JPH074257B2 - 新規なプラスミド - Google Patents
新規なプラスミドInfo
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- JPH074257B2 JPH074257B2 JP58107842A JP10784283A JPH074257B2 JP H074257 B2 JPH074257 B2 JP H074257B2 JP 58107842 A JP58107842 A JP 58107842A JP 10784283 A JP10784283 A JP 10784283A JP H074257 B2 JPH074257 B2 JP H074257B2
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- JP
- Japan
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- plasmid
- tryptophan
- fraction
- medium
- gene
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- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はトリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝
子を含む画分を有する新規なプラスミドに関し、さらに
詳しくは、宿主内に安定に維持することのできる、トリ
プトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む画
分、例えばトリプトフアンオペロンを有するプラスミド
に関する。
子を含む画分を有する新規なプラスミドに関し、さらに
詳しくは、宿主内に安定に維持することのできる、トリ
プトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む画
分、例えばトリプトフアンオペロンを有するプラスミド
に関する。
トリプトフアンオペロンのクローニングについては従来
からいろいろと研究されているが、例えばJournal of G
eneral Microbiology,Vol.118,253（1980）に記載され
ているように、宿主内での安定性に問題があり、トリプ
トフアンの工業的製造に応用するには多くの困難がある
と考えられている。
からいろいろと研究されているが、例えばJournal of G
eneral Microbiology,Vol.118,253（1980）に記載され
ているように、宿主内での安定性に問題があり、トリプ
トフアンの工業的製造に応用するには多くの困難がある
と考えられている。
一方、プラスミドの宿主内での安定性において、応用的
に最も重要な要素は一般に宿主の継代培養におけるプラ
スミドの脱落現象である。そのため、従来よりプラスミ
ドの脱落を防止するために種々の試みがなされており、
例えば、エシエリヒア属のストレプトマイシンに依存し
ないという性質を司る染色体遺伝子DNAフラグメントが
組み込まれたプラスミドを、エシエリヒア属のストレプ
トマイシン依存性変異株に含有せしめて、プラスミドを
含有する微生物の性質を安定する方法が提案されている
（特開昭55−156591号公報）。しかしながら、かかる方
法は経済的に問題があるのみならず、目的のプラスミド
に複雑な機能を組み込む必要があるため、宿主の分裂増
殖時にプラスミドが安定に娘細胞に分配され難いことが
予想され、工業的に応用するにはかなりの問題がある。
に最も重要な要素は一般に宿主の継代培養におけるプラ
スミドの脱落現象である。そのため、従来よりプラスミ
ドの脱落を防止するために種々の試みがなされており、
例えば、エシエリヒア属のストレプトマイシンに依存し
ないという性質を司る染色体遺伝子DNAフラグメントが
組み込まれたプラスミドを、エシエリヒア属のストレプ
トマイシン依存性変異株に含有せしめて、プラスミドを
含有する微生物の性質を安定する方法が提案されている
（特開昭55−156591号公報）。しかしながら、かかる方
法は経済的に問題があるのみならず、目的のプラスミド
に複雑な機能を組み込む必要があるため、宿主の分裂増
殖時にプラスミドが安定に娘細胞に分配され難いことが
予想され、工業的に応用するにはかなりの問題がある。
そこで、本発明者らは、トリプトフアンシンターゼの生
合成を司る遺伝子を含む画分、例えばトリプトフアンオ
ペロンを、親細胞から娘細胞へと継代的に安定に分配す
ることを可能にする機能をもつプラスミドについて鋭意
研究を行なつた。その結果、本発明者らは、Ｆ因子プラ
スミド（又はＦプラスミド）は通常細胞染色体当り１〜
２個のコピー数しかもたないが、細胞分裂時に安定に娘
細胞に受け継がれていく機構を有していることに着目
し、このＦ因子プラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝
子を含む画分と、上記のトリプトフアンシンターゼの生
合成を司る遺伝子を含む画分とを組合せることにより、
本発明を完成するに至つた。
合成を司る遺伝子を含む画分、例えばトリプトフアンオ
ペロンを、親細胞から娘細胞へと継代的に安定に分配す
ることを可能にする機能をもつプラスミドについて鋭意
研究を行なつた。その結果、本発明者らは、Ｆ因子プラ
スミド（又はＦプラスミド）は通常細胞染色体当り１〜
２個のコピー数しかもたないが、細胞分裂時に安定に娘
細胞に受け継がれていく機構を有していることに着目
し、このＦ因子プラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝
子を含む画分と、上記のトリプトフアンシンターゼの生
合成を司る遺伝子を含む画分とを組合せることにより、
本発明を完成するに至つた。
しかして、本発明によれば、 （１）大腸菌のトリプトフアンオペロンに由来するトリ
プトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む画分
と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る
遺伝子を含むmini−Ｆ画分とを有することを特徴とする
組換えプラスミド、 （２）該組換えプラスミドで形質転換された大腸菌、及
び （３）該大腸菌の培養物又はその処理物の存在下に、イ
ンドールとＬ−又はDL−セリンとを反応させて反応液中
にＬ−トリプトフアンを生成せしめ、該反応液からＬ−
トリプトフアンを採取することを多特徴とするＬ−トリ
プトフアンの製造方法が提供される。
プトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む画分
と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る
遺伝子を含むmini−Ｆ画分とを有することを特徴とする
組換えプラスミド、 （２）該組換えプラスミドで形質転換された大腸菌、及
び （３）該大腸菌の培養物又はその処理物の存在下に、イ
ンドールとＬ−又はDL−セリンとを反応させて反応液中
にＬ−トリプトフアンを生成せしめ、該反応液からＬ−
トリプトフアンを採取することを多特徴とするＬ−トリ
プトフアンの製造方法が提供される。
本発明のプラスミドを構成する「トリプトフアンシンタ
ーゼの生合成を司る遺伝子を含む画分」（以下「Ｔ画
分」と略称することがある）とは、インドールとＬ−又
はDL−セリンからＬ−トリプトフアンの生合成を司る遺
伝子を含む画分を意味し、しかして、Ｔ画分にはトリプ
トフアンオペロン又はトリプトフアンオペロンを含むも
つと大きな遺伝子画分、或いは、トリプトフアンオペロ
ン中のトリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子
であるTrp AとTrp Bにプロモータ及びオペレーターを結
合した画分、又はTrp AとTrp BにTrp C、Trp D及びTrp
Eの少なくとも１種とプロモーター及びオペレーターを
結合した画分（例えば、Trp A、Trp B、Trp C及びTrp E
にプロモーター及びオペレーターが結合した画分）等が
包含される。これらのＴ画分としては実用的には大腸菌
由来のものが好適に使用され、中でも、トリプトフアン
オペロンそれ自体及びフアージφ80ptの遺伝子を制限酵
素Bam HIにより切断して得られる約22.6kbの分子量を有
するトリプトフアンオペロンを含む画分が有利に使用さ
れる。
ーゼの生合成を司る遺伝子を含む画分」（以下「Ｔ画
分」と略称することがある）とは、インドールとＬ−又
はDL−セリンからＬ−トリプトフアンの生合成を司る遺
伝子を含む画分を意味し、しかして、Ｔ画分にはトリプ
トフアンオペロン又はトリプトフアンオペロンを含むも
つと大きな遺伝子画分、或いは、トリプトフアンオペロ
ン中のトリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子
であるTrp AとTrp Bにプロモータ及びオペレーターを結
合した画分、又はTrp AとTrp BにTrp C、Trp D及びTrp
Eの少なくとも１種とプロモーター及びオペレーターを
結合した画分（例えば、Trp A、Trp B、Trp C及びTrp E
にプロモーター及びオペレーターが結合した画分）等が
包含される。これらのＴ画分としては実用的には大腸菌
由来のものが好適に使用され、中でも、トリプトフアン
オペロンそれ自体及びフアージφ80ptの遺伝子を制限酵
素Bam HIにより切断して得られる約22.6kbの分子量を有
するトリプトフアンオペロンを含む画分が有利に使用さ
れる。
本発明は前述したように、上記のＴ画分を、Ｆ因子プラ
スミドの増殖制御分配系を司る遺伝子を含む画分と組合
わせる点に特徴を有する。Ｆ因子プラスミドは例えば
「蛋白質、核酸、酵素」第27巻第１号（1982）の98頁の
図１の遺伝子地図及びEco RIによる物理的地図に示され
る如き構造をもつ、分子量が94.5kb（62×106dolton）
の既知のプラスミドであり、大腸菌などの腸内細菌中に
通常細胞染色体当り１〜２個のコピー数で存在し、従つ
て染色体が細胞当り２個あるとすればＦ因子プラスミド
としては２〜４個しか担われていない。このプラスミド
は細胞分裂時にちようど倍化してそれぞれの娘細胞に正
確に伝達されるような機構を備えている（このように、
コピー数を低いレベルに保ちつつ、正確に宿主の増殖と
ペースを合わせて増やす仕組みをstringentな増殖の制
御と呼んでいる）。Ｆ因子プラスミドにおけるこのよう
なstringentな増殖の制御機能が、mini−Ｆと呼ばれる
分子量が9.1kbの自律増殖できる断片に担われているこ
とも既に究明されており、このmini−ＦがＦ因子プラス
ミドにより制限酵素EcoRIにより切り出し可能であるこ
とも知られている。
スミドの増殖制御分配系を司る遺伝子を含む画分と組合
わせる点に特徴を有する。Ｆ因子プラスミドは例えば
「蛋白質、核酸、酵素」第27巻第１号（1982）の98頁の
図１の遺伝子地図及びEco RIによる物理的地図に示され
る如き構造をもつ、分子量が94.5kb（62×106dolton）
の既知のプラスミドであり、大腸菌などの腸内細菌中に
通常細胞染色体当り１〜２個のコピー数で存在し、従つ
て染色体が細胞当り２個あるとすればＦ因子プラスミド
としては２〜４個しか担われていない。このプラスミド
は細胞分裂時にちようど倍化してそれぞれの娘細胞に正
確に伝達されるような機構を備えている（このように、
コピー数を低いレベルに保ちつつ、正確に宿主の増殖と
ペースを合わせて増やす仕組みをstringentな増殖の制
御と呼んでいる）。Ｆ因子プラスミドにおけるこのよう
なstringentな増殖の制御機能が、mini−Ｆと呼ばれる
分子量が9.1kbの自律増殖できる断片に担われているこ
とも既に究明されており、このmini−ＦがＦ因子プラス
ミドにより制限酵素EcoRIにより切り出し可能であるこ
とも知られている。
本発明はこのmini−Ｆに担われている増殖制御分配系を
利用するものであり、しかして「Ｆ因子プラスミドの増
殖制御分配系を司る遺伝子を含む画分」（以下Ｆ画分と
略称することがある）とは、上述したようなＦ因子プラ
スミドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子画
分を意味し、そのようなＦ画分の代表例としては約9.1k
bの分子量を有するmini−Ｆ画分が挙げられる。
利用するものであり、しかして「Ｆ因子プラスミドの増
殖制御分配系を司る遺伝子を含む画分」（以下Ｆ画分と
略称することがある）とは、上述したようなＦ因子プラ
スミドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子画
分を意味し、そのようなＦ画分の代表例としては約9.1k
bの分子量を有するmini−Ｆ画分が挙げられる。
本発明のプラスミドは、以上に述べたＴ画分とＦ画分に
加えて、さらに他の遺伝子画分、例えば各種細菌の薬剤
耐性を司る、例えばカナマイシン耐性等の遺伝子画分、
例えばカナマイシン耐性を司る遺伝子画分等を含有して
いてもよい。
加えて、さらに他の遺伝子画分、例えば各種細菌の薬剤
耐性を司る、例えばカナマイシン耐性等の遺伝子画分、
例えばカナマイシン耐性を司る遺伝子画分等を含有して
いてもよい。
そのようなプラスミドの代表例として、本発明では、ト
リプトフアンオペロン画分及びＦ因子プラスミドのmini
−Ｆ画分を含有し、分子量が約31.7kbであり且つ下記の
制限酵素に対して下記の感受性を示す、すなわち （ａ） EcoRIに対する認識部位が５ケ所であり、 （ｂ） Bam HIに対する認識部位が２ケ所であり、 （ｃ） Hind IIIに対する認識部位が３ケ所であること
を特徴とするプラスミドpMTY−１が提供される。
リプトフアンオペロン画分及びＦ因子プラスミドのmini
−Ｆ画分を含有し、分子量が約31.7kbであり且つ下記の
制限酵素に対して下記の感受性を示す、すなわち （ａ） EcoRIに対する認識部位が５ケ所であり、 （ｂ） Bam HIに対する認識部位が２ケ所であり、 （ｃ） Hind IIIに対する認識部位が３ケ所であること
を特徴とするプラスミドpMTY−１が提供される。
このプラスミドpMTY−１は下記のとおり約31.7kbの分子
量を有するが、この分子量はアガロース・ゲル電気泳動
法により測定したものである。
量を有するが、この分子量はアガロース・ゲル電気泳動
法により測定したものである。
また、プラスミドPMTY−１の各種制限酵素に対する感受
性は上記（ａ）〜（ｃ）に示すとおりであり、より詳細
に各制限酵素による分解断片の分子量（kb）を示せば次
のとおりである。
性は上記（ａ）〜（ｃ）に示すとおりであり、より詳細
に各制限酵素による分解断片の分子量（kb）を示せば次
のとおりである。
（ａ） Eco RI:9.1,7.0,6.4,6.1,3.1 （ｂ） Bam HI:22.6,9.1 （ｃ） Hind III:18.0,10.8,2.9 以上に述べた如き特性をもつプラスミドpMTY−１は例え
ば次のようにして製造することができる。
ば次のようにして製造することができる。
まず、トリプトフアンオペロン画分の調製は、例えば、
染色体遺伝子中にトリプトフアンオペロンをもつ大腸
菌、例えば、Escherichia coli K−12（IFO3301,ATCC10
798,ATCC e23562）などに、フアージ、例えばフアージ
φ80（ATCC11456a−B1）などを感染させ、溶源化及び誘
発現象を利用して、フアージDNA中にトリプトフアンオ
ペロンを取り込んだフアージを大量に調製し〔R.M.Denn
ey、C.Yanofsky;J.Bacteriol.,118、505（1974）参
照〕、それから常法〔E.F.Fritsch,Sambrook,“Molecul
ar cloning"（1982）p.164〜165、Cold Spin Harbor La
boratory参照〕に従つてフアージDNAを抽出し、制限酵
素、例えばBamHI,EcoRI等を用いてトリプトフアンオペ
ロンを含む遺伝子画分を切り出すことにより行なうこと
ができる。
染色体遺伝子中にトリプトフアンオペロンをもつ大腸
菌、例えば、Escherichia coli K−12（IFO3301,ATCC10
798,ATCC e23562）などに、フアージ、例えばフアージ
φ80（ATCC11456a−B1）などを感染させ、溶源化及び誘
発現象を利用して、フアージDNA中にトリプトフアンオ
ペロンを取り込んだフアージを大量に調製し〔R.M.Denn
ey、C.Yanofsky;J.Bacteriol.,118、505（1974）参
照〕、それから常法〔E.F.Fritsch,Sambrook,“Molecul
ar cloning"（1982）p.164〜165、Cold Spin Harbor La
boratory参照〕に従つてフアージDNAを抽出し、制限酵
素、例えばBamHI,EcoRI等を用いてトリプトフアンオペ
ロンを含む遺伝子画分を切り出すことにより行なうこと
ができる。
他方、mini F画分の調製は、例えば、Ｆ因子プラスミド
を保有する微生物、例えば、大腸菌（E.coli）Ｋ−12株
（ATCC15153,ATCC e23589,ATCC e23590）等からそれ
自体公知の方法で、例えばP.Guerry、D.L.LeBlanc、S.F
alkow;J.Bact.,116,1064（1973）等の文献に記載の方法
でＦ因子プラスミドを取り出し、それから制限酵素Eco
RIを用いて分子量が約9.1kbのmini F断片を切り出すこ
とにより調製することができる。
を保有する微生物、例えば、大腸菌（E.coli）Ｋ−12株
（ATCC15153,ATCC e23589,ATCC e23590）等からそれ
自体公知の方法で、例えばP.Guerry、D.L.LeBlanc、S.F
alkow;J.Bact.,116,1064（1973）等の文献に記載の方法
でＦ因子プラスミドを取り出し、それから制限酵素Eco
RIを用いて分子量が約9.1kbのmini F断片を切り出すこ
とにより調製することができる。
このようにして調製されたmini F断片は、上記トリプト
フアンオペロンを含む遺伝子画分の切り出しに用いたと
同じ制限酵素で処理した後、上記で調製したトリプトフ
アンオペロンを含む遺伝子画分と一緒にし、リガーゼ、
例えばT4フアージ由来のリガーゼ等を作用させて結合さ
せることにより、目的とするプラスミドpMTY−１が得ら
れる。
フアンオペロンを含む遺伝子画分の切り出しに用いたと
同じ制限酵素で処理した後、上記で調製したトリプトフ
アンオペロンを含む遺伝子画分と一緒にし、リガーゼ、
例えばT4フアージ由来のリガーゼ等を作用させて結合さ
せることにより、目的とするプラスミドpMTY−１が得ら
れる。
なお、プラスミドpMTY−１の具体的調製法については後
記実施例１に詳細に説明されている。
記実施例１に詳細に説明されている。
このようにして調製される本発明のプラスミドは、コピ
ー数は少ないが、宿主の細胞分裂に際して娘細胞に正確
に受け継がれ、脱落することが少ないという優れた特性
を有する。
ー数は少ないが、宿主の細胞分裂に際して娘細胞に正確
に受け継がれ、脱落することが少ないという優れた特性
を有する。
従つて、本発明のプラスミドはトリプトフアンの製造に
おいて工業的に応用することが大いに期待される。トリ
プトフアンの製造に際しては、本発明のプラスミドで宿
主が形質転換される。この形質転換に利用できる宿主菌
としては、例えば、大腸菌、枯草菌、サツカロマイセス
等が挙げられるが、これらの中でも大腸菌が好ましい。
更に、これら宿主菌をトリプトフアン要求性変異株とし
たものが特に好ましいものである。
おいて工業的に応用することが大いに期待される。トリ
プトフアンの製造に際しては、本発明のプラスミドで宿
主が形質転換される。この形質転換に利用できる宿主菌
としては、例えば、大腸菌、枯草菌、サツカロマイセス
等が挙げられるが、これらの中でも大腸菌が好ましい。
更に、これら宿主菌をトリプトフアン要求性変異株とし
たものが特に好ましいものである。
また、これら宿主菌に対する本発明のプラスミドの導入
はそれ自体公知の方法、例えばM.Mandel,A.Higa;J.Mol.
Biol,53,159（1970）等の文献に記載の方法で行なうこ
とができる。
はそれ自体公知の方法、例えばM.Mandel,A.Higa;J.Mol.
Biol,53,159（1970）等の文献に記載の方法で行なうこ
とができる。
このようにして形質転換された宿主菌はそれ自体公知の
方法で培養することにより、トリプトフアンシンターゼ
を充分に生産蓄積させた後、インドールとＬ−又はDL−
セリンとからＬ−トリプトフアンを製造する際の酵素反
応に利用することができる。培養された菌体を該酵素反
応に利用する場合、該菌体はそのままで使用することが
できるが、該菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、又
はその破砕物をさらに水等で抽出した抽出物、或いは該
抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成分を沈澱させた
粗精製物の形で使用することもでき、さらに、該菌体又
はこれら処理物は必要により固定化して用いることもで
きる。
方法で培養することにより、トリプトフアンシンターゼ
を充分に生産蓄積させた後、インドールとＬ−又はDL−
セリンとからＬ−トリプトフアンを製造する際の酵素反
応に利用することができる。培養された菌体を該酵素反
応に利用する場合、該菌体はそのままで使用することが
できるが、該菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、又
はその破砕物をさらに水等で抽出した抽出物、或いは該
抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成分を沈澱させた
粗精製物の形で使用することもでき、さらに、該菌体又
はこれら処理物は必要により固定化して用いることもで
きる。
該菌体又はその処理物の存在下でのインドールとＬ−又
はDL−セリンとの反応は、通常の酵素反応と同様に例え
ば0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0〜9.0）あるいは水（pH7.0
〜9.0）等の溶媒中で、約20〜約50℃、好ましくは約30
〜約40℃の温度で通常約10〜72時間行なわれる。
はDL−セリンとの反応は、通常の酵素反応と同様に例え
ば0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0〜9.0）あるいは水（pH7.0
〜9.0）等の溶媒中で、約20〜約50℃、好ましくは約30
〜約40℃の温度で通常約10〜72時間行なわれる。
インドールとＬ−又はDL−セリンの反応時の使用量には
特に制限はないが、一般にはそれぞれを0.1〜20％（wt/
vol）の濃度範囲で使用するのが適当である。また、該
菌体又はその処理物の使用量も特に制限されるものでは
ないが、一般に１〜10％（wt/vol）の濃度で使用するこ
とができる。
特に制限はないが、一般にはそれぞれを0.1〜20％（wt/
vol）の濃度範囲で使用するのが適当である。また、該
菌体又はその処理物の使用量も特に制限されるものでは
ないが、一般に１〜10％（wt/vol）の濃度で使用するこ
とができる。
なお、上記形質転換された菌の培養は宿主菌の種類によ
つて異なるが、一般には、通常用いられる合成或いは天
然培地を用いて行なうことができる。しかして炭素源と
しては、グルコース、グリセロース、フラクトース、シ
ユクロース、糖密等の種々の炭水化物が使用できる。ま
た、窒素源としては、トリプトン、酵母エキス、コーン
・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機
窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒素源と
共に炭素源にもなり得る。
つて異なるが、一般には、通常用いられる合成或いは天
然培地を用いて行なうことができる。しかして炭素源と
しては、グルコース、グリセロース、フラクトース、シ
ユクロース、糖密等の種々の炭水化物が使用できる。ま
た、窒素源としては、トリプトン、酵母エキス、コーン
・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機
窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒素源と
共に炭素源にもなり得る。
培養は、振盪培養或いは通知撹拌深部培養などの好気的
条件下に行うことができる。溶媒温度は一般に20〜50℃
であり、培地中の培地のpHは中性または微アルカリ性附
近に維持することが望ましい。培養期間は、通常１〜５
日である。
条件下に行うことができる。溶媒温度は一般に20〜50℃
であり、培地中の培地のpHは中性または微アルカリ性附
近に維持することが望ましい。培養期間は、通常１〜５
日である。
上記のような培養方法によつて得られた菌体又はその処
理物を用いてインドールとＬ−、又はDL−セリンを反応
せしめて得られる、反応液中に生成したＬ−トリプトフ
アンの分離・精製は、イオン交換樹脂、活性炭等による
吸着・脱着処理等の公知の方法により行うことができ
る。
理物を用いてインドールとＬ−、又はDL−セリンを反応
せしめて得られる、反応液中に生成したＬ−トリプトフ
アンの分離・精製は、イオン交換樹脂、活性炭等による
吸着・脱着処理等の公知の方法により行うことができ
る。
また、本発明のプラスミドで形質転換した宿主菌はＬ−
トリプトフアンの発酵法による生産にも利用することが
できる。すなわち、本発明のプラスミドで形質転換した
宿主をインドールを含む培地で培養すれば、培地中にＬ
−トリプトフアンが生産蓄積し、これを採取することに
よりＬ−トリプトフアンを製造することができる。
トリプトフアンの発酵法による生産にも利用することが
できる。すなわち、本発明のプラスミドで形質転換した
宿主をインドールを含む培地で培養すれば、培地中にＬ
−トリプトフアンが生産蓄積し、これを採取することに
よりＬ−トリプトフアンを製造することができる。
実施例1:プラスミドpMTY−１の調製 （Ａ） mini F画分の調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12菌株（ATCC15153）を１のＬ
培地（Bactoトリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl5g、グ
ルコース1g、水１;pH7.2）に接種し、約37℃で約４時
間振盪培養した後、菌体を集め、リゾチウム処理を行な
い且つドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を添加して溶菌
させた。この溶菌液を32,000×ｇで40分間遠心分離処理
し、上清を分画し、次いで塩化セシウム−エチジウムブ
ロマイド平衡密度勾配遠心分離処理を行なつた後、透析
処理により、Ｆ因子プラスミドを含む溶液を分取した。
この溶液にエタノール沈澱を行ない、最終的に約20μｇ
のＦ因子プラスミドを採取した。
培地（Bactoトリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl5g、グ
ルコース1g、水１;pH7.2）に接種し、約37℃で約４時
間振盪培養した後、菌体を集め、リゾチウム処理を行な
い且つドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を添加して溶菌
させた。この溶菌液を32,000×ｇで40分間遠心分離処理
し、上清を分画し、次いで塩化セシウム−エチジウムブ
ロマイド平衡密度勾配遠心分離処理を行なつた後、透析
処理により、Ｆ因子プラスミドを含む溶液を分取した。
この溶液にエタノール沈澱を行ない、最終的に約20μｇ
のＦ因子プラスミドを採取した。
次に、mini F画分の調製に際して、上記のＦ因子プラス
ミドを５μｇとり、制限酵素であるEcoRIを37℃、１時
間作用させて該Ｆ因子プラスミドDNA鎖を切断し、約9.1
kbのmini F断片を含むDNA溶液を調製した。
ミドを５μｇとり、制限酵素であるEcoRIを37℃、１時
間作用させて該Ｆ因子プラスミドDNA鎖を切断し、約9.1
kbのmini F断片を含むDNA溶液を調製した。
（Ｂ） フアージφ80ptの調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を100mlのＬ培地
（組成は前記と同じ）に接種し、37℃で約４時間振盪し
た培養物の0.2mlと、フアージφ80（ATCC11456a−B1）
水溶液（105ケ/ml）の0.1mlとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培
地＋寒天沫）中に混合したのち、Ｌ培地寒天プレート上
に重層する。該プレートを37℃にて約５時間培養すると
プラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２〜３日間37℃にて
培養を継続すると、プラーク中にフアージφ80溶原菌の
生育コロニーを生ずる。該溶原菌をＬ培地にて37℃で４
時間培養後、上記と同じＬ培地寒天プレート上に塗抹し
たのち、紫外線照射（400〜800ergs/mm2、10〜20秒）に
よる溶原フアージの誘発によりフアージφ80pt（トリプ
トフアンオペロンを含むフアージDNA）を調製する。
（組成は前記と同じ）に接種し、37℃で約４時間振盪し
た培養物の0.2mlと、フアージφ80（ATCC11456a−B1）
水溶液（105ケ/ml）の0.1mlとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培
地＋寒天沫）中に混合したのち、Ｌ培地寒天プレート上
に重層する。該プレートを37℃にて約５時間培養すると
プラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２〜３日間37℃にて
培養を継続すると、プラーク中にフアージφ80溶原菌の
生育コロニーを生ずる。該溶原菌をＬ培地にて37℃で４
時間培養後、上記と同じＬ培地寒天プレート上に塗抹し
たのち、紫外線照射（400〜800ergs/mm2、10〜20秒）に
よる溶原フアージの誘発によりフアージφ80pt（トリプ
トフアンオペロンを含むフアージDNA）を調製する。
（Ｃ） トリプトフアンオペロン画分の調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を１のＬ培地
（組成は前記と同じ）に接種し、約37℃で約３時間振盪
培養し、対数増殖期に25％（w/v）グルコース溶液10ml
と上記で調製したフアージφ80pt溶液を1011ケ/mlの濃
度で添加し（moi 2.0）、５時間振盪を継続後常法通り
クロロホルムの添加により、フアージφ80ptを大量に調
製した〔T.Maniatis,E.F.Fritsch,Sambrook;“Molecula
r cloning"（1982）p.76〜80Cold Spring Harbor Labor
atory参照〕。
（組成は前記と同じ）に接種し、約37℃で約３時間振盪
培養し、対数増殖期に25％（w/v）グルコース溶液10ml
と上記で調製したフアージφ80pt溶液を1011ケ/mlの濃
度で添加し（moi 2.0）、５時間振盪を継続後常法通り
クロロホルムの添加により、フアージφ80ptを大量に調
製した〔T.Maniatis,E.F.Fritsch,Sambrook;“Molecula
r cloning"（1982）p.76〜80Cold Spring Harbor Labor
atory参照〕。
次に取得したフアージφ80pt溶液をトリス緩衝液（pH7.
8にて透析後、フエノール法により、DNA抽出法〔上記
“Molecular Cloning"p.85参照〕によつてフアージDNA
を抽出精製し、これに制限酵素BamHIを与え30℃で30分
間反応させ、トリプトフアンオペロンを含む遺伝子画分
を得た。
8にて透析後、フエノール法により、DNA抽出法〔上記
“Molecular Cloning"p.85参照〕によつてフアージDNA
を抽出精製し、これに制限酵素BamHIを与え30℃で30分
間反応させ、トリプトフアンオペロンを含む遺伝子画分
を得た。
（Ｄ） トリプトフアンオペロン画分とmini F画分の結
合 前記（Ａ）で得たmini F画分に制限酵素BamHIを30℃に
て30分間反応させ、次いで、60℃で５分間熱処理してBa
mHIを失活させた後、前記（Ｃ）で得たトリプトフアン
オペロン画分を添加混合し、ATP（アデノシントリホス
フエート）及びジチオスチレイトールを加え、さらにT4
フアージ由来のDNAリガーゼ（DNA結合作用を有する；宝
酒造（株）製「T4DNAリガーゼ」）を添加した後、12℃
で17時間反応を行なつた。次いで60℃で５分間熱処理し
て、DNAリガーゼを失活させた後、エタノール沈澱法に
て、プラスミドpMTY−１を採取した。
合 前記（Ａ）で得たmini F画分に制限酵素BamHIを30℃に
て30分間反応させ、次いで、60℃で５分間熱処理してBa
mHIを失活させた後、前記（Ｃ）で得たトリプトフアン
オペロン画分を添加混合し、ATP（アデノシントリホス
フエート）及びジチオスチレイトールを加え、さらにT4
フアージ由来のDNAリガーゼ（DNA結合作用を有する；宝
酒造（株）製「T4DNAリガーゼ」）を添加した後、12℃
で17時間反応を行なつた。次いで60℃で５分間熱処理し
て、DNAリガーゼを失活させた後、エタノール沈澱法に
て、プラスミドpMTY−１を採取した。
得られたプラスミドpMTY−１の分子量を、アガロース・
ゲル電気泳動法により測定した。使用したアガロース・
ゲル電気泳動装置は、マリソル産業（株）型フラツトア
ガロースゲル電気泳動装置KS−8422FAE型であり、電気
泳動条件は、0.6％寒天ゲルを作製し、緩衝液（0.04M T
ris、0.04M酢酸ソーダ、0.008M EDTA、酢酸でpH8.3に調
製）中に制限酵素（Eco RI、Bam HI又はHind III）を用
いてプラスミドpMTY−１を分解させたDNA断片の混合物
を入れ、80V、４〜５時間電気泳動させた。
ゲル電気泳動法により測定した。使用したアガロース・
ゲル電気泳動装置は、マリソル産業（株）型フラツトア
ガロースゲル電気泳動装置KS−8422FAE型であり、電気
泳動条件は、0.6％寒天ゲルを作製し、緩衝液（0.04M T
ris、0.04M酢酸ソーダ、0.008M EDTA、酢酸でpH8.3に調
製）中に制限酵素（Eco RI、Bam HI又はHind III）を用
いてプラスミドpMTY−１を分解させたDNA断片の混合物
を入れ、80V、４〜５時間電気泳動させた。
泳動後、寒天ゲルを取り出し、エチジウムブロマイドに
て染色後、254nmUV光で照射してDNAの移動位置を検出
し、分子量既知のDNA断片（λDNAをHind IIIで分解して
得られたDNA:和光純薬工業（株）製「λDNA−Hind III
digests」）との比較により分子量を決定した。
て染色後、254nmUV光で照射してDNAの移動位置を検出
し、分子量既知のDNA断片（λDNAをHind IIIで分解して
得られたDNA:和光純薬工業（株）製「λDNA−Hind III
digests」）との比較により分子量を決定した。
実施例2:プラスミドpMTY−１による大腸菌Ｋ−12系変異
株の形質転換 （Ａ） 宿主菌の準備 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）から常法に従
い、NTG（ニトロソグアニジン）処理によつてトリプト
フアン要求性変異株を調製した〔E.A.Adelberg et al.,
Biochem,Biophys,Res. Comm,18,788（1965）参照〕。
株の形質転換 （Ａ） 宿主菌の準備 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）から常法に従
い、NTG（ニトロソグアニジン）処理によつてトリプト
フアン要求性変異株を調製した〔E.A.Adelberg et al.,
Biochem,Biophys,Res. Comm,18,788（1965）参照〕。
すなわち、上記E.coli K−12株をＬ培地にて対数増殖中
期まで培養し、遠心分離により集菌して菌株をTris−マ
レイン酸緩衝液（pH6.0）に懸濁した後、100μg/ml〜20
0μg/mlのNTG（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）を添加し、15〜30分間処理する。該処理
物を同じ緩衝液にて洗浄後、Ｌ培地に添加し、37℃にて
振盪培養を行ない、該培養物は常法に従い、ペニシリン
濃縮法およびレプリカ法を併用してトリプトフアン要求
性変異株を単離した。
期まで培養し、遠心分離により集菌して菌株をTris−マ
レイン酸緩衝液（pH6.0）に懸濁した後、100μg/ml〜20
0μg/mlのNTG（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）を添加し、15〜30分間処理する。該処理
物を同じ緩衝液にて洗浄後、Ｌ培地に添加し、37℃にて
振盪培養を行ない、該培養物は常法に従い、ペニシリン
濃縮法およびレプリカ法を併用してトリプトフアン要求
性変異株を単離した。
（Ｂ） 形質転換 上記（Ａ）で得た大腸菌Ｋ−12系株（トリプトフアン要
求性変異株を、前記実施例で用いたと同じＬ培地10mlに
接種し、37℃にて振盪培養を行ない、対数増殖中期もし
くは、後期まで生育させた後遠心分離にて集菌し、これ
を０℃の氷冷下に0.1MMgCl2及び0.1MCaCl2の水溶液に懸
濁させてDNA受容状態菌（コンピーテント菌）を調製し
た。これに前記実施例１で得たプラスミドpMTY−１を加
え、０℃の氷冷下に40分間反応させ、次いで40℃にて３
分間加温処理した後、再度０℃の氷冷下にて２時間反応
させた。
求性変異株を、前記実施例で用いたと同じＬ培地10mlに
接種し、37℃にて振盪培養を行ない、対数増殖中期もし
くは、後期まで生育させた後遠心分離にて集菌し、これ
を０℃の氷冷下に0.1MMgCl2及び0.1MCaCl2の水溶液に懸
濁させてDNA受容状態菌（コンピーテント菌）を調製し
た。これに前記実施例１で得たプラスミドpMTY−１を加
え、０℃の氷冷下に40分間反応させ、次いで40℃にて３
分間加温処理した後、再度０℃の氷冷下にて２時間反応
させた。
次にＬ培地に上記処理菌体を接種し、37℃にて１時間30
分振盪培養後、遠心分離にて集菌し、菌体を洗浄後、最
少培地（Davis培地:K2HPO47g、KH2PO42g、MgSO4・7H2O
0.1g、（NH4）2SO41g、グルコース2g、純水１）にて
調製した平板培地に塗抹し、37℃にて培養し、生育した
コロニーを再び同培地上で純化した後、形質転換株（Tr
p要求性の消失、すなわちプラスミド上のトリプトフア
ンオペロンにより生合成可能となり、最少培地上にて生
育可能となつた菌株）を得た。この形質転換株は茨木県
つくば市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術
研究所に、昭和58年７月６日付で受託番号：微工研菌寄
第7139号にて寄託されている。
分振盪培養後、遠心分離にて集菌し、菌体を洗浄後、最
少培地（Davis培地:K2HPO47g、KH2PO42g、MgSO4・7H2O
0.1g、（NH4）2SO41g、グルコース2g、純水１）にて
調製した平板培地に塗抹し、37℃にて培養し、生育した
コロニーを再び同培地上で純化した後、形質転換株（Tr
p要求性の消失、すなわちプラスミド上のトリプトフア
ンオペロンにより生合成可能となり、最少培地上にて生
育可能となつた菌株）を得た。この形質転換株は茨木県
つくば市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術
研究所に、昭和58年７月６日付で受託番号：微工研菌寄
第7139号にて寄託されている。
参考例1:形質転換株の安定性 前述のＬ培地100mlを500ml容三角フラスコに分注し、12
0℃で15分間滅菌処理したものに、実施例２で得た形質
転換株を植菌し、37℃にて24時間振盪培養を行なつた
後、同様にして調製したＬ培地に2ml植継し、同じく37
℃にて24時間振盪培養を行ない、この操作を繰返し実施
して計５回の培養を行なつた。
0℃で15分間滅菌処理したものに、実施例２で得た形質
転換株を植菌し、37℃にて24時間振盪培養を行なつた
後、同様にして調製したＬ培地に2ml植継し、同じく37
℃にて24時間振盪培養を行ない、この操作を繰返し実施
して計５回の培養を行なつた。
各培養終了時（24時間培養時）に集菌し、菌体を洗浄
後、前記最少培地にＬ−トリプトフアン20mg/を添加
して調製した平板培地に一定量塗抹し、37℃にて１日培
養した。生育コロニー200ケ（無差別選択）をし、トリ
プトフアンを含まない最少培地に植菌し、37℃にて２日
間培養後、再度同様の最少培地に植菌し、生育コロニー
をカウントする。
後、前記最少培地にＬ−トリプトフアン20mg/を添加
して調製した平板培地に一定量塗抹し、37℃にて１日培
養した。生育コロニー200ケ（無差別選択）をし、トリ
プトフアンを含まない最少培地に植菌し、37℃にて２日
間培養後、再度同様の最少培地に植菌し、生育コロニー
をカウントする。
この結果、トリプトフアン添加培地に生育したコロニー
はすべてトリプトフアンを含まない最少培地にも生育す
ること、すなわち該プラスミドの高度な安定性を確認し
た。
はすべてトリプトフアンを含まない最少培地にも生育す
ること、すなわち該プラスミドの高度な安定性を確認し
た。
なお、形質転換株中のプラスミド存在の確認試験とし
て、形質転換株のアクリジンオレンジ処理法により、Tr
p要求性株が出現し、また、前記のSDS−リゾチーム法及
び塩化セシウム−エチジウムブロマイド法により、プラ
スミド確認を併行して行ない、プラスミドの分子量に変
化の無いことを確認した。
て、形質転換株のアクリジンオレンジ処理法により、Tr
p要求性株が出現し、また、前記のSDS−リゾチーム法及
び塩化セシウム−エチジウムブロマイド法により、プラ
スミド確認を併行して行ない、プラスミドの分子量に変
化の無いことを確認した。
実施例3:L−トリプトフアンの製造 Ｌ培地100mlを500ml容三角フラスコに分注し、120℃で1
5分間滅菌後、実施例２で得た形質転換株を植菌し、37
℃にて一夜振盪培養後、同様の培地500mlに10ml接種
し、同じく37℃にて５時間振盪培養した。遠心分離によ
り菌体を回収し、これをインドール500mg、DL−セリン
2.0gおよびピリドキサールリン酸5mgを含む50mMリン酸
緩衝液（pH7.5）50mlに懸濁し、振盪しながら30℃、72
時間反応を行なつた。反応終了後液を10mlとり、メタノ
ール10mlを加えて激しく撹拌した後、遠心分離により得
た上澄液について高速液体クロマトグラフイーで生成し
たＬ−トリプトフアンの分析を行なつたところ、15mg/m
lの生成が認められた。
5分間滅菌後、実施例２で得た形質転換株を植菌し、37
℃にて一夜振盪培養後、同様の培地500mlに10ml接種
し、同じく37℃にて５時間振盪培養した。遠心分離によ
り菌体を回収し、これをインドール500mg、DL−セリン
2.0gおよびピリドキサールリン酸5mgを含む50mMリン酸
緩衝液（pH7.5）50mlに懸濁し、振盪しながら30℃、72
時間反応を行なつた。反応終了後液を10mlとり、メタノ
ール10mlを加えて激しく撹拌した後、遠心分離により得
た上澄液について高速液体クロマトグラフイーで生成し
たＬ−トリプトフアンの分析を行なつたところ、15mg/m
lの生成が認められた。
反応終了液50mlに苛性ソーダ水溶液を加えてpH10にした
のち、アンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオ
ンSKI−Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプ
トフアンを吸着せしめ、2N−アンモニア水で溶出せしめ
た。溶出液を濃縮してＬ−トリプトフアンの粗結晶を析
出させたのち、これをアセトンで洗浄し、乾燥してＬ−
トリプトフアンの結晶を360mg得た。
のち、アンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオ
ンSKI−Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプ
トフアンを吸着せしめ、2N−アンモニア水で溶出せしめ
た。溶出液を濃縮してＬ−トリプトフアンの粗結晶を析
出させたのち、これをアセトンで洗浄し、乾燥してＬ−
トリプトフアンの結晶を360mg得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高山 義博 茨城県稲敷郡阿見町大字若栗1315 三菱油 化株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭57−80398（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】大腸菌のトリプトフアンオペロンに由来す
るトリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含
む画分と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系
を司る遺伝子を含むmini−Ｆ画分とを有することを特徴
とする組換えプラスミド。 - 【請求項２】大腸菌のトリプトフアンオペロンに由来す
るトリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含
む画分と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系
を司る遺伝子を含むmini−Ｆ画分とを有する組換えプラ
スミドで形質転換された大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58107842A JPH074257B2 (ja) | 1983-06-17 | 1983-06-17 | 新規なプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58107842A JPH074257B2 (ja) | 1983-06-17 | 1983-06-17 | 新規なプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS602189A JPS602189A (ja) | 1985-01-08 |
| JPH074257B2 true JPH074257B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=14469433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58107842A Expired - Lifetime JPH074257B2 (ja) | 1983-06-17 | 1983-06-17 | 新規なプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH074257B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES8705033A1 (es) * | 1984-12-04 | 1987-04-16 | Biotech Australia Pty Ltd | Un metodo para preparar una vacuna para uso en el tratamiento prevencion de diarrea porcina neonatol. |
| EP0438591B1 (en) * | 1987-10-12 | 1994-08-10 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Process for producing l-tryptophane |
| US5279951A (en) * | 1989-05-08 | 1994-01-18 | Research Association For Utilization Of Light Oil | Cultivation of transformed microorganisms |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5780398A (en) * | 1980-11-05 | 1982-05-19 | Sanraku Inc | Plasmid produced by genetic manipulation, coliform bacillus having the same and preparation of tryptophan with said bacillus |
-
1983
- 1983-06-17 JP JP58107842A patent/JPH074257B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS602189A (ja) | 1985-01-08 |
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