ES2341264T3 - El uso de fosfocetolasa para producir metabolitos utiles. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para producir al menos un metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, y L-leucina que comprende cultivar una bacteria que tiene de forma inherente actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa en un medio de cultivo, y recoger dicho metabolito útil del medio de cultivo y/o la bacteria, en el que dicha bacteria tiene una capacidad de producir dicho metabolito útil, y en el que la bacteria está modificada para aumentar la actividad D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o fructosa-6fosfato fosfocetolasa aumentando la cantidad de copias del gen respectivo, o sustituyendo o modificando el promotor.
Description
El uso de fosfocetolasa para producir
metabolitos útiles.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir ácido L-glutámico,
L-glutamina, L-prolina y
L-leucina. La presente invención también se refiere
a nuevas bacterias útiles en el procedimiento de producción.
Convencionalmente, los metabolitos útiles tales
como L-aminoácidos, sus intermedios, y otros
compuestos químicos del metabolismo bacteriano se producen por
procedimientos en los que se han modificado cepas bacterianas
aisladas de fuentes naturales, o mutantes de las mismas, para
potenciar su productividad.
El azúcar es la fuente principal de carbono en
un microorganismo que es adecuado para fermentación. Las rutas de
Embden-Meyerhof y de la pentosa fosfato
(pentosa-P) son las dos rutas preliminares del
metabolismo intermediario del azúcar en un microorganismo. Una
tercera ruta, la ruta de Entaer-Doudoroff, también
es conocida, ya que tiene algunas conexiones con las rutas de ácido
carboxílico. Durante la glucolisis, la glucosa se metaboliza en
compuestos intermedios principales, tales como fosfoenolpiruvato,
piruvato, y acetil-coenzima A, que se usan como
constituyentes en la formación de muchos compuestos celulares, tales
como L-aminoácidos, purinas y pirimidinas,
vitaminas, etc. Además, la generación de energía (ATP y NADH) sucede
durante la glucolisis. El piruvato formado después de la glucolisis
a menudo se convierte de nuevo en fosfoenolpiruvato (PEP) por la
fosfoenolpiruvato sintasa codificada por el gen pps, o en
acetil-CoA por la piruvato deshidrogenasa
codificada por el gen pdh etc. Uno de los compuestos
mencionados anteriormente, la acetil-CoA, se forma
a partir del piruvato mediante la piruvato deshidrogenasa, y
acompañada por la liberación de CO_{2}. Esta pérdida de un átomo
de carbono provoca rendimientos de producción disminuidos de los
compuestos útiles derivados de la acetil-CoA.
Se ha informado de dos enzimas de la ruta
bifidum, la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa (también conocida como "fosfocetolasa") y la
fructosa-6-fosfato fosfocetolasa. La
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa (EC 4.1.2.9) cataliza la conversión con consumo de
fosfato de la xilulosa-5-fosfato en
gliceraldehído-3-fosfato y
acetilfosfato, con la liberación concomitante de una molécula de
agua. La fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa (EC 4.1.2.22) cataliza la conversión con consumo de
fosfato de fructosa-6-fosfato en
eritrosa-4-fosfato y acetilfosfato,
con la liberación concomitante de una molécula de agua. Ambas
enzimas forman acetilfosfato, el precursor de la
acetil-CoA, sin perder carbono mediante CO_{2}. Se
ha informado de la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa (EC 4.1.2.9) en bacterias que pertenecen a los
géneros Acetobacter (Schramm, M. y col., J. Biol. Chem.,
233(6), 1283-8 (1958)),
Bifidobacterium (Sgorbati, B. y col., Antonie Van
Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57
(1976); Grill, J.P. y col. Curr Microbiol., 31(1),
49-54 (1995)) Lactobacillus (Posthuma, C.C. y
col., Appl. Environ. Microbiol., 68(2),
831-7 (2002)), Thiobacillus (Greenley, D.E. y
Smith, D.W., Arch. Microbiol., 122, 257-261
(1979)), en levaduras que pertenecen a los géneros Candida,
Rhodotorula, Rhodosporidium, Pichia, Yarrowia, Hansenula,
Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Trichosporon, Wingea
(Evans, C.T. y Ratledge, C., Arch. Microbiol., 139,
48-52 (1984); Ratledge, C. y Holdsworth, J.E., Appl.
Microbiol. Biotechnol., 22, 217-221 (1985)). Se ha
informado de la fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa (EC 4.1.2.22) en bacterias, tales como Acetobacter
xylinum (Schramm, M. y col., J. Biol. Chem., 233(6),
1283-8 (1958)), Bifidobacterium globosum y
Bifidobacterium dentium (Sgorbath, B. y col., Antonie
Leeuwenhoek, 42, 49-57 (1976)), Bifidobacterium
bifidum, Gardnerella vaginalis (Gavini, F. y col., Anaerobe, 2,
191-193 (1996)), y levaduras, tales como
Rhodotorula graminis, Rhodotorula glutinis, Candida sp., Candida
tropicalis, Saccharomyces pastorianus (Whitworth, D.A. y
Ratledge, C., J. Gen. Microbiol., 102, 397-401
(1977)). Se ha informado de que en algunos organismos ambas
actividades están representadas por una enzima (véase, por ejemplo,
los artículos de Schramm, M. y col. (J. Biol. Chem., 233(6),
1283-8 (1958)); Sgorbati, B. y col. (Antonie Van
Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57
(1976)); Meile, L. y col. (J. Bacteriol., 183(9),
2929-36 (2001))).
Se han clonado los genes de la fosfocetolasa de
dos especies y se han determinado sus secuencias. Éstos son el gen
xfp que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa/fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa de Bifidobacterium lactis (Meile, L. y col.,
J. Bacteriol., 183(9), 2929-36 (2001)), y el
gen xpkA que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa de Lactobacillus pentosus (Posthuma, C.C. y
col., Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7
(2002)). Una búsqueda de la bases de datos Microbial Genome
proporcionada por el National Center for Biotechnology information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=&DB=genome)
reveló varios genes que codifican fosfocetolasas putativas.
Se conocen procedimientos para mejorar la
capacidad de las levaduras para producir etanol a partir de xilosa
introduciendo genes para la xilosa reductasa, la xilitol
deshidrogenasa y adicionalmente la fosfocetolasa (documento
WO2003078643). Sin embargo, nunca se ha informado de los efectos de
usar el gen de la fosfocetolasa para la eliminación de dióxido de
carbono.
Un objetivo de la presente invención es
potenciar la producción de metabolitos útiles por cepas de bacterias
que tienen la capacidad de producir los metabolitos así como
proporcionar un procedimiento para producir los metabolitos usando
estas cepas.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar una bacteria que tenga la capacidad de producir un
metabolito útil, estando la bacteria modificada para que tenga una
actividad aumentada de la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o la
fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el
metabolito útil se obtiene de la acetil-coenzima
A.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el
metabolito útil se selecciona entre el grupo constituido por ácido
L-glutámico, L-glutamina,
L-prolina, L-arginina,
L-leucina, L-cisteína, succinato, y
polihidroxibutirato.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar una bacteria que tenga una capacidad de producir un
metabolito útil, no teniendo la bacteria de forma inherente una
actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa, y habiéndose transformado dicha bacteria con un
fragmento de ADN que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o la
fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el
metabolito útil se obtiene de la acetil-coenzima
A.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el
metabolito útil se selecciona entre el grupo constituido por ácido
L-glutámico, L-glutamina,
L-prolina, L-arginina,
L-leucina, L-cisteína, succinato, y
polihidroxibutirato.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, seleccionándose
la bacteria entre el grupo constituido por la familia
Enterobacteriaceae, la bacteria Coryneform, y la
bacteria Bacillus.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar la bacteria descrita anteriormente, perteneciendo la
bacteria al género Escherichia o Pantoea.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar un procedimiento para producir un metabolito útil,
que comprende cultivar la bacteria en un medio de cultivo, y recoger
el metabolito útil del medio de cultivo.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que
el metabolito útil se obtiene de la acetil-coenzima
A.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que
el metabolito útil se selecciona entre el grupo constituido por
ácido L-glutámico, L-glutamina,
L-prolina, L-arginina,
L-leucina, L-cisteína, succinato, y
polihidroxibutirato.
Estos objetivos se han conseguido potenciando
una actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa en una bacteria que tiene la capacidad de producir un
metabolito útil seleccionado entre ácido
L-glutámico, L-glutamina,
L-prolina y L-leucina que ha hecho
posible utilizar el carbono de forma más eficaz y aumentar la
producción del metabolito útil por la bacteria. Por tanto, la
presente invención se ha completado.
La presente invención se describe a continuación
con detalle.
La Figura 1 muestra la alineación de
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasas de L. pentosus y L plantarum (identidad
del 98,5%).
La Figura 2 muestra el procedimiento de
construcción del plásmido pBS3.
La Figura 3 muestra el procedimiento de
construcción del plásmido pBS4S.
La Figura 4 muestra el procedimiento de
construcción del plásmido pBS5T.
La Figura 5 muestra las curvas de crecimiento de
cepas con el gen de la fosfocetolasa amplificado y una cepa de
control en un medio mínimo que contenía acetato.
La Figura 6 muestra las curvas de crecimiento de
cepas con el gen de la fosfocetolasa amplificado y una cepa de
control en un medio mínimo.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La Figura 7 (fotografía) muestra la
electroforesis de extractos celulares que contienen la proteína
fosfocetolasa.
La Figura 8 muestra la producción de ácido
L-glutámico usando cepas con el gen de la
fosfocetolasa amplificado en condiciones de biotina suficiente.
La Figura 9 muestra la producción de ácido
L-glutámico usando cepas con el gen de la
fosfocetolasa amplificado con la adición de penicilina.
La Figura 10 muestra la producción de ácido
L-glutámico usando una cepa en la que se introduce
un gen de fosfocetolasa y se reduce la actividad
6-fosfofructoquinasa.
La Figura 11 muestra la producción de ácido
L-glutámico usando una cepa en la que se introduce
un gen de fosfocetolasa y se reduce la actividad
6-fosfofructoquinasa en presencia de penicilina.
La Figura 12 muestra la producción de
L-glutamina (Gln) usando una cepa con el gen de la
fosfocetolasa amplificado.
La bacteria de la presente invención abarca una
bacteria que tiene una capacidad de producir un metabolito útil,
seleccionado entre ácido L-glutámico,
L-glutamina, L-prolina y
L-leucina, bacteria que se ha modificado para
aumentar la actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa.
La bacteria de la presente invención incluye
tanto una bacteria que no tiene de forma inherente una actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa como una bacteria que tiene de forma inherente una
actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa. Introduciendo un gen que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa o la
fructosa-6-fosfato fosfocetolasa en
dicha bacteria, se potencia la productividad de
acetil-CoA en la bacteria, lo que condice a una
producción potenciada de metabolitos útiles.
En la bacteria de la presente invención, puede
potenciarse cualquiera de las dos o ambas actividades
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa.
En la presente invención, el término
"fosfocetolasa" incluye tanto
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa como
fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa.
En la presente invención, la expresión
"actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa" significa una actividad que cataliza la reacción
de conversión con consumo de fosfato de
xilulosa-5-fosfato en
gliceraldehído-3-fosfato y
acetilfosfato con la liberación concomitante de una molécula de
agua. Esta actividad puede medirse por el procedimiento descrito
por Goldberg, M. y col. (Methods Enzymol., 9,
515-520 (1966) o L. Meile (J. Bacteriol. (2001) 183;
2929-2936).
En la presente invención, la expresión
"actividad fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa" significa una actividad que cataliza la reacción
de conversión con consumo de fosfato de
fructosa-6-fosfato en
eritrosa-4-fosfato y acetilfosfato
con la liberación concomitante de una molécula de agua. La actividad
fructosa-6-fosfato fosfocetolasa
puede medirse por el procedimiento descrito por Racker, E. (Methods
Enzymol., 5, 276-280 (1962) o L. Meile (J.
Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936).
La actividad fosfocetolasa en bacterias que
tienen de forma inherente actividad fosfocetolasa puede potenciarse
más que la de una cepa de tipo silvestre o no modificada,
preferiblemente no menos de 1,5 veces, más preferiblemente no menos
de 2 veces, y mucho más preferiblemente no menos de 3 veces de una
cepa de tipo silvestre o no modificada. Además, en esta invención,
puede usarse una bacteria que no tiene de forma inherente
actividades
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa como cepa precursora. La actividad fosfocetolasa en la
bacteria que no tiene de forma inherente actividad fosfocetolasa
puede potenciarse transformado la bacteria con un fragmento de ADN
que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o la
fructosa-6-fosfato fosfocetolasa.
Que una bacteria precursora tenga de forma inherente actividad
fosfocetolasa o no puede medirse por el mismo procedimiento que se
ha descrito anteriormente.
Que la actividad fosfocetolasa se ha introducido
puede confirmarse usando una cepa deficiente en piruvato
deshidrogenasa (PDH). Las cepas PDH-deficientes son
auxótrofas para acetato. Por otro lado, si se introduce la
fosfocetolasa, una cepa PDH-deficiente ya no será
auxótrofa para acetato. Por consiguiente, la introducción del gen
que codifica la fosfocetolasa puede confirmarse en base a la
compensación por la cepa huésped para la auxotrofia para acetato.
Como cepa PDH-deficiente, puede usarse la cepa
\DeltaaceE que se describe en los Ejemplos.
La
"D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa" puede ser una enzima derivada de las bacterias que
tienen una actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa, incluyendo la bacteria ácido láctica, la bacteria que
asimila metanol, la bacteria que asimila metano, la bacteria
Streptococcus, y especialmente aquellas bacterias que
pertenecen a los géneros Acetobacter, Bifidobacterium
Lactobacillus, Thiobacillus, Streptococcus, Methylococus,
Butyrivibrio, Fibrobacter, y/o levaduras que pertenecen a los
géneros Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Pichia, Yarrowia,
Hansenula, Kluyveromyces Saccharomyces, Trichosporon, Wingea o
similares.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La
"fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa" puede ser una enzima derivada de las bacterias que
tienen una actividad
fructosa-6-fosfato fosfocetolasa que
pertenecen a los géneros Acetobacter, Bifidobacterium,
Chlorobium, Brucella, Methylococus, Gardnerella, y/o levaduras
que pertenecen a Rhodotorula, Candida, Saccharomyces o
similares.
También es posible que ambas actividades estén
representadas por una enzima, la
D-xilulosa-5-fosfato/fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa.
La secuencia de nucleótidos del gen xpkA
que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa de Lactobacillus pentosus MD363 se ha
registrado en la base de datos EMBL/GenBank con el número de
referencia AJ309011 (Posthuma, C.C. y col., Appl. Environ.
Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)) y se muestra
como la SEC ID Nº 1. La secuencia de nucleótidos del gen
xpk1 que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa de Lactobacillus plantarum se ha registrado en
la base de datos EMBL/GenBank con el número de referencia NC_004567
Región: complemento (2362936..2365302) (Kleerebezem, M., y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 1990-1995
(2003)) y se muestra como la SEC ID Nº 3. La secuencias de
nucleótidos de los genes xpk y xpk homólogo se muestran en la Tabla
1 y la lista de secuencias. La alineación de las secuencias de
aminoácidos de las SEC ID Nº 2 y 4 se muestra en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos del gen xfp
que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato/fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa de Bifidobacterium lactis se ha registrado en
la base de datos EMBL/GenBank con el número de referencia AJ293946
(Meile, L. y col., J. Bacteriol., 183(9),
2929-36 (2001)) y se muestra como la SEC ID Nº 5, y
la secuencia de aminoácidos codificada por el gen xfp se
muestra como la SEC ID Nº 6. Las secuencias de nucleótidos de los
genes xfp y xfp homólogo se muestran en la Tabla 2 y la lista de
secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes xpkA, xpk1, y xfp pueden
obtenerse todos por PCR (reacción en cadena de la polimerasa;
remítase a White, T.J. y col., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando
cebadores diseñados en base a la secuencia de nucleótidos de los
genes conocidos. Los genes que contienen un motivo de fosfocetolasa
pueden obtenerse usando pfam y motif (http://pfam.wustl.edu/,
http://www.genome jp/dbget-bin/www_bget?pfam+XFP).
El gen xpk1 de Lactobacillus puede obtenerse usando los
cebadores mostrados en las SEC ID Nº 7 y Nº 8. El gen xfp de
Bifidobacterium puede obtenerse usando los cebadores
mostrados en las SEC ID Nº 11 y Nº 12. El gen xpkA de
Lactobacillus puede obtenerse usando los cebadores mostrados
en las SEC ID Nº 19 y Nº 24.
La actividad fosfocetolasa puede potenciarse
transformando una cepa precursora con un ADN que codifica
fosfocetolasa. La transformación de una bacteria con un ADN que
codifica fosfocetolasa puede realizarse por procedimientos
convencionales usando un ADN que codifica fosfocetolasa como se ha
descrito anteriormente.
Una ADN que codifica
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa puede ser un ADN que codifica una variante de
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa, que puede encontrarse en diferentes cepas de
bacterias, de acuerdo con la diversidad natural. El ADN que
codifica dichas variantes puede obtenerse aislando un ADN que
hibride con el gen xpkA (por ejemplo, la SEC ID Nº 1 ó 3), o
parte del gen, en condiciones rigurosas, y que codifique una
proteína que tenga la actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa. La expresión "condiciones rigurosas" como se usa
en este documento incluye condiciones en las que se forma un
llamado híbrido específico, y no se forma un híbrido no específico.
Por ejemplo, las condiciones rigurosas pueden incluir condiciones en
las que hibridan ADN que tienen elevada homología, por ejemplo, ADN
que tienen homología no menor del 70% entre sí, preferiblemente el
80% o más, más preferiblemente el 90% o más, mucho más
preferiblemente el 95% o más. Como alternativa, las condiciones
rigurosas se ejemplifican por condiciones que comprenden condiciones
ordinarias de lavado en hibridación de Southern, por ejemplo, 60ºC,
1 x SSC, SDS al 0,1%, preferiblemente, 60ºC, 0,1 x SSC, SDS al
0,1%. La duración del lavado depende del tipo de membrana usada para
la transferencia y, como norma, está recomendada por el fabricante.
Por ejemplo, la duración recomendada de lavado de la membrana de
nylon Hybond^{TM} N+ (Amersham) en condiciones rigurosas es de 15
minutos. Como sonda para explorar un gen variante xpkA,
puede usarse una secuencia parcial de la secuencia de nucleótidos
descrita en la Tabla 1. Dicha sonda puede prepararse por PCR usando
oligonucleótidos basados en la secuencia de nucleótidos descrita en
la Tabla 1 como cebadores, y un fragmento de ADN que contenga la
secuencia de nucleótidos descrita en la Tabla 1 como molde. Cuando
se usa como sonda un fragmento de ADN que tiene una longitud de
aproximadamente 300 pb, el lavado después de la hibridación puede
realizarse en las siguientes condiciones: 50ºC, 2 x SSC, y SDS al
0,1% al menos dos veces.
Un ADN que codifique la
fructosa-6-fosfato fosfocetolasa
puede obtenerse por procedimientos similares como se ha descrito
anteriormente usando la secuencia de nucleótidos descrita en la
Tabla 2 como sonda.
Se sabe que existe alguna desviación de
distribución de codones sinónimos entre los 61 codones de
aminoácidos hallados dentro de la población de moléculas de ARNm, y
el nivel de ARNt afines parece directamente proporcional a la
frecuencia del uso de codones (véase, por ejemplo, Kane, J.F., Curr.
Opin. Biotechnol., 6(5),
494-500(1995)). Desde este punto de vista,
es fácil predecir los problemas de traducción con especies
abundantes de ARNm que contienen un exceso de codones de ARNt
raros. Dicha situación podría surgir después del inicio de la
transcripción de un gen heterólogo clonado en, por ejemplo, el
huésped E. coli. Recientes estudios sugieren que grupos de
codones AGG/AGA, CUA, AUA, CGA o CCC pueden reducir tanto la
cantidad como la calidad de la proteína sintetizada. Además, es
probable que un exceso de cualquiera de estos codones, incluso
dentro de grupos, pudiera crear problemas de traducción. De modo
que, cuando se transfiere un ADN heterólogo que codifica una
proteína de interés a la bacteria, es deseable remplazar los
codones raros por codones usados más frecuentemente para evitar
estos problemas de traducción. La frecuencia del uso de codones en
más de 11.000 organismos se presenta en la "Codon usage
database" (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. y col.,
Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).
Además, el gen que codifica la fosfocetolasa de
la presente invención no está limitado a un gen de tipo silvestre,
pero puede ser un gen mutante o modificado de forma artificial que
tiene modificaciones en las secuencias de nucleótidos mostradas en
la Tabla 1 y 2. Las proteínas codificadas pueden incluir
sustituciones, deleciones, o inserciones, de uno o varios restos de
aminoácidos en una o más posiciones en las secuencias de aminoácidos
mostradas en la Tabla 1 y 2, siembre que se mantenga la función de
la proteína fosfocetolasa codificada. Aunque la cantidad de
"varios" restos de aminoácidos mencionada en este documento
difiere dependiendo de las posiciones en la estructura
tridimensional o tipos de restos de aminoácidos, puede ser de 2 a
20, preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 5. Dichas
sustituciones de aminoácidos incluyen mutaciones con sentido
funcionalmente neutras, y son preferiblemente sustituciones
conservativas. En el caso de aminoácidos aromáticos, las
sustituciones conservativas incluyen phe, trp, y tyr de forma
intercambiable entre sí. En el caso de aminoácidos hidrófobos,
sustituciones conservativas incluyen leu, ile, y val de forma
intercambiable entre sí. En el caso de aminoácidos polares,
sustituciones conservativas incluyen gln y asn de forma
intercambiable entre sí. En el caso de aminoácidos básicos,
sustituciones conservativas incluyen arg, lys e his de forma
intercambiable entre sí. En el caso de aminoácidos ácidos,
sustituciones conservativas incluyen asp y glu de forma
intercambiable entre sí. En el caso de aminoácidos que contienen
grupos hidroxilo, sustituciones conservativas incluyen ser y thr de
forma intercambiable entre sí. Las sustituciones conservativas
también incluyen la sustitución de ala por ser o thr, la
sustitución de arg por gln, his o lys, la sustitución de asn por
glu, gln, lys, his o asp, la sustitución de asp por asn, glu o gln,
la sustitución de cys por ser o ala, la sustitución de gln por asn,
glu, lys, his, asp o arg, la sustitución de glu por gly, asn, gln,
lys o asp, la sustitución de gly por pro, la sustitución de his por
asn, lys, gln, arg o tyr, la sustitución de ile por leu, met, val o
phe, la sustitución de leu por ile, met, val o phe, la sustitución
de lys por asn, glu, gln, his o arg, la sustitución de met por ile,
leu, val o phe, la sustitución de phe por trp, tyr, met, ile o leu,
la sustitución de ser por thr o ala, la sustitución de thr por ser
o ala, la sustitución de trp por phe o tyr, la sustitución de tyr
por his, phe o trp y la sustitución de val por met, ile o leu. Las
mutaciones que causan dicha sustitución, deleción, o inserción de
uno o varios aminoácidos como se ha descrito anteriormente también
incluyen mutaciones de origen natural que surgen de diferencias
individuales, y diferencias en especies de microorganismos que
albergan el gen de la fosfocetolasa (mutante o variante). La región
a sustituir puede seleccionarse buscando la región conservada
(motivo) en PKT con MOTIF y Pfam.
Dichos genes pueden obtenerse modificando una
secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1 ó 2, por ejemplo,
por mutagénesis específica de sitio, de modo que se introducen una o
más sustituciones, deleciones, o inserciones en un sitio específico
de la proteína codificada por el gen.
Además, dichos genes también pueden obtenerse
por tratamientos de mutagénesis convencional tales como los
mencionados a continuación. Los ejemplos de tratamientos de
mutagénesis incluyen tratar un gen que tiene una secuencia de
nucleótidos mostrada en la Tabla 1 ó 2 o una secuencia de
nucleótidos de los números de nucleótido 49 a 948 en la SEC ID Nº 1
in vitro con hidroxilamina, y tratar una bacteria tal como
una bacteria Escherichia que alberga el gen con irradiación
por rayos ultravioleta o un agente de mutagénesis usado en
tratamientos de mutación típicos tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) o EMS (metanosulfonato de etilo).
La expresión del gen de la fosfocetolasa (a
partir de ahora, mencionado como gen pkt, incluyendo el gen xpk o
xfp) puede potenciarse, por ejemplo, aumentando la cantidad de
copias del gen pkt en células usando técnicas de recombinación
genética. Por ejemplo, puede prepararse un ADN recombinante ligando
un fragmento génico que contiene el gen pkt con un vector,
preferiblemente un vector multicopia, que puede replicarse en la
bacteria huésped, e introduciendo el vector resultante en la
bacteria huésped.
Cuando se usa el gen xfp de Bifidobacterium
animalis, puede obtenerse por, por ejemplo, el procedimiento de
PCR (reacción en cadena de la polimerasa, remítase a White, T.J. y
col., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando cebadores diseñados en
base a la secuencia de nucleótidos del gen xfp de Bifidobacterium
animalis (SEC ID Nº 9 ó 11), por ejemplo, cebadores que tienen
cada uno una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 13 ó 14, y
usando un ADN cromosómico de Bifidobacterium animalis como
molde. También puede usarse el gen pkt de otros microorganismos, y
puede obtenerse de su ADN cromosómico o biblioteca de ADN
cromosómico por PCR usando cebadores oligonucleotídicos diseñados
en base a una secuencia de su gen pkt o una secuencia homóloga del
mismo, o por hibridación usando una sonda oligonucleotídica
preparada en base a dicha información de secuencia que se muestra
en la Tabla 1 ó 2. Un ADN cromosómico a usar como donante de ADN
puede prepararse a partir de un microorganismo, por ejemplo, por el
procedimiento de Saito y Miura (remítase a H. Saito y K. Miura,
Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering
Experiments, Editado por la Society for Bioscience and
Bioengineering, Japón, pág.97-98, Baifukan,
1992).
Después, el gen pkt se liga a un ADN vector
funcional en la bacteria huésped para preparar un ADN recombinante.
Preferiblemente, se usan vectores que se replican de forma autónoma
en la bacteria huésped.
Los ejemplos de vectores que se replican de
forma autónoma en Escherichia coli incluyen pUC19, pUC18,
pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG y pACYC están disponibles
en Takara Bio), RSF1010, pBR322, pMW118, pMW219 (pMW está
disponible en Nippon Gene), y demás. También pueden usarse vectores
fágicos tales como 11059, 1BF101, M13mp9.
Los ejemplos de vectores que se replican de
forma autónoma en bacterias corineformes incluyen pAM330 (documento
EP 0077548B), pHM1519 (documento EP 0078537), pGA1 (documento
EP10977998), y pYM2 (documento US6.905.819).
Además, puede usarse un llamado vector lanzadera
que se replica de forma autónoma tanto en Escherichia coli
como en bacterias corineformes, por ejemplo, pVK9, pVK7 (documento
US2003-0175912), pSFK6 (documento
JP2000-262288A), y pHK4 (documento
JPS-007491A).
El pVK9 es un vector lanzadera para E.
coli-corineformes obtenido escindiendo un fragmento
BamHI-KpnI que contiene el origen de replicación de
pHK4 (documento
JP-A-5-007491) e
introduciéndolo en el sitio AvaII de pHSG299 (Producto de
Takara-Bio).
Para preparar un ADN recombinante ligando el gen
pkt y cualquiera de los vectores mencionados anteriormente, se ligan
el vector y un fragmento que contiene el gen pkt, habitualmente
usando una ligasa tal como una ADN ligasa T4.
Para introducir un ADN recombinante preparado
como se ha descrito anteriormente en una bacteria, puede emplearse
cualquier procedimiento de transformación conocido presentado hasta
ahora. Por ejemplo, puede emplearse un procedimiento para tratar
células receptoras con cloruro cálcico para aumentar la
permeabilidad del ADN, que se ha presentado para Escherichia
coli (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), y
un procedimiento para usar células competentes preparadas a partir
de células en crecimiento para introducir un ADN, que se ha
presentado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A.
y Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Además de estos
procedimientos, puede emplearse un procedimiento para introducir un
ADN recombinante en células receptores tipo protoplasto o
esferoplasto, que se ha presentado para aplicarse a Bacillus
subtilis, actinomicetes, y levaduras (Chang, S. y Choen, S.N.,
Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. y
Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. y
Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). Además, la
transformación de bacterias corineformes también puede realizarse
por el procedimiento de pulsos eléctricos (Sugimoto y col.,
documento JP2-207791A).
El gen pkt puede introducirse integrando una
única copia o múltiples copias del gen en un ADN cromosómico de una
bacteria. Además, la cantidad de copias del gen pkt puede también
aumentarse integrando múltiples copias del gen en un ADN
cromosómico de una bacteria. Para integrar una o más copias del gen
pkt en un ADN cromosómico de una bacteria, puede realizarse
recombinación homóloga marcando como diana una secuencia que existe
en múltiples copias en un ADN cromosómico. El ADN repetitivo y las
repeticiones invertidas en un extremo de un transposón pueden
usarse como una secuencia que existe en un ADN cromosómico en
múltiples copias. Como alternativa, como se describe en el
documento JP2-109985A, también es posible incorporar
el gen pkt en un transposón, y permitir que se transfiera de modo
que el gen se integre en el ADN cromosómico. Además, la potenciación
de la expresión génica puede realizarse por transposición tal como
integración de Mu. Por ejemplo, una ronda de integración de Mu
permite la introducción en un cromosoma bacteriano de hasta 3 copias
del gen. Pueden usarse transposones tales como Mu, Tn10 y Tn5. La
integración del gen pkt en el cromosoma puede confirmarse por
hibridación de Southern usando una sonda que tenga una secuencia
parcial del gen pkt.
Potenciar la expresión del gen pkt también puede
obtenerse remplazando una secuencia reguladora de la expresión,
incluyendo un promotor del gen pkt, en un ADN cromosómico o en un
plásmido con un más potente, como se describe en el documento WO
00/18935, amplificando un factor regulador que aumenta la expresión
del gen pkt, o delecionando o atenuando un factor regulador que
reduce la expresión del gen pkt. Además, también es posible
introducir varias sustituciones de nucleótidos en una región
promotora del gen pkt de modo que el promotor sea más potente. Se
describe un procedimiento para evaluar la potencia de un promotor y
ejemplos de promotores potentes en Goldstein y col. (Prokaryotic
promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1,
105-128). Además, como se sabe que una secuencia
espaciadora entre el sitio de unión al ribosoma (RBS) y el codón de
inicio de la traducción, especialmente, varios nucleótidos justo
cadena arriba del codón de inicio, tiene una gran influencia sobre
la eficacia de traducción, esta secuencia puede modificarse. Las
secuencias reguladoras de la expresión del gen pkt pueden
identificarse usando un vector para la identificación del promotor o
un software de análisis genético tal como GENETYX.
\newpage
Los ejemplos de dichos promotores potentes
incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el
promotor tac, el promotor P_{R}, el promotor P_{L} del fago
lambda, el promotor tet, el promotor amyE, el promotor spac, y
demás. Un ejemplo de un promotor potente para corinebacterias
incluye el promotor PS2 (Appl Environ Microbiol. Enero de 2003;
69(1): 358-66; Mol Microbiol. Julio de 1993;
9(1): 97-109; documento WO93/03158), el
promotor trc, el promotor tac, el promotor lacUV5, el promotor
araBAD. La fuerza del promotor se define como la frecuencia de
acciones de inicio de la síntesis de ARN. Los procedimientos para
evaluar la fuerza de un promotor se describen por, por ejemplo,
Deuschle U., Kammerer W., Gentz R, Bujard H. (Promoters in
Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength
indicates alternate structures. EMBO J., 5,
2987-2994 (1986)).
La expresión del gen pkt se potencia por dicha
sustitución o modificación de un promotor. La sustitución de una
secuencia reguladora de la expresión también puede obtenerse, por
ejemplo, usando un plásmido sensible a la temperatura. Los ejemplos
de un plásmido sensible a la temperatura para bacterias corineformes
incluyen p48K y pSFKT2 (documento JP2000-262288A),
pHSC4 (remítase a la publicación de patente francesa abierta a
inspección pública Nº 2667875.1992 y el documento
JPS-7491A), pBS5T y demás. Estos plásmidos pueden
replicarse de forma autónoma al menos a una temperatura de 25ºC,
pero no pueden replicarse de forma autónoma a una temperatura de
37ºC en bacterias corineformes. La modificación de la secuencia
reguladora de la expresión puede combinarse con un aumento de la
cantidad de copias del gen pkt.
También es adecuado el procedimiento de usar
levansucrasa que es letal para corinebacterias como marcador de
recombinación homóloga. El gen sacB que codifica la levansucrasa
puede usarse para seleccionar la cepa en la que se deleciona el
vector del cromosoma de forma eficaz. (Schafer, A. y col., Gene 145
(1994) 69-73). Puede usarse el gen sacB y el gen
homólogo de sacB descrito a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Bacillus subillus: sacB número de
referencia en GenBank X02730 (SEC ID Nº 40)
Bacillus amyloliqufaciens: sacB número de
referencia en GenBank X52988
Zymomonas mobilis: sacB número de
referencia en GenBank L33402
Bacillus stearothermophilus: surB número
de referencia en GenBank U34874
Lactobacillus sanfranciscensis: frfA
número de referencia en GenBank AJ508391
Acetobacter xylinus: lsxA número de
referencia en GenBank AB034152
Gluconacetobacter diazotrophicus: lsdA
número de referencia en GenBank L41732
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de ADN plasmídico, la digestión y
ligamiento de ADN, la transformación, la selección de un
oligonucleótido como cebador y similares puede realizarse por
procedimientos habituales bien conocidos por los especialistas en
la técnica. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en
Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., "Molecular Cloning A
Laboratory Manual, Segunda Edición", Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989).
Las bacterias de la presente invención incluyen
no solamente una bacteria que no tiene de forma inherente una
actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa, sino también una bacteria que tiene de forma
inherente una actividad de estas proteínas y se ha modificado para
que la actividad esté potenciada. Preferiblemente se usa la
primera.
Los ejemplos específicos de la bacteria usada en
la presente invención incluyen bacterias que pertenecen a la
familia Enterobacteriaceae tales como el género
Escherichia, Pantoea, bacterias corineformes tales como
Corynebacterium glutamicum, bacterias Bacillus tales
como Bacillus subtilis, y demás. Sin embargo, la bacteria de
la presente invención no se limita a estos ejemplos.
La familia Enterobacteriaceae incluye
bacterias que pertenecen a los géneros Enterobacter, Erwinia,
Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia,
Shigella, Morganella etc. Específicamente, pueden usarse las
clasificadas en Enterobacteriaceae de acuerdo con la
taxonomía usada en la base de datos del NCBI (National Center for
Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=
1236&1vl=3&keep=1&srch-mode=1&unlock). Se prefiere una bacteria que pertenece al género de Escherichia o Pantoea.
1236&1vl=3&keep=1&srch-mode=1&unlock). Se prefiere una bacteria que pertenece al género de Escherichia o Pantoea.
Pueden utilizarse las bacterias
Escherichia presentadas en Neidhardt y col. (Neidhardt, F.C.
y col., Escherichia coli y Salmonella typhimurium,
American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabla 1),
tales como Escherichia coli. Los ejemplos de cepas de tipo
silvestre de Escherichia coli incluyen, aunque sin
limitación, la cepa K12 y derivados de los mismos, la cepa MG1655
(ATCC Nº 47076), y la cepa W3110 (ATCC Nº 27325). Estas cepas están
disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC, Dirección:
P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América).
La expresión "una bacteria que pertenece al
género Pantoea" significa que la bacteria se clasifica
como el género Pantoea de acuerdo con la clasificación
conocida para los especialistas en la técnica de microbiología, y
también incluye algunas especies de Enterobacter agglomerans
recientemente reclasificadas en Pantoea agglomerans, Pantoea
ananatis, Pantoea stewartii o similares, en base al análisis de
secuencia de nucleótidos del ARNr 16S etc.
En la presente invención, las bacterias
corineformes incluyen bacterias clasificadas como bacteria
Coryneform de acuerdo con la clasificación conocida para los
especialistas en la técnica de microbiología, bacterias que hasta
ahora estaban clasificadas en el género Brevibacterium, pero
que ahora se han reclasificado en el género Corynebacterium
(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)), y también bacterias que
pertenecen al género Brevibacterium, que es un congénere
cercano del género Corynebacterium. A continuación se
enumeran ejemplos de dichas bacterias Coryneform.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Específicamente, se incluyen las siguientes
cepas:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Estas cepas pueden obtenerse de, por ejemplo, la
American Type Culture Collection (ATCC, Dirección: P.O. Box 1549,
Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América). Cada cepa tiene un
número de registro asignado, y se puede solicitar un suministro de
cada cepa por su número de registro. El número de registro para cada
cepa está indicado en el catálogo de la American Type Culture
Collection. La cepa AJ12340 se depositó el 27 de octubre de 1987 en
el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry
(actualmente, la agencia administrativa independiente, National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology,
International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6,
1-1, Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón,
código postal: 305-5466)) según las disposiciones
del Tratado de Budapest, y recibió un número de referencia de FERM
BP-1539. La cepa AJ12418 se depositó el 5 de enero
de 1989 en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry según las
disposiciones del Tratado de Budapest y recibió un número de
referencia de FERM BP-2205.
La expresión "bacteria Bacillus"
significa que la bacteria está clasificada como el género
Bacillus de acuerdo con la clasificación conocida para los
especialistas en la técnica de microbiología. En la presente
invención, la bacteria Bacillus incluye, aunque sin
limitación, la cepa de Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC
6051), la cepa de Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12,
1-9) y demás, y ejemplos de Bacillus
amiloliquefaciens incluyen, aunque sin limitación, Bacillus
amiloliquefaciens cepa T (ATCC 23842), Bacillus
amiloliquefaciens cepa N (ATCC 23845) y demás.
La bacteria de la presente invención puede
obtenerse introduciendo el ADN mencionado anteriormente (gen pkt)
en una bacteria que ya tiene una capacidad de producir un metabolito
útil. Como alternativa, la bacteria de la presente invención puede
obtenerse confiriendo la capacidad de producir un metabolito útil a
la bacteria en la que se ha introducido el gen pkt. En el último
caso, introducir el gen pkt y conferir la capacidad de producir el
metabolito útil puede realizarse en cualquier orden.
La expresión "una bacteria que tiene una
capacidad de producir un metabolito útil" significa una bacteria,
que tiene una capacidad de producir y causar la acumulación del
metabolito útil en un medio cuando la bacteria de la presente
invención se cultiva en el medio. La capacidad de producir el
metabolito puede conferirse o potenciarse por cruce incluyendo
tratamiento de mutagénesis y modificación genética. La expresión
"la bacteria tiene capacidad de producir un metabolito útil"
significa que la bacteria es capaz de producir y causar la
acumulación del metabolito en un medio en una cantidad mayor que una
cepa de tipo silvestre o cepa no mutada. La expresión "la
bacteria tiene la capacidad de producir un metabolito útil" como
se usa en este documento también significa una bacteria que es
capaz de producir y causar la acumulación en un medio de una
cantidad no menor de 0,5 g/l, más preferiblemente no menor de 1,0
g/l del metabolito diana.
La expresión "metabolito útil" significa un
metabolito principal tal como un L-aminoácido, ácido
orgánico, vitamina, sacárido y/o intermedio de las rutas de
Embden-Meyerhof, de pentosa fosfato
(pentosa-P), la ruta de
Entner-Doudoroff, ciclo del citrato, y biosíntesis
de aminoácidos. El L-aminoácido a producirse en la
presente invención no está particularmente limitado, e incluye
L-lisina, L-arginina,
L-ornitina, L-histidina,
L-citrulina, L-isoleucina,
L-alanina, L-valina,
L-leucina, y L-glicina,
L-treonina, L-serina,
L-prolina, L-fenilalanina,
L-tirosina, y L-triptófano,
L-cisteína, L-cistina,
L-metionina, L-ornitina, ácido
L-glutámico, ácido L-aspártico,
L-glutamina, y L-asparagina. Más
preferiblemente, la bacteria de la presente invención es una
bacteria que tiene una capacidad de producir un metabolito derivado
de la acetil-CoA. Dicho metabolito se selecciona
entre el grupo constituido por ácido L-glutámico,
L-glutamina, L-prolina,
L-arginina, L-leucina,
L-cisteína, succinato, y polihidroxibutirato.
A continuación en este documento, se explicarán
en detalle ejemplos de cepas a las que se ha conferido una
capacidad de producir metabolitos útiles y procedimientos para
conferir dicha capacidad.
A continuación en este documento, se explicarán
procedimientos para conferir una capacidad de producir metabolitos
útiles a una cepa precursora como se ha mencionado
anteriormente.
Para conferir una capacidad de producir
metabolitos útiles, pueden usarse procedimientos usados
convencionalmente para cruzar una bacteria productora de
metabolitos útiles que pertenece al género Escherichia o
bacteria Coryneform y demás. Por ejemplo, pueden usarse
procedimientos para obtener una cepa mutante auxótrofa, una cepa
resistente a análogos, o una cepa mutante de regulación metabólica
que tiene una capacidad de producir metabolitos útiles, y
procedimientos para crear una cepa recombinante que tenga actividad
potenciada de una enzima biosintética de metabolitos útiles
("Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies
Press [Gakkai Shuppan Center], 1ª Edición, publicada el 30 de mayo
de 1986, pág. 77-100). Cuando se cruzan bacterias
productoras de metabolitos útiles usando estos procedimientos,
pueden conferirse una o más propiedades, incluyendo auxotrofia,
resistencia a análogos, y mutación de regulación metabólica.
Cuando se crea una cepa recombinante, puede
potenciarse la actividad de una única o de múltiples enzimas
biosintéticas de metabolitos útiles. Además, los procedimientos
para conferir propiedades de auxotrofia, resistencia a análogos, y
mutación de regulación metabólica pueden combinarse con
procedimientos para potenciar una actividad de una enzima
biosintética de metabolitos útiles.
Puede obtenerse una cepa mutante auxótrofa, una
cepa resistente a metabolitos útiles tales como un análogo de
L-aminoácido, o una cepa mutada para la regulación
metabólica que tiene una capacidad de producir un metabolito útil
sometiendo una cepa precursora o de tipo silvestre a un tratamiento
de mutagénesis típico tal como irradiación con rayos X o rayos
ultravioleta, tratamiento con un agente de mutagénesis tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG). Después, puede seleccionarse una cepa auxótrofa, una cepa
resistente a análogos o una cepa mutante de la regulación metabólica
que tiene una capacidad de producir metabolitos útiles entre las
cepas mutadas.
Los procedimiento para conferir capacidad
productora de ácido L-glutámico a las bacterias como
se ha descrito anteriormente incluyen, por ejemplo, modificar las
bacterias de modo que se potencie y/o sobre-exprese
la expresión de un gen que codifica una enzima implicada en la
biosíntesis de ácido L-glutámico. Los ejemplos de
enzimas implicadas en la biosíntesis de ácido
L-glutámico incluyen glutamato deshidrogenasa
(también mencionada como "GDH" a partir de ahora en este
documento), glutamina sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato
deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa (también
mencionada como "CS" a partir de ahora en este documento),
fosfoenolpiruvato carboxilasa (también mencionada como "PEPC"
a partir de ahora en este documento), piruvato carboxilasa, piruvato
deshidrogenasa, piruvato quinasa, fosfoenolpiruvato sintasa,
enolasa, fosfogliceromutasa, fosfoglicerato quinasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, fructosa bifosfato
aldolasa, fosfofructoquinasa, glucosa fosfato isomerasa, y demás.
De estas enzimas, es preferible que se potencie la actividad de una
o más de CS, PEPC, y GDH, y es más preferible que se potencien las
actividades de las tres enzimas.
Los ejemplos de bacterias modificadas por el
procedimiento que se ha descrito anteriormente de modo que se
potencien la expresión del gen de la CS, el gen de la PEPC y/o el
gen de la GDH incluyen las bacterias descritas en los documentos
US6.197.559, US6.331.419, y las publicaciones de patentes europeas
Nº 0999282 y Nº 1078989.
La modificación de una bacteria para conferir la
capacidad de producir ácido L-glutámico puede
realizarse reduciendo o inactivando la actividad de una enzima que
cataliza una reacción que se ramifica desde la ruta biosintética
del ácido L-glutámico, y que produce un compuesto
diferente al ácido L-glutámico. Los ejemplos de
enzimas que catalizan una reacción que se ramifica desde la ruta
biosintética del ácido L-glutámico y que producen
un compuesto diferente al ácido L-glutámico incluyen
la 2-oxoglutarato deshidrogenasa, isocitrato liasa,
glutamato descarboxilasa, 1-pirrolina
deshidrogenasa, y demás. De estas enzimas, es preferible reducir o
eliminar la actividad de la 2-oxoglutarato
deshidrogenasa.
Para reducir o inactivar las actividades de las
enzimas mencionadas anteriormente, pueden introducirse mutaciones
para reducir o inactivar las actividades intracelulares de las
enzimas por tratamiento de mutagénesis habitual o ingeniería
genética. Los ejemplos de tratamiento de mutagénesis incluyen
irradiación por rayos X o rayos ultravioleta, el tratamiento con un
agente de mutagénesis tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
y demás. Los ejemplos de procedimientos para reducir o eliminar la
actividad intracelular de una enzima incluyen mutar o delecionar un
gen que codifica la enzima en células de un microorganismo de modo
que la actividad intracelular se reduce o elimina en comparación
con una cepa no mutada. Los ejemplos de procedimientos para mutar o
delecionar un gen incluyen la modificación de secuencias reguladoras
de la expresión tales como promotores y secuencias de
Shine-Dalgamo (SD), la introducción de mutaciones
con pérdida de sentido, mutaciones sin sentido, o mutaciones de
desplazamiento de fase en una fase de lectura abierta, y la deleción
de una parte del gen (J Biol Chem. 1997
272(13):8611-7). Un gen mutado puede
introducirse en un microorganismo usando una técnica de
recombinación homóloga en la que se remplaza un gen de tipo
silvestre en un cromosoma por el gen mutado, o usando un transposón
o factor IS. Las técnicas de recombinación homóloga incluyen
procedimientos que usan ADN lineal, un plásmido sensible a la
temperatura, y un plásmido no replicable. Estos procedimientos se
describen en Proc Natl Acad Sci USA. 6 de junio de 2000;
97(12):6640-5, la patente de Estados Unidos
Nº 6303383, el documento JP05-007491A, y
similares.
La actividad intracelular de la enzima diana y
el grado de disminución en la actividad pueden confirmarse midiendo
la actividad de la enzima usando un extracto celular o una fracción
purificada del mismo obtenida de una cepa candidata y comparándola
con la actividad de una cepa de tipo silvestre o no modificada. Por
ejemplo, la actividad 2-oxoglutarato deshidrogenasa
puede medirse por el procedimiento de Reed y col. (Reed L.J. y
Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, pág.
55-61, 1969). Se describen ejemplos de bacterias que
pertenecen al género Escherichia deficientes en la actividad
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa o que tienen
actividad \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa
reducida y procedimientos para obtenerlas en las patentes de Estados
Unidos 5.378.616 y 5.573.945. Específicamente, estas cepas incluyen
las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM
BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM
BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM
BP-4881)
E. coli W3110sucA::Km^{r} se obtuvo
alterando el gen de la \alpha-cetoglutarato
deshidrogenasa (a partir de ahora en este documento mencionado
"gen sucA") en E. coli W3110. Esta cepa es
completamente deficiente en la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias corineformes en las que el gen
sucA se altera usando recombinación homóloga se explican en
detalle en el documento WO95/34672 y la patente de Estados Unidos
5.977.331.
Otros ejemplos de bacterias productoras de ácido
L-glutámico incluyen las que pertenecen al género
Escherichia y tienen resistencia a un antimetabolito de
ácido aspártico. Estas cepas también pueden ser deficientes en la
actividad alfa-ácido cetoglutárico deshidrogenasa e incluyen, por
ejemplo, la cepa AF13199 (PERM BP-5807) (patente de
Estados Unidos 5.908.768), o la cepa FFRM P-12379,
que está modificada adicionalmente para que tenga capacidad
disminuida de descomposición de ácido L-glutámico
(patente de Estados Unidos 5.393.671); la cepa de E coli
AJ13138 (FERM BP-5565) (patente de Estados Unidos
6.110.714) y similares.
Los ejemplos de bacterias que producen ácido
L-glutámico que pertenecen al género Pantoea,
incluyen cepas mutantes deficientes en la actividad
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa o con
actividad \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa
disminuida, y pueden obtenerse como se ha descrito anteriormente.
Dichas cepas incluyen Pantoea ananatis AJ13356 o AJ13601
(patente de Estados Unidos 6.331.419). Pantoea ananatis
AJ13356 se depositó en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade y Industry
(actualmente, National Institute of Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,
1-1, Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
305-8566, Japón) el 19 de febrero de 1998 y recibió
un número de referencia de FERM P-16645. Después se
convirtió en un depósito internacional según las directrices del
Tratado de Budapest el 11 de enero de 1999 y recibió un número de
referencia de FERM BP-6615. Pantoea ananatis
AJ13601 se depositó en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry
(actualmente, National Institute of Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,
1-1, Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
305-8566, Japón) el 18 de agosto de 1999 y recibió
un número de referencia de FERM P-17516. Después se
convirtió en un depósito internacional según las directrices del
Tratado de Budapest el 6 de julio de 2000 y recibió un número de
referencia de FERM BP-7207. La Pantoea
ananatis AJ13356 y AJ13601 son deficientes en la actividad
\alpha-KGDH como resultado de la alteración del
gen que codifica la subunidad E1 de \alphaKGDH (gen sucA).
Las cepas anteriores se identificaron como Enterobacter
agglomerans cuando se aislaron y se depositaron como las cepa
AJ13356, y la cepa AJ13601 de de Enterobacter agglomerans,
respectivamente. Sin embargo, recientemente se reclasificaron como
Pantoea ananatis en base a la secuenciación de nucleótidos
del ARNr 16S y demás. Aunque AJ13356, AJ13601 y su cepa precursora,
AJ13355 (FERM BP-6614), se depositaron todas en el
depósito mencionado anteriormente como Enterobacter
agglomerans, se describen como Pantoea ananatis para los
propósitos de esta memoria descriptiva.
Ejemplos adicionales de bacterias
Coryneform que tienen capacidad productora de ácido
L-glutámico incluyen un mutante resiste a análogos
de ácido orgánico, y un mutante resistente a escletina (documentos
JP56-1889A, JP56140895A, JP5702689A, JP88994A).
\newpage
Los ejemplos de bacterias Coryneform
productoras de ácido L-glutámico resistentes a
análogos incluyen las siguientes cepas:
Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM
P-5007, documento JP56-1889A)
Brevibacterium glutamicum AJ11368 (FERM
P-P-5020, documento
JP56-1889A)
Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM
P-4318, documento JP57-2689A)
Brevibacterium flavum AJ11218
(FERM-P 4319, documento
JP57-2689A)
Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM
P-5472, documento JP56-140895A)
Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM
P-5316, documento JP56-35981A)
Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM
BP-3004, documento JP56-151495A)
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de bacterias productoras de
L-glutamina que pueden usarse como cepa precursora a
modificar para que tengan actividad aumentada de la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa incluyen una bacteria corineforme productora de
L-glutamina que está modificada para que tenga
actividad glutamato deshidrogenasa potenciada, activada glutamina
sintetasa (documento EP 1229121A), o para que tenga actividad
glutaminasa disminuida (documento EP1424397A). Además, puede usarse
una bacteria que pertenece al género Escherichia que alberga
una glutamina sintetasa mutante en la que el resto aminoacídico
tirosina correspondiente a la posición 397 en una glutamina
sintetasa de tipo silvestre está remplazada con cualquier resto
aminoacídico.
Puede usarse el procedimiento de conferir
resistencia a
6-diazo-5-oxo-norleucina
(documento JP3-232497A), resistencia a análogos de
purina, resistencia a sulfóxido de metionina (documento JP
61-202694A), resistencia a ácido
\alpha-cetomalínico (documento
JP56-151495) para conferir o potenciar la capacidad
productora de L-glutamina por cruce. Los ejemplos
específicos de bacterias Coryneform que tienen capacidad
productora de L-glutamina incluyen, aunque sin
limitación:
Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM
P-5492, documento JP56-161495A)
Brevibacterium flavum AJ11576
(FERMBP-10381, documento
JP56-161495A)
Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM
P-8123, documento JP61-202694A)
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de bacterias productoras de
L-prolina útiles como cepa precursora a modificar
para que tengan actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa aumentada incluyen una bacteria productora de
L-prolina que pertenece al género Escherichia
que alberga \gamma-glutamil quinasa
des-sensibilizada en inhibición retrógrada por
L-prolina, y/o en la que está destruido el sistema
de degradación de L-prolina. Un procedimiento para
cruzar la bacteria que tiene \gamma-glutamil
quinasa des-sensibilizada en inhibición retrógrada
por L-prolina se ejemplifica introduciendo un ADN
que codifica \gamma-glutamil quinasa
des-sensibilizada en inhibición retrógrada por
L-prolina en células (Dandekar, A.M., Uratsu, S.L.,
J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988)). Un
procedimiento para destruir el sistema de degradación de
L-prolina se ejemplifica introduciendo una mutación
en un gen de prolina deshidrogenasa de modo que no se exprese la
prolina deshidrogenasa activa. Además, puede obtenerse una bacteria
en la que está destruido el sistema de degradación de
L-prolina obteniéndose una cepa deficiente en la
capacidad de asimilar L-prolina y seleccionando una
cepa que produzca en exceso L-prolina de forma
extracelular usando auxotrofia de L-prolina como
indicativo. Las bacterias productoras de L-prolina
que pertenecen al género Escherichia incluyen las cepas de
E. coli NRRL B-12403 y NRRL
B-12404 (patente GB 2075056), VKPM
B-8012 (publicación de patente de Estados Unidos
abierta a inspección pública 2002-0058315), y
pueden usarse mutantes plasmídicos descritos en la patente DE
3127361, mutantes plasmídicos descritos por Bloom F.R. y col. (The
15th Miami winter symposium, 1983, pág. 34) y similares para obtener
dichas cepas.
Los ejemplos de bacterias productoras de
L-leucina que pueden usarse como cepa precursora a
modificar para que tenga actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa aumentada incluyen las bacterias productoras de
L-leucina que pertenecen al género
Escherichia, tales como las cepas de E. coli
H-9068 (ATCC 21530), H-9070 (FERM
BP-4704) y H-9072 (FERM
BP-4706) resistentes a 4-azaleucina
o 5,5,5-trifluoroleucina (patente de Estados Unidos
5.744.331), cepas de E. coli en que la inhibición retrógrada
de la isopropilmalato por L-leucina está
des-sensibilizada (documento EP1067191B), la cepa de
E. coli AJ11478 resistente a
\beta-2-tienilalanina y
\beta-hidroxileucina (patente de Estados Unidos
5.763.231), la cepa de E. coli 57 (VKPM
B-7386, patente rusa Nº 2140450), y similares.
Además, es preferible que la bacteria de la
presente invención se modifique adicionalmente para que tenga
actividad 6-fosfofructoquinasa reducida. La
actividad 6-fosfofructoquinasa puede medirse por el
procedimiento descrito por, por ejemplo, Denise Kotlars y Henri Buc
(Methods in Enzymology (1982) 90: 60-70). La
actividad 6-fosfofructoquinasa en la bacteria de la
presente invención está reducida menos que la de una cepa de tipo
silvestre o no modificada, preferiblemente menos del 90%, más
preferiblemente menos del 70%, y mucho más preferiblemente no menos
del 50% de una cepa de tipo silvestre o no modificada. La actividad
6-fosfofructoquinasa puede reducirse mutando o
alterando un gen que codifique esta enzima, donde dicho
procedimientos puede ser similar al procedimiento usado para reducir
reduce la actividad \alpha-cetoglutarato
deshidrogenasa.
En la presente invención, los metabolitos útiles
pueden producirse cultivando las bacterias mencionadas anteriormente
en un medio de cultivo, permitiendo la acumulación del metabolito
útil en el medio de cultivo y/o células bacterianas, y recogiendo
dicho metabolito útil del medio de cultivo y/o las células
bacterianas.
El cultivo, la recogida, y la purificación de
metabolitos útiles del medio, pueden realizarse por procedimientos
de fermentación convencionales en los que se produce un metabolito
útil usando una bacteria. El medio de cultivo puede ser sintético o
natural, siempre que el medio contenga una fuente de carbono y una
fuente de nitrógeno y minerales y, si es necesario, cantidades
apropiadas de nutrientes que la bacteria necesita para el
crecimiento. La fuente de carbono incluye diversos carbohidratos
tales como glucosa y sacarosa, y diversos ácidos orgánicos.
Dependiendo del modo de asimilación de la bacteria elegida, puede
usarse alcohol, incluyendo etanol y glicerol. Como fuente de
nitrógeno, puede usarse amoniaco, sulfato de amonio, otros
compuestos de nitrógeno tales como aminas, una fuente de nitrógeno
natural tal como peptona, hidrolizado de soja y microorganismos
fermentadores digeridos. Como minerales, pueden usarse monofosfato
potásico, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso,
sulfato de manganeso, cloruro cálcico, y similares. En esta
invención, es más deseable añadir clorhidrato de tiamina (vitamina
B1) en el medio de cultivo. La concentración de clorhidrato de
tiamina es más de 10 \mug/l, preferiblemente más de 10 mg/l, más
preferiblemente menos de 100 mg/l.
El cultivo se realiza preferiblemente en
condiciones aeróbicas tal como un cultivo con agitación, y cultivo
en agitación con aireación, a una temperatura de 20 a 42ºC,
preferiblemente de 37 a 40ºC. El pH del medio de cultivo está
habitualmente entre 5 y 9, preferiblemente entre 6,5 y 7,2. El pH
del medio de cultivo puede ajustarse con amoniaco, carbonato
cálcico, diversos ácidos, diversas bases, y tampones. Habitualmente,
un cultivo de 1 a 5 días es suficiente para la acumulación del
metabolito útil diana en el medio líquido.
Después del cultivo, pueden retirarse los
sólidos tales como células del medio líquido por centrifugación o
filtración en membrana, y después puede recogerse el metabolito útil
diana y purificarse por procedimientos de intercambio iónico,
concentración, y cristalización etc.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se explicará a
continuación más específicamente con referencia a los siguientes
Ejemplos no limitantes. Abreviaturas: Pyr-piruvato,
PEP-fosfoenolpiruvato,
GA-3P-gliceraldehído-3-fosfato,
Acecha-acetil-CoA.
El rendimiento ponderal teórico (Y) se calcula
como
Y = (peso
molecular de producto x moles) / (peso molecular de sustrato x
moles).
Las ecuaciones están simplificadas y muestran
solamente compuestos de carbono y moléculas energéticas.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema PTS seguido de glucolisis da la
siguiente ecuación:
Glucosa = PEP +
Pyr +ATP +2
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfoenolpiruvato carboxilasa codificada por
el gen ppc cataliza la siguiente reacción:
PEP + CO_{2}
=
oxaloacetato
\vskip1.000000\baselineskip
La piruvato deshidrogenasa codificada por el gen
pdh cataliza la siguiente reacción:
Pyr =
acetil-CoA + CO_{2} +
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Y la ecuación final es:
(A)Glucosa =
acetil-CoA + oxaloacetato + ATP + 3
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema PTS seguido de glucolisis da la
siguiente ecuación:
Glucosa + PEP =
fructosa-6-fosfato +
Pyr
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfoenolpiruvato sintasa cataliza la
siguiente reacción:
Pyr + ATP =
PEP
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfoenolpiruvato carboxilasa codificada por
el gen ppc cataliza la siguiente reacción:
PEP + CO_{2}
=
oxaloacetato
\vskip1.000000\baselineskip
La
fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa:
Fosfato +
fructosa-6-fosfato = H_{2}O +
eritrosa-4-fosfato + acetil
fosfato
\vskip1.000000\baselineskip
La transaldolasa y transcetolasa:
Fructosa-6-fosfato
+ eritrosa-4-fosfato = 2
xilulosa-5-fosfato
\vskip1.000000\baselineskip
La
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa:
Fosfato +
xilulosa-5-fosfato =
gliceraldehído-3-fosfato + acetil
fosfato
\vskip1.000000\baselineskip
Glucolisis:
Gliceraldehído-3
-fosfato = PEP + 2 ATP
+2NADH
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfato acetiltransferasa codificada por el
gen pta
Acetilfosfato =
acetil-CoA
\vskip1.000000\baselineskip
Y la ecuación final es:
(B)2 glucosa +
2 CO_{2} = 3 acetil-CoA + 2 oxaloacetato +
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
La comparación de las ecuaciones (A) y (B)
muestra que el uso de las actividades fosfocetolasa permite la
generación de 1,5 moléculas de acetil-CoA a partir
de 1 molécula de glucosa y ahorra 1 molécula de CO_{2} en
contraste con 1 molécula de acetil-CoA obtenida a
partir de 1 molécula de glucosa en el metabolismo de la glucosa sin
las actividades fosfocetolasa.
\vskip1.000000\baselineskip
PTS + glucolisis:
(A)glucosa =
acetil-CoA+oxaloacetato + ATP+
3NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclo TCA:
acetil-CoA +
oxaloacetato = 2-oxoglutarato + NADPH +
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Glutamato deshidrogenasa:
2-oxoglutarato +
NH_{3} + NADPH = ácido
glutámico
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación final:
(C)glucosa =
ácido glutámico + ATP + 3 NADH +
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de ácido
L-glutámico es del 81,7%.
\vskip1.000000\baselineskip
Glucolisis y PPC no oxidativa:
5 glucosa + 5
PEP = 5 fructosa-6-fosfato + 5
Pyr
en la
que
fructosa-6-fosfato
+ ATP = 2
GA-3P
2
fructosa-6-fosfato + 2
GA-3P = 2
xilulosa-5-fosfato +2
eritrosa-4-fosfato
2
fructosa-6-fosfato + 2
eritrosa-4-fosfato = 4
xilulosa-5-fosfato
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
5 glucosa + 5
PEP +ATP = 6 xilulosa-5-fosfato + 5
Pyr
\vskip1.000000\baselineskip
Después, la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa:
Xilulosa-5-fosfato
+ fosfato = GA-3P +
acetilfosfato
\newpage
La glucolisis y la fosfato
acetiltransferasa:
GA-3P = PEP + ATP
+
NADH
Acetilfosfato =
acetil-CoA
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
(1)5 glucosa =
6 acetil-CoA + PEP +5 ATP + 6 NADH + 5
PYR
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfoenolpiruvato sintasa
PYR + 2 ATP =
PEP +
fosfato
Suponiendo que NADH = 2 ATP
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
5 glucosa = 6
acetil-CoA + 6 PEP +7
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc):
PEP + CO_{2}
=
oxaloacetato
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
(2)5 glucosa +6
CO_{2} = 6 acetil-CoA + 6 oxaloacetato +7
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclo TCA:
Oxaloacetato +
acetil-CoA = oxoglutarato + CO_{2} +
NADPH
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
5 glucosa = 6
oxoglutarato + 6NADPH
+7ATP
\vskip1.000000\baselineskip
La glutamato deshidrogenasa:
Oxoglutarato +
NADPH = ácido
glutámico
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación final:
(D)5 glucosa =
6 ácido glutámico + 7
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de ácido
L-glutámico es del 98%.
\vskip1.000000\baselineskip
PTS + glucolisis:
2 glucosa + 2
PEP = 2 fructosa-6-fosfato + 2
PYR
\vskip1.000000\baselineskip
La
fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa2:
fructosa-6-fosfato
+ fosfato = eritrosa-4-fosfato +
acetilfosfato
\vskip1.000000\baselineskip
La transaldolasa y transcetolasa:
fructosa-6-fosfato
+ eritrosa-4-fosfato = 2
xilulosa-5-fosfato
\vskip1.000000\baselineskip
La
xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa:
2
xilulosa-5-fosfato + 2 fosfato = 2
GA-3P + 2
acetilfosfato
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
2 glucosa +
2PEP = 2 GA-3P + 3 acetilfosfato + 2
PYR
\vskip1.000000\baselineskip
Glucolisis:
GA-3P = PEP + ATP
+
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
(3)2 glucosa =
3 acetilfosfato + 2 PYR + 2 ATP + 2
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfoenolpiruvato sintasa:
PYR + 2ATP =
PEP
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfato acetiltransferasa:
Acetilfosfato =
acetil-CoA
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
2 glucosa = 3
acetil-CoA + 2 PEP +
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfoenolpiruvato carboxilasa:
PEP + CO_{2}
=
oxaloacetato
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
(4)2 glucosa +
2 CO_{2} = 3 acetil-Co-A + 2
oxaloacetato +
NADH
o
6 glucosa + 6
CO_{2} = 9 acetil-CoA + 6 oxaloacetato + 3
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
La derivación del glioxalato:
2
Acetil-CoA = succinato +
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclo TCA:
Succinato =
oxaloacetato + ATP +
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
6 glucosa + 6
CO_{2} = 7 acetil-CoA + 7 oxaloacetato + ATP + 5
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclo TCA:
Acetil-CoA +
oxaloacetato = 2-oxoglutarato + NADPH +
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
La glutamato deshidrogenasa:
2-oxoglutarato +
NH_{3} + NADPH = ácido
glutámico
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación final:
6 glucosa = 7
ácido glutámico + ATP + 5 NADH +
CO_{2}
o
(E)6 glucosa =
7 ácido glutámico + 11 ATP +
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de ácido
L-glutámico es del 95,3%.
La comparación de las ecuaciones (C), (D), y (E)
muestra que el uso de las actividades fosfocetolasa aumenta
significativamente el rendimiento teórico de la biosíntesis de ácido
L-glutámico y permite la generación de 1 molécula
más de ácido L-glutámico que las moléculas de
glucosa utilizadas y evita la liberación de CO_{2} en contraste
con 1 molécula de ácido L-glutámico obtenida de 1
molécula de glucosa en el metabolismo de la glucosa sin las
actividades fosfocetolasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
1
PTS + glucolisis:
glucosa = PEP +
PYR + ATP + 2
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfoenolpiruvato carboxilasa:
PEP + CO_{2}
=
oxaloacetato
\newpage
Piruvato deshidrogenasa:
PYR =
acetil-CoA + CO_{2} +
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuaciones resumidas:
Glucosa =
oxaloacetato + acetil-CoA + ATP + 3
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclo TCA:
Oxaloacetato +
acetil-CoA = succinato + NADPH + NADH + ATP + 2
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuaciones finales:
Glucosa =
succinato + NADPH + 4 NADH + 2 ATP + 2
CO_{2}
o suponiendo que NADH = NADPH = 2
ATP
(F)Glucosa =
succinato + 12 ATP + 2
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de succinato es
del 65%.
\vskip1.000000\baselineskip
La glucolisis, PPC no oxidativa,
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa, fosfato acetiltransferasa y fosfoenolpiruvato
carboxilasa da la ecuación resumida (véase el Ejemplo 2, ecuación
2):
5 glucosa + 6
CO_{2} = 6 acetil-CoA +6 oxaloacetato + 7
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclo TCA:
Oxaloacetato +
acetil-Co A = succinato + NADPH + NADH + ATP + 2
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación final:
5 glucosa = 6
succinato + 6 CO_{2} +6 NADPH + 25
ATP
o suponiendo que NADH = NADPH =
2ATP
(G)5 glucosa =
6 succinato + 6 CO_{2} + 37
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de succinato es
del 79%.
\newpage
La glucolisis, PPC no oxidativa,
fructosa-6-fosfato fosfocetolasa,
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa, fosfato acetiltransferasa, y fosfoenolpiruvato
carboxilasa da la ecuación resumida (véase el Ejemplo 2, ecuación
4):
2 glucosa + 2
CO_{2} = 3 acetil-CoA + 2 oxaloacetato +
NADH
o
4 glucosa + 4
CO_{2} = 6 acetil-CoA + 4 oxaloacetato + 2
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclo TCA:
Oxaloacetato +
acetil-CoA = succinato + NADPH + NADH + ATP + 2
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
4 glucosa = 4
succinato + 2 acetil-CoA + 4 CO_{2} + 4NADPH + 6
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Derivación del glioxilato:
2
acetil-CoA = succinato +
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación final:
4 glucosa = 5
succinato + 4 CO_{2} + 4 NADPH + 7
NADH
o suponiendo que NADH = NADPH =
2ATP
(H)4 glucosa =
5 succinato + 4 CO_{2} + 22
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de succinato es
Y = 82%.
La comparación de las ecuaciones (F), (G), y (H)
muestra que el uso de las actividades fosfocetolasa aumenta
significativamente el rendimiento teórico de la biosíntesis del
succinato y permite la generación de 1 molécula más de succinato que
las moléculas de glucosa utilizadas, y evita la liberación de
CO_{2} en contraste con 1 molécula de succinato obtenida de 1
molécula de glucosa en el metabolismo de la glucosa sin las
actividades fosfocetolasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Glucolisis:
glucosa = 2 PYR
+ 2 ATP + 2
NADH
\newpage
Biosíntesis de L-leucina:
2 PYR+NADPH =
2-ceto-isovalerato +
CO_{2}
2-ceto-isovalerato
+ acetil-CoA + ácido L-glutámico =
leucina + NADH + 2-oxoglutarato +
CO_{2}
o
2-ceto-isovalerato
+ acetil-CoA = leucina + NADH - NADPH +
CO_{2}
en la que el NADPH se usa para la
regeneración del ácido
L-glutámico
\vskip1.000000\baselineskip
La piruvato deshidrogenasa:
PYR =
acetil-CoA + NADH +
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
3 PYR = leucina
+2 NADH -2 NADPH + 3
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación final:
3 glucosa = 2
leucina +4 NADH -4 NADPH + 6 CO_{2} + 6ATP + 6
NADH
o suponiendo que NADH = NADPH = 2
ATP
(I)3 glucosa =2
leucina+ 18 ATP + 6
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de
L-leucina es Y = 48%.
\vskip1.000000\baselineskip
La glucolisis, PPC no oxidativa,
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa, y fosfato acetiltransferasa da la ecuación resumida
(véase el Ejemplo 2, ecuación 1):
5 glucosa = 6
acetil-CoA + PEP +5 ATP + 6 NADH + 5
PYR
\vskip1.000000\baselineskip
La piruvato quinasa:
PEP = PYR +
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
5 glucosa = 6
acetil-CoA +6PYR + 6ATP
+6NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Biosíntesis de L-leucina:
2 PYR +
acetil-CoA = leucina + NADH - 2 NADPH + 2
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
(5)5 glucosa =
3 leucina + 3 acetil-CoA + 6 ATP + 9 NADH - 6 NADPH
+ 6
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Otra acción de la glucolisis da:
(6)3 glucosa =
6PYR+ 18
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
Sumando las ecuaciones 5 y 6:
3 glucosa = 6 PYR + 18
ATP
+
5 glucosa = 3 leucina + 3
acetil-CoA + 6 ATP + 9 NADH - 6 NADPH + 6
CO_{2}
+
8 glucosa = 3 leucina + (6 PYR + 3
Ace-CoA) + 9 NADH - 6 NADPH + 24 ATP + 6
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación final:
8 glucosa = 6
leucina + 24 ATP + 12 NADH - 12 NADPH + 12
CO_{2}
o suponiendo que NADH =
NADPH
(J)8 glucosa =
6 leucina + 12 CO_{2} + 24
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de
L-leucina es Y = 55%.
\vskip1.000000\baselineskip
La glucolisis, PPC no oxidativa,
fructosa-6-fosfato fosfocetolasa,
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa da la ecuación resumida (véase el Ejemplo 2, ecuación
3):
2 glucosa = 3
acetilfosfato + 2 PYR + 2 ATP + 2
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfato acetiltransferasa:
Acetilfosfato =
acetil-CoA
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
2 glucosa = 3
acetil-CoA + 2 PYR + 2 ATP + 2
NADH
\vskip1.000000\baselineskip
Biosíntesis de L-leucina:
2 PYR +
acetil-CoA = leucina + NADH - 2 NADPH + 2
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación resumida:
(7)2 glucosa =
leucina + 2 acetil-CoA + 2 ATP + 3 NADH - 2 NADPH +
2
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Otra acción de la glucolisis da:
(8)2 glucosa =
3 PYR + 12
ATP
\vskip1.000000\baselineskip
Sumando las ecuaciones 7 y 8:
2 glucosa = leucina + 2
acetil-CoA + 2 ATP + 3 NADH - 2 NADPH + 2
CO_{2}
+
2 glucosa = 4 PYR + 12
ATP
=
4 glucosa = leucina + (4 PYR + 2
acetil-CoA) + 14 ATP + 3 NADH - 2 NADPH + 2
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Biosíntesis de L-leucina:
4 PYR + 2
acetil-CoA = 2 leucina + 2 NADH - 4 NADPH + 4
CO_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ecuación final:
4 glucosa = 3
leucina + 14 ATP+ 5 NADH - 6 NADPH+ 6
CO_{2}
o suponiendo que NADH = NADPH = 2
ATP
4 glucosa = 3
leucina+ 6 CO_{2}+12 ATP
(K)
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento ponderal teórico de
L-leucina es Y = 55%.
La comparación de las ecuaciones (I), (J), y (K)
muestra que el uso de las actividades fosfocetolasa aumenta
significativamente el rendimiento teórico de la biosíntesis de la
L-leucina.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen xpk1 puede clonarse a partir del
ADN cromosómico de Lactobacillus plantarum cepa 8PA3 (VKPM
B-7495). En base a la secuencia de nucleótidos
presentada, se pueden sintetizar los cebadores representados en la
SEC ID Nº 7 (cebador 1) y Nº 8 (cebador 2) para la amplificación del
gen xpk1. El cebador 1 contiene el sitio de reconocimiento
HindIII introducido en el extremo 5' del mismo. El cebador 2
contiene el sitio de reconocimiento EcoRI introducido en el
extremo 5' del mismo.
El ADN cromosómico de Lactobacillus
plantarum cepa 8PA3 puede usarse como molde para PCR y puede
prepararse por un procedimiento habitual. La PCR puede realizarse
usando el "Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400" en las
siguientes condiciones: desnaturalización inicial del ADN a 95ºC
durante 5 min.; después 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC
durante 30 segundos, hibridación a 55ºC durante 60 segundos y
elongación a 72ºC durante 120 segundos; polimerización final
durante 7 min. a 72ºC usando la Taq polimerasa de Fermentas
(Fermentas, Lituania). El fragmento de PCR obtenido que contiene el
gen xpk1 con su propia secuencia SD y sin una secuencia
promotora puede tratarse con HindIII y EcoRI e
insertarse en el vector pMW119 previamente tratado con las mismas
enzimas. De este modo, puede obtenerse el plásmido
pMW-xpk1.
La transformación de una cepa bacteriana
productora de un metabolito útil con el plásmido
pMW-xpk1 puede realizarse por un procedimiento
habitual para obtener la cepa que contenga el gen xpk1
amplificado.
\newpage
La transformación de la cepa de E. coli
productora de ácido L-glutámico VL334thrC^{+}
(publicación de patente europea Nº 1172433) con el plásmido
pMW-xpk1 puede realizarse por un procedimiento
habitual para obtener la cepa
VL334thrC^{+}-pMW-xpk1.
Ambas cepas, VL334thrC^{+} y
VL334thrC^{+}-pMW-xpk1, pueden
cultivarse durante 18-24 horas a 37ºC en placas de
L-agar. Después, puede transferirse una carga de las
células a tubos de ensayo que contienen 2 ml de medio de
fermentación. El medio de fermentación debe contener 60 g/l de
glucosa, 25 g/l de sulfato de amonio, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1
g/l MgSO_{4}, 0,1 mg/ml tiamina, 70 \mug/ml de
L-isoleucina y 25 g/l de tiza (pH 7,2). La glucosa
y la tiza deben esterilizarse por separado. El cultivo puede
realizarse a 30ºC durante 3 días con agitación. Después del
cultivo, la cantidad acumulada de ácido L-glutámico
puede determinarse por cromatografía en papel (composición de la
fase líquida: butanol-ácido acético-agua=4:1:1) con
posterior tinción con ninhidrina (solución al 1% en acetona) y
elución adicional de los compuestos en etanol al 50% con CdCl_{2}
al 0,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de la cepa de E. coli
productora de L-prolina 702ilvA (VKPM
B-8012, publicación de patente rusa 2000124295,
publicación de patente europea Nº 1172433) con el plásmido
pMW-xpk1 puede realizarse por un procedimiento
habitual para obtener la cepa
702ilvA-pMW-xpk1.
Ambas cepas de E. coli 702ilvA y
702ilvA-pMW-xpk1 pueden cultivarse
durante 18-24 horas a 37ºC en placas de
L-agar. Después, estas cepas pueden cultivarse en
las mismas condiciones que se han descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de la cepa de E. coli
productora de L-leucina 57 (VKPM
B-7386, patente de Estados Unidos 6.124.121) con el
plásmido pMW-xpk1 puede realizarse por un
procedimiento habitual para obtener la cepa
57-pMW-xpk1.
Ambas cepas de E. coli 57 y
57-pMW-xpk1 pueden cultivarse
durante 18-24 horas a 37ºC en placas de
L-agar. Después, estas cepas pueden cultivarse en
las mismas condiciones que se han descrito anteriormente sin la
adición de isoleucina en el medio.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de la cepa de E. coli
productora de L-cisteína JM15(ydeD) con el
plásmido pMW-xpk1 puede realizarse un procedimiento
habitual para obtener la cepa
JM15(ydeD)-pMW-xpk1.
La cepa de E. coli JM15(ydeD) es
un derivado de la cepa de E. coli JM15 (patente de Estados
Unidos 6.218,168) que puede transformarse con el ADN que tiene el
gen ydeD que codifica una proteína de membrana, que no está
implicada en la ruta biosintética de ningún
L-aminoácido (patente de Estados Unidos
5.972.663).
Las condiciones de fermentación para la
evaluación de la producción de L-cisteína se
describen en detalle en el Ejemplo 6 de la patente de Estados Unidos
6.218.168.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de la cepa de Enterobacter
agglomerans productora de ácido L-glutámico
AJ13356 (patente de Estados Unidos 6.331.419) (recientemente
reclasificada como Pantoea ananatis) con el plásmido
pMW-xpk1 puede realizarse por un procedimiento
habitual para obtener la cepa
AJ13356-pMW-xpk1.
Cada una de las cepas AJ13356 y
AJ13356-xpk1 puede inocularse en un matraz de 500 ml
de volumen que contiene 20 ml de un medio de cultivo que comprende
40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato de amonio, 0,5 g/l de sulfato
de magnesio heptahidrato, 2 g/l de dihidrogenofosfato potásico, 0,5
g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de cloruro cálcico heptahidrato,
0,02 g/l de sulfato ferroso heptahidrato, 0,02 g/l de sulfato de
manganeso tetrahidrato, 0,72 mg/l de sulfato de zinc dihidrato,
0,64 mg/l de sulfato de cobre pentahidrato, 0,72 mg/l de cloruro de
cobalto hexahidrato, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de molibdato
sódico dihidrato, 2 g/l de extracto de levadura, 30 g/l de
carbonato cálcico, 200 mg/l de monoclorhidrato de
L-lisina, 200 mg/l de L-metionina y
200 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico
(DAP), y pueden cultivarse a 37ºC con agitación hasta que la
glucosa contenida en el medio de cultivo se consuma completamente.
Después de completarse el cultivo, pueden medirse el ácido
L-glutámico que se ha acumulado en el medio de
cultivo como anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen xfp se clonó a partir del ADN cromosómico
de la cepa de Bifidobacterium animalis JCM1190. En base a la
secuencia de nucleótidos presentada del gen xfp de
Bifidobacterium animalis ATCC 27674 (Nº de referencia a
GenBank AY518213, SEC ID Nº 9), pueden sintetizarse los cebadores
representados en la SEC ID Nº 13 y Nº 14 y usarse para la
amplificación del gen xfp. Bifidobacterium animalis JCM1190
puede obtenerse de la Japan Collection of Microorganisms (JCM).
La secuencia de ADN del gen xfp de B.
animalis JCM1190 se muestra en la SEC ID Nº 11.
Para amplificar el gen xfp (SEC ID Nº 11) de
Bifidobacterium animalis JCM1190 y clonarlo en un vector
lanzadera pVK9 para E. coli-corineformes, el ADN cromosómico
de Bifidobacterium animalis JCM1190 se extrajo usando el Kit
de purificación Wizard Genomic (Promega). El pVK9 es un vector
lanzadera para E. coli-corineformes, obtenido por digestión
de pHK4 (documento JP 5-007491A) con BamHI y KpnI
para obtener la región que incluye su origen de replicación e
introducción de la región en el sitio AvaII de pHSG299 (producto de
Takara Bio Inc.) El fragmento del gen xfp que incluía una región
promotora se amplificó por PCR usando el ADN cromosómico de B.
animalis como molde y usando los cebadores mostrados en las SEC
ID Nº 13 y Nº 14 como cebadores. La PCR se realizó por un
procedimiento convencional.
El producto de PCR resultante se purificó de
manera convencional y se digirió con XbaI. El producto de PCR
digerido se ligó usando el Kit de ligamiento (producto de Takara Bio
Inc) a pVK9 que se había digerido con XbaI. La mezcla de ligamiento
se usó para transformar células competentes de Escherichia
coli DH5\alpha (producto de Takara Bio Inc.). Las células se
sembraron en medio LB (10 g de bactotriptona, 5 g de extracto de
bacto-levadura y 10 g de NaCl en 1 l) que contenía
IPTG 100 \muM, 40 mg/ml de X-Gal y 25 mg/ml de Km
y se cultivaron durante una noche. Después, las colonias blancas que
salieron a flote se seleccionaron y se separaron en colonias
sencillas para obtener transformantes. El plásmido diana
pVK9-xfp que contenía el gen xfp se aisló de los
transformantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un fragmento de ADN, en el que una
región promotora nativa del gen xfp de B. animalis estaba
remplazada con un promotor PS2 (Peyret JL, Mol Microbiol. Julio de
1993; 9(1):97-109, documento WO93/03158), de
acuerdo con el procedimiento de PCR solapante (R.M. Horton, H.D.
Hunts, S.N. Ho, J.K. Pullen, y L.R. Pease, Gene, 77,
61-68 (1989)). El procedimiento se describe
específicamente a continuación.
Primero, se realizó la PCR usando pPSTG1 que
contenía el promotor PS2 (Y. Kikuchi, M. Date, K. Yokoyama, Y.
Umezawa y H. Matsui, Appl. Environ. Microbiol. Appl. Environ.
Microbiol 69, 358-366 (2003)) como molde y los ADN
sintéticos de las SEC ID Nº 15 y Nº 16 como cebadores para obtener
un producto de amplificación del promotor PS2. Después, para
obtener un producto de amplificación de una secuencia del gen xfp
(región codificante), se realizó la PCR usando el
pVK9-xfp como molde y los ADN sintéticos de las SEC
ID Nº 17 y Nº 18 como cebadores. Las SEC ID Nº 16 y Nº 18 son
complementarias entre sí.
Después, para obtener un fragmento que contenga
el promotor PS2 y el gen xfp de B. animalis, se
mezclaron los fragmentos génicos mencionados anteriormente del
promotor PS2 y el gen xfp de B. animalis en cantidades
sustancialmente equimolares, y se realizó la PCR usando esta mezcla
como molde y los ADN sintéticos de las SEC ID Nº 14 y Nº 19 como
cebadores.
El producto de PCR resultante se purificó de
manera convencional y se digirió con XbaI. El producto de PCR
digerido se ligo usando el Kit de ligamiento (producto de Takara Bio
Inc) a pVK9 que se había digerido con XbaI. La mezcla de ligamiento
se usó para transformar células competentes de Escherichia
coli DH5\alpha (producto de Takara Bio Inc.). Las células se
sembraron en medio LB (10 g de bacto-triptona, 5 g
de extracto de bacto-levadura y 10 g de NaCl en 1
l) que contenía IPTG 100 \muM, 40 mg/ml de X-Gal y
25 mg/ml de Km y se cultivaron durante una noche. Después, las
colonias blancas que salieron a flote se seleccionaron y se
separaron en colonias sencillas para obtener transformantes. El
plásmido objetivo pVK9-PS2_xfp que contenía el
promotor PS2 y el gen xfp se aisló de los transformantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un fragmento de ADN en el que la
región promotora nativa del gen xfp de B. animalis
estaba remplazada con un promotor tac de acuerdo con el
procedimiento de PCR solapante (R.M. Horton, H.D. Hunt, S.N. Ho,
J.K. Pullen y L.R. Pease, Gene, 77,
61-68(1989)). El procedimiento se describe
específicamente a continuación.
Primero, se realizó la PCR usando el
pKK223-3 (Pharmacia) como molde y los ADN sintéticos
de las SEC ID Nº 20 y Nº 21 como cebadores para obtener un producto
de amplificación del promotor tac. Después, para obtener un
producto de amplificación de una secuencia del gen xfp (región
codificante), se realizó la PCR usando el ADN cromosómico de B.
animalis JCM1190 como molde y los ADN sintéticos de las SEC ID
Nº 14 y Nº 22 como cebadores. Las secuencias de nucleótidos de las
SEC ID Nº 20 y Nº 22 son complementarias entre sí.
Después, para obtener un fragmento que contenga
el promotor tac y el gen xfp de B. animalis, se mezclaron
los fragmentos génicos mencionados anteriormente del promotor tac y
el gen xfp de B. animalis en cantidades
sustancialmente equimolares, y se realizó la PCR usando esta mezcla
como molde y los ADN sintéticos de las SEC ID Nº 14 y Nº 21 como
cebadores.
El producto de PCR resultante se purificó de
manera convencional y se digirió con XbaI. El producto de PCR
digerido se ligó usando el Kit de ligamiento (producto de Takara Bio
Inc) a pVK9 que se había digerido con XbaI. La mezcla de ligamiento
se usó para transformar células competentes (producto de Takara Bio
Inc.) de Escherichia coli DH5\alpha. Las células se
sembraron en medio LB (10 g de bacto-triptona, 5 g
de extracto de bacto-levadura y 10 g de NaCl en 1
l) que contenía IPTG 100 \muM, 40 mg/ml de X-Gal y
25 mg/ml de Km y se cultivaron durante una noche. Después, las
colonias blancas que salieron a flote se seleccionaron y se
separaron en colonias sencillas para obtener transformantes. El
plásmido objetivo pVK9-tac_xfp que contenía el gen
xfp y el promotor tac se aisló de los transformantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen xpkA se clonó del ADN cromosómico de la
cepa de Lactobacillus pentosus JCM1558. Lactobacillus
pentosus JCM1558 puede obtenerse de la Japan Collection of
Microorganisms (JCM). Para amplificar un gen xpkA que codifique
fosfocetolasa (SEC ID Nº 1; AJ309011: gi: 16605513) de
Lactobacillus pentosus JCM1558 y clonarlo en un vector
lanzadera pVK9, se extrajo el ADN cromosómico de Lactobacillus
pentosus JCM1558 usando un kit de purificación Wizard Genomic
(Promega).
Se obtuvo un fragmento de ADN remplazando la
región promotora del gen xpkA de L. pentosus que
codifica la fosfocetolasa con un promotor PS2 de acuerdo con el
procedimiento de PCR solapante. El procedimiento se describe
específicamente en este documento.
Primero se realizó la PCR usando pPSTG1 que
contenía el promotor PS2 (Y. Kikuchi, M. Date, K. Yokoyama, Y.
Umezawa y H. Matsui, Appl. Environ. Microbiol. Appl. Environ.
Microbiol 69, 358-366 (2003)) como molde y los ADN
sintéticos de las SEC ID Nº 15 y Nº 23 como cebadores para obtener
un producto de amplificación del promotor PS2. Después, para
obtener un producto de amplificación de una secuencia del gen xpkA
(región codificante), se realizó la PCR usando el ADN cromosómico
de Lactobacillus pentosus JCM1558 como molde y los ADN
sintéticos de la SEC ID Nº 24 y Nº 25 como cebadores. Las
secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº 23 y Nº 25 son
complementarias entre sí.
Después, para obtener un fragmento que contenga
el promotor PS2 y el gen xpkA de L. pentosus, se
mezclaron los fragmentos génicos mencionados anteriormente del
promotor PS2 y el gen xpkA de L. pentosus en cantidades
sustancialmente equimolares, y se realizó la PCR usando esta mezcla
como molde y los ADN sintéticos de las SEC ID Nº 19 y Nº 24 como
cebadores.
El producto de PCR resultante se purificó de
manera convencional y se digirió con XbaI. El producto de PCR
digerido se ligó usando el Kit de ligamiento (producto de Takara Bio
Inc) a pVK9 que se había digerido con XbaI. La mezcla de ligamiento
se usó para transformar células competentes (producto de Takara Bio
Inc.) de Escherichia coli DH5\alpha. Las células se
sembraron en medio LB (10 g de bacto-triptona, 5 g
de extracto de bacto-levadura y 10 g de NaCl en 1
l) que contenía IPTG 100 \muM, 40 mg/ml de X-Gal y
25 mg/ml de Km y se cultivaron durante una noche. Después, las
colonias blancas que salieron a flote se seleccionaron y se
separaron en colonias sencillas para obtener transformantes. El
plásmido objetivo pVK9-PS2_xpkA que contenía el
promotor PS2 y xpkA se aisló de los transformantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cepa PDH-deficiente es
auxótrofa para acetato. Por otro lado, una cepa PDH (piruvato
deshidrogenasa)-deficiente en la que se introduce el
gen de la fosfocetolasa ya no será auxótrofa para acetato. Por
consiguiente, se confirmó el efecto de la introducción del gen xfp o
xpkA.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el ADN cromosómico de Bacillus
subtilis como molde para PCR y los ADN sintéticos de las SEC ID
Nº 42 y Nº 43 como cebadores, se obtuvo un gen sacB (SEC ID Nº 40)
por PCR. La reacción de PCR se realizó, después de 1 ciclo de
mantenimiento a 94ºC durante 5 minutos, repitiendo 25 veces un ciclo
de 94ºC durante 30 segundos, 49ºC durante 30 segundos y 72ºC
durante 2 minutos, usando LA taq (TaKaRa Bio). El producto de PCR se
digirió con BglII y BamHI y los extremos se hicieron romos después
de la purificación por un procedimiento habitual. El producto de
PCR resultante se ligó con pHSG299 que se había digerido con AvaII y
los extremos se habían hecho romos. El plásmido se usó para
transformar células competentes de Escherichia coli JM109
(Takara Bio Inc.), y después los transformantes se suspendieron en
medio LB que contenía 25 mg/ml de kanamicina y se cultivaron
durante una noche. Las colonias se picaron y se sometieron a
aislamiento de colonia sencilla, y después se obtuvieron
transformantes. El plásmido diana pBS3 que contenía el gen sacB se
aisló de los transformantes.
El procedimiento de construcción de pBS3 se
ilustra en la Fig. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Por PCR solapante, se obtuvo un plásmido
alterando el sitio SmaI en la región codificante del gen resistente
a kanamicina en el plásmido pBS3. Primero, usando pBS3 como molde y
los ADN sintéticos de las SEC ID Nº 44 y Nº 45 como cebadores, se
realizó la PCR, y se obtuvo el producto de PCR que contenía la
región N-terminal del gen resistente a kanamicina.
Por otro lado, para obtener un producto de PCR que contuviera la
región C-terminal del gen de resistencia a
kanamicina, se realizó la PCR usando pBS3 como molde y los ADN
sintéticos de las SEC ID Nº 46 y Nº 47 como cebadores. El producto
de PCR puede obtenerse, después de 1 ciclo de tratamiento con calor
a 98ºC durante 5 minutos, repitiendo 25 veces un ciclo de 98ºC
durante 10 segundos, 57ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1
minuto, usando la ADN polimerasa Pirobest (Takara Bio Inc.). Las
secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº 45 y Nº 46 son
parcialmente complementarias entre sí.
El sitio SmaI de esta secuencia se alteró
introduciendo una mutación sin causar una sustitución de aminoácido.
Para obtener un fragmento del gen de resistencia a kanamicina
mutante en el estuviera alterado el sitio SmaI, se mezclaron la
región N-terminal del producto génico y la región
C-terminal del producto génico del gen de
resistencia a kanamicina para formar una mezcla casi equimolar.
Usando la mezcla resultante como molde para la PCR y los ADN
sintéticos de las SEC ID Nº 44 y Nº 47 como cebadores, se realizó la
PCR. Se obtuvo el producto de PCR que tenía la mutación en el gen
de resistencia a kanamicina. El producto de PCR diana puede
obtenerse, después de 1 ciclo de tratamiento con calor a 98ºC
durante 5 minutos, repitiendo 25 veces un ciclo que comprende 98ºC
durante 10 segundos, 57ºC durante 30 segundos a 72ºC durante 1,5
minuto usando la ADN polimerasa Pirobest
(Takara Bio Inc.).
(Takara Bio Inc.).
El producto de PCR se digirió con BanII después
de la purificación y se insertó en el sitio BanII del pBS3 descrito
anteriormente. El ADN obtenido se usó para transformar células
competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.), se
suspendieron en medio LB que contenía 25 mg/ml de kanamicina y se
cultivaron durante una noche. Las colonias se picaron y se
sometieron a aislamiento de colonia sencilla, y se obtuvieron
transformantes. El plásmido objetivo pBS4S se aisló de los
transformantes. El procedimiento de construcción de pBS4S se ilustra
en la Fig. 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido pBS5T que tenía un
origen de replicación sensible a la temperatura de bacterias
corineformes por los siguientes procedimientos.
Se obtuvo la región de replicación sensible a la
temperatura digiriendo pHSC4 (documento US5616480A) con BamHI y
SmaI y haciendo romos los extremos del fragmento digerido, y después
esta región se ligó al sitio NdeI con extremos romos de pBS4S. El
ADN obtenido se usó para transformar células competentes de
Escherichia coli JM109 (producto de Takara Bio Inc.), y los
transformantes se suspendieron en medio LB que contenía 25 mg/ml de
Km y se cultivaron durante una noche. Las colonias se picaron y se
sometieron a aislamiento de colonia sencilla, y después se
obtuvieron transformantes. El plásmido objetivo pBS5T que contenía
el fragmento sacB y el origen de replicación sensible a la
temperatura se aisló de los transformantes. La Fig. 4 ilustra el
esquema de construcción de pBS5T.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un fragmento de ADN para la alteración
del gen aceE que codifica la piruvato deshidrogenasa
(componente E1 de la piruvato deshidrogenasa) de ATCC13869 por el
procedimiento de PCR solapante usando como ADN sintéticos cebadores
basados en la secuencia de nucleótidos presentada del gen
aceE de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Nº de
referencia a la base de datos GenBank NC 003450; SEC ID Nº 38).
\newpage
Primero, se realizó la PCR usando un ADN
cromosómico de C. glutamicum ATCC13869 como molde y los ADN
sintéticos de las SEC ID Nº 26 y Nº 27 como cebadores para obtener
un producto de amplificación de extremo N-terminal
gen del aceE gene. Después, para obtener un producto de
amplificación del extremo C-terminal del gen
aceE, se realizó la PCR usando el ADN cromosómico de C.
glutamicum ATCC13869 como molde y los ADN sintéticos de las SEC
ID Nº 28 y Nº 29 como cebadores. Las secuencias de las SEC ID Nº 26
y Nº 28 son complementarias entre sí.
Después, para obtener un fragmento aceE
en el que esté delecionada una secuencia interna, se mezclaron los
fragmentos génicos mencionados anteriormente del extremo N y C en
cantidades sustancialmente equimolares, y se realizó la PCR usando
esta mezcla como molde y los ADN sintéticos de las SEC ID Nº 30 y Nº
31 como cebadores.
El producto de PCR resultante se purificó de
manera convencional y se digirió con SmaI. El producto de PCR
digerido se ligó usando el Kit de ligamiento (producto de Takara Bio
Inc) al pBS5T descrito anteriormente que se había digerido con
SmaI. La mezcla de ligamiento se usó para transformar células
competentes de Escherichia coli DH5\alpha (producto de
Takara Bio Inc.). Las células se sembraron en medio LB (10 g de
bacto-triptona, 5 g de extracto de
bacto-levadura y 10 g de NaCl en 1 l) que contenía
IPTG 100 \muM, 40 mg/ml de X-Gal y 25 mg/ml de Km
y se cultivaron durante una noche. Después, las colonias blancas que
salieron a flote se seleccionaron y se separaron en colonias
sencillas para obtener transformantes. El plásmido objetivo
pBS5T-\DeltaaceE se aisló de los
transformantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen aceE codifica el componente E1 de
la piruvato deshidrogenasa.
Primero, se transformó la cepa ATCC13869 con una
elevada concentración del plásmido
pBS5T-\DeltaaceE por el procedimiento de
pulsos eléctricos, se sembró en el medio CM-Dex (5
g/l de glucosa, 10 g/l de polipeptona, 10 g/l de extracto de
levadura, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,01 g/l de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de
hidrolizado de soja y 10 \mug/l de biotina, pH 7,5 (NaOH)) que
contenía 25 mg/ml de kanamicina, y se cultivó a 25ºC durante
aproximadamente 60 horas, y las colonias que salieron a flote se
aislaron como transformantes. Después, los transformantes se
cultivaron en un medio líquido CM-Dex a 34ºC durante
una noche. Después de la dilución apropiada, los transformantes
cultivados se suspendieron en un medio CM-Dex que
contenía 25 mg/ml de kanamicina y se cultivaron a 34ºC durante
aproximadamente 30 horas. La cepa \DeltaaceE, que podía
crecer en este medio y que tenía tanto el gen resistente a
kanamicina como el gen sacB obtenido del plásmido en el cromosoma,
se obtuvo como resultado de recombinación homóloga de un único
entrecruzamieto entre el tipo alterado del gen aceE
(\DeltaaceE) en el plásmido y el gen nativo aceE en
el cromosoma.
A continuación, la cepa \DeltaaceE
obtenida por recombinación homóloga por un único entrecruzamiento
se cultivó durante una noche en un medio líquido
CM-Dex a 31,5ºC. Después de la dilución apropiada,
la cepa \DeltaaceE recombinante homóloga por un único
entrecruzamiento se suspendió en un medio Dex-S10
libre de kanamicina y que contenía sacarosa al 10% (10 g/l de
sacarosa, 10 g/l de polipeptona, 10 0 g/l de extracto de levadura,
1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,01 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de
MnSO_{4}\cdot4H_{2}O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de hidrolizado de
soja, 10 \mug/l de biotina y 2 g/l de acetato sódico, ajustado a
pH 7,5 con KOH). El cultivo se realizó a 34ºC durante
aproximadamente 30 horas. Como resultado de la recombinación
homóloga por entrecruzamiento, se obtuvo una cepa que no tiene el
gen SacB cromosómico y no es sensible a sacarosa.
Las cepas obtenidas de este modo incluyen
aquellas que tienen el tipo alterado del gen aceE y aquellas
que tienen el tipo silvestre del gen aceE. Que el gen
aceE fuera de tipo alterado o de tipo silvestre se confirmó
por una reacción de PCR directa usando las células obtenidas por
cultivo en un medio de agar Dex-S10. La cepa que
contenía el tipo alterado del gen aceE se seleccionó y se
llamó "ATCC13869\DeltaaceE".
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujeron pVK9 (plásmido de control),
pVK9-xfp (plásmido para amplificar el gen xfp de
Bifidobacterium animalis), pVK9-PS2_xfp
(plásmido para amplificar el gen xfp de Bifidobacterium
animalis, en el que su promotor nativo está remplazado con un
promotor PS2), y pVK9-PS2_xpkA (plásmido para
amplificar el gen xpkA de Lactobacillus pentosus, en el que
su promotor nativo está remplazado con un promotor PS2) cada uno en
la cepa ATCC138690\DeltaaceE para obtener cepas que
expresaran fosfocetolasa, y se introdujo pVK9 en la cepa ATCC13869
como control. Específicamente, la cepa ATCC13869\DeltaaceE
y la cepa ATCC13869 cada una se transformaron por el procedimiento
de pulsos eléctricos, se sembraron en un medio
CM-Dex (5 g/l de glucosa, 10 g/l de polipeptona, 10
g/l de extracto de levadura, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,01 g/l de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de
hidrolizado de soja y 10 \mug/l de biotina, ajustado a pH 7,5 con
NaOH) que contenía 25 mg/ml de kanamicina, y se cultivaron a 31,5ºC
durante aproximadamente 30 horas. Las colonias que salieron a flote
se aislaron como transformantes y se denominaron
ATCC13869\DeltaaceE(pVK9),
ATCC13869\DeltaaceE(pVK9-xfp),
ATCC13869\DeltaaceE(pVK9-PS2_xfp),
ATCC13869\DeltaaceE(pvK9-PS2_xpkA) y
ATCC1869(pVK9), respectivamente.
Estas cepas se cultivaron en un
micro-agitador ("Biophotorecorder
TN-1506", producto de ADVANTEC) mientras se
medía la DO con la función de tiempo. En este caso se emplearon dos
medios, es decir, un medio líquido mínimo (compuesto por 10 g/l de
glucosa, 2,5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,5 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 0,25 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l
de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de
MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de urea, 50 \mug/l de biotina,
100 ml de VB1-HCl, 15 mg/l de ácido protocatecuico,
0,02 mg/l de CuSO_{4}, 10 mg/l de CaCl_{2}, y 40 g/l de MOPS,
ajustado a pH 7,0 con KOH) que contenía 25 mg/ml de kanamicina, y
un medio líquido mínimo que contenía acetato (2 g/l de acetato
sódico). Los resultados del cultivo en el medio mínimo y los
resultados en el medio mínimo que contenía acetato se ilustran en
las Fig. 6 y 5, respectivamente. La cepa
ATCC13869\DeltaaceE(pVK9) podía crecer en el medio mínimo
que contenía acetato, pero no podía crecer en el medio mínimo, y
por tanto mostraba auxtrofia de acetato. Las cepas
ATCC13869\DeltaaceE que llevan pvK9-xfp,
pVK9-PS2_xfp, y pVK9-PS2_xpkA,
respectivamente podían crecer en el medio mínimo, lo que indica que
la introducción de xfp o xpkA provoca la compensación de la
auxotrofia de acetato del cepa PDH-deficiente. Por
consiguiente, se confirmó la actividad fisiológica de la
fosfocetolasa que se había introducido en C. glutamicum.
\vskip1.000000\baselineskip
La bacteria corineforme puede producir ácido
L-glutámico en condiciones en las que está limitada
la biotina, o se añade penicilina o tensioactivo en el medio
(remítase al documento WO95/34672). Se sabe, por otro lado, que la
cepa que estaba modificada para disminuir la actividad
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (E1.2.4.2
sucA; 2-oxoglutarato deshidrogenasa) puede
producir ácido L-glutámico incluso no en dichas
condiciones (Kimura E., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 79,
37-57(2003), "Metabolic engineering of
glutamic acid production"). Por consiguiente, se estudió la
mejora en el rendimiento de fermentación de ácido
L-glutámico por la introducción de un gen de
fosfocetolasa usando una cepa sucA-deficiente de C.
glutamicum ATCC13869.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un fragmento con sucA
delecionado derivado e la cepa C. glutamicum ATCC13869 por el
procedimiento de PCR solapante usando como cebadores ADN sintéticos
diseñados en base a la secuencia de nucleótidos del gen sucA
de C. glutamicum ATCC13032 (Nº de referencia a la base de
datos GenBank NC_003450; SEC ID Nº 48).
Primero, se realizó la PCR usando un ADN
cromosómico de C. glutamicum ATCC13869 como molde y los ADN
sintéticos de las SEC ID Nº 32 y Nº 33 como cebadores para obtener
un producto de amplificación del extremo N-terminal
del gel sucA. Después, para obtener un producto de
amplificación del extremo C-terminal del gen
sucA, se realizó la PCR usando el ADN cromosómico de C.
glutamicum ATCC13869 como molde y los ADN sintéticos de las SEC
ID Nº 34 y Nº 35 como cebadores. Las secuencias de las SEC ID Nº 33
y Nº 34 son complementarias entre sí.
Después, para obtener un fragmento de
sucA en el que su secuencia interna esté delecionada, se
mezclaron los fragmentos génicos mencionados anteriormente del
extremo N y C en cantidades sustancialmente equimolares, y se
realizó la PCR usando esta mezcla como molde y los ADN sintéticos de
las SEC ID Nº 36 y Nº 37 como cebadores.
El producto de PCR resultante se purificó de
manera convencional y se digirió con BamHI. El producto de PCR
digerido se ligó usando el Kit de ligamiento (producto de Takara Bio
Inc) al pBS3 descrito anteriormente que se había digerido con
BamHI. La mezcla de ligamiento se usó para transformar células
competentes de Escherichia coli DH5\alpha (producto de
Takara Bio Inc.). Las células se sembraron en medio LB (10 g de
bacto-triptona, 5 g de extracto de
bacto-levadura y 10 g de NaCl en 1 l) que contenía
IPTG 100 \muM, 40 mg/ml de X-Gal y 25 mg/ml de Km
y se cultivaron durante una noche. Después, las colonias blancas que
salieron a flote se seleccionaron y se separaron en colonias
sencillas para obtener transformantes. El plásmido diana
pBS3\DeltasucA se aisló de los transformantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El pBS3\DeltasucA preparado en (A) no
contiene una región de replicación autónoma en las células de la
bacteria corineforme. Por lo tanto, si se transforma una
corinebacteria con este plásmido, aparecería una cepa que tiene
este plásmido integrado en su cromosoma por recombinación homóloga
como transformante aunque sucede en una frecuencia extremadamente
baja. La C. glutamicum ATCC 13869 se transformó con una
elevada concentración del plásmido pBS3\DeltasucA por el
procedimiento de pulsos eléctricos, se sembró en medio
CM-Dex (5 g/l de glucosa, 10 g/l de polipeptona, 10
g/l de extracto de levadura, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,01 g/l de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de
hidrolizado de soja y 10 \mug/l de biotina, ajustado a pH 7,5 con
NaOH) que contenía 25 mg/ml de kanamicina, y se cultivó a 31,5ºC
durante aproximadamente 30 horas, y después, las colonias que
salieron a flote se aislaron como transformantes. Estos
transformantes tienen tanto el gen de resistencia a kanamicina como
el gen SacB obtenido del plásmido, como resultado de recombinación
homóloga entre el fragmento del gen sucA del plásmido y el
gen nativo en el cromosoma.
A continuación, la primera cepa recombinante
obtenida se cultivó durante una noche en un medio líquido
CM-Dex libre de kanamicina a 31,5ºC. Después de la
dilución apropiada, el transformante cultivado se sembró en el
medio Dex-S10 libre de kanamicina (10 g/l de
sacarosa, 10 g/l de polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura, 1
g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01
g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de
MnSO_{4}\cdot4H_{2}O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de hidrolizado de
soja, y 10 \mug/l de biotina, ajustado a pH 7,5 con KOH) que
contenía sacarosa al 10%, se cultivó a 31,5ºC durante
aproximadamente 30 horas, y la colonia que salió a flore se aisló
como un transformante. Como resultado de la segunda recombinación
homóloga por entrecruzamiento, se obtuvo una cepa que ha perdido el
gen SacB del cromosoma y no es sensible a sacarosa.
Las cepas obtenidas de este modo incluyen
aquellas que tienen un tipo alterado del gen sucA y aquellas
que tienen un tipo silvestre del gen sucA. Que el gen
sucA sea al tipo alterado o el tipo silvestre se confirmó
por una reacción de PCR directa usando las células obtenidas por
cultivo en un medio de agar Dex-S10. Se seleccionó
una cepa que tenía un tipo alterado del gen sucA.
La producción de ácido
L-glutámico por la cepa de sucA-alterado se
evaluó en el siguiente procedimiento. Las células de la cepa de
sucA-alterado obtenidas por cultivo en un medio de placa CM2B
se inocularon en un matraz que contenía 80 g de glucosa, 1 g de
KH_{2}PO_{4}, 0,4 g de MgSO_{4}, 30 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,01 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 15
ml de solución de hidrolizado de soja, 200 mg de clorhidrato de
tiamina, 60 \mug de biotina y 50 g de CaCO_{3} en 1 l de agua
pura (ajustado a pH 8,0 con KOH) y se cultivaron a 31,5ºC con
agitación hasta que el azúcar se consumió completamente. Después de
completarse el cultivo, se midió la cantidad de ácido
L-glutámico acumulado en el caldo de cultivo. La
cepa de sucA-alterado que podía producir un mayor rendimiento
de fermentación de ácido L-glutámico que ATCC13869
se seleccionó como la cepa de sucA-alterado de ATCC13869 y se
llamó ATCC13869\DeltasucA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la expresión de un gen de la
fosfocetolasa y su actividad enzimática usando la cepa que se había
modificado para potenciar la expresión de la fosfocetolasa.
Se introdujeron pVK9 (plásmido de control),
pVK9-xfp (plásmido para amplificar el gen xfp de
Bifidobacterium animalis), pVK9-tac_xfp
(plásmido para amplificar el gen xfp de Bifidobacterium
animalis, en el que su promotor nativo está remplazado con un
promotor tac), pVK9-PS2_xfp (plásmido para
amplificar el gen xfp de Bifidobacterium animalis, en el que
su promotor nativo está remplazado con un promotor PS2), y
pVK9-PS2_xpkA (plásmido APRA amplificar el gen xpkA
de Lactobacillus pentosus, en el que su promotor nativo está
remplazado con un promotor PS2) cada uno en la C. glutamicum
ATCC13869\DeltasucA descrita anteriormente para
obtener cepas que expresen fosfocetolasa. Específicamente, la cepa
ATCC13869\DeltasucA se transformó con cada uno de los
plásmidos por el procedimiento de pulsos eléctricos, se sembró en un
medio CM-Dex (5 g/l de glucosa, 10 g/l de
polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l
de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de
MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de hidrolizado
de soja y 10 \mug/l de biotina, ajustado a pH 7,5 con NaOH) que
contenía 25 mg/ml de kanamicina y se cultivó a 31,5ºC durante
aproximadamente 30 horas. Las colonias que salieron a flote se
aislaron como transformantes y se denominaron
ATCC13869\DeltasucA(pVK9),
ATCC13869\DeltasucA(pVK9-xfp),
ATCC13869\DeltasucA (pVK9-tac_xfp),
ATCC13869\DeltasucA(pVK9-PS2_xfp), y
ATCC13869\DeltasucA(pVK9-PS2_xpkA),
respectivamente.
Para obtener una solución enzimática en bruto,
las células de las cepas mencionadas anteriormente obtenidas
cultivando cada cepa en un medio de placa CM-Dex se
inocularon en un matraz que contenía 30 g de glucosa, 1 g de
KH_{2}PO_{4}, 0,4 g de MgSO_{4}, 15 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,01 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O,
13,7 ml de una solución de hidrolizado de soja, 200 mg de
clorhidrato de tiamina, 300 \mug de biotina, y 50 g de CaCO_{3}
en 1 l de agua pura (ajustado a pH 8,0 con KOH) y se cultivaron a
31,5ºC con agitación. El cultivo se terminó cuando la DO620 de la
concentración celular llegó a ser 15, medida por un "Hitachi
Spectrophotometer U-2000A". Después de eliminar
el carbonato cálcico por centrifugación moderada a 3000 rpm durante
30 segundos, se recogieron las células. Los siguientes
procedimientos se realizaron de 0 a 4ºC. Las células recogidas se
lavaron dos veces con una solución de NaCl 0,85 N y se
resuspendieron en 4 ml/g (peso húmedo) de tampón A (KPO_{4} 100 mM
(pH 6,5), KCl 30 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl_{2} 1 mM, PMSF 0,2 mM, DTT
2 mM). Las células se alteraron por un disruptor celular ultrasónico
("Bioruptor"). Las células no alteradas se retiraron por
centrifugación (15.000 g, 60 min.) para obtener una solución
enzimática en bruto. La concentración proteica en la solución
enzimática en bruto se cuantificó usando una solución CBB (solución
CBB de ensayo proteico, producto de Nacalai Tesque) con albúmina
sérica bovina como muestra patrón.
Por SDS-PAGE, se separó la
proteína en la solución enzimática en bruto. El procedimiento
específico de la separación se describirá a continuación. La
solución enzimática en bruto se mezcló, después del ajuste de la
concentración, con un tampón de muestra ("Laemmli sample
buffer", producto de BIORAD) a 1:1. Después de calentar a 95ºC
durante 2 minutos, la mezcla resultante se aplicó a "Ready Gel J
10%" (producto de BIORAD) de modo que la cantidad de proteína
aplicada fuera de 10 \mug, seguido de electroforesis durante 40
minutos en un tanque de electroforesis MiniProtean III Cell
(producto de BIORAD) a un voltaje constante de 200 V. Como tampón
de electroforesis, se usó tris/glicina/SDS (BIORAD). Para la
tinción, se usó azul brillante de Coomassie ("Bio Safe
Coomassei", BIORAD). Los resultados se muestran a continuación en
la Fig. 7 (marcador: producto de BIORAD, patrones de proteína
precision plus (nº 161-0363)).
\newpage
Los carriles 1 a 5 de la Figura 7 muestran
ATCC13869\DeltasucA(pVK9),
ATCC13869\DeltasucA(pVK9-xfp),
ATCC13869
\DeltasucA(pVK9-tac_xfp), ATCC13869\DeltasucA(pVK9-PS2_xfp), y ATCC13869\DeltasucA(pVK9-PS2_xpkA), respectivamente. En comparación con la banda de control (pVK9), la banda de aproximadamente 90 kD que corresponde a la del producto génico fosfocetolasa llega a ser más densa en la cepa que estaba modificada para potenciar la actividad fosfocetolasa. Esto sugiere claramente que existe una cantidad suficiente de expresión del gen de la fosfocetolasa en la bacteria corineforme.
\DeltasucA(pVK9-tac_xfp), ATCC13869\DeltasucA(pVK9-PS2_xfp), y ATCC13869\DeltasucA(pVK9-PS2_xpkA), respectivamente. En comparación con la banda de control (pVK9), la banda de aproximadamente 90 kD que corresponde a la del producto génico fosfocetolasa llega a ser más densa en la cepa que estaba modificada para potenciar la actividad fosfocetolasa. Esto sugiere claramente que existe una cantidad suficiente de expresión del gen de la fosfocetolasa en la bacteria corineforme.
De acuerdo con el procedimiento de Meile (L.
Meile, L.M. Rohr, T.A. Geissmann, M. Herensperger y M. Teuber, J.
Bacteriol. 183, 2929-2936 (2001)), se midió la
actividad enzimática del gen de la fosfocetolasa. Después de la
reacción con 0,075 ml de una solución enzimática en bruto (KPO_{4}
33,3 mM (pH 6,5), clorhidrato de L-cisteína 1,9 mM,
fluoruro sódico 23 mM, yodoacetato sódico 8 mM, y
D-fructosa 6-fosfato 27 mM) a 37ºC
durante 30 minutos, se añadieron 0,075 ml de clorhidrato de
hidroxilamina (2 M, pH 6,5). La mezcla se dejó reaccionar durante
10 minutos a temperatura ambiente y después se tiñó con 0,05 ml de
ácido tricloroacético al 15% (peso/vol), 0,05 ml de HCl 4 M y 0,05
ml de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O (en HCl 0,1 mM, al 5% en peso/vol).
Después de eliminar los cristales por separación centrífuga, se
midió la DO505 usando un lector de actividad enzimática ("Spectra
max 190", producto de Molecular Devices).
Los resultados se muestran a continuación en la
Tabla 3. No se detectó cavidad enzimática en el control (pVK9),
mientras que se detectó actividad enzimática en las cepas en que las
que se había potenciado la actividad fosfocetolasa.
Usando la cepa C. glutamicum
ATCC13869\DeltasucA se evaluó el efecto de la introducción
de un gen de la fosfocetolasa sobre el rendimiento de fermentación
de ácido L-glutámico. Las células de las cepas
ATCC13869\DeltasucA(pVK9),
ATCC13869\DeltasucA(pVK9-xfp),
ATCC13869\DeltasucA(pVK9-PS2_xfp) y
ATCC13869\DeltasucA(pVK9-PS2_xpkA)
obtenidas por cultivo en un medio de placa CM-Dex se
inocularon en el matraz que contenía 30 g de glucosa, 1 g de
KH_{2}PO_{4}, 0,4 g de MgSO_{4}, 15 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,01 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O,
13,7 ml de una solución de hidrolizado de soja, 200 mg de
clorhidrato de tiamina, 300 \mug de biotina, y 50 g de CaCO_{3}
en 1 l de agua pura (ajustado a pH 8,0 con KOH) y se cultivaron a
31,5ºC con agitación hasta que se consumió completamente el azúcar.
Después de completarse el cultivo, se midió la cantidad de ácido
L-glutámico acumulado y la DO en el caldo de
cultivo. Los resultados se muestran en la Fig. 8. Los resultados
muestran que todas las cepas en las que el gen xfp está amplificado
muestran elevada producción de ácido L-glutámico en
comparación con el control.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar en la DO final equilibrada, se
detuvo la proliferación de células añadiendo penicilina G. La
producción de ácido L-glutámico se comparó añadiendo
penicilina G al medio como se ha descrito anteriormente en (1) de
modo que su concentración final fuera 4 U/ml en múltiples puntos de
crecimiento cuando la DO llegó a estar dentro de un intervalo de 10
a 14 después de que se empezara el cultivo. Los resultados se
muestran en la Fig. 9. Estos resultados muestran que incluso si la
producción de ácido L-glutámico se comparaba entre
ellos en un punto en el que los recuentos celulares finales eran
iguales, la producción de ácido L-glutámico era
mayor en las cepas del xfp o el gen xpk amplificado en comparación
con la cepa de control. Los resultados descritos anteriormente
muestran que la introducción de fosfocetolasa es eficaz para mejorar
el rendimiento de fermentación de ácido
L-glutámico.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido
pVK9-PS2-xfp que expresa el gen
xfp de Bifidobacterium animalis y el vector lanzadera
pVK9 de control se introdujeron en la cepa NP106/RSFCPG productora
de ácido L-glutámico por electroporación usando
Bio-Rad MicroPulser. La cepa NP106/RSFCPG se obtuvo
recuperando el plásmido pSTVCB de la cepa AJ13601 (FERM
BP-7207; publicación de patente europea 1078989)
sembrando la cepa AJ13601 en el medio que no contiene cloranfenicol
como marcador de selección.
Para transformar la cepa NP106/RSFCPG con el
plásmido pVK9-PS2-xfp o el vector
pVK9, las células obtenidas por cultivo durante una noche en medio
LBG-M9 (triptona (10 g/l), extracto de levadura (5
g/l), NaCl (5 g/l), glucosa (5 g/l), 0,5 x solución salina M9) con
la adición de tetraciclina (10 \mug/ ml)) se diluyeron 1:100 en
medio LBG-M9 fresco y se incubaron a 34ºC con
aireación hasta DO_{595}=0,6. Las células de 10 ml del cultivo se
recogieron por centrifugación, se lavaron tres veces con agua
desionizada enfriada en hielo y con glicerol al 10% enfriado en
hielo y se resuspendieron en glicerol al 10%. Se añadieron 10 ng del
ADN plasmídico a la suspensión celular y se aplicaron pulsos
eléctricos (E = 20 kV/cm, t = 5 msegundos). Se añadió 1 ml de medio
LBG-M9 inmediatamente después de la electroporación.
Las células se incubaron a 34ºC en aireación durante 2 horas y se
sembraron en medio sólido LBG-M9 que contenía 40
\mug/ml de kanamicina. Las placas se incubaron a 34ºC durante 48
horas. Los clones cultivados se inocularon en 2 ml de medio
LBG-MES (triptona (10 g/l), extracto de levadura (5
g/l), NaCl (5 g/l), glucosa (5 g/l), MES 0,1 M, pH 7,0) que contenía
40 \mug/ml de kanamicina y 10 \mug/ml de tetraciclina y se
incubaron a 34ºC en aireación durante una noche. Se inocularon 80
\mul del medio cultivado durante una noche que contenía las
células bacterianas en 2 ml de medio de fermentación (glucosa (40
g/l), MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,5 g/l),
(NH_{4})_{2}SO_{4} (16 g/l), KH_{2}PO_{4} (0,3
g/l), KCl (1,0 g/l), MES (10 g/l), betaína (1,0 g/l),
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O (10 mg/l), MnSO_{4}\cdot5H_{2}O
(10 mg/l), lisina, metionina, y DAP 100 mg/l de cada uno, triptona
(1 g/l), extracto de levadura (1 g/l), pantotenato cálcico (10
mg/l), CaCO_{3} (30 g/l)) en tubos de ensayo y se incubaron
durante 26 horas con aireación. La cantidad de ácido
L-glutámico acumulado se determinó por el
procedimiento de CCP. Los datos promedio de 4 experimentos
independientes están representados en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede observarse de la Tabla 4, la cepa que
lleva el plásmido pVK9-PS2-xfp
mostró una acumulación de ácido L-glutámico de
aproximadamente 2,6 g/l mayor que la cepa de control transformada
con el vector pVK9, que corresponde a un aumento de al menos el 6%
en el rendimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron fragmentos génicos que carecen de
la ORF de pfk derivados de la cepa ATCC13869 por el procedimiento
de PCR solapante usando ADN sintético como cebadores diseñados en
base a la secuencia de nucleótidos del gen correspondiente de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Nº de referencia a la
base de datos GenBank NC_003450; SEC ID Nº 61). Específicamente,
los productos de amplificación de la región
N-terminal del gen pfk se obtuvieron por un
procedimiento de PCR convencional usando ADN cromosómico de la cepa
de C. glutamicum ATCC13869 como molde, y ADN sintéticos de
las SEC ID Nº 50 y Nº 51 como cebadores. Por otro lado, para obtener
productos de amplificación de la región C-terminal
del gen pfk, se realizó una PCR convencional usando ADN cromosómico
de la cepa ATCC13869 como molde y ADN sintéticos de las SEC ID Nº 52
y Nº 53 como cebadores. Las secuencias de las SEC ID Nº 51 y Nº 53
son complementarias entre sí.
Después, para obtener un fragmento génico de pfk
en el que su secuencia interna esté delecionada, los productos de
amplificación mencionados anteriormente de la región
N-terminal y C-terminal del gen pfk
se mezclaron en cantidades sustancialmente equimolares, y los
productos de amplificación génica se obtuvieron por una PCR
convencional usando esta mezcla como molde y ADN sintéticos de las
SEC ID Nº 54 y Nº 55 como cebadores. El producto de PCR se purificó
de un modo habitual y después se digirió con BamHI, y se insertó en
el sitio BamHI de la pBS5T descrita anteriormente. Este ADN se usó
para transformar células competentes de Escherichia coli
DH5\alpha (producto de Takara Bio Inc.), y las células se
sembraron y cultivaron durante una noche en medio LB suplementado
con IPTG 100 \muM, 40 \mug/ml de X-Gal, y 25
\mug/ml de kanamicina. Después, se picaron las colonias blancas
que salieron a flote y se separaron en colonias sencillas para
obtener transformantes. Los plásmidos se aislaron de los
transformantes obtenidos, y el plásmido que tenía un inserto del
producto de PCR diana se seleccionó y se llamó
pBS5T-\Deltapfk.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa mencionada anteriormente
ATCC13869\DeltasucA se transformó primero con una elevada
concentración del plásmido pBS5T-\Deltapfk por el
procedimiento de pulsos eléctricos, y se sembró en medio
CM-Dex (5 g/l de glucosa, 10 g/l de polipeptona, 10
g/l de extracto de levadura, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,01 g/l de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de
hidrolizado de soja, y 10 \mug/l de biotina, ajustado a pH 7,5 con
NaOH) suplementado con 25 \mug/ml de kanamicina, y se cultivó
durante aproximadamente 60 horas a 25ºC. Los transformantes
resultantes se cultivaron con agitación durante una noche a 34ºC, y
después se diluyeron adecuadamente, y se sembraron y cultivaron
durante 30 horas en medio CM-Dex suplementado con 25
\mug/ml de kanamicina. La cepa que puede crecer en este medio es
una cepa en la que el gen de resistencia a kanamicina y el gen SacB
derivado de dicho plásmido están integrados en su cromosoma, como
resultado de la recombinación homóloga entre el fragmento génico de
pfk en dicho plásmido y el mismo gen localizado en el cromosoma de
la cepa
ATCC13869.
ATCC13869.
Después de que los primeros recombinantes se
cultivaran durante una noche en medio líquido CM-Dex
libre de kanamicina a 31,5ºC, y después de una dilución apropiada,
se sembraron en medio Dex-S10 libre de kanamicina y
que contenía sacarosa al 10% (10 g/l de glucosa, 10 g/l de
polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O,
3 g/l de urea, 1,2 g/l de hidrolizado de soja, 10 \mug/l de
biotina, y 2 g/l de acetato sódico, ajustado a pH 7,5 con KOH), y
se cultivaron durante aproximadamente 30 horas a 34ºC. Como
resultado, se obtuvo una cepa que parece haber perdido el gen SacB y
ha llegado a ser insensible a sacarosa a causa de la segunda
recombinación homóloga.
Las cepas obtenidas incluyen aquellas que tienen
el tipo alterado del gen pfk derivado de
pBS5T-\Deltapfk, y aquellas que tienen el tipo
silvestre del gen pfk. Para confirmar si el gen pfk era de tipo
alterado o de tipo silvestre, se realizó un análisis de PCR directa
usando las células bacterianas cultivadas en un medio de agar
Dex-10. Se seleccionó la cepa que tenía solamente el
tipo alterado de pfk y se llamó ATCC13869 \DeltasucA
\Deltapfk.
\vskip1.000000\baselineskip
Como PFK con actividad reducida, se obtuvieron
PFK*1 (SEC ID Nº 57) y PFK*2 (SEC ID Nº 59). PFK*1 se generar
sustituyendo lisina por ácido glutámico en la posición 171 de la PFK
de tipo silvestre (SEC ID Nº 61). PFK*2 se genera sustituyendo
ácido glutámico por arginina en la posición 171 de la PFK de tipo
silvestre (SEC ID Nº 61). Estas secuencias pueden obtenerse por PCR
recombinante usando el gen pfk de tipo silvestre como molde y ADN
sintéticos para introducir dicha mutación como cebadores.
\vskip1.000000\baselineskip
Para construir un vector de expresión de PFK, se
realizó una PCR convencional usando ADN cromosómico de la cepa de
C. glutamicum ATCC13869 como molde, y ADN sintéticos de las
SEC ID Nº 54 y Nº 55 como cebadores. El producto de PCR se purificó
de un modo habitual y después se digirió con XbaI y KpnI, y el
fragmento génico que contenía el gen pfk se insertó en el sitio
XbaI-KpnI del pVK9 descrito anteriormente. Este ADN
se usó para transformar células competentes de Escherichia
coli DH5\alpha (producto de Takara Bio Inc.), y las células
se sembraron y se cultivaron durante una noche en medio LB
suplementado con IPTG 100 \muM, 40 \mug/ml de
X-Gal, y 25 \mug/ml de Km. Después, las colonias
blancas que salieron a flote se pircaron y separaron en colonias
sencillas para obtener transformantes. Los plásmidos se aislaron de
los transformantes obtenidos, y el plásmido que tenía un inserto
del gen diana se seleccionó y se llamó pVK9-PFK.
Después, para construir un plásmido que exprese
tanto la PFK mutante como la fosfocetolasa al mismo tiempo, el
pVK9-PS2_xfp mencionado anteriormente se digirió con
XbaI, y después el fragmento génico que contenía el PS2_xfp se
purificó y se insertó en el sitio XbaI del pVK9-PFK.
Este ADN se usó para transformar células competentes de
Escherichia coli DH5\alpha (producto de Takara Bio Inc.), y
las células se sembraron y se cultivaron durante una noche en medio
LB suplementado con IPTG 100 \muM, 40 \mug/ml de
X-Gal, y 25 \mug/ml de Km. Después, las colonias
blancas que salieron a flote se picaron y se separaron en colonias
sencillas para obtener transformantes. Los plásmidos se aislaron de
los transformantes obtenidos, y el plásmido que tenía un inserto del
PS2_xfp y pfk se seleccionó y se llamó
pVK9-PS2_xfp_PFK.
Para construir un plásmido que exprese tanto el
gen pfk mutante como el gen de la fosfocetolasa al mismo tiempo, se
generaron pVK9-PS2_xfp_PFK*1 y
pVK9-PS2_xfp_PFK* de acuerdo con el mismo
procedimiento empleado en la construcción de
pVK9-PS2_xfp_PFK.
\newpage
Los plásmidos de expresión mencionados
anteriormente para PFK y fosfocetolasa
(pVK9-PS2_xfp_PFK,
pVK9-PS2_xfp_PFK*1, y
pVK9-PS2_xfp_PFK*2) se usaron para transformar la
cepa ATCC13869 \DeltasucA \Deltapfk mencionada
anteriormente para examinar la actividad enzimática de PFK. La
transformación se realizó por el procedimiento de pulsos
eléctricos, y los transformantes se obtuvieron sembrando las células
bacterianas en medio CM-Dex (5 g/l de glucosa, 10
g/l de polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 0,4 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l
de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de
MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3 g/l de urea, 1,2 g/l de hidrolizado
de soja, y 10 \mug/l de biotina, ajustado a pH 7,5 con NaOH)
suplementado con 25 \mug/ml de kanamicina, y cultivándolas
durante aproximadamente 30 horas a 31,5ºC.
La solución enzimática en bruto se obtuvo del
siguiente modo. Se recogieron células bacterianas en fase
logarítmica, se lavaron con tampón Kpi 100 mM (pH 8,2), y después
se disolvieron en el mismo tampón, seguido de alteración
ultrasónica. La fracción soluble se separó por ultracentrifugación
(60000 rpm, 30 min.) para obtener la solución enzimática en bruto.
El procedimiento para cuantificar la concentración de proteínas en
la solución enzimática en bruto se muestra a continuación. La
solución enzimática en bruto y la solución de BSA de concentración
conocida para generar una curva patrón se hicieron reaccionar cada
una con solución CBB (solución CBB de ensayo de proteínas, Nacalai
Tesque) para desarrollar color, y se siguió por la medición de la
DO595 nm usando spectra max 190 (Molecular Divices).
Después, se midió la actividad PFK de acuerdo
con el procedimiento convencional (Denise Kotlars y Henri Buc,
Methods in Enzymology (1982) 90: 60-70). El
procedimiento específico se muestra a continuación. La actividad
enzimática se determinó añadiendo solución enzimática en bruto a
Tris-HCl 100 mM (pH 8,2), MgCl_{2} 10 mM, ATP 1
mM, 1 U/ml de glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa, 1 U/ml de triosafosfato isomerasa, 1 U/ml de
aldolasa, NADH 0,2 mM, y
fructosa-6-fosfato 10 mM, seguido de
la medición de los cambios en el transcurso del tiempo en la DO340
nm usando spectra max 190 (Molecular Divices). La actividad relativa
de la PFK reducida cuando la actividad de la PFK de tipo silvestre
está establecida a 1, se muestra en la siguiente Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la cepa C. glutamicum ATCC13869
\DeltasucA \Deltapfk, se evaluó el efecto de la reducción
en la actividad PFK sobre el rendimiento de fermentación de ácido
L-glutámico. Las células de cada cepa obtenidas
cultivando la cepa en una placa CM-Dex se inocularon
en un medio que contenía 30 g de glucosa, 1 g de KH_{2}PO_{4},
0,4 g de MgSO_{4}, 15 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,01 g
de FeSO_{4}\cdotH_{2}O, 0,01 g de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O,
13,7 ml de una solución de hidrolizado de soja, 200 \mug de
clorhidrato de tiamina, 300 \mug de biotina, y 50 g de CaCO_{3}
en 1 l de agua pura (ajustado a pH 8,0 con KOH), y se cultivaron a
31,5ºC. Después de completarse el cultivo, se midió la cantidad de
ácido L-glutámico acumulado y la concentración
bacteriana (DO) en el caldo de cultivo. El resultado se muestra en
la Figura 10. El resultado muestra que la cepa que expresa el gen
pfk mutante mostraba mayor producción de ácido
L-glutámico en comparación con la cepa que expresaba
el gen pfk de tipo silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento de ácido
L-glutámico se comparó añadiendo penicilina G a una
concentración final de 4 U/ml al medio descrito anteriormente para
detener el crecimiento celular para obtener una cantidad bacteriana
final equilibrada, en múltiples momentos de crecimiento cuando la
DO llega a estar dentro de un intervalo de 10 a 14 después del
inicio del cultivo. El resultado se muestra en la Figura 11. Los
resultados descritos anteriormente muestran que la reducción en la
actividad PFK en cepas con fosfocetolasa introducida es eficaz para
mejorar el rendimiento de fermentación de ácido
L-glutámico.
\newpage
Usando la cepa B. flavum AJ11576
(JP56-16479A), se evaluó el efecto de la
introducción de un gen de la fosfocetolasa sobre la mejora del
rendimiento de fermentación de L-glutamina.
La cepa AJ11576 es resistente a compuestos que
tienen actividad vitamina P. Esta cepa se depositó en el National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology,
International Patent Organism Depositary (Central
6,1-1, Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibarald-ken,
305-8566, Japón) el 6 de mayo de 1980 y recibió un
número de referencia de FERM P-05502. Después se
convirtió en un depósito internacional según las directrices del
Tratado de Budapest y recibió un número de referencia de FERM
BP-10381.
El pVK9 (plásmido de control) y
pVK9-PS2_xfp (plásmido para amplificar el gen xfp de
Bifidobacterium animalis, en el que el promotor nativo está
remplazado con un promotor PS2) se introdujeron cada uno en la cepa
de B. flavum descrita anteriormente AJ11576 para obtener
cepas que expresan fosfocetolasa. Específicamente, la cepa se
transformó con cada uno de los plásmidos por el procedimiento de
pulsos eléctricos, se sembró en un medio CM2G (5 g/l de glucosa, 10
g/l de polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl,
ajustado a pH 7,0 con KOH) que contenía 25 mg/ml de kanamicina y se
cultivó a 31,5ºC durante aproximadamente 30 horas. Las colonias que
salieron a flote se aislaron como transformantes y se denominaron
AJ11576 (pVK9) y AJ11576 (pVK9-PS2_xfp),
respectivamente.
Las células de las cepas AJ11576 (pVK9) y
AJ11576 (pVK9-PS2_xfp) obtenidas por cultivo en un
medio de placa CM2G se inocularon en el medio de cultivo en matraz
que contenía 100 g de glucosa, 2,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g de
MgSO_{4}, 60 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,01 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5,7 ml de una solución de hidrolizado
de soja, 2 mg de clorhidrato de tiamina, 4 \mug de biotina, 0,02
ml de GD-113 y 50 g de CaCO_{3} en 1 l de agua
pura (ajustado a pH 6,8 con NaOH) y se cultivaron a 31,5ºC con
agitación hasta que se consumió completamente el azúcar. Después de
completarse el cultivo, se midió la cantidad de
L-glutamina acumulada y la DO en el caldo de
cultivo. Los resultados se muestran en la Figura 12. Se ha
descubierto que todas las cepas con el gen xfp amplificado
mostraban elevada producción de L-glutamina en
comparación con la cepa de control.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EL USO DE FOSFOCETOLASA PARA
PRODUCIR METABOLITOS ÚTILES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C272-C5130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RU2004124226
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-08-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/644562
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-01-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus pentosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2367)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 788
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus pentosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus plantarum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2367)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 788
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus plantarum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2660
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (128)..(2605)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaagcttg tgaaaagcaa attaaggagt g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagaattct tattttaaac ccttccattg c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium animalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (320)..(2797)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium animalis
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium animalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (320)..(2797)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium animalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtctaga ttttcaacac gccgcgcaat atcc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtctaga gaattcgccc ttggcctttc atcggctaag c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaattcctgt gaattagctg attt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaccaata acaggattag tcatagaggc gaaggctcct tgaatagg
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtctaga gaattcgccc ttggcctttc atcg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctattcaag gagccttcgc ctctatgact aatcctgtta ttggtacc
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctattctaga aaattcctgt gaattagctg atttagtact tttc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaccaata acaggattag tcataattct gtttcctgtg tgaaattg
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggttctaga ggatccggag cttatcgact gcac
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatttcaca caggaaacag aattatgact aatcctgtta ttggtacc
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtgatga gtaatctgta gacatagagg cgaaggctcc ttgaatagg
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtctaga ttatttcaaa cctttccatt gcca
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctattcaag gagccttcgc ctctatgtct acagattact catcaccag
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatctgtcc cttgaggtga tttattccac acctcctgtt ggaatgtt
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaggtacaa cgcaacgatg cag
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
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<212> ADN
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<213> ADN artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacattccaa caggaggtgt ggaataaatc acctcaaggg acagataa
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatggtttgc tcgcaggtat tttg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacccggg cagagaagcc ttggaggtga tctg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtcccggg accatgattg cgttgtggtc gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaggcactc gtcctcggtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggctagtgc aggactataa agaccagttc tcctaaaaat aacgtgtc
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacacgttat ttttaggaga actggtcttt atagtcctgc actagcct
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> ADN artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatcgtgg ccaccgatcc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
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<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatcccc accggcgtac tcgtg
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacggatcc ttccaatgct attggttg
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2769
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2769)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> aceE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 922
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2014
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (464)..(1885)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sacB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 473
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
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<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill24
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatcttc aaaaggttag gaatacggt
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttttgaag atcgaccagt tgg
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacctggaat gctgttttcc cagggatcgc agtggtgagt aacc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgggaaaa cagcattcca ggtattag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcaggtcga ctctagagga tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3774
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3774)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sucA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pfk50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccgcaatt ttcgcagcct tagaacacct
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pfk51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgttgataa aagcccgaaa aactaattaa acccatcaca acacccgcg
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pfk52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcttctgca gaatctcaaa cgcacgctta cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pfk53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgggtgtt gtgatgggtt taattagttt ttcgggcttt tatcaacag
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pfk54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaaggatcc agggcaaggg gttctagaaa gaccaacgga
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pfk55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctggatcc tctcaaacgc acgcttaccg atctcttgta cgtg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1041
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1041)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pfk*1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 346
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1041
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1041)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pfk*2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 346
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1041
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1041)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pfk
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 346
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2412
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus plantarum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2412)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xpk
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus plantarum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus agalactiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2379)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xpk
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 792
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus agalactiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactococcus lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2469)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xpk
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactococcus lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus johnsonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2406)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xpk
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 801
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus johnsonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2400)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 799
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium longum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2478)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium longum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlorobium tepidum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2454)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 817
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlorobium tepidum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brucella suis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2370)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 789
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brucella suis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brucella abortus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2379)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 792
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brucella abortus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Methylococcus capsulatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2436)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 811
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Methylococcus capsulatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
Claims (10)
1. Un procedimiento para producir al menos un
metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido
L-glutámico, L-glutamina,
L-prolina, y L-leucina que comprende
cultivar una bacteria que tiene de forma inherente actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa en un medio de cultivo, y recoger dicho metabolito
útil del medio de cultivo y/o la bacteria,
en el que dicha bacteria tiene una capacidad de
producir dicho metabolito útil, y
en el que la bacteria está modificada para
aumentar la actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa aumentando la cantidad de copias del gen respectivo, o
sustituyendo o modificando el promotor.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un procedimiento para producir al menos un
metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido
L-glutámico, L-glutamina,
L-prolina, y L-leucina que comprende
cultivar una bacteria que no tiene de forma inherente actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa en un medio de cultivo, y recoger dicho metabolito
útil del medio de cultivo y/o la bacteria,
en el que dicha bacteria tiene una capacidad de
producir dicho metabolito útil, y
en el que dicha bacteria está transformada con
un fragmento de ADN que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o la
fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que la bacteria tiene un gen mutado o
alterado que codifica la 6-fosfofructoquinasa con
actividad 6-fosfofructoquinasa reducida.
4. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la bacteria se
selecciona entre el grupo constituido por Enterobacteriaceae,
bacterias Coryneform, y bacterias Bacillus.
5. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la bacteria
pertenece al género Escherichia o Pantoea.
6. Una bacteria que tiene una capacidad de
producir al menos un metabolito útil seleccionado entre el grupo
constituido por ácido L-glutámico,
L-glutamina, L-prolina, y
L-leucina,
estando la bacteria modificada para tener una
actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa aumentada aumentando la cantidad de copias del gen
respectivo, o sustituyendo o modificando el promotor y tiene un gen
mutado o alterado que codifica la
6-fosfofructoquinasa que tiene una actividad
6-fosfofructoquinasa reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
7. La bacteria de acuerdo con la reivindicación
6, seleccionándose la bacteria entre el grupo constituido por
Enterobacteriaceae, bacterias Coryneform, y bacterias Bacillus.
8. La bacteria de acuerdo con la reivindicación
6, perteneciendo la bacteria al género Escherichia o Pantoea.
9. Una bacteria que tiene de forma inherente
actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa, teniendo dicha bacteria una capacidad de producir un
metabolito útil seleccionado entre el grupo constituido por ácido
L-glutámico, L-glutamina,
L-prolina, y L-leucina, y estando
dicha bacteria modificada para aumentar la actividad
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y/o fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa aumentando la cantidad de copias del gen respectivo o
sustituyendo o modificando el promotor.
10. Una bacteria que no tiene de forma inherente
actividades
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato
fosfocetolasa, estando dicha bacteria transformada con un fragmento
de ADN que codifica la
D-xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa, y teniendo dicha bacteria una capacidad de producir y
causar la acumulación en un medio de una cantidad no menor de 0,5
g/l de al menos un metabolito útil seleccionado entre el grupo
constituido por ácido L-glutámico,
L-glutamina, L-prolina, y
L-leucina.
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