KR100892577B1 - 유용한 대사산물을 생산하기 위한 포스포케톨라제의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아세틸 조효소 A에서 유래되는 유용한 대사산물, 예컨대 L-글루탐산, L-글루타민, L-프롤린, L-아르기닌, L-류신, L-시스테인, 숙시네이트 및 폴리하이드록시부티레이트 등의 생산능이 있고, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 증강되도록 변형된 세균을 제공한다. 또한, 본 발명은 이 세균을 이용하여 유용한 대사산물을 생산하는 방법도 제공한다.

아세틸 조효소 A, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제, 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제, 대사산물

Description

유용한 대사산물을 생산하기 위한 포스포케톨라제의 용도{The use of phosphoketolase for producing useful metabolites}

본 발명은 유용한 대사산물, 구체적으로 아세틸 조효소 A(아세틸-CoA)에서 유래되는 대사산물의 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 생산방법에 유용한 신규 세균에 관한 것이다.

통상, L-아미노산과 같은 유용한 대사산물, 이의 중간체 및 세균 대사의 다른 화학물질은 천연에서 분리한 세균 균주 또는 이의 돌연변이주를 생산성이 증가되도록 변형시키는 방법에 의해 생산된다.

당은 발효에 적합한 미생물의 주요 탄소원이다. 엠브덴-메이어호프(Embden-Meyerhof) 경로와 펜토스 포스페이트(펜토스-P) 경로는 미생물의 중간 당 대사 중의 2가지 예비 경로이다. 또한, 제3 경로로서, 엔트너-도우도로프(Entner-Doudoroff) 경로는 카복실산 경로와 일부 관련이 있는 것으로서 공지되어 있다. 해당과정 동안, 글루코스는 L-아미노산, 퓨린 및 피리미딘, 비타민 등과 같은 많은 세포 화합물의 형성에 구성분으로서 사용되는 주요 중간체 화합물, 예컨대 포스포에놀피루베이트, 피루베이트 및 아세틸 조효소 A로 대사된다. 또한, 해당과정 동안에는 에너지(ATP 및 NADH)가 생성된다. 해당과정 후 형성된 피루베이트는 종종 pps 유전자에 의해 암호화된 포스포에놀피루베이트 신타제에 의해 포스포에놀피루베이트(PEP)로 다시 전환되거나, 또는 pdh 유전자 등에 의해 암호화된 피루베이트 데하이드로게나제에 의해 아세틸-CoA로 다시 전환된다. 전술한 화합물 중 하나인 아세틸-CoA는 피루베이트 데하이드로게나제에 의해 피루베이트로부터 형성되며, CO₂ 방출을 동반한다. 이러한 하나의 탄소 원자의 상실은 아세틸-CoA로부터 유래되는 유용한 화합물의 생산 수율을 감소시킨다.

비피덤(bifidum) 경로의 2가지 효소인 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제("포스포케톨라제"로도 알려져 있다) 및 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제는 이미 보고된 바 있다. D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제(EC4.1.2.9)는 자이룰로스-5-포스페이트를 글리세르알데하이드-3-포스페이트 및 아세틸포스페이트로 포스페이트 소비 전환을 촉매하고, 이와 동시에 물 1분자를 방출시킨다. 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제(EC4.1.2.22)는 프럭토스-6-포스페이트에서 에리트로스-4-포스페이트 및 아세틸포스페이트로의 포스페이트 소비 전환을 촉매하고, 이와 동시에 물 1분자를 방출시킨다. 이러한 두 효소는 CO₂를 통한 탄소 상실 없이 아세틸-CoA의 전구체인 아세틸포스페이트를 형성한다. D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제(EC4.1.2.9)는 아세토박터(Acetobacter) 속(Schramm, M. et al, J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)), 비피도박테리 움(Bifidobacterium) 속(Sgorbati, B. et al, Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1-2), 49- 57 (1976); Grill, J.P. et al Curr Microbiol., 31(1), 49-54 (1995)), 락토바실러스(Lactobacillus) 속(Posthuma, CC. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)), 티오바실러스(Thiobacillus) 속(Greenley, D.E. and Smith, D.W., Arch. Microbiol., 122, 257-261 (1979))에 속하는 세균에서, 및 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 피치아(Pichia), 야로위아(Yarrowia), 한세눌라(Hansenula), 크루베로마이세스(Kluyveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 트리코스포론(Trichosporon), 윈지아(Wingea) 속에 속하는 효모(Evans, CT. and Ratledge, C, Arch. Microbiol., 139, 48-52 (1984); Ratledge, C. and Holdsworth, J.E., Appl. Microbiol. Biotechnol., 22, 217-221 (1985))에서 보고되어 있다. 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제(EC 4.1.2.22)는 아세토박터 자일리넘(Acetobacter xylinum: Schramm, M. et al, J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)), 비피도박테리움 글로보섬(Bifidobacterium globosum) 및 비피도박테리움 덴티움(B. dentium)(Sgorbath, B.et al, Antonie Leeuwenhoek, 42, 49-57 (1976)), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)( Gavini, F. et al, Anaerobe, 2, 191-193 (1996))와 같은 세균에서, 및 로도토룰라 그라미니스(Rhodotorula graminis), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 칸디다 종(Candida sp.), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus)(Whitworth, D.A. and Ratledge, C, J. Gen. Microbiol., 102, 397-401 (1977))와 같은 효모에서 보고되어 있다. 상기 두 활성을 하나의 효소가 나타내는 일부 유기체도 보고되어 있다(예컨대, 문헌[Schramm, M. et al., (J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)); Sgorbati, B. et al., (Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57 (1976)); Meile, L. et al (J. Bacteriol., 183(9), 2929-36 (2001))] 참조).

2종 유래의 포스포케톨라제 유전자는 클로닝되고, 서열분석되어 있다. 그 하나는 비피도박테리움 락티스 유래의 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제/프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 xfp 유전자이고(Meile, L. et al, J. Bacteriol., 183(9), 2929-36 (2001)), 다른 하나는 락토바실러스 펜토수스 유래의 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 xpkA 유전자이다(Posthuma, CC. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)). 국립 생물공학 정보센터에 의해 제공된 미생물 게놈 데이타베이스 조사(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=&DB=genome)에 따르면, 추정상의 포스포케톨라제를 암호화하는 여러 유전자가 밝혀져 있다.

자일로스로부터 에탄올을 생산하는 효모의 능력을 개선시키는 방법으로서, 자일로스 리덕타제, 자일리톨 데하이드로게나제 및 추가로 포스포케톨라제에 대한 유전자를 도입시키는 방법이 공지되어 있다(WO200378643). 하지만, 이산화탄소 제거를 위해 포스포케톨라제 유전자를 사용하는 효과는 보고된 바 없다.

발명의 개요

본 발명은 대사산물 생산력이 있는 세균 균주를 이용하여 유용한 대사산물의 생산을 증강시키는 것뿐만 아니라, 상기 균주를 이용하여 대사산물을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 제1 목적은 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 증가하도록 변형된, 유용한 대사산물의 생산력이 있는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 제2 목적은 상기 유용한 대사산물이 아세틸 조효소A로부터 유래되는 것이 특징인, 유용한 대사산물의 생산력이 있는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 제3 목적은 상기 유용한 대사산물이 L-글루탐산, L-글루타민, L-프롤린, L-아르기닌, L-류신, L-시스테인, 숙시네이트 및 폴리하이드록시부티레이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인, 유용한 대사산물의 생산력이 있는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 제4 목적은 세균이 본래 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 없고, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA 단편으로 형질전환된, 유용한 대사산물의 생산력이 있는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 제5 목적은 유용한 대사산물이 아세틸 조효소 A에서 유래되는 것이 특징인, 유용한 대사산물의 생산력이 있는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 제6 목적은 상기 유용한 대사산물이 L-글루탐산, L-글루타민, L- 프롤린, L-아르기닌, L-류신, L-시스테인, 숙시네이트 및 폴리하이드록시부티레이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인, 유용한 대사산물의 생산력이 있는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 제7 목적은 상기 세균이 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae) 와, 코리네폼(Coryneform)균 및 바실러스(Bacillus) 세균으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인, 유용한 대사산물의 생산력이 있는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 제8 목적은 상기 세균이 에세리치아(Escherichia) 또는 판토에아(Pantoea) 속에 속하는 것이 특징인, 유용한 대사산물의 생산력이 있는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 제9 목적은 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계 및 이와 같이 배양된 배양 배지로부터 유용한 대사산물을 수거하는 단계를 포함하는, 유용한 대사산물의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제10 목적은 상기 유용한 대사산물이 아세틸 조효소 A에서 유래되는 것이 특징인, 유용한 대사산물의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제11 목적은 상기 유용한 대사산물이 L-글루탐산, L-글루타민, L-프롤린, L-아르기닌, L-류신, L-시스테인, 숙시네이트 및 폴리하이드록시부티레이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인, 유용한 대사산물의 생산방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적들은 유용한 대사산물, 구체적으로 아세틸-CoA 유래의 대사산물 중 하나를 생산하는 능력이 있는 세균에서 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성을 증강시켜, 탄소를 더욱 효율적으로 이용할 수 있게 하여 그 세균에 의한 유용한 대사산물의 생산을 증가시킴으로써 달성되었고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이하, 본 발명을 더 상세히 설명한다.

도 1은 엘. 펜토수스 및 엘. 플란타럼 유래의 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제를 정렬한 것이다(동일성 98.5%).

도 2는 플라스미드 pBS3의 작제 절차를 도시한 것이다.

도 3은 플라스미드 pBS4S의 작제 절차를 도시한 것이다.

도 4는 플라스미드 pBS5T의 작제 절차를 도시한 것이다.

도 5는 아세테이트를 함유하는 최소 배지에서 포스포케톨라제 유전자 증폭된 균주 및 대조군 균주의 증식 곡선을 도시한 것이다.

도 6은 최소 배지에서 포스포케톨라제 유전자 증폭된 균주 및 대조군 균주의 증식 곡선을 도시한 것이다.

도 7은 포스포케톨라제 단백질을 함유하는 세포 추출물의 전기영동 사진이다.

도 8은 비오틴이 충분한 조건 하에서 포스포케톨라제 유전자가 증폭된 균주에 의한 L-글루탐산의 생산을 도시한 것이다.

도 9는 페니실린 첨가 하에 포스포케톨라제 유전자 증폭된 균주에 의한 L-글 루탐산의 생산을 도시한 것이다.

도 10은 포스포케톨라제 유전자가 도입되고 6-포스포프럭토키나제 활성이 저하된 균주에 의한 L-글루탐산의 생산을 도시한 것이다.

도 11은 포스포케톨라제 유전자가 도입되고 6-포스포프럭토키나제 활성이 페니실린의 존재 하에서 저하된 균주에 의한 L-글루탐산의 생산을 도시한 것이다.

도 12는 포스포케톨라제 유전자 증폭된 균주에 의한 L-글루타민(Gln)의 생산을 도시한 것이다.

본 발명의 세균은 유용한 대사산물의 생산력이 있고, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 증가하도록 변형시킨 세균을 포함한다.

본 발명의 세균에는 본래 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 없는 세균은 물론, 본래 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 있는 세균이 모두 포함된다. 이러한 세균에 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 유전자를 도입시키면, 그 세균의 아세틸-CoA의 생산성이 증강되어, 유용한 대사산물의 생산 증강을 유도한다.

본 발명의 세균에서는, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성 중 어느 한 활성 또는 두 활성이 모두 증강될 수 있다.

본 발명에서, "포스포케톨라제"란 용어에는 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제가 포함된다.

본 발명에서, "D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제의 활성"이란 표현은 물 1분자의 방출을 수반하면서 자이룰로스-5-포스페이트를 글리세르알데하이드-3-포스페이트 및 아세틸포스페이트로 전환시키는 포스페이트 소비 전환 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 이 활성은 문헌[Goldberg, M.et al(Methods Enzymol., 9, 515-520(1966)) 또는 L.Meile(J.Bacteriol.(2001) 183; 2929-2936)]에 기술된 방법에 따라 측정할 수 있다.

본 발명에서, "프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성"이란 표현은 물 1분자의 방출을 수반하면서 프럭토스-6-포스페이트를 에리트로스-4-포스페이트 및 아세틸포스페이트로 전환시키는 포스페이트 소비 전환 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제 활성은 문헌[Racker, E. Methods Enzymol., 5, 276-280(1962) 또는 L.Meile, J.Bacteriol.(2001) 183; 2929-2936]에 기술된 방법에 따라 측정할 수 있다.

본래 포스포케톨라제 활성을 보유한 세균에서 포스포케톨라제의 활성은 야생형 또는 비변형 균주의 활성보다 높게, 바람직하게는 야생형 또는 비변형 균주의 1.5배 이상, 더욱 바람직하게는 2배 이상 및 가장 바람직하게는 3배 이상 증강될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따르면, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성을 본래 보유하지 않는 세균이 모균주로서 사용될 수 있다. 포스포케톨라제 활성을 본래 보유하지 않는 세균에서 포스포케톨라제의 활성은 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA 단편으로 세균을 형질전환하여 증강시킬 수 있다. 모세균이 포스포케톨라제 활성을 보유하는지의 여부는 전술한 바와 같은 방법으로 측정할 수 있다.

포스포케톨라제 활성이 도입되었는지의 여부는 피루베이트 데하이드로게나제(PDH) 결손 균주를 사용하여 확인할 수 있다. PDH 결손 균주는 아세테이트 영양요구성이다. 한편, 포스포케톨라제가 도입되면, PDH 결손 균주는 더 이상 아세테이트 영양요구성이 아닐 것이다. 따라서, 포스포케톨라제를 암호화하는 유전자의 도입은 아세테이트 영양요구성인 숙주 균주가 나타내는 보상에 기초하여 확인할 수 있다. PDH 결손 균주로서, 실시예에 기술된 바와 같은 △aceE 균주를 사용할 수 있다.

"D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제"는 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 있는 세균, 예컨대 젖산 세균, 메탄올 자화 세균, 메탄 자화 세균, 스트렙토코커스 세균 및 특히 아세토박터, 비피도박테리움, 락토바실러스, 티오바실러스, 스트렙토코커스, 메틸로코커스, 부티리비브리오, 피브로박터 속에 속하는 세균 및/또는 칸디다, 로도토룰라, 로도스포리디움, 피치아, 야로위아, 한세눌라, 클루이베로마이세스, 사카로마이세스, 트리코스포론, 윈지아 속 등에 속하는 효모에서 유래되는 효소일 수 있다.

"프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제"는 아세토박터, 비피도박테리움, 클로로븀, 브루셀라, 메틸로코커스, 가드너렐라 속에 속하는, 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 있는 세균 및/또는 로도토룰라, 칸디다, 사카로마이세스 등에 속하는 효모로부터 유래하는 효소일 수 있다.

또한, 상기 두 활성이 하나의 효소, 즉 D-자이룰로스-5-포스페이트/프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제에 의해 나타나는 것도 가능하다.

락토바실러스 펜토수스 MD363의 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 xpkA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 EMBL/GenBank 데이터베이스에 수탁번호 AJ309011로 등록되어 있으며(Posthuma, CC. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)), 서열번호 1로서 제시한다. 락토바실러스 플란타럼의 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 xpk1 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 EMBL/GenBank 데이터베이스에 승인 번호 NC_004567 Region:상보체(2362936..2365302)로서 등록되어 있고(Kleerebezem, M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 1990-1995 (2003)), 서열번호 3으로서 제시한다. xpk 및 xpk 상동성 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 표 1 및 서열목록에 제시한다. 서열번호 2 및 4의 아미노산 서열 정렬은 도 1에 제시한다.

비피도박테리움 락티스의 D-자이룰로스-5-포스페이트/프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 xfp 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 EMBL/GenBank 데이터베이스에 승인 번호 AJ293946으로서 등록되어 있고(Meile, L., et al., J.Bacteriol., 183(9), 2929-36(2001)), 서열번호 5로서 제시했으며, xfp 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 6으로서 제시했다. xfp 및 xfp 상동성 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 표 2와 서열목록에 제시했다.

xpkA, xpk1 및 xfp 유전자는 모두 공지된 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여 설계한 프라이머를 사용하여 PCR(폴리머라제 연쇄 반응; White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989) 참조)을 통해 수득할 수 있다. 포스포케톨라제의 모티프(motif)를 함유하는 유전자는 pfam과 모티프를 사용하여 수득할 수 있다(http://pfam.wustl.edu/, http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?pfam+XFP). 락토바실러스 유래의 xpk1 유전자는 서열번호 7 및 8에 제시한 프라이머를 사용하여 수득할 수 있다. 비피도박테리움 유래의 xfp 유전자는 서열번호 11 및 12에 제시한 프라이머를 사용하여 수득할 수 있다. 락토바실러스 유래의 xpkA 유전자는 서열번호 19 및 24에 제시한 프라이머를 사용하여 수득할 수 있다.

포스포케톨라제의 활성은 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA로 모균주를 형질전환하여 증강시킬 수 있다. 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA를 이용한 세균의 형질전환은 통상의 방법으로 전술한 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA를 이용하여 수행할 수 있다.

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA는 자연적 다양성에 따라 다른 세균 균주에서 찾아볼 수 있는 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제의 변이체를 암호화하는 DNA일 수 있다. 이러한 변이체를 암호화하는 DNA는 엄중 조건(stringent condition) 하에서 xpkA 유전자(예, 서열번호 1 또는 3), 또는 이 유전자의 일부와 하이브리드화하고, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 있는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리하여 수득할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "엄중 조건"이란 용어는 소위 특이적 하이브리드가 형성되고 비특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 포함한다. 예를 들어, 엄중 조건은 상동성이 높은 DNA, 예컨대 상동성이 서로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 DNA가 하이브리드화되는 조건을 포함할 수 있다. 또는, 엄중 조건은 예컨대, 서던 하이브리드화에서의 통상의 세척 조건, 예컨대 60℃, 1xSSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1xSSC, 0.1% SDS를 포함하는 조건이다. 세척 시간은 블롯팅에 사용된 막 종류에 따라 달라지며, 대체로 제조자의 권장에 따른다. 예를 들어, 엄중 조건 하에서 Hybond™ N+나일론 막(Amersham) 세척의 권장 시간은 15분이다. 변이 xpkA 유전자를 선별하기 위한 프로브로는 표 1에 게시된 뉴클레오타이드 서열의 부분 서열을 사용할 수 있다. 이러한 프로브는 표 1에 게시된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하고, 표 1에 게시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 제조할 수 있다. 길이가 약 300bp인 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 경우에, 하이브리드화 후의 세척은 다음과 같은 조건 하에서 수행할 수 있다: 50℃, 2xSSC 및 0.1% SDS, 적어도 2회.

프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA는 표 2에 게시된 뉴클레오타이드 서열을 프로브로서 사용하여 전술한 바와 유사한 절차에 따라 수득할 수 있다.

동의적 코돈의 약간의 분포 편향(bias)은 mRNA 분자의 집단에서 발견되는 61개 아미노산 코돈 중에서 존재하며, 동종 tRNA의 농도가 코돈 사용 빈도에 직접 비례하는 것으로 보인다는 점은 이미 공지되어 있다(예컨대, Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500(1995)). 이러한 관점으로부터, 과량의 희귀 tRNA 코돈을 함유하는 과잉 mRNA 종이 보유한 해독 문제를 쉽게 예측할 수 있다. 이러한 상황은 에세리치아 콜리 숙주 등에서 클로닝된 이종 유전자의 전사가 개시된 후 발생할 수도 있다. 최근 연구들은 AGG/AGA, CUA, AUA, CGA 또는 CCC 코돈의 클러스터가 합성 단백질의 함량과 품질을 모두 저하시킬 수 있음을 시사한다. 또한, 이러한 코돈 중 임의의 코돈의 과량은 심지어 클러스터가 아니어도 해독의 문제점을 일으킬 수 있다. 따라서, 당해 목적하는 단백질을 암호화하는 이종 DNA를 세균으로 이동시키는 경우에는, 이러한 해독 문제를 피하기 위해서 희귀 코돈을 더욱 빈번히 사용되는 코돈으로 대체하는 것이 바람직하다. 11,000가지 이상의 유기체에서 확인된 코돈 사용의 빈도는 "코돈 사용 데이터베이스"(http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000))에 제시되어 있다.

더욱이, 본 발명의 포스포케톨라제를 암호화하는 유전자는 야생형 유전자에 국한되지 않고, 표 1 및 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 변형을 보유한 돌연변이 유전자 또는 인공 변형된 유전자일 수 있다. 암호화된 단백질은 암호화된 포스포케톨라제 단백질의 기능이 유지되는 한, 표 1 및 2에 제시된 아미노산 서열 중의 하나 또는 그 이상의 위치에 있는 하나 또는 여러 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 본 명세서에 언급된 "여러" 아미노산 잔기의 수는 아미노산 잔기의 3차원 구조 또는 유형에서의 위치에 따라 다르기도 하지만, 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 더욱 바람직하게는 2 내지 5개 범위일 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 기능적으로 중성의 센스 돌연변이를 포함하며, 보존적 치환인 것이 바람직하다. 방향족 아미노산의 경우에, 보존적 치환에는 상호 대체가능한 phe, trp 및 tyr이 있다. 소수성 아미노산의 경우에, 보존적 치환에는 상호 대체가능한 leu, ile 및 val이 있다. 극성 아미노산의 경우에, 보존적 치환에는 상호 대체가능한 gln 및 asn이 있다. 염기성 아미노산의 경우에, 보존적 치환에는 상호 대체가능한 arg, lys 및 his이 있다. 산성 아미노산의 경우에, 보존적 치환에는 상호 대체가능한 asp 및 glu이 있다. 하이드록실 기 함유 아미노산의 경우에, 보존적 치환에는 상호 대체가능한 ser 및 thr이 있다. 또한, 보존적 치환에는 ala 대신 ser 또는 thr의 사용, arg 대신 gln, his 또는 lys의 사용, asn 대신 glu, gln, lys, his 또는 asp의 사용, asp 대신 asn, glu 또는 gln의 사용, cys 대신 ser 또는 ala의 사용, gly 대신 pro의 사용, his 대신 asn, lys, gln, arg 또는 tyr의 사용, ile 대신 leu, met, val 또는 phe의 사용, leu 대신 ile, met, val 또는 phe의 사용, lys 대신 asn, glu, gln, his 또는 arg의 사용, met 대신 ile, leu, val 또는 phe의 사용, phe 대신 trp, tyr, met, ile 또는 leu의 사용, ser 대신 thr 또는 ala의 사용, thr 대신 ser 또는 ala의 사용, trp 대신 phe 또는 tyr의 사용, tyr 대신 his, phe 또는 trp의 사용 및 val 대신 met, ile 또는 leu의 사용이 포함된다. 전술한 바와 같이, 하나 또는 여러 아미노산의 그러한 치환, 결실 또는 삽입을 유발하는 돌연변이에는 포스포케톨라제 유전자를 보유하는 미생물의 종간 차이 및 균주간 차이에서 나타나는 천연의 돌연변이가 있다(돌연변이체 또는 변이체). 치환되는 영역은 PKT의 보존 영역(모티프)를 MOTIF 및 Pfam으로 조사하여 선발할 수 있다.

이러한 유전자는 표 1 또는 2에 제시한 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜, 예컨대 부위 특이적 돌연변이유발법으로 변형시켜, 그 유전자에 의해 암호화된 단백질의 특정 부위에 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입이 도입되게 함으로써 수득할 수 있다.

더욱이, 상기 유전자는 이하에 기술하는 바와 같은 통상의 돌연변이유발 처리를 통해서도 수득할 수 있다. 돌연변이유발 처리의 예에는 표 1 또는 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 보유하거나, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 49 내지 948에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 보유한 유전자를 시험관내에서 하이드록실아민으로 처리하는 방법 및 싱기 유전자를 보유하는 에세리치아 세균과 같은 세균을 자외선 조사 처리하거나 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 EMS(에틸 메탄설포네이트)와 같은 전형적인 돌연변이 처리에 사용되는 돌연변이유발제로 처리하는 방법이 있다.

포스포케톨라제 유전자(이하, xpk 또는 xfp 유전자를 포함하는, pkt 유전자라 한다)의 발현 증강은 예컨대 유전자 재조합 기술을 이용하여 세포의 pkt 유전자의 카피수를 증가시켜 달성할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA는 숙주 세균에서 복제할 수 있는 벡터, 바람직하게는 다중카피 벡터에 pkt 유전자 함유 유전자 단편을 연결시킨 뒤, 수득되는 벡터를 숙주 세균에 도입시켜 제조할 수 있다.

비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자가 사용되는 경우에는, 예컨대, 비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여 설계한 프라이머(서열번호 9 또는 11), 예컨대 서열번호 13 또는 14의 뉴클레오타이드 서열을 보유한 각 프라이머를 사용하고, 주형으로서 비피도박테리움 아니말리스의 염색체 DNA를 사용하는 PCR 방법(폴리머라제 연쇄 반응, White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989) 참조)을 통해 수득할 수 있다. 또한, 다른 미생물 유래의 pkt 유전자도 사용할 수 있고, 그 pkt 유전자의 서열 또는 이의 상동성 서열을 기초로 하여 설계한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR, 또는 표 1 또는 2에 제시한 바와 같은 서열 정보를 기초로 하여 제조한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용한 하이브리드화에 의해 그 염색체 DNA 또는 염색체 DNA 라이브러리로부터 수득할 수도 있다. DNA 공여체(donor)로서 사용되는 염색체 DNA는 미생물로부터 예컨대, 사이토와 미우라(H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifukan, 1992)의 방법에 따라 제조할 수 있다.

그 다음, pkt 유전자는 숙주 세균에서 작동성(operable)인 DNA 벡터에 연결시켜 재조합 DNA를 제조한다. 바람직하게는 숙주 세균에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터를 사용하는 것이 좋다.

에세리치아 콜리에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG 및 pACYC는 Takara Bio에서 입수할 수 있다), RSFlOlO, pBR322, pMWl 18, pMW219(pMW는 Nippon Gene에서 입수할 수 있다) 등이 있다. 또한, 파지 벡터, 예컨대 11059, IBF101, M13mp9도 사용할 수 있다.

코리네형 세균에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 pAM330(EP 0077548B), pHM1519(EP 0078537), pGA1(EP 10977998) 및 pYM2(US6,905,819)가 있다.

더욱이, 에세리치아 콜리과 코리네형 세균에서 모두 자율적으로 복제할 수 있는 소위 셔틀(shuttle) 벡터, 예컨대 pVK9, pVK7(US2003-0175912), pSFK6(JP2000-262288A) 및 pHK4(JP5-007491A)도 사용할 수 있다.

pVK9는 pHK4(JP-A-5-007491) 유래의 복제성 오리진을 함유하는 BamHI-KpnI 단편을 절단하고 그 단편을 pHSG299(Takara-Bio 제품)의 AvaII 부위에 도입시켜 수득한 에세리치아 콜리-코리네폼 셔틀 벡터이다.

앞에서 언급한 임의의 벡터와 pkt 유전자를 연결시켜 재조합 DNA를 제조하기 위해, pkt 유전자를 함유하는 단편과 벡터의 연결은 보통 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 실시한다.

앞에서 기술한 바와 같이 제조합 재조합 DNA를 세균에 도입시키는 방법으로는, 지금까지 보고된 임의의 공지된 형질전환법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 에세리치아 콜리에서 보고되었던, DNA의 투과성 증가를 위해 염화칼슘으로 수용체 세포를 처리하는 방법(Mandel, M. and Higa, A., J.Mol.Biol., 53, 159(1970)), 및 바실러스 서브틸리스에서 보고되었던, DNA 도입을 위해 증식 세포로부터 제조한 컴피턴트(competent) 세포를 이용하는 방법(Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153(1977))이 사용될 수 있다. 이러한 방법외에도, 바실러스 서브틸리스, 액티노마이세테스 및 효모에 적용할 수 있는 것으로 보고된 원형질 또는 부분원형질 수용체 세포에 재조합 DNA를 도입시키는 방법을 이용할 수도 있다(Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). 또한, 코리네형 세균의 형질전환은 전기 펄스법을 이용하여 수행할 수도 있다(Sugimoto et al., JP2-207791A).

pkt 유전자는 세균의 염색체 DNA에 유전자의 단일 카피 또는 다중 카피를 통합시켜 도입시킬 수 있다. 더욱이, pkt 유전자의 카피수는 세균의 염색체 DNA에 상기 유전자의 다중 카피를 통합시켜 증가시킬 수도 있다. 세균의 염색체 DNA에 pkt 유전자의 단일 또는 다중 카피를 통합시키기 위해서는 염색체 DNA에 다중 카피로 존재하는 서열을 표적으로 하여 상동성 재조합을 수행할 수도 있다. 트랜스포존 말단의 반복성 DNA 및 역위성 반복체는 염색체 DNA에 다중 카피로 존재하는 서열로서 사용할 수 있다. 또는, JP2-109985A에 게시된 바와 같이, pkt 유전자를 트랜스포존에 병합시킨 뒤, 전이시켜 유전자가 염색체 DNA에 통합되도록 할 수도 있다. 게다가, 유전자 발현의 증강은 Mu 통합과 같은 전위에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 1회의 Mu 통합은 최고 3카피의 유전자를 세균 염색체로 도입시킨다. Mu, Tn10 및 Tn5와 같은 트랜스포존을 사용할 수 있다. pkt 유전자의 염색체 중으로의 통합은 pkt 유전자의 부분 서열을 보유한 프로브를 이용하여 서던 하이브리드화를 통해 확인할 수 있다.

또한, pkt 유전자의 발현 증강은 염색체 DNA 또는 플라스미드 상에 존재하는 pkt 유전자의 프로모터를 비롯한 발현 조절 서열을 WO00/18935에 기술된 바와 같은 더욱 강한 서열로 대체하거나, pkt 유전자의 발현을 증가시키는 조절 인자를 증폭시키거나, 또는 pkt 유전자의 발현을 감소시키는 조절 인자를 결실 또는 약화시켜 달성할 수도 있다. 더욱이, 프로모터가 더욱 강력해지도록 pkt 유전자의 프로모터 영역에 여러 뉴클레오타이드 치환을 도입시키는 방법도 가능하다. 프로모터의 효능을 평가하는 방법과 강력한 프로모터의 예는 문헌[Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128)]에 게시되어 있다. 또한, 리보솜 연결 부위(RBS)와 해독 개시 코돈 사이의 스페이서(spacer) 서열, 구체적으로 개시 코돈 바로 앞 상류의 몇몇 뉴클레오타이드는 해독 효율에 큰 영향을 미치는 바, 이 서열을 변형시킬 수도 있다. pkt 유전자의 발현 조절 서열은 프로모터 동정용 벡터 또는 GENETYX와 같은 유전자 분석 소프트웨어를 사용하여 동정할 수 있다.

이러한 강력한 프로모터의 예에는 lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, P_R 프로모터, 람다 파지의 p_L 프로모터, tet 프로모터, amyE 프로모터, spac 프로모터 등이 있다. 코리네박테리움의 강력한 프로모터의 예에는 PS2 프로모터(Appl Environ Microbiol. 2003 Jan;69(l):358-66; Mol Microbiol. 1993 Jul;9(l):97-109; WO93/03158), trc 프로모터, tac 프로모터, lacUV5 프로모터, araBAD 프로모터가 있다. 프로모터 강도는 RNA 합성 개시 작용의 빈도로서 정의되어진다. 프로모터 강도를 평가하는 방법은 예컨대 문헌[Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H., Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J., 5, 2987-2994(1986)]에 기술되어 있다.

pkt 유전자의 발현은 상기와 같은 프로모터의 치환이나 변형에 의해서도 증강된다. 발현 조절 서열의 치환은 예컨대 온도 민감성 플라스미드의 사용을 통해서도 달성될 수 있다. 코리네형 세균의 온도 민감성 플라스미드의 예에는 p48K 및 pSFKT2(JP2000-262288A), pHSC4(프랑스특허 공개번호 2667875, 1992 및 JP5-7491A 참조), pBS5T 등이 있다. 이러한 플라스미드는 적어도 25℃의 온도에서 자율적으로 복제할 수 있지만, 코리네형 세균에서 37℃의 온도에서는 자율적으로 복제할 수 없다. 발현 조절 서열의 변형은 pkt 유전자의 카피수 증가와 조합할 수 있다.

상동성 재조합 마커로서 코리네박테리움에 치명적인 레반슈크라제를 사용하는 방법도 적합하다. 레반슈크라제를 암호화하는 sacB 유전자는 벡터가 효과적으로 염색체로부터 결실되는 균주를 선발하는데 사용할 수 있다(Schafer, A. et al. Gene 145(1994) 69-73). sacB 유전자와 이하에 기술되는 sacB의 상동성 유전자를 사용할 수 있다:

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillus) : sacB GenBank 승인 번호 X02730 (서열번호 40)

바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliqufaciens) : sacB GenBank 승인 번호 X52988

자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) : sacB GenBank 승인 번호 L33402

바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) : surB GenBank 승인 번호 U34874

락토바실러스 샌프란시센시스(Lactobacillus sanfranciscensis) : firfA GenBank 승인 번호 AJ508391

아세토박터 자일리누스(Acetobacter xylinus) : lsxA GenBank 승인 번호 AB034152

글루콘아세토박터 디아조트로피커스(Gluconacetobacter diazotrophicus) : lsdA GenBank 승인 번호 L41732

플라스미드 DNA의 제조, DNA의 분해 및 연결, 형질전환, 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드의 선발 등은 당해기술분야의 숙련된 자(이하, 당업자라 한다)에게 공지된 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 방법은 예컨대 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기술되어 있다.

본 발명의 세균은 본래 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성을 보유하지 않는 세균뿐만 아니라 상기 단백질의 활성을 본래 보유하며 활성 증강을 위해 변형된 세균을 포함한다. 전자를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 세균의 구체적인 예에는 엔테로박테리아시에 과, 예컨대 에세리치아 속, 판토에아 속, 코리네형 세균, 예컨대 코리네박테리움 글루타미컴, 바실러스균, 예컨대 바실러스 서브틸리스 등에 속하는 세균이 있다. 하지만, 본 발명의 세균이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

엔테로박테리아시에 과에는 엔테로박터, 에르위니아, 에세리치아, 클렙시엘라, 판토에아, 프로비덴시아, 살모넬라, 세라티아, 시겔라, 모르가넬라 등의 속에 속하는 세균이 있다. 구체적으로, NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/ wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock)에서 사용된 분류학에 따라 엔테로박테리아시에로 분류되는 세균을 사용할 수 있다. 에세리치아 또는 판토테아 속에 속하는 세균이 바람직하다.

문헌[Neidhardt F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, 표 1)에 보고된 에세리치아 균, 예컨대 에세리치아 콜리가 활용될 수 있다. 에세리치아 콜리의 야생형 균주의 예에는 K12 균주와 이의 유도체, MG1655 균주(ATCC 47076) 및 W3110 균주(ATCC 27325)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 주소: 미국 버지니아 20108 마나사스 사서함 1549)에서 입수할 수 있다.

"판토에아 속에 속하는 세균"이란 용어는 이 세균이 미생물학 분야의 당업자에게 공지된 분류법에 따라 판토에아 속으로 분류된다는 것을 의미하며, 또한 최근 16S rRNA 등의 뉴클레오타이드 서열 분석을 기초로 하여 판토에아 애글로메란스(Pantoea agglomerans), 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 판토에아 스튜워티(Pantoea stewartii) 등으로 재분류된 엔테로박터 애글로메란스의 일부 종도 포함한다.

본 발명에 있어서, 코리네형 세균에는 미생물학 분야의 당업자에게 공지된 분류법에 따라 코리네형 세균으로 분류된 세균, 전에는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속으로 분류되었으나, 현재는 코리네박테리움 속으로 재분류된 세균(Int. J. Syst. BacterioL, 41, 255 (1991)), 및 코리네박테리움 속과 근연성이 있는 브레비박테리움 속에 속하는 세균이 포함된다. 이러한 코리네형 세균의 예에는 다음과 같은 것이 있다:

코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum)

코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum)

코리네박테리움 알카놀리티컴(Corynebacterium alkanolyticum)

코리네박테리움 칼루네(Corynebacterium callunae)

코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)

코리네박티리움 릴륨(Corynebacterium lilium)

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)

코리네박테리움 써모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes)

코리네박테리움 헤르큘리스(Corynebacterium herculis)

브레비박테리움 디바리카텀(Brevibacterium divaricatum)

브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum)

브레비박테리움 임마리오필럼(Brevibacterium immariophilum)

브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)

브레비박테리움 로슘(Brevibacterium roseum)

브레비박테리움 사카롤리티컴(Brevibacterium saccharolyticum)

브레비박테리움 티오제니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)

코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes)

브레비박테리움 알범(Brevibacterium album)

브레비박테리움 세리넘(Brevibacterium cerinum)

마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum).

구체적으로, 다음과 같은 균주가 포함된다:

코리네박테리움 아세토액시도필럼 ATCC 13870

코리네박티리움 아세토글루타미컴 ATCC 15806

코리네박테리움 알카놀리티컴 ATCC 21511

코리네박테리움 칼루네 ATCC 15991

코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13020, 13032, 13060

코리네박테리움 릴륨 ATCC 15990

코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965

코리네박테리움 써모아미노제네스 AJl2340(FERM BP-1539)

코리네박테리움 헤르큘리스 ATCC 13868

브레비박테리움 디바리카텀 ATCC 14020

브레비박테리움 플라범 ATCC 13826, ATCC 14067, AJl2418 (FERM BP-2205)

브레비박테리움 임마리오필럼 ATCC 14068

브레비박테리움 락토퍼멘텀(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC 13869

브레비박테리움 로슘 ATCC 13825

브레비박테리움 사카롤리티컴 ATCC 14066

브레비박테리움 티오제니탈리스 ATCC 19240

브레비박테리움 암모니아제네스 ATCC 6871, ATCC 6872

브레비박테리움 알범 ATCC 15111

브레비박테리움 세륨 ATCC 15112

마이크로박테리움 암모니아필럼 ATCC 15354

이러한 균주들은 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 주소: 미국 버지니아 20108 마나사스 사서함 1549)에서 입수할 수 있다. 각 균주는 등록번호가 있어서 그 등록번호를 통해 각 균주를 분양 신청할 수 있다. 각 균주의 등록번호는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 카탈로그에 게재되어 있다. AJ12340 균주는 부다페스트 조약에 의거하여 국제통상산업성 산업기술청 국립생명과학 인간공학 연구소(현재, 독립 행정청으로서, 일본 산업기술종합연구소, 국제 특허 미생물 기탁소; 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 초메 1-1 츠쿠바 센트럴 6, 우편번호: 305-5466)에 1987년 10월 27일에 수탁번호 FERM BP-1539로서 기탁되어 있다. AJ12418 균주는 부다페스트 조약에 의거하여 국제통상산업성 산업기술청 국립생명과학 인간공학 연구소에 수탁번호 FERM BP-2205로서 기탁되어 있다.

"바실러스균"이란 용어는 미생물학 분야의 당업자에게 공지된 분류법에 따라 바실러스 속으로 분류된 세균을 의미한다. 본 발명에서, 바실러스균에는 바실러스 서브틸리스 168 Marburg 균주(ATCC 6051), 바실러스 서브틸리스 PY79 균주(Plasmid, 1984, 12, 1-9) 등(이에 국한되지 않는다)이 있고, 바실러스 아밀로리쿼페이션스의 예에는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 T 균주(ATCC23842), 바실러스 아밀로리쿼페이션스 N 균주(ATCC 23845) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 세균은 이미 유용한 대사산물을 생산하는 능력이 있는 세균에 전술한 DNA(pkt 유전자)를 도입시켜 수득할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 세균은 pkt 유전자가 도입된 세균에 유용한 대사산물의 생산능을 부여하여 수득할 수도 있다. 후자의 경우에, pkt 유전자 도입 및 유용한 대사산물의 생산능 부여는 어떠한 순서로 수행하여도 된다.

"유용한 대사산물을 생산하는 능력이 있는 세균"이란 표현은 본 발명의 세균을 배지에서 배양할 때 그 배지에서 유용한 대사산물을 생산하고 축적을 유발하는 능력이 있는 세균을 의미한다. 대사산물을 생산하는 능력은 돌연변이유발 처리 및 유전자 변형을 비롯한 개량(breeding)을 통해 부여되거나 증강될 수 있다. "유용한 대사산물을 생산하는 능력이 있는 세균"이란 표현은 야생형 또는 미변형 균주보다 많은 양으로 대사산물을 배지에서 생산하여 축적시킬 수 있는 세균을 의미한다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "유용한 대사산물을 생산하는 능력이 있는 세균"이란 표현은 표적 대사산물을 0.5g/L 이상, 더욱 바람직하게는 1.0g/L 이상의 함량으로 배지에서 생산하여 축적시킬 수 있는 세균을 의미한다.

"유용한 대사산물"이란 표현은 L-아미노산, 유기산, 비타민, 당류 및/또는 엠브덴-메이어호프, 펜토스 포스페이트(펜토스-P) 경로, 엔트너-도우도로프 경로, 시트레이트 사이클 및 아미노산 생합성의 중간체와 같은 주요 대사산물을 의미한다. 본 발명에서 생산되는 L-아미노산은 특별한 제한이 없으며, 그 예에는 L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티딘, L-시트룰린, L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-글리신, L-트레오닌, L-세린, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-타이로신, L-트립토판, L-시스테인, L-시스틴, L-메티오닌, L-오르니틴, L-글루탐산, L-아스파르트산, L-글루타민 및 L-아스파라긴이 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 세균은 아세틸-CoA에서 유래하는 대사산물을 생산하는 능력이 있는 세균이다. 이러한 대사산물은 L-글루탐산, L-글루타민, L-프롤린, L-아르기닌, L-류신, L-시스테인, 숙시네이트 및 폴리하이드록시부티레이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이다.

이하, 유용한 대사산물을 생산하는 능력이 부여된 균주의 예 및 이러한 능력을 부여하는 방법에 대하여 상세히 설명될 것이다.

또한, 앞에서 언급한 모균주에 유용한 대사산물을 생산하는 능력을 부여하는 방법도 이하에 설명될 것이다.

유용한 대사산물을 생산하는 능력을 부여하기 위하여, 에세리치아 또는 코리네형 세균 등에 속하는 유용한 대사산물 생산균의 개량 시 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 유용한 대사산물을 생산하는 능력이 있는 영양요구성 돌연변이 균주, 유사체 내성 균주 또는 대사 조절 돌연변이 균주를 수득하는 방법, 및 유용한 대사산물 생합성 효소의 활성이 증강된 재조합 균주의 제조방법을 사용할 수 있다(Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1st Edition, published on May 30, 1986, pp.77-100). 이러한 방법을 이용하여 유용한 대사산물 생산균을 개량하면, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 조절 돌연변이와 같은 하나 이상의 성질이 부여될 수 있다.

재조합 균주가 제조되면, 하나 또는 여러 유용한 대사산물 생합성 효소의 활성이 증강될 수 있다. 게다가, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 조절 돌연변이의 성질을 부여하는 방법은 유용한 대사산물 생합성 효소의 활성을 증강시키는 방법과 조합될 수 있다.

유용한 대사산물 생산능이 있는 영양요구성 돌연변이 균주, 유용한 대사산물, 예컨대 L-아미노산 유사체 내성 균주 또는 대사 조절 변이 균주는 모균주 또는 야생형 균주를 일반적인 돌연변이유발 처리, 예컨대 X선 또는 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)과 같은 돌연변이유발제로 처리하여 수득할 수 있다. 이와 같이 돌연변이된 균주로부터, 그 다음 유용한 대사산물 생산능이 있는 영양요구균, 유사체 내성 균주 또는 대사 조절 변이 균주가 선발될 수 있다.

전술한 바와 같은 세균에 L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법에는, 예컨대 L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강 및/또는 과잉발현되도록 세균을 변형시키는 방법이 포함된다. L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소의 예에는 글루타메이트 데하이드로게나제(이하, "GDH"라고도 한다), 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제(이하, "CS"라고도 한다), 포스포에놀피루베이트 카복실라제(이하, "PEPC"라고도 한다), 피루베이트 카복실라제, 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 포스포에놀피루베이트 신타제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스 포스페이트 이소머라제 등이 있다. 이러한 효소 중에서도, CS, PEPC 및 GDH 중 하나 또는 그 이상의 활성이 증강되는 것이 바람직하고, 상기 3가지 효소 모두의 활성이 증강되는 것이 더 바람직하다.

CS 유전자, PEPC 유전자 및/또는 GDH 유전자의 발현을 증강시키는 전술한 바와 같은 방법에 의해 변형된 세균의 예에는 US6,197,559, US6,331,419 및 유럽특허공개번호 0999282 및 1078989에 게시된 세균이 있다.

L-글루탐산 생산능을 부여하기 위한 세균의 변형은 L-글루탐산 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루탐산 외의 다른 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 감소 또는 불활성시켜 수행할 수 있다. L-글루탐산 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루탐산 외의 다른 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소의 예에는 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제, 이소시트레이트 리아제, 글루타메이트 데카복실라제, 1-피롤린 데하이드로게나제 등이 있다. 이러한 효소 중에서도, 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제의 활성을 감소 또는 제거하는 것이 바람직하다.

전술한 효소들의 활성을 감소 또는 불활성화시키기 위하여, 그 효소들의 세포내 활성을 감소 또는 불활성화시키는 돌연변이가 통상의 돌연변이유발 처리 또는 유전자 조작 기술에 의해 도입될 수 있다. 돌연변이유발 처리의 예에는 X선 또는 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 돌연변이유발제 처리 등이 있다. 효소의 세포내 활성을 감소 또는 제거하는 방법의 예에는 세포내 활성이 미변이 균주에 비해 감소 또는 제거되도록 미생물 세포에 존재하는 상기 효소를 암호화하는 유전자를 돌연변이 또는 결실시키는 방법이 있다. 유전자를 돌연변이 또는 결실시키는 방법의 예에는 프로모터 및 샤인-달가노(SD) 서열과 같은 발현 조절 서열의 변형, 개방 판독 프레임에 미스센스 돌연변이, 논센스 돌연변이 또는 판독 전이 돌연변이의 도입, 및 상기 유전자 일부의 결실 방법이 포함된다(J.Biol.Chem. 1997 272(13):8611-7). 돌연변이된 유전자는 염색체 상의 야생형 유전자를 돌연변이 유전자로 치환시키는 상동성 재조합 기술을 이용하거나 또는 트랜스포존 또는 IS 인자를 이용하여 미생물에 도입시킬 수 있다. 상동성 재조합 기술에는 선형 DNA, 온도 민감성 플라스미드 및 비복제성 플라스미드를 사용하는 방법이 있다. 이러한 방법들은 문헌[Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 7;97(12):6640-5, 미국 특허6303383, JP05-07491A 등에 설명되어 있다.

표적 효소의 세포내 활성 및 그 활성의 감소 정도는 후보 균주에서 수득된 세포 추출물 또는 이의 정제된 분획을 사용하여 효소 활성을 측정한 뒤, 야생형 또는 미변형 균주의 활성과 비교하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제 활성은 리드 등(Reed L.J. and Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, pp. 55-61, 1969)의 방법을 통해 측정할 수 있다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결실되거나 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 에세리치아 속에 속하는 세균의 예 및 이러한 세균을 수득하는 방법은 미국 특허 5,378,616 및 5,573,945에 설명되어 있다. 구체적으로, 이러한 균주에는 다음과 같은 것이 있다:

에세리치아 콜리 W3110sucA::Kmr

에세리치아 콜리 AJ12624(FERM BP-3853)

에세리치아 콜리 AJ12628(FERM BP-3854)

에세리치아 콜리 AJ12949(FERM BP-4881)

에세리치아 콜리 W3110sucA::Km^r은 에세리치아 콜리 W3110의 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 유전자(이하, "sucA 유전자"라 한다)를 붕괴시켜 수득할 수 있다. 이 균주는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제가 완전 결손된 균주이다.

sucA 유전자가 상동성 재조합에 의해 붕괴된 코리네형 세균은 WO95/34672 및 미국 특허 5,977,331에 상세히 설명되어 있다.

L-글루탐산 생산균의 다른 예에는 에세리치아 속에 속하고 아스파르트산 항대사산물에 내성이 있는 균주가 있다. 또한, 이러한 균주는 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성이 결손성일 수 있으며, 그 예에는 균주 AF13199(FERM BP-5807)(미국 특허 5,908,768) 또는 추가 변형으로 L-글루탐산 분해능이 저하된 균주 FERM P-12379(미국 특허 5,393,671); 에세리치아 콜리 균주 AJ13138(FERM BP-5565)(미국 특허 6,110,714) 등이 있다.

판토에아 속에 속하는 L-글루탐산 생산균의 예에는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결손성이거나 또는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 저하된 돌연변이 균주가 있고, 이 역시 전술한 바와 같이 수득할 수 있다. 이러한 균주에는 판토에아 아나나티스 AJ13356 또는 AJ13601(미국 특허 6,331,419)이 있다. 판토테아 아나나티스 AJ13356은 국제통상산업성 산업기술청 국립생명과학 인간공학 연구소(현재, 일본 산업기술종합연구소, 국제 특허 미생물 기탁소; 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 초메 1-1 츠쿠바 센트럴 6, 우편번호: 305-5466)에 1998년 2월 19일에 수탁번호 FERM P-16645로서 기탁되어 있다. 그 다음, 1999년 1월 11일자로 부다페스트 조약에 의거한 국제기탁소로 이관하여 수탁번호 FERM P-17516을 받았다. 그 다음, 2000년 7월 6일자로 부다페스트 조약에 의거한 국제기탁소로 이관하여 수탁번호 FERM BP-7207을 받았다. 판토에아 아나나티스 AJ13356 및 AJ13601은 αKGDH의 E1 서브유닛을 암호화하는 유전자(sucA 유전자)의 붕괴 결과로서 α-KGDH 활성이 결손성이다. 상기 균주들은 분리되었을 때 엔테로박터 애글로메란스로 동정되어, 각각 엔테로박터 애글로메란스 AJ13356균주 및 AJ13601균주로서 기탁되었다. 하지만, 최근에 16S rRNA 등의 뉴클레오타이드 서열분석을 기초로 하여 판토에아 아나나티스로 재분류되었다. AJ13356, AJ13601 및 이의 모균주 AJ13355(FERM BP-6614)는 모두 전술한 기탁기관에 엔테로박터 애글로메란스로 기탁되었지만, 본 명세서에서는 판토테아 아나나티스로 설명된다.

L-글루탐산 생산능이 있는 코리네형 세균의 또 다른 예에는 유기산 유사체 내성 돌연변이주 및 에스클레틴 내성 돌연변이주(JP56-1889A, JP56140895A, JP5702689A, JP88994A)가 있다.

유사체 내성 L-글루탐산 생산성 코리네형 세균의 예에는 다음과 같은 균주가 있다:

브레비박테리움 플라범 AJ11355(FERM P-5007, JP56-1889A)

브레비박테리움 글루타미컴 AJ11368(FERM P-P-5020, JP56-1889A)

브레비박테리움 플라범 AJ11217(FERM P-4318, JP57-2689A)

브레비박테리움 플라범 AJ11218(FERM P-4319, JP57-2689A)

브레비박테리움 플라범 AJ11564(FERM P-5472, JP56-140895A)

브레비박테리움 플라범 AJ11439(FERM P-5316, JP56-35981A)

코리네박테리움 글루타미컴 H7684(FERM BP-3004, JP56-151495A)

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 증가된 활성을 보유하도록 변형되는 모균주로서 사용될 수 있는 L-글루타민 생산균의 예에는 글루타메이트 데하이드로게나제 활성, 글루타민 신테타제 활성이 증강(EP1229121A)되도록 변형되거나, 글루타미나제 활성이 감소(EP1424397A)되도록 변형된 L-글루타민 생산성 코리네형 세균이 있다. 또한, 야생형 글루타민 신테타제의 위치 397에 상응하는 티로신 아미노산 잔기가 임의의 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이 글루타민 신테타제를 보유한 에세리치아 속에 속하는 세균도 사용될 수 있다.

6-디아조-5-옥소-노르류신 내성(JP3-232497A), 퓨린 유사체 내성, 메티오닌 설폭사이드 내성(JP61-202694A), α-케토말린산 내성(JP56-151495)을 부여하는 방법은 개량을 통해 L-글루타민 생산능을 부여하거나 증강시키는데 사용될 수 있다. L-글루타민 생산능이 있는 코리네형 세균의 구체적인 예에는 다음과 같은 것이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다:

브레비박테리움 플라범 AJ11573(FERM P-5492, JP56-161495A)

브레비박테리움 플라범 AJ11576(FERMBP-10381, JP56-161495A)

브레비박테리움 플라범 AJ12212(FERM P-8123, JP61-202694A)

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 증가된 활성을 보유하도록 변형되는 모균주로서 유용한 L-프롤린 생산균의 예에는 L-프롤린에 의한 피드백 억제 시 탈감작화된(desensitized)인 γ-글루타밀 키나제를 보유하고(하거나) L-프롤린 분해계가 파괴된 에세리치아 속에 속하는 L-프롤린 생산균이 있다. L-프롤린에 의한 피드백 억제 시 탈감작화된 γ-글루타밀 키나제를 보유한 세균을 개량하는 방법에는 L-프롤린에 의한 피드백 억제 시 탈감작화된 γ-글루타밀 키나제를 암호화하는 DNA를 세포로 도입시키는 방법이 있다(Dandekar, A.M.m Uratus, S.L., J.Bacteriol., 170, 12, 5943-5(1988)). L-프롤린 분해계를 파괴하는 방법에는, 활성 프롤린 데하이드로게나제가 발현되지 않도록 프롤린 데하이드로게나제 유전자에 돌연변이를 도입시키는 방법이 있다. 또한, L-프롤린 분해계가 파괴된 세균은 L-프롤린 자화능 결손 균주를 수득한 뒤, 지표로서 L-프롤린 영양요구성을 이용하여 L-프롤린을 세포외로 과잉생산하는 균주를 선발하여 수득할 수 있다. 에세리치아 속에 속하는 L-프롤린 생산균에는 에세리치아 콜리 균주 NRRL B-12403 및 NRRL B-12404(영국 특허 2075056), VKPM B-8012(미국 특허 공개번호 2002-0058315)가 있으며, 이러한 균주를 수득하기 위하여 독일 특허 3127361에 기술된 플라스미드 돌연변이체, 문헌[Bloom F.R. et al., The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34]에 기술된 플라스미드 돌연변이체 등을 사용할 수 있다.

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 증가된 활성을 보유하도록 변형되는 모균주로서 사용할 수 있는 L-아르기닌 생산균의 예에는 에세리치아 속에 속하는 L-아르기닌 생산균, 예컨대 에세리치아 콜리 균주 237(VKPM B-7925) 및 이의 유도체로서 돌연변이 N-아세틸글루타메이트 신타제를 보유한 균주, N-아세틸글루타메이트 신테타제를 암호화하는 argA 유전자가 도입된 아르기닌 생산 균주(JP57-5693A) 등이 있다.

L-아르기닌 생산균의 다른 예에는 L-아르기닌 생합성 효소, 예컨대 N-아세틸글루타메이트 신타제(argA), N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제(argC), 오르니틴 아세틸글루타메이트 신타제(argA), N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제(argC), 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 아세틸오르니틴 데아세틸라제(argE), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(argF), 아르기니노숙시네이트 신타제(argG), 아르기니노숙시네이트 리아제(argH) 및 카바모일 포스페이트 신타제(carAB) 등을 암호화하는 유전자를 증폭시킨 균주가 있다. 상기 효소들을 암호화하는 유전자 명칭은 각 효소 명칭 뒤의 괄호 안에 제시하였다.

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 증가된 활성을 보유하도록 변형되는 모균주로서 사용할 수 있는 L-류신 생산균의 예에는 에세리치아 속에 속하는 L-류신 생산균, 예컨대 4-아자류신 또는 5,5,5-트리플루오로류신 내성인 에세리치아 콜리 균주 H-9068(ATCC 21530), H-9070(FERM BP-4704) 및 H-9072(FERM BP-4706), L-류신에 의한 이소프로필말레이트 신타제의 피드백 억제가 탈감작화된 에세리치아 콜리 균주(EP106719B), β-2-티에닐알라닌 및 β-하이드록시류신 내성인 에세리치아 콜리 균주 AJ11478(미국 특허 5,763,231), 에세리치아 콜리 균주 57(VKPM B-7386, 러시아 특허 2140450) 등이 있다.

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 증가된 활성을 보유하도록 변형되는 모균주로서 사용할 수 있는 L-시스테인 생산균의 예에는 에세리치아 속에 속하는 L-시스테인 생산균, 예컨대 피드백 내성의 세린 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 여러 cysE 대립유전자로 형질전환된 에세리치아 콜리 균주 JM15(미국 특허 6,218,168); 세포독성 물질을 분비시키기에 적합한 단백질을 암호화하는 유전자를 과잉발현하는 에세리치아 콜리 균주 W3110(미국 특허 5,972,663); 시스테인 데설포히드라제(cysteine desulfohydrase) 활성을 저하시킨 에세리치아 콜리 균주(JP11-155571A2); cysB 유전자에 의해 암호화된 시스테인 레굴론(regulon)에 대한 양성 전사 조절인자의 증가된 활성을 이용하는 에세리치아 콜리 균주 W3110(WO 01/27307A1) 등이 있다.

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 증가된 활성을 보유하도록 변형되는 모균주로서 사용할 수 있는 숙시네이트 생산균의 예에는 에세리치아 및 코리네형 세균 속에 속하는 숙시네이트 생산균, 예컨대 브레비박테리움 플라범 MJ233△ldh 균주(JP11-206385A), 및 브레비박테리움 플라범 MJ233/pPCPYC 균주(WO01/27258)가 있다.

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 증가된 활성을 보유하도록 변형되는 모균주로서 사용할 수 있는L-리신 생산균의 예에는 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11082(NRRL B-11470)의 S-(2-아미노에틸)시스테인(이하, "AEC") 내성 돌연변이 균주(JP56-1914B, JP56-1915B, JP57-14157B, JP57-14158B, JP57-30474B, JP58- 10075B JP59-4993B, JP61-35840B, JP62-24074B, JP62-36673B, JP5-11958B, JP7- 112437B 및 JP7-112438B에 기술된 것), L-호모세린과 같은 아미노산 영양요구성인 돌연변이 균주(JP48-28078B 및 JP56-6499B), AEC 내성이고 L-류신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌 및 L-발린과 같은 아미노산 영양요구성인 돌연변이 균주(미국 특허 3,708,395 및 3,825,472), DL-α-아미노-ε-카프로락탐, α-아미노-라우릴락탐, 아스파르트산 유사체, 설파 약물, 퀴노이드, 및 N-라우로일류신에 내성인 L-리신 생산 돌연변이 균주, 옥살로아세테이트 데카복실라제 억제제 또는 기도 효소 억제제 내성인 L-리신 생산 돌연변이 균주(JP50-53588A, JP50-31093A, JP52-102498A, JP53-9394A, JP53-86089A, JP55-9783A, JP55-9759A, JP56- 32995A, JP56-39778A, JP53-43591B 및 JP53-1833B), 이노시톨 또는 아세트산 영양요구성인 L-리신 생산성 돌연변이 균주(JP55-9784A 및 JP56-8692A), 34℃ 또는 그 이상의 온도에서 플루오로피루브산에 민감한 L-리신 생산성 돌연변이 균주(JP55-9783A 및 JP53-86090A), 에틸렌 글리콜 내성인 브레비박테리움 또는 코르네박테리움의 L-리신 생산성 돌연변이 균주(미국 특허 4,411,997) 등이 있다.

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 증가된 활성을 보유하도록 변형되는 모균주로서 사용할 수 있는L-리신 생산균의 또 다른 예에는 에세리치아 콜리 WC196의 S-(2-아미노에틸)시스테인(이하, "AEC"라 한다) 내성 돌연변이 균주가 있다(WO96/17930). WC196 균주는 에세리치아 콜리 AJ13069로 명명되어 있고, 독립 행정청으로서, 일본 산업기술종합연구소, 국제 특허 미생물 기탁기관(일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 초메 1-1 츠쿠바 센트럴 6, 우편번호: 305-5466)에 1994년 12월 6일에 수탁번호 FERM P-14690으로서 기탁되어 있다. 그 다음, 이 기탁물은 부다페스트 조약에 의거한 국제기탁기관으로 1995년 9월 29일에 이양되어 수탁번호 FERM BP-5252를 받았다.

L-트레오닌 생산능이 있는 미생물의 예에는 6-디메틸아미노퓨린 내성 돌연변이주(JP5-304969A), 효소 활성을 증강시키는 돌연변이를 보유한 트레오닌 생합성 효소의 유전자를 플라스미드로 증폭시킨 균주(JP1-29559B, JP05-227977A), 트레오닌 오페론을 플라스미드로 증폭시킨 균주(JP2-109985A), 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 유전자 및 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 증폭시킨 균주(JP2002-51787A) 등이 있다.

또한, L-트레오닌 생산균주로서, 에세리치아 콜리 VKPM B-3996 균주(미국 특허 5,175,107)를 사용할 수도 있다. VKPM B-3996은 러시아 국립산업미생물수집소(VKPM) GNII 제네티카에 1987년 11월 19일에 수탁번호 VKPM B-3996로서 기탁되었다. VKPM B-3996 균주는 스트렙토마이신 내성 마커 유전자를 보유한 플라스미드 pAYC32에 트레오닌 오페론(thrABC)을 삽입하여 수득한 플라스미드 pVIC40(국제특허공개 WO90/04636)을 보유한다(Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167). pVIC40에 함유된 돌연변이 thrA 유전자에 의해 암호화된 아스파토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I은 L-트레오닌에 의한 피드백 억제 시 방출된다.

에세리치아 콜리 VKPM B-5318 균주(EP 0593792B)는 또한 L-트레오닌 생산 균주로서 사용될 수 있다. VKPM B-5318은 러시아 국립산업미생물연구소(VKPM) GNII 제네티카에 1987년 11월 19일자로 등록번호 VKPM B-5318로 수탁되었다. VKPM B-5318 균주는 L-이소류신 영양요구성이고, 트레오닌 생합성 효소를 암호화하는 트레오닌 오페론은 λ파지 유래의 Cro 단백질의 C1 온도 민감성 리프레서(represser), PR 프로모터 및 N-말단 끝(end) 하류에 위치한다. 더욱이, 이 균주는 트레오닌 생합성 유전자의 발현이 λ파지 유래의 프로모터 및 리프레서에 의해 조절되도록 작제한 플라스미드 DNA를 함유한다.

또한, 에세리치아 콜리 MG442 균주(US4,278,765)는 L-트레오닌 생산성 균주로서 사용될 수 있다. MG442 균주는 러시아 국립산업미생물 수집소(VKPM)에 CMIMB-1628로서 기탁되었다.

L-페닐알라닌 생산능이 있는 에세리치아균의 예에는 tyrA 및 tyrR 유전자가 붕괴된 에세리치아 콜리 AJ12739(tyrA::Tn10, TyrR; VKPM B-8197), 돌연변이된 pheA가 도입된 에세리치아 콜리 HW1089(미국 특허 5,354,672) 및 yddG 및 yedA 유전자가 증폭된 에세리치아 콜리 균주(WO 03/044192)가 있다. L-페닐알라닌 생산능이 있는 코리네형 세균의 예에는 타이로신 영양요구성이고 L-페닐알라닌-L-타이로신 내성인 균주가 있다(JP5-49489A).

L-트립토판 생산능이 있는 세균은 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 및 안트라닐레이트 신타제를 비롯한 L-트립토판 생합성 효소의 활성을 증강시켜 수득할 수 있다. 이 효소들은 L-트립토판 또는 L-세린에 의한 피드백 억제에 내성일 수 있다. 예를 들어, 이러한 피드백 내성 효소를 보유한 세균은 L-세린 내성 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 보유하는 에세리치아 콜리 SV164 균주에 L-트립토판 내성 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 돌연변이 serA 유전자를 함유하는 플라스미드 pGH5를 도입시켜 수득할 수 있다(WO94/08031).

또한, L-트립토판 생산능이 있는 세균은 트립토판 오페론에 의해 암호화된 L-트립토판 생합성 효소의 활성을 증강시켜 수득할 수도 있다. 이러한 L-트립토판 오페론 효소에는 트립토판 신타제 및 안트라닐레이트 신타제가 있다. 이러한 세균의 예에는 L-세린 내성 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 트립토판 오페론을 도입시킨 에세리치아 콜리 균주가 있다(JP57-71397A, JP62-244382A 및 미국 특허 4,371,614).

또한, L-트립토판 생산능이 있는 세균의 예에는 L-페닐알라닌 및 L-타이로신 영양요구성인 에세리치아 콜리 AGX17(pGX44)[NRRL B-12263], 및 트립토판 오페론을 함유하는 플라스미드 pGX50을 보유하는 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(미국 특허 4,371,614)가 있다.

L-이소류신 생산능이 있는 에세리치아균의 예에는 6-디메틸아미노퓨린 내성의 돌연변이 균주(JP5-304969A), L-이소류신하이드록사메이트, 티아이소류신, DL-에티오닌 또는 아르기닌하이드록사메이트 내성의 돌연변이 균주(JP5-130882A) 및 트레오닌 탈아미노효소 및 아세토하이드록실산 신타제를 암호화하는 유전자가 플라스미드에 의해 증폭되는 재조합 균주(JP2-458A, JP2-23988A 및 JP8-47397A)가 있다.

L-발린 생산능이 있는 세균은 ilvGMEDA 오페론에 의해 암호화된 L-발린 생합성 효소, 구체적으로 ilvG 유전자에 의해 암호화된 아세토하이드록실레이트 신타제의 활성을 증강시켜 수득할 수 있다(JP02-748418B). 이러한 효소들은 L-발린에 의한 피드백 억제에 내성일 수 있다.

L-발린 생산능이 있는 세균에는 아세토락테이트 신타제 III 유전자(ilvIH 유전자)의 발현을 감소시킨 세균이 있다.

L-발린 생산능이 있는 세균은 아미노산 유사체 내성일 수 있다. 이러한 세균의 예에는 L-이소류신 및 L-메티오닌 영양요구성이고 D-리보스, 퓨린 뉴클레오사이드 또는 피리미딘 리보뉴클레오사이드 내성인 돌연변이 균주(FERM P-1841, P-5556; JP53-025034A) 및 폴리케토노이드 내성인 돌연변이 균주(FERM P-9325; JP04-045314B)가 있다.

L-알라닌 생산능이 있는 세균의 예에는 H-ATPase 활성이 결손된 코리네형 세균 균주(Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov; 57(4): 534-40) 또는 아스파르트산 β-데카복실라제 유전자가 증폭된 코리네폼 균주(JP07-163383A)가 있다.

더욱이, 본 발명의 세균은 6-포스포프럭토키나제의 활성이 감소되도록 추가 변형된 것이 바람직하다. 6-포스포프럭토키나제 활성은 예컨대 문헌[Denise Kotlars and Henri Buc, Methods in Enzymology(1982) 90: 60-70]에 기술된 방법에 따라 측정할 수 있다. 본 발명에 따른 세균의 6-포스포프럭토키나제 활성은 야생형 또는 미변형 균주의 활성 미만, 바람직하게는 야생형 또는 미변형 균주의 90% 미만, 더욱 바람직하게는 70% 미만, 가장 바람직하게는 50% 미만으로 감소된 것이다. 6-포스포프럭토키나제의 활성은 이 효소를 암호화하는 유전자의 돌연변이 또는 붕괴에 의해 감소될 수 있고, 이 방법은 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성을 감소시키는데 사용된 방법과 유사할 수 있다.

본 발명에 따르면, 유용한 대사산물은 전술한 세균을 배양 배지에서 배양한 뒤, 그 배양 배지 및/또는 세균 세포에 유용한 대사산물의 축적이 이루어지게 하고, 축적된 유용한 대사산물을 배양 배지 및/또는 세균 세포로부터 수거하여 생산할 수 있다.

배양, 배지로부터 유용한 대사산물의 수거 및 정제는 세균을 이용하여 유용한 대사산물을 생산하는 종래의 발효법으로 수행할 수 있다. 배양 배지는 배지가 탄소원, 질소원 및 무기질과, 필요한 경우 세균의 증식에 필요한 적당한 양의 영양소를 함유하기만 한다면 합성 배지이거나 천연 배지일 수 있다. 탄소원에는 글루코스 및 슈크로스와 같은 다양한 탄수화물, 및 다양한 유기산이 있다. 선택된 세균의 자화 방식에 따라서, 에탄올 및 글리세롤과 같은 알콜을 사용할 수도 있다. 질소원으로는, 암모니아, 황산암모늄, 다른 질소 화합물, 예컨대 아민, 펩톤과 같은 천연질소원, 대두 가수분해물 및 분해된 발효 미생물을 사용할 수 있다. 무기질로서, 인산일칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 염화칼슘 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 배양 배지에 티아민 염산염(비타민 B1)을 첨가하는 것이 더욱 바람직하다. 티아민 염산염의 농도는 10㎍/L 이상, 바람직하게는 10mg/L 이상, 더욱 바람직하게는 100mg/L 미만이다.

배양은 폭기(aeration) 하에 진탕 배양, 교반 배양과 같은 호기 조건 하에서, 20 내지 42℃의 온도, 바람직하게는 37 내지 40℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 배양 배지의 pH는 보통 5 내지 9이고, 바람직하게는 6.5 내지 7.2 사이이다. 배양 배지의 pH는 암모니아, 탄산칼슘, 다양한 산, 다양한 염기 및 완충액으로 조정할 수 있다. 보통 1 내지 5일 배양이면, 액체 배지에서 표적의 유용한 대사산물을 축적시키기에 충분하다.

배양 후, 세포와 같은 고형물은 원심분리 또는 막 여과를 통해 액체 배지로부터 제거할 수 있고, 표적의 유용한 대사산물은 이온교환, 농축 및 결정화법 등으로 수거 및 정제할 수 있다.

본 발명은 이하 비제한적 실시예를 참조로 하여 더욱 상세히 설명될 것이다. 약어: Pyr - 피루베이트, PEP - 포스포에놀피루베이트, GA-3P -글리세르알데하이드-3-포스페이트, AceCoA - 아세틸-CoA.

이론적 중량 수율(Y)은 다음과 같이 계산한다:

Y = (산물의 분자량 x 몰)/(기질의 분자량 x 몰).

이 반응식은 오로지 탄소 화합물 및 에너지 분자만을 나타내도록 간략화된 것이다.

실시예 1. 포스포케톨라제 활성이 있거나 없는 세균에 의한 아세틸-CoA 형성율 계산

1. 포스포케톨라제 활성을 수반하지 않는 아세틸-CoA 생합성 경로의 반응

PTS 시스템과 후속 해당과정은 다음과 같은 반응식을 제공한다:

글루코스 = PEP + Pyr + ATP + 2NADH

ppc 유전자에 의해 암호화된 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 다음과 같 은 반응을 촉매한다:

PEP + CO₂ = 옥살로아세테이트

pdh 유전자에 의해 암호화된 피루베이트 데하이드로게나제는 다음과 같은 반응을 촉매한다:

Pyr = 아세틸-CoA + CO₂ + NADH

그리고 최종 반응식은

글루코스 = 아세틸-CoA + + 옥살로아세테이트 + ATP + 3NADH (A)

2. 포스포케톨라제 활성을 수반하는 아세틸-CoA 생합성 경로의 반응

PTS 시스템과 후속 해당과정은 다음과 같은 반응식을 제공한다:

글루코스 + PEP = 프럭토스-6-포스페이트 + Pyr

포스포에놀피루베이트 신타제는 다음과 같은 반응을 촉매한다:

Pyr + ATP = PEP

ppc 유전자에 의해 암호화된 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 다음과 같은 반응을 촉매한다:

PEP + CO₂ = 옥살로아세테이트

프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제:

포스페이트 + 프럭토스-6-포스페이트 = H₂O + 에리트로스-4-포스페이트 + 아세틸 포스페이트

트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제:

프럭토스-6-포스페이트 + 에리트로스-4-포스페이트 = 2 자이룰로스-5-포스페이트

D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제:

포스페이트 + 프럭토스-5-포스페이트 = 글리세르알데하이드-3-포스페이트 +아세틸 포스페이트

해당과정:

글리세르알데하이드-3-포스페이트 = PEP + 2ATP + 2NADH

pta 유전자에 의해 암호화된 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제

아세틸포스페이트 = 아세틸-CoA

최종 반응식은 다음과 같다:

2 글루코스 + 2 CO₂ = 3 아세틸-CoA + 2 옥살로아세테이트 + NADH (B)

상기 반응식 (A)와 (B)를 비교해 보면, 포스포케톨라제의 활성을 사용할 때 글루코스 1분자로부터 아세틸-CoA 1.5분자가 생성되고 CO₂ 1분자가 절약되는 반면, 포스포케톨라제 활성 없는 글루코스 대사에서는 글루코스 1분자로부터 아세틸-CoA 1분자가 수득되는 것을 알 수 있다.

실시예 2. 포스포케톨라제 활성을 보유 또는 보유하지 않는 세균을 이용한 L-글루탐산 생산의 이론적 수율 계산

1. PTS, 해당과정 및 TCA 사이클을 수반하는 L-글루탐산 생합성 경로의 반응

PTS + 해당과정:

글루코스 = 아세틸-CoA + 옥살로아세테이트 + ATP + 3NADH (A)

TCA 사이클:

아세틸-CoA + 옥살로아세테이트 = 2-옥소글루타레이트 + NADPH + CO₂

글루타메이트 데하이드로게나제:

2-옥소글루타레이트 + NH3 + NADPH = 글루탐산

최종 반응식:

글루코스 = 글루탐산 + ATP + 3NADH + CO₂ (C)

L-글루탐산의 이론적 중량 수율은 81.7%이다.

2. 해당과정, 비산화적 PPC 및 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 만을 수반하는 L-글루탐산 생합성 경로의 반응

해당과정 및 비산화적 PPC:

5 글루코스 + 5 PEP = 5 프럭토스-6-포스페이트 + 5 Pyr, 이 때

프럭토스-6-포스페이트 + ATP = 2 GA-3P

2 프럭토스-6-포스페이트 + 2 GA-3P = 2 자이룰로스-5-포스페이트 + 2 에리트로스-4-포스페이트

2 프럭토스-6-포스페이트 + 2 에리트로스-4-포스페이트 = 4 자이룰로스-5-포스페이트

요약 반응식:

5 글루코스 + 5 PEP + ATP = 6 자이룰로스-5-포스페이트 + 5 Pyr

그 다음, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제:

자이룰로스-5-포스페이트 + 포스페이트 = GA-3P + 아세틸포스페이트

해당과정 및 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제:

GA-3P = PEP + ATP + NADH

아세틸포스페이트 = 아세틸-CoA

요약 반응식:

5 글루코스 = 6 아세틸-CoA + PEP + 5 ATP + 6 NADH + 5 PYR (1)

포스포에놀피루베이트 신타제

PYR + 2ATP = PEP + 포스페이트

NADH = 2ATP라고 가정

요약 반응식:

5 글루코스 = 6 아세틸-CoA + 6 PEP + 7 ATP

포스포에놀피루베이트 카복실라제(ppc):

PEP + CO₂ = 옥살로아세테이트

요약 반응식:

5 글루코스 + 6 CO₂ = 6 아세틸-CoA + 6 옥살로아세테이트 + 7ATP (2)

TCA 사이클:

옥살로아세테이트 + 아세틸-CoA = 옥소글루타레이트 + CO₂ + NADPH

요약 반응식:

5 글루코스 = 6 옥소글루타레이트 + 6NADPH + 7ATP

글루타메이트 데하이드로게나제:

옥소글루타레이트 + NADPH = 글루탐산

최종 반응식:

5 글루코스 = 6 글루탐산 + 7 ATP (D)

L-글루탐산의 이론적 중량 수율은 98%이다.

3. 해당과정, 비산화적 PPC, 포스포케톨라제 및 글리옥살레이트 바이패스를 수반하는 L-글루탐산 생합성 경로의 반응

PTS + 해당과정:

2 글루코스 + 2PEP = 2 프럭토스-6-포스페이트 + 2PYR

프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제2:

프럭토스-6-포스페이트 + 포스페이트 = 에리트로스-4-포스페이트 + 아세틸포스페이트

트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제:

프럭토스-6-포스페이트 + 에리트로스-4-포스페이트 = 2 자이룰로스-5-포스페이트

자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제:

2 자이룰로스-5-포스페이트 + 2 포스페이트 = 2 GA-3P + 2 아세틸포스페이트

요약 반응식:

2 글루코스 + 2PEP = 2 GA-3P + 3 아세틸포스페이트 + 2PYR

해당과정:

GA-3P = PEP + ATP + NADH

요약 반응식:

2 글루코스 = 3 아세틸포스페이트 + 2PYR + 2ATP + 2NADH (3)

포스포에놀피루베이트 신타제:

PYR + 2 ATP = PEP

포스페이트 아세틸트랜스퍼라제:

아세틸포스페이트 = 아세틸-CoA

요약 반응식:

2 글루코스 = 3 아세틸-CoA + 2PEP + NADH

포스포에놀피루베이트 카복실라제:

PEP + CO₂ = 옥살로아세테이트

요약 반응식:

2 글루코스 + 2 CO₂ = 3 아세틸-CoA + 2 옥살로아세테이트 + NADH 또는 (4)

6 글루코스 + 6 CO₂ = 9 아세틸-CoA + 6 옥살로아세테이트 + 3 NADH

글리옥살레이트 바이패스:

2 아세틸-CoA = 숙시네이트 + NADH

TCA 사이클:

숙시네이트 = 옥살로아세테이트 + ATP + NADH

요약 반응식:

6 글루코스 + 6 CO₂ = 7 아세틸-CoA + 7 옥살로아세테이트 + ATP + 5 NADH

TCA 사이클:

아세틸-CoA + 옥살로아세테이트 = 2-옥소글루타레이트 + NADPH + CO₂

글루타메이트 데하이드로게나제:

2-옥소글루타레이트 + NH₃ + NADPH = 글루탐산

최종 반응식:

6 글루코스 = 7 글루탐산 + ATP + 5 NADH + CO₂

또는 6 글루코스 = 7 글루탐산 + 11 ATP + CO_{2 (E)}

L-글루탐산의 이론적 중량 수율은 95.3%이다.

반응식 (C), (D) 및 (E)를 비교해 보면, 포스포케톨라제의 활성을 사용할 때, L-글루탐산 생합성의 이론적 수율이 유의적으로 증가하고, 사용된 글루코스 분자보다 1분자 더 많은 L-글루탐산이 생성되며 CO₂ 방출이 저지되는 반면, 포스포케톨라제 활성 없는 글루코스 대사에서는 글루코스 1분자로부터 L-글루탐산 1분자가 수득된다는 것을 알 수 있다.

실시예 3. 포스포케톨라제 활성이 있거나 또는 없는 세균을 이용한 숙시네이트 생산의 이론적 수율 계산

1. PTS, 해당과정 및 TCA 사이클을 수반하는 숙시네이트 생합성 경로의 반응

PTS + 해당과정:

글루코스 = PEP + PYR + ATP + 2NADH

포스포에놀피루베이트 카복실라제:

PEP + CO₂ = 옥살로아세테이트

피루베이트 데하이드로게나제:

PYR = 아세틸-CoA + CO₂ + NADH

요약 반응식:

글루코스 = 옥살로아세테이트 + 아세틸-CoA + ATP + 3NADH

TCA 사이클:

옥살로아세테이트 + 아세틸-CoA = 숙시네이트 + NADPH + NADH + ATP + 2CO₂

최종 반응식:

글루코스 = 숙시네이트 + NADPH + 4NADH + 2ATP + 2CO₂

또는 NADH = NADPH = 2ATP로 가정 시,

글루코스 = 숙시네이트 + 12ATP + 2CO₂ (F)

숙시네이트의 이론적 중량 수율은 65%이다.

2. 해당과정, 비산화적 PPC 및 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 만을 수반하는 숙시네이트 생합성 경로의 반응

해당과정, 비산화적 PPC, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 및 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 다음과 같은 요 약 반응식을 제공한다(실시예 2, 반응식 2 참조):

5 글루코스 + 6CO₂ = 6 아세틸-CoA + 6옥살로아세테이트 + 7ATP

TCA 사이클:

옥살로아세테이트 + 아세틸-CoA = 숙시네이트 + NADPH + NADH + ATP + 2CO₂

최종 반응식:

5 글루코스 = 6 숙시네이트 + 6CO₂ + 6NADPH + 25ATP

또는 NADH = NADPH = 2ATP 라고 가정 시,

5 글루코스 = 6 숙시네이트 + 6CO₂ + 37ATP (G)

숙시네이트의 이론적 중량 수율은 79%이다.

3. 해당과정, 비산화적 PPC, 포스포케톨라제 및 글리옥살레이트 바이패스를 수반하는 숙시네이트 생합성 경로의 반응

해당과정, 비산화적 PPC, 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 및 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 다음과 같은 요약 반응식을 제공한다(실시예 2, 반응식 4 참조):

2 글루코스 + 2CO₂ = 3 아세틸-CoA + 2 옥살로아세테이트 + NADH 또는

4 글루코스 + 4CO₂ = 6 아세틸-CoA + 4 옥살로아세테이트 + 2NADH

TCA 사이클:

옥살로아세테이트 + 아세틸-CoA = 숙시네이트 + NADPH + NADH + ATP + 2CO₂

요약 반응식:

4 글루코스 = 4 숙시네이트 + 2 아세틸-CoA + 4CO₂ + 4NADPH + 6NADH

글리옥살레이트 바이패스:

2 아세틸-CoA = 숙시네이트 + NADH

최종 반응식:

4 글루코스 = 5 숙시네이트 + 4CO₂ + 4NADPH + 7NADH

또는 NADH = NADPH = 2ATP 라고 가정 시,

4 글루코스 = 5 숙시네이트 + 4CO₂ + 22ATP (H)

숙시네이트의 이론적 중량 수율은 Y=82%이다.

반응식 (F), (G) 및 (H)를 비교해보면, 포스포케톨라제 활성이 없는 글루코스 대사에서는 글루코스 1분로부터 숙시네이트 1분자가 수득되는 것에 반해, 포스포케톨라제 활성이 이용된 경우에는 숙시네이트 생합성의 이론적 수율이 유의적으로 증가되고 사용된 글루코스 분자보다 숙시네이트 1분자가 더 생산되며, CO₂ 방출이 저지된다는 것을 알 수 있다.

실시예 4. 포스포케톨라제 활성이 있거나 없는 세균을 이용한 L-류신 생산의 이론적 수율 계산

1. PTS 및 해당과정을 수반하는 L-류신 생합성 경로의 반응

해당과정:

글루코스 = 2PYR + 2ATP + 2NADH

L-류신 생합성:

2 PYR + NADPH = 2-케토-이소발러레이트 + CO₂

2-케토-이소발러레이트 + 아세틸-CoA + L-글루탐산 = 류신 + NADH + 2-옥소글루타레이트 + CO₂ 또는

2-케토-이소발러레이트 + 아세틸-CoA = 류신 + NADH - NADPH + CO₂

여기서, NADPH가 L-글루탐산의 재생에 사용되는 경우,

피루베이트 데하이드로게나제

PYR = 아세틸-CoA + NADH + CO₂

요약 반응식:

3 PYR = 류신 + 2 NADH - 2 NADPH + 3 CO₂

최종 반응식:

3 글루코스 = 2 류신 + 4 NADH - 4 NADPH + 6 CO₂ + 6 ATP + 6 NADH

또는 NADH = NADPH = 2 ATP라고 가정하면,

3 글루코스 = 2 류신 + 18 ATP + 6 CO₂ (I)

L-류신의 이론적 중량 수율은 Y=48%이다.

2. 해당과정, 비산화적 PPC 및 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 만을 수반하는 L-류신 생합성 경로의 반응

해당과정, 비산화적 PPC, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 및 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 다음과 같은 요약 반응식을 제공한다(실시예 2, 반응식 1 참조):

5 글루코스 = 6 아세틸-CoA + PEP + 5 ATP + 6 NADH + 5 PYR

피루베이트 키나제:

PEP = PYR + ATP

요약 반응식:

5 글루코스 = 6 아세틸-CoA + 6PYR + 6ATP + 6NADH

L-류신 생합성:

2 PYR + 아세틸-CoA = 류신 + NADH - 2 NADPH + 2 CO₂

요약 반응식:

5글루코스 = 3류신 + 3아세틸-CoA + 6ATP + 9NADH - 6NADPH + 6CO₂ (5)

다른 해당과정의 작용은 다음과 같다:

3 글루코스 = 6PYR + 18ATP (6)

반응식 (5)와 (6)을 합하면:

3 글루코스 = 6 PYR + 18 ATP

+

5글루코스 = 3류신 + 3 아세틸-CoA + 6ATP + 9NADH-6NADPH + 6CO₂ =

8글루코스 = 3류신 + (6PYR + 3Ace-CoA) + 9NADH - 6NADPH + 24ATP + 6CO₂

최종 반응식

8글루코스 = 6류신 + 24APT + 12NADH - 12NADPH + 12CO₂

또는 NADH = NADPH라고 가정 시,

8 글루코스 = 6류신 + 12CO₂ + 24ATP (J)

L-류신의 이론적 중량 수율은 Y=55%이다.

3. 해당과정, 비산화적 PPC 및 2개의 포스포케톨라제가 관여하는 L-류신 생합성 경로의 반응.

해당과정, 비산화적 PPC, 프럭토스-6-포스페이트포스포케톨라제, D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제는 요약 반응식을 제공한다(실시예 2, 반응식 3 참조):

2 글루코스 = 3 아세틸포스페이트 + 2PYR + 2ATP + 2NADH

포스페이트 아세틸트랜스퍼라제:

아세틸포스페이트 = 아세틸-CoA

요약 반응식:

2 글루코스 = 3 아세틸-CoA + 2PYR + 2ATP + 2NADH

L-류신 생합성:

2PYR + 아세틸-CoA = 류신 + NADH - 2NADPH + 2CO₂

요약 반응식:

2글루코스 = 류신 + 2아세틸-CoA + 2ATP + 3NADH - 2NADPH + 2CO₂ (7)

다른 해당과정은 다음과 같다:

2글루코스 = 3PYR + 12ATP (8)

반응식 (7)과 (8)을 합하면:

2글루코스 = 류신 + 2아세틸-CoA + 2ATP + 3NADH - 2NADPH + 2CO₂

+

2글루코스 = 3PYR + 12ATP

=

4글루코스 = 류신 + (4PYR + 2아세틸-CoA) + 14ATP + 3NADH - 2NADPH + 2CO₂

L-류신 생합성:

4PYR + 2아세틸-CoA = 2류신 + 2NADH - 4NADPH + 4CO₂

최종 반응식:

4글루코스 = 3류신 + 14ATP + 5NADH - 6NADPH + 6CO₂

또는 NADH = NADPH = 2ATP라고 가정 시,

4글루코스 = 3류신 + 6CO₂ + 12ATP (K)

L-류신의 이론적 중량 수율은 Y=55%이다.

반응식 (I), (J) 및 (K)를 비교해보면, 포스포케톨라제의 활성을 이용하면 L-류신 생합성의 이론적 수율이 유의적으로 증가함을 알 수 있다.

실시예 5. 락토바실러스 플란타럼 유래의 포스포케톨라제 유전자(xpk1)의 클로닝 및 이러한 xpk1 유전자 증폭이 에세리치아 콜리에서 유용한 대사산물의 생산 에 미치는 효과의 평가

xpk1 유전자는 락토바실러스 플란타럼 균주 8PA3(VKPM B-7495)의 염색체 DNA로부터 클로닝할 수 있다. 보고된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하면, xpk1 유전자 증폭에 사용할 서열번호 7(프라이머 1) 및 서열번호 8(프라이머 2)에 제시된 프라이머를 합성할 수 있다. 프라이머 1은 5'-말단에 도입된 Hind III 인식 부위를 함유한다. 프라이머 2는 5'-말단에 도입된 EcoRI 인식 부위를 함유한다.

락토바실러스 플란타럼 균주 8PA3의 염색체 DNA는 PCR의 주형으로서 사용될 수 있고, 통상의 방법으로 제조할 수 있다. PCR은 다음과 같은 조건 하에서 "Applied Biosystems GeneAmp PCR Systerm 2400"을 이용하여 수행할 수 있다: 초기 DNA 변성, 95℃에서 5분; 그 다음 변성 30회, 95℃에서 30초, 어닐링 55℃에서 60초, 그리고 신장 72℃에서 120초; 최종 중합, Fermentas Taq 폴리머라제(Fermentas, Lithuania)를 이용하여 72℃에서 7분. 그 결과 수득되는 프로모터 서열 없이 자신의 SD 서열을 보유한 xpk1 유전자를 함유하는 PCR 단편을 HindIII 및 EcoRI으로 처리한 뒤, 사전에 이 효소들로 처리한 벡터 pMW119에 삽입할 수 있다. 그 결과, 플라스미드 pMW-xpk1 이 수득될 수 있다.

이러한 pMW-xpk1 플라스미드를 이용한, 유용한 대사산물 생산균 균주의 형질전환은 통상의 방법으로 수행하여, 증폭된 xpk1 유전자를 함유하는 균주를 수득할 수 있다.

에세리치아 콜리 균주 VL334thrC⁺-pMW-xpk1에 의한 L-글루탐산 생산.

에세리치아 콜리 균주 L-글루탐산 생산 균주 VL334thrC⁺(유럽 특허 공개번호 1172433)의 pMW-xpk1 플라스미드를 이용한 형질전환은 통상의 방법으로 수행하여 균주 VL334thrC⁺-pMW-xpk1을 수득할 수 있다.

두 균주, VL334thrC⁺ 및 VL334thrC⁺-pMW-xpk1은 L-한천 평판배지에서 37℃ 하에 18 내지 24시간 동안 증식시킬 수 있다. 그 다음, 세포 1 백금이를 발효 배지 2ml를 함유한 시험관에 접종할 수 있다. 발효 배지는 60g/L 글루코스, 25g/L 황산암모늄, 2g/L KH₂PO₄, 1g/L MgSO₄, 0.1mg/ml 티아민, 70㎍/ml L-이소류신 및 25g/l 초크(pH 7.2)를 함유해야 한다. 글루코스 및 초크는 각각 멸균되어야 한다. 배양은 진탕 하에 30℃에서 3일 동안 수행할 수 있다. 배양 후, 축적된 L-글루탐산의 축적량은 종이 크로마토그래피(액체 상 조성: 부탄올-아세트산-물 = 4:1:1)로 측정한 다음, 닌하이드린(아세톤 중에 1% 용액)으로 염색 후, 화합물을 0.5% CdCl₂를 보유한 50% 에탄올에서 용출시켰다.

에세리치아 콜리 균주 702ilvA-pMW-xpk1에 의한 L-프롤린 생산

pMW-xpk1 플라스미드를 이용한 에세리치아 콜리 L-프롤린 생산 균주 702ilvA(VKPM B-8012, 러시아 특허 출원 2000124295, 유럽특허공개번호 1172433)의 형질전환은 통상의 방법으로 수행하여 균주 702ilvA-pMW-xpk1을 수득할 수 있다.

에세리치아 콜리 균주 702ilvA 및 702ilvA-pMW-xpk1은 모두 L-한천 평판 배지에서 37℃하에 18 내지 24시간 동안 증식시킬 수 있다. 그 다음, 균주들의 배양 은 전술한 바와 같은 조건에서 수행할 수 있다.

에세리치아 콜리 균주 57-pMW-xpk1에 의한 L-류신의 생산

pMW-xpk1 플라스미드를 이용한 에세리치아 콜리 L-류신 생산 균주 57(VKPM B-7386, 러시아 특허 6,124,121)의 형질전환은 통상의 방법으로 수행하여 균주 57-pMW-xpk1을 수득할 수 있다.

에세리치아 콜리 균주 57 및 57-pMW-xpk1은 모두 L-한천 평판 배지에서 37℃하에 18 내지 24시간 동안 증식시킬 수 있다. 그 다음, 균주들의 배양은 배지에 이소류신을 첨가함이 없이 전술한 바와 같은 조건에서 수행할 수 있다.

에세리치아 콜리 균주 JM15(ydeD)-pMW-xpk1에 의한 L-시스테인의 생산

pMW-xpk1 플라스미드에 의한 에세리치아 콜리 L-시스테인 생산 균주 JM15(ydeD)의 형질전환은 통상의 방법으로 수행하여 균주 JM15(ydeD)-pMW-xpk1을 수득할 수 있다.

에세리치아 콜리 균주 JM15(ydeD)는 임의의 L-아미노산의 생합성 경로에 관여하지 않고(미국 특허 5,972,663), 막 단백질을 암호화하는 ydeD 유전자를 보유한 DNA로 형질전환할 수 있는 에세리치아 콜리 균주 JM15의 유도체이다(미국 특허 6,218,168).

L-시스테인 생산을 평가하기 위한 발효 조건은 미국 특허 6,218,168의 실시예 6에 상세하게 설명되어 있다.

판토에아 아나나티스 균주 AJ13356-xpk1에 의한 L-글루탐산의 생산

pMW-xpk1 플라스미드를 이용한 L-글루탐산 생산성 엔테로박터 애글로메란스 AJ13356 균주(미국 특허 6,331,419)(최근 판토테아 아나나티스로 재분류됨)의 형질전환은 통상의 방법에 따라 수행하여 균주 AJ13356-pMW-xpk1을 수득할 수 있다.

AJ13356 및 AJ13356-xpk1 균주는 각각 40g/L 글루코스, 20g/L 황산암모늄, 0.5g/L 황산마그네슘 7수화물, 2g/L 인산이수소칼륨, 염화나트륨 0.5g/L, 염화칼슘 7수화물 0.25g/L, 0.02g/L 황산제일철 7수화물, 0.02g/L 황산망간 4수화물, 0.72mg/L 황산아연 2수화물, 0.64mg/L 황산구리 5수화물, 0.72mg/L 염화코발트 6수화물, 0.4mg/L 붕산, 1.2mg/L 몰리브덴산나트륨 2수화물, 2g/L 효모 추출물, 30g/L 탄산칼슘, 200mg/L L-리신 모노하이드로클로라이드, 200mg/L L-메티오닌 및 200mg/L DL-α,ε-디아미노피멜산(DAP)을 함유하는 배양 배지 20ml가 주입된 500ml 용량 플라스크에 접종하여, 배양 배지에 함유된 글루코스가 모두 소비될 때까지 37℃에서 진탕 배양할 수 있다. 배양 완료 후, 배양 배지에 축적된 L-글루탐산은 앞에서와 같이 측정할 수 있다.

실시예 6: 코리네형 세균을 이용한 포스포케톨라제 유전자의 생리적 활성 확인

(6-1) 포스포케톨라제 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드의 작제

(1) pVK9-xfp의 작제

xfp 유전자는 비피도박테리움 아니말리스 JCM1190의 염색체 DNA로부터 클로닝했다. 비피도박테리움 아니말리스 ATCC 27674(GenBank 수탁번호 AY518213, 서열번호 9)의 xfp 유전자에 대한 보고된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여, 서열번호 13 및 14에 게시된 프라이머를 합성할 수 있고, xfp 유전자의 증폭에 사용할 수 있다. 비피도박테리움 아니말리스 JCM1190은 일본미생물수집소(JCM)로부터 수득할 수 있다.

비. 아니말리스 JCM1190 유래 xfp 유전자의 DNA 서열은 서열번호 11에 제시했다.

비피도박테리움 아니말리스 JCM1190 유래의 xfp 유전자(서열번호 11)를 증폭시키고 pVK9 에세리치아 콜리-코리네폼 셔틀 벡터에 클로닝하기 위하여, 비피도박테리움 아니말리스 JCM1190의 염색체 DNA를 위자드 게놈 정제 키트(Promeg)를 이용하여 추출했다. pVK9는 복제성 기원을 포함한 영역을 수득하기 위한 목적으로 pHK4(JP5-007491A)를 BamHI 및 KpnI로 분해하고, 그 영역을 pHSG299(Takara Bio Inc. 제품)의 AvaII 부위에 삽입하여 수득한 에세리치아 콜리-코리네폼 셔틀 벡터이다. 프로모터 영역을 포함한 xfp 유전자 단편은 비. 아니말리스의 염색체 DNA를 주형으로 사용하고 프라이머로서 서열번호 13 및 14에 제시한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR은 통상의 방법에 따라 수행했다.

수득되는 PCR 산물은 통상의 방법으로 정제하고 XbaI로 분해했다. 분해된 PCR 산물을, 연결 키트(Ligation Kit, Takara Bio Inc. 제품)를 사용하여 XbaI로 분해된 pVK9에 연결시켰다. 연결 혼합물을 사용하여 에세리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시켰다. 세포를 IPTG 100μM, X-Gal 40mg/ml 및 Km 25mg/ml를 함유하는 LB 배지(1L 중에 박토 트립톤 10g, 박토 효모 추출물 5g 및 NaCl 10g)에 도말하고 하룻밤 동안 배양했다. 그 다음, 나타나는 백색 콜로니를 선발하고 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 이러한 형 질전환체로부터 xfp 유전자를 함유하는 대상 플라스미드 pVK9-xfp를 분리했다.

(2) pVK9-PS2_xfp의 작제

비. 아니말리스 xfp 유전자의 천연 프로모터 영역을 PS2 프로모터(Peyret JL, Mol Microbiol. 1993 Jul; 9(1): 97-109, WO9303158)로 대체한 DNA 단편은 오버랩 PCR 법(R.M.Horton, H.D.Hunts, S.M.Ho, J.K.Pullen, and L.R.Pease, Gene, 77, 61-68(1989))에 따라 수득했다. 이 방법을 이하에 상세히 설명한다.

먼저, 주형으로서 PS2 프로모터(Y.Kikuchi, M.Date, K.Yokoyama, Y.umezawa and H.Matsui, Appl.Environ.Microbiol. 69, 358-366(2003))를 함유하는 pPSTG1과 프라이머로서 서열번호 15 및 16의 합성 DNA를 이용하는 PCR을 수행하여 PS2 프로모터의 증폭 산물을 수득했다. 그 다음, xfp 유전자 서열(암호 영역)의 증폭 산물을 수득하기 위하여, 주형으로서 pVK-xfp를, 프라이머로서 서열번호 17 및 18의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행했다. 서열번호 16 및 18은 서로 상보성이다.

그 다음, PS2 프로모터와 비. 아니말리스 xfp 유전자를 함유하는 단편을 수득하기 위하여, PS2 프로모터의 전술한 유전자 단편과 비. 아니말리스 xfp 유전자를 거의 등몰의 양으로 혼합하고, 이 혼합물을 주형으로서, 서열번호 14 및 19의 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행했다.

그 결과 수득되는 PCR 산물은 통상의 방식으로 정제하고 XbaI로 분해했다. 분해된 PCR 산물은 연결 키트(Takara Bio Inc 제품)를 이용하여, XbaI로 분해된 pVK9에 연결시켰다. 이 연결 혼합물을 사용하여 에세리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시켰다. 이 세포를 IPTG 100μM, 40mg/ml X-Gal 및 25mg/ml Km을 함유하는 LB 배지(1L 중에 10g 박토 트립톤, 5g 박토 효모 추출물 및 10g NaCl)에 도말하고 하룻밤 동안 배양했다. 그 다음, 나타나는 백색 콜로니를 선발하고 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 이러한 형질전환체로부터 PS2 프로모터와 xfp 유전자를 함유하는 대상 플라스미드 pVK9-PS2_xfp를 분리했다.

(3) pVK9-tac_xfp의 작제

비. 아니말리스 xfp 유전자의 천연 프로모터 영역을 tac 프로모터로 대체한 DNA 단편은 오버랩 PCR 법(R.M.Horton, H.D.Hunts, S.M.Ho, J.K.Pullen, and L.R.Pease, Gene, 77, 61-68(1989))에 따라 수득했다. 이 방법을 이하에 상세히 설명한다.

먼저, 주형으로서 pKK223-3(Pharmacia)을, 프라이머로서 서열번호 20 및 21의 합성 DNA를 이용하여 PCR을 수행하여 tac 프로모터의 증폭 산물을 수득했다. 그 다음, xfp 유전자 서열(암호 영역)의 증폭 산물을 수득하기 위하여, 주형으로서 비. 아니말리스 JCM1190의 염색체 DNA를, 프라이머로서 서열번호 14 및 22의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행했다. 서열번호 20 및 22의 뉴클레오타이드 서열은 서로 상보성이다.

그 다음, tac 프로모터와 비. 아니말리스 xfp 유전자를 함유하는 단편을 수득하기 위하여, tac 프로모터의 전술한 유전자 단편과 비. 아니말리스 xfp 유전자를 거의 등몰의 양으로 혼합하고, 이 혼합물을 주형으로서, 서열번호 14 및 21의 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행했다.

그 결과 수득되는 PCR 산물은 통상의 방식으로 정제하고 XbaI로 분해했다. 분해된 PCR 산물은 연결 키트(Takara Bio Inc 제품)를 이용하여, XbaI로 분해된 pVK9에 연결시켰다. 이 연결 혼합물을 사용하여 에세리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시켰다. 이 세포를 IPTG 100μM, 40mg/ml X-Gal 및 25mg/ml Km을 함유하는 LB 배지(1L 중에 10g 박토 트립톤, 5g 박토 효모 추출물 및 10g NaCl)에 도말하고 하룻밤 동안 배양했다. 그 다음, 나타나는 백색 콜로니를 선발하고 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 이러한 형질전환체로부터 tac 프로모터와 xfp 유전자를 함유하는 대상 플라스미드 pVK9-tac_xfp를 분리했다.

(4) pVK9-PS2_xpkA의 작제

락토바실러스 펜토수스 JCM1558의 염색체 DNA로부터 xpkA 유전자를 클로닝했다. 락토바실러스 펜토수스 JCM1558은 일본미생물수집소(JCM)에서 수득할 수 있다. 락토바실러스 펜토수스 JCM1558로부터 포스포케톨라제를 암호화하는 xpkA 유전자(서열번호 1; AJ309011:gi:16605513)를 증폭시키기 위하여, 락토바실러스 펜토수서 JCM1558의 염색체 DNA를 워저드 게놈 정제 키트(Promega)를 이용하여 추출했다.

포스포케톨라제를 암호화하는 엘. 펜토수스 xpkA 유전자의 프로모터 영역을 오버랩 PCR법에 따라 PS2 프로모터로 대체하여 DNA 단편을 수득했다. 이 방법을 이하에 상세히 설명한다.

먼저, 주형으로서 PS2 프로모터(Y.Kikuchi, M.Date, K.Yokoyama, Y.umezawa and H.Matsui, Appl.Environ.Microbiol. 69, 358-366(2003))를 함유하는 pPSTG1과 프라이머로서 서열번호 15 및 23의 합성 DNA를 이용하는 PCR을 수행하여 PS2 프로모터의 증폭 산물을 수득했다. 그 다음, xpkA 유전자(암호 영역) 서열의 증폭 산물을 수득하기 위하여, 주형으로서 락토바실러스 펜토수스 JCM1558의 염색체 DNA를, 프라이머로서 서열번호 24 및 25의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행했다. 서열번호 23 및 25의 뉴클레오타이드 서열은 서로 상보성이다.

그 다음, PS2 프로모터와 엘. 펜토수스 xpkA 유전자를 함유하는 단편을 수득하기 위하여, PS2 프로모터의 전술한 유전자 단편과 엘. 펜토수스 xpkA 유전자를 거의 등몰의 양으로 혼합하고, 이 혼합물을 주형으로서, 서열번호 19 및 24의 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행했다.

그 결과 수득되는 PCR 산물은 통상의 방식으로 정제하고 XbaI로 분해했다. 분해된 PCR 산물은 연결 키트(Takara Bio Inc 제품)를 이용하여, XbaI로 분해된 pVK9에 연결시켰다. 이 연결 혼합물을 사용하여 에세리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시켰다. 이 세포를 IPTG 100μM, 40mg/ml X-Gal 및 25mg/ml Km을 함유하는 LB 배지(1L 중에 10g 박토 트립톤, 5g 박토 효모 추출물 및 10g NaCl)에 도말하고 하룻밤 동안 배양했다. 그 다음, 나타나는 백색 콜로니를 선발하고 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 이러한 형질전환체로부터 PS2 프로모터와 xpkA 유전자를 함유하는 대상 플라스미드 pVK9-PS2_xpkA를 분리했다.

(6-2) 포스포케톨라제의 생체내 생리 활성 확인

(1) ATCC13869△aceE 균주의 작제

PDH 결손 균주는 아세트산염 영양요구성이다. 반면, 포스포케톨라제 유전자가 도입된 PDH(피루베이트 데하이드로게나제) 결손 균주는 더 이상 아세트산염의 영양요구성이 아닐 것이다. 이에 따라, xfp 또는 xpkA 유전자의 도입 효과를 확인했다.

유전자 붕괴 벡터의 작제

(A) pBS3의 작제

PCR 주형으로서 바실러스 서브틸리스의 염색체 DNA를, 프라이머로서 서열번호 42 및 43의 합성 DNA를 사용하여 sacB 유전자(서열번호 40)를 PCR를 수득했다. PCR 반응은 94℃에서 5분간을 유지하는 1회 사이클 후, 94℃에서 30초, 49℃에서 30초, LA Taq(TaKaRa Bio)를 이용한 72℃에서 2분간의 사이클을 25회 반복하여 수득했다. 그 다음, PCR 산물을 Bg1II 및 BamHI으로 분해하고, 통상의 방법으로 정제한 후 평활말단화했다. 수득되는 PCR 산물을, AvaII로 분해한 pHSG299와 연결시킨 뒤, 평활말단화했다. 이 플라스미드를 이용하여 에세리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc.)를 형질전환시킨 뒤, 이 형질전환체를 카나마이신 25mg/ml을 함유하는 LB 배지에 현탁시킨 뒤, 하룻밤 동안 배양했다. 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리한 뒤, 형질전환체를 수득했다. 이 형질전환체로부터 sacB 유전자를 함유하는 대상 플라스미드 pBS3을 분리했다.

pBS3의 작제 절차는 도 2에 도시했다.

(B) pBS4S의 작제

플라스미드 pBS3의 카나마이신 내성 유전자의 암호 영역에 존재하는 SmaI 부 위를 절단한 뒤, 오버랩 PCR을 통해 플라스미드를 수득했다. 먼저, 주형으로서 pBS3을, 프라이머로서 서열번호 44 및 45의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 카나마이신 내성 유전자의 N 말단 영역을 함유하는 PCR 산물을 수득했다. 한편, 카나마이신 내성 유전자의 C 말단 영역을 함유하는 PCR 산물을 수득하기 위하여, 주형으로서 pBS3과 프라이머로서 서열번호 46 및 47의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행했다. 이 PCR 산물은 98℃에서 5분간의 열처리 1사이클 후, 98℃에서 10초, 57℃에서 30초, 그 다음 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara Bio Inc.)를 이용한 72℃에서 1분간의 사이클을 25회 반복하여 수득할 수 있다. 서열번호 45 및 46의 뉴클레오타이드 서열은 서로 부분적으로 상보성이다.

이 서열의 SmaI 부위는 아미노산 치환 없이 돌연변이를 도입시켜 붕괴했다. SmaI 부위가 붕괴되는 돌연변이 카나마이신 내성 유전자 단편을 수득하기 위하여, 이 유전자 산물의 N 말단 영역과 카나마이신 내성 유전자의 유전자 산물의 C 말단 영역을 혼합하여 거의 등몰의 혼합물을 만들었다. 결과적으로 수득되는 혼합물을 PCR 주형으로서, 서열번호 44 및 47의 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행했다. 카나마이신 내성 유전자에 돌연변이가 있는 PCR 산물을 수득했다. 대상 PCR 산물은 98℃에서 5분간의 열처리 1사이클 후, 98℃에서 10초, 57℃에서 30초, 그 다음 Pyrobest DNA Polymerase(Takara Bio Inc.)를 이용한 72℃에서 1.5분간의 사이클을 25회 반복하여 수득할 수 있다.

PCR 산물을 정제 후 BanII로 분해하고, 전술한 pBS3의 BanII 부위에 삽입했다. 수득되는 DNA를 이용하여 에세리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시키고, 25mg/ml 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 현탁시킨 다음, 하룻밤 동안 배양했다. 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리한 뒤, 형질전환체를 수득했다. 형질전환체로부터 대상 플라스미드 pBS4S를 분리했다. pBS4S의 작제 절차는 도 3에 도시했다.

(C) pBS5T의 작제

코리네형 세균 유래의 온도 민감성 복제 오리진을 보유한 플라스미드 pBS5T는 다음과 같은 절차에 따라 작제했다.

온도 민감성 복제 영역은 pHSC4(US5616480A)를 BamHI 및 SmaI로 분해하여 수득하고, 분해된 단편을 평활 말단화한 뒤, 이 영역을 pBS4S의 평활말단화된 NdeI 부위에 연결시켰다. 수득된 DNA를 이용하여 에세리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시키고, 형질전환체를 25mg/ml Km을 함유하는 LB 배지에 현탁시킨 뒤, 하룻밤 동안 배양했다. 콜로니를 채취하여 단일 콜로니를 분리한 뒤, 형질전환체를 수득했다. 이 형질전환체로부터 sacB 단편과 온도 민감성 복제 오리진을 함유하는 대상 플라스미드 pBS5T를 분리했다. 도 4는 pBS5T의 작제 개요를 도시한 것이다.

(2) aceE 유전자 붕괴용 단편의 클로닝

피루베이트 데하이드로게나제(피루베이트 데하이드로게나제 E1 성분)를 암호화하는 aceE 유전자가 붕괴된 DNA 단편은 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032(GenBank Database 수탁번호 NC003450; 서열번호 38)의 aceE 유전자로 보고된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 한 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 오버랩 PCR법을 통해 ATCC13869로부터 수득했다.

먼저, PCR은 씨. 글루타미컴 ATCC13869의 염색체 DNA를 주형으로서 이용하고 서열번호 26 및 27의 합성 DNA를 프라이머로서 이용하여 수행함으로써, aceE 유전자의 N 말단 측의 증폭 산물을 수득했다. 그 다음, aceE 유전자의 C 말단 측의 증폭 산물을 수득하기 위하여, 주형으로서 씨. 글루타미컴 ATCC13869의 염색체 DNA, 프라이머로서 서열번호 28 및 29의 합성 DNA를 이용하여 PCR을 수행했다. 서열 26 및 28의 서열은 서로 상보성이다.

그 다음, 내부 서열이 결실된 aceE 단편을 수득하기 위하여, N 말단 및 C 말단의 전술한 유전자 단편을 거의 등몰의 양으로 혼합하고, 이 혼합물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 30 및 31의 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행했다.

그 결과 수득되는 PCR 산물은 통상의 방법으로 정제하고, SmaI으로 분해했다. 분해된 PCR 산물은 연결 키트(Takara Bio Inc. 제품)를 이용하여, SmaI으로 분해된 전술한 pBS5T에 연결시켰다. 연결 혼합물을 이용하여 에세리치아 콜리 DH5α 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시켰다. IPTG 100μM, X-Gal 40mg/ml 및 Km 25mg/ml를 함유하는 LB 배지(1L 중에 10g 박토 트립톤, 5g 박토 효모 추출물 및 10g NaCl)에 세포를 도말하여 하룻밤 동안 배양했다. 나타나는 백색 콜로니를 선발하고 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 이러한 형질전환체로부터 대상 플라스미드 pBS5T-△aceE를 분리했다.

(3) aceE 붕괴된 균주의 작제

먼저, ATCC 13869 균주는 전기 펄스법을 통해 고농도 플라스미드 pBS5T-△aceE로 형질전환시킨 뒤, 25mg/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 배지(5g/L 글루코스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·7H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물 및 10㎍/L 비오틴, pH 7.5(NaOH)) 위에 도말하고, 25℃에서 약 60시간 동안 배양한 다음, 나타나는 콜로니를 선발하고 형질전환체로서 분리했다. 그 다음, 형질전환체를 CM-Dex 액체 배지에서 34℃ 하에 하룻밤 동안 배양했다. 적당히 희석한 후, 배양된 형질전환체를 25mg/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 배지에 현탁시킨 후, 34℃에서 약 30시간 동안 배양했다. 이 배지에서 증식할 수 있고 카나마이신 내성 유전자와 플라스미드 유래 sacB 유전자를 염색체 위에 모두 보유하는 △aceE 균주는 플라스미드 위의 aceE 유전자의 붕괴형(△aceE)과 염색체의 천연 aceE 유전자 사이에 1회 크로스오버 상동성 재조합의 결과로서 수득했다.

그 다음, 단일 크로스오버 상동성 재조합을 통해 수득한 △aceE 균주를 CM-Dex 액체 배지에서 31.5℃ 하에 하룻밤 동안 배양했다. 적당히 희석한 후, 1회 크로스오버 상동성 재조합체 △aceE 균주를 카나마이신을 첨가하지 않은 10% 슈크로스 함유 Dex-S10 배지(10g/L 슈크로스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·4H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물, 10㎍/L 비오틴 및 2g/L 아세트산나트륨, pH 7.5(KOH)로 조정)에 현탁시켰다. 배양은 34℃에서 약 30시간 동안 수행했다. 2차 크로스오 버 상동성 재조합의 결과로서, 염색체 sacB 유전자를 보유하지 않고 슈크로스에 민감하지 않은 균주를 수득했다.

이러한 방식으로 수득한 균주에는 aceE 유전자의 붕괴형을 보유한 균주 및 야생형 aceE 유전자를 보유한 균주가 포함된다. aceE 유전자가 붕괴형 또는 야생형인지의 여부는 Dex-S10 한천 배지에서 배양하여 수득한 세포를 사용하여 직접 PCR 반응을 통해 확인했다. aceE 유전자의 붕괴형을 함유하는 균주를 선발하여 "ATCC13869△aceE"라 명명했다.

(4) △aceE 균주에서 포스포케톨라제의 생리적 활성 평가

pVK9(대조군 플라스미드), pVK9-xfp(비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자 증폭용 플라스미드), pVK9-PS2_xfp(천연 프로모터를 PS2 프로모터로 치환시킨 비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자 증폭용 플라스미드), 및 pVK9-PS2_xpkA(천연 프로모터를 PS2 프로모터로 치환시킨, 락토바실러스 펜토수스의 xpkA 유전자 증폭용 플라스미드)를 각각 ATCC13869△aceE 균주에 도입시켜 포스포케톨라제 발현 균주를 수득하고, 대조군으로서 pVK9를 ATCC13869에 도입시켰다. 구체적으로, ATCC13869△aceE 균주와 ATCC13869 균주는 각각 전기 펄스법으로 형질전환시키고, 25mg/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 배지(5g/L 글루코스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·7H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물 및 10㎍/L 비오틴, pH 7.5(NaOH)) 위에 도말하고, 31.5℃에서 약 30시간 동안 배양했다. 나타나는 콜로니 를 형질전환체로서 분리하여 각각 ATCC13869△aceE (pVK9), ATCC13869△aceE (pVK9-xfp), ATCC13869△aceE (pVK9-PS2_xfp), ATCC13869△aceE (pVK9-PS2_xpkA) 및 ATCC13869(pVK9)라 명명했다.

이러한 균주들을 마이크로진탕기("Biophotorecorder TN-1506", ADVANTEC 제품)에서 배양하고, 시간의 함수로서 OD를 측정했다. 여기서는 2가지 배지를 이용했다. 그 하나는 25mg/ml 카나마이신을 함유하는 최소 액체 배지(10mg/ml 글루코스, 2.5g/L (NH₄)₂SO₄, 0.5g/L KH₂PO₄, 0.25g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·7H₂O, 2g/L 우레아, 50㎍/L 비오틴, 100ml VB1-HCl, 15mg/L 프로토카테추산, 0.02mg/L CuSO₄, 10mg/ml CaCl₂ 및 40g/L MOPS, KOH로 pH 7.0으로 조정), 및 아세트산염(2g/L 아세트산나트륨)을 함유하는 최소 액체 배지에서 배양했다. 최소 배지에서의 배양 결과 및 아세트산염을 함유하는 최소 배지에서의 배양 결과는 각각 도 6과 5에 도시했다. ATCC13869△aceE(pVK9) 균주는 아세트산염 함유 최소 배지에서 증식할 수 있는 반면, 상기 최소 배지에서는 증식할 수 없는 바, 아세트산염 영양요구성을 나타냈다. pvK9-xfp, pVK9-PS2_xfp, 및 pVK9-PS2_xpkA를 각각 보유하는 ATCC13869△aceE 균주는 각각 최소 배지에서도 증식할 수 있었는데, 이것은 xfp 또는 xpkA의 도입이 PDH 결손 균주의 아세트산염 영양요구성을 보충할 수 있음을 보여주는 것이다. 따라서, 씨. 글루타미컴으로 도입된 포스포케톨라제의 생리적 활성이 확인되었다.

실시예 7. 포스포케톨라제 효소 활성의 확인

코리네형 세균은 배지에서 비오틴이 제한되거나, 페니실린 또는 계면활성제가 첨가된 조건 하에서 L-글루탐산을 생산할 수 있다(WO95/34672 참조). 하지만, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성(E1.2.4.2 sucA; 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제)이 저하되도록 변형된 균주는 그러한 조건 하에서도 L-글루탐산을 생산할 수 있다는 것이 공지되어 있다(Kimura E., Adv.Biochem.Eng.Biotechnol., 79, 37-57(2003), "Metabolic engineering of glutamic acid production"). 따라서, sucA 결손 균주 씨. 글루타미컴 ATCC13869를 이용하여, 포스포케톨라제 유전자의 도입 시 L-글루탐산의 발효 수율이 개선되는 것에 대해 연구했다.

(7-1) ATCC13869△sucA 균주의 작제

(1) sucA 유전자 붕괴용 단편의 클로닝

씨. 글루타미컴 ATCC13869 유래의 sucA 결손 단편은 씨. 글루타미컴 ATCC13032의 뉴클레오타이드 서열 sucA 유전자(GenBank Database Accession No. NC_003450; 서열번호 48)를 기초로 하여 설계한 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 오버랩 PCR법으로 수득했다.

먼저, 주형으로서 씨. 글루타미컴 ATCC13869의 염색체 DNA를 이용하고 프라이머로서 서열번호 32 및 33의 합성 DNA를 이용하여 PCR을 수행함으로써, sucA 유전자의 N-말단의 증폭 산물을 수득했다. 그 다음, sucA 유전자의 C 말단의 증폭 산물을 수득하기 위하여, 주형으로서 씨. 글루타미컴 ATCC13869의 염색체 DNA를 이용하고 프라이머로서 서열번호 34 및 35의 합성 DNA를 이용하여 PCR을 수행했다. 서 열번호 33 및 34의 서열은 서로 상보성이다.

그 다음, 내부 서열이 결실된 sucA 단편을 수득하기 위하여, 전술한 N 말단 및 C 말단의 유전자 단편을 거의 등몰 양으로 혼합하고, 이 혼합물을 주형으로서 이용하고, 서열번호 36 및 37의 합성 DNA를 프라이머로서 이용하여 PCR을 수행했다.

그 결과 수득되는 PCR 산물을 통상의 방법으로 정제하여 BamHI로 분해했다. 분해된 PCR 산물은 연결 키트(Takara Bio Inc 제품)를 이용하여, BamHI으로 분해된 전술한 pBS3에 연결시켰다. 이러한 연결 혼합물을 이용하여 에세리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시켰다. 이 세포를 100μM IPTG, 40mg/ml X-Gal 및 25mg/ml Km을 함유하는 LB 배지(1L 중에 10g 박토 트립톤, 5g 박토 효모 추출물 및 10g NaCl)에 도말하여, 하룻밤 동안 배양했다. 그 다음, 나타나는 백색 콜로니를 선발하고, 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 이 형질전환체로부터 대상 플라스미드 pBS3△sucA를 분리했다.

(2) sucA 붕괴 균주의 제조

(1)에서 제조된 pBS3△sucA 는 코리네형 세균의 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 영역을 함유하지 않는다. 따라서, 코리네박테리움을 상기 플라스미드로 형질전환시키면, 상동성 재조합에 의하여 그 염색체에 상기 플라스미드가 통합된 균주는 극히 낮은 빈도일지라도 형질전환체로서 나타날 것이다. 씨. 글루타미컴 ATCC13869를 전기 펄스법을 이용하여 고농도의 플라스미드 pBS3△sucA 로 형질전환시키고, 25mg/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 배지(5g/L 글루코스, 10g/L 폴리펩 톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·7H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물 및 10㎍/L 비오틴, pH 7.5(NaOH)) 위에 도말하고, 31.5℃에서 약 30시간 동안 배양한 다음, 나타나는 콜로니를 형질전환체로서 분리했다. 이러한 형질전환체는 플라스미드의 sucA 유전자 단편과 염색체 상의 천연 유전자 사이의 상동성 재조합의 결과로서, 상기 플라스미드 유래의 ScaB 유전자와 카나마이신 내성 유전자를 모두 보유한다.

그 다음, 수득한 1차 재조합체 균주를 카나마이신 무첨가 CM-Dex 액체 배지에서 31.5℃ 하에 하룻밤 동안 배양했다. 배양된 형질전환체를 적당히 희석한 후, 카나마이신 무첨가 10% 슈크로스 함유 Dex-S10 배지(10g/L 슈크로스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·4H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물 및 10㎍/L 비오틴, pH 7.5(KOH)로 조정)에 도말하고, 31.5℃에서 약 30시간 동안 배양한 후, 나타나는 콜로니를 형질전환체로서 분리했다. 2차 크로스오버 상동성 재조합의 결과로서, 염색체 유래의 SacB 유전자를 보유하지 않고 슈크로스에 민감하지 않은 균주를 수득했다.

이러한 방식으로 수득한 균주에는 sucA 유전자의 붕괴형을 보유한 균주 및 야생형 sucA 유전자를 보유한 균주가 포함된다. sucA 유전자가 붕괴형 또는 야생형인지의 여부는 Dex-S10 한천 배지에서 배양하여 수득한 세포를 사용하여 직접 PCR 반응을 통해 확인했다. sucA 유전자의 붕괴형을 함유하는 균주를 선발했다.

sucA 붕괴된 균주에 의한 L-글루탐산의 생산은 다음과 같은 방법으로 평가했다. CM2B 평판 배지에서 배양하여 수득한 sucA 붕괴 균주의 세포를 80g 글루코스, 1g KH₂PO₄, 0.4g MgSO₄, 30g (NH₄)₂SO₄, 0.01g FeSO₄·7H₂O, 0.01g MnSO₄·7H₂O, 15ml 대두 가수분해물 용액, 200mg 티아민 염산염, 60㎍ 비오틴 및 50g CaCO₃를 1L 정제수에 함유(KOH로 pH 8.0으로 조정)하는 플라스크에 접종하고, 당이 완전히 소비될 때까지 31.5℃에서 진탕 배양했다. 배양 완료 후, 배양액에 축적된 L-글루탐산의 양을 측정했다. L-글루탐산 발효 수율이 ATCC13869보다 높게 나타날 수 있는 sucA 붕괴 균주를 ATCC13869의 sucA 붕괴 균주로서 선발하여, ATCC13869△sucA로 명명했다.

(7-2) sucA 붕괴된 ATCC13869 균주에서 포스포케톨라제 유전자 발현 및 효소 활성의 확인

포스포케톨라제 발현의 증강을 위해 변형시킨 균주를 이용하여 포스포케톨라제 활성 및 이의 효소 활성을 조사했다.

pVK9(대조군 플라스미드), pVK9-xfp(비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자 증폭용 플라스미드), pVK9-tac_xfp(천연 프로모터를 tac 프로모터로 치환시킨 비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자 증폭용 플라스미드), 및 pVK9-tac_xfp(천연 프로모터를 tac 프로모터로 치환시킨, 비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자 증폭용 플라스미드), pVK9-PS2_xfp(천연 프로모터를 PS2 프로모터로 치환시킨, 비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자 증폭용 플라스미드), 및 pVK9-PS2_xpkA(천 연 프로모터를 PS2 프로모터로 치환시킨, 락토바실러스 펜토수스의 xpkA 유전자 증폭용 플라스미드)를 각각 전술한 씨. 글루타미컴 ATCC13869△sucA 균주에 도입시켜 포스포케톨라제 발현 균주를 수득했다. 구체적으로, ATCC13869△sucA 균주를 각각 전기 펄스법으로 각 플라스미드로 형질전환시키고, 25mg/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 배지(5g/L 글루코스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·7H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물 및 10㎍/L 비오틴, NaOH로 pH 7.5로 조정) 위에 도말하고, 31.5℃에서 약 30시간 동안 배양했다. 나타나는 콜로니를 형질전환체로서 분리하여 각각 ATCC13869△sucA (pVK9), ATCC13869△sucA (pVK9-xfp), ATCC13869△sucA (pVK9-tac_xfp), ATCC13869△sucA(pVK9-PS2_xfp) 및 ATCC13869△sucA (pVK9-PS2_xpkA)라 명명했다.

미정제 효소 용액을 수득하기 위하여, 각 균주를 CM-Dex 평판 배지에서 배양하여 수득한 상기 균주들의 세포들을 30g 글루코스, 1g KH₂PO₄, 0.4g MgSO₄, 15g (NH₄)₂SO₄, 0.01g FeSO₄·7H₂O, 0.01g MnSO₄·7H₂O, 13.7ml 대두 가수분해물 용액, 200mg 티아민 염산염, 300㎍ 비오틴 및 50g CaCO₃를 1L 정제수에 함유(KOH로 pH 8.0으로 조정)하는 플라스크에 접종하고, 31.5℃에서 진탕 배양했다. "히다치 분광분석계 U-2000A"로 측정했을 때, OD620 세포 농도가 15가 되면 배양을 종결했다. 3000rpm에서 30초 간의 적당한 원심분리를 통해 탄산칼슘을 제거한 후, 세포를 수거했다. 다음과 같은 절차를 0 내지 4℃에서 수행했다. 수거한 세포를 0.85N NaCl 용액으로 2회 세척하고, 완충액 A(100mM KPO₄(pH 6.5, 30mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM MgCl₂, 0.2mM PMSF, 2mM DTT) 4ml/g(습윤 중량)에 재현탁시켰다. 세포를 초음파 세포 붕괴기("Bioruptor")로 붕괴시켰다. 붕괴되지 않은 세포는 원심분리(15,000g, 60min)하여 제거하여 미정제 효소 용액을 수득했다. 이러한 미정제 효소 용액 중의 단백질 농도는 표준 시료로서 소 혈청 알부민을 이용하는 CBB 용액(단백질 분석 CBB 용액, Nacalai Tesque 제품)을 이용하여 정량분석했다.

미정제 효소 용액 중의 단백질은 SDS-PAGE로 분리했다. 이러한 분리의 구체적인 절차는 다음과 같다. 미정제 효소 용액을 농도를 조정한 후, 시료 완충액("Laemmli 시료 완충액", BIORAD 제품)과 1:1의 비율로 혼합했다. 95℃에서 2분 동안 가열한 후, 수득되는 혼합물을 적용되는 단백질 함량이 10㎍이 되도록 "Ready Gel J 10%"(BIORAD 제품)에 적용하고, 정전압 200V 하에 MiniProtean III Cell phoresis tank(BIORAD 제품)에서 40분 동안 전기영동했다. 전기영동 완충액으로는, 트리스/글리신/SDS(BIORAD)를 사용했다. 염색 후, 쿠마시 브릴리언트 블루("Bio Safe Coomassie", BIORAD)를 사용했다. 그 결과는 도 7에 제시했다(마커: BIORAD 제품, 프레시젼 플러스 단백질 표준물(#161-0363)).

도 7의 레인 1 내지 5는 ATCC13869△sucA(pVK9), ATCC13869△sucA(pVK9-xfp), ATCC13869△sucA(pVK9-tac_xfp), ATCC13869△sucA(pVK9-PS2_xfp) 및 ATCC13869△sucA(pVK9-PS2_xpkA)를 각각 나타낸다. 대조군 밴드(pVK9)와 비교 시, 포스포케톨라제 유전자 산물에 해당하는 약 90kD 밴드는 포스포케톨라제 활성이 증 강되도록 변형시킨 균주에서 더욱 진해졌다. 이는, 포스포케톨라제 유전자 발현의 충분한 양이 코리네형 세균에서 발생된다는 것을 암시한다.

마일레법(L. Meile, L.M.Rohr, T.A. Geissmann, M.Herensperger and M.Teuber, J.Bacteriol. 183, 2929-2936(2001))에 따라, 포스포케톨라제 유전자의 효소 활성을 측정했다. 미정제 효소 용액(33.3mM KPO₄(pH 6.5), 1.9mM L-시스테인 염산염, 23mM 플루오르화나트륨, 8mM 요오도아세트산나트륨 및 27mM D-프럭토스 6-포스페이트) 0.075ml와 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 하이드록실아민 염산염(2M, pH 6.5) 0.075ml를 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 10분 동안 반응시킨 다음, 15%(wt/vol) 트리클로로아세트산 0.05ml, 4M HCl 0.05ml 및 FeCl₃·6H₂O(0.1M HCl 중에, 5% wt/vol) 0.05ml로 염색했다. 원심분리를 통해 결정을 제거한 후, OD505를 효소 활성 판독기("Spectra max 190", Molecular Devices 제품)를 사용하여 측정했다.

그 결과는, 이하 표 3에 제시했다. 대조군(pVK9)에서는 효소 활성이 전혀 검출되지 않는 반면, 포스포케톨라제 활성이 증강된 균주에서는 효소 활성이 검출되었다.

실시예 8: 포스포케톨라제 활성이 증강된 세균의 L-글루탐산 생산능 평가

(8-1) 충분한 양의 비오틴을 함유하는 조건 하에서의 평가

균주 씨. 글루타미컴 ATCC13869 △sucA를 이용하여, L-글루탐산의 발효 수율에 미치는 포스포케톨라제 유전자의 도입 효과를 평가했다. CM-Dex 평판 배지에서 배양하여 수득한 ATCC13869△sucA (pVK9), ATCC13869△sucA (pVK9-xfp), ATCC13869△sucA(pVK9-PS2_xfp) 및 ATCC13869△sucA (pVK9-PS2_xpkA) 균주의 세포를 30g 글루코스, 1g KH₂PO₄, 0.4g MgSO₄, 15g (NH₄)₂SO₄, 0.01g FeSO₄·7H₂O, 0.01g MnSO₄·7H₂O, 13.7ml 대두 가수분해물 용액, 200mg 티아민 염산염, 300㎍ 비오틴 및 50g CaCO₃를 1L 정제수에 함유(KOH로 pH 8.0으로 조정)하는 플라스크에 접종하고, 당이 완전히 소비될 때까지 31.5℃에서 진탕 배양했다. 배양 완료 후, 축적된 L-글루탐산의 양 및 배양액의 OD를 측정했다. 그 결과는 도 8에 도시했다. 이러한 결과는, xfp 유전자가 증폭된 모든 균주가 대조군에 비해 높은 L-글루탐산 수율을 나타낸다는 것을 보여준다.

(8-2) 페니실린이 첨가된 경우의 평가

최종 OD가 동등한 조건 하에서 평가하기 위하여, 페니실린 G를 첨가하여 세포 증식을 정지시켰다. L-글루탐산의 수율은 상기 (1)에 기술한 배지에 페니실린 G를 첨가하여, 배양 개시 후 OD가 10 내지 14 범위가 되었을 때 복수의 증식점에서 최종 농도가 4U/ml 이 되도록 하여 비교했다. 그 결과는 도 9에 제시했다. 이 결과들은 최종 세포수가 동일한 증식점일 때, L-글루탐산 수율을 비교하더라도, xfp 유전자 또는 xpk 유전자 증폭된 균주의 L-글루탐산 수율이 대조군 균주에 비해 높다는 것을 보여준다. 이와 같은 결과는 포스포케톨라제의 도입이 L-글루탐산 발효 수율의 개선에 효과적임을 입증해준다.

실시예 9. 판토에아 아나나티스 균주에 의한 L-글루탐산 축적에 미치는 비. 아니말리스의 xfp 유전자의 발현 효과

비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자를 발현하는 pVK9-PS2-xfp 플라스미드 및 대조군 pVK9 셔틀 벡터를 Bio-Rad MicroPulser를 이용한 전기침투(electroporation)를 통해 L-글루탐산 생산 균주 NP106/RSFCPG로 도입시켰다. NP106/RSFCPG 균주는 AJ13601 균주(FERM BP-7207; 유럽 특허 공개 1078989) 유래의 pSTVCB 플라스미드를 큐어링(curing)하고 선발 마커로서 클로람페니콜을 함유하지 않는 배지에서 AJ13601 균주를 평판배양하여 수득했다.

NP106/RSFCPG 균주를 pVK9-PS2-xfp 플라스미드 또는 pVK9 벡터로 형질전환시키기 위하여, 테트라사이클린(10㎍/ml)을 첨가한 LBG-M9 배지(트립톤(10g/L), 효모 추출물(5g/L), NaCl(5g/L), 글루코스(5g/L), 0.5x M9 염 용액)에서 하룻밤 동안 배양하여 수득한 세포를 새로운 LBG-M9 배지로 1:100의 비율로 희석하고, 호기 조건 하에 34℃에서 OD₅₉₅=0.6이 될 때까지 배양했다. 배양물 10ml를 원심분리하여 세포를 수거하고, 빙냉 탈이온수와 빙냉 10% 글리세롤로 3회 세척한 뒤, 10% 글리세롤에 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액에 플라스미드 DNA 10ng을 첨가하고, 전기 펄스(E=20kV/cm, t=5msec)를 가했다. 전기침투 후 즉시 LBG-M9 배지 1ml를 첨가했다. 호기 조건 하에 34℃에서 세포를 2시간 동안 배양하고, 40㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LBG-M9 고체 배지에 평판배양했다. 이 평판을 34℃에서 48시간 동안 배양했다. 증식된 클론은 카나마이신 40㎍/ml 및 테트라사이클린 10㎍/ml를 함유하는 LBG-MES 배지(트립톤(10g/L), 효모 추출물(5g/L), NaCl(5g/L), 글루코스(5g/L), MES 0.1M, pH 7.0) 2ml에 접종하고 34℃, 호기 조건 하에서 하룻밤 동안 배양했다. 하룻밤 배양된 세균 세포 함유 배지 80㎕를 시험관의 발효 배지(글루코스(40g/L), MgSO₄·7H₂O(0.5g/L), (NH₄)₂SO₄(16g/L), KH₂PO₄(0.3g/L), KCl(1.0g/L), MES(10g/L), 베타인(1.0g/L), FeSO₄·7H₂O(10mg/ml), MnSO₄·5H₂O(10mg/L), 리신, 메티오닌 및 DAP 각각 100mg/L, 트립톤(1g/L), 효모 추출물(1g/L), 판토텐산칼슘(10mg/L), CaCO₃(30g/L)) 2ml에 접종하고, 호기 조건 하에 26시간 동안 배양했다. 축적된 L-글루탐산 양은 TLC법으로 측정했다. 독립된 4회 실험의 평균 데이터는 표 4에 게시했다.

표 4에서 볼 수 있듯이, pVK9-PS2-xfp 플라스미드를 보유하는 균주는 벡터 pVK9로 형질전환된 대조군 균주보다 약 2.6g/L 많은 L-글루탐산 축적을 나타냈다. 이것은 적어도 6%의 수율 증가에 해당한다.

실시예 10. 포스포케톨라제 활성 증강 및 6-포스포프럭토키나제(PFK) 활성 감소의 조합에 의한 L-글루탐산 발효 수율의 개선

(10-1) sucA 및 PFK 이중 붕괴 균주의 제조

(1) pfk 유전자 붕괴용 플라스미드의 작제

ATCC13869 균주 유래의 pfk의 ORF가 결실된 유전자 단편은 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032의 해당 유전자의 뉴클레오타이스 서열(GenBank Database Accession No. NC_003450; 서열번호 61)을 기초로 하여 설계한 프라이머로서 합성 DNA를 사용하여 오버랩 PCR법으로 수득했다. 구체적으로, pfk 유전자의 N 말단 영역의 증폭 산물은 주형으로서 씨. 글루타미컴 균주 ATCC13869의 염색체 DNA를 이용하고 프라이머로서 서열번호 50 및 51의 합성 DNA를 이용하여 통상의 PCR법으로 수득했다. 한편, pfk 유전자의 C 말단 영역의 증폭 산물을 수득하기 위해서는 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 이용하고 프라이머로서 서열번호 52 및 53의 합성 DNA를 이용하여 통상의 PCR로 수행했다. 서열번호 51 및 53의 서열은 서로 상보성이다.

그 다음, 내부 서열이 결실된 pfk 유전자 단편을 수득하기 위하여, 전술한 pfk의 N 말단 및 C 말단 영역의 증폭 산물을 거의 등몰의 양으로 혼합하고, 이 혼합물을 주형으로 이용하고 프라이머로서 서열번호 54 및 55의 합성 DNA를 이용하여 통상의 PCR을 통해 유전자 증폭 산물을 수득했다. 이 PCR 산물은 통상의 방법으로 정제하고, BamH I로 분해한 뒤, 앞에 기술한 pBS5T의 BamHI 부위에 삽입했다. 이 DNA를 이용하여 에세리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시키고, 이 세포를 100μM IPTG, 40mg/ml X-Gal 및 25mg/ml 카나마이신이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양했다. 그 다음, 나타나는 백색 콜로니를 선발하고, 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 대상 PCR 산물의 삽입체를 보유한 플라스미드를 선발하여 pBS5T-△pfk라 명명했다.

(2) 붕괴 균주의 제조

전술한 균주 ATCC13869△sucA를 먼저 고농도의 플라스미드 pBS5T-△pfk로 전기펄스법으로 형질전환시키고, 25㎍/ml 카나마이신이 보충된 CM-Dex 배지(5g/L 글루코스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·7H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물 및 10㎍/L 비오틴, NaOH로 pH 7.5로 조정) 위에 도말하고, 25℃에서 약 60시간 동안 배양했다. 수득되는 형질전환체는 34℃에서 하룻밤 동안 진탕 배양하고, 그 다음, 적당히 희석한 뒤, 25㎍/ml 카나마이신이 보충된 CM-Dex 배지에서 30시간 동안 평판 배양했다. 이 배지에서 증식할 수 있는 균주는 ATCC13869 균주의 염색체 상에 위치한 pfk 유전자와 상기 플라스미드 상에 위치한 pfk 유전자 단편 사이에 상동성 재조합의 결과로서, 상기 플라스미드 유래의 SacB 유전자와 카나마이신 내성 유전자가 염색체에 통합된 균주이다.

이러한 1차 재조합체를 그 다음 카나마이신 무첨가 액체 CM-Dex 배지에서 31.5℃ 하에 하룻밤 동안 배양하고, 적당히 희석한 후, 카나마이신 무첨가 10% 슈크로스 함유 Dex-S10 배지(10g/L 글루코스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·4H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물, 10㎍/L 비오틴 및 2g/L 아세트산나트륨, pH 7.5(KOH)로 조정)에 도말하여, 34℃에서 약 30시간 동안 배양했다. 결과적으로, 2차 상동성 재조합으로 인해, SacB 유전자를 상실하여 슈크로스에 민감하지 않게 된 것으로 보이는 균주를 수득했다.

수득된 균주에는 pBS5T-△pfk 유래 pfk 유전자의 붕괴형을 보유한 균주 및 야생형 pfk 유전자를 보유한 균주가 포함된다. pfk 유전자가 붕괴형 또는 야생형인지의 여부를 확인하기 위하여, Dex-10 한천 배지에서 배양된 세균 세포를 이용하여 직접 PCR 분석을 수행했다. pfk 붕괴형만을 보유한 균주를 선발하여 ATCC13869△sucA△pfk라 명명했다.

(10-2) 활성이 감소된 PFK를 암호화하는 돌연변이 pfk 유전자 획득

(1) 활성이 감소된 돌연변이 PFK

활성이 감소된 PFK로서 PFK*1(서열번호 57) 및 PFK*2(서열번호 59)를 수득했다. PFK*1은 야생형 PFK(서열번호 61)의 171번 위치에 있는 글루탐산을 리신으로 치환시켜 수득했다. PFK*2는 야생형 PFK(서열번호 61)의 171번 우치에 있는 글루탐산을 아르기닌으로 치환시켜 수득했다. 이러한 서열들은 주형으로서 야생형 pfk 유전자를 사용하고 프라이머로서 각각의 돌연변이를 도입시킬 수 있는 합성 DNA를 사용하여 크로스오버 PCR을 통해 수득할 수 있다.

(2) 돌연변이 pfk 유전자 및 포스포케톨라제 유전자용 발현 벡터의 작제

PFK 발현 벡터를 작제하기 위하여, 주형으로서 씨. 글루타미컴 균주 ATCC13869의 염색체 DNA를 이용하고 프라이머로서 서열번호 54 및 55의 합성 DNA를 이용하여 통상의 PCR을 수행했다. 이 PCR 산물은 통상의 방법으로 정제한 뒤, XbaI 및 KpnI로 분해하고, pfk 유전자를 함유하는 유전자 단편을 앞에서 설명한 pVK9의 XbaI-KpnI 부위에 삽입했다. 이 DNA를 이용하여 에세리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시키고, 이 세포를 100μM IPTG, 40㎍/ml X-Gal 및 25㎍/ml Km이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 평판배양했다. 그 다음, 나타나는 백색 콜로니를 채취하여 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 수득된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 대상 유전자의 삽입체를 보유한 플라스미드를 선발하여 pVK9-PFK라 명명했다.

그 다음, 돌연변이 PFK와 포스포케톨라제를 동시에 모두 발현하는 플라스미드를 작제하기 위하여, 전술한 pVK9-PS2_xfp를 XbaI로 분해하고, PS2_xfp를 함유하는 유전자 단편을 정제하여 pVK9-PFK의 XbaI 부위에 삽입했다. 이 DNA를 이용하여 에세리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(Takara Bio Inc. 제품)를 형질전환시키고, 이 세포를 100μM IPTG, 40㎍/ml X-Gal 및 25㎍/ml Km이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 평판배양했다. 그 다음, 나타나는 백색 콜로니를 채취하여 단일 콜로니로 분리하여 형질전환체를 수득했다. 수득된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, PS2_xfp 및 pfk의 삽입체를 보유한 플라스미드를 선발하여 pVK9-PS2_xfp_PFK라 명명했다.

돌연변이 pfk 유전자와 포스포케톨라제 유전자를 동시에 모두 발현하는 플라스미드를 작제하기 위하여, pVK9-PS2_xfp_PFK의 작제에 이용된 바와 같은 절차에 따라 pVK9-PS2_xfp_PFK*1 및 pVK9-PS2_xfp_PFK*2를 수득했다.

(3) 활성 분석

이러한 PFK 및 포스포케톨라제의 발현 플라스미드(pVK9-PS2_xfp_PFK, pVK9-PS2_xfp_PFK*1 및 pVK9-PS2_xfp_PFK*2)를 이용하여 전술한 균주 ATCC13869△sucA△pfk를 형질전환시키고, PFK의 효소 활성을 조사했다. 형질전환은 전기펄스법으로 수행하고, 형질전환체는 세균 세포를 25㎍/ml 카나마이신이 보충된 CM-Dex 배지(5g/L 글루코스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·7H₂O, 3g/L 우레아, 1.2g/L 대두 가수분해물 및 10㎍/L 비오틴, NaOH로 pH 7.5로 조정) 위에 도말하고, 31.5℃에서 약 30시간 동안 배양했다.

미정제 효소 용액은 다음과 같은 방식으로 수득했다. 대수기의 세균 세포를 수거하고, 100mM Kpi 완충액(pH 8.2)으로 세척한 뒤, 동일한 완충액에 용해시킨 후 초음파 붕괴시켰다. 가용성 분획은 초원심분리(60000rpm, 30min)로 분리하여 미정제 효소 용액을 수득했다. 미정제 효소 용액의 단백질 농도를 정량분석하는 절차는 다음과 같다. 이러한 미정제 효소 용액과 표준 곡선 작도를 위한 공지된 농도의 BSA 용액을 각각 CBB 용액(단백질 분석 CBB 용액, Nacalai Tesque)과 반응시켜 발색시킨 뒤, spectra max190(Molecular Divices)을 이용하여 OD595nm를 측정했다.

그 다음, PFK 활성을 통상의 방법에 따라 측정했다(Denise Kotlars and Henri Buc, Methods in Enzymology(1982) 90: 60-70). 구체적인 절차는 다음과 같다. 효소 활성은 미정제 효소 용액을 100mM Tris-HCl(pH 8.2), 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 1U/ml 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 1U/ml 트리오스포스페이트 이소머라제, 1U/ml 알돌라제, 0.2mM NADH 및 10mM 프럭토스-6-포스페이트에 첨가한 뒤, spectra max190(Molecular Divices)을 이용하여 OD340nm에서 시간 경과에 따른 변화를 측정하여 수득했다. 야생형 PFK의 활성을 1이라 할 때, 저하된 PFK의 상대 활성은 이하 표 5에 제시했다.

(10-3) PFK 활성 저하에 의한 L-글루탐산의 수율 증가

(1) 충분한 양의 비오틴을 함유하는 조건 하에서의 평가

균주 씨. 글루타미컴 ATCC13869 △sucA △pfk를 이용하여, L-글루탐산의 발효 수율에 미치는 PFK 활성의 저하 효과를 평가했다. 균주를 CM-Dex 평판에서 배양하여 수득한 각 균주의 세포를 1L 정제수 중에 30g/L 글루코스, 1g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄, 15g (NH₄)₂SO₄, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01g/L MnSO₄·7H₂O, 13.7ml 대두 가수분해물 용액, 200㎍ 티아민 염산염, 300㎍ 비오틴 및 50g CaCO₃를 함유하는 배지(KOH로 pH 8.0으로 조정)에 접종하고, 31.5℃에서 배양했다. 배양 완료 후, 배양액 중의 축적된 L-글루탐산 양 및 세균 세포 농도(OD)를 측정했다. 그 결과는 도 10에 도시했다. 이 결과는 야생형 pfk 유전자를 발현하는 균주에 비해, 돌연변이 pfk 유전자를 발현하는 균주가 더 높은 L-글루탐산 수율을 나타낸다는 것을 보여준다.

(2) 페니실린이 첨가될 때의 평가

전술한 배지에 최종 농도 4U/ml의 페니실린 G를 첨가하여, 배양 개시 후 OD가 10 내지 14 범위가 되었을 때 복수 증식점에서 최종 세균 양이 동등하도록 세포 증식을 정지시켜, L-글루탐산의 수율을 비교했다. 그 결과는 도 11에 제시했다. 이 결과는 포스포케톨라제 도입된 균주에서의 PKF 활성 저하가 L-글루탐산의 발효 수율의 개선에 효과적이라는 것을 보여준다.

실시예 11: 포스포케톨라제 활성이 증강된 세균을 이용한 L-글루타민 생산 평가

비. 플라범 AJ11576(JP56-16479A) 균주를 이용하여, L-글루타민의 발효 수율의 개선에 미치는 포스포케톨라제 유전자의 도입 효과를 평가했다.

AJ11576 균주는 비타민 P 활성을 보유한 화합물에 내성적이다. 이 균주는 일본 산업기술종합연구소, 국제 특허 미생물 기탁기관(일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 초메 1-1 센트럴 6, 우편번호: 305-8566)에 1980년 5월 6일에 수탁번호 FERM P-05502로서 기탁되어 있다. 그 다음, 이 기탁물은 부다페스트 조약에 의거한 국제기탁기관으로 이양되어 수탁번호 FERM BP-10381을 받았다.

이와 같은 균주 비. 플라범 AJ11576에 pVK9(대조군 플라스미드) 및 pVK9-PS2_xfp(천연 프로모터가 PS2 프로모터로 치환된 비피도박테리움 아니말리스의 xfp 유전자 증폭용 플라스미드)를 각각 도입시켜 포스포케톨라제 발현 균주를 수득했다. 구체적으로, 상기 균주는 상기 플라스미드로 각각 전기펄스법으로 형질전환시키고, 25mg/ml 카나마이신을 함유하는 CM2G 배지(5g/L 글루코스, 10g/L 폴리펩톤, 10g/L 효모 추출물, 5g/L NaCl, KOH로 pH 7.0으로 조정)에 도말하고, 31.5℃에서 약 30시간 동안 배양했다. 나타나는 콜로니는 형질전환체로서 분리하여 AJ11576(pVK9) 및 AJ11576(pVK9-PS2_xfp)라 각각 명명했다.

CM2G 평판 배지에서 배양하여 수득한 AJ11576(pVK9) 및 AJ11576(pVK9-PS2_xfp) 균주의 세포를 1L 정제수 중에 100g/L 글루코스, 2.5g/L KH₂PO₄, 0.4g/L MgSO₄, 60g (NH₄)₂SO₄, 0.01g/L FeSO₄·7H₂O, 5.7ml 대두 가수분해물 용액, 2mg 티아민 염산염, 4㎍ 비오틴, 0.02ml GD-113 및 50g CaCO₃를 함유하는 배지(NaOH로 pH 6.8로 조정)에 접종하고, 당이 완전히 소비될 때까지 31.5℃에서 진탕 배양했다. 배양 완료 후, 배양액 중의 축적된 L-글루탐산 양 및 OD를 측정했다. 그 결과는 도 12에 도시했다. 이 결과는 xfp 유전자 증폭된 균주가 모두 대조군 균주에 비해 높은 L-글루타민 생산을 나타낸다는 것을 보여주었다.

이상, 바람직한 구체예를 참고로 하여 본 발명을 상세히 설명하였지만, 본 발명의 범위 안에서 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 등가물이 사용될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 예컨대 우선권 번호, RU2004124226 및 US 60/644,562 등은 본 출원의 일부로서 참고인용된 것이다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> THE USE OF PHOSPHOKETOLASE FOR PRODUCING USEFUL METABOLITES <130> C272-C5130 <140> 10-2007-7005679 <141> 2007-03-09 <150> RU 2004124226 <151> 2004-08-10 <150> US 60/644,562 <151> 2005-01-19 <160> 81 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2367 <212> DNA <213> Lactobacillus pentosus <220> <221> CDS <222> (1)..(2364) <400> 1 atg tct aca gat tac tca tca cca gca tat ttg caa aaa gtt gat aag 48 Met Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Pro Ala Tyr Leu Gln Lys Val Asp Lys 1 5 10 15 tac tgg cgt gct gcc aac tat tta tca gtt ggt caa ctt tat tta aaa 96 Tyr Trp Arg Ala Ala Asn Tyr Leu Ser Val Gly Gln Leu Tyr Leu Lys 20 25 30 gat aat cct tta tta caa cgg cca tta aag gct agt gac gtt aag gtt 144 Asp Asn Pro Leu Leu Gln Arg Pro Leu Lys Ala Ser Asp Val Lys Val 35 40 45 cac cca atc ggt cac tgg ggc acg att gcc ggc caa aac ttc atc tat 192 His Pro Ile Gly His Trp Gly Thr Ile Ala Gly Gln Asn Phe Ile Tyr 50 55 60 gcg cat ctt aac cgg gtc atc aac aag tac ggt ttg aag atg ttc tac 240 Ala His Leu Asn 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Leu Ala Thr Ser Trp Gln Ser Thr Lys Phe Ile Asn Pro Ile 180 185 190 aac gat ggg gca gtg tta cca atc ttg aac ctt aac ggc ttt aag att 624 Asn Asp Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu Asn Leu Asn Gly Phe Lys Ile 195 200 205 tct aac cca acg att ttt ggt cgg act tct gat gaa aag atc aag caa 672 Ser Asn Pro Thr Ile Phe Gly Arg Thr Ser Asp Glu Lys Ile Lys Gln 210 215 220 tac ttc gaa agc atg aac tgg gaa cca atc ttt gtt gaa ggt gac gat 720 Tyr Phe Glu Ser Met Asn Trp Glu Pro Ile Phe Val Glu Gly Asp Asp 225 230 235 240 cct gaa aag gtt cac cca gct tta gct aag gcc atg gat gaa gcc gtc 768 Pro Glu Lys Val His Pro Ala Leu Ala Lys Ala Met Asp Glu Ala Val 245 250 255 gaa aag atc aaa gcc att caa aag aac gct cgt gaa aac gat gac gct 816 Glu Lys Ile Lys Ala Ile Gln Lys Asn Ala Arg Glu Asn Asp Asp Ala 260 265 270 act tta cca gta tgg ccg atg atc gtc ttc cgc gca cct aag ggc tgg 864 Thr Leu Pro Val Trp Pro Met Ile Val Phe Arg Ala Pro Lys Gly Trp 275 280 285 act ggt cct aag tca tgg gat ggc gac aag atc gaa ggt tca ttc cga 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Ala Ser Thr Asp Gln Gly Ser Glu Pro Asp Ile Val Phe Ala Ala 610 615 620 gct ggg acg gaa cca acg ctt gaa acg ttg gct gcc atc caa tta cta 1920 Ala Gly Thr Glu Pro Thr Leu Glu Thr Leu Ala Ala Ile Gln Leu Leu 625 630 635 640 cac gac agt ttc cca gag atg aag att cgt ttc gtg aac gtg gtc gac 1968 His Asp Ser Phe Pro Glu Met Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Val Asp 645 650 655 atc ttg aag tta cgt agt cct gaa aag gat ccg cgg ggc ttg tca gat 2016 Ile Leu Lys Leu Arg Ser Pro Glu Lys Asp Pro Arg Gly Leu Ser Asp 660 665 670 gct gag ttt gac cat tac ttt act aag gac aaa cca gtg gtc ttt gct 2064 Ala Glu Phe Asp His Tyr Phe Thr Lys Asp Lys Pro Val Val Phe Ala 675 680 685 ttc cac ggt tac gaa gac tta gtt cgt gac atc ttc ttt gat cgt cac 2112 Phe His Gly Tyr Glu Asp Leu Val Arg Asp Ile Phe Phe Asp Arg His 690 695 700 aac cat aac tta tac gtc cac ggt tac cgt gaa aat ggt gat att acc 2160 Asn His Asn Leu Tyr Val His Gly Tyr Arg Glu Asn Gly Asp Ile Thr 705 710 715 720 aca cca ttc gac gta cgg gtc atg aac cag atg gac cgc ttc gac tta 2208 Thr Pro Phe Asp Val Arg Val Met Asn Gln Met Asp Arg Phe Asp Leu 725 730 735 gct aag tcg gca att gcg gcg caa cca gca atg gaa aac act ggt gcg 2256 Ala Lys Ser Ala Ile Ala Ala Gln Pro Ala Met Glu Asn Thr Gly Ala 740 745 750 gcc ttc gtt caa tcc atg gat aat atg ctt gct aaa cac aat gcc tat 2304 Ala Phe Val Gln Ser Met Asp Asn Met Leu Ala Lys His Asn Ala Tyr 755 760 765 atc cgg gat gcc gga act gac ttg cca gaa gtt aat gat tgg caa tgg 2352 Ile Arg Asp Ala Gly Thr Asp Leu Pro Glu Val Asn Asp Trp Gln Trp 770 775 780 aag ggt tta aaa taa 2367 Lys Gly Leu Lys 785 <210> 4 <211> 788 <212> PRT <213> Lactobacillus plantarum <400> 4 Met Thr Thr Asp Tyr Ser Ser Pro Ala Tyr Leu Gln Lys Val Asp Lys 1 5 10 15 Tyr Trp Arg Ala Ala Asn Tyr Leu Ser Val Gly Gln Leu Tyr Leu Lys 20 25 30 Asp Asn Pro Leu Leu Gln Arg Pro Leu Lys Ala Ser Asp Val Lys Val 35 40 45 His Pro Ile Gly His Trp Gly Thr Ile Ala Gly Gln Asn Phe Ile Tyr 50 55 60 Ala His Leu Asn Arg Val Ile Asn Lys Tyr Gly Leu Lys Met Phe Tyr 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495 Gln His Phe Lys Trp Leu Arg Lys Ala Asn Glu Leu Asp Trp Arg Lys 500 505 510 Lys Tyr Pro Ser Leu Asn Ile Ile Ala Ala Ser Thr Val Phe Gln Gln 515 520 525 Asp His Asn Gly Tyr Thr His Gln Asp Pro Gly Ala Leu Thr His Leu 530 535 540 Ala Glu Lys Lys Pro Glu Tyr Ile Arg Glu Tyr Leu Pro Ala Asp Ala 545 550 555 560 Asn Thr Leu Leu Ala Val Gly Asp Val Ile Phe Arg Ser Gln Glu Lys 565 570 575 Ile Asn Tyr Val Val Thr Ser Lys His Pro Arg Gln Gln Trp Phe Ser 580 585 590 Ile Glu Glu Ala Lys Gln Leu Val Asp Asn Gly Leu Gly Ile Ile Asp 595 600 605 Trp Ala Ser Thr Asp Gln Gly Ser Glu Pro Asp Ile Val Phe Ala Ala 610 615 620 Ala Gly Thr Glu Pro Thr Leu Glu Thr Leu Ala Ala Ile Gln Leu Leu 625 630 635 640 His Asp Ser Phe Pro Glu Met Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Val Asp 645 650 655 Ile Leu Lys Leu Arg Ser Pro Glu Lys Asp Pro Arg Gly Leu Ser Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Asp His Tyr Phe Thr Lys Asp Lys Pro Val Val Phe Ala 675 680 685 Phe His Gly Tyr Glu Asp Leu Val Arg Asp Ile Phe Phe Asp Arg His 690 695 700 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Tyr Met Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro 35 40 45 ctg atg aag gag ccc ttc acc cgc gat gac gtg aag cac cgt ctg gtc 313 Leu Met Lys Glu Pro Phe Thr Arg Asp Asp Val Lys His Arg Leu Val 50 55 60 ggc cac tgg ggc acc acc ccg ggc ctg aac ttc ctt ctc gcc cac atc 361 Gly His Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Leu Ala His Ile 65 70 75 aac cgc ctg atc gcc gat cac cag cag aac acc gtg ttc atc atg ggt 409 Asn Arg Leu Ile Ala Asp His Gln Gln Asn Thr Val Phe Ile Met Gly 80 85 90 cct ggc cac ggc ggc cct gca ggt acc gct cag tcc tac atc gac ggc 457 Pro Gly His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ala Gln Ser Tyr Ile Asp Gly 95 100 105 110 acc tac acc gag tac tac ccg aac atc acc aag gac gaa gct ggc ctg 505 Thr Tyr Thr Glu Tyr Tyr Pro Asn Ile Thr Lys Asp Glu Ala Gly Leu 115 120 125 cag aag ttc ttc cgc cag ttc tcc tac ccg ggt ggc att cct tcc cac 553 Gln Lys Phe Phe Arg Gln Phe Ser Tyr Pro Gly Gly Ile Pro Ser His 130 135 140 ttc gct ccg gag acg ccg ggc tcc atc cac gaa ggc ggc gag ctg ggc 601 Phe Ala Pro 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Asp His Leu Ser Ile His Arg Arg Phe Ala Glu Leu Phe Glu Thr Ile 255 260 265 270 ttc gac gag atc tgc gat atc aag gct gcg gct cag acc gac gac atg 985 Phe Asp Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Ala Ala Gln Thr Asp Asp Met 275 280 285 acc cgt ccg ttc tac ccg atg ctc atc ttc cgc acc ccg aag ggc tgg 1033 Thr Arg Pro Phe Tyr Pro Met Leu Ile Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp 290 295 300 acc tgc ccg aag ttc atc gac ggc aag aag acc gaa ggc tcc tgg cgt 1081 Thr Cys Pro Lys Phe Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg 305 310 315 gca cac cag gtc ccg ctg gct tcc gcc cgc gac acc gag gcc cac ttc 1129 Ala His Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe 320 325 330 gaa gtc ctc aag ggc tgg atg gaa tcc tac aag ccg gag gag ctc ttc 1177 Glu Val Leu Lys Gly Trp Met Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe 335 340 345 350 aac gcc gac ggc tcc atc aag gag gac gtc acc gca ttc atg cct aag 1225 Asn Ala Asp Gly Ser Ile Lys Glu Asp Val Thr Ala Phe Met Pro Lys 355 360 365 ggc gaa ctg cgc atc ggc gcc aac ccg aat gcc aac 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ctc gag gcc tac ctg ctc acc ggc cgt 1609 Glu His Gln Cys Glu Gly Phe Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Thr Gly Arg 480 485 490 cac ggc atc tgg agc tcc tac gag tcc ttc gtg cac gtg atc gac tcc 1657 His Gly Ile Trp Ser Ser Tyr Glu Ser Phe Val His Val Ile Asp Ser 495 500 505 510 atg ctg aac cag cat gcg aag tgg ctc gag gcc acc gtc cgc gag atc 1705 Met Leu Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Glu Ala Thr Val Arg Glu Ile 515 520 525 ccg tgg cgt aag ccg atc tcc tcg gtg aac ctc ctg gtc tcc tcg cac 1753 Pro Trp Arg Lys Pro Ile Ser Ser Val Asn Leu Leu Val Ser Ser His 530 535 540 gtg tgg cgt cag gat cac aac ggc ttc tcg cac cag gat ccg ggt gtg 1801 Val Trp Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Val 545 550 555 acc tcc gtc ctg ctg aac aag acg ttc aac aac gac cac gtg acg aac 1849 Thr Ser Val Leu Leu Asn Lys Thr Phe Asn Asn Asp His Val Thr Asn 560 565 570 atc tac ttc gcg acc gat gcc aac atg ctg ctg gcc atc gcc gag aag 1897 Ile Tyr Phe Ala Thr Asp Ala Asn Met Leu Leu Ala Ile Ala Glu Lys 575 580 585 590 tgc 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acc aag aag cag tgg gac aac ggc tat ctc 1696 Asn Ala Thr Tyr Glu Val Thr Lys Lys Gln Trp Asp Asn Gly Tyr Leu 445 450 455 tcg gct ctc gtc gac gag aac atg gct gtc acc ggc cag gtt gtc gag 1744 Ser Ala Leu Val Asp Glu Asn Met Ala Val Thr Gly Gln Val Val Glu 460 465 470 475 cag ctc tcc gag cat cag tgc gaa ggc ttc ctc gag gcc tac ctg ctc 1792 Gln Leu Ser Glu His Gln Cys Glu Gly Phe Leu Glu Ala Tyr Leu Leu 480 485 490 acg ggc cgc cac ggc atg tgg agc acc tat gag tcc ttc gcc cac gtg 1840 Thr Gly Arg His Gly Met Trp Ser Thr Tyr Glu Ser Phe Ala His Val 495 500 505 atc gac tcg atg ctc aac cag cat gcg aag tgg ctc gag gcg acc gtc 1888 Ile Asp Ser Met Leu Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Glu Ala Thr Val 510 515 520 cgc gag atc ccg tgg cgc aag ccg atc tcc tcg gtc aac ctc ctc gtc 1936 Arg Glu Ile Pro Trp Arg Lys Pro Ile Ser Ser Val Asn Leu Leu Val 525 530 535 tcc tcg cac gtg tgg cgt cag gac cac aac ggc ttc tcg cat cag gac 1984 Ser Ser His Val Trp Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp 540 545 550 555 ccg ggt gtc acc tcc gtc ctg atc aac aag acg ttc aac aac gac cac 2032 Pro Gly Val Thr Ser Val Leu Ile Asn Lys Thr Phe Asn Asn Asp His 560 565 570 gtg acg aac atc tac ttc gcg acc gac gcc aac atg ctg ctc gcg atc 2080 Val Thr Asn Ile Tyr Phe Ala Thr Asp Ala Asn Met Leu Leu Ala Ile 575 580 585 gcc gag aag tgc ttc aag tcc acc aac aag atc aac gcg atc ttc tcc 2128 Ala Glu Lys Cys Phe Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Ala Ile Phe Ser 590 595 600 ggc aag cag ccg gct ccg acc tgg att acc ctc gac gag gct cgt gcc 2176 Gly Lys Gln Pro Ala Pro Thr Trp Ile Thr Leu Asp Glu Ala Arg Ala 605 610 615 gag ctc gag gcc ggc gcc gcc gag tgg aag tgg gct tcc aac gcc aag 2224 Glu Leu Glu Ala Gly Ala Ala Glu Trp Lys Trp Ala Ser Asn Ala Lys 620 625 630 635 agc aac gac gag gtc cag att gtc ctc gcc gcc gca ggc gat gtc ccg 2272 Ser Asn Asp Glu Val Gln Ile Val Leu Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro 640 645 650 acc cag gag atc atg gcc gct tcc gat gcc ctg aac aag gat ggc atc 2320 Thr Gln Glu Ile Met Ala Ala Ser Asp Ala Leu Asn Lys Asp 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acaggattag tcatagaggc gaaggctcct tgaatagg 48 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctagtctaga gaattcgccc ttggcctttc atcg 34 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cctattcaag gagccttcgc ctctatgact aatcctgtta ttggtacc 48 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ctattctaga aaattcctgt gaattagctg atttagtact tttc 44 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ggtaccaata acaggattag tcataattct gtttcctgtg tgaaattg 48 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cggttctaga ggatccggag cttatcgact gcac 34 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 caatttcaca caggaaacag aattatgact aatcctgtta ttggtacc 48 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ctggtgatga gtaatctgta gacatagagg cgaaggctcc ttgaatagg 49 <210> 24 <211> 34 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ctg tac gaa gtt ggc ttc aac 432 Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn 130 135 140 cac ttc ttc cgc ggc aag gat cac cca ggc ggc ggc gac cag atc ttc 480 His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gln Ile Phe 145 150 155 160 ttc cag ggc cac gca tca cca ggt atg tac gca cgt gca ttc atg gag 528 Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu 165 170 175 ggt cgc ctt tct gaa gac gat ctc gat ggc ttc cgt cag gaa gtt tcc 576 Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gln Glu Val Ser 180 185 190 cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac cca cac ggt atg aag 624 Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys 195 200 205 gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt ctt ggc cca atg gat 672 Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp 210 215 220 gcc att tac cag gca cgt ttc aac cgc tac ctc gaa aac cgt ggc atc 720 Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile 225 230 235 240 aag gac acc tct gac cag cac gtc tgg gcc ttc ctt ggc gac ggc gaa 768 Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu 245 250 255 atg gac gag cca gaa tca cgt ggt ctc atc cag cag gct gca ctg aac 816 Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn 260 265 270 aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc aac ctg cag cgt ctc 864 Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu 275 280 285 gac gga cct gtc cgc ggt aac acc aag atc atc cag gaa ctc gag tcc 912 Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser 290 295 300 ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tct gtg atc aag gtt gtt tgg ggt cgc 960 Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys Val Val Trp Gly Arg 305 310 315 320 gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat ggt gca ctt gtt gag 1008 Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu 325 330 335 atc atg aac aac acc tcc gat ggt gac tac cag acc ttc aag gct aac 1056 Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn 340 345 350 gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga cgt gac cca cgc acc 1104 Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr 355 360 365 gca aag ctc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa atc tgg aag ctt cca 1152 Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro 370 375 380 cgt ggc ggc cac gat tac cgc aag gtt tac gca gcc tac aag cga gct 1200 Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala 385 390 395 400 ctt gag acc aag gat cgc cca acc gtc atc ctt gct cac acc att aag 1248 Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys 405 410 415 ggc tac gga ctc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt aac gca acc cac cag 1296 Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gln 420 425 430 atg aag aag ctg acg ctt gat gat ctg aag ttg ttc cgc gac aag cag 1344 Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gln 435 440 445 ggc atc cca atc acc gat gag cag ctg gag aag gat cct tac ctt cct 1392 Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gln Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu 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Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro 675 680 685 tcc ttt gcg tac gag atc gca cac ctg gtt cac cgt ggc atc gac cgc 2112 Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His Arg Gly Ile Asp Arg 690 695 700 atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt atc tac tac atc acc atc 2160 Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile Tyr Tyr Ile Thr Ile 705 710 715 720 tac aac gag cca acc cca cag cca gct gag cca gaa gga ctg gac gta 2208 Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val 725 730 735 gaa ggc ctg cac aag ggc atc tac ctc tac tcc cgc ggt gaa ggc acc 2256 Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr 740 745 750 ggc cat gag gca aac atc ttg gct tcc ggt gtt ggt atg cag tgg gct 2304 Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gln Trp Ala 755 760 765 ctc aag gct gca tcc atc ctt gag gct gac tac gga gtt cgt gcc aac 2352 Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn 770 775 780 att tac tcc gct act tct tgg gtt aac ttg gct cgc gat ggc gct gct 2400 Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala 785 790 795 800 cgt aac aag gca cag ctg cgc aac cca ggt gca gat gct ggc gag gca 2448 Arg Asn Lys Ala Gln Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala 805 810 815 ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc cca tac gtt gca gtg 2496 Phe Val Thr Thr Gln Leu Lys Gln Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val 820 825 830 tct gac ttc tcc act gat ctg cca aac cag atc cgt gaa tgg gtc cca 2544 Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile Arg Glu Trp Val Pro 835 840 845 ggc gac tac acc gtt ctc ggt gca gat ggc ttc ggt ttc tct gat acc 2592 Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr 850 855 860 cgc cca gct gct cgt cgc ttc ttc aac atc gac gct gag tcc att gtt 2640 Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp Ala Glu Ser Ile Val 865 870 875 880 gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca cgc gaa ggc aag atc gac gtc tcc 2688 Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile Asp Val Ser 885 890 895 gtt gct gct cag gct gct gag aag ttc aag ttg gat gat cct acg agt 2736 Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser 900 905 910 gtt tcc gta gat cca aac gct cct gag gaa taa 2769 Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu 915 920 <210> 39 <211> 922 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 39 Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn 1 5 10 15 Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp 20 25 30 Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gln 35 40 45 Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu 50 55 60 Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp 65 70 75 80 Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp 85 90 95 Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp Asn Ala Ala 100 105 110 Ile Met Val His Arg Ala Gln Arg Pro Gly Ile Gly Val Gly Gly His 115 120 125 Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn 130 135 140 His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gln Ile Phe 145 150 155 160 Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu 165 170 175 Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gln Glu Val Ser 180 185 190 Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys 195 200 205 Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp 210 215 220 Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile 225 230 235 240 Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu 245 250 255 Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn 260 265 270 Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu 275 280 285 Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser 290 295 300 Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys Val Val Trp Gly Arg 305 310 315 320 Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu 325 330 335 Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn 340 345 350 Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro 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gcaaatcctt ttatgatttt ctatcaaaca aaagaggaaa atagaccagt tgcaatccaa 240 acgagagtct aatagaatga ggtcgaaaag taaatcgcgc gggtttgtta ctgataaagc 300 aggcaagacc taaaatgtgt aaagggcaaa gtgtatactt tggcgtcacc ccttacatat 360 tttaggtctt tttttattgt gcgtaactaa cttgccatct tcaaacagga gggctggaag 420 aagcagaccg ctaacacagt acataaaaaa ggagacatga acg atg aac atc 472 Met Asn Ile 1 aaa aag ttt gca aaa caa gca aca gta tta acc ttt act acc gca ctg 520 Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr Thr Ala Leu 5 10 15 ctg gca gga ggc gca act caa gcg ttt gcg aaa gaa acg aac caa aag 568 Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr Asn Gln Lys 20 25 30 35 cca tat aag gaa aca tac ggc att tcc cat att aca cgc cat gat atg 616 Pro Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg His Asp Met 40 45 50 ctg caa atc cct gaa cag caa aaa aat gaa aaa tat caa gtt cct gaa 664 Leu Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln Val Pro Glu 55 60 65 ttc gat tcg tcc aca att aaa aat atc tct tct gca aaa ggc ctg gac 712 Phe Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys Gly Leu Asp 70 75 80 gtt tgg gac agc tgg cca tta caa aac gct gac ggc act gtc gca aac 760 Val Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Asn 85 90 95 tat cac ggc tac cac atc gtc ttt gca tta gcc gga gat cct aaa aat 808 Tyr His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn 100 105 110 115 gcg gat gac aca tcg att tac atg ttc tat caa aaa gtc ggc gaa act 856 Ala Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val Gly Glu Thr 120 125 130 tct att gac agc tgg aaa aac gct ggc cgc gtc ttt aaa gac agc gac 904 Ser Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp 135 140 145 aaa ttc gat gca aat gat tct atc cta aaa gac caa aca caa gaa tgg 952 Lys Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr Gln Glu Trp 150 155 160 tca ggt tca gcc aca ttt aca tct gac gga aaa atc cgt tta ttc tac 1000 Ser Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg Leu Phe Tyr 165 170 175 act gat ttc tcc ggt aaa cat tac ggc aaa caa aca ctg aca act gca 1048 Thr Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala 180 185 190 195 caa gtt aac gta tca gca tca gac agc tct ttg aac atc aac ggt gta 1096 Gln Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile Asn Gly Val 200 205 210 gag gat tat aaa tca atc ttt gac ggt gac gga aaa acg tat caa aat 1144 Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Asn 215 220 225 gta cag cag ttc atc gat gaa ggc aac tac agc tca ggc gac aac cat 1192 Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly Asp Asn His 230 235 240 acg ctg aga gat cct cac tac gta gaa gat aaa ggc cac aaa tac tta 1240 Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His Lys Tyr Leu 245 250 255 gta ttt gaa gca aac act gga act gaa gat ggc tac caa ggc gaa gaa 1288 Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln Gly Glu Glu 260 265 270 275 tct tta ttt aac aaa gca tac tat ggc aaa agc aca tca ttc ttc cgt 1336 Ser Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser Phe Phe Arg 280 285 290 caa gaa agt caa aaa ctt ctg caa agc gat aaa 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act tac tca cac ttc gct gta cct caa gcg 1720 Pro Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val Pro Gln Ala 405 410 415 aaa gga aac aat gtc gtg att aca agc tat atg aca aac aga gga ttc 1768 Lys Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn Arg Gly Phe 420 425 430 435 tac gca gac aaa caa tca acg ttt gcg cca agc ttc ctg ctg aac atc 1816 Tyr Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu Leu Asn Ile 440 445 450 aaa ggc aag aaa aca tct gtt gtc aaa gac agc atc ctt gaa caa gga 1864 Lys Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu Glu Gln Gly 455 460 465 caa tta aca gtt aac aaa taaaaacg caaaagaaaa tgccgatatc ctattggcat 1920 Gln Leu Thr Val Asn Lys 470 tttcttttat ttcttatcaa cataaaggtg aatcccatat gaactatata aaagcaggca 1980 aatggctaac cgtattccta accttttgaa gatc 2014 <210> 41 <211> 473 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 41 Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr 1 5 10 15 Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr 20 25 30 Asn Gln Lys Pro 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Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser 115 120 125 gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca gga caa acc cca atc agg 432 Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg 130 135 140 ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg gat atc tcc ctg gaa atc 480 Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile 145 150 155 160 cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca gct cgc ctc atg ttc gaa 528 Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu 165 170 175 aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag cgc acc cgc ggt ggc aag 576 Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys 180 185 190 atc tcc ttc acc cac atc att ggc tac gcc atg gtg aag gca gtc atg 624 Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met 195 200 205 gct cac ccg gac atg aac aac tcc tac gac gtc atc gac ggc aag cca 672 Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro 210 215 220 acc ctg atc gtg cct gag cac atc aac ctg ggc ctt gct atc gac ctt 720 Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu 225 230 235 240 cct cag aag gac ggc tcc cgc gca ctt gtc gta gca gcc atc aag gaa 768 Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu 245 250 255 acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc gca gcc tac gaa gac atc 816 Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile 260 265 270 gtg gca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc atg gat gac tac cag ggc 864 Val Ala Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly 275 280 285 gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc atc ggt acc cgc cac tct 912 Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser 290 295 300 gtt cca cgt cta acc aag ggc cag ggc acc atc atc ggt gtc ggt tcc 960 Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser 305 310 315 320 atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct tca gaa gac cgc ctt gca 1008 Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala 325 330 335 gag ctc ggc gtt ggc aaa ctt gtc acc atc acc tcc acc tac gat cac 1056 Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His 340 345 350 cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa ttc ctg cgc acc atg tct 1104 Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser 355 360 365 cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat gag atc ttc gac gca atg 1152 Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met 370 375 380 aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca cag gac gtt cca aac acc 1200 Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr 385 390 395 400 ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag ctc att gag gca tac cgc 1248 Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg 405 410 415 tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac cca ctt tca tgg gtt cag 1296 Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln 420 425 430 cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac ctc gac atc gag acc cac 1344 Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His 435 440 445 aac ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc ttc aac gtc 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caa ggc ctc gac gaa gtt gtc atc ggt 1728 Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly 565 570 575 atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg ttc aac atc gtg ggc aag 1776 Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys 580 585 590 cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa ggc caa atg gag cag ggc 1824 Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly 595 600 605 cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac cac ctc ggt tcc gaa ggc 1872 Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly 610 615 620 cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag atc aag gtc tcc ctg act 1920 Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr 625 630 635 640 gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac cca gtg atg gaa ggt atc 1968 Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile 645 650 655 gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag ggc gta gac ggc aag act 2016 Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr 660 665 670 gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct gca ttc gca ggc ctg ggc 2064 Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly 675 680 685 atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct aag ctg cgt ggc tac gac gtc 2112 Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val 690 695 700 ggc ggc acc atc cac atc gtg gtg aac aac cag atc ggc ttc acc acc 2160 Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr 705 710 715 720 acc cca gac tcc agc cgc tcc atg cac tac gca acc gac tac gcc aag 2208 Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys 725 730 735 gca ttc ggc tgc cca gtc ttc cac gtc aac ggc gac gac cca gag gca 2256 Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala 740 745 750 gtt gtc tgg gtt ggc cag ctg gcc acc gag tac cgt cgt cgc ttc ggc 2304 Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly 755 760 765 aag gac gtc ttc atc gac ctc gtc tgc tac cgc ctc cgc ggc cac aac 2352 Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn 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Asn Tyr His Pro Arg Val 885 890 895 gct ccc gtt gct aag aag cgc gtc tcc tct gtc acc gaa ggt ggc atc 2736 Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile 900 905 910 gac tgg gca tgg ggc gag ctc ctc gcc ttc ggt tcc ctg gct aac tcc 2784 Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser 915 920 925 ggc cgc ttg gtt cgc ctt gca ggt gaa gat tcc cgc cgc ggt acc ttc 2832 Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe 930 935 940 acc cag cgc cac gca gtt gcc atc gac cca gcg acc gct gaa gag ttc 2880 Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe 945 950 955 960 aac cca ctc cac gag ctt gca cag tcc aag ggc aac aac ggt aag ttc 2928 Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe 965 970 975 ctg gtc tac aac tcc gca ctg acc gag tac gca ggc atg ggc ttc gag 2976 Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu 980 985 990 tac ggc tac tcc gta gga aac gaa gac tcc atc gtt gca tgg gaa gca 3024 Tyr Gly Tyr Ser Val 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Val Met Gly Arg His 165 170 175 gtg ggt tgg att gct ctg cac gca ggt atg gcg ggc ggt gct cac tac 576 Val Gly Trp Ile Ala Leu His Ala Gly Met Ala Gly Gly Ala His Tyr 180 185 190 acc gtt att cca gaa gta cct ttc gat att gca gag atc tgc aag gcg 624 Thr Val Ile Pro Glu Val Pro Phe Asp Ile Ala Glu Ile Cys Lys Ala 195 200 205 atg gaa cgt cgc ttc cag atg ggc gag aag tac ggc att atc gtc gtt 672 Met Glu Arg Arg Phe Gln Met Gly Glu Lys Tyr Gly Ile Ile Val Val 210 215 220 gcg gaa ggt gcg ttg cca cgc gaa ggc acc atg gag ctt cgt gaa ggc 720 Ala Glu Gly Ala Leu Pro Arg Glu Gly Thr Met Glu Leu Arg Glu Gly 225 230 235 240 cac att gac cag ttc ggt cac aag acc ttc acg gga att gga cag cag 768 His Ile Asp Gln Phe Gly His Lys Thr Phe Thr Gly Ile Gly Gln Gln 245 250 255 atc gct gat gag atc cac gtg cgc ctc ggc cac gat gtt cgt acg acc 816 Ile Ala Asp Glu Ile His Val Arg Leu Gly His Asp Val Arg Thr Thr 260 265 270 gtt ctt ggc cac att caa cgt ggt gga acc cca act gct ttc gac cgt 864 Val Leu Gly His Ile Gln Arg Gly Gly Thr Pro Thr Ala Phe Asp Arg 275 280 285 gtt ctg gcc act cgt tat ggt gtt cgt gca gct cgt gcg tgc cat gag 912 Val Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Arg Ala Ala Arg Ala Cys His Glu 290 295 300 gga agc ttt gac aag gtt gtt gct ttg aag ggt gag agc att gag atg 960 Gly Ser Phe Asp Lys Val Val Ala Leu Lys Gly Glu Ser Ile Glu Met 305 310 315 320 atc acc ttt gaa gaa gcc gtc gga acc ttg aag gaa gtc cca ttc gaa 1008 Ile Thr Phe Glu Glu Ala Val Gly Thr Leu Lys Glu Val Pro Phe Glu 325 330 335 cgc tgg gtt act gcc cag gca atg ttt gga ta g 1041 Arg Trp Val Thr Ala Gln Ala Met Phe Gly 340 345 <210> 57 <211> 346 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 57 Met Glu Asp Met Arg Ile Ala Thr Leu Thr Ser Gly Gly Asp Cys Pro 1 5 10 15 Gly Leu Asn Ala Val Ile Arg Gly Ile Val Arg Thr Ala Ser Asn Glu 20 25 30 Phe Gly Ser Thr Val Val Gly Tyr Gln Asp Gly Trp Glu Gly Leu Leu 35 40 45 Ala Asp Arg Arg Val Gln Leu Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Asp Arg Ile 50 55 60 Leu Leu Arg Gly Gly Thr Ile Leu Gly Thr Gly Arg Leu His Pro Asp 65 70 75 80 Lys Phe Lys Ala Gly Ile Asp Gln Ile Lys Ala Asn Leu Glu Asp Ala 85 90 95 Gly Ile Asp Ala Leu Ile Pro Ile Gly Gly Glu Gly Thr Leu Lys Gly 100 105 110 Ala Lys Trp Leu Ser Asp Asn Gly Ile Pro Val Val Gly Val Pro Lys 115 120 125 Thr Ile Asp Asn Asp Val Asn Gly Thr Asp Phe Thr Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Thr Ala Val Ala Val Ala Thr Asp Ala Val Asp Arg Leu His Thr Thr 145 150 155 160 Ala Glu Ser His Asn Arg Val Met Ile Val Lys Val Met Gly Arg His 165 170 175 Val Gly Trp Ile Ala Leu His Ala Gly Met Ala Gly Gly Ala His Tyr 180 185 190 Thr Val Ile Pro Glu Val Pro Phe Asp Ile Ala Glu Ile Cys Lys Ala 195 200 205 Met Glu Arg Arg Phe Gln Met Gly Glu Lys Tyr Gly Ile Ile Val Val 210 215 220 Ala Glu Gly Ala Leu Pro Arg Glu Gly Thr Met Glu Leu Arg Glu Gly 225 230 235 240 His Ile Asp Gln Phe Gly His Lys Thr Phe Thr Gly Ile Gly Gln Gln 245 250 255 Ile Ala Asp Glu Ile His Val Arg Leu Gly His Asp Val Arg Thr Thr 260 265 270 Val Leu Gly His Ile Gln Arg Gly Gly Thr Pro Thr Ala Phe Asp Arg 275 280 285 Val Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Arg Ala Ala Arg Ala Cys His Glu 290 295 300 Gly Ser Phe Asp Lys Val Val Ala Leu Lys Gly Glu Ser Ile Glu Met 305 310 315 320 Ile Thr Phe Glu Glu Ala Val Gly Thr Leu Lys Glu Val Pro Phe Glu 325 330 335 Arg Trp Val Thr Ala Gln Ala Met Phe Gly 340 345 <210> 58 <211> 1041 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1038) <223> pfk*2 <400> 58 atg gaa gac atg cga att gct act ctc acg tca ggc ggc gac tgc ccc 48 Met Glu Asp Met Arg Ile Ala Thr Leu Thr Ser Gly Gly Asp Cys Pro 1 5 10 15 gga cta aat gcc gtc atc cga gga atc gtc cgc aca gcc agc aat gaa 96 Gly Leu Asn Ala Val Ile Arg Gly Ile Val Arg Thr Ala Ser Asn Glu 20 25 30 ttt ggc tcc acc gtc gtt ggt tat caa gac ggt tgg gaa gga ctg tta 144 Phe Gly Ser Thr Val Val Gly Tyr Gln Asp Gly Trp Glu Gly Leu Leu 35 40 45 gcc gat cgt cgc gta cag ctg tat gac gat gaa gat att gac cga atc 192 Ala Asp Arg Arg Val Gln Leu Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Asp Arg Ile 50 55 60 ctc ctt cga ggc ggc acc att ttg ggc act ggt cgc ctc cat ccg gac 240 Leu Leu Arg Gly Gly Thr Ile Leu Gly Thr Gly Arg Leu His Pro Asp 65 70 75 80 aag ttt aag gcc gga att gat cag att aag gcc aac tta gaa gac gcc 288 Lys Phe Lys Ala Gly Ile Asp Gln Ile Lys Ala Asn Leu Glu Asp Ala 85 90 95 ggc atc gat gcc ctt atc cca atc ggt ggc gaa gga acc ctg aag ggt 336 Gly Ile Asp Ala Leu Ile Pro Ile Gly Gly Glu Gly Thr Leu Lys Gly 100 105 110 gcc aag tgg ctg tct gat aac ggt atc cct gtt gtc ggt gtc cca aag 384 Ala Lys Trp Leu Ser Asp Asn Gly Ile Pro Val Val Gly Val Pro Lys 115 120 125 acc att gac aat gac gtg aat ggc act gac ttc acc ttc ggt ttc gat 432 Thr Ile Asp Asn Asp Val Asn Gly Thr Asp Phe Thr Phe Gly Phe Asp 130 135 140 act gct gtg gca gtg gct acc gac gct gtt gac cgc ctg cac acc acc 480 Thr Ala Val Ala Val Ala Thr Asp Ala Val Asp Arg Leu His Thr Thr 145 150 155 160 gct gaa tct cac aac cgt gtg atg atc gtg agg gtc atg ggc cgc cac 528 Ala Glu Ser His Asn Arg Val Met Ile Val Arg Val Met Gly Arg His 165 170 175 gtg ggt tgg att gct 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Ala Arg Ala Cys His Glu 290 295 300 Gly Ser Phe Asp Lys Val Val Ala Leu Lys Gly Glu Ser Ile Glu Met 305 310 315 320 Ile Thr Phe Glu Glu Ala Val Gly Thr Leu Lys Glu Val Pro Phe Glu 325 330 335 Arg Trp Val Thr Ala Gln Ala Met Phe Gly 340 345 <210> 60 <211> 1041 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1038) <223> pfk <400> 60 atg gaa gac atg cga att gct act ctc acg tca ggc ggc gac tgc ccc 48 Met Glu Asp Met Arg Ile Ala Thr Leu Thr Ser Gly Gly Asp Cys Pro 1 5 10 15 gga cta aat gcc gtc atc cga gga atc gtc cgc aca gcc agc aat gaa 96 Gly Leu Asn Ala Val Ile Arg Gly Ile Val Arg Thr Ala Ser Asn Glu 20 25 30 ttt ggc tcc acc gtc gtt ggt tat caa gac ggt tgg gaa gga ctg tta 144 Phe Gly Ser Thr Val Val Gly Tyr Gln Asp Gly Trp Glu Gly Leu Leu 35 40 45 gcc gat cgt cgc gta cag ctg tat gac gat gaa gat att gac cga atc 192 Ala Asp Arg Arg Val Gln Leu Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Asp Arg Ile 50 55 60 ctc ctt cga ggc ggc acc att ttg ggc act ggt cgc ctc cat ccg gac 240 Leu Leu Arg 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Gly Trp Ile Ala Leu His Ala Gly Met Ala Gly Gly Ala His Tyr 180 185 190 acc gtt att cca gaa gta cct ttc gat att gca gag atc tgc aag gcg 624 Thr Val Ile Pro Glu Val Pro Phe Asp Ile Ala Glu Ile Cys Lys Ala 195 200 205 atg gaa cgt cgc ttc cag atg ggc gag aag tac ggc att atc gtc gtt 672 Met Glu Arg Arg Phe Gln Met Gly Glu Lys Tyr Gly Ile Ile Val Val 210 215 220 gcg gaa ggt gcg ttg cca cgc gaa ggc acc atg gag ctt cgt gaa ggc 720 Ala Glu Gly Ala Leu Pro Arg Glu Gly Thr Met Glu Leu Arg Glu Gly 225 230 235 240 cac att gac cag ttc ggt cac aag acc ttc acg gga att gga cag cag 768 His Ile Asp Gln Phe Gly His Lys Thr Phe Thr Gly Ile Gly Gln Gln 245 250 255 atc gct gat gag atc cac gtg cgc ctc ggc cac gat gtt cgt acg acc 816 Ile Ala Asp Glu Ile His Val Arg Leu Gly His Asp Val Arg Thr Thr 260 265 270 gtt ctt ggc cac att caa cgt ggt gga acc cca act gct ttc gac cgt 864 Val Leu Gly His Ile Gln Arg Gly Gly Thr Pro Thr Ala Phe Asp Arg 275 280 285 gtt ctg gcc act cgt tat ggt gtt cgt gca gct cgt gcg tgc cat 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Gly Ser Asp Met Thr Glu Leu Gly Lys Tyr Ile 405 410 415 cgt gat tta att gag ttg aac aaa gac aac aag aac ttc cgt ggc tgg 1296 Arg Asp Leu Ile Glu Leu Asn Lys Asp Asn Lys Asn Phe Arg Gly Trp 420 425 430 ggt cct gac gaa acc tta tct aac aaa cta ggc gct gct ttt gaa gat 1344 Gly Pro Asp Glu Thr Leu Ser Asn Lys Leu Gly Ala Ala Phe Glu Asp 435 440 445 acc aaa cgt cag tgg atg gaa cca atc cac gaa cct aat gat gct ttg 1392 Thr Lys Arg Gln Trp Met Glu Pro Ile His Glu Pro Asn Asp Ala Leu 450 455 460 tta gca cct caa ggc cgg att att gac tcc atg ttg tca gaa cac atg 1440 Leu Ala Pro Gln Gly Arg Ile Ile Asp Ser Met Leu Ser Glu His Met 465 470 475 480 gat gaa ggg atg ttg gaa gct tac aat tta acc gga cgt tac ggt ttc 1488 Asp Glu Gly Met Leu Glu Ala Tyr Asn Leu Thr Gly Arg Tyr Gly Phe 485 490 495 ttc gca agt tat gaa tca ttc ctg cgc gtt gtg gat tca atg tta acc 1536 Phe Ala Ser Tyr Glu Ser Phe Leu Arg Val Val Asp Ser Met Leu Thr 500 505 510 caa cac ttc aag tgg tta cgg aat tct cac gaa gaa acc cct tgg cgg 1584 Gln His Phe Lys Trp Leu Arg Asn Ser His Glu Glu Thr Pro Trp Arg 515 520 525 gct gat gta cct tca ctg aat gtg att gca tca tca aca gcc ttc caa 1632 Ala Asp Val Pro Ser Leu Asn Val Ile Ala Ser Ser Thr Ala Phe Gln 530 535 540 caa gat cac aat ggt tac tct cac caa gat cca ggt atc att tca cac 1680 Gln Asp His Asn Gly Tyr Ser His Gln Asp Pro Gly Ile Ile Ser His 545 550 555 560 ttg gct gaa aag aag acc gaa tac gtt cgt gcc tat ctt cca ggt gat 1728 Leu Ala Glu Lys Lys Thr Glu Tyr Val Arg Ala Tyr Leu Pro Gly Asp 565 570 575 gcc aat act ttg att gca acc ttt gat aag gct atc caa agc aaa caa 1776 Ala Asn Thr Leu Ile Ala Thr Phe Asp Lys Ala Ile Gln Ser Lys Gln 580 585 590 ttg att aat tta atc att gcc agc aag cac cct cgt cca caa tgg ttc 1824 Leu Ile Asn Leu Ile Ile Ala Ser Lys His Pro Arg Pro Gln Trp Phe 595 600 605 aca atg gac gaa gct aag cgc tta gtt cgt gat ggc ctt ggt gtt gtt 1872 Thr Met Asp Glu Ala Lys Arg Leu Val Arg Asp Gly Leu Gly Val Val 610 615 620 gat tgg gca agc act gat cat ggt gaa gaa ccc gac gtt gtc ttc gca 1920 Asp Trp Ala Ser Thr Asp His Gly Glu Glu Pro Asp Val Val Phe Ala 625 630 635 640 act gcc ggc tct gaa cca acg act gaa agc tta gct gcc gta tca atc 1968 Thr Ala Gly Ser Glu Pro Thr Thr Glu Ser Leu Ala Ala Val Ser Ile 645 650 655 ttg cat gca cgc ttc cct gaa atg aag att cgc ttc att aac gtt gtt 2016 Leu His Ala Arg Phe Pro Glu Met Lys Ile Arg Phe Ile Asn Val Val 660 665 670 gat ctt ctg aag ctg aag aaa gac gac cct cgt ggt tta tca gat gct 2064 Asp Leu Leu Lys Leu Lys Lys Asp Asp Pro Arg Gly Leu Ser Asp Ala 675 680 685 gaa ttt gat gct ttc ttc act aag gac aaa cca gtt atc ttt gct tat 2112 Glu Phe Asp Ala Phe Phe Thr Lys Asp Lys Pro Val Ile Phe Ala Tyr 690 695 700 cat gca tac gac gac tta gta aag acc atc ttc ttc gat cgc cat aac 2160 His Ala Tyr Asp Asp Leu Val Lys Thr Ile Phe Phe Asp Arg His Asn 705 710 715 720 cat aac tta cac gtt cat ggt tac cgc gaa gaa ggc gac att aca acg 2208 His Asn Leu His Val His Gly Tyr Arg Glu Glu Gly Asp Ile Thr Thr 725 730 735 cca ttc gac atg cgt gtt cgc aac gaa ctc gat cgt ttc cac tta gtc 2256 Pro Phe Asp Met Arg Val Arg Asn Glu Leu Asp Arg Phe His Leu Val 740 745 750 aaa gct gcc tta tta gca acg cca gct tat gcc gaa aaa ggt gcc cat 2304 Lys Ala Ala Leu Leu Ala Thr Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Gly Ala His 755 760 765 gtc att caa gag atg aac agc att tta gac aag cat cat gac tat atc 2352 Val Ile Gln Glu Met Asn Ser Ile Leu Asp Lys His His Asp Tyr Ile 770 775 780 cgt gct gaa ggt acc gat att cca gaa gtt gaa aac tgg aaa tgg act 2400 Arg Ala Glu Gly Thr Asp Ile Pro Glu Val Glu Asn Trp Lys Trp Thr 785 790 795 800 gca ttg aag t ag 2412 Ala Leu Lys <210> 63 <211> 803 <212> PRT <213> Lactobacillus plantarum <400> 63 Leu Gln Arg Ser Cys Lys Ile Met Ser Glu Ala Ile Lys Ser Lys Thr 1 5 10 15 Val Asp Tyr Ser Ser Asp Glu Tyr Leu Lys Arg Val Asp Glu Tyr Trp 20 25 30 Arg Ala Ala Asn Tyr Ile Ser Val Gly Gln Leu Tyr Leu Leu Asn Asn 35 40 45 Pro Leu Leu Arg Glu Pro Leu Lys Ala Thr Asp Val Lys Val His Pro 50 55 60 Ile Gly His Trp Gly Thr Ile Ala Gly Gln Asn Phe Ile Tyr Ala His 65 70 75 80 Leu Asn Arg Ala Ile Asn Lys Tyr Gly Leu Asn Met Phe Tyr Ile Glu 85 90 95 Gly Pro Gly His Gly Gly Gln Val Met Val Ser Asn Ser Tyr Leu Asp 100 105 110 Gly Thr Tyr Thr Glu Thr Tyr Pro Lys Ile Thr Gln Asp Lys Ala Gly 115 120 125 Met Lys Arg Leu Phe Lys Gln Phe Ser Phe Pro Gly Gly Val Ala Ser 130 135 140 His Ala Asp Pro Lys Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu Leu 145 150 155 160 Gly Tyr Ser Ile Leu His Gly Ala Gly Ala Val Leu Asp Asn Pro Gly 165 170 175 Leu Ile Ala Ala Thr Val Val Gly Asp Gly Glu Ser Glu Thr Gly Pro 180 185 190 Leu Ala Thr Ser Trp Gln Val Asn Lys Phe Leu Asn Pro Ile Thr Asp 195 200 205 Gly Thr Val Leu Pro Ile Leu Asn Leu Asn Gly Phe Lys Ile Ser Asn 210 215 220 Pro Thr Val Leu Ser Arg Glu Ser His Glu Glu Leu Glu Asp Tyr Phe 225 230 235 240 Lys Gly Leu Gly Trp Asp Pro His Phe Val Glu Gly Thr Asp Pro Ala 245 250 255 Lys Met His Lys Ile Met Ala Glu Glu Leu Asp Lys Val Ile Glu Glu 260 265 270 Ile His Ala Ile Arg Lys Asn Ala Lys Asp Asn Asn Asp Glu Ser Arg 275 280 285 Pro Lys Trp Pro Met Ile Val Phe Arg Ala Pro Lys Gly Trp Thr Gly 290 295 300 Pro Lys Ser Trp Asp Gly Glu Pro Ile Glu Gly Ser Phe Arg Ala His 305 310 315 320 Gln Ile Pro Ile Pro Val Asp Arg Asn His Met Glu His Ala Asp Lys 325 330 335 Leu Val Asp Trp Leu Lys Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Glu 340 345 350 Asn Gly Thr Leu Lys Pro Glu Ile Ala Ala Ile Ile Pro Glu Gly Gln 355 360 365 Ala Arg Met Ala Ala Asn Pro Val Thr Asn Gly Gly Lys Leu Thr Lys 370 375 380 Asp Leu Ile Thr Pro Asn Ile Asp Asp Tyr Ala Leu Asp Asn Lys Ser 385 390 395 400 His Gly Lys Glu Asp Gly Ser Asp Met Thr Glu Leu Gly Lys Tyr Ile 405 410 415 Arg Asp Leu Ile Glu Leu Asn Lys Asp Asn Lys Asn Phe Arg Gly Trp 420 425 430 Gly Pro Asp Glu Thr Leu Ser Asn Lys Leu Gly Ala Ala Phe Glu Asp 435 440 445 Thr Lys Arg Gln Trp Met Glu Pro Ile His Glu Pro Asn Asp Ala Leu 450 455 460 Leu Ala Pro Gln Gly Arg Ile Ile Asp Ser Met Leu Ser Glu His Met 465 470 475 480 Asp Glu Gly Met Leu Glu Ala Tyr Asn Leu Thr Gly Arg Tyr Gly Phe 485 490 495 Phe Ala Ser Tyr Glu Ser Phe Leu Arg Val Val Asp Ser Met Leu Thr 500 505 510 Gln His Phe Lys Trp Leu Arg Asn Ser His Glu Glu Thr Pro Trp Arg 515 520 525 Ala Asp Val Pro Ser Leu Asn Val Ile Ala Ser Ser Thr Ala Phe Gln 530 535 540 Gln Asp His Asn Gly Tyr Ser His Gln Asp Pro Gly Ile Ile Ser His 545 550 555 560 Leu Ala Glu Lys Lys Thr Glu Tyr Val Arg Ala Tyr Leu Pro Gly Asp 565 570 575 Ala Asn Thr Leu Ile Ala Thr Phe Asp Lys Ala Ile Gln Ser Lys Gln 580 585 590 Leu Ile Asn Leu Ile Ile Ala Ser Lys His Pro Arg Pro Gln Trp Phe 595 600 605 Thr Met Asp Glu Ala Lys Arg Leu Val Arg Asp Gly Leu Gly Val Val 610 615 620 Asp Trp Ala Ser Thr Asp His Gly Glu Glu Pro Asp Val Val Phe Ala 625 630 635 640 Thr Ala Gly Ser Glu Pro Thr Thr Glu Ser Leu Ala Ala Val Ser Ile 645 650 655 Leu His Ala Arg Phe Pro Glu Met Lys Ile Arg Phe Ile Asn Val Val 660 665 670 Asp Leu Leu Lys Leu Lys Lys Asp Asp Pro Arg Gly Leu Ser Asp Ala 675 680 685 Glu Phe Asp Ala Phe Phe Thr Lys Asp Lys Pro Val Ile Phe Ala Tyr 690 695 700 His Ala Tyr Asp Asp Leu Val Lys Thr Ile Phe Phe Asp Arg His Asn 705 710 715 720 His Asn Leu His Val His Gly Tyr Arg Glu Glu Gly Asp Ile Thr Thr 725 730 735 Pro Phe Asp Met Arg Val Arg Asn Glu Leu Asp Arg Phe His Leu Val 740 745 750 Lys Ala Ala Leu Leu Ala Thr Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Gly Ala His 755 760 765 Val Ile Gln Glu Met Asn Ser Ile Leu Asp Lys His His Asp Tyr Ile 770 775 780 Arg Ala Glu Gly Thr Asp Ile Pro Glu Val Glu Asn Trp Lys Trp Thr 785 790 795 800 Ala Leu Lys <210> 64 <211> 2379 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <220> <221> CDS <222> (1)..(2376) <223> xpk <400> 64 atg tca gaa ttt gat aca aaa tca tat tta gaa aaa ctt gat gca tgg 48 Met Ser Glu Phe Asp Thr Lys Ser Tyr Leu Glu Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 tgg aga gca gct aat tat att tct gca gca caa atg tat cta aag gat 96 Trp Arg Ala Ala Asn Tyr Ile Ser Ala Ala Gln Met Tyr Leu Lys Asp 20 25 30 aat cct ctc ttg aga cga gag cta gtt gaa aac gac tta aag gtt cat 144 Asn Pro Leu Leu Arg Arg Glu Leu Val Glu Asn Asp Leu Lys Val His 35 40 45 cca att ggt cac tgg ggc act gta cct gga caa aac ttt atc tat gct 192 Pro Ile Gly His Trp Gly Thr Val Pro Gly Gln Asn Phe Ile Tyr Ala 50 55 60 cac tta aat cgc gct att aat aaa tac gat tta gac atg ttc tat att 240 His Leu Asn Arg Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Leu Asp Met Phe Tyr Ile 65 70 75 80 gaa ggt cca ggt cat ggt ggt caa gtt atg gta tct aat tca tat tta 288 Glu Gly Pro Gly His Gly Gly Gln Val Met Val Ser Asn Ser Tyr Leu 85 90 95 gat ggt tca tat act gaa tta aac cca aat att gag caa aca gag gat 336 Asp Gly Ser Tyr Thr Glu Leu Asn Pro Asn Ile Glu Gln Thr Glu Asp 100 105 110 ggc ttt aag cag tta tgt aaa atc ttc tct ttc cca ggt gga att gca 384 Gly Phe Lys Gln Leu Cys Lys Ile Phe Ser Phe Pro Gly Gly Ile Ala 115 120 125 tcc cat gca gca cca gaa aca cca ggg tca att cat gaa ggt ggt gaa 432 Ser His Ala Ala Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu 130 135 140 ctt ggt tac gca ctt tct cat gcg aca ggt gcc atc cta gac aat cca 480 Leu Gly Tyr Ala Leu Ser His Ala Thr Gly Ala Ile Leu Asp Asn Pro 145 150 155 160 gat gtt att gct gcg act gtt att ggt gat ggt gaa ggt gaa aca gga 528 Asp Val Ile Ala Ala Thr Val Ile Gly Asp Gly Glu Gly Glu Thr Gly 165 170 175 cca ctt atg gct ggt tgg cta tct aat acc ttt atc aat cca gta aat 576 Pro Leu Met Ala Gly Trp Leu Ser Asn Thr Phe Ile Asn Pro Val Asn 180 185 190 gat ggt gct gtt cta cca atc ttc tat tta aat ggt ggt aaa atc cat 624 Asp Gly Ala Val Leu Pro Ile Phe Tyr Leu Asn Gly Gly Lys Ile His 195 200 205 aac cca act atc ttt gaa cgt aag aca gat gaa gaa tta tct cag ttt 672 Asn Pro Thr Ile Phe Glu Arg Lys Thr Asp Glu Glu Leu Ser Gln Phe 210 215 220 ttt gaa gga tta ggt tgg aaa cct att ttt gca gat gtt gtt gaa ctc 720 Phe Glu Gly Leu Gly Trp Lys Pro Ile Phe Ala Asp Val Val Glu Leu 225 230 235 240 tct gag gat cat gcg gct gct cat gct ttg ttt gca gaa aaa tta gat 768 Ser Glu Asp His Ala Ala Ala His Ala Leu Phe Ala Glu Lys Leu Asp 245 250 255 caa gct att caa gag att aaa acc att caa tca gaa gca cga caa aaa 816 Gln Ala Ile Gln Glu Ile Lys Thr Ile Gln Ser Glu Ala Arg Gln Lys 260 265 270 cca gca gaa gaa gct atc caa gca aaa ttc cct gtc ttg gtt gca cgt 864 Pro Ala Glu Glu Ala Ile Gln Ala Lys Phe Pro Val Leu Val Ala Arg 275 280 285 att cct aag ggg tgg act ggt cca aaa gct tgg gaa gga aca cca att 912 Ile Pro Lys Gly Trp Thr Gly Pro Lys Ala Trp Glu Gly Thr Pro Ile 290 295 300 gaa ggt ggc ttc cgc gct cac caa gta cca att cca gta gat gcc cac 960 Glu Gly Gly Phe Arg Ala His Gln Val Pro Ile Pro Val Asp Ala His 305 310 315 320 cat atg gaa cat gtc gat tct ctt ttg tca tgg ctt caa tca tac cgt 1008 His Met Glu His Val Asp Ser Leu Leu Ser Trp Leu Gln Ser Tyr Arg 325 330 335 cca gaa gaa tta ttt gat gaa agt ggt aaa atc gtt gat gag att gct 1056 Pro Glu Glu Leu Phe Asp Glu Ser Gly Lys Ile Val Asp Glu Ile Ala 340 345 350 gct att tca cca aaa ggt gat cgt cgc atg tcc atg aat cca ata acc 1104 Ala Ile Ser Pro Lys Gly Asp Arg Arg Met Ser Met Asn Pro Ile Thr 355 360 365 aat gct ggt att gtt aaa gca atg gat aca gca gat tgg aag aaa ttt 1152 Asn Ala Gly Ile Val Lys Ala Met Asp Thr Ala Asp Trp Lys Lys Phe 370 375 380 gct ctt gat att aat gtt cca ggt caa att atg gca caa gat atg att 1200 Ala Leu Asp Ile Asn Val Pro Gly Gln Ile Met Ala Gln Asp Met Ile 385 390 395 400 gaa ttt gga aaa tat gca gca gat ttg gta gat gct aat cca gat aat 1248 Glu Phe Gly Lys Tyr Ala Ala Asp Leu Val Asp Ala Asn Pro Asp Asn 405 410 415 ttc cgt att ttt ggt cca gat gaa acg aaa tca aat cgt ctt caa gaa 1296 Phe Arg Ile Phe Gly Pro Asp Glu Thr Lys Ser Asn Arg Leu Gln Glu 420 425 430 gtg ttt aca cgt act agc cgt caa tgg ctt ggt cgt cgt aaa cca gat 1344 Val Phe Thr Arg Thr Ser Arg Gln Trp Leu Gly Arg Arg Lys Pro Asp 435 440 445 tat gac gaa gct tta agt cca gct gga cgt gtt att gat tcc caa ttg 1392 Tyr Asp Glu Ala Leu Ser Pro Ala Gly Arg Val Ile Asp Ser Gln Leu 450 455 460 tct gaa cat caa gca gaa ggt ttc tta gaa ggt tat gtt tta act ggt 1440 Ser Glu His Gln Ala Glu Gly Phe Leu Glu Gly Tyr Val Leu Thr Gly 465 470 475 480 cgt cac ggc ttc ttt gct tca tac gaa tca ttc ctt cgc gtt gta gat 1488 Arg His Gly Phe Phe Ala Ser Tyr Glu Ser Phe Leu Arg Val Val Asp 485 490 495 tca atg gta aca caa cat ttc aaa tgg tta cgt aaa tca aaa aca cac 1536 Ser Met Val Thr Gln His Phe Lys Trp Leu Arg Lys Ser Lys Thr His 500 505 510 aca aca tgg cgt aaa aat tat cca gcg ctt aac tta att gca gct tca 1584 Thr Thr Trp Arg Lys Asn Tyr Pro Ala Leu Asn Leu Ile Ala Ala Ser 515 520 525 act gtt ttc caa caa gat cat aat ggt tac act cac caa gat cca ggt 1632 Thr Val Phe Gln Gln Asp His Asn Gly Tyr Thr His Gln Asp Pro Gly 530 535 540 atc tta act cac tta gct gaa aaa aca cct gaa tac att cgt gaa tat 1680 Ile Leu Thr His Leu Ala Glu Lys Thr Pro Glu Tyr Ile Arg Glu Tyr 545 550 555 560 tta cca gca gat act aac tca ctt cta gct gtt atg gat aaa gcg ttt 1728 Leu Pro Ala Asp Thr Asn Ser Leu Leu Ala Val Met Asp Lys Ala Phe 565 570 575 aaa gct gaa gat aaa att aat tta att gtg aca tct aag cac cct cgt 1776 Lys Ala Glu Asp Lys Ile Asn Leu Ile Val Thr Ser Lys His Pro Arg 580 585 590 cca caa ttt tac tct att gct gaa gca gaa gag tta gtg gca gaa gga 1824 Pro Gln Phe Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Glu Glu Leu Val Ala Glu Gly 595 600 605 tat aag gtg att gac tgg gct tca aat gtg tcg ctt aat caa gag cca 1872 Tyr Lys Val Ile Asp Trp Ala Ser Asn Val Ser Leu Asn Gln Glu Pro 610 615 620 gat gtt gtc ttt gct gcg gcg gga aca gaa cct aac tta gaa gct ttg 1920 Asp Val Val Phe Ala Ala Ala Gly Thr Glu Pro Asn Leu Glu Ala Leu 625 630 635 640 gca gct att agt att ctt cat aag gct ttc cca gaa ctt aag att aga 1968 Ala Ala Ile Ser Ile Leu His Lys Ala Phe Pro Glu Leu Lys Ile Arg 645 650 655 ttt gtt aat gta tta gac atc cta aaa ctt cgt cat cct tca caa gat 2016 Phe Val Asn Val Leu Asp Ile Leu Lys Leu Arg His Pro Ser Gln Asp 660 665 670 gct cgc ggt tta tca gat gaa gag ttt gac aaa gtc ttt acc aca gat 2064 Ala Arg Gly Leu Ser Asp Glu Glu Phe Asp Lys Val Phe Thr Thr Asp 675 680 685 aaa cct gtt att ttt gct ttc cat agt tat gaa gat atg att cga gat 2112 Lys Pro Val Ile Phe Ala Phe His Ser Tyr Glu Asp Met Ile Arg Asp 690 695 700 att ttc ttt agt cgt cac aat cat aat ttg cat acg cat ggt tac cgt 2160 Ile Phe Phe Ser Arg His Asn His Asn Leu His Thr His Gly Tyr Arg 705 710 715 720 gaa aat ggt gat atc aca aca cca ttt gat atg cgc gtg atg tca gaa 2208 Glu Asn Gly Asp Ile Thr Thr Pro Phe Asp Met Arg Val Met Ser Glu 725 730 735 ttg gac cga ttc cat ctg gca cag gat gca gct ctt gct tct tta gga 2256 Leu Asp Arg Phe His Leu Ala Gln Asp Ala Ala Leu Ala Ser Leu Gly 740 745 750 aat gaa gca caa gcc ttc agt gat gaa atg aat caa atg gtt gct tat 2304 Asn Glu Ala Gln Ala Phe Ser Asp Glu Met Asn Gln Met Val Ala Tyr 755 760 765 cac aaa gac tat att cgt gaa cac gga gac gat att cca gaa gtg caa 2352 His Lys Asp Tyr Ile Arg Glu His Gly Asp Asp Ile Pro Glu Val Gln 770 775 780 aat tgg aaa tgg gaa aat atc aag tag 2379 Asn Trp Lys Trp Glu Asn Ile Lys 785 790 <210> 65 <211> 792 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 65 Met Ser Glu Phe Asp Thr Lys Ser Tyr Leu Glu Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Trp Arg Ala Ala Asn Tyr Ile Ser Ala Ala Gln Met Tyr Leu Lys 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Ser Glu Asp His Ala Ala Ala His Ala Leu Phe Ala Glu Lys Leu Asp 245 250 255 Gln Ala Ile Gln Glu Ile Lys Thr Ile Gln Ser Glu Ala Arg Gln Lys 260 265 270 Pro Ala Glu Glu Ala Ile Gln Ala Lys Phe Pro Val Leu Val Ala Arg 275 280 285 Ile Pro Lys Gly Trp Thr Gly Pro Lys Ala Trp Glu Gly Thr Pro Ile 290 295 300 Glu Gly Gly Phe Arg Ala His Gln Val Pro Ile Pro Val Asp Ala His 305 310 315 320 His Met Glu His Val Asp Ser Leu Leu Ser Trp Leu Gln Ser Tyr Arg 325 330 335 Pro Glu Glu Leu Phe Asp Glu Ser Gly Lys Ile Val Asp Glu Ile Ala 340 345 350 Ala Ile Ser Pro Lys Gly Asp Arg Arg Met Ser Met Asn Pro Ile Thr 355 360 365 Asn Ala Gly Ile Val Lys Ala Met Asp Thr Ala Asp Trp Lys Lys Phe 370 375 380 Ala Leu Asp Ile Asn Val Pro Gly Gln Ile Met Ala Gln Asp Met Ile 385 390 395 400 Glu Phe Gly Lys Tyr Ala Ala Asp Leu Val Asp Ala Asn Pro Asp Asn 405 410 415 Phe Arg Ile Phe Gly Pro Asp Glu Thr Lys Ser Asn Arg Leu Gln Glu 420 425 430 Val Phe Thr Arg Thr Ser Arg Gln Trp Leu Gly Arg Arg Lys Pro Asp 435 440 445 Tyr Asp Glu Ala Leu Ser Pro Ala Gly Arg Val Ile Asp Ser Gln Leu 450 455 460 Ser Glu His Gln Ala Glu Gly Phe Leu Glu Gly Tyr Val Leu Thr Gly 465 470 475 480 Arg His Gly Phe Phe Ala Ser Tyr Glu Ser Phe Leu Arg Val Val Asp 485 490 495 Ser Met Val Thr Gln His Phe Lys Trp Leu Arg Lys Ser Lys Thr His 500 505 510 Thr Thr Trp Arg Lys Asn Tyr Pro Ala Leu Asn Leu Ile Ala Ala Ser 515 520 525 Thr Val Phe Gln Gln Asp His Asn Gly Tyr Thr His Gln Asp Pro Gly 530 535 540 Ile Leu Thr His Leu Ala Glu Lys Thr Pro Glu Tyr Ile Arg Glu Tyr 545 550 555 560 Leu Pro Ala Asp Thr Asn Ser Leu Leu Ala Val Met Asp Lys Ala Phe 565 570 575 Lys Ala Glu Asp Lys Ile Asn Leu Ile Val Thr Ser Lys His Pro Arg 580 585 590 Pro Gln Phe Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Glu Glu Leu Val Ala Glu Gly 595 600 605 Tyr Lys Val Ile Asp Trp Ala Ser Asn Val Ser Leu Asn Gln Glu Pro 610 615 620 Asp Val Val Phe Ala Ala Ala Gly Thr Glu Pro Asn Leu Glu Ala Leu 625 630 635 640 Ala Ala Ile Ser Ile Leu His Lys Ala Phe Pro Glu Leu Lys Ile Arg 645 650 655 Phe Val Asn Val Leu Asp Ile Leu Lys Leu Arg His Pro Ser Gln Asp 660 665 670 Ala Arg Gly Leu Ser Asp Glu Glu Phe Asp Lys Val Phe Thr Thr Asp 675 680 685 Lys Pro Val Ile Phe Ala Phe His Ser Tyr Glu Asp Met Ile Arg Asp 690 695 700 Ile Phe Phe Ser Arg His Asn His Asn Leu His Thr His Gly Tyr Arg 705 710 715 720 Glu Asn Gly Asp Ile Thr Thr Pro Phe Asp Met Arg Val Met Ser Glu 725 730 735 Leu Asp Arg Phe His Leu Ala Gln Asp Ala Ala Leu Ala Ser Leu Gly 740 745 750 Asn Glu Ala Gln Ala Phe Ser Asp Glu Met Asn Gln Met Val Ala Tyr 755 760 765 His Lys Asp Tyr Ile Arg Glu His Gly Asp Asp Ile Pro Glu Val Gln 770 775 780 Asn Trp Lys Trp Glu Asn Ile Lys 785 790 <210> 66 <211> 2469 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <220> <221> CDS <222> (1)..(2466) <223> xpk <400> 66 atg aca gaa tat aat tca gaa gct tat ttg aaa aag ctt gat aaa tgg 48 Met Thr Glu Tyr Asn Ser Glu Ala Tyr Leu Lys Lys Leu Asp Lys Trp 1 5 10 15 tgg cga gca gca act tat ctt gga gca gga atg atc ttc ttg aaa gaa 96 Trp Arg Ala Ala Thr Tyr Leu Gly Ala Gly Met Ile Phe Leu Lys Glu 20 25 30 aat cca ttg ttc tct gtg aca ggt act cca att aaa gcg gaa aac ctt 144 Asn Pro Leu Phe Ser Val Thr Gly Thr Pro Ile Lys Ala Glu Asn Leu 35 40 45 aaa gcc aat cct att ggg cac tgg ggg acg gtt tca gga caa act ttc 192 Lys Ala Asn Pro Ile Gly His Trp Gly Thr Val Ser Gly Gln Thr Phe 50 55 60 ctc tat gct cat gct aat cgt cta atc aat aaa tat gat caa aag atg 240 Leu Tyr Ala His Ala Asn Arg Leu Ile Asn Lys Tyr Asp Gln Lys Met 65 70 75 80 ttt tac atg ggt ggc ccc gga cat ggt gga caa gct atg gtt gtt cct 288 Phe Tyr Met Gly Gly Pro Gly His Gly Gly Gln Ala Met Val Val Pro 85 90 95 tct tat ctt gat ggc tca tat aca gaa gct tat cca gag att acc caa 336 Ser Tyr Leu Asp Gly Ser Tyr Thr Glu Ala Tyr Pro Glu Ile Thr Gln 100 105 110 gat ttg gaa gga atg tca cgt ttg ttt aaa cgt ttc tca ttt cct gga 384 Asp Leu Glu Gly Met Ser Arg Leu Phe Lys Arg Phe Ser Phe Pro Gly 115 120 125 gga ata ggg tcg cat atg aca gca caa acc cct ggt tca ctt cat gaa 432 Gly Ile Gly Ser His Met Thr Ala Gln Thr Pro Gly Ser Leu His Glu 130 135 140 gga ggt gag ttg ggt tat gtg cta tca cat gca aca ggg gct att ctt 480 Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Val Leu Ser His Ala Thr Gly Ala Ile Leu 145 150 155 160 gat caa cct gaa cag att gct ttt gct gtt gtt ggg gat gga gaa gct 528 Asp Gln Pro Glu Gln Ile Ala Phe Ala Val Val Gly Asp Gly Glu Ala 165 170 175 gaa act gga ccg ttg atg aca agt tgg cac tct att aaa ttc att aat 576 Glu Thr Gly Pro Leu Met Thr Ser Trp His Ser Ile Lys Phe Ile Asn 180 185 190 cct aag aat gat ggg gcg att tta cca att ctt gat tta aat ggt ttt 624 Pro Lys Asn Asp Gly Ala Ile Leu Pro Ile Leu Asp Leu Asn Gly Phe 195 200 205 aaa att tca aat cct act ttg ttc gct cga act tca gat gtt gat att 672 Lys Ile Ser Asn Pro Thr Leu Phe Ala Arg Thr Ser Asp Val Asp Ile 210 215 220 cgt aaa ttc ttt gaa gga ctg ggt tac tca cct cgt tat att gaa aat 720 Arg Lys Phe Phe Glu Gly Leu Gly Tyr Ser Pro Arg Tyr Ile Glu Asn 225 230 235 240 gat gat att cat gat tac atg gct tat cat aaa tta gca gct gaa gtt 768 Asp Asp Ile His Asp Tyr Met Ala Tyr His Lys Leu Ala Ala Glu Val 245 250 255 ttt gat aaa gcg att gaa gac att cat caa att cag aaa gat gcg cgt 816 Phe Asp Lys Ala Ile Glu Asp Ile His Gln Ile Gln Lys Asp Ala Arg 260 265 270 gaa gat aat cgt tat caa aat gga gag att cca gct tgg cca att gtt 864 Glu Asp Asn Arg Tyr Gln Asn Gly Glu Ile Pro Ala Trp Pro Ile Val 275 280 285 atc gca cgt tta cca aaa ggt tgg ggt ggt cca cgt tat aat gat tgg 912 Ile Ala Arg Leu Pro Lys Gly Trp Gly Gly Pro Arg Tyr Asn Asp Trp 290 295 300 tca ggt cct aaa ttt gac ggt aag gga atg cca att gaa cat agt ttc 960 Ser Gly Pro Lys Phe Asp Gly Lys Gly Met Pro Ile Glu His Ser Phe 305 310 315 320 cgt gcg cat caa gtt cca ctt ccg tta tct tct aaa aat atg gga act 1008 Arg Ala His Gln Val Pro Leu Pro Leu Ser Ser Lys Asn Met Gly Thr 325 330 335 tta cca gaa ttt gta aaa tgg atg act tct tac caa cca gaa act tta 1056 Leu Pro Glu Phe Val Lys Trp Met Thr Ser Tyr Gln Pro Glu Thr Leu 340 345 350 ttt aat gct gat gga agt ttg aaa gaa gag ttg cgt gat ttt gca cca 1104 Phe Asn Ala Asp Gly Ser Leu Lys Glu Glu Leu Arg Asp Phe Ala Pro 355 360 365 aaa ggt gag atg cga atg gct tca aac cct gta aca aat ggg gga gtt 1152 Lys Gly Glu Met Arg Met Ala Ser Asn Pro Val Thr Asn Gly Gly Val 370 375 380 gat tct tct aat ttg gtt tta cca gat tgg caa gaa ttt gca aat cca 1200 Asp Ser Ser Asn Leu Val Leu Pro Asp Trp Gln Glu Phe Ala Asn Pro 385 390 395 400 att tct gaa aat aat cga ggg aaa tta ctc cct gat aca aat gac aat 1248 Ile Ser Glu Asn Asn Arg Gly Lys Leu Leu Pro Asp Thr Asn Asp Asn 405 410 415 atg gat atg aat gtt ttg tca aaa tat ttt gct gaa ata gtc aaa ctt 1296 Met Asp Met Asn Val Leu Ser Lys Tyr Phe Ala Glu Ile Val Lys Leu 420 425 430 aat cct acg cgt ttc cgt ttg ttt ggt cct gat gaa acc atg tct aat 1344 Asn Pro Thr Arg Phe Arg Leu Phe Gly Pro Asp Glu Thr Met Ser Asn 435 440 445 cgt ttt tgg gaa atg ttt aag gtg acg aat cgt cag tgg atg caa gtc 1392 Arg Phe Trp Glu Met Phe Lys Val Thr Asn Arg Gln Trp Met Gln Val 450 455 460 ata aaa aat cca aat gat gaa ttt atc tca cct gag ggt cgc 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aat act ttg ctt gcc gta ttt gac 1776 Arg Gln Tyr Leu Pro Ala Asp Gly Asn Thr Leu Leu Ala Val Phe Asp 580 585 590 cgt gct ttt caa gat aga agt aaa att aat cat att gta gcc tct aaa 1824 Arg Ala Phe Gln Asp Arg Ser Lys Ile Asn His Ile Val Ala Ser Lys 595 600 605 caa cct cgt caa caa tgg ttt act aaa gaa gaa gct gaa aaa ttg gcg 1872 Gln Pro Arg Gln Gln Trp Phe Thr Lys Glu Glu Ala Glu Lys Leu Ala 610 615 620 act gac gga att gca aca att gat tgg gct tca acg gct aaa gat gga 1920 Thr Asp Gly Ile Ala Thr Ile Asp Trp Ala Ser Thr Ala Lys Asp Gly 625 630 635 640 gaa gca gta gat tta gtt ttt gcc tca gca gga gct gag cct aca att 1968 Glu Ala Val Asp Leu Val Phe Ala Ser Ala Gly Ala Glu Pro Thr Ile 645 650 655 gaa aca ctg gca gct tta cat ctt gta aac gaa gtt ttc cca cag gca 2016 Glu Thr Leu Ala Ala Leu His Leu Val Asn Glu Val Phe Pro Gln Ala 660 665 670 aaa ttc cgt tat gtg aac gtg gtt gaa ttg ggt cgg ttg caa aag aaa 2064 Lys Phe Arg Tyr Val Asn Val Val Glu Leu Gly Arg Leu Gln Lys Lys 675 680 685 aag gga gca ctc aat caa gaa cgt gaa ctc tca gat gaa gaa ttt gaa 2112 Lys Gly Ala Leu Asn Gln Glu Arg Glu Leu Ser Asp Glu Glu Phe Glu 690 695 700 aaa tac ttt ggc cct tca ggc act cca gta att ttt gga ttc cat gga 2160 Lys Tyr Phe Gly Pro Ser Gly Thr Pro Val Ile Phe Gly Phe His Gly 705 710 715 720 tat gaa gat tta atc gaa tcc att ttc tat caa aga gga cat gat ggt 2208 Tyr Glu Asp Leu Ile Glu Ser Ile Phe Tyr Gln Arg Gly His Asp Gly 725 730 735 ttg att gtt cat ggt tac cgt gaa gat ggt gac atc acg acg act tat 2256 Leu Ile Val His Gly Tyr Arg Glu Asp Gly Asp Ile Thr Thr Thr Tyr 740 745 750 gat atg cgg gtt tac tct gag ctt gac cgt ttc cac caa gcg att gat 2304 Asp Met Arg Val Tyr Ser Glu Leu Asp Arg Phe His Gln Ala Ile Asp 755 760 765 gcc atg caa gtt cta tat gtc aac cga aaa gtt aat caa ggt cta gcg 2352 Ala Met Gln Val Leu Tyr Val Asn Arg Lys Val Asn Gln Gly Leu Ala 770 775 780 aaa gct ttc att gac cga atg aaa cgg aca cta gtt aaa cac ttt gaa 2400 Lys Ala Phe Ile Asp Arg Met Lys Arg Thr Leu Val Lys His Phe Glu 785 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Leu Asn Met Phe Tyr 65 70 75 80 Ile Glu Gly Ser Gly His Gly Gly Gln Val Met Val Ser Asn Ser Tyr 85 90 95 Leu Asp Gly Ser Tyr Thr Glu Arg Tyr Pro Glu Ile Thr Gln Asp Glu 100 105 110 Lys Gly Met Ala Lys Leu Phe Lys Gln Phe Ser Phe Pro Gly Gly Val 115 120 125 Ala Ser His Ala Ala Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly 130 135 140 Glu Leu Gly Tyr Ser Leu Ser His Gly Val Gly Ala Ile Leu Asp Asn 145 150 155 160 Pro Asp Val Ile Ala Ala Val Glu Ile Gly Asp Gly Glu Ser Glu Thr 165 170 175 Gly Pro Leu Ala Thr Ser Trp Phe Ser Ser Lys Phe Ile Asn Pro Ile 180 185 190 Lys Asp Gly Ala Val Ile Pro Ile Leu Gln Ile Asn Gly Phe Lys Ile 195 200 205 Ser Asn Pro Thr Ile Val Ser Arg Met Ser Asp Glu Asp Leu Thr Lys 210 215 220 Tyr Phe Glu Gly Met Gly Trp Lys Pro Tyr Phe Val Ser Ala Tyr Lys 225 230 235 240 Asp Gly Glu Phe Asn Gly Tyr Lys Asp His Met Glu Val His Gln Glu 245 250 255 Met Ala Lys Thr Met Asp Glu Val Val Glu Glu Ile Lys Ala Ile Gln 260 265 270 Lys His Ala Arg Glu Asn Asn Asp Asp Ser Leu Val Lys 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Gly Tyr Val Leu Thr Gly Arg His Gly Phe Phe Ala Thr Tyr Glu Ala 485 490 495 ttt ggt cgt gta gta gat tcg atg ctt act caa cat atg aag tgg ctt 1536 Phe Gly Arg Val Val Asp Ser Met Leu Thr Gln His Met Lys Trp Leu 500 505 510 aga aaa gct aaa gaa caa tat tgg cgt cat gat tat cca tca ctt aac 1584 Arg Lys Ala Lys Glu Gln Tyr Trp Arg His Asp Tyr Pro Ser Leu Asn 515 520 525 ttt gtt gct act tca aca gta ttc caa caa gat cac aat ggt tac act 1632 Phe Val Ala Thr Ser Thr Val Phe Gln Gln Asp His Asn Gly Tyr Thr 530 535 540 cac caa gat cca ggc att tta act cac tta tat gaa aag aat cgt cca 1680 His Gln Asp Pro Gly Ile Leu Thr His Leu Tyr Glu Lys Asn Arg Pro 545 550 555 560 gat tta gtt cat gaa tac ttg cca tca gat act aat act tta ctt gct 1728 Asp Leu Val His Glu Tyr Leu Pro Ser Asp Thr Asn Thr Leu Leu Ala 565 570 575 gta ggt aac aag gca ttt act gat cgt gaa tgt att aat gtt tta gta 1776 Val Gly Asn Lys Ala Phe Thr Asp Arg Glu Cys Ile Asn Val Leu Val 580 585 590 act tca aag caa cct cgt cca caa tgg ttc tca att 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ttt gca cgt aac cgt cat aat gta cat 2160 Ser Met Met Glu Ser Ile Trp Phe Ala Arg Asn Arg His Asn Val His 705 710 715 720 att cac tgc tac gaa gaa aac ggt gat att act acc cca ttt gat atg 2208 Ile His Cys Tyr Glu Glu Asn Gly Asp Ile Thr Thr Pro Phe Asp Met 725 730 735 cgt gtt ttg aac cac ctt gac aga ttt gat ctt gcc aaa gat gct gtt 2256 Arg Val Leu Asn His Leu Asp Arg Phe Asp Leu Ala Lys Asp Ala Val 740 745 750 gaa agt gtt gat aaa ttg aag ggc aag aac gct gac ttt atc agt cat 2304 Glu Ser Val Asp Lys Leu Lys Gly Lys Asn Ala Asp Phe Ile Ser His 755 760 765 atg gat gac ttg ctt gaa aag cac cac caa tac att cgt gat aat ggt 2352 Met Asp Asp Leu Leu Glu Lys His His Gln Tyr Ile Arg Asp Asn Gly 770 775 780 aaa gat atg cca gaa gtt act gaa tgg aag tgg aag ggc ttg aag taa 2397 Lys Asp Met Pro Glu Val Thr Glu Trp Lys Trp Lys Gly Leu Lys 785 790 795 taa 2400 <210> 71 <211> 799 <212> PRT <213> Lactobacillus acidophilus <400> 71 Met Thr Val Asn Tyr Asp Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Ser Val Asp Ala 1 5 10 15 Tyr 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ctc gaa ggc gtt gac aag tac tgg cgc gtt gcc 96 Val Ser Glu Glu Ala Leu Glu Gly Val Asp Lys Tyr Trp Arg Val Ala 20 25 30 aac tac ctt tcc atc ggc cag att tat ctg cgt tcc aac ccg ctg atg 144 Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met 35 40 45 aag gag ccc ttc acc cgc gaa gat gtg aag cac cgt ctg gtg ggc cac 192 Lys Glu Pro Phe Thr Arg Glu Asp Val Lys His Arg Leu Val Gly His 50 55 60 tgg ggc act acc cct ggc ctg aac ttc ctc atc ggc cac atc aac cgt 240 Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg 65 70 75 80 ttc att gct gac cac ggc cag aac acc gtg atc atc atg ggc ccg ggc 288 Phe Ile Ala Asp His Gly Gln Asn Thr Val Ile Ile Met Gly Pro Gly 85 90 95 cac ggt ggc ccg gcc ggt acc tcc cag tcc tac ctg gac ggc acc tac 336 His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ser Gln Ser Tyr Leu Asp Gly Thr Tyr 100 105 110 acc gag acc ttc ccg aag atc acc aag gac gaa gct ggt ctg cag aag 384 Thr Glu Thr Phe Pro Lys Ile Thr Lys Asp Glu Ala Gly Leu Gln Lys 115 120 125 ttc ttc cgt cag ttc tct 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gag ccc tac gag ttc gtc gct ggc ttc gat gat gag gac cac 768 Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Ala Gly Phe Asp Asp Glu Asp His 245 250 255 atg tcc atc cac cgt cgc ttc gcc gag ctg tgg gag acc atc tgg gac 816 Met Ser Ile His Arg Arg Phe Ala Glu Leu Trp Glu Thr Ile Trp Asp 260 265 270 gag atc tgc gac atc aag gcc acc gct cag acc gac aac gtg cac cgt 864 Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Thr Ala Gln Thr Asp Asn Val His Arg 275 280 285 ccg ttc tac ccg atg ctg atc ttc cgc acc ccg aag ggc tgg acc tgc 912 Pro Phe Tyr Pro Met Leu Ile Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp Thr Cys 290 295 300 ccg aag tac atc gac ggc aag aag acc gag ggc tcc tgg cgt tcc cac 960 Pro Lys Tyr Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ser His 305 310 315 320 cag gtg ccg ctg gct tcc gcc cgc gac acc gag gcc cac ttc gag gtt 1008 Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe Glu Val 325 330 335 ctc aag aac tgg ctc gag tcc tac aag ccg gaa gag ctg ttc gac gcc 1056 Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Ala 340 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Ala Asp Ile Ala Arg Val Tyr Phe Pro 545 550 555 560 ccg gat gcc aac acc ctt ttg tgg gtg gga gat cac tgc ctg aaa acc 1728 Pro Asp Ala Asn Thr Leu Leu Trp Val Gly Asp His Cys Leu Lys Thr 565 570 575 tgg aac cgc gtg aat gtc atc gtg gcg ggc aag cag ccg gaa ccg caa 1776 Trp Asn Arg Val Asn Val Ile Val Ala Gly Lys Gln Pro Glu Pro Gln 580 585 590 tgg ctg acc atg gcg gag gct gag aaa cat tgc gaa gca ggt ctc ggc 1824 Trp Leu Thr Met Ala Glu Ala Glu Lys His Cys Glu Ala Gly Leu Gly 595 600 605 ata tgg gaa tgg gcg ggt acg gaa gac ggg ctg gag ccg gat atc gtc 1872 Ile Trp Glu Trp Ala Gly Thr Glu Asp Gly Leu Glu Pro Asp Ile Val 610 615 620 atg gcc tgc gcg ggc gat gtg ccg acc atg gaa acg ctt gcc gcg gtt 1920 Met Ala Cys Ala Gly Asp Val Pro Thr Met Glu Thr Leu Ala Ala Val 625 630 635 640 gat ctt ctg cgc cag tcc ctg ccg cat ctg cgc att cgc gtg gtg aat 1968 Asp Leu Leu Arg Gln Ser Leu Pro His Leu Arg Ile Arg Val Val Asn 645 650 655 gtg gtt gac ctc atg gtg ctg caa tcg ccg cat cag cac ccg cat ggc 2016 Val Val Asp Leu Met Val Leu Gln Ser Pro His Gln His Pro His Gly 660 665 670 att tcc gat gag gaa ttc gac cgg atg ttc acc acc aac agg ccc gtc 2064 Ile Ser Asp Glu Glu Phe Asp Arg Met Phe Thr Thr Asn Arg Pro Val 675 680 685 atc ttc gcc tat cac ggc tat cct tat ctc atc cat cga ctg gtc tat 2112 Ile Phe Ala Tyr His Gly Tyr Pro Tyr Leu Ile His Arg Leu Val Tyr 690 695 700 aag cgc acc aac cac tcc aat ttc cac gtt cgt ggt ttt atc gag cag 2160 Lys Arg Thr Asn His Ser Asn Phe His Val Arg Gly Phe Ile Glu Gln 705 710 715 720 gga acg acc aca acg cct ttc gac atg acc gtg ctg aac gag ctg gat 2208 Gly Thr Thr Thr Thr Pro Phe Asp Met Thr Val Leu Asn Glu Leu Asp 725 730 735 cgt ttc cac ctc gcg atg gaa gcc gtc gag cgc ctg ccg ctg ggc gaa 2256 Arg Phe His Leu Ala Met Glu Ala Val Glu Arg Leu Pro Leu Gly Glu 740 745 750 agc gtt gcc aaa ccc ctg atc gac aat ttc acg gag aaa ctt gcg ctg 2304 Ser Val Ala Lys Pro Leu Ile Asp Asn Phe Thr Glu Lys Leu Ala Leu 755 760 765 cat aag gac tat atc cga cag cat ggt gag gac atg ccg gaa atc cgc 2352 His Lys Asp Tyr Ile Arg Gln His Gly Glu Asp Met Pro Glu Ile Arg 770 775 780 gac tgg aaa tgg aca tgg ccg cga taa 2379 Asp Trp Lys Trp Thr Trp Pro Arg 785 790 <210> 79 <211> 792 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 79 Met Ser Thr Val Pro Ala Lys Gly Pro Leu Thr Pro Gln Gln Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ile Asn Arg Tyr Trp Arg Ala Ala Asn Tyr Leu Ser Val Gly Gln 20 25 30 Ile Tyr Leu Met Lys Asn Pro Leu Leu Arg Glu Pro Leu Gln Pro Glu 35 40 45 His Ile Lys Pro Arg Leu Leu Gly His Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu 50 55 60 Asn Phe Ile Tyr Ala His Leu Asn Arg Ile Ile Gln Gln Arg Asn Ala 65 70 75 80 Asn Val Ile Tyr Ile Cys Gly Pro Gly His Gly Gly Pro Gly Met Val 85 90 95 Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Ile Tyr Pro Ala Ile 100 105 110 Ser Glu Asp Glu Ala Gly Met Glu Arg Leu Phe Arg Gln Phe Ser Phe 115 120 125 Pro Gly Gly Ile Pro Ser His Ala Ala Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile 130 135 140 His Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Ala Leu Val His Ala Tyr Gly Ala 145 150 155 160 Ala Phe Asp Asn Pro Asp Leu Val Val Ala Cys Val Val Gly Asp Gly 165 170 175 Glu Ala Glu Thr Gly Ala Leu Ala Thr Ser Trp His Ser Asn Lys Phe 180 185 190 Leu Asn Pro Ala Arg Asp Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu His Leu Asn 195 200 205 Gly Tyr Lys Ile Ala Asn Pro Thr Val Leu Ala Arg Leu Ser Asp Asp 210 215 220 Asp Leu Asp Asn Leu Phe Arg Gly Tyr Gly Tyr Glu Pro Phe Phe Val 225 230 235 240 Glu Gly Ser Glu Pro Ala Asp Met His Gln Lys Met Ala Ala Thr Leu 245 250 255 Asp Thr Ile Phe Gln Arg Ile Gln Asp Ile Lys Lys Asn Ala Asp Val 260 265 270 His Ser Pro Glu Arg Pro Arg Trp Pro Met Ile Ile Leu Arg Ser Pro 275 280 285 Lys Gly Trp Thr Gly Pro Lys Thr Val Asp Gly Leu Val Val Glu Asn 290 295 300 Tyr Trp Arg Ala His Glu Val Pro Val Ala Asn Cys Arg Glu Asn Asp 305 310 315 320 Ala His Arg Lys Ile Leu Glu Asp Trp Met Lys Ser Tyr Asp Pro Ser 325 330 335 Asp Leu Phe Asp Glu Lys Gly Ala Leu Lys Pro Glu Leu Arg Ala Leu 340 345 350 Ala Pro Lys Gly Glu Ala Arg Ile Gly Ala Asn Pro His Ala Asn Gly 355 360 365 Gly Leu Leu Arg Lys Glu Leu His Met Pro Asp Phe Arg Gln Tyr Ala 370 375 380 Val Asn Val Thr Glu Pro Gly Ala Ile Glu Ala Gln Ser Thr Lys Ile 385 390 395 400 Leu Gly Asp Phe Leu Arg Asp Val Met Lys Leu Asn Glu Thr Glu Lys 405 410 415 Asn Phe Arg Ile Phe Gly Pro Asp Glu Thr Ala Ser Asn Arg Leu Gly 420 425 430 Ser Val Leu Glu Ala Thr Asn Arg Val Trp Met Ala Glu Thr Leu Asp 435 440 445 Met Asp Asp His Leu Ala Ala Asp Gly Arg Val Met Glu Val Leu Ser 450 455 460 Glu His Leu Cys Gln Gly Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Ser Gly Arg 465 470 475 480 His Gly Phe Phe Ser Cys Tyr Glu Ala Phe Ile His Ile Ile Asp Ser 485 490 495 Met Phe Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Gln Val Ala Arg Glu Leu Glu 500 505 510 Trp Arg Lys Pro Ile Ser Ser Leu Asn Tyr Leu Leu Thr Ser His Val 515 520 525 Trp Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Phe Val 530 535 540 Asp Leu Val Ala Asn Lys Ser Ala Asp Ile Ala Arg Val Tyr Phe Pro 545 550 555 560 Pro Asp Ala Asn Thr Leu Leu Trp Val Gly Asp His Cys Leu Lys Thr 565 570 575 Trp Asn Arg Val Asn Val Ile Val Ala Gly Lys Gln Pro Glu Pro Gln 580 585 590 Trp Leu Thr Met Ala Glu Ala Glu Lys His Cys Glu Ala Gly Leu Gly 595 600 605 Ile Trp Glu Trp Ala Gly Thr Glu Asp Gly Leu Glu Pro Asp Ile Val 610 615 620 Met Ala Cys Ala Gly Asp Val Pro Thr Met Glu Thr Leu Ala Ala Val 625 630 635 640 Asp Leu Leu Arg Gln Ser Leu Pro His Leu Arg Ile Arg Val Val Asn 645 650 655 Val Val Asp Leu Met Val Leu Gln Ser Pro His Gln His Pro His Gly 660 665 670 Ile Ser Asp Glu Glu Phe Asp Arg Met Phe Thr Thr Asn Arg Pro Val 675 680 685 Ile Phe Ala Tyr His Gly Tyr Pro Tyr Leu Ile His Arg Leu Val Tyr 690 695 700 Lys Arg Thr Asn His Ser Asn Phe His Val Arg Gly Phe Ile Glu Gln 705 710 715 720 Gly Thr Thr Thr Thr Pro Phe Asp Met Thr Val Leu Asn Glu Leu Asp 725 730 735 Arg Phe His Leu Ala Met Glu Ala Val Glu Arg Leu Pro Leu Gly Glu 740 745 750 Ser Val Ala Lys Pro Leu Ile Asp Asn Phe Thr Glu Lys Leu Ala Leu 755 760 765 His Lys Asp Tyr Ile Arg Gln His Gly Glu Asp Met Pro Glu Ile Arg 770 775 780 Asp Trp Lys Trp Thr Trp Pro Arg 785 790 <210> 80 <211> 2436 <212> DNA <213> Methylococcus capsulatus <220> <221> CDS <222> (1)..(2433) <400> 80 atg gca acc caa ttc ccc ctg tcc tcc gaa ttc gaa cgg ctc acc gtc 48 Met Ala Thr Gln Phe Pro Leu Ser Ser Glu Phe Glu Arg Leu Thr Val 1 5 10 15 tac ggg ccg acc cgc gcc act gtc agc gga aca ccg ctg gat gcc gaa 96 Tyr Gly Pro Thr Arg Ala Thr Val Ser Gly Thr Pro Leu Asp Ala Glu 20 25 30 gaa gtc cgc aaa atc cat gcg ttc tgg cga gcc tgc aat tac ctg gcg 144 Glu Val Arg Lys Ile His Ala Phe Trp Arg Ala Cys Asn Tyr Leu Ala 35 40 45 ctg ggc atg atc tac ctg cgg ggg aat ccg ctg ctg cgt gaa ccg ctc 192 Leu Gly Met Ile Tyr Leu Arg Gly Asn Pro Leu Leu Arg Glu Pro Leu 50 55 60 aaa ccc gag cac atc aag cac cgt ctg ctc ggc cat tgg ggc tcc agc 240 Lys Pro Glu His Ile Lys His Arg Leu Leu Gly His Trp Gly Ser Ser 65 70 75 80 ccc aac ctt gcg ttc gtc tac acc cat ctg aac cgg gcc atc cgg aaa 288 Pro Asn Leu Ala Phe Val Tyr Thr His Leu Asn Arg Ala Ile Arg Lys 85 90 95 cac gac ctc gac atg atc ttc atg 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ccg atc cgc gac ggc gcg gtg ctg ccg atc ctc 672 Asn Lys Phe Leu Asn Pro Ile Arg Asp Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu 210 215 220 aac ctc aac ggc tac aag atc aac aac ccc acc ctg ctg gcg cgc atc 720 Asn Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Arg Ile 225 230 235 240 agc cac gaa gaa ttg gaa aat ctg ctc agg ggt tac ggc tac acg cct 768 Ser His Glu Glu Leu Glu Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Gly Tyr Thr Pro 245 250 255 tat ttc gtg gag ggc tcg gaa ccg gaa agc atg cac cag gcg atg gcc 816 Tyr Phe Val Glu Gly Ser Glu Pro Glu Ser Met His Gln Ala Met Ala 260 265 270 gcg acg gtg gac cgc agc atc gaa gac atc cgc gcc gcc cag acc gag 864 Ala Thr Val Asp Arg Ser Ile Glu Asp Ile Arg Ala Ala Gln Thr Glu 275 280 285 gcc cgc gcc agc ggc atc gcc cga cgg ccg cgc tgg ccg atg atc gtg 912 Ala Arg Ala Ser Gly Ile Ala Arg Arg Pro Arg Trp Pro Met Ile Val 290 295 300 ctg cgc tcg ccc aag ggc tgg acc gcg cca cgc cag atc gac ggc cac 960 Leu Arg Ser Pro Lys Gly Trp Thr Ala Pro Arg Gln Ile Asp Gly His 305 310 315 320 aac gtc gag ggc ttc tgg cgc gct cat cag gtg ccg gta gcc gac gtc 1008 Asn Val Glu Gly Phe Trp Arg Ala His Gln Val Pro Val Ala Asp Val 325 330 335 gcg aaa aat ccc gaa cac ctg aag ctg ctg gaa ggc tgg atg cgc agc 1056 Ala Lys Asn Pro Glu His Leu Lys Leu Leu Glu Gly Trp Met Arg Ser 340 345 350 tac aag ccg gaa gaa ctg ttc gac gcc gaa ggc tgc ccc gtc gcc gaa 1104 Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Ala Glu Gly Cys Pro Val Ala Glu 355 360 365 atc cgg gaa atg gcg ccg gcc ggt ctc cgc cgc atg ggt ctc aac ccc 1152 Ile Arg Glu Met Ala Pro Ala Gly Leu Arg Arg Met Gly Leu Asn Pro 370 375 380 cac gcc aac ggc ggc cat ctg aaa aag gcc ctg cgc atc cct aat ttc 1200 His Ala Asn Gly Gly His Leu Lys Lys Ala Leu Arg Ile Pro Asn Phe 385 390 395 400 cgc aac tac ggc atc gaa gtc gcc aaa ccg ggc cag atc gaa gcg ccg 1248 Arg Asn Tyr Gly Ile Glu Val Ala Lys Pro Gly Gln Ile Glu Ala Pro 405 410 415 aac acc cag ccg ctg ggc gtg ttc ctg cgc gac gtg atg aag gag aac 1296 Asn Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Arg Asp Val Met Lys Glu Asn 420 425 430 gcg cac aac ttc cgg ctg ttc ggc cct gac gag aat acc tcc aac aag 1344 Ala His Asn Phe Arg Leu Phe Gly Pro Asp Glu Asn Thr Ser Asn Lys 435 440 445 ctg gac gcc gtc tac gcc gct gcc aag aaa ttc tgg atc gcc gag tat 1392 Leu Asp Ala Val Tyr Ala Ala Ala Lys Lys Phe Trp Ile Ala Glu Tyr 450 455 460 ttc ccc gaa gac cag gat ggc ggc gaa ctg gcc ccc gac ggc cgg gtc 1440 Phe Pro Glu Asp Gln Asp Gly Gly Glu Leu Ala Pro Asp Gly Arg Val 465 470 475 480 atg gaa atg ctc agc gag cat acc ctg gaa ggc atg ctg gaa ggc tac 1488 Met Glu Met Leu Ser Glu His Thr Leu Glu Gly Met Leu Glu Gly Tyr 485 490 495 ctt ctg acc ggg cgc cac ggc ttc ctc tcg acc tac gaa gcc ttc gtc 1536 Leu Leu Thr Gly Arg His Gly Phe Leu Ser Thr Tyr Glu Ala Phe Val 500 505 510 cac gtc atc gat tcg atg ttc aac cag cac gcc aag tgg ctg tcc atc 1584 His Val Ile Asp Ser Met Phe Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Ser Ile 515 520 525 tgc aac cag ctg tcc tgg cgc cag gac gtg gcc tcg ctc aac ctg ctc 1632 Cys Asn Gln Leu Ser Trp Arg Gln Asp Val Ala Ser Leu Asn Leu Leu 530 535 540 atc act tcg acg gtc tgg cga cag gac cac aac ggc ttc acc cac cag 1680 Ile Thr Ser Thr Val Trp Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Thr His Gln 545 550 555 560 gac ccc ggt ttc ctg gac gtc gtc gtg aac aag agc gcc gac gtc acc 1728 Asp Pro Gly Phe Leu Asp Val Val Val Asn Lys Ser Ala Asp Val Thr 565 570 575 cgc atc tac ctg ccg ccc gac gtc aac agc ctg ctg tcg gtc gcc gac 1776 Arg Ile Tyr Leu Pro Pro Asp Val Asn Ser Leu Leu Ser Val Ala Asp 580 585 590 cac tgc ctg cgc agc cag aac tac atc aac gtg atc gtg tcg gac aaa 1824 His Cys Leu Arg Ser Gln Asn Tyr Ile Asn Val Ile Val Ser Asp Lys 595 600 605 cag ttg cat ctg cag ttc atg gac atg gac gcc gcg atc gcc cat tgc 1872 Gln Leu His Leu Gln Phe Met Asp Met Asp Ala Ala Ile Ala His Cys 610 615 620 acg gag ggc ttg ggc atc tgg gaa tgg gcc agc aac gac gag ggc cag 1920 Thr Glu Gly Leu Gly Ile Trp Glu Trp Ala Ser Asn Asp Glu Gly Gln 625 630 635 640 gag ccc gac gtg gtc atg gcc tgc gcc ggc gac atc ccg acc ctg gaa 1968 Glu Pro Asp Val 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2304 Asn Asn Gln Ile Asp Arg Phe Ser Leu Ala Ile Asp Val Ile Asp Arg 755 760 765 att ccg gag atc gcg gtc tcc ggc gcc cac gcc aag gcc cgg ttc cgc 2352 Ile Pro Glu Ile Ala Val Ser Gly Ala His Ala Lys Ala Arg Phe Arg 770 775 780 aaa cag cag atc gcc tgc cgc cag tat gcc tac gag cac ggc gtc gac 2400 Lys Gln Gln Ile Ala Cys Arg Gln Tyr Ala Tyr Glu His Gly Val Asp 785 790 795 800 atg ccg gag gtc gcg ggc tgg cgc tgg ccg ggc tga 2436 Met Pro Glu Val Ala Gly Trp Arg Trp Pro Gly 805 810 <210> 81 <211> 811 <212> PRT <213> Methylococcus capsulatus <400> 81 Met Ala Thr Gln Phe Pro Leu Ser Ser Glu Phe Glu Arg Leu Thr Val 1 5 10 15 Tyr Gly Pro Thr Arg Ala Thr Val Ser Gly Thr Pro Leu Asp Ala Glu 20 25 30 Glu Val Arg Lys Ile His Ala Phe Trp Arg Ala Cys Asn Tyr Leu Ala 35 40 45 Leu Gly Met Ile Tyr Leu Arg Gly Asn Pro Leu Leu Arg Glu Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Glu His Ile Lys His Arg Leu Leu Gly His Trp Gly Ser Ser 65 70 75 80 Pro Asn Leu Ala Phe Val Tyr Thr His Leu Asn Arg Ala Ile Arg Lys 85 90 95 His Asp Leu Asp Met Ile Phe Met Ala Gly Pro Gly His Gly Ala Pro 100 105 110 Gly Val Leu Gly Pro Leu Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ser Glu Ile Tyr 115 120 125 Pro Asp Lys Asp Leu Ser Glu Glu Gly Leu Leu Asn Phe Phe Lys Gln 130 135 140 Phe Ser Phe Pro Gly Gly Ile Gly Ser His Cys Thr Pro Glu Thr Pro 145 150 155 160 Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Val Leu Ser His Ala 165 170 175 Cys Gly Ala Ala Phe Asp Asn Pro Asp Leu Ile Val Ala Ala Val Val 180 185 190 Gly Asp Gly Glu Ala Glu Thr Gly Pro Leu Ala Thr Ser Trp His Ile 195 200 205 Asn Lys Phe Leu Asn Pro Ile Arg Asp Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu 210 215 220 Asn Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Arg Ile 225 230 235 240 Ser His Glu Glu Leu Glu Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Gly Tyr Thr Pro 245 250 255 Tyr Phe Val Glu Gly Ser Glu Pro Glu Ser Met His Gln Ala Met Ala 260 265 270 Ala Thr Val Asp Arg Ser Ile Glu Asp Ile Arg Ala Ala Gln Thr Glu 275 280 285 Ala Arg Ala Ser Gly Ile Ala Arg Arg Pro Arg Trp Pro Met Ile Val 290 295 300 Leu Arg Ser 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Asp Ser Met Phe Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Ser Ile 515 520 525 Cys Asn Gln Leu Ser Trp Arg Gln Asp Val Ala Ser Leu Asn Leu Leu 530 535 540 Ile Thr Ser Thr Val Trp Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Thr His Gln 545 550 555 560 Asp Pro Gly Phe Leu Asp Val Val Val Asn Lys Ser Ala Asp Val Thr 565 570 575 Arg Ile Tyr Leu Pro Pro Asp Val Asn Ser Leu Leu Ser Val Ala Asp 580 585 590 His Cys Leu Arg Ser Gln Asn Tyr Ile Asn Val Ile Val Ser Asp Lys 595 600 605 Gln Leu His Leu Gln Phe Met Asp Met Asp Ala Ala Ile Ala His Cys 610 615 620 Thr Glu Gly Leu Gly Ile Trp Glu Trp Ala Ser Asn Asp Glu Gly Gln 625 630 635 640 Glu Pro Asp Val Val Met Ala Cys Ala Gly Asp Ile Pro Thr Leu Glu 645 650 655 Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Leu Arg Glu Glu Phe Pro Glu Leu Lys 660 665 670 Ile Arg Phe Ile Asn Val Val Asp Leu Phe Lys Leu Gln Pro Glu Ser 675 680 685 Glu His Pro His Gly Leu Ser Asp Lys Asp Phe Asp Ser Leu Phe Thr 690 695 700 Arg Asp Lys Pro Val Ile Phe Asn Phe His Gly Tyr Pro Trp Leu Ile 705 710 715 720 His Arg Leu 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Claims (10)

1. D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA 단편 또는 D-자이룰로스-5-포스페이트/프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제를 암호화하는 DNA 단편으로 형질전환시켜 D-자이룰로스-5-포스페이트 포스포케톨라제 또는 D-자이룰로스-5-포스페이트/프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제의 활성이 증가된, L-글루탐산, L-글루타민, L-프롤린, L-류신 및 L-시스테인으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 유용한 대사산물의 생산능이 있는 에세리치아(Escherichia) 세균, 코리네형 세균(Coryneform bacterium) 및 판토에아(Pantoea) 세균으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세균.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 6-포스포프럭토키나제의 활성이 저하되도록 추가 변형된 세균.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항 또는 제5항에 따른 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 이 배양 배지, 세균 또는 이들 둘 모두로부터 L-글루탐산, L-글루타민, L-프롤린, L-류신 및 L-시스테인으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 유용한 대사산물을 수거하는 단계를 포함하는, 상기 유용한 대사산물의 생산방법.
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