 11, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент метилазы S @ 11 - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представл ет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обусловливающую синтез метилазы SSOLL, и штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК - продуцент метилазы SSOLL. Целью изобретени   вл етс  получение штамма, продуцирующего только метилазу SSOLL без сопутствующей рестриктазы, а также увеличение уровн  синтеза метилазы SSOLL в клетках бактерий. Получен штамм, продуцирующий только метилазу SSOLL без рестриктазы, и повышен уровень синтеза метилазы SSOLL в клетках бактерий в 40 раз по сравнению с используемым ранее. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности, к генной инженерии .

Целью изобретени  . вл етс  получение штамма, продуцирующего только метипазу Sso II, без сопутствующей рестриктазы, а также увеличение уровн  синтеза метилазы Sso II в клетках бактерий.

Сущность изобретени  состоит в том, что получена рекомбинантна  плазмидна  ДНК, обуславливающа  синтез метилазы Sso II,и штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК - продуцент метилазы Sso II.

Полученна  плазмида d 33 состоит из следующих элементов: плазмидна  ДНК вектора pUC19, размер которой

2,69 т.п.о., плазмидна  ДНК Р4 из S. sonnei 47, кодирующа  метилазу Sso II, размер которой 4,4 т.п.о.

Способ конструировани  плазмиды заключаетс  в том, что плазмидную ДНК вектора PUC19 гидролизуют эндо- нуклеазой рестр}псции BamHI и соедин ют ДНК-лигазой с плазмидной ДНК Р4 гидролизованной рестриктазой Bgl II. Затем смесь соединенных фрагментов ДНК обрабатывают рестриктазой Ват KI и трансформируют в клетки Е. соП

О1 00 I4S

Сл 00

PS200. Трансформанты высевают на сре- д/ с ампициллином и из выросших клонов Взщел ют плазмиду, обозначенную как d 33..

Используют штамм бактерий Е. coli BJ834 (Гд, тр, несущий плазмиду d 33 И продуцируют метилазу 5sо II.

Штамм-продуцент метилазы Sso II

Полученной смесью трансформируют клетки Е. coli pS 200, дл  чего 50 мкл суспензии Е. coli PS 200 вно- с т Б 20 мл питательного бульона LB, выращивают до титра 7x10 кл/мл при во флаконе объемом 200 мл. После чего суспензию клеток охлаждают во льду в течение 10 с и центрифугируют

получен трансформацией клеток Е. coli JQ при 5000 g 15 мин при 4 С Суперна ,11834плазмидой d33. Содержание метилаз

so II в сконструированном штамме laBHo 300000 ед. на 1 г биомассы клеток ..

Пример. . Получение плазмиды dl 33. Плазмидную ДНК из штамма Е, coli XS13, содержащую две гпазмиды: Р4 (2,8 МЛ) и Р9 (100 МД), выдел ют щелочным методом. Шгазмид- ьую TpIK Р4 отдел ют от высокомоле- кул рной ЛНК Р9 с помощью хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Качество р азделени  плазмид анализируют эле- ктрофорезом. В очищенных препаратах глазмидной ДНК Р4 присутствие плаз- Р9 не вы вл етс .

Плазмиднуго ДНК Р4 и ДНК вектора IUC19 используют дл  конструировани  глазмиды d 33, которое провод т сле- д:.У1ощим образом: 0,5 мкг вектора pU (11.9 инкубируют с эндонуклеазой рестрикции Ват HI (5 ед.) в буфере А 100 мМ NaCl, 50 мМ трис-НС1, рН ,5, 10 мМ MgCl, 1 мМ дитиотрейтол)

мкг плазмидной ДНК Р4 инкубируют с рестриктазой Bgl II (10 ед.) в бу пере 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 1 IlgCl г, 1 мМ дитиотрейтол. Инкубацию провод т при 37°С в течение 1 ч. ;атем пробы прогревают в течение

5 мин при 65 с и анализируют полно- гу гидролиза с помощью электрофореза Соединение ДНК плазмиды и вектора провод т в буфере, содержал ем 0,05 М

фИс-HCl, рН 7,4, 0,01 MMgCl.,, 0,,01 М 45 рестрикционному анализу.

Характеристика щтамма

.щтиотрейтол, 0,1 мМ АТФ ДНК-лигазу ij)ara Т4 (100 ед/мп) добавл ют из засчета 0.,5 мкл ферментЯ на 5 мкг ДНК. Лробу инкубирзпот 12 ч при 10°С.

Затем в смесь соединенных фрагмен- сп санному в примере, получают штаммtroB добавл ют 1 мкг 0,5 М ЭДТА, экс- |грагируют равным объемом хлороформа, ереосаждают 2,5 объемами этанола, по- рле растворени  осадка ДНК пробу ин- убируют 12 мин при 65°С и обрабаты-- j, ают 10 ед. рестриктазы BatiiHl в буфе- |ре А в течение 1 ч при 37°С с целью |обогащени  смеси соединенных фраг- Центов гибридными молекулами ДНК,

продуцент метилазы Sso II.с активностью не менее 300000 ед/г биомассы клеток.

Штамм Escherichia coli В834, несущий плазмиду d 33 (гg, m) - продуцент метилазы Sso II характеризуетс  следующими признаками.

Культурально-формологические приз наки.

тант сливают. Осадок суспендируют в 1/2 объема 0,1 М CaCl После 40 мин инкубации во льду клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют осадок в 0,5 мл 0,1 М CaCl. Суспензию клеток выдерживают во льду 10- 12 ч, затем используют дл  трансформции .

К 200 мкл суспензии клеток в CaCl добавл ют 20 мкл смеси соединенных фрагментов ДНК и выдерживают 40 мин во льду, затем на 90 с помещают в лед ную баню с температурой 42°С, после чего еще на 2 мин в лед. Суспензию развод т в 10 раз бульоном LB и инкубируют 1 ч при , после чего высевают на чашки с ампициллином (50 мкг/мп). Из выросщих клонов вьщел ют плазмидную ДНК. обозначенную как d 33 э содержащую в своем составе вектор pUC1 95 несущий ген Ыа, который детерминирует синтез р-лактамазы и плазмидную ДНК Р4, несущую ген метилазы Sso II, определ ющий синтез метилазы Sso II, Сайт узнавани  рестриктазы Bgl II лежит. вну-Три последовательности гена рестриктазы Sso II, поэтому при клониро- вании происходит встраивание внутрь гена рестриктазы ДНК вектора pUC19, разобщающей этот ген, и синтеза рестриктазы Sso II в клетках, несзщих плазмиду d 33, не происходит.

Плазмидную ДНК d 33 подвергают

Характеристика щтамма.

Плазмиду d 33 трансформируют в штамм Е. coli В834 по методу, опипродуцент метилазы Sso II.с активностью не менее 300000 ед/г биомассы клеток.

Штамм Escherichia coli В834, несущий плазмиду d 33 (гg, m) - продуцент метилазы Sso II характеризуетс  следующими признаками.

Культурально-формологические признаки .

Клетки пр мые, палочковидные, неподвижные , грамотрицательные, лакто- зопозитивные. При рассеве на чашки с 1,3%-ным МПА рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными кра ми. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (МПА, МПВ, LB-бульон и LB-arap).

Физиолого-бйохимические признаки. . Клетки растут в пределах 4-45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, лактозу, маннит с образованием кислоты, не .разлагает сахарозу, сбраживает мальтозу, ксилозу , сорбит, дульцит, рамнозу, образует индол и сероводород.

Про вл ет устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды d 33.

Уровень синтеза метилазы анализи- следукндим образом.

Культуру клеток E.coli В834, не- .сущих плазмиду d 33, выращивают в 1 л среды LB с 50 мкг/мл ампициллина при до титра 4 х 10 кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 0,1 М NaCl, 7 мМ 2-медкаптоэтанол, 100 мкг/мл лизоцима и выдерживают при 10 мин. Клетки разрушают ультразвуком . Экстракт получают центрифугированием при (48000 g) в течение часа.

Активность метилазы Sso II определ ют в реакционной смеси с общим объемом 100 мкл, содержащей 1 мкг акцепторной ДНК, 0,5 мк S-аденозилме- тионина и 5 мкл каждого из дес тикратных разведений супернатанта. Инкубацию провод т в течение различных вре1 . Рекомбинантна  ппазмидна  7ШК d 33, кодирующа  метипазу Sso II, молекул рной массой 4,5 МД и размером 7,1 т.п.о., содержаща  плазмидную ДНК вектора PU С19 размером 2,7 т.п.о плазмиднуш ДНК Р4 с геном метилазы Sso II размером 4,4 т.п.о один учаменных промежутков от 1 до 24 ч при . Пробы нанос т на фильтры GF/C, 45 разщеплени  эндонуклеазами С1а I, осаждают 5%-ной трихлоруксусной кисло- EcoR V, Sac 11, Pst I, Sph I, Hind III, той, отмывают 70%-ным этанолом, высушивают и просчитьгоают радиоактивность в толуоловом сцинтилл торе. За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, обеспечивающего полную модификацию 1 мкг

S ас I, Крп I, Sma I. ХЪа I, участка расщеплени  Cfr 101, SalG I, четыре участка расщеплени  EcoR I, Bla ген, 50 кодирующий -лактамазу,фрагменту гена lac, соединенные с синтетическим полилинкером, расположенные по обе стороны клонированной ДНК Р4, ген метилазы Sso II, расположенный на клонированной ДНК плазмиды Р4, детерминирующей синтез метилазы Sso II, последовательность гена рестриктазы Sso. II j. состо щую из двух фрагментов, расположенных по обе стороны ДНК вектора .

акцепторной /ЩК за 24 ч.

Уровень активности метилазы, определенный в штамме Е. coli Б834, не- сущем d 33, соответствует 300000 ед. на 1 кг биосмассы.

Ниже приведены значени  уровней синтеза метилазы Sso II в штаммах

Е. coli, трансформированных плазми- . дои d 33.

ШтаммАктивность метилазы , ед/г

E.coli PS 200/d33 10000 E.coli B834/d33 300000

Рекомбинантна  плазмида d 33 представл ет собой высококопийную, имеющую удобный селективный маркер, векторную молекулу, несущую ген метилазы Sso II. Плазмида d 33 может служить основной дл  проведени  работ, имеющих теоретическое значение - дл  изу- чеНй  характера метилировани  Sso II и определени  первичной структуры гена метилазы, а также дл  практических работ по созданию суперпродуцентов метилазы Sso II.

Штамм бактерий Escherichia coli В834, трансформированный плазм1-щой d 33,  вл етс  эффективным про.дуцен- том метилазы Sso II (уровень активности метилазы - 300000 ед. на 1 г биомассы). При этом в штамме. E.coli В834 не продуцируетс  рестриктаза Sso II. сопутствующа  метилазе Sso II, близка  по физико-химическим параметрам к белку метилазы Sso II. Этот факт позвол ет при работе с этим штаммом использовать наиболее легкую технологически схему очистки метилазы Sso II.

рмула изобретени 

40

1. Рекомбинантна  ппазмидна  7ШК d 33, кодирующа  метипазу Sso II, молекул рной массой 4,5 МД и размером 7,1 т.п.о., содержаща  плазмидную ДНК вектора PU С19 размером 2,7 т.п.о плазмиднуш ДНК Р4 с геном метилазы Sso II размером 4,4 т.п.о один уча45 разщеплени  эндонуклеазами С1а I, EcoR V, Sac 11, Pst I, Sph I, Hind III

разщеплени  эндонуклеазами С1а I, EcoR V, Sac 11, Pst I, Sph I, Hind III,

S ас I, Крп I, Sma I. ХЪа I, участка расщеплени  Cfr 101, SalG I, четыре участка расщеплени  EcoR I, Bla ген, кодирующий -лактамазу,фрагменту гена lac, соединенные с синтетическим полилинкером, расположенные по обе стороны клонированной ДНК Р4, ген метилазы Sso II, расположенный на клонированной ДНК плазмиды Р4, детерминирующей синтез метилазы Sso II, последовательность гена рестриктазы Sso. II j. состо щую из двух фрагментов, расположенных по обе стороны ДНК вектора .

PU

СПС

эы

715325858

С19, котора , таким образом, не . 2. Штамм бактерий Escherichia coli 1собна определ ть синтез рестрикта- ГИСК, В834 - продуцент метипазы Sso II.Sso II.

Claims (2)

1. Формула изобретения

   1. Рекомбинантная ппазмидная ДНК d 33, кодирующая метипазу Sso II, молекулярной массой 4,5 МД и размером 7,1 т.п.о., содержащая плазмидную ДНК вектора PU С19 размером 2,7 т.п.о плазмидную ДНК Р4 с геном метилазы Sso II размером 4,4 т.п.о один участок разщегшения эндонуклеазами Cla I, EcoR V, Sac II, Pst I, Sph I, Hirai III, S ас I, Kpn I, Sma I, Xba I, участка расщепления Cfr 101, SalG I, четыре участка расщепления EcoR I, Bia ген, кодирующий β-лактамазу,фрагменты гена lac, соединенные с синтетическим полилинкером, расположенные по обе стороны клонированной ДНК Р4, ген метилазы Sso II, расположенный на клонированной ДНК плазмиды Р4, детерминирующей синтез метилазы Sso II, последовательность гена рестриктазы Sso.II; состоящую из двух фрагментов, расположенных по обе стороны ДНК вектора

   Ί

   PU C19, которая, таким образом, не способна определять синтез рестриктазы

   Sso II.
2. 2. Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК, В834 - продуцент метилазы Sso II.