ES2666072T3 - Alfa-isopropilmalato sintasas resistentes a la retroacción - Google Patents

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Abstract

Secuencia nucleotídica aislada que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos >= 90%, >= 92%, >= 94%, >= 96%, >= 97%, >= 98%, >= 99% o 100%, preferiblemente >= 97%, particularmente de forma preferible >= 98%, muy particularmente de forma preferible >= 99%, y extremadamente de forma preferible 100%, idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en la que SEQ ID NO:2, en la posición 553, o en una posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos, tiene un aminoácido proteinogénico distinto de L-tirosina, y en la que la secuencia nucleotídica es una secuencia nucleotídica replicable que codifica la enzima isopropilmalato sintasa aislada de microorganismos del género Corynebacterium, en la que las secuencias proteicas codificadas de ese modo contienen un aminoácido proteinogénico distinto de L-tirosina en la posición correspondiente a la posición 553 de SEQ ID NO:2.

Description

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etapas:
a) fermentar uno de los microorganismos según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 en un medio,
b) acumular el KIC o la L-leucina en el medio, en el que se obtiene un caldo de fermentación. En este caso se prefiere que la sustancia química fina o un producto líquido o sólido que contiene la sustancia química fina se obtenga a partir del caldo de fermentación que contiene la sustancia química fina.
El uso de tal procedimiento según la invención conduce, como se muestra en el Ejemplo 4 con referencia a la producción de cetoisocaproato, o como se muestra en el Ejemplo 5 con referencia a la producción de L-leucina, a un incremento extraordinario en el rendimiento en comparación con la cepa de partida respectiva (Ejemplo 4, KIC: 0,027 g/g frente a 0,012 g/g; Ejemplo 5, leucina: 0,041 g/g frente a 0,002 g/g).
Además, se prefiere particularmente que el microorganismo según la invención produzca KIC o L-leucina, aún más preferiblemente, segregue KIC o L-leucina al medio. Los microorganismos producidos se pueden cultivar de forma continua – como se describe, por ejemplo, en el documento WO 05/021772 -, o de forma discontinua en el procedimiento por lotes (cultivo por lotes o procedimiento por lotes), o en el procedimiento por lote alimentado o por lote alimentado repetitivo, con el fin de producir el compuesto químico orgánico deseado. En el manual por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Process biotechnology 1. Introduction to bioengineering] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)), o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and periphery equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)), hay disponible un resumen de un tipo general en métodos de cultivo conocidos.
El medio de cultivo o medio de fermentación que se va a usar debe satisfacer muy apropiadamente las demandas de las cepas respectivas. Las descripciones de los medios de cultivo de diversos microorganismos están contenidos en el manual “Manual of Methods for General Bacteriology” de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Las expresiones medio de cultivo y medio de fermentación o medio son mutuamente intercambiables.
Como fuente de carbono, se pueden usar azúcares e hidratos de carbono, tales como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, disoluciones que contienen sacarosa a partir del procesamiento de remolacha o de caña de azúcar, almidón, hidrolizado de almidón y celulosa, aceites y grasas, tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido láctico.
Como fuente de nitrógeno, se pueden usar compuestos nitrogenados orgánicos tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de la maceración del maíz, harina de soja, y urea o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio, y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente, o como una mezcla.
Como fuente de fósforo, se puede usar ácido fosfórico, dihidrogenofosfato potásico, o hidrogenofosfato dipotásico, o las sales correspondientes que contienen sodio.
El medio de cultivo debe contener, además, sales, por ejemplo en forma de cloruros o sulfatos de metales tales como, por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, además de las sustancias mencionadas anteriormente, se pueden usar sustancias esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos, por ejemplo homoserina, y vitaminas, por ejemplo tiamina, biotina o ácido pantoténico.
Dichos materiales de partida se pueden añadir al cultivo en forma de un único lote, o se pueden suministrar de una manera adecuada durante el cultivo.
Para el control del pH del cultivo, se usan de manera adecuada compuestos básicos tales como hidróxido sódico, hidróxido potásico, amoníaco, o agua amoniacal, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. El pH se ajusta generalmente a 6,0 a 8,5, preferiblemente 6,5 a 8. Para el control del desarrollo de espuma, se pueden usar antiespumantes, tales como, por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos, se pueden añadir al medio sustancias adecuadas que actúan selectivamente, tales como, por ejemplo, antibióticos. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en condiciones aerobias. A fin de mantener dichas condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tales como, por ejemplo, aire. Igualmente es posible el uso de líquidos que están enriquecidos con peróxido de hidrógeno. Opcionalmente, la fermentación se lleva a cabo a presión superatmosférica, por ejemplo a una presión superatmosférica de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo es habitualmente 20ºC a 45ºC, y preferiblemente 25ºC a 40ºC, de forma particularmente preferible 30ºC a 37ºC. En el caso de los procedimientos por lotes o por lotes alimentados, el cultivo se continúa preferiblemente hasta que se ha formado una cantidad suficiente para la medida de obtener el compuesto químico orgánico deseado. Esta meta se alcanza habitualmente en 10 horas a 160 horas. En los procedimientos continuos, son posibles tiempos de cultivo más prolongados. Debido a la actividad de los microorganismos, se produce el enriquecimiento (acumulación) de las sustancias químicas finas en el medio de
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El caldo de fermentación se extrae de la vasija de cultivo o del recipiente de fermentación, opcionalmente se recoge, y se usa para proporcionar un producto en forma líquida o sólida que contiene la sustancia química fina. La expresión “obtener el producto que contiene la sustancia química fina” también se usa para ello. En el caso más simple, el caldo de fermentación que contiene la sustancia química fina extraído del recipiente de fermentación es el propio producto obtenido.
Por medio de una o más de las medidas seleccionadas del grupo
a) eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o virtualmente completa (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) del agua,
b) eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o virtualmente completa (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) de la biomasa, en el que esta es inactivada opcionalmente antes de la retirada,
c) eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o virtualmente completa (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3%, ≥ 99,7%) de los subproductos orgánicos formados durante el transcurso de la fermentación, y
d) eliminación parcial (> 0%) a completa (100%) o virtualmente completa (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3%, ≥ 99,7%) de los componentes del medio de fermentación usado, o los materiales de partida que no se consumen por la fermentación,
se logra una concentración o purificación del compuesto químico orgánico deseado a partir del caldo de fermentación. De esta manera, se aíslan productos que tienen un contenido deseado del compuesto.
La eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o virtualmente completa (≥ 80% a < 100%) del agua (medida a)) también se denomina secado.
En una variante del procedimiento, por eliminación completa o virtualmente completa del agua, de la biomasa, de los subproductos orgánicos y de los componentes no consumidos del medio de fermentación usado, se llega exitosamente a formas del producto puras (≥ 80% en peso, ≥ 90% en peso) o de alta pureza (≥ 95% en peso, ≥ 97% en peso, ≥ 99% en peso) del compuesto químico orgánico deseado, preferiblemente L-aminoácidos. Para las medidas según a), b), c) o d), existe en la técnica anterior una gran variedad de instrucciones técnicas.
En el caso de procedimientos para producir KIC o L-leucina, usando bacterias del género Corynebacterium, se prefieren procedimientos en los que se obtienen productos que no contienen ninguno de los componentes del caldo de fermentación. Estos productos se usan, en particular, en medicina humana, en la industria farmacéutica, y en la industria alimentaria.
El procedimiento según la invención sirve para la producción fermentativa de KIC o L-leucina.
La invención finalmente se refiere al uso del microorganismo según la invención para la producción fermentativa de KIC o L-leucina.
La presente invención se describirá con más detalle aquí en lo sucesivo con referencia a realizaciones ejemplares.
Ejemplo 1
Producción del vector de intercambio pK18mobsacB_leuA_Y553D
La síntesis de un constructo de intercambio largo de 812 pb se llevó a cabo en (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemania) (véase SEQ ID NO:7). El fragmento contiene los últimos 594 pb del gen leuA de tipo salvaje (término C) a 206 pb de la región en dirección 3’ del gen leuA de ATCC13032, y también tanto los sitios de corte de SphI y BamHI requeridos para la clonación en el vector pK18mobsacB. En la posición 195, en dirección 5’ del extremo 3’ del gen leuA, en este fragmento de intercambio la base T se muta a la base G – esto cambia el codón de tipo salvaje TAC (que codifica el aminoácido Y, tirosina) por el codón GAC (que codifica el aminoácido D, aspartato). La clonación del fragmento en el vector pK18mobsacB se llevó a cabo en la compañía GeneArt. El vector de intercambio resultante pK18mobsacB_leuA_Y553D fue suministrado por GeneArt, y se usó para producir las cepas de los ejemplos (véase Ejemplo 3).
Ejemplo 2
Producción de la cepa de C. glutamicum ATCC13032_DilvE
La cepa de C. glutamicum ATCC13032 se transformó con el plásmido pK19mobsacB_DilvE (Marienhagen et al., Journal of Bacteriology 187:7639-7646 (2005)) mediante electroporación. La electroporación se llevó a cabo según el protocolo de Haynes et al. (FEMS Microbiology Letters 61: 329-334 (1989)).
El plásmido pK18mobsacB o pK18mobsacB_DilvE no se puede replicar de forma independiente en C. glutamicum
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ATCC13032, y solamente es retenido en la célula si, como consecuencia de un suceso de recombinación, se ha integrado en el cromosoma. El cribado de clones que tiene un pK18mobsacB_DilvE integrado se llevó a cabo sembrando en placas el lote de electroporación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), que se ha suplementado con 15 mg/l de kanamicina. Los clones que crecieron se rallaron sobre placas de agar LB que contienen 25 mg/l de kanamicina, y se incubaron durante 16 horas a 33ºC. Para cribar mutantes en los que se ha escindido el plásmido como consecuencia de un segundo suceso de recombinación, los clones se cultivaron durante 20 horas de forma no selectiva en medio líquido LB (+ 5 g/l de acetato de potasio), después se rallaron sobre agar LB que contiene 10% de sacarosa, y se incubaron durante 24 horas.
El plásmido pK18mobsacB_DilvE contiene, igual que el plásmido de partida pK18mobsacB, además del gen de resistencia a kanamicina, una copia del gen sacB que codifica la levano sacarasa de Bacillus subtilis. La expresión inducible por sacarosa conduce a la formación de levano sacarasa, que cataliza la síntesis de levano, el producto tóxico para C. glutamicum. En agar LB (que contiene 5 g/l de acetato potásico), con sacarosa, por lo tanto, solamente crecen aquellos clones en los que nuevamente se ha cortado el pK18mobsacB integrado. En el corte, junto con el plásmido, se puede cortar la copia cromosómica completa de ilvE, o la copia incompleta con la supresión interna de ilvE.
Se examinaron aproximadamente 40 a 50 colonias en busca del genotipo “crecimiento en presencia de sacarosa” y “sin crecimiento en presencia de kanamicina”. A fin de detectar que el alelo de ilvE suprimido ha permanecido en el cromosoma, se estudiaron aproximadamente 20 colonias que tienen el fenotipo “crecimiento en presencia de sacarosa” y “sin crecimiento en presencia de kanamicina” según el método de PCR estándar de Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) usando la reacción en cadena de la polimerasa. En este caso, a partir del ADN cromosómico de las colonias, se amplificó un fragmento de ADN que porta las regiones circundantes de la región de ilvE suprimida. Se seleccionaron para la PCR los siguientes oligonucleótidos cebadores.
ilvE-XbaI-fw 5’-gctctagagccaagcctagccattcctcaa-3’
ilvE-XbaI-rev 5’-gctctagagccagccactgcattctcctta-3’
Los cebadores permiten, en clones de control que tienen el locus de ilvE completo, la amplificación de un fragmento de ADN de un tamaño de aproximadamente 1,4 kb. En los clones que tienen un locus de argFRGH suprimido, se amplificaron fragmentos de ADN que tienen un tamaño de aproximadamente 0,6 kb.
Los fragmentos de ADN amplificados se identificaron mediante electroforesis en gel de agarosa de concentración 0,8%. Se pudo mostrar de ese modo que la cepa porta en el cromosoma un alelo de ilvE suprimido. La cepa se denominó C. glutamicum ATCC13032_DilvE, y se estudió en el ensayo de producción (véase el Ejemplo 4) para determinar su capacidad para producir isocaproato.
Ejemplo 3
Producción de la cepa C. glutamicum ATCC13032_DilvE_leuAY553D y C. glutamicum ATCC13032_leuAY553D
La cepa C. glutamicum ATCC13032 y la cepa C. glutamicum ATCC13032_DilvE del Ejemplo 2 se transformaron mediante electroporación con el plásmido pK18mobsacB_leuA_Y553D del Ejemplo 1. El método se describe en detalle en el Ejemplo 2.
El intercambio del codón de tipo salvaje TAC (que codifica tirosina en la posición 553) por el codón GAC (que codifica aspartato en la posición 553) se demostró secuenciando una pluralidad de clones candidatos del fenotipo “crecimiento en presencia de sacarosa” y “sin crecimiento en presencia de kanamicina”. Para este fin, primeramente se produjo un fragmento de PCR de leuA-1 (767 pb de longitud) que tiene los cebadores leuA1 (5’-GATCTATCTAGATTGAGGGCCTTGGGCATACG-3’) y leuA-2 (5’-GATCTAGGATCCGCGACTACGAGGCTGTTATC-3’), y se secuenció con el cebador leuA-3 (5’-GATCTATCTAGAAAGCTTAAACGCCGCCAGCC-3’). Los clones candidatos positivos se seleccionaron y examinaron en el ensayo de comportamiento subsiguiente (Ejemplos 4 y 5).
Ejemplo 4
Producción de cetoisocaproato con C. glutamicum ATCC13032, C. glutamicum ATCC13032_DilvE y C. glutamicum ATCC13032_DilvE_leuAY553D
Para estudiar su capacidad para producir cetoisocaproato, las cepas C. glutamicum ATCC13032, C. glutamicum ATCC13032_DilvE y C. glutamicum ATCC13032_DilvE_leuAY553D se precultivaron en 10 ml de medio de ensayo en cada caso durante 16 h a 33ºC. Para el ensayo de producción, se inoculó cada 10 ml de medio de ensayo con el precultivo resultante de manera que la OD 600 (densidad óptica a 600 nm) de partida fue 0,1. Cada clon se examinó en tres matraces de agitación de manera que cada cepa está representada por un total de nueve matraces de agitación. El medio de ensayo fue idéntico al medio CgXII descrito en Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993)
175: 5593-5603), pero adicionalmente contenía en cada caso 200 mg/l de los aminoácidos L-leucina, L-valina y Lisoleucina. En aras de la simplicidad, la composición del medio de ensayo se resume aquí más abajo en la Tabla 1.
Tabla 1: Composición del medio CgXII con adición en cada caso de 200 mg/l de los aminoácidos L-leucina, L-valina y L-isoleucina
Componente
Contenido por l
(NH4)2SO4
20 g
Urea
5 g
KH2PO4
1 g
K2HPO4
1 g
MgSO4·7H2O
0,25 g
Ácido 3-morfolinopropanosulfónico (MOPS)
42 g
CaCl2
0,01 g
FeSO4·7H2O
0,01 g
MnSO4·H2O
0,01 g
ZnSO4·7H2O
0,001 g
CuSO4
0,0002 g
NiCl2·6H2O
0,00002 g
Biotina
0,0002 g
Ácido protocatecuico
0,03 g
Glucosa
40 g
L-Valina
0,2 g
L-Isoleucina
0,2 g
L-Leucina
0,2 g
pH (con NaOH)
7
5
El cultivo se llevó a cabo a 33ºC y 200 rpm en matraces de agitación de 100 ml. La amplitud del agitador fue 5 cm. Después de 24 horas, las muestras se extrajeron de los cultivos y se determinó la densidad óptica. Subsiguientemente, las células se centrifugaron brevemente (centrífuga de banco de tipo 5415D (Eppendorf) a 13000 rpm, 10 min., temperatura ambiente), y el contenido de glucosa y el contenido de cetoisocaproato se
10 determinaron en el sobrenadante.
La densidad óptica se determinó a una longitud de onda de 660 nm usando el fotómetro de placas de microtitulación GENios (Tecan, Reading UK). Las muestras se diluyeron antes de la medida 1:100 con agua desmineralizada. El análisis de KIC para la determinación de la concentración transcurre mediante separación de los cetoácidos y otros productos de secreción mediante cromatografía de intercambio catiónico (columna REZEX RFQ -Fast Fruit H+
15 (Phenomenex)) en un polímero de estireno-divinilbenceno sulfonado en la forma de H+ usando ácido sulfúrico 0,025 N, con detección subsiguiente mediante UV a 215 nm.
Para el cálculo del rendimiento de KIC, la cantidad de KIC formado se dividió entre la cantidad de dextrosa consumida.
Los resultados del experimento del matraz de agitación para la formación de cetoisocaproato se muestran en la 20 Tabla 2.
Tabla 2: Formación de cetoisocaproato tras 24 horas de incubación. Abreviaturas: KIC = cetoisocaproato

Claims (1)

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