JP5157180B2 - L−アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Description
ホスホトランスアセチラーゼ活性を増強させた菌による有用物質の発酵生産としては、poly-β-hydroxyalkanoate copolymerの生産(特許文献10,11参照)及びエタノールの生産(特許文献12参照)が知られている。また、ホスホトランスアセチラーゼを酵素として利用したL-含硫アミノ酸の製造法(特許文献13参照)が知られている。しかし、L-アミノ酸発酵生産菌の育種においてホスホトランスアセチラーゼの増強が有効であること、及びホスホトランスアセチラーゼ活性とL-アミノ酸生産性との関係については知られていない。
(1)L-アミノ酸生産能を有し、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されるように改変された微生物を培地で培養して、L-アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL-アミノ酸を採取する、L-アミノ酸の製造法。
(2)前記微生物が、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりホスホトランスアセチラーゼ活性が増強した微生物である、(1)の製造法。
(3)前記ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子が下記(a)又は(b)に示すDNAである(2)の製造法:
(a)配列番号34の塩基番号1214〜2641、もしくは配列番号40の塩基配列を含むDNA、または
(b)配列番号34の塩基番号1214〜2641、もしくは配列番号40の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスホトランスアセチラーゼ活性を示すタンパク質をコードするDNA。
(4)前記ホスホトランスアセチラーゼ活性がramB遺伝子を不活性化させることにより増強されたことを特徴とする(1)〜(3)のいずれかの製造法。
(5)前記微生物がさらにD-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性が増強するように改変された微生物である(1)〜(4)のいずれかの製造法。
(6)前記微生物がさらにピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように改変された微生物である(1)〜(5)のいずれかの製造法。
(7)前記微生物がさらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように改変された微生物である(1)〜(6)のいずれかの製造法。
(8)前記微生物がコリネ型細菌、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌またはエシェリヒア属細菌である、(1)〜(7)のいずれかの製造法。
(9)前記L-アミノ酸が、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニン、L-ロイシン、L-システインから選択されるL-アミノ酸である、(1)〜(8)のいずれかの製造法。
本発明の製造法に用いられる微生物(本発明の微生物ともいう)はL-アミノ酸生産能を有し、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されるように改変された微生物である。本発明の微生物は、L-アミノ酸生産能を有する微生物を親株とし、それをホスホトランスアセチラーゼ活性が増強するように改変することによって得ることができる。本発明の微生物は、本来的にL-アミノ酸生産能を有するものであってもよいし、変異法や組換えDNA技術などを利用した育種によりL-アミノ酸生産能を付与されたものであってもよい。
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869(コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869)
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
ck)。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。
agglomerans)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)又はパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、パントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株(FERM BP−6614)、AJ13356株(FERM BP−6615)、AJ13601株(FERM BP−7207)及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
L-アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、L-アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる(アミノ酸発酵、(株)学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77〜100頁参照)。ここで、L-アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、2種又は3種以上であってもよい。また、発現が増強されるL-アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、2種又は3種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
育種によってL−グルタミン酸生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、L−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。L−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどが挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株(国際公開95/34672号パンフレット)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172;フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP−4173;フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP−4174;フランス特許公報9401748号明細書参照)
パントエア・アナナティス AJ13601 (FERM BP-7207)
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410株(FERM BP-6617)
パントエア・アナナティス AJ13355 (FERM BP-6614)
が挙げられる。
つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
この変異は、配列番号33のアミノ酸番号419−533の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが、インサーションシーケンス(以下ISという)や、トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は、アミノ酸置換を伴うもの(ミスセンス変異)や、上記ISの挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの、ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。C末端側に転移因子が挿入されたyggB遺伝子の塩基配列を配列番号7、アミノ酸配列を配列番号8に示す。
また、C末端側変異として、配列番号33のアミノ酸番号419−533の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異も挙げられる。
(2)膜貫通領域の変異
yggB遺伝子がコードするYggBタンパク質は、5個の膜貫通領域を有していると推測されており、配列番号33の野生型のYggBタンパク質のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号1〜23(第1膜貫通領域)、25〜47(第2膜貫通領域)、62〜84(第3膜貫通領域)、86〜108(第4膜貫通領域)、110〜132(第5膜貫通領域)の領域に相当する。yggB遺伝子の変異は、この膜貫通領域をコードするDNA内に変異を有していることが望ましく、変異導入は1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入又は逆位を含む変異で、フレームシフト変異、ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。
膜貫通領域の変異の例としては、配列番号33に示されるアミノ酸配列において、14位のロイシン残基と15位のトリプトファン残基間に1又は数アミノ酸挿入する変異、100位のアラニン残基を他のアミノ酸残基へ置換する変異、111位のアラニン残基を他のアミノ酸残基へ置換する変異などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949 (FERM BP-2632:特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736;特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007;特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P- P-5020;特開昭56-1889号公報参照)ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318;特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM-P4319;特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472;特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136;特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004;特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426(FERM P-5123;特開平56-048890号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440(FERM P-5137;特開平56-048890号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796(FERM P-6402;特開平58-158192号
公報参照)
書)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492, 特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERMBP-10381, 特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ12212 (FERM P-8123, 特開昭61-202694)
などが挙げられる。
さらに、細菌にアミノ酸アナログ耐性を付与することによってL−バリン生産能を付与することもできる。そのような細菌の例としては、例えば、L-イソロイシン及びL-メチオニン要求性であり、D-リボース、プリンヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を示す変異株 (FERM P−1841, P−5556; 特開昭53−025034)やポリケチド耐性を示す変異株(FERM P-9325; 特許1934507号)が挙げられる。
(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)の酵素活性を上昇させることによってこれらの生産能を付与することができる。
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子(lysC)は、L−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。
、酵素活性を強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子(trpE)、及び/又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子(serA)を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子を腸内細菌科に属する微生物に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。このような細菌としてより具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するエシェリヒア・コリSV164に、脱感作型ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serAを持つプラスミドpGH5(国際公開第94/08031号パンフレット参照)を導入することによって得られる形質転換株が挙げられる。
aceオペロンの発現が強化された細菌は、aceオペロンを含むDNAを強力なプロモーターに連結し、これをプラスミドや相同組換えによって、細菌内に導入することや、トランスポゾンによって上記DNAを多コピー存在させることによって達成できる。
A増幅株(国際公開第03/044192号パンフレット)が挙げられる。
135 (2003))、rhtB遺伝子(欧州特許出願公開第0994190号明細書)、rhtC遺伝子(欧州特許出願公開第1013765号明細書)、yfiK、yeaS遺伝子(欧州特許出願公開第1016710号明細書)が挙げられる。また宿主にL−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32(Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)を参照のこと)にスレオニン生合成系遺伝子(スレオニンオペロン:thrABC)を挿入して得られたプラスミドpVIC40(国際公開第90/04636号パンフレット)を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼI−ホモセリンデヒドロゲナーゼIの、L−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。
上記のようなL-アミノ酸生産能が付与された微生物を、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強するように改変することによって、本発明の製造法に用いる微生物を得ることができる。ただし、ホスホトランスアセチラーゼ活性増強のために改変とL-アミノ酸生産能の付与はどちらを先に行ってもよい。
「ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強するように改変された」とは、親株、あるいは野生株に対して細胞当たりのホスホトランスアセチラーゼ分子の数が増加した場合や、ホスホトランスアセチラーゼ分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生株とは、コリネ型細菌の場合、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム(ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム)ATCC13869やATCC13032である。エシェリヒア・コリの野生株としては、具体的には、プロトタイプの野生株K12株由来のエシェリヒア・コリ W3110 (ATCC 27325)、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。またパントエア・アナナティスの野生株としては、具体的には、パントエア・アナナティスAJ13355株(FERM BP−6614)、AJ13356株(FERM BP−6615)が挙げられる。
ikmanns (1999)Microbiology. 145: 503-513に記載の方法で活性を測定することによって確認できる。
また、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されたことの確認は、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子のm-RNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。活性あるいは発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
argへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
同様にpta遺伝子は、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有する限り、N末端側、C末端側が延長したものあるいは削られているものでもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号35あるいは41のアミノ酸配列のN末端側50アミノ酸から5アミノ酸、C末端側50アミノ酸から5アミノ酸延長・削除したものでもよい。
場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。
染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、ptaをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。(特開平2-109985号、特開平7−107976号、Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)、Plasmid. 2000 Nov;44(3):285-91)。
145, 69〜73 (1994) )、pGEM−T(Promega corporation, Madison, WI, USA)、pCR2.1−TOPO(Shuman (1994). Journal of Biological Chemisty 269: 32678〜84; USP 5487993)、pCR(R)Blunt(Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534〜541 (1993))、pEM1(Schrumpf等,1991, Journal of Bacteriology 173: 4510〜4516)またはpBGS8(spratt等, 1986, Gene, 41:337〜342)等が挙げられる。pta遺伝子を含むプラスミドベクター
をコリネ型細菌中に接合または形質転換によって転移させる。接合法は、例えばSchaefer等(Applied and Environmental Microbiology 60, 756〜759 (1994))に記載されている。形質転換法は、例えばTheirbach等(Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356〜362 (1988))、DunicanおよびShivinan(Bio/Technology 7, 1067〜1070 (1989))およびTauch等(FEMS Microbiological Letters 123, 343〜347 (1994))に記載されている。
pta遺伝子の上流領域としては、例えば、配列番号34の塩基番号1〜1213の領域が挙げられる。pta遺伝子上流のプロモーター等の発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりpta遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、pta遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
また、発現量の上昇は、m-RNAの生存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。
ramB遺伝子により制御を受けないように改変されたかどうかは、酢酸非存在下(例えば炭素源がグルコースのみ)で、構成的に発現されているかどうかを検討することによって、確認することができる。(J Bacteriol. 2004 May;186(9):2798-809)
れている。C.glutamicumATCC13032のaccession No.NC_006958.1: 390784..392208として登録されている配列が利用できる。本遺伝子配列を配列番号42に、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列番号43に示す。またC.glutamicumATCC13869株のramB遺伝子を配列番号36に、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列番号37に示す。
ramB遺伝子は、配列番号36または42の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRamB結合配列に結合してホスホトランスアセチラーゼ遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。なお、「ストリンジェントな条件」については前述したとおりである。
バチルス・アミロリキュファシエンス:sacB GenBank Accession Number X52988
ザイモモナス・モビリス:sacB GenBank Accession Number L33402
バチルス・ステアロサーモフィラス:surB GenBank Accession Number U34874
ラクトバチルス・サンフランシセンシス:frfA GenBank Accession Number AJ508391
アセトバクター・キシリナス:lsxA GenBank Accession Number AB034152
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス:lsdA GenBank Accession Number L41732
ー)を挟んだ状態で染色体に挿入されている。
D-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性はいずれか一方を活性化してもよいし、両方を活性化してもよい。なお、本明細書ではD-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼとフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼをまとめてホスホケトラーゼと呼ぶことがある。
D-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、キシルロース−5−リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Goldberg, M.らの文献 (Methods Enzymol., 9,515-520 (1966) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936)に記載の方法によって測定することができる。
また、フルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、フルクトース6-リン酸をエリスロース-4-リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Racker, Eの文献 (Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936)に記載の方法によって測定することができる。
ホスホケトラーゼとの活性増強は、上述したホスホトランスアセチラーゼの活性増強と同様に、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子のコピー数の増加やホスホケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーターの改変などによって行うことができる。
ホスホケトラーゼ遺伝子は宿主が持っているものを増幅してもよいし、宿主がホスホケトラーゼ活性を持たない場合は、他の種の遺伝子を導入することにより、ホスホケトラーゼ活性を付与してもよい。
D-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼをコードする遺伝子は、該酵素活性を有する微生物の染色体DNAを鋳型にしてPCRなどの手段によって得ることができる。このような微生物としては、乳酸菌、メタノール資化性細菌、メタン資化性細菌、ストレプトコッカス属細菌、アセトバクター(Acetobacter)属細菌、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属細菌、ラクトバチルス(Lactobacillus)属細菌、チオバチルス(Thiobacillus)属細菌、メチロコッカス(Methylococcus)属細菌、ブチリビブリオ(Butyrivibrio)属細菌、フィブロバクター(Fibrobacter)属細菌などの細菌や、キャンディダ(Candida)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、ロドスポリディウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、クルイベロ
ミセス(Kluyveromyces)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ウィンゲア(Wingea) 属などに属する酵母などが挙げられる。
フルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼをコードする遺伝子は、該酵素活性を有する微生物の染色体DNAを鋳型にしてPCRなどの手段によって得ることができる。このような微生物としては、アセトバクター属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、クロロビウム(Chlorobium)属細菌、ブルセラ(Brucella)属細菌、メチロコッカス属細菌、ガードネレラ( Gardnerella)属細菌などの細菌や、キャンディダ属、ロドトルラ属、サッカロミセス属などに属する酵母などが挙げられる。
また、Lactobacillus plantarum のxpk1遺伝子を使用することもできる。この塩基配列はEMBL/GenBank データベースにアクセス番号NC_004567 Region: complement (2362936..2365302) (Kleerebezem, M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 1990-1995 (2003)) で登録されている(配列番号54)。xpk1遺伝子のホモログには、配列番号54の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつD-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。
その他にも、これらの遺伝子のホモログとして、GenBank Accession No. NC_004567 Complement (3169067-3171478)の Lactobacillus plantarum の遺伝子、GenBank Accession
No. NP_736274のアミノ酸配列をコードするStreptococcus agalactiae の遺伝子、GenBank Accession No. NP_267658のアミノ酸配列をコードするLactococcus lactis subsp. Lactisの遺伝子、GenBank Accession No. のNC_005362 696462..698867のLactobacillus johnsonii の遺伝子、GenBank Accession No. YP_193510のアミノ酸配列をコードするLactobacillus acidophilus の遺伝子などが挙げられる。
xfp遺伝子のホモログ遺伝子として、GenBank Accession No. NP_696135のアミノ酸配列をコードするBifidobacterium longum の遺伝子、GenBank Accession No. NP_662409のアミノ酸配列をコードするChlorobium tepidum の遺伝子、GenBank Accession No. NP_699578のアミノ酸配列をコードするBrucella suis の遺伝子、GenBank Accession No. YP_223570のアミノ酸配列をコードするBrucella abortus の遺伝子などを用いることもできる。xfp遺伝子のホモログには、配列番号56の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつD-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼ及びフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼの両方の活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。
その他のD-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼ遺伝子及びフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ遺伝子の例としては、WO2006/016705に開示されているものが挙げられる。
また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼはアスパラギン酸にフィードバック阻害を受けることがあるので、アスパラギン酸にフィードバック阻害を受けないように改変することが好ましい。(欧州特許0723011号)
上記のようにして得られるコリネ型細菌などの微生物を培地に培養し、培地中にL-アミノ酸を生成蓄積せしめ、L-アミノ酸を該培地から採取することにより、L-アミノ酸を製造することが出来る。
。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
pta遺伝子増幅の親株として、sucA破壊、yggB変異導入株を用いた。sucA破壊、yggB変異株は以下の方法で構築できる。
(1−1) sucA破壊株の構築
ATCC13869のsucA欠損株(ATCC13869ΔsucA)は以下のようにして構築した。
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1oサブユニットをコードするsucA遺伝子の破壊は、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子を搭載したプラスミドpBS3を用いて行った。sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築は、国際公開2005/113745 号パンフレット及び2005/113744号パンフレットに記載のpBS3を用いた。
C.glutamicum ATCC13869株由来のsucAのORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 (GenBank Database Accession No.NC_003450)の該遺伝子の塩基配列(配列番号30)を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたオーバーラップPCR 法で取得した。具体的にはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号1、2の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い、sucA遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、sucA遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号3、4の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行った。配列番号2と3は互いに相補的であり、sucAのORFの全配列を欠損させた構造となっている。
次に内部配列を欠失したsucA遺伝子断片を得るために、上記sucA N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号5と6の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い変異導入されたsucA遺伝子増幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後BamHIで消化し、上述のpBS3 のBamHI部位に挿入する。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLBプレート培地に塗布し、一晩培養し、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたプラスミドをpBS3ΔsucAと命名した。
スミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体として出現した。C.glutamicumATCC13869株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS3ΔsucAを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地(グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、biotin 10 μg/L、寒天15g/L、 NaOHでpH7.5に調整)に塗布し、31.5℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのsucA遺伝子断片とATCC13869株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびsacB遺伝子が挿入されている株である。
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地(CM-Dexプレート培地の成分から寒天を除いて作成)にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10プレート培地(ショ糖 100g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・4H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、寒天15g/L、 KOHでpH7.5に調整)に塗布にし、31.5℃にて約30時間培養する。その結果、2回目の相同組み換えによりsacB遺伝子が脱落しシュークロース非感受性となったと推定される株を得ることができる。
この様にして得られた株の中には、そのsucA遺伝子がpBS3ΔsucAに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。sucA遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10プレート培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、sucA遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。sucA遺伝子をPCR増幅するためのプライマー(配列番号5および配列番号6)を用いて分析した際、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型にしたものよりもPCR産物の大きさが小さいものをsucA欠損株として以降の実験
に使用した。
ATCC13869ΔsucA株に変異型yggB遺伝子を導入した。導入された変異は、yggB遺伝子のC末端側の領域にIS(Insertion sequence)が挿入されている。(図1)。変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号7に、アミノ酸配列を配列番号8に記した。本変異が導入された株をATCC13869ΔsucAyggB::ISとした。
yggBのC末端側にISが挿入された株は、以下のようにして3断片に分けてPCRを行うことで構築することもできる。
まず、配列番号44と配列番号45のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行いyggBの上流側断片を取得する。一方で、配列番号46と配列番号47をプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、IS断片を取得する。配列番号45と配列番号46は互いに相補的な領域を含む。次に、これらのPCR産物をほぼ等モルとなるように混合したものを鋳型とし、配列番号44と配列番号47をプライマーとしてISの上流にyggB断片が付加された断片を調製する。
一方で、配列番号48と配列番号49をプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行いyggBの下流側断片を取得する。なお、配列番号47と配列番号48は互いに相補的である。これと、先に調製したISの上流にyggB断片が付加された断片をほぼ等モルとなるように混合し、配列番号50と配列番号51のDNAをプライマーとして、P
CRを行いyggBにISが挿入された断片を取得できる。得られた断片をSacIで処理し、pBS4S(国際公開2005/113745号パンフレット及び2005/113744号パンフレット)のSacI部位に導入し、染色体上のyggBをyggB::ISに置換するためのプラスミドを構築する。なお、ATCC13869株には類似のISが複数存在するため、配列番号7と完全に一致するIS挿入遺伝子を取得するためには、構築したプラスミドの配列を確認し同一配列を有するクローンであることを確認する必要があるが、ISに由来する領域の多少の塩基の相違は、ISが挿入されたyggBの機能発現において大きな影響を及ぼさない。こうして得られたプラスミドを用いて定法に従って染色体上のyggBを置換することにより染色体上のyggBにISが挿入された株を構築することができる。
ホスホトランスアセチラーゼ(pta)遺伝子の発現を増強した株を構築するため、C.glutamicum ATCC13869株よりホスホトランスアセチラーゼ(pta)遺伝子をPCRで増幅しpVC7シャトルベクターへクローニングした。pVC7は、ATCC13869株のクリプティックプラスミドpAM330(GenBank Database Accession No. D00038)をHindIIIで切り出し平滑末端化した断片をpHSG399(タカラバイオ)のBsaAI部位に挿入したシャトルベクターである。(米国特許出願公開20030134397号)既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032(GenBank Database Accession No.NC_003450 配列番号40)のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNA(配列番号9、配列番号10 )をプライマーとして常法によりPCRを行い、プロモーター領域を含むホスホトランスアセチラーゼ遺伝子全長を有する遺伝子断片を取得した。生成したPCR産物を常法により精製後BamH I及びKpn Iで消化し、pVC7のBamH I及びKpn I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびCm 25μg/mlを含むLBプレート培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVC7-ptaと命名した。
ATCC13869ΔsucAyggB::IS株をpVK9で形質転換した株を取得した。形質転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得た。上記プラスミドを導入した株をATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)と命名した。
pVK9は、pHSG299(タカラバイオ)のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。(米国特許出願公開20050196846号)
次に、ATCC13869ΔsucAyggB::IS (pVK9)株にpVC7(コントロール用プラスミド)、及びpVC7-pta(PTA増幅用プラスミド)を形質転換した株を取得した。形質転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/ml及びクロラムフェニコール5μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得た。それぞれ上記プラスミドを導入した株をATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9, pVC7)及びATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9, pVC7-pta)と命名した。
ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9, pVC7)及びATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9, pVC7-pta)株のPTA酵素活性を測定するために、粗酵素液を以下に示す方法で調整した。まず、各菌株をCM-Dex液体培地において31.5℃にて培養した。タイテックMimi photo 518R デジタル比色計で測定したOD660が0.6-0.9の時点で培養を止め集菌した。これ以後の操作は4℃で行った。50 mM Tris/HCl (pH 7.0)溶液で2回洗浄後、緩衝液(50 mM Tris/HCl (pH 7.0), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM, 1 mM DTT, 30%(w/v)グリセロール)に4g/ml (wet weight)になるよう溶解した。超音波破砕機(Bioruptor)により細胞を破砕し、遠心分離(15,000g, 60 min)後の上清を粗酵素液とした。粗酵素液のたんぱく質量を定量するため
の手順を以下に示す。粗酵素液及び検量線作成のための濃度既知のBSAをそれぞれCBB溶液(ナカライテスク プロテインアッセイCBB溶液)と反応し発色後、酵素活性測定装置(Molecular Divices, spectra max 190)でOD595 nm を測定することにより、タンパク質濃度の定量をおこなった。
次に、従来の方法(D. J. Reinscheid, S. Schnicke, D. Rittmann, U. Zahnow, H. Sahm and B. J. Eikmanns (1999) Microbiology. 145: 503-513)を参考にPTA酵素活性を測定した。具体的な手順を以下に示す。酵素反応は25度で100 mM Tris/HCl (pH 7.6), 5 mM MgCl2, 0.5mM L-cystein hydrochloride, 20 mM NH4Cl2, 1 mM CoA, 20 mM acetyl phosphateに粗酵素液を加えることで反応を開始させた。酵素活性測定装置(Molecular Divices, spectra max 190)でOD232nm を測定することにより、acetyl-CoAの生成を検出することでPTA酵素活性を測定した。
C.glutamicum ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9, pVC7)及びATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9, pVC7-pta)株を用い、PTA増強によるL−グルタミン酸発酵収率向上の効果を上述のsucA欠損株評価と同様の方法で培養評価した。結果を以下の表に示す。L−グルタミン酸収率は、対照株と比べてPTA増強株が高いことが明らかになった。
つぎに、ホスホトランスアセチラーゼとホスホケトラーゼの組み合わせによる、L-グルタミン酸発酵への効果について検討することにした。
ホスホケトラーゼの発現プラスミドは以下のように構築した。
Bifidobacterium animalisよりホスホケトラーゼ遺伝子(配列情報は既に公開されている:AY518213:gi:41056820)をPCRで増幅し実施例1で使用したpVK9シャトルベクターへクローニングするために、ゲノムをWizard Genomic Purification Kit(Promega Corporation)を使用し抽出した。B. animalisのゲノムDNAを鋳型に配列番号11、12の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い、プロモーター領域を含むホスホケトラーゼ遺伝子全長を有する遺伝子断片を取得した。生成したPCR産物を常法により精製後Xba Iで消化し、pVK9のXba I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコン
ピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLBプレート培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVK9-xfpと命名した。
B. animalisホスホケトラーゼ遺伝子のプロモーター領域をPS2プロモーターに置換したDNA断片をオーバーラップPCR法(R. M. Horton, H. D. Hunt, S. N. Ho, J. K. Pullen and L. R. Pease (1989) Gene 77: 61-68)により取得した。具体的には、pPSTG1(Y. Kikuchi, M. Date, K. Yokoyama, Y. Umezawa and H. Matsui (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 358-366)を鋳型に配列番号13、14の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いPS2プロモーターの増幅産物を得た。一方、pVK9-xfpを鋳型に配列表配列番号15、16の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い、B. animalisホスホケトラーゼ遺伝子の増幅産物を得た。配列番号14と16は互いに相補的である。次にPS2プロモーターとB. animalisホスホケトラーゼ遺伝子を結合した断片を得るために、上記PS2プロモーターおよびB. animalisホスホケトラーゼ遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型に配列番号12、17の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い目的遺伝子増幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後Xba Iで消化し、pVK9のXba I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLBプレート培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVK9-PS2_xfpと命名した。
上述の方法に従い、C.glutamicum ATCC13869ΔsucAyggB::IS株にpVK9_PS2_xfpを形質転換した株を取得し、ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp)と命名した。次に、ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp)株にpVC7(コントロール用プラスミド)、及びpVC7-pta(PTA増幅用プラスミド)を形質転換した株を取得しそれぞれ、ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp, pVC7)及びATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp, pVC7-pta)と命名した。
C.glutamicum ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9, pVC7)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9, pVC7-pta)ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp, pVC7)及びATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp, pVC7-pta)株を用い、PTA増強とホスホケトラーゼ増強の組み合わせによるL−グルタミン酸発酵収率向上の効果を実施例1(1−1)の方法で培養評価した。結果を以下の表3に示す。L−グルタミン酸収率は、PTAまたはホスホケトラーゼを単独で増強した株双方に比べ、PTA及びホスホケトラーゼを同時に増強した株が高いことが明らかになった。
PTA遺伝子の発現は転写因子RamBにより負に制御されており、ramB遺伝子欠損株でPTA酵素活性が上昇することが知られている(Journal of Bacteriology May 2004 2798-2809)。そこで、ramB欠損株を構築し、グルタミン酸発酵収率向上効果に関し検討する。
ramB遺伝子欠損は、sacB搭載温度感受性プラスミドpBS5Tを用いて破壊した。(国際公開WO2005113745 号、WO2005113744 号)ramB遺伝子ATCC13869株由来のRamBのORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 (GenBank Database Accession No.NC_003450 配列番号36に塩基配列を、配列番号37にアミノ酸配列を示す)の該遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたオーバーラップPCR 法で取得する。具体的にはC.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号19、20の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いramB遺伝子N末端側の増幅産物を得る。一方、ramB遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ATCC13869株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番18、21の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行う。配列番号18、19は互いに相補的であり、RamBのORFの全配列を欠損させた構造となっている。次に内部配列を欠失したramB遺伝子断片を得るために、上記RamB N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号22、23の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い内部配列を欠失したramB遺伝子増幅産物を得る。生成したPCR産物を常法により精製後Xba Iで消化し、上述のpBS5TのXbaI部位に挿入する。 このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS5T-ramBと命名する。
まず、ATCC13869ΔsucAyggB::IS株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS5T-ramBを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、25℃で約60時間培養する。得られた形質転換体をCM-Dex液体培地で34℃で1晩振とう培養し、適当に希釈した後、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、34℃で約30時間培養する。この培地上に生育した株は該プラスミドのramB遺伝子断片とATCC13869ΔsucAyggB::IS株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている株である。
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10培地(ショ糖 100g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・4H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、酢酸ナトリウム2g/l pH7.5(KOH))に塗布にし、34℃にて約30時間培養する。その結果、2回目の相同組み換えによりsacB遺伝子が脱落しシュークロース非感受性となったと考えられる株を得ることができる。
この様にして得られた株の中には、そのramB遺伝子がpBS5T-ramBに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ramB遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応にておこなう。変異型ramB遺伝子のみを有する株を選抜しATCC13869ΔsucAyggB::IS ΔramBと命名する。
ATCC13869ΔsucAyggB::IS ΔramBにpVK9(コントロール用プラスミド)、及びpVK9_PS2_xfp(ホスホケトラーゼ(PKT)増幅用プラスミド)を形質転換した株を取得する。形質
転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得る。それぞれ上記プラスミドを導入した株をATCC13869ΔsucAyggB::IS ΔramB(pVK9)及びATCC13869ΔsucAyggB::IS ΔramB(pVK9_PS2_xfp)と命名する。実施例1で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)株及び実施例1で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp)株とあわせて実施例1(1−1)の方法で培養評価する。ramB欠損株におけるL-グルタミン酸発酵収率向上の効果及びramB欠損とPKT増強の組み合わせによるL-グルタミン酸発酵収率向上効果について確認することができる。
PTA活性の増強はPTAのプロモーターを改変することによっても達成できる。PTA遺伝子のプロモーターにはRamBが結合しPTAの酵素活性に影響すると考えられる領域が2箇所存在していることが知られている(J Bacteriol. 2004 May;186(9):2798-809.)。そこで、PTAプロモーターのRamB結合領域をそれぞれ改変した株及び同時に改変した株を構築し、グルタミン酸発酵収率向上効果に関し検討する。
ATCC13869株由来のPTAのプロモーター領域を含むORF遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 (GenBank Database Accession No.NC_003450)の該遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたPCR 法で取得する。ここでptaのプロモーター領域は、具体的にはC.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号24、25の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いPTA遺伝子のプロモーター領域を含む増幅産物を得る。生成したPCR産物を常法により精製後Xba Iで消化し、pUC19(宝バイオ社製)のXbaI部位に挿入する。 このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびAmp 50μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpUC19-PTAと命名する。
次に、Site-Directed Mutagenesis Kits(STARATAGNE社製)を使用しPTAプロモーター領域に変異を導入する。pUC19-PTAを鋳型として、配列番号26、27の合成DNAを用い、kitに付属のマニュアルに従いRamB結合領域の一箇所に変異を導入したプラスミドを作成する。目的のプラスミドをpUC19-m1PTAと命名する。
次に、pUC19-m1PTAを鋳型として、配列番号24、25の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いPTA遺伝子の変異導入プロモーター領域を含む増幅産物を得る。生成したPCR産物を常法により精製後、上述のpBS5TのSmaI部位に挿入する。 このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の変異及びその他の配列にエラーが挿入されていないことを確認できたものをpBS5T-m1PTAと命名する。
同様に、もう一方のRamB結合領域に変異を導入したプラスミドを配列番号28、29の合成DNAを用い作成後、目的配列をpBS5Tへ再度クローニングする。目的のプラスミドをpBS5T-m2PTAと命名する。さらに、2箇所のRamB結合領域に同時に変異を導入したプラスミドも同様の手順で作成し、pBS5T-m1m2PTAと命名する。
実施例4の方法に従い、ATCC13869ΔsucAyggB::IS株より、PTAプロモーターを改変した株を取得する。変異型の確認は当該領域の配列をシークエンスすることにより確認する。
PTAプロモーターのRamB結合領域を改変した株を、それぞれATCC13869 ΔsucAyggB::IS m1、ATCC13869 ΔsucA yggB::IS m2、ATCC13869 ΔsucA yggB::IS m1m2と命名する。
ATCC13869 ΔsucA yggB::IS m1、ATCC13869 ΔsucA yggB::IS m2、ATCC13869 ΔsucAyggB::IS m1m2それぞれににpVK9(コントロール用プラスミド)、及びpVK9_PS2_xfp(PKT増幅用プラスミド)を形質転換した株を取得する。形質転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得る。それぞれ上記プラスミドを導入した株をATCC13869ΔsucAyggB::IS m1(pVK9)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1(pVK9_PS2_xfp)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2(pVK9)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2(pVK9_PS2_xfp)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1m2(pVK9)及びATCC13869ΔsucA m1m2(pVK9_PS2_xfp)と命名する。実施例1で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)株及び実施例1で構築したATCC13869ΔsucA(pVK9_PS2_xfp)株とあわせて実施例1(1−1)の方法で培養評価する。PTAプロモーター改変株におけるL-グルタミン酸発酵収率向上の効果及びPTAプロモーター改変とPKT増強の組み合わせによるL-グルタミン酸発酵収率向上効果について確認することができる。
PTA活性の増強はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(以下PPCともいう)またはピルビン酸カルボキシラーゼ(以下PCともいう)の増強と組合わせてもよい。そこで、PTAとPPCまたはPCをプラスミドで発現増強した株を構築し、グルタミン酸発酵収率向上効果を検討する。
PPCをコリネ型細菌内で高発現するプラスミドは以下のようにして構築した。まず配列番号58と配列番号59に示す合成DNAをプライマーとして、C. glutamicum ATCC14067株の染色体DNAを鋳型としてPCR反応を行い、PPC遺伝子断片を得た。得られた増幅断片を平滑末端化し、pHSG399(タカラバイオ)のSmaI部位に挿入し、得られたプラスミドをpPCFとした。次に、PPC遺伝子コード領域の上流を欠失させるために、pPCFをDraIとSalIで処理し、pHSG398(タカラバイオ)のSmaI部位に挿入し、lacZ'に対して逆向きにPPC遺伝子断片が挿入されたプラスミドをpPCFdsとした。PPC遺伝子の上流にアスパルトキナーゼ遺伝子のプロモーターを連結するために、p399AKYB(特開平6−62866参照)をPstIとApaLIで処理して平滑末端化することで、アスパルトキナーゼ遺伝子プロモーターとコリネ型細菌内で自立複製可能な領域を含むDNA断片を調製し、これをpPCFdsのSalI部位を平滑末端化した部位に挿入した。得られたプラスミドのうちアスパルトキナーゼ遺伝子のプロモーターとPPC遺伝子が順向きになっているものをpAKPFdsとした。pAKPFdsが含むコリネ型細菌内で自律複製可能な領域はpVK9_PS2_xfpと同様にpHM1519由来であることから、pVK9_PS2_xfpと共存できない。そこで、配列番号60と配列番号61に示す合成DNAをプライマーとして、pAKPFdsを鋳型としてPCRを行い、得られたPPC遺伝子断片をKpnIで処理し、pAM330由来の自律複製領域を含むpVC7(特開2000−201692参照)のKpnI部位に挿入した。得られたプラスミドをpVC-PPCと命名した。
実施例2で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)株、実施例3で構築したATCC13869ΔsucA(pVK9_PS2_xfp)株および実施例5で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS m1(pVK9)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1(pVK9_PS2_xfp)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2(pVK9)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2(pVK9_PS2_xfp)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1m2(pVK9)及びATCC13869ΔsucA m1m2(pVK9_PS2_xfp)をpVC7またはpVC-PPCまたはPC遺伝子の発現プラスミドpBPYC6(特開2000−201692参照)で形質転換する。得られた形質転換体を、実施例1(1−1)の方法で培養評価する。PTAプロモーター改変とPC増強
またはPPC増強の組み合わせによるL-グルタミン酸発酵収率向上効果、およびPTAプロモーター改変とPKT増強とPC増強またはPPC増強の組み合わせによるL-グルタミン酸発酵収率向上効果について確認することができる。
Claims (7)
- L-アミノ酸生産能を有し、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されるように改変された微生物を培地で培養して、L-アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL-アミノ酸を採取する、発酵法によるL-アミノ酸の製造法であって、
前記微生物がコリネバクテリウム属細菌またはブレビバクテリウム属細菌であり、
前記L-アミノ酸が、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニンから選択されるL-アミノ酸である、方法。 - 前記微生物が、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりホスホトランスアセチラーゼ活性が増強した微生物である、請求項1に記載の製造法。
- 前記ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子が下記(a)又は(b)に示すDNAである請求項2に記載の製造法:
(a)配列番号34の塩基番号1214〜2641、もしくは配列番号40の塩基配列を含むDNA、または
(b)配列番号34の塩基番号1214〜2641、もしくは配列番号40の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスホトランスアセチラーゼ活性を示すタンパク質をコードするDNA。 - 前記ホスホトランスアセチラーゼ活性がramB遺伝子を不活性化させることにより増強されたことを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造法。
- 前記微生物がさらにD-キシロース5−リン酸−ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性が増強するように改変された微生物である請求項1〜4の
いずれか一項に記載の製造法。 - 前記微生物がさらにピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように改変された微生物である請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造法。
- 前記微生物がさらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように
改変された微生物である請求項1〜6のいずれか一項に記載の製造法。
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