JP7372329B2 - プリンヌクレオチドを生産する微生物及びそれを用いたプリンヌクレオチドの生産方法 - Google Patents
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Description
pstS開始コドン置換菌株の作製及びXMP生産能の評価
1-1.pstS開始コドン置換組換えベクター及びXMP生産菌株の作製
XMP生産菌株であるCJX1664(コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872由来のXMP生産株,KCCM12285P,特許文献4)及びそのpurA(G85S)変異株であるCJX1664::purA(G85S)(KCCM12286P,特許文献4)の内在性pstS遺伝子の活性が強化された菌株を作製するために、pstSの内在性開始コドンであるGTGをタンパク質の発現率が相対的に高い開始コドンであるATGに置換する実験を行った。
作製した菌株のXMP生産能を測定するために、フラスコ評価を行った。次の種培地2.5mlを含有する14mlのチューブにCJX1664、CJX1664_pstS(g1a)、CJX1664::purA(G85S)、CJX1664::purA(G85S)_pstS(g1a)を接種し、30℃にて170rpmで24時間振盪培養した。次の生産培地32ml(本培地24ml+別途殺菌培地8ml)を含む250mlのコーナーバッフルフラスコに0.7mlの種培養液を接種し、30℃にて170rpmで75時間振盪培養した。
XMPフラスコ種培地
グルコース30g/L,ペプトン15g/L,酵母エキス15g/L,塩化ナトリウム2.5g/L,尿素3g/L,アデニン150mg/L,グアニン150mg/L,pH7.0(培地1L中)
XMPフラスコ生産培地(本培地)
グルコース50g/L,硫酸マグネシウム10g/L,塩化カルシウム100mg/L,硫酸鉄20mg/L,硫酸マンガン10mg/L,硫酸亜鉛10mg/L,硫酸銅0.8mg/L,ヒスチジン20mg/L,シスチン15mg/L,β-アラニン15mg/L,ビオチン100ug/L,チアミン5mg/L,アデニン50mg/L,グアニン25mg/L,ナイアシン15mg/L,pH7.0(培地1L中)
XMPフラスコ生産培地(別途殺菌培地)
リン酸二水素カリウム18g/L,リン酸水素二カリウム42g/L,尿素7g/L,硫酸アンモニウム5g/L(培地1L中)
pstC開始コドン置換菌株の作製及びIMP生産能の評価
2-1.pstC開始コドン置換組換えベクター及びIMP生産菌株の作製
IMP生産菌株であるCJI2335(コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872由来のIMP生産株,KCCM12278P,特許文献5)の染色体遺伝子を分離し、配列番号15と配列番号16のプライマー対、及び配列番号17と配列番号18のプライマー対を用いて、重合酵素連鎖反応により遺伝子断片(pstC(ATG)-A,pstC(ATG)-B)をそれぞれ得た。PCRは、94℃で5分間の変性後、94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で1分間の重合を20サイクル行い、その後72℃で7分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ771bp、766bpのポリヌクレオチドが得られた。
実施例2-1で作製したpstC開始コドン置換菌株であるCJI2335_pstC(g1a)、CJI2332::purA(G85S)_pstC(gla)におけるIMP生産能の向上を確認するために、次の実験を行った。
IMP種培地
グルコース1%,ペプトン1%,肉汁1%,酵母エキス1%,塩化ナトリウム0.25%,アデニン100mg/L,グアニン100mg/L,pH7.2(培地1L中)
IMPフラスコ発酵培地
グルタミン酸ナトリウム0.1%,塩化アンモニウム1%,硫酸マグネシウム1.2%,塩化カルシウム0.01%,硫酸鉄20mg/L,硫酸マンガン20mg/L,硫酸亜鉛20mg/L,硫酸銅5mg/L,L-システイン23mg/L,アラニン24mg/L,ニコチン酸8mg/L,ビオチン45μg/L,チアミン塩酸塩5mg/L,アデニン30mg/L,リン酸(85%)1.9%,グルコース4.2%,原糖2.4%(培地1L中)
pstC開始コドン置換菌株の作製及びXMP生産能の評価
3-1.pstC開始コドン置換組換えベクター及びXMP生産菌株の作製
XMP生産能を有する菌株であるCJX1664、CJX1664::purA(G85S)に実施例2-1で作製したpDZ-pstC(ATG)ベクターをエレクトロポレーション法で形質転換し、その後カナマイシン25mg/Lを含有する選択培地で染色体上に変異遺伝子が挿入された菌株を1次候補群として選択した。その後、2次交差過程を経て、染色体上の内在性pstCの開始コドンがATGに置換された菌株を得た。開始コドンが置換された遺伝子は、実施例2-1と同様に確認した。前記方法で得られたpstC開始コドン置換菌株をCJX1664_pstC(g1a)、CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a)と命名した。
前記CJX1664_pstC(g1a)、CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a)菌株のXMP生産能を測定するために、実施例1-2の方法でフラスコ評価を行った。培養結果を表5に示す。
pstS及びpstC開始コドン同時置換菌株の作製及びIMP生産能の評価
4-1.pstS及びpstC開始コドン同時置換IMP生産菌株の作製
高い活性を示す開始コドン(ATG)をpstSとpstCの2つ遺伝子の両方に導入した菌株を作製するために、実施例2-1で作製した菌株であるCJI2335_pstC(g1a)、CJI2332::purA(G85S)_pstC(g1a)に、実施例1-1の方法で作製したベクターpDZ-pstS(ATG)を挿入した。ベクターが挿入された菌株の選択方法は、実施例1-1と同様にした。この過程を経て、pstSとpstCの開始コドンが置換組換えベクターで形質転換された菌株を選択し、2次選択過程を経て、菌株の作製を完了した。作製した菌株をCJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a)、CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)と命名した。
前記CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a)、CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)菌株のIMP生産能を測定するために、実施例2-2と同様にフラスコ評価を行った。
pstSC強化のためのpstSCABオペロン強化IMP生産菌株の作製及び評価
5-1.コリネバクテリウム・スタティオニス由来pstSC強化のためのpstSCAB遺伝子オペロンのコピー数が増加したベクターの作製及びIMP生産菌株の作製
pstSCの活性強化のためにコピー数を増加させた微生物を作製し、IMPの生産能を評価した。
コリネバクテリウム・スタティオニス由来pstSCがコピー数増加により活性強化されたCJI2335_2pstSCAB、CJI2332::purA(G85S)_2pstSCAB菌株、親株であるCJI2335、CJI2332::purA(G85S)を用いて、実施例2-2のフラスコ評価方法でIMP生産能を評価した。その結果を表8に示す。
pstSC強化のためのpstSCABオペロン強化XMP生産菌株の作製及び評価
6-1.コリネバクテリウム・スタティオニス由来pstSCAB遺伝子オペロンのコピー数が増加したXMP生産菌株の作製
実施例5-1で作製したpDZ-2pstSCABベクターが導入されたXMP生産菌株であるCJX1664、CJX1664::purA(G85S)にエレクトロポレーション法で形質転換し、2次交差過程を経て、染色体上の内在性pstSCAB遺伝子の隣に1つのpstSCAB遺伝子をさらに挿入し、総数を2つに増加させた菌株を得た。連続して挿入されたpstSCAB遺伝子は、2つのpstSCAB連結部位を増幅する配列番号24と配列番号25のプライマーを用いたPCRにより最終確認した。前記方法で得られたpstSCABコピー数が増加した菌株をCJX1664_2pstSCAB、CJX1664::purA(G85S)_2pstSCABと命名した。
前記CJX1664_2pstSCAB、CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB菌株のXMP生産能を測定するために、実施例1-2と同様にフラスコ評価を行った。
pstSC強化のためのpstSCAB遺伝子プロモーター置換IMP生産菌株の作製及び評価
7-1.pstSCAB遺伝子プロモーター置換組換えベクターの作製及びIMP生産菌株の作製
リン酸流入因子Pstシステムの構成要素タンパク質をコードするpstSCの発現量を増加させるために、染色体内のpstS自己プロモーターを活性が強いことが知られているcj7プロモーター(特許文献3)に置換した。
コリネバクテリウム・スタティオニス由来pstSCのcj7プロモーター適用により活性が強化されたCJI2335_Pcj7/pstS、CJI2332::purA(G85S)_Pcj7/pstS菌株、親株であるCJI2335、CJI2332::purA(G85S)を用いて、実施例2-2のフラスコ評価方法によりIMP生産能を評価した。その結果を表11に示す。
pstSC強化のためのpstSCAB遺伝子プロモーター置換XMP生産菌株の作製及び評価
8-1.pstSCAB遺伝子プロモーター置換XMP菌株の作製
実施例7-1で作製したpDZ-pCJ7/PstSCABベクターをXMP生産菌株であるCJX1664、CJX1664::purA(G85S)菌株にエレクトロポレーション法で形質転換し、2次交差過程を経て、染色体上の内在性pstSCABのプロモーターがcj7プロモーターに置換された菌株を作製した。置換されたcj7プロモーターは、cj7プロモーターとpstS遺伝子の一部を連結して増幅する配列番号32、配列番号33をプライマー対としたPCRにより最終確認した。前記方法で得られた菌株をCJX1664_Pcj7/pstS、CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstSと命名した。
コリネバクテリウム・スタティオニス由来pstSCのcj7プロモーター適用により活性が強化されたCJX1664_Pcj7/pstS、CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstS菌株、親株であるCJX1664、CJX1664::purA(G85S)を用いて、実施例1-2のフラスコ評価方法でXMP生産能を評価した。その結果を表12に示す。
Claims (9)
- プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム(Corynebacterium)属微生物であって、pstSCABオペロンによりコードされるリン酸流入システムの活性が、その内在性活性に比べて強化されるよう改変されることにより、前記プリンヌクレオチドの生産能が、改変前の微生物に比べて増加しており、
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)であり、
前記改変前の微生物が、野生型のコリネバクテリウム・スタティオニスであり、
前記活性の強化が、
1)前記リン酸流入システムをコードする遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法、
2)前記リン酸流入システムをコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、
3)前記リン酸流入システムの開始コドン又は5'UTR領域の塩基配列を改変する方法、
4)前記リン酸流入システム活性が増加するように染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法、
5)前記リン酸流入システムの活性を示す外来ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを導入する方法、又は
6)前記方法の組み合わせ、により行われている、
コリネバクテリウム属微生物。 - 前記リン酸流入システムの活性強化は、pstS、pstC、pstA及びpstBからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が強化されるものである、請求項1に記載のコリネバクテリウム属微生物。
- 前記pstS遺伝子によりコードされるタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列を含むものである、請求項2に記載のコリネバクテリウム属微生物。
- 前記pstC遺伝子によりコードされるタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列を含むものである、請求項2に記載のコリネバクテリウム属微生物。
- 前記プリンヌクレオチドは、5'-イノシン酸(5'-inosinemonophosphate,IMP)、5'-キサンチル酸(5'-xanthosine monophosphate,XMP)及び5'-グアニル酸(5'-guanosine monophosphate,GMP)からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項1に記載のコリネバクテリウム属微生物。
- プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、プリンヌクレオチドの生産方法であって、前記コリネバクテリウム属微生物において、pstSCABオペロンによりコードされるリン酸流入システムの活性が、その内在性活性に比べて強化されるよう改変されることにより、前記プリンヌクレオチドの生産能が、改変前の微生物に比べて増加しており、
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)であり、
前記改変前の微生物が、野生型のコリネバクテリウム・スタティオニスであり、
前記活性の強化が、
1)前記リン酸流入システムをコードする遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法、
2)前記リン酸流入システムをコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、
3)前記リン酸流入システムの開始コドン又は5'UTR領域の塩基配列を改変する方法、
4)前記リン酸流入システム活性が増加するように染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法、
5)前記リン酸流入システムの活性を示す外来ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを導入する方法、又は
6)前記方法の組み合わせ、により行われる、
方法。 - 前記方法は、培養した培地又は微生物からプリンヌクレオチドを回収するステップをさらに含む、請求項6に記載のプリンヌクレオチドの生産方法。
- 前記プリンヌクレオチドは、5'-イノシン酸、5'-キサンチル酸及び5'-グアニル酸からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項7に記載のプリンヌクレオチドの生産方法。
- コリネバクテリウム属微生物を含むプリンヌクレオチド生産用組成物であって、前記コリネバクテリウム属微生物において、pstSCABオペロンによりコードされるリン酸流入システムの活性が、その内在性活性に比べて強化されるよう改変されることにより、プリンヌクレオチドの生産能が、改変前の微生物に比べて増加している、強化されたコリネバクテリウム属微生物を含み、
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)であり、
前記改変前の微生物が、野生型のコリネバクテリウム・スタティオニスであり、
前記活性の強化が、
1)前記リン酸流入システムをコードする遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法、
2)前記リン酸流入システムをコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、
3)前記リン酸流入システムの開始コドン又は5'UTR領域の塩基配列を改変する方法、
4)前記リン酸流入システム活性が増加するように染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法、
5)前記リン酸流入システムの活性を示す外来ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを導入する方法、又は
6)前記方法の組み合わせ、により行われている、
プリンヌクレオチド生産用組成物。
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