JP2024501753A - イソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体及びそれを用いたｌ－ロイシンの生産方法 - Google Patents

Abstract

本出願は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体及びそれを用いたＬ－ロイシンの生産方法に関する。【選択図】なし

Description

本出願は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体及びそれを用いたＬ－ロイシンの生産方法に関する。

Ｌ－ロイシンは、必須アミノ酸の一種であって、医薬、食品、飼料添加物、工業薬品など、広範囲に用いられる高価なアミノ酸であり、主に微生物を用いて生産される。Ｌ－ロイシンが含まれる分枝鎖アミノ酸の発酵生産は、主にエシェリキア属微生物又はコリネバクテリウム属微生物により行われ、ピルビン酸から様々な段階を経て２－ケトイソカプロン酸（2-ketoisocaproate）が前駆体として生合成されることが知られている（特許文献１，２）。

上記Ｌ－ロイシン生合成に関与する酵素であるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）は、バリン生合成経路で生成される２－ケトイソ吉草酸（2-ketoisovalerate）をバリンに変換するのではなく、ロイシン生合成に必要なイソプロピルリンゴ酸（isopropylmalate）に変換するロイシン生合成の第１段階酵素であり、ロイシン生合成過程において重要な酵素である。しかし、前記イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、最終産物であるＬ－ロイシン又はその誘導体によるフィードバック阻害を受ける。よって、高濃度ロイシン生産を目的としてフィードバック阻害を解除したイソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体に関する様々な先行技術が存在するが（特許文献３，４）、依然としてよりよい変異体を見出すための研究は続けられている。

韓国登録特許第１０－０２２００１８号公報 韓国登録特許第１０－０４３８１４６号公報 米国特許出願公開第２０１５／００７９６４１号明細書 米国特許第６４０３３４２号明細書 国際公開第２０２１／１８７７８１号 米国特許第７６６２９４３号明細書 米国特許第１０５８４３３８号明細書 米国特許第１０２７３４９１号明細書 米国特許出願公開第２０２１／０２５４１１１号明細書 国際公開第２０２１／１１２４６９号

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本発明者らは、高濃度のＬ－ロイシン生産に用いることのできるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体を見出すべく鋭意努力した結果、新規なイソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体を見出し、それを含む微生物から高収率でＬ－ロイシンを生産できることを確認し、本出願を完成するに至った。

本出願は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）活性を有する変異型ポリペプチドを提供することを目的とする。

また、本出願は、本出願の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。

さらに、本出願は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することを目的とする。

さらに、本出願は、本出願の変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを含む、Ｌ－ロイシンを生産するコリネバクテリウム属（The genus of Corynebacterium）微生物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、本出願の変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを含む、Ｌ－ロイシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－ロイシン生産方法を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、本出願の変異型ポリペプチド、もしくは本出願のポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム・グルタミカム菌株、又はそれを培養した培地を含むＬ－ロイシン生産用組成物を提供することを目的とする。

本出願において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を有する変異型ポリペプチドは、野生型イソプロピルリンゴ酸シンターゼに比べて活性が向上するものであり、それを用いてＬ－ロイシンを高収率で大量生産することができる。

以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。さらに、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。

上記目的を達成するための本出願の一態様は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。

具体的には、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）１３８番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｉ）１６２番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｉｉ）２１１番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｖ）２４５番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及びｖ）５８８番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むものであってもよい。

本出願における「イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase, IPMS）」とは、２－ケトイソ吉草酸（2-ketoisovalerate）をアセチルＣｏＡと反応させてＬ－ロイシンの前駆体の一つであるイソプロピルリンゴ酸（isopropylmalate）に変換する酵素を意味する。本出願におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼは、イソプロピルリンゴ酸合成酵素、ＩＰＭＳ、ＬｅｕＡタンパク質又はＬｅｕＡと混用されてもよい。

本出願における前記ＬｅｕＡは、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られ、具体的には、ｌｅｕＡ遺伝子によりコードされるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有するタンパク質であるが、これに限定されるものではない。

前記ＬｅｕＡは、コリネバクテリウム属微生物由来の酵素であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のイソプロピルリンゴ酸シンターゼであってもよい。

本出願のＬｅｕＡは、配列番号１のアミノ酸配列を含むものであるが、これに限定されるものではない。また、前記ＬｅｕＡは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するポリペプチドを含むものであってもよい。さらに、このような相同性又は同一性を有してイソプロピルリンゴ酸シンターゼに相当する活性を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠損、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。

例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部における本出願のタンパク質の機能を変更しない配列の付加もしくは欠失、自然に発生し得る突然変異、非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。

前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。通常、保存的置換は、タンパク質又はポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。

本出願のＬｅｕＡは、配列番号１のアミノ酸配列又はそれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよく、前記アミノ酸配列から必須に構成される（consisting essentially of）ものであってもよい。

本出願における「変異型ポリペプチド（variant）」とは、少なくとも１つのアミノ酸が保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により前記変異型ポリペプチドの変異前のアミノ酸配列とは異なるが、機能（functions）又は特性（properties）が維持されるポリペプチドを意味する。このような変異型ポリペプチドは、一般に前記ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸を改変し、その改変したポリペプチドの特性を評価することにより同定（identify）することができる。すなわち、変異型ポリペプチドの能力は、変異前のポリペプチドより向上するか、変わらないか又は低下する。また、一部の変異型ポリペプチドには、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異型ポリペプチドも含まれてもよい。他の変異型ポリペプチドには、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異型ポリペプチドも含まれてもよい。前記「変異型ポリペプチド」は、変異型、改変、変異したタンパク質、変異、変異体など（英語表現では、modification、modified polypeptide、modified protein、mutant、mutein、divergentなど）と混用されるが、変異を意味する用語であればいかなるものでもよい。

また、変異型ポリペプチドは、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、変異型ポリペプチドのＮ末端には、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移動（translocation）に関与するシグナル（又はリーダー）配列が結合されてもよい。また、前記変異型ポリペプチドは、確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。

本出願の変異型ポリペプチドは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有するものであってもよい。また、本出願の変異型ポリペプチドは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する野生型ポリペプチドより強化されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有するものであってもよい。

本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）１３８番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｉ）１６２番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｉｉ）２１１番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｖ）２４５番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及びｖ）５８８番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むものであってもよく、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）１３８番目に相当する位置のアミノ酸残基であるロイシンのロイシン以外の他のアミノ酸残基への置換、ｉｉ）１６２番目に相当する位置のアミノ酸残基であるヒスチジンのヒスチジン以外の他のアミノ酸残基への置換、ｉｉｉ）２１１番目に相当する位置のアミノ酸残基であるセリンのセリン以外の他のアミノ酸残基への置換、ｉｖ）２４５番目に相当する位置のアミノ酸残基であるアスパラギンのアスパラギン以外の他のアミノ酸残基への置換、及びｖ）５８８番目に相当する位置のアミノ酸残基であるイソロイシンのイソロイシン以外の他のアミノ酸残基への置換からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むものであってもよく、より具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）１３８番目に相当する位置のアミノ酸残基であるロイシンのグリシンへの置換、ｉｉ）１６２番目に相当する位置のアミノ酸残基であるヒスチジンのグルタメートへの置換、ｉｉｉ）２１１番目に相当する位置のアミノ酸残基であるセリンのロイシンへの置換、ｉｖ）２４５番目に相当する位置のアミノ酸残基であるアスパラギンのセリンへの置換、及びｖ）５８８番目に相当する位置のアミノ酸残基のイソロイシンのプロリンへの置換からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むものであってもよく、さらに具体的には、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの置換を含むものであってもよい。前記少なくとも２つの置換は、前記ｉ）及びｖ）の組み合わせ、ｉｉ）及びｖ）の組み合わせ、ｉｉｉ）及びｖ）の組み合わせ、又はｉｖ）及びｖ）の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。前記少なくとも４つの置換は、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）の組み合わせであるが、これに限定されるものではない。前記少なくとも５つの置換は、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）及びｖ）の組み合わせであってもよい。

本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸配列を有する／含むものであってもよく、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸配列からなる／から必須に構成されるものであってもよい。本出願の変異型ポリペプチドには、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上、及び１００％未満の同一性又は相同性を有し、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸配列において、ｉ）１３８番目に相当する位置のアミノ酸残基がグリシンであるか、ｉｉ）１６２番目に相当する位置のアミノ酸残基がグルタメートであるか、ｉｉｉ）２１１番目に相当する位置のアミノ酸残基がロイシンであるか、ｉｖ）２４５番目に相当する位置のアミノ酸残基がセリンであるか、又はｖ）５８８番目に相当する位置のアミノ酸残基がプロリンであるポリペプチドが含まれてもよい。具体的には、配列番号６は、配列番号１のアミノ酸配列において１３８番目に相当する位置のアミノ酸残基であるロイシンがグリシンに置換されたアミノ酸配列であってもよく、配列番号８は、１６２番目に相当する位置のアミノ酸残基であるヒスチジンがグルタメートに置換されたアミノ酸配列であってもよく、配列番号１０は、２１１番目に相当する位置のアミノ酸残基であるセリンがロイシンに置換されたアミノ酸配列であってもよく、配列番号１２は、５８８番目に相当する位置のアミノ酸残基であるイソロイシンがプロリンに置換されたアミノ酸配列であってもよく、配列番号１４は、２４５番目に相当する位置のアミノ酸残基であるアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸配列であってもよい。

また、このような同一性又は相同性を有し、本出願の変異型ポリペプチドに相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸配列において、ｉ）１３８番目、ｉｉ）１６２番目、ｉｉｉ）２１１番目、ｉｖ）２４５番目又はｖ）５８８番目以外に、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有する変異型ポリペプチドも本出願に含まれることは言うまでもない。具体的には、前記置換には、（１）イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードするｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡに置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目に相当する位置のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換される変異（Ｒ５５８Ｈ）、（２）ｌｅｕＡ遺伝子の１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換され、５６１番目に相当する位置のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換される変異（Ｇ５６１Ｄ）、及び（３）ｌｅｕＡ遺伝子の７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧに置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリンがシステインに置換される変異（Ｐ２４７Ｃ）の少なくとも１つが含まれるが、これについては前述した通りである。

より具体的には、前記変異型ポリペプチドには、前記ｉ）１３８番目の変異に前記２４７番目、５５８番目及び５６１番目の変異をさらに含む（配列番号３８）ポリペプチド、ｉｉ）１６２番目の変異に前記２４７番目、５５８番目及び５６１番目の変異をさらに含む（配列番号４０）ポリペプチド、ｉｉｉ）２１１番目の変異に前記２４７番目、５５８番目及び５６１番目の変異をさらに含む（配列番号４２）ポリペプチド、ｉｖ）２４５番目の変異に前記２４７番目、５５８番目及び５６１番目の変異をさらに含む（配列番号４４）ポリペプチド、ｖ）５８８番目の変異に前記２４７番目、５５８番目及び５６１番目の変異をさらに含む（配列番号４６）ポリペプチド、ｉｉｉ）２１１番目及びｖ）５８８番目の変異に前記２４７番目、５５８番目及び５６１番目の変異をさらに含む（配列番号４８）ポリペプチド、ｉ）１３８番目、ｉｉ）１６２番目、ｉｉｉ）２１１番目及びｉｖ）２４５番目の変異に前記２４７番目、５５８番目及び５６１番目の変異をさらに含む（配列番号５０）ポリペプチド、又はｉ）１３８番目、ｉｉ）１６２番目、ｉｉｉ）２１１番目、ｉｖ）２４５番目及びｖ）５８８番目の変異に前記２４７番目、５５８番目及び５６１番目の変異をさらに含む（配列番号５２）ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「相当する（corresponding to）」とは、ポリペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はポリペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相当するアミノ酸残基であることを意味する。相当する位置のアミノ酸を確認することは、特定配列を参照する配列の特定アミノ酸を決定することになる。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は比較（reference）タンパク質における類似又は対応する位置を意味する。

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１とアライメント（align）すると、それに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の数、位置を参照してナンバリングすることができる。例えば、本出願における配列アラインメントアルゴリズムは、クエリー配列（「参照配列」ともいう）と比較すると、アミノ酸の位置、又は置換、挿入、欠失などの改変が生じる位置を確認することができる。

このようなアラインメントには、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献１）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅｍａｎプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）などを用いることができるが、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の配列アラインメントプログラム、ペアワイズ配列（pairwise sequence）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。

本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全部又は一部分とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドン縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。

任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献３のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献１）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献１などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。

本出願の他の態様は、本出願の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的には前記変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。

本出願の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０又は配列番号５２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであるが、これらに限定されるものではない。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１又は配列番号５３の塩基配列を有するものであってもよく、前記塩基配列を含むものであってもよい。

前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１又は配列番号５３と相同性又は同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。

また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本出願のポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１１、１２参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸塩基配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。

具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１１）。

例えば、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０又は配列番号５２のアミノ酸配列をコードする配列であればいかなるものを含むものでもよい。

本出願のポリヌクレオチドにおいて、変異型ポリペプチドについては前述した通りである。

本出願のさらに他の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

本出願のベクターとは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれてもよい。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。

本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＣＭ２（特許文献５）、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に導入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。

本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞又は微生物内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。

本出願のベクターにおいて、ポリヌクレオチドについては前述した通りである。

本出願のさらに他の態様は、本出願の変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを含む、Ｌ－ロイシンを生産するコリネバクテリウム属（The genus of Corynebacterium）微生物を提供する。

本出願における「微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（modification）が行われた微生物である。

本出願の微生物は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド、及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物、本出願の変異体、もしくは本出願のポリヌクレオチドを発現するように改変された微生物、本出願の変異体、もしくは本出願のポリヌクレオチドを発現する微生物（例えば、組換え菌株）、又は本出願の変異体の活性を有する微生物（例えば、組換え菌株）であるが、これらに限定されるものではない。

本出願の微生物は、自然にイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性もしくはＬ－ロイシン生産能を有する微生物、又はイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性もしくはＬ－ロイシン生産能のない親株に、本出願の変異型ポリペプチドを発現させるか、Ｌ－ロイシン生産能が付与された微生物であるが、これらに限定されるものではない。

具体的には、本出願の微生物は、本出願のポリヌクレオチド、又は本出願の変異型ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換され、本出願の変異型ポリペプチドを発現する細胞又は微生物であり、本出願の目的上、本出願の微生物は、本出願の変異型ポリペプチドを含み、Ｌ－ロイシンを生産する微生物であればいかなるものでもよい。例えば、本出願の微生物は、天然の野生型微生物又はＬ－ロイシンを生産する微生物に本出願の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することにより、本出願の変異型ポリペプチドが発現し、Ｌ－ロイシン生産能が向上した組換え微生物であってもよい。前記Ｌ－ロイシン生産能が向上した組換え微生物は、天然の野生型微生物又は非改変微生物に比べてＬ－ロイシン生産能が向上した微生物であるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株もしくは天然菌株自体、又は自然要因もしくは人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非改変微生物とは、本明細書におけるタンパク質変異体が導入されていないか、導入される前の菌株を意味する。前記「非改変微生物」は、「改変前の菌株」、「改変前の微生物」、「非変異菌株」、「非改変菌株」、「非変異微生物」又は「基準微生物」と混用される。

具体的には、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウムテス・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であってもよい。

本出願の微生物は、本出願のイソプロピルリンゴ酸シンターゼを構成する配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）１３８番目、ｉｉ）１６２番目、ｉｉｉ）２１１番目、ｉｖ）２４５番目又はｖ）５８８番目以外の少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする塩基配列を含む微生物であってもよく、具体的には、前記置換には、（１）イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードするｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡに置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換される変異（Ｒ５５８Ｈ）、（２）ｌｅｕＡ遺伝子の１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換される変異（Ｇ５６１Ｄ）、又は（３）ｌｅｕＡ遺伝子の７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧに置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリンがシステインに置換される変異（Ｐ２４７Ｃ）の少なくとも１つが含まれるが、これについては前述した通りである。

具体的には、本出願のＬ－ロイシンを生産する微生物は、このような変異を含むイソプロピルリンゴ酸シンターゼを発現することにより、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性が強化された微生物であってもよい。

本出願におけるポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性を内在性活性より向上させることを意味する。前記強化は、上方調節（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、向上（increase）などと混用される。ここで、向上には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用されてもよい。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「強化」又は「向上」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性に比べて向上することを意味する。

前記強化は、外来ポリペプチドの導入により達成してもよく、内在性ポリペプチドの活性の強化により達成してもよい。前記ポリペプチドの活性が強化されたか否かは、当該ポリペプチドの活性の程度、発現量、又は当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加により確認することができる。

前記ポリペプチドの活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的ポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化できるものであればいかなるものでもよい。具体的には、分子生物学における通常の方法であり、当該技術分野における通常の知識を有する者に周知の遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであるが、これらに限定されるものではない（例えば、非特許文献１３、１４など）。

具体的には、本出願のポリペプチド活性の強化は、１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させること、２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域を活性が強力な配列に置換すること、３）ポリペプチドをコードする遺伝子の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域の塩基配列を改変すること、４）ポリペプチド活性が向上するように前記ポリペプチドのアミノ酸配列を改変すること、５）ポリペプチド活性が向上するように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変すること、６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入すること、７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化すること、８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾すること、又は９）前記１）～８）の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。

より具体的には、前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させることは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞に導入することにより行われる。あるいは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体に１コピー又は２コピー以上導入することにより行われてもよい。前記染色体への導入は、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞内に導入することにより行われるが、これに限定されるものではない。前記ベクターについては前述した通りである。

前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域（又は発現調節配列）を活性が強力な配列に置換することは、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有する配列に置換することにより行われる。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。例えば、本来のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（特許文献６）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献７）、Ｏ２プロモーター（特許文献８）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域の塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてポリペプチド発現率が高い他の開始コドンに置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性が向上するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記置換は、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体に挿入することにより行われるが、これに限定されるものではない。ここで、用いられるベクターは、染色体に導入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーについては前述した通りである。

前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入することは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することにより行われる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列はいかなるものでもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前述したように導入したポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチドが生成されてその活性が向上してもよい。

前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化することは、宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するように、内在ポリヌクレオチドのコドンを最適化するか、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われる。

また、前記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾することは、例えば分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が保存されているデータベースと比較し、配列の類似性の程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、それを基に構造を確認し、改変又は化学的に修飾する露出部分を選択して改変又は修飾することにより行われてもよい。

このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性又は濃度が野生型や改変前の微生物菌株で発現するポリペプチドの活性又は濃度に比べて向上するか、当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することにより行われるが、これらに限定されるものではない。

本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変（例えば、前述したタンパク質変異体をコードするための改変）は、（ａ）微生物内の染色体導入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ（engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9）を用いたゲノム編集、並びに／又は（ｂ）紫外線や放射線などの光及び／もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に注入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。この導入されるヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。

より具体的には、本出願のＬ－ロイシンを生産する微生物は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０又は配列番号５２を含むポリペプチド、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０又は配列番号５２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１又は配列番号５３を含むポリヌクレオチドをさらに含む微生物であってもよい。

本出願の微生物において、変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、Ｌ－ロイシンなどについては前述した通りである。

本出願のさらに他の態様は、本出願の変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを含む、Ｌ－ロイシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－ロイシン生産方法を提供する。

本出願における「培養」とは、本出願のコリネバクテリウム属菌株を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び流加培養であるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「培地」とは、本出願のコリネバクテリウム属菌株を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を培養することができる。具体的には、コリネバクテリウム属菌株の培養培地は、非特許文献１５に開示されている。

本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。

また、本出願のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方式で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。さらに、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。

本出願の培養により生産されたＬ－ロイシンは、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留されてもよい。

本出願のＬ－ロイシン生産方法は、本出願のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を準備するステップ、又は前記菌株を培養するための培地を準備するステップをさらに含んでもよい。

本出願のＬ－ロイシン生産方法は、前述したように培養した培地又は本出願のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株からＬ－ロイシンを回収するステップをさらに含んでもよい。

前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするＬ－ロイシンを回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－ロイシンを回収することができる。

また、本出願のＬ－ロイシン生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のＬ－ロイシン生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非連続的に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願の方法において、変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、Ｌ－ロイシンなどについては前述した通りである。

本出願のさらに他の態様は、本出願の変異型ポリペプチド、もしくは本出願のポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム・グルタミカム菌株、又はそれを培養した培地を含むＬ－ロイシン生産用組成物を提供する。

本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本出願の組成物において、変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、Ｌ－ロイシンなどについては前述した通りである。

以下、実施例を挙げて本出願をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示する好ましい実施形態にすぎず、本出願がこれらに限定されるものではない。なお、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野又は類似技術分野における熟練した技術者が十分に理解し、容易に実施することのできるものである。

変異したイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードするＤＮＡライブラリーの作製
１－１．ｌｅｕＡを含むベクターの作製
イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Isopropylmaleate synthase）活性を有するｌｅｕＡ変異ライブラリーを作製するために、まずｌｅｕＡを含む組換えベクターを作製した。野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のＬｅｕＡタンパク質（配列番号１, Uniprot accession code: P42455）をコードするｌｅｕＡ遺伝子（配列番号２）を増幅するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２野生株の染色体を鋳型とし、配列番号３及び４のプライマーを用いて、９４℃で１分間の変性、５８℃で３０秒間の結合、７２℃で１分間のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる重合を２５サイクル行うことによりＰＣＲを行った。用いたプライマーの配列を表１に示す。

そのＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen）により大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして「ｐＣＲ－ｌｅｕＡ」を得た。

１－２．ｌｅｕＡ変異ライブラリーの作製
実施例１－１で作製したベクターに基づいて、エラープローンＰＣＲキット（error-prone PCR kit, clontech Diversify（登録商標） PCR Random Mutagenesis Kit）を用いてｌｅｕＡ変異ライブラリーを作製した。１０００ｂｐ当たり０～３つの変異が起こる条件で、表１に示す配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。

具体的には、９４℃で３０秒間のプレヒーティング（pre-heating）後、９４℃で３０秒間の変性、６８℃で１分３０秒間の重合を２５サイクル行うことによりＰＣＲを行った。ここで、得られたＰＣＲ産物に対して、メガプライマー（megaprimer, 50～125ng）により、９５℃で５０秒間の変性、６０℃で５０秒間の結合、６８℃で１２分間の重合を２５回サイクル行い、その後ＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＤＨ５αに熱ショック法により形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換したコロニー２０種を選択してプラスミドを得て、塩基配列を分析した結果、２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｋｂの頻度で異なる位置に変異が導入されたことが確認された。約２０，０００個の形質転換した大腸菌コロニーを採取してプラスミドを抽出した。これを「ｐＴＯＰＯ－ｌｅｕＡ－ｌｉｂｒａｒｙ」と命名した。

作製したライブラリーの評価及び変異体の選択
２－１．Ｌ－ロイシン生産量が増加した変異菌株の選択
実施例１－２で作製したｐＴＯＰＯ－ｐｈｅＡ－ｌｉｂｒａｒｙを野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する栄養培地（表２）に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株１０，０００個のコロニーを選択した。選択した各コロニーをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）１～ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）１０，０００と命名した。

確保した１０，０００個のコロニーのうち、Ｌ－ロイシン生産が増加し、芳香族アミノ酸であるＬ－フェニルアラニンの生産量が増加及び低減したコロニーを確認するために、各コロニーに対して次の方法で発酵力価評価を行った。

表２の生産培地２５ｍｌと２５ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各コロニーを白金耳で接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養した。培養終了後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC, SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＬ－ロイシン生産量を測定した。

その結果、１０，０００個のコロニーのうち、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べてＬ－ロイシン生産能が最も向上した菌株５種（ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）３８４７，ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）４７０８，ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５１０９，ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）７５６３，ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）８４５９）を選択した。選択した菌株から生産されたＬ－ロイシンの濃度を表３に示す。

表３に示すように、ｌｅｕＡ遺伝子に変異のあるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）３８４７は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシン生産能が約１．４１倍に向上することが確認された。また、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）４７０８、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５１０９、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）７５６３、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）８４５９は、親株に比べて、それぞれ約１．４５倍、１．５９倍、１．３６倍、１．３８倍に向上することが確認された。

２－２．Ｌ－ロイシン生産量が増加した変異菌株の変異の確認
選択した変異菌株５種のｌｅｕＡ遺伝子変異を確認するために、表１に示す配列番号３と配列番号４のプライマーを用いて、各変異菌株のＤＮＡを鋳型とし、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間の結合、７２℃で１分３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合を行う条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンシングを行った。

シーケンシングの結果、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）３８４７菌株は、配列番号２のｌｅｕＡ遺伝子の４１２番目、４１３番目のヌクレオチドであるＣとＴが全てＧに置換されていることが確認された。これは、ＬｅｕＡタンパク質の１３８番目（翻訳開始コドンを３５個後に表記するものであって、ＬｅｕＡタンパク質が５８１個のアミノ酸からなるもの（配列番号５）である公知の文献に基づく場合は１０３番目；以下、１３８番目という）のアミノ酸であるロイシンがグリシンに置換された変異体（以下、Ｌ１３８Ｇという）をコードすることを意味するものである。ＬｅｕＡ変異体（Ｌ１３８Ｇ）のアミノ酸配列及びそれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列を配列番号６及び配列番号７に示す。

ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）４７０８菌株は、ｌｅｕＡ遺伝子の４８４番目、４８６番目のヌクレオチドであるＣが全てＧに置換されていることが確認された。これは、ＬｅｕＡタンパク質の１６２番目（翻訳開始コドンを３５個後に表記するものであって、ＬｅｕＡタンパク質が５８１個のアミノ酸からなるもの（配列番号５）である公知の文献に基づく場合は１２７番目；以下、１６２番目という）のアミノ酸であるヒスチジンがグルタメートに置換された変異体（以下、Ｈ１６２Ｅという）をコードすることを意味するものである。ＬｅｕＡ変異体（Ｈ１６２Ｅ）のアミノ酸配列及びそれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列を配列番号８及び配列番号９に示す。

ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５１０９菌株は、ｌｅｕＡ遺伝子の６３１番目～６３３番目のヌクレオチドであるＴＣＣがＣＴＴに置換されていることが確認された。これは、ＬｅｕＡタンパク質の２１１番目（翻訳開始コドンを３５個後に表記するものであって、ＬｅｕＡタンパク質が５８１個のアミノ酸からなるもの（配列番号５）である公知の文献に基づく場合は１７６番目；以下、２１１番目という）のアミノ酸であるセリンがロイシンに置換された変異体（以下、Ｓ２１１Ｌという）をコードすることを意味するものである。ＬｅｕＡ変異体（Ｓ２１１Ｌ）のアミノ酸配列及びそれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列を配列番号１０及び配列番号１１に示す。

ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）７５６３菌株は、ｌｅｕＡ遺伝子の１７６２番目～１７６３番目のヌクレオチドであるＡＴがＣＣに置換されていることが確認された。これは、ＬｅｕＡタンパク質の５８８番目（翻訳開始コドンを３５個後に表記するものであって、ＬｅｕＡタンパク質が５８１個のアミノ酸からなるもの（配列番号５）である公知の文献に基づく場合は５５３番目；以下、５８８番目という）のアミノ酸であるイソロイシンがプロリンに置換された変異体（以下、Ｉ５８８Ｐという）をコードすることを意味するものである。ＬｅｕＡ変異体（Ｉ５８８Ｐ）のアミノ酸配列及びそれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列を配列番号１２及び配列番号１３に示す。

また、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）８４５９菌株は、ｌｅｕＡ遺伝子の７３３番目～７３４番目のヌクレオチドであるＡＡがＴＣに置換されていることが確認された。これは、ＬｅｕＡタンパク質の２４５番目（翻訳開始コドンを３５個後に表記するものであって、ＬｅｕＡタンパク質が５８１個のアミノ酸からなるもの（配列番号５）である公知の文献に基づく場合は２１０番目；以下、２４５番目という）のアミノ酸であるアスパラギンがセリンに置換された変異体（以下、Ｎ２４５Ｓという）をコードすることを意味するものである。ＬｅｕＡ変異体（Ｎ２４５Ｓ）のアミノ酸配列及びそれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列を配列番号１４及び配列番号１５に示す。

以下の実施例においては、上記変異（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｉ５８８Ｐ）がコリネバクテリウム属微生物のＬ－ロイシン生産量に影響を及ぼすか否かについて確認する。

選択した変異菌株のＬ－ロイシン生産能の確認
３－１．ｌｅｕＡ変異を含む挿入ベクターの作製
実施例２で選択した変異を菌株に導入するために、挿入用ベクターを作製した。ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｉ５８８Ｐ）変異導入用ベクターの作製には、部位特異的突然変異誘発（Site directed mutagenesis）法を用いた。具体的には、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型とし、Ｌ１３８Ｇ変異を生成するために、配列番号１６及び配列番号１７のプライマー対、配列番号１８及び配列番号１９のプライマー対を用い、Ｈ１６２Ｅ変異を生成するために、配列番号１６及び配列番号２０のプライマー対、配列番号１９及び配列番号２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。Ｓ２１１Ｌ変異を生成するために、配列番号１６及び配列番号２２のプライマー対、配列番号１９及び配列番号２３のプライマー対を用い、Ｎ２４５Ｓ変異を生成するために、配列番号１６及び配列番号２４のプライマー対、配列番号１９及び配列番号２５のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。Ｉ５８８Ｐ変異を生成するために、配列番号１６及び配列番号２６のプライマー対、配列番号１９及び配列番号２７のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。より具体的には、９４℃で５分間の変性後に、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間の結合、７２℃で１分３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合を行う条件でＰＣＲを行った。用いたプライマーの具体的な配列を表４に示す。

そのＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣＭ２ベクターとインフュージョン（In-Fusion）酵素を用いて、ＤＮＡ断片間の末端１５塩基の相同配列をフュージョンさせてクローニングし、ＬｅｕＡのアミノ酸を置換するベクター「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｈ１６２Ｅ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｓ２１１Ｌ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｎ２４５Ｓ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｉ５８８Ｐ）」を作製した。また、変異体を組み合わせることにより、ｌｅｕＡのアミノ酸を置換するベクター「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｓ２１１Ｌ，Ｉ５８８Ｐ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｉ５８８Ｐ）」を作製した。

３－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株への変異体の導入及び評価
実施例３－１で作製したｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ）、ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｈ１６２Ｅ）、ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｓ２１１Ｌ）、ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｎ２４５Ｓ）、ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｉ５８８Ｐ）、ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｓ２１１Ｌ，Ｉ５８８Ｐ）、ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ）、ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｉ５８８Ｐ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にｌｅｕＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより判断し、菌株に変異が導入されたことが確認された。作製された菌株は全８種であり、それぞれ「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｌ１３８Ｇ」、「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｈ１６２Ｅ」、「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｓ２１１Ｌ」、「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｎ２４５Ｓ」、「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｉ５８８Ｐ」、「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｓ２１１Ｌ，Ｉ５８８Ｐ）」「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ）」、「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｉ５８８Ｐ）」と命名した。

前述したように作製した全８種の菌株のＬ－ロイシン生産能を評価するために、フラスコ発酵力価評価を行った。生産培地２５ｍｌをそれぞれ含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、及び前述したように作製したＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｌ１３８Ｇ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｈ１６２Ｅ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｓ２１１Ｌ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｎ２４５Ｓ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｉ５８８Ｐ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｓ２１１Ｌ，Ｉ５８８Ｐ）、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ）、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｉ５８８Ｐ）をそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してＬ－ロイシンを生産した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－ロイシンの生産量を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のロイシン濃度を表５に示す。

表５に示すように、ｌｅｕＡ遺伝子にＬ１３８Ｇ変異のあるＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｌ１３８Ｇは、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシンの収率が約１．４５倍に向上し、Ｈ１６２Ｅ変異のあるＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｈ１６２Ｅは、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシンの収率が約１．４９倍に向上し、Ｓ２１１Ｌ変異のあるＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｓ２１１Ｌは、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシンの収率が約１．５８倍に向上し、Ｎ２４５Ｓ変異のあるＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｎ２４５Ｓは、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシンの収率が約１．４０倍に向上し、Ｉ５８８Ｐ変異のあるＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｉ５８８Ｐは、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシンの収率が約１．３７倍に向上し、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｓ２１１Ｌ，Ｉ５８８Ｐ）は、親株に比べて、Ｌ－ロイシンの収率が約１．５１倍に向上した。ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ）とＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｉ５８８Ｐ）は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムに比べて、Ｌ－ロイシンの収率が約１．５６倍に向上することが確認された。

ロイシン生産株におけるｌｅｕＡ選択変異のロイシン生産能の確認
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ロイシンを生産したとしても極微量を生産するにすぎない。よって、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のロイシン生産菌株を作製し、選択した変異を導入してロイシン生産能を確認する実験を行った。具体的な実験方法及び結果は次の通りである。

４－１．Ｌ－ロイシン生産株ＣＪＬ－８１０９菌株の作製
高濃度のＬ－ロイシン生産のための菌株として、（１）ｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡに置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換される変異（Ｒ５５８Ｈ）、（２）ｌｅｕＡ遺伝子の１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換される変異（Ｇ５６１Ｄ）、及び（３）ｌｅｕＡ遺伝子の７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧに置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリンがシステインに置換される変異（Ｐ２４７Ｃ）を含む野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来の菌株を作製した。

具体的には、ｌｅｕＡ遺伝子変異（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）を含むｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクター（特許文献９）をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差を経て、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、配列番号２８及び５５のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間／５５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間）を行い、塩基配列を分析することにより判断し、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ変異が導入されたことが確認された。用いたプライマーの具体的な配列を表６に示す。ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株を「ＣＪＬ－８１００」と命名した。

前記Ｌ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００に変異（Ｐ２４７Ｃ）を導入するために、挿入用ベクターを作製した。

具体的には、ＣＪＬ－８１００菌株の染色体を鋳型とし、配列番号２８及び２９のプライマー、配列番号５４及び５５のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。結果として得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣＭ２ベクターとＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素を用いて、ＤＮＡ断片間の末端１５塩基の相同配列をフュージョンさせてクローニングし、野生型菌株のＬｅｕＡアミノ酸配列において５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換されたＬｅｕＡ変異体をコードするｌｅｕＡ変異を含み、ＬｅｕＡの２４７番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）をシステイン（Ｃｙｓ）に置換するベクターｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）を作製した。

前記ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差を経て、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間の結合、７２℃で９０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合）を行い、塩基配列を分析することにより判断し、Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ及びＧ５６１Ｄ変異が導入されたことが確認された。ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株を「ＣＡ１３－８１０５」と命名した。

前記ＣＡ１３－８１０５は、ブダペスト条約上の受託機関である韓国微生物保存センターに２０２０年４月２９日付けで受託番号ＫＣＣＭ１２７０９Ｐとして寄託した。

作製したＣＡ１３－８１０５菌株においてＬ－ロイシン生産能を向上させるために、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain amino acid aminotransferase）をコードする遺伝子であるｉｌｖＥ変異体（Ｖ１５６Ａ）が導入された菌株を作製した（特許文献１０）。具体的には、前記ｉｌｖＥ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｉｌｖＥ（Ｖ１５６Ａ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１００にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差を経て、ｉｌｖＥ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、表７の配列番号３０及び配列番号３１のプライマー対を用いてＰＣＲ（９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間／５５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間）を行い、塩基配列を分析することにより判断し、Ｖ１５６Ａ変異が導入されたことが確認された。ｐＤＣＭ２－ｉｌｖＥ（Ｖ１５６Ａ）ベクターで形質転換された菌株を「ＣＪＬ－８１０８」と命名した。

作製したＣＪＬ－８１０８菌株においてＬ－ロイシン生産能を向上させるために、クエン酸シンターゼ（Citrate Synthase）活性を弱化させたｇｌｔＡ変異体（Ｍ３１２Ｉ）が導入された菌株を作製した。

具体的には、ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異導入用ベクターの作製には、部位特異的突然変異誘発（Site directed mutagenesis）法を用いた。野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、表８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。結果として得られた遺伝子断片をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣＭ２ベクターとインフュージョン（In-Fusion）酵素を用いて、ＤＮＡ断片間の末端１５塩基の相同配列を結合させてクローニングし、３１２番目のアミノ酸であるメチオニンをイソロイシンに置換するベクターｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を作製した。

前記ｇｌｔＡ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０８にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差を経て、ｇｌｔＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、表９の配列番号３６及び配列番号３７のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間／５５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間）を行い、塩基配列を分析することにより判断し、Ｍ３１２Ｉ変異が導入されたことが確認された。ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターで形質転換された菌株を「ＣＪＬ－８１０９」と命名した。

４－２．ｌｅｕＡ変異を含む挿入ベクターの作製
実施例４－１で作製したＬ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１０９に実施例２で選択した変異（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｉ５８８Ｐ）を導入するために、挿入用ベクターを作製した。

ＣＪＬ－８１０９菌株の染色体を鋳型とし、表４のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間の結合、７２℃で１分３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合を行うものとした。結果として得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣＭ２ベクターとインフュージョン酵素を用いて、ＤＮＡ断片間の末端１５塩基の相同配列をフュージョンさせてクローニングし、全８個のベクター「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ，Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｈ１６２Ｅ，Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｓ２１１Ｌ，Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｎ２４５Ｓ，Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ，Ｉ５８８Ｐ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｓ２１１Ｌ，Ｐ２４７Ｃ，Ｉ５８８Ｐ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）」、「ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｌ１３８Ｇ，Ｈ１６２Ｅ，Ｓ２１１Ｌ，Ｎ２４５Ｓ，Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ，Ｉ５８８Ｐ）」を作製した。

４－３．ＣＪＬ－８１０９菌株へのｌｅｕＡ変異体の導入及び評価
Ｌ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１０９を実施例４－２で作製したベクターで形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株のｌｅｕＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより判断し、菌株にｌｅｕＡ変異が導入されたことが確認された。作製した全８種の菌株を表１１に示すように命名した。変異を含む変異体のアミノ酸配列及びそれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列を表１０に示す。

その後、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、作製したＣＪＬ－８１０９、ＣＪＬ－８１１７、ＣＪＬ－８１１８、ＣＡ１３－８１１９、ＣＪＬ－８１２０、ＣＪＬ－８１２１、ＣＪＬ－８１２２、ＣＪＬ－８１２３、ＣＪＬ－８１２５菌株のＬ－ロイシン生産能を評価した。具体的には、実施例２－１と同様にフラスコ培養を行い、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて、親株及び変異菌株のＬ－ロイシン生産量を測定した。その結果を表１１に示す。

表１１に示すように、ｌｅｕＡ遺伝子にＬ１３８Ｇ、Ｈ１６２Ｅ、Ｓ２１１Ｌ、Ｎ２４５Ｓ、Ｉ５８８Ｐ、Ｓ２１１Ｌ／Ｉ５８８Ｐ、Ｌ１３８Ｇ／Ｈ１６２Ｅ／Ｓ２１１Ｌ／Ｎ２４５Ｓ又はＬ１３８Ｇ／Ｈ１６２Ｅ／Ｓ２１１Ｌ／Ｎ２４５Ｓ／Ｉ５８８Ｐ変異をさらに含むＬ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１１７、ＣＪＬ－８１１８、ＣＡ１３－８１１９、ＣＪＬ－８１２０、ＣＪＬ－８１２１、ＣＪＬ－８１２２、ＣＪＬ－８１２４及びＣＪＬ－８１２５は、親株である野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシン生産能が約４～５倍に向上することが確認された。また、Ｌ－ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１１７、ＣＪＬ－８１１８、ＣＡ１３－８１１９、ＣＪＬ－８１２０、ＣＪＬ－８１２１、ＣＪＬ－８１２２、ＣＪＬ－８１２３及びＣＪＬ－８１２５は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０９に比べて、Ｌ－ロイシン生産能が約１．２～１．６倍に向上することが確認された。

これらの結果から、ＬｅｕＡタンパク質のアミノ酸配列における１３８番目、１６２番目、２１１番目、２４５番目、５８８番目の位置のアミノ酸がＬ－ロイシン生産活性に重要な位置であることが確認される。

４－４．ＬｅｕＡ変異体を導入した菌株におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性の測定
実施例４－３で作製したＬ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１０９、ＣＪＬ－８１１７、ＣＪＬ－８１１８、ＣＡ１３－８１１９、ＣＪＬ－８１２０、ＣＪＬ－８１２１、ＣＪＬ－８１２２、ＣＪＬ－８１２３及びＣＪＬ－８１２５におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を測定するために、次の方法で実験を行った。

表２の生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに前記菌株（ＣＪＬ－８１０９，ＣＪＬ－８１１７，ＣＪＬ－８１１８，ＣＡ１３－８１１９，ＣＪＬ－８１２０，ＣＪＬ－８１２１，ＣＪＬ－８１２２，ＣＪＬ－８１２３，ＣＪＬ－８１２５）及び野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪培養した。培養終了後に、培養液を遠心分離して上清を捨て、ペレットを溶菌緩衝液で洗浄して混濁させ、細胞を破砕した。溶菌液のタンパク質定量は、ブラッドフォード法により行い、１００μｇ／ｍｌのタンパク質を含む溶菌液を用いた。ここで、生成されるＣｏＡを用いた還元によりＤＴＮＢ（５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸），エルマン（Ellman）試薬）から形成されるチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）による４１２ｎｍにおける吸光変化を測定し、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ酵素の活性を測定した。各菌株におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性の測定結果を表１２に示す。

次に、前記酵素のロイシンに対するフィードバック阻害の解除の程度を確認するために、ロイシンを２ｇ／Ｌ添加した条件で、１００μｇ／ｍｌのタンパク質を含む溶菌液を用いた場合に生成されるＣｏＡを測定することにより、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を測定した。各菌株におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性の測定結果を表１３に示す。

表１２及び表１３に示すように、ＬｅｕＡ変異体発現ベクターを形質転換したＬ－ロイシン生産菌株ＣＪＬ－８１０９、ＣＪＬ－８１１７、ＣＪＬ－８１１８、ＣＡ１３－８１１９、ＣＪＬ－８１２０、ＣＪＬ－８１２１、ＣＪＬ－８１２２、ＣＪＬ－８１２３、ＣＪＬ－８１２５は、対照群である野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性が約１．１８～１．３８倍に向上することが確認された。また、前記Ｌ－ロイシン生産菌株は、ロイシンを２ｇ／Ｌ添加した条件でも、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ酵素活性をそれぞれ８３％～９３％維持したので、ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたことが確認された。

前記ＣＡ１３－８１１９は、ブダペスト条約上の受託機関である韓国微生物保存センターに２０２１年２月８日付けで受託番号ＫＣＣＭ１２９４９Ｐとして寄託した。

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

作製したライブラリーの評価及び変異体の選択
２－１．Ｌ－ロイシン生産量が増加した変異菌株の選択
実施例１－２で作製したｐＴＯＰＯ－ｌｅｕＡ－ｌｉｂｒａｒｙを野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する栄養培地（表２）に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株１０，０００個のコロニーを選択した。選択した各コロニーをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）１～ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）１０，０００と命名した。

Claims (14)

1. 配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）１３８番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｉ）１６２番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｉｉ）２１１番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、ｉｖ）２４５番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及びｖ）５８８番目に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）活性を有する変異型ポリペプチド。
2. 前記ｉ）は、１３８番目に相当する位置のアミノ酸残基であるロイシンのグリシンへの置換である、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
3. 前記ｉｉ）は、１６２番目に相当する位置のアミノ酸残基であるヒスチジンのグルタメートへの置換である、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
4. 前記ｉｉｉ）は、２１１番目に相当する位置のアミノ酸残基であるセリンのロイシンへの置換である、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
5. 前記ｉｖ）は、２４５番目に相当する位置のアミノ酸残基であるアスパラギンのセリンへの置換である、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
6. 前記ｖ）は、５８８番目に相当する位置のアミノ酸残基であるイソロイシンのプロリンへの置換である、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
7. 前記変異型ポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１４からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
10. 請求項１に記載の変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを含む、Ｌ－ロイシンを生産するコリネバクテリウム属（The genus of Corynebacterium）微生物。
11. 前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１０に記載のコリネバクテリウム属微生物。
12. 請求項１に記載の変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを含む、Ｌ－ロイシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－ロイシン生産方法。
13. 前記培養するステップの後に、培地又は微生物からＬ－ロイシンを回収するステップをさらに含む、請求項１２に記載のＬ－ロイシン生産方法。
14. 請求項１に記載の変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、もしくはそれを含むベクターを含む、Ｌ－ロイシンを生産するコリネバクテリウム属微生物、又はそれを培養した培地を含むＬ－ロイシン生産用組成物。