JPH08168383A - 核酸関連物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来法によるイノシン、イノシン酸、キサン
チル酸などの核酸関連物質の生産は必ずしも満足すべき
ものではなく、調味料、医薬品原料として重要なこれら
核酸関連物質をより高収率で安価に製造する方法の開発
が望まれている。 【解決手段】 本発明により、核酸関連物質を効率良く
生成するための、微生物のＡＰＴａｓｅの合成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換
え体ＤＮＡ、および該組換え体ＤＮＡを保有し、コリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属し、か
つ核酸関連物質を生産する能力を有する微生物を提供す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はプリンヌクレオチド
生合成に関与する酵素であるアミドフォスフォリボシル
・トランスフェラーゼ（ＥＣ2.4.2.14、以下ＡＰＴａｓ
ｅと称することもある）の合成に関与する遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用い
て、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物を形質転換し、得られる形質転換株を培
地に培養し、培養物中にイノシン、５’−イノシン酸、
５’−キサンチル酸などの核酸関連物質を生成蓄積さ
せ、該培養物から該核酸関連物質を採取する核酸関連物
質の製造法に関する。

【０００２】核酸関連物質は、調味料、医薬品原料とし
て有用であることから、本発明は食品および医薬品工業
の分野に属する。

【０００３】

【従来の技術】核酸関連物質の製造法としては、リボ核
酸を分解する方法、発酵生産した前駆物質を合成法によ
り目的物質に変換する方法、微生物により直接発酵生産
する方法などが知られている。発酵法で核酸関連物質を
生産する方法については、野生株から誘導された突然変
異株を用いる方法が知られている。たとえば５’−イノ
シン酸生産性変異株（特公昭５８−４６３１９）、５’
−キサンチル酸生産性変異株（特開昭６０−１５６３９
９）などを用いる方法が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来法によるイノシ
ン、イノシン酸、キサンチル酸などの核酸関連物質の生
産は必ずしも満足すべきものではなく、調味料、医薬品
原料として重要なこれら核酸関連物質をより高収率で安
価に製造する方法の開発が望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は微生物を用い
る核酸関連物質の生産において、従来の突然変異の付与
による育種とは全く異なる、組換えＤＮＡ技法による核
酸関連物質生産菌株の育種方法について研究を重ねた。
その結果、核酸関連物質の生合成に係る酵素であるＡＰ
Ｔａｓｅの遺伝子（以下ｐｕｒＦと略記することがあ
る）を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体Ｄ
ＮＡを保有させた菌株が核酸関連物質の高い生産性を有
することを見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００６】本発明は、微生物のＡＰＴａｓｅの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡを保有し、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属し、かつ核酸関連物質を生
産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に
核酸関連物質を生成蓄積させ、該培養物から該核酸関連
物質を採取することを特徴とする核酸関連物質の製造法
を提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の核酸関連物質としては、
イノシン、イノシン酸またはキサンチル酸などがあげら
れる。本発明に用いるＡＰＴａｓｅの遺伝子（ｐｕｒ
Ｆ）を含むＤＮＡ断片としては原核生物、バクテリオフ
ァージまたはプラスミドに由来するものが用いられる
が、なかでも細菌特にエシェリヒア属、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌由来の
ｐｕｒＦを含むＤＮＡ断片が好適に用いられる。具体的
には大腸菌Ｋ１２株の染色体ＤＮＡ由来のｐｕｒＦを含
むＤＮＡ断片があげられる。

【０００８】本発明に用いるベクターとしてはコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種内で自律
増殖できるものであればいずれも用いることができる。
具体的にはｐＣＧ１、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１
１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４などが好適に
用いられる。これらベクターについては特開昭５７−１
３４５００、特開昭５７−１８３７９９、特開昭５８−
３５１９７、特開昭５８−１０５９９９、特開昭５８−
１２６７８９、特開昭５９−１５６２９２にそれぞれ記
載されている。

【０００９】ｐｕｒＦを含む供与体ＤＮＡとベクターＤ
ＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制限
酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼで再連結反応した
後、この結合反応混合物を用いて、ｐｕｒＦを欠失した
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択
することによって得ることができる。コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属菌種で直接組換え体Ｄ
ＮＡを選択するかわりに、たとえば大腸菌のような既に
遺伝子組換え技法が確立している宿主−ベクター系を用
いてｐｕｒＦを分離し、しかる後にコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属菌種にてこの分離遺伝子
を発現させることもできる。すなわち、ｐｕｒＦの供与
体ＤＮＡを、大腸菌とコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属菌種とのシャトルベクターＤＮＡと試
験管内で結合反応させ、この反応混合物を用い、ｐｕｒ
Ｆが欠損した大腸菌の変異株を形質転換する。ついで、
欠損形質が相補された形質転換株を選択し、この形質転
換株から組換え体プラスミドを単離する。この組換え体
プラスミドを用いてコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌種を形質転換し、形質転換株を選択分
離することによっても目的とする組換え体ＤＮＡを取得
できる。大腸菌とコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種とのシャトルベクターとしてはｐＣＥ
５２、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４などが使用できる。

【００１０】本発明の宿主微生物としては、コリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属に属しＤＮＡ取
込み能を有する微生物であれば、野生株の他に薬剤耐
性、栄養要求性などの性質を有する変異株、核酸関連物
質生産性を有するまたは失った変異株など、いかなる菌
株を用いてもよい。好適にはブレビバクテリウム・アン
モニアゲネスＡＴＣＣ６８７２や、この菌株を親株とし
て変異誘導された核酸関連物質生産菌株たとえば５’−
イノシン酸生産菌ブレビバクテリウム・アンモニアゲネ
ス ＫＹ１３１８４（ＦＥＲＭ Ｐ−３７９０）、５’
−キサンチル酸生産菌ブレビバクテリウム・アンモニア
ゲネスＡＴＣＣ２１０７５、イノシン生産菌ブレビバク
テリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１４７７などが
あげられる。

【００１１】微生物の形質転換法として、特開昭５７−
１８６４９２にコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物の形質転換法について報告が
ある。しかし、本発明で宿主微生物として好適に用いる
ことができるブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
は、ブレビバクテリウム属に属してはいるものの、他の
ブレビバクテリウム属菌種、たとえばブレビバクテリウ
ム・フラバムなどとは、染色体ＤＮＡの相同性が明らか
に異なる〔インターナショナル・ジャーナル・オブ・シ
ステマティック・バクテリオロジー（Int.J.Sys.Bacter
iol.) 31, 131 (1981)〕ため、従来の遺伝子組換え技法
においては、宿主微生物としては利用されていない。本
発明により、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスを
宿主微生物として用いる遺伝子組換え技法が確立した点
で、本発明はさらに有用である。

【００１２】宿主微生物の組換え体ＤＮＡによる形質転
換は(1)培養細胞からのプロトプラストの調製、(2)組換
え体ＤＮＡによるプロトプラストの形質転換処理、(3)
プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換株の
選択からなる工程にて行われる。具体的方法をブレビバ
クテリウム・アンモニアゲネスを用いた例により以下に
示す。

【００１３】(1)培養細胞からのプロトプラストの調製 プロトプラストの調製は微生物を細胞壁の合成が阻害さ
れる条件下で増殖させ、この培養細胞に高張液中でリゾ
チームあるいはアクロモペプチダーゼなどを作用させ
て、細胞壁を溶解除去することによって行われる。栄養
細胞を得るために使用する培地は、ブレビバクテリウム
・アンモニアゲネスが生育できるものであればいずれで
も使用できる。たとえばＮＢ培地（第１表）のような完
全栄養培地や、ＧIII培地（第２表）のような半合成培
地などが使用できる。

【００１４】

【表１】

【００１５】

【表２】

【００１６】この培地にブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネスを接種し、２０−４０℃にて通気撹拌条件下で
培養する。培地の吸光度（ＯＤ）を比色計にて経時的に
測定し、菌の対数増殖期の初期（ＯＤが０．１〜０．１
５に達したとき）に細胞壁合成阻害剤を添加する。細胞
壁合成を阻害する薬剤としては、ぺニシリン、グリシン
などを使用することができる。これら薬剤の使用量は、
微生物の生育を半ば抑制する濃度もしくはそれ以下が望
ましく、ペニシリンの場合には培養液中に０．１〜２．
０Ｕ／ｍｌ程度、またグリシンの場合には１０〜４０ｍ
ｇ／ｍｌ程度の濃度になるように添加する。薬剤添加後
さらに培養を続け、数世代増殖させて栄養細胞を得る。
培養液から栄養細胞を集菌し、培地および高張液にて洗
浄したのち、それぞれの高張培地に懸濁し、溶菌酵素処
理を行う。洗浄に用いる培地としては前記のＮＢ培地、
ＧIII培地などが使用でき、高張液としてはＰ３高張液
（第３表）が使用できる。

【００１７】

【表３】

【００１８】また高張培地としては栄養培地、半合成培
地、最少培地などに高張化薬剤として０．２５−０．６
Ｍシュクロース、０．３−０．７Ｍコハク酸２ナトリウ
ム、０．４−２．０Ｍソルビトールのいずれかを添加し
たもの、あるいはＰ３高張液などを用いることができ
る。溶菌酵素処理は、卵白リゾーチームあるいはアクロ
モペプチダーゼなどをいずれも０．１−５．０ｍｇ／ｍ
ｌ程度の濃度となるように添加し、３０−４０℃にて５
−２０時間保持する。プロトプラストの生成は光学顕微
鏡で観察することにより、球型の細胞として確認するこ
とができる。

【００１９】このようにして調製したプロトプラスト
は、高張寒天培地上において生育してコロニーを形成
し、栄養細胞に再生する。再生を行わせるためには、通
常３日から２０日間、２０−４０℃に保つ。高張寒天培
地としては、栄養培地、半合成培地、最少培地などに
０．２５−０．６Ｍのシュクロースまたは０．３−０．
７Ｍのコハク酸２ナトリウムおよび寒天（ディフコ社
製）１４ｇ／Ｌを添加したものなどが用いられる。

【００２０】(2)組換え体ＤＮＡによるプロトプラスト
の形質転換処理 プロトプラストの組換え体ＤＮＡによる形質転換は、細
胞がプロトプラスト状態を保持できる高張液中でプロト
プラストと組換え体ＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡ取
込み媒介作用のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、
平均分子量１，５４０−６，０００）と２価金属陽イオ
ンを加えて処理することによって行われる。高張条件を
与える安定化剤としては、微生物のプロトプラストの保
持に一般に使われるものでよく、たとえばシュクロー
ス、コハク酸２ナトリウム：ソルビトールなどを用いる
ことができる。ＰＥＧの使用可能な濃度範囲は最終濃度
で５−６０％である。２価金属陽イオンとしては、たと
えばＣａ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｂａ²⁺、Ｓｒ²⁺などが最
終濃度１−１００ｍＭの範囲において効果的で、単独使
用あるいは併用することができる。処理の温度は０−２
５℃が好適である。

【００２１】(3)プロトプラストの正常細胞への復帰再
生と形質転換株の選択 プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換株の
選択は次のように行う。組換え体ＤＮＡを用いて形質転
換処理したプロトプラストの再生は、前記のプロトプラ
ストの再生と同様に高張寒天培地上において行う。形質
転換株は組換え体ＤＮＡに由来する遺伝子が菌に付与す
る形質について選択することによって取得できる。この
特徴的形質獲得に基づく選択は、高張寒天培地上で再生
と同時に行ってもよい。また、一旦非選択的に再生させ
てから再生正常細胞を集め通常の低張寒天培地上で選択
を行ってもよい。

【００２２】形質転換株は通常の栄養培地に培養するこ
とにより、導入した組換え体ＤＮＡの形質を発現させる
ことができる。組換え体ＤＮＡの導入により形質転換株
に薬剤耐性などの性質が付与されている場合は、その性
質にあわせて培地に薬剤を補給することもある。このよ
うにして得られた形質転換株を、発酵法による核酸関連
物質製造の際に用いられている培養方法により培養する
ことによって核酸関連物質を製造することができる。す
なわち該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物、アミノ
酸ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的条件下
において温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば、培
養物中に核酸関連物質が生成蓄積するのでこれを採取す
る。

【００２３】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、シュクロース、グリセロール、澱粉、澱粉加水分解
液、糖蜜、糖蜜加水分解物などの炭水化物、グルコン
酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸などの各種有機酸、グリシ
ン、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸などのア
ミノ酸など、該生産菌が資化可能なものであればいずれ
も使用可能である。窒素源としてはアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペ
プトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン
スチープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミー
ルあるいはその消化物などの窒素含有有機物、グリシ
ン、グルタミン酸などの各種アミノ酸など種々のものが
使用できる。無機物としてはリン酸第一カリウム、リン
酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄硫酸マンガン、硫酸亜
鉛、炭酸カルシウムなどを用いることができる。さら
に、用いる菌がアミノ酸、核酸、ビタミンなど特定の栄
養素を生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を
適当量添加するが、前記したような他の培地成分に伴っ
て培地に供給されれば特に加えなくても良い。

【００２４】培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養など
の好気的条件下に行う。培養温度は一般に２０−４０℃
が好適である。培養期間は通常２−７日である。培地の
ｐＨはアンモニア水、尿素液、水酸化ナトリウム溶液な
どで中性付近に保つことが望ましい。こうようにして培
養物中に著量の核酸関連物質が蓄積する。培養終了後、
イオン交換樹脂法、吸着法、沈殿法、抽出法などの単独
または組合せにより、培養物から核酸関連物質を回収す
ることができる。

【００２５】

【実施例】次に実施例を示す。 実施例１ (1)ｐｕｒＦのｐＣＥ５３へのクローニング 大腸菌の染色体ＤＮＡは、大腸菌Ｋ１２株（エシェリヒ
ア・コリＡＴＣＣ３３５２５）をバクトトリプトン（デ
ィフコ社製）１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）
５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌを含み、ｐＨを７．２に
調整したＬ培地に植菌し、３０℃で１８時間培養後、得
られた培養菌体からスミスのフェノール抽出法〔Smith.
M.G..;メソッズ・イン・エンチモロジイ(Methods in En
zymology), 12 , Part A, 545(1967) 〕に従い単離し
た。ｐＣＥ５３はこのプラスミドを保有する大腸菌１２
株亜株ＭＭ２９４（特開昭60−210994号公報参照）か
ら、該公報記載の方法により分離精製した。

【００２６】上記で調製した大腸菌Ｋ１２株の染色体Ｄ
ＮＡ１０を１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（以下トリスと略す）−塩酸（ｐＨ７．５）、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂および６ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含む緩衝液（以下Ｙ−100
緩衝液と称する）４０μlに溶かし、２４単位の制限酵
素ＰｓｔＩ（宝酒造社製、以下特記しない限り制限酵素
はすべて宝酒造社製）と２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ
を加え、３７℃で１時間消化反応を行った。その後、６
５℃、１０分間の熱処理により反応を停止させた。

【００２７】一方ｐＣＥ５３プラスミドＤＮＡ３μｇを
Ｙ−１００緩衝液２０μｌ中に溶かし、１２単位のＰｓ
ｔＩと１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で１時間消
化反応を行い、６５℃、１０分間の熱処理により反応を
停止させた。両消化物を混合した後、２０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_2、１０ｍＭジ
チオスレイトールおよび０．５ｍＭＡＴＰを含む緩衝液
（以下Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液と称する）１２０μｌ
および３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加
え４℃、１８時間処理した。このようにして得られたＴ
４ＤＮＡリガーゼ反応混合物を用い、ｐｕｒＦ欠損によ
るヒポキサンチン要求性の大腸菌ＦＬ−４６株をコーエ
ン（Cohen）らの方法〔Cohen et al.,:プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンス(Proc.Natl.Acad.Sci.)U.S.A., 69, 2110(1972)〕
により形質転換し、選択培地（グルコース２ｇ、Ｎａ₂
ＨＰＯ₄ ６ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５
ｇ、ＮＨ₄Ｃｌ １ｇ、ＭｇＳＯ ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５
ｇ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ １５ｍｇ、サイアミン塩酸塩
４ｍｇ、カザミノ酸２ｇ、Ｌ−トリプトファン５０ｍ
ｇ、カナマイシン５０ｍｇおよび寒天１６ｇを水１Ｌに
含みｐＨ７．２に調整した培地）に塗布後、３７℃で３
日間培養することによりカナマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）に耐性で、かつ宿主が示すヒポキサンチン要求性が
相補された形質転換株を得た。

【００２８】この形質転換株からプラスミドをアンらの
方法〔An.G.et al.,ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
イ(J.Bacteriol.), 140, 400(1979)〕により分離精製し
ＰｓｔＩなどの制限酵素で消化することによりプラスミ
ドの構造解析を行った。その結果、ｐＣＥ５３のＰｓｔ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片に大腸菌Ｋ１２株の染色体ＤＮＡ由
来の約９ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片が挿入
された組換え体プラスミドであることを確認し、このプ
ラスミドをｐＥＦ１２と名付けた。ｐＥＦ１２を用い、
大腸菌ＦＬ−４６株をコーエンらの方法により再形質転
換したところ、カナマイシン耐性株として選択される形
質転換株のすべでがヒポキサンチン非要求性となってい
た。これらのことより、ｐＥＦ１２にｐｕｒＦがクロー
ン化されていることが確認された。

【００２９】(2)プラスミドｐＥＦ１２のブレビバクテ
リウム・アンモニアゲネスへの導入 (1)にて分離精製したプラスミドｐＥＦ１２をブレビバ
クテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２の形
質転換に供した。形質転換は下記のようにして調製した
ＡＴＣＣ６８７２株のプロトプラストを用いて行った。
ＡＴＣＣ６８７２株をＮＢ培地で３０℃、１６時間振盪
培養し、その種培養液０．８ｍｌをＧIII培地８ｍｌの
入ったＬ字型試験管に接種し、モノー型振盪培養機を用
いて３０℃で振盪培養した。培地の吸光度を東京光電比
色計にて経時的に測定し、対数増殖期の初期（培養時間
約３時間、菌体濃度約１０ ⁸個／ｍｌ) に０．３Ｕ／ｍ
ｌになるようにペニシリンＧを添加し、さらに３時間培
養を続けた。培養液から菌体を集菌しＧIII培地で洗浄
後、２．０ｍｇ／ｍｌ卵白リゾチーム、０．６ｍｇ／ｍ
ｌアクロモペプチダーゼ含有Ｐ３高張液１ｍｌに再懸濁
し、３０℃で１６時間静置してプロトプラスト化した。

【００３０】このプロトプラスト懸濁液０．５ｍｌを小
試験管にとり２，５００×ｇ, １０分間遠心分離し、Ｔ
ＳＭＣ緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、３０ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ ₂ 、５０ｍＭトリス−塩酸、０．４Ｍシュクロー
ス、ｐＨ７．５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳ
ＭＣ緩衝液０．１ｍｌに再懸濁した。この懸濁液にｐＥ
Ｆ１２プラスミドＤＮＡ１０μｇを含むＴＳＭＣ緩衝液
０．１ｍｌを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に
２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６，０００
（半井化学薬品社製）を含む液０．８ｍｌを添加して混
合した。１０分後、ＧIII培地２ｍｌを添加し、２，５
００×ｇ, １０分間遠心分離し上澄液を除去した。沈降
したプロトプラストを１ｍｌのＧIII培地に懸濁してか
ら、該懸濁液の０．２ｍｌをカナマイシン２００μｇ／
ｍｌを含む高張寒天培地（ＧIII培地に０．５Ｍコハク
酸２ナトリウム、1.４％寒天を含む）に塗布し、３０℃
で１４日間培養し、培地上に生育してくるカナマイシン
耐性の形質転換株Ｔ−５１を得た。得られた形質転換株
は、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＴ−５１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３３２）として、昭和６２年４月
３日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ている。

【００３１】(3)ブレビバクテリウム・アンモニアゲネ
スからのプラスミドの調製 (2)で得られた形質転換株Ｔ−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１３３２）からｐＥＦ１２プラスミドを次のようにして
単離、精製した。ＮＢ培地で３０℃、１６時間振盪培養
し、その種培養液４ｍｌをＧIII培地４００ｍｌに接種
し、３０℃で振盪培養した。対数増殖期の初期（菌体濃
度１０⁸個／ｍｌ）に０．３Ｕ／ｍｌになるようにペニ
シリンＧを添加し、さらに５時間培養を続けた。培養液
から菌体を集菌しＴＥＳ緩衝液〔３０ｍＭトリス−塩
酸、５ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤ
ＴＡ）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０〕で洗浄後、
リゾチーム−アクロモペプチダーゼ液（１２．５％シュ
クロース、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−塩
酸、３ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍｇ／ｍｌアクロモペ
プチダーゼ、ｐＨ８．０）で１０ｍｌに懸濁し、３７℃
で４時間反応させた。反応液に５Ｍ ＮａＣｌ ２．４
ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．６ｍｌ、
４％ラウリル硫酸ナトリウムと０．７Ｍ ＮａＣｌから
なる溶液４．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水中に１６時間置いた。溶菌物全体を遠心分離管に
移し、４℃で６０分間６９，０００×ｇの遠心分離を行
い上清液を回収した。

【００３２】これに重量百分率１０％相当のＰＥＧ６，
０００を加え、静かに混和して溶解後、氷水中に置い
た。１０時間後、１，５００×ｇで１０分間遠心分離し
てペレットを回収した。ＴＥＳ緩衝液５ｍｌを加えてペ
レットを静かに再溶解してから、１．５ｍｇ／ｍｌエチ
ジウムブロマイド２．０ｍｌを添加し、これに塩化セシ
ウムを加えて静かに溶解し密度を１．５８０に合わせ
た。この溶液を２０℃、１０５，０００×ｇで４０時間
超遠心分離にかけた。この密度勾配遠心により共有結合
で閉じられた環状のＤＮＡは紫外線照射下に遠心チャー
ブ中下方の密度の高いバンドとして見出された。このバ
ンド部分を注射器で遠心チューブの側面から抜き取るこ
とによってｐＥＦ１２プラスミドＤＮＡを含む液を分離
した。次いで分離液を等容量のイソプロパノール〔容量
百分率、イソプロパノール：ＴＥＳ緩衝液＝９：１（な
おこのＴＥＳ緩衝液は飽和溶解量の塩化セシウムを含
む）〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、しかる後にＴＥＳ緩衝液に対して透析した。

【００３３】こうして単離、精製したプラスミドＤＮＡ
をＰｓｔＩなどの制限酵素で消化することによって構造
解析を行った。その結果、(1)で確認したｐＥＦ１２と
同じ構造を有していることが確認された。

【００３４】(4)プラスミドのイノシン生産性菌株への
導入と、該形質転換株のＡＰＴａｓｅ活性の測定 イノシン生産能を有するブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネスＡＴＣＣ２１４７７を(2)と同様の方法でプロ
トプラスト化したのち(3)にて単離、精製した組換え体
プラスミドｐＥＦ１２を用いて形質転換し、カナマイシ
ン耐性の形質を有する形質転換株を取得した。

【００３５】ＡＴＣＣ２１４７７および形質転換株ＡＴ
ＣＣ２１４７７／ｐＥＦ１２のＡＰＴａｓｅの活性の測
定は公知の方法〔J.M.Lewis and S.C.Hartman, メソッ
ズ・イン・エンチモロジイ（Methods in Enzymology),
51,171-178 (1978)〕を若干改変して下記のように実施
した。活性測定に供する菌株を、１００ｍｌのＧIII培
地を含む５００ｍｌの三角フラスコを用いて３０℃、１
６時間振盪培養し、得られた菌体を超音波で破砕して溶
菌液を調製した。これを６，０００×ｇ、３０分間遠心
分離して得た上清を粗酵素液として用い、３０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ８．０）、９ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６ｍ
Ｍフッ化カリウム（ＫＦ）、３ｍＭホスホリボシルピロ
リン酸、１２ｍＭグルタミンからなる溶液０．３ｍｌ中
で２５℃、５分間反応させた。なおグルタミンを含まな
いものを対照実験とした。反応終了後、０．１ｍｌの
１．０Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）、０．０５
ｍｌの３ｍＭピロリン酸ナトリウム溶液、０．１ｍｌの
０．１Ｍ塩化マンガン溶液を順次加えた後、１，５００
×ｇ、５分間遠心分離してペレットを回収した。これに
０．５ｍｌの０．０１Ｍ塩化マンガン溶液、０．１ｍｌ
の１０％アセトン溶液を順次加えて洗浄後、遠心分離し
てペレットを回収した。このペレットに１．０Ｎ硫酸
１．０ｍｌを加え、１００℃、１５分間加熱した。冷却
後、無機リン測定用アッセイキット（和光純薬社製）を
用いてリンの定量を行い、グルタミン依存性の活性を測
定することによりＡＰＴａｓｅ活性を求めた。第４表に
活性測定結果を示す。

【００３６】

【表４】

【００３７】ｐｕｒＦを含む組換え体プラスミドｐＥＦ
１２が導入されたことにより、ＡＰＴａｓｅ活性が１．
５倍に増大しており、明らかに活性上昇効果が認められ
た。

【００３８】(5)形質転換株によるイノシンの生産 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１４
７７およびその形質転換株ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＥＦ
１２のイノシン生産性を調べた。

【００３９】両菌株を各々ＮＢ培地２０ｍｌを含む２５
０ｍｌ容三角フラスコに一白金耳ずつ接種し、３０℃、
２４時間培養して得た種培養液を、生産培地（グルコー
ス１３０ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １０ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １０
ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１０ｇ、コーンスチープリカー
２０ｇ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ、ＦｅＳＯ ₄
・７Ｈ₂Ｏ １０ｍｇ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２ｍｇ、
ＭｎＣｌ₂・４−６Ｈ₂Ｏ２ｍｇ、ビオチン ３０μｇ、
ビタミンＢ₁ ５ｍｇ、パントテン酸カルシウム １０
ｍｇ、ニコチン酸 ５ｍｇ、アデニン １００ｍｇ、グ
アニン １００ｍｇ、尿素 ４ｇを純水１Ｌに含みｐＨ
７．６に調整した培地）２０ｍｌを含むバッフルプレー
ト付２５０ｍｌ容三角フラスコに１０％（容量比）の割
合で植菌し、３０℃で４日間、２２０ｒｐｍにて振盪培
養した。培養中４８および７２時間目に別殺菌した尿素
を２ｇ／Ｌの割合で添加しｐＨを調整した。培養終了
後、培養物中のイノシン蓄積量をペーパークロマトグラ
フィーにより定量した。その結果を第５表に示す。

【００４０】

【表５】

【００４１】ｐｕｒＦを含む組換え体プラスミドｐＥＦ
１２を導入したことにより、顕著なイノシン生産性の改
善が認められた。

【００４２】実施例２ 実施例１の(3)で単離、精製した組換え体プラスミドｐ
ＥＦ１２を用い、５’−イノシン酸生産能を有するブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ１３１８４（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−３７９０）を、実施例１の(2)と同様の方
法でプロトプラスト化したのち形質転換し、カナマイシ
ン耐性の形質を有する形質転換株を取得した。該形質転
換株ＫＹ１３１８４／ｐＥＦ１２のＡＰＴａｓｅ活性の
測定を実施例１の(4)と同様の方法で実施した。その結
果を第６表に示す。また該形質転換株ＫＹ１３１８４／
ｐＥＦ１２を実施例１の(5)と同様にしてペーパークロ
マトグラフィーにより５’−イノシン酸を定量した。蓄
積した５’−イノシン酸の量を第７表に示す。対照菌株
として親株ＫＹ１３１８４を用い同様に実施した。

【００４３】

【表６】

【００４４】

【表７】

【００４５】ｐＥＦ１２が導入されたことにより、ＡＰ
Ｔａｓｅ活性の上昇、５’−イノシン酸生産性の改善が
認められた。

【００４６】実施例３ 実施例１の(3)で単離、精製した組換え体プラスミドｐ
ＥＦ１２を用い、５’−キサンチル酸生産能を有するブ
レビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１０７
５を形質転換した。形質転換は、ペニシリン濃度を０．
５Ｕ／ｍｌとしてプロトプラストを調製する以外は実施
例１の(2)と同様にして行い、カナマイシン耐性形質を
獲得した形質転換株を取得した。該形質転換株ＡＴＣＣ
２１０７５／ｐＥＦ１２のＡＰＴａｓｅ活性の測定を実
施例１の(4)と同様の方法で実施した。対照としてＡＴ
ＣＣ２１０７５株を用い同様に処理した。結果を第８表
に示す。

【００４７】

【表８】

【００４８】ｐｕｒＦを含む組換え体プラスミドｐＥＦ
１２が導入されたことにより、ＡＰＴａｓｅ活性の上昇
が認められた。次に該形質転換株ＡＴＣＣ２１０７５／
ｐＥＦ１２の５’−キサンチル酸生産能を調べた。ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１０７５
およびＡＴＣＣ２１０７５／ｐＥＦ１２をＮＢ培地２０
ｍｌを含む２５０ｍｌ容三角フラスコに各々一白金耳ず
つ接種し、３０℃、２４時間培養して得た種培養液を実
施例１の(5)と同じ組成の生産培地２０ｍｌを含む２５
０ｍｌ容三角フラスコに１０％（容量比）の割合で植菌
し、３０℃で４日間、２２０ｒｐｍにて振盪培養した。
培養中４８および７２時間目に別殺菌した尿素を２ｇ／
Ｌの割合で添加しｐＨを調整した。蓄積した５’−キサ
ンチル酸をペーパークロマトグラフィーにより定量し
た。結果を第９表に示す。

【００４９】

【表９】

【００５０】ｐｕｒＦを含む組換え体プラスミドｐＥＦ
１２が導入されたことにより、５’−キサンチル酸の生
産性改善が認められた。

【００５１】

【発明の効果】本発明方法により、プリンヌクレオチド
生合成に関与する酵素であるＡＰＴａｓｅの遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有させたコリ
ネバクテリウム属またはブレヒバクテリウム属に属する
微生物および該微生物を用いた核酸関連物質の製造法を
提供することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネバクテリウム属またはブレビバク
   テレウム属に属する微生物のアミドフォスフォリボシル
   ・トランスフェラーゼの合成に関与する遺伝情報を担う
   ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 エシェリヒア属、コリネバクテリウム属
   またはブレビバクテリウム属に属する微生物のアミドフ
   ォスフォリボシル・トランスフェラーゼの合成に関与す
   る遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換
   え体ＤＮＡを保有し、コリネバクテリウム属またはブレ
   ビバクテリウム属に属し、かつ核酸関連物質を生産する
   能力を有する微生物。
3. 【請求項３】 エシェリヒア属、コリネバクテリウム属
   またはブレビバクテリウム属に属する微生物のアミドフ
   ォスフォリボシル・トランスフェラーゼの合成に関与す
   る遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換
   え体ＤＮＡを保有し、コリネバクテリウム属またはブレ
   ビバクテリウム属に属し、かつ核酸関連物質を生産する
   能力を有する微生物がブレビバクテリウム・アンモニア
   ゲネスＴ−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３３２）である請
   求項２記載の微生物。