JP2008509661A - 有用な代謝産物を製造するためのホスホケトラーゼの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、有用な代謝産物、特にアセチル−コエンザイムA(アセチル−CoA)に由来する有用な代謝産物を製造する方法に関する。本発明は、該製造方法において使用される新規の細菌にも関する。
慣用的には、L−アミノ酸、それらの中間体、及び細菌代謝のその他の化学物質のような有用な代謝産物は、天然源から単離される細菌株又はその変異体がそれらの生産性を増強するよう改変される方法により製造される。
、アセトバクター・キシリヌス(Schramm, M. et al, J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958))、ビフィドバクテリウム・グロボスム及びビフィドバクテリウム・デンチウム(Sgorbath, B. et al, Antonie Leeuwenhoek, 42, 49-57 (1976))、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ガードネレラ・バギナリス(Gavini, F. et al, Anaerobe, 2, 191-193 (1996))などの細菌、並びにロドトルラ・グラミニス、ロドトルラ・グルチニス、カンジダ種、カンジダ・トロピカリス、サッカロミセス・パストリアヌス(Whitworth, D.A. and Ratledge, C., J. Gen. Microbiol., 102, 397-401 (1977))などの酵母で報告されている。幾つかの生物体では、両活性は、1つの酵素により保持されるということも報告されている(例えばSchramm, M. et al(J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)); Sgorbati, B. et al(Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57(1976)); Meile, L. et al(J. Bacteriol., 183(9), 2929-36(2001)))。
本発明の目的は、有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌の菌株による有用な代謝産物の生産を増大させること、及びこの菌株を用いた代謝産物の製造方法を提供することである。
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(4), 1990-1995 (2003))、配列番号3に示される。xpk遺伝子及びxpk相同遺伝子の塩基配列は、表1及び配列表に示される。配列番号2及び4のアミノ酸配列のアラインメントは、図1に示される。
クター、例えば、pVK9、pVK7(US2003−0175912)、pSFK6(特開2000−262288号公報)、及びpHK4(特開平5−007491号公報)も用いることができる。
(1977))が用いられ得る。これらの方法のほかに、バチルス・ズブチリス、放線菌及び酵母に適用可能であると報告された、プロトプラスト様又はスフェロプラスト様レシピエント細胞中に組換えDNAを導入する方法(Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978);Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978))が用いられ得る。さらにコリネ型細菌の形質転換も、電気パルス法により実施され得る(Sugimoto et al., 特開平2−207791号公報)。
数個のヌクレオチドは翻訳効率に大きな影響を及ぼすことが既知であるため、この配列を改変してもよい。pkt遺伝子の発現調節配列は、プロモーター同定のためのベクター又はGENETYXのような遺伝子分析ソフトウエアを用いて同定され得る。
バチルス・スブチリス:sacB、GenBankアクセス番号X02730(配列番号40)
バチルス・アミロリクファシエンス:sacB、GenBankアクセス番号X52988
ザイモモナス・モビリス:sacB、GenBankアクセス番号L33402
バチルス・ステアロサーモフィルス:surB、GenBankアクセス番号U34874
ラクトバチルス・サンフランシセンシス:frfA、GenBankアクセス番号AJ508391
アセトバクター・キシリヌス:lsxA、GenBankアクセス番号AB034152
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス:lsdA、GenBankアクセス番号L41732
が好ましくは用いられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
特に、以下の菌株を包含する。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020、13032、13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP−1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826、ATCC14067、AJ12418(FERM BP−2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ATCC13869
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
t遺伝子が導入されている細菌に対して有用な代謝産物を生産する能力を付与することにより得ることができる。後者の場合、pkt遺伝子の導入及び有用な代謝産物を生産する能力の付与は、任意の順序で実施され得る。
能力を有する、栄養要求性株、アナログ耐性株又は代謝調節変異株が、変異株から選択される。
とにより確認され得る。例えば2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reed他(Reed L.J. and Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, pp.55-61, 1969)の方法により測定され得る。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損するか又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低減したエシェリヒア属細菌の例、及びそれらの取得方法は、米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。具体的には、これらの菌株としては以下のものが挙げられる:
エシェリヒア・コリ W3110sucA::Kmr
エシェリヒア・コリ AJ12624(FERM BP−3853)
エシェリヒア・コリ AJ12628(FERM BP−3854)
エシェリヒア・コリ AJ12949(FERM BP−4881)
かしそれらは本明細書の目的のためにパントエア・アナナティスとして記載される。
ブレビバクテリウム・フラバム AJ11355(FERM P−5007、特開昭56−1889号公報)
ブレビバクテリウム・グルタミカム AJ11368(FERM P−P−5020、特開昭56−1889号公報)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ11217(FERM P−4318、特開昭57−2689号公報)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ11218(FERM P−4319、特開昭57−2689号公報)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ11564(FERM P−5472、特開昭56−140895号公報)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ11439(FERM P−5316、特開昭56−35981号公報)
コリネバクテリウム・グルタミカム H7684(FERM BP−3004、特開昭56−151495号公報)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ11573(FERM P−5492、特開昭56−161495号公報)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ11576(FERM BP−10381、特開昭56−161495号公報)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ12212(FERM P−8123、特開昭61−202694号公報)
たγ−グルタミルキナーゼを有する細菌の育種方法は、L−プロリンによるフィードバック阻害に脱感作されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを細胞中に導入する方法が例示される(Dandekar, A.M., Uratsu, S.L., J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988))。L−プロリン分解系を破壊する方法は、活性プロリンデヒドロゲナーゼが発現しないよう、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に変異を導入する方法が例示される。さらにまた、L−プロリン分解系が破壊された細菌は、L−プロリン−資化能を欠く株を得て、そしてL−プロリン栄養要求性を指標にすることにより細胞外にL−プロリンを過剰生産する株を選択することにより取得され得る。エシェリヒア属に属するL−プロリン生産菌としては、エシェリヒア・コリNRRL B−12403株及びNRRL B−12404株(英国特許第2075056号)、VKPM B−8012(米国特許公開2002−0058315号)が挙げられ、そして西独国特許第3127361号に記載されたプラスミド変異体、Bloom F.R.他(The 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34)により記載されたプラスミド変異体等がこのような菌株を取得するために用いられ得る。
リヒア・コリW3110株(米国特許第5,972,663号);システインデスルホヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ株(特開平11−155571号公報);cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンに関する正の転写レギュレーターの活性が増大されたエシェリヒア・コリW3110株(WO01/27307A1)等が挙げられる。
Buc(Methods in Enzymology (1982) 90: 60-70)により記載された方法により測定され得る。本発明の細菌中の6−ホスホフルクトキナーゼの活性は、野生株又は非改変株のものより低く、好ましくは野生株又は非改変株の90%未満、さらに好ましくは70%未満、最も好ましくは50%未満に低減される。6−ホスホフルクトキナーゼの活性は、この
酵素をコードする遺伝子に変異導入するか又は破壊することにより低減され得るが、この場合、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するために用いられる方法と同様の方法を使用しうる。
略語:Pyr − ピルビン酸、PEP − ホスホエノールピルビン酸、GA−3P − グルセルアルデヒド−3−リン酸、AceCoA − アセチル−CoA。
理論的重量収率(Y)は、以下のように算定する:
Y=(生成物の分子量×モル)/(基質の分子量×モル)。
方程式は簡略化され、炭素化合物及びエネルギー分子のみを示す。
ホスホケトラーゼ活性を有するか又は有さない細菌によるアセチル−CoA生成の算定
解糖作用に続くPTSシステムは、以下の式で与えられる。
グルコース = PEP + Pyr + ATP + 2NADH
PEP + CO2 = オキサロ酢酸
Pyr = アセチル−CoA + CO2 + NADH
グルコース=アセチル−CoA+オキサロ酢酸+ATP+3NADH (A)
である。
グルコース + PEP = フルクトース−6−リン酸 + Pyr
Pyr + ATP = PEP
PEP + CO2 = オキサロ酢酸
リン酸+フルクトース−6−リン酸=H2O+エリスロース−4−リン酸+アセチルリン酸
フルクトース−6−リン酸+エリスロース−4−リン酸=2キシルロース−5−リン酸
リン酸+キシルロース−5−リン酸=グリセルアルデヒド−3−リン酸+アセチルリン酸
グリセルアルデヒド−3−リン酸 = PEP + 2ATP + 2NADH
アセチルリン酸 = アセチル−CoA
2グルコース+2CO2=3アセチル−CoA+2オキサロ酢酸+NADH (B)
ホスホケトラーゼ活性を有する又は有さない細菌を用いたL−グルタミン酸生産の理論的収率の算定
1.PTS、解糖作用及びTCAサイクルを包含するL−グルタミン酸生合成経路の反応
グルコース=アセチル−CoA+オキサロ酢酸+ATP+3NADH (A)
アセチル−CoA+オキサロ酢酸=2−オキソグルタル酸+NADPH+CO2
2−オキソグルタル酸 + NH3 + NADPH = グルタミン酸
グルコース = グルタミン酸 + ATP + 3NADH + CO2 (C)
5グルコース + 5PEP = 5フルクトース−6−リン酸 + 5Pyr、ここで
フルクトース−6−リン酸 + ATP = 2GA−3P
2フルクトース−6−リン酸 + 2GA−3P = 2キシルロース−5−リン酸
+ 2エリスロース−4−リン酸
2フルクトース−6−リン酸 + 2エリスロース−4−リン酸 = 4キシルロース−5−リン酸
5グルコース+5PEP+ATP=6キシルロース−5−リン酸+5Pyr
キシルロース−5−リン酸 + リン酸 = GA−3P + アセチルリン酸
GA−3P = PEP + ATP + NADH
アセチルリン酸 = アセチル−CoA
5グルコース=6アセチル−CoA+PEP+5ATP+6NADH+5PYR (1)
ホスホエノールピルビン酸シンターゼ
PYR + 2ATP = PEP + リン酸
(NADH = 2ATPと仮定する)
5グルコース = 6アセチル−CoA + 6PEP + 7ATP
PEP + CO2 = オキサロ酢酸
5グルコース+6CO2=6アセチル−CoA+6オキサロ酢酸+7ATP (2)
オキサロ酢酸+アセチル−CoA=オキソグルタル酸+CO2+NADPH
5グルコース = 6オキソグルタル酸 + 6NADPH + 7ATP
オキソグルタル酸 + NADPH = グルタミン酸
5グルコース = 6グルタミン酸 + 7ATP (D)
L−グルタミン酸の理論的収率は、98%である。
2グルコース + 2PEP = 2フルクトース−6−リン酸 + 2PYR
フルクトース−6−リン酸+リン酸=エリスロース−4−リン酸+アセチルリン酸
フルクトース−6−リン酸+エリスロース−4−リン酸=2キシルロース−5−リン酸
2キシルロース−5−リン酸+2リン酸=2GA−3P+2アセチルリン酸
2グルコース+2PEP=2GA−3P+3アセチルリン酸+2PYR
GA−3P = PEP + ATP + NADH
2グルコース=3アセチルリン酸+2PYR+2ATP+2NADH (3)
PYR + 2ATP = PEP
アセチルリン酸 = アセチル−CoA
2グルコース = 3アセチル−CoA + 2PEP + NADH
PEP + CO2 = オキサロ酢酸
2グルコース+2CO2=3アセチル−CoA+2オキサロ酢酸+NADH又は(4)
6グルコース+6CO2=9アセチル−CoA+6オキサロ酢酸+3NADH
2アセチル−CoA = コハク酸 + NADH
コハク酸 = オキサロ酢酸 + ATP + NADH
6グルコース+6CO2=7アセチル−CoA+7オキサロ酢酸+ATP+5NADH
アセチル−CoA+オキサロ酢酸=2−オキソグルタル酸+NADPH+CO2
2−オキソグルタル酸 + NH3 + NADPH = グルタミン酸
6グルコース=7グルタミン酸+ATP+5NADH+CO2 又は
6グルコース = 7グルタミン酸 + 11ATP +CO2 (E)
L−グルタミン酸の理論的収率は、95.3%である。
ホスホケトラーゼ活性を有する又は有さない細菌を用いたコハク酸生産の理論的収率の算定
1. PTS、解糖作用及びTCAサイクルを包含するコハク酸生合成経路の反応
グルコース = PEP + PYR + ATP + 2NADH
PEP + CO2 = オキサロ酢酸
PYR = アセチル−CoA + CO2 + NADH
グルコース=オキサロ酢酸+アセチル−CoA+ATP+3NADH
オキサロ酢酸+アセチル−CoA=コハク酸+NADPH+NADH+ATP+2CO2
グルコース=コハク酸+NADPH+4NADH+2ATP+2CO2
又は NADH = NADPH = 2ATPと仮定して
グルコース = コハク酸 + 12ATP + 2CO2 (F)
コハク酸の理論的収率は、65%である。
5グルコース+6CO2=6アセチル−CoA+6オキサロ酢酸+7ATP
オキサロ酢酸 + アセチル−CoA = コハク酸 + NADPH + NADH + ATP + 2CO2
5グルコース = 6コハク酸 + 6CO2 + 6NADPH + 25ATP
又は NADH = NADPH = 2ATPと仮定して
5グルコース = 6コハク酸 + 6CO2 + 37ATP (G)
コハク酸の理論的収率は、79%である。
2グルコース+2CO2=3アセチル−CoA+2オキサロ酢酸+NADH 又は
4グルコース+4CO2=6アセチル−CoA+4オキサロ酢酸+2NADH
オキサロ酢酸+アセチル−CoA=コハク酸+NADPH+NADH+ATP+2CO2
4グルコース=4コハク酸+2アセチル−CoA+4CO2+4NADPH+6NADH
2アセチル−CoA = コハク酸 + NADH
4グルコース = 5コハク酸 + 4CO2 + 4NADPH + 7NADH
又は NADH = NADPH = 2ATPと仮定して
4グルコース = 5コハク酸 + 4CO2 + 22ATP (H)
コハク酸の理論的収率は、Y=82%である。
ある、ということを示す。
ホスホケトラーゼ活性を有する又は有さない細菌を用いたL−ロイシン生産の理論的収率の算定
1. PTS及び解糖作用を包含するL−ロイシン生合成経路の反応
グルコース = 2PYR + 2ATP + 2NADH
2PYR+NADPH=2−ケト−イソ吉草酸+CO2
2−ケト−イソ吉草酸+アセチル−CoA+L−グルタミン酸=ロイシン+NADH+2−オキソグルタル酸+CO2 又は
2−ケト−イソ吉草酸+アセチル−CoA=ロイシン+NADH−NADPH+CO2
(式中、NADPHは、L−グルタミン酸の再生に用いられる)
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ
PYR=アセチル−CoA+NADH+CO2
3PYR=ロイシン+2NADH−2NADPH+3CO2
3グルコース=2ロイシン+4NADH−4NADPH+6CO2+6ATP+6NADH
又は NADH=NADPH=2ATPと仮定して
3グルコース=2ロイシン+18ATP+6CO2 (I)
L−ロイシンの理論的収率は、Y=48%である。
5グルコース=6アセチル−CoA+PEP+5ATP+6NADH+5PYR
PEP=PYR+ATP
5グルコース=6アセチル−CoA+6PYR+6ATP+6NADH
2PYR+アセチル−CoA=ロイシン+NADH−2NADPH+2CO2
5グルコース=3ロイシン++3アセチル−CoA+6ATP+9NADH−6NADPH+6CO2 (5)
3グルコース=6PYR+18ATP (6)
を与える。
3グルコース=6PYR+18ATP
+
5グルコース=3ロイシン++3アセチル−CoA+6ATP+9NADH−6NADPH+6CO2
=
8グルコース=3ロイシン+(6PYR+3Ace−CoA)+9NADH−6NADPH+24ATP+6CO2
8グルコース=6ロイシン+24ATP+12NADH−12NADPH+12CO2
又は NADH=NADPHと仮定して
8グルコース=6ロイシン+12CO2+24ATP (J)
L−ロイシンの理論的収率は、Y=55%である。
2グルコース=3アセチルリン酸+2PYR+2ATP+2NADH
アセチルリン酸 = アセチル−CoA
2グルコース=3アセチル−CoA+2PYR+2ATP+2NADH
2PYR+アセチル−CoA=ロイシン+NADH−2NADPH+2CO2
2グルコース=ロイシン+2アセチル−CoA+2ATP+3NADH+−2NADPH+2CO2 (7)
2グルコース=3PYR+12ATP (8)
を与える。
2グルコース=ロイシン+2アセチル−CoA+2ATP+3NADH+−2NADPH+2CO2
+
2グルコース=4PYR+12ATP
=
4グルコース=ロイシン+(4PYR+2アセチル−CoA)+14ATP+3NADH+−2NADPH+2CO2
4PYR+2アセチル−CoA=2ロイシン+2NADH−4NADPH+4CO2
4グルコース=3ロイシン+14ATP+5NADH+−6NADPH+6CO2
又は NADH=NADPH=2ATPと仮定して
4グルコース=3ロイシン+6CO2+12ATP (K)
L−ロイシンの理論的収率は、Y=55%である。
ラクトバチルス・プランタラムからのホスホケトラーゼ遺伝子(xpk1)のクローニング並びにエシェリヒア・コリによる有用な代謝産物の生産に及ぼすxpk1遺伝子増幅効果の評価
xpk1遺伝子を、ラクトバチルス・プランタラム8PA3株(VKPM B−7495)の染色体DNAからクローン化する。報告された塩基配列に基づいて、xpk1遺伝子の増幅のために配列番号7(プライマー1)及び8(プライマー2)で示されるプライマーを合成する。プライマー1は、その5’末端に導入されたHindIII認識部位を含有する。プライマー2は、その5’末端に導入されたEcoRI認識部位を含有する。
pMW−xpk1プラスミドを用いたエシェリヒア・コリL−グルタミン酸生産株VL334thrC+(欧州特許公開第1172433号)の形質転換を通常の方法により実施し、VL334thrC+−pMW−xpk1株を取得することができる。
.2)を含有する。グルコース及び石灰は、別々に滅菌する。培養は、振盪しながら30℃で3日間実行する。培養後、ペーパークロマトグラフィー(液相組成:ブタノール−酢酸−水=4:1:1)と、その後のニンヒドリン(アセトン中1%溶液)による染色及びさらに0.5%CdCl2を含む50%エタノール中での化合物の溶離により、蓄積したL−グルタミン酸の蓄積量を決定することができる。
pMW−xpk1プラスミドを用いたエシェリヒア・コリL−プロリン生産株702ilvA(VKPM B−8012、ロシア特許出願第2000124295号、欧州特許公開第1172433号)の形質転換を通常の方法により実施し、702ilvA−pMW−xpk1株を取得することができる。
pMW−xpk1プラスミドを用いたエシェリヒア・コリL−ロイシン生産株57株(VKPM B−7386、米国特許第6,124,121号)の形質転換を通常の方法により実施し、57−pMW−xpk1株を取得することができる。
pMW−xpk1プラスミドを用いたエシェリヒア・コリL−システイン生産株JM15(ydeD)の形質転換を通常の方法により実施し、JM15(ydeD)−pMW−xpk1株を取得することができる。
pMW−xpk1プラスミドを用いたL−グルタミン酸生産エンテロバクター・アグロメランスAJ13356株(米国特許第6,331,419号)(近年、パントエア・アナナティスとして再分類された)の形質転換を通常の方法により実施し、AJ133556−pMW−xpk1株を取得することができる。
.4mg/Lのホウ酸、1.2mg/Lのモリブデン酸ナトリウム・二水和物、2g/Lの酵母エキス、30g/Lの炭酸カルシウム、200mg/LのL−リジン一塩酸塩、200mg/LのL−メチオニン及び200mg/LのDL−α,ε−ジアミノピメリン酸(DAP)を含む培地20mlを含有する500ml容積フラスコ中に、AJ13356株及びAJ13356−xpk1株を各々、接種し、培地中に含有されるグルコースが完全に消費されるまで、振盪しながら37℃で培養する。培養終了後、培地中に蓄積したL−グルタミン酸を上記と同様に測定することができる。
コリネ型細菌を用いたホスホケトラーゼ遺伝子の生理学的活性の確認
(5−1)ホスホケトラーゼ遺伝子のクローニング及び発現プラスミドの構築
(1)pVK9−xfpの構築
ビフィドバクテリウム・アニマリスJCM1190株の染色体DNAから、xfp遺伝子をクローン化した。ビフィドバクテリウム・アニマリスATCC27674(GenBankアクセス番号AY518213:配列番号9)のxfp遺伝子の報告された塩基配列に基づいて、配列番号13及び14で示されるプライマーを合成し、xfp遺伝子の増幅のために用いる。Japan Collection of Microorganisms(JCM)から、ビフィドバクテリウム・アニマリスJCM1190を得ることができる。
ビフィドバクテリウム・アニマリスxfp遺伝子のネイティブプロモーター領域がPS2プロモーター(Peyret JL, Mol Microbiol. 1993 Jul; 9(1): 97-109、WO93/03158)で置換されたDNA断片を、オーバーラップPCR法(R.M. Horton, H.D. Hunts, S.N. Ho, J.K. Pullen, and L.R. Pease, Gene, 77, 61-68 (1989))に従って得た。本方法は、以下で具体的に記載する。
ビフィドバクテリウム・アニマリスxfp遺伝子のネイティブプロモーター領域がtacプロモーターで置換されたDNA断片を、オーバーラップPCR法(R.M. Horton, H.D. Hunt, S.N. Ho, J.K. Pullen, and L.R. Pease, Gene, 77, 61-68 (1989))に従って得た。本方法は、以下で具体的に記載する。
プラスミドpVK9−tac_xfpを形質転換体から単離した。
ラクトバチルス・ペントススJCM1558株の染色体DNAから、xpkA遺伝子をクローン化した。ラクトバチルス・ペントススJCM1558は、Japan Collection of Microorganisms(JCM)から得られる。ラクトバチルス・ペントススJCM1558からホスホケトラーゼをコードするxpkA遺伝子(配列番号1;AJ309011:gi:16605513)を増幅し、それをpVK9シャトルベクター中にクローン化するために、Wizard Genomic精製キット(Promega)を用いてラクトバチルス・ペントススJCM1558の染色体DNAを抽出した。
K. Yokoyama, Y. Umezawa and H. Matsui, Appl. Environ. Microbiol. Appl. Environ.
Microbiol 69, 358-366 (2003))を、プライマーとして配列番号15及び23の合成DNAを用いてPCRを実施して、PS2プロモーターの増幅産物を得た。次に、xpkA遺伝子配列の増幅産物(コード領域)を得るために、鋳型としてラクトバチルス・ペントススJCM1558の染色体DNAを、プライマーとして配列番号24及び25の合成DNAを用いて、PCRを実施した。配列番号23及び25のヌクレチオド配列は、互いに相補的である。
(1)ATCC13869ΔaceE株の構築
PDH欠損株は、酢酸に対して栄養要求性である。他方で、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入されたPDH(ピルビン酸デヒドロゲナーゼ)欠損株は、酢酸に対してもはや栄養要求性でない。したがってxfp又はxpkA遺伝子の導入の効果が確認された。
(A)pBS3の構築
PCRのための鋳型としてバチルス・ズブチリスの染色体DNAを、プライマーとして配列番号42及び43の合成DNAを用いて、sacB遺伝子(配列番号40)をPCRにより得た。LAtaq(TaKaRa Bio)を用いて、94℃に5分間保持する1サイクルの
後、94℃で30秒、49℃で30秒及び72℃で2分間のサイクルを25回反復して、PCRを実行した。PCR産物をBglII及びBamHIで消化して、通常方法による精製後に平滑末端化した。その結果生じたPCR産物をAvaIIで消化し、平滑末端化しておいたpHSG299と結合した。プラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテント細胞(Takara Bio Inc.)を形質転換して、次に25mg/mlのカナマイシンを含有するLB培地中に形質転換体を懸濁し一晩培養した。コロニーをピックアップし、単一コロニーにして、形質転換体を得た。sacB遺伝子を含有する標的プラスミドpBS3を、形質転換体から単離した。
オーバーラップPCRにより、プラスミドpBS3中のカナマイシン耐性遺伝子のコード領域においてSmaI部位を破壊することにより、プラスミドを得た。先ず、鋳型としてpBS3を、プライマーとして配列番号44及び45の合成DNAを用いて、PCRを実施し、カナマイシン耐性遺伝子のN末端領域を含有するPCR産物を得た。他方で、カナマイシン耐性遺伝子のC末端領域を含有するPCR産物を得るために、鋳型としてpBS3を、プライマーとして配列番号46及び47の合成DNAを用いて、PCRを実施した。PyrobestDNAポリメラーゼ(Takara Bio Inc.)を用いて、98℃で5分間の1サイクルの熱処理後、98℃で10秒、57℃で30秒及び72℃で1分間のサイクルを25回反復して、PCR産物を得ることができる。配列番号45及び46の塩基配列は、互いに部分的に相補的である。
コリネ型細菌からの温度感受性複製起点を有するプラスミドpBS5Tを、以下の手法により構築した。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のaceE遺伝子の報告された塩基配列(GenBankデータベースアクセス番号NC003450;配列番号38)に基づいて、プライマーとして合成DNAを用いてオーバーラップPCR法により、ATCC13869から、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1構成成分)をコードするaceE遺伝子を破壊するためのDNA断片を得た。
aceE遺伝子はピルビン酸デヒドロゲナーゼE1構成成分をコードする。
O4、0.4g/LのMgSO4・7H2O、0.01g/LのFeSO4・7H2O、0.01g/LのMnSO4・4H2O、3g/Lの尿素、1.2g/Lの大豆加水分解物、10mg/Lのビオチン、及び2g/lの酢酸ナトリウム、KOHでpH7.5に調整)中に懸濁した。培養を、34℃で約30時間実施した。二次交差相補的組換えの結果として、染色体上にSacB遺伝子を有さず且つスクロースに対して感受性でない菌株を得た。
pVK9(対照のためのプラスミド)、pVK9−xfp(ビフィドバクテリウム・アニマリスのxfp遺伝子を増幅するためのプラスミド)、pVK9−PS2_xfp(ネイティブプロモーターがPS2プロモーターに置き換えられたビフィドバクテリウム・アニマリスのxfp遺伝子を増幅するためのプラスミド)及びpVK9−PS2_xpkA(ネイティブプロモーターがPS2プロモーターに置き換えられたラクトバチルス・ペントススのxpkA遺伝子を増幅するためのプラスミド)を各々、ATCC13869ΔaceE株に導入して、ホスホケトラーゼ発現株を取得し、そしてpVK9を対照としてATCC13869株中に導入した。具体的には、ATCC13869ΔaceE株及びATCC13869株を各々、電気パルス法により形質転換して、25mg/mlのカナマイシンを含有するCM−Dex培地(5g/Lのグルコース、10g/Lのポリペプトン、10g/Lの酵母エキス、1g/LのKH2PO4、0.4g/LのMgSO4・7H2O、0.01g/LのFeSO4・7H2O、0.01g/LのMnSO4・4H2O、3g/Lの尿素、1.2g/Lの大豆加水分解物及び10mg/Lのビオチン、NaOHでpH7.5に調整)上にプレーティングし、31.5℃で約30時間培養した。出現したコロニーを形質転換体として単離し、そしてそれぞれATCC13869ΔaceE(pVK9)、ATCC13869ΔaceE(pVK9−xfp)、ATCC13869ΔaceE(pVK9−PS2_xfp)、ATCC13869ΔaceE(pVK9−PS2_xpkA)及びATCC1869(pVK9)と名づけた。
ホスホケトラーゼの酵素活性の確認
コリネ型細菌は、ビオチンが制限されるか、或いはペニシリン又は界面活性剤が培地中に添加される条件下でL−グルタミン酸を生産し得る(WO95/34672)。他方、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(E1.2.4.2 sucA;2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ)活性が低減するよう改変された菌株は、このような条件化でなくてもL−グルタミン酸を生産し得る(Kimura E., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 79,
37-57 (2003), "Metabolic engineering of glutamic acid production")ということが知られている。したがって、sucA欠損コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869を用いたホスホケトラーゼ遺伝子の導入によるL−グルタミン酸の発酵収率における改善を試験した。
(1)sucA遺伝子の破壊のための断片のクローニング
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のsucA遺伝子の塩基配列(GenBankデータベースアクセス番号NC_003450;配列番号48)に基づいて設計されたプライマー合成DNAを用いたオーバーラップPCR法により、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株由来の欠失型sucA断片を得た。
(A)で調製されたpBS3ΔsucAは、コリネ型細菌の細胞中で自律的に複製可能な領域を含有しない。したがってコリネバクテリウムがこのプラスミドで形質転換される場合、かなり低頻度であるが、相同的組換えによりこのプラスミドが染色体中に組み込まれた株が形質転換体として出現する。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS3ΔsucAで形質転換し、25mg/mlのカナマイシンを含有するCM−Dex培地(5g/Lのグルコース、10g/Lのポリペプトン、10g/Lの酵母エキス、1g/LのKH2PO4、0.4g/LのMgSO4・7H2O、0.01g/LのFeSO4・7H2O、0.01g/LのMnSO4・7H2O、3g/Lの尿素、1.2g/Lの大豆加水分解物及び10mg/Lのビオチン、NaOHによりpH7.5に調整)上にプレーティングし、31.5℃で約30時間
培養し、出現したコロニーを形質転換体として単離した。これらの形質転換体は、プラスミド上のsucA遺伝子断片と染色体上のネイティブ遺伝子との間の相同的組換えの結果として、カナマイシン耐性遺伝子及びプラスミド由来のSacB遺伝子の両方を有する。
ホスホケトラーゼの発現が増強するよう改変された菌株を用いて、ホスホケトラーゼ遺伝子の発現及びその酵素活性を調べた。
グし、31.5℃で約30時間培養した。出現したコロニーを形質転換体として単離し、そしてそれぞれATCC13869ΔsucA(pVK9)、ATCC13869ΔsucA(pVK9−xfp)、ATCC13869ΔsucA(pVK9−tac_xfp)、ATCC13869ΔsucA(pVK9−PS2_xfp)及びATCC13869ΔsucA(pVK9−PS2_xpkA)と名づけた。
Blue(「Bio Safe Coomassei」、BIORAD)を用いた。結果を、図7で以下に示す(マーカー:BIORADの製品、Precision plus protein standard(#161−0363))。
酢酸、0.05mlの4M HCl及び0.05mlのFeCl3・6H2O(0.1m HCl中、5% wt/vol)で染色した。遠心分離による結晶の除去後、酵素活性リーダー(「Spectra max 190」、Molecular Devicesの製品)を用いてOD505を測定した。
ホスホケトラーゼ活性が増強された細菌のL−グルタミン酸生産能の評価
(7−1)十分量のビオチンを含有する条件下での評価
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869ΔsucA株を用いることにより、L−グルタミン酸の発酵収率に及ぼすホスホケトラーゼ遺伝子の導入の効果を評価した。CM−Dexプレート培地上で培養することにより得られるATCC13869ΔsucA(pVK9)株、ATCC13869ΔsucA(pVK9−xfp)株、ATCC13869ΔsucA(pVK9−PS2_xfp)株及びATCC13869ΔsucA(pVK9−PS2_xpkA)株の細胞を、純水1L中に30gのグルコース、1gのKH2PO4、0.4gのMgSO4、15gの(NH4)2SO4、0.01gのFeSO4・7H2O、0.01gのMnSO4・7H2O、13.7mlの大豆加水分解溶液、200mgの塩酸チアミン、300mgのビオチン及び50gのCaCO3(KOHでpH8.0に調整)を含有するフラスコ中に接種し、糖が完全に消費されるまで、振盪しながら31.5℃で培養した。培養終了後、培養ブロス中の蓄積L−グルタミン酸の量及びODを測定した。結果を図8に示す。その結果、xfp遺伝子が増幅された菌株すべてが対照と比較して高いL−グルタミン酸収率を示すということがわかる。
等しい最終ODのもとで評価するために、ペニシリンGを添加することにより細胞の増殖を停止した。培養開始後にODが10〜14の範囲内になった場合、その最終濃度が複数の増殖点で4U/mlであるよう、上記(1)に記載したように培地にペニシリンGを添加することにより、L−グルタミン酸の収率を比較した。結果を図9に示す。これらの結果は、それらの最終細胞数が等しくなった時点でL−グルタミン酸の収率をそれらの間で比較した場合でも、L−グルタミン酸収率は、対照株と比較して、xfp遺伝子増幅株又はxpk遺伝子増幅株においてより高かった、ということを示す。上記の結果は、ホスホケトラーゼの導入がL−グルタミン酸発酵収率を改善するために有効である、ということを示す。
パントエア・アナナティス株によるL−グルタミン酸蓄積に及ぼすビフィドバクテリウム・アニマリスのxfp遺伝子の発現の効果
ビフィドバクテリウム・アニマリスのxfp遺伝子を発現するpVK9−PS2−xfpプラスミド及び対照pVK9シャトルベクターを、Bio−Radマイクロパルサーを用いて電気穿孔により、NP106/RSFCPG L−グルタミン酸生産株に導入した。なお、NP106/RSFCPG株は、選択マーカーとしてクロラムフェニコールを含有しない培地上でAJ13601株(FERM BP−7207;欧州特許公開第1078989号)をプレーティングすることにより、AJ13601株からpSTVCBプラ
スミドを除去して得られた。
ホスホケトラーゼ活性向上と6−ホスホフルクトキナーゼ(PFK)活性弱化の組み合わせによるグルタミン酸発酵収率の向上
8-1. sucA及びPFKの2重欠損株の作成
(1)pfk遺伝子欠損用プラスミドの構築
ATCC13869株由来のpfkのORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 (GenBank Database Accession No.NC_003450:配列番号61)の該遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたオーバーラップPCR 法で取得した。具体的にはC.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号50、51の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いpfk遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、pfk遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ATCC13869株
ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号52、53の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行った。配列番号51、53は互いに相補的である。
次に内部配列を欠失したpfk遺伝子断片を得るために、上記pfk N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号54、55の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い遺伝子増幅産物を得た。PCR産物を常法により精製後BamH Iで消化し、上述のpBS5T のBamHI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS5T-Δpfkと命名した。
まず、上述のATCC13869ΔsucA株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS5T-Δpfkを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地(グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、biotin 10 ug/L、pH7.5(NaOH))に塗布し、25℃で約60時間培養した。得られた形質転換体をCM-Dex液体培地で34℃で1晩振とう培養し、適当に希釈した後、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、34℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのpfk遺伝子断片とATCC13869株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている株である。
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10培地(ショ糖 10g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・4H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、酢酸ナトリウム2g/l pH7.5(KOH))に塗布にし、34℃にて約30時間培養した。その結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しシュークロース非感受性となったと考えられる株を得た。
この様にして得られた株の中には、そのpfk遺伝子がpBS5T-Δpfkに由来する欠損型pfk遺伝子に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。pfk遺伝子が欠損型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応にておこなった。欠損型pfk遺伝子のみを有する株を選抜しATCC13869ΔsucAΔpfkと命名した。
(1)活性の弱化した変異型PFK
活性の弱化したPFKとして、PFK*1(配列番号57)及びPFK*2(配列番号59)を得た。PFK*1は野生型PFK(配列番号61)の171番目のグルタミン酸がリシンに置換されたものである。PFK*2は野生型PFK(配列番号61)の171番目のグルタミン酸がアルギニンに置換されたものである。これらの配列は野生型PFK鋳型とし、変異導入した合成DNAをプライマーとしたクロスオーバーPCRにより取得することが出来る。
PFK発現ベクターを構築するため、C.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号54、55の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いpfk遺伝子増幅産物を得た。PCR産物を常法により精製後Xba I及びKpn Iで消化しpfkを含む遺伝子断片を、上述のpVK9 のXba I及びKpn I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/m
lおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の遺伝子が挿入されていたものをpVK9-PFKと命名した。
次にPFK及びホスホケトラーゼを同時に発現するプラスミドを構築するため、上述のpVK9-PS2_xfpをXbaIで消化後、PS2_xfpを含む断片を常法により精製し、上述のpVK9-PFKのXbaI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル(宝バイオ社製)に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、PS2_xfpが挿入されていたものをpVK9-PS2_xfp_PFKと命名した。
変異型pfk遺伝子及びホスホケトラーゼ遺伝子を同時発現するプラスミドを構築するため、pVK9-PS2_xfp_PFK 構築と同様の手順で、pVK9-PS2_xfp_PFK*1及び pVK9-PS2_xfp_PFK*2を作成した。
上述のPFK及びホスホケトラーゼ発現プラスミド(pVK9-PS2_xfp_PFK、pVK9-PS2_xfp_PFK*1及び pVK9-PS2_xfp_PFK*2)を上述のATCC13869 ΔsucAΔpfk株に形質転換し、PFK酵素活性を検討した。形質転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地(グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、biotin 10 ug/L、pH7.5(NaOH))に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得た。
粗酵素液の抽出は以下に示す方法で行った。対数増殖期の菌体を遠心分離により回収し、100mM KPi(pH8.2) バッファーで洗浄後、同バッファーに溶解し、超音波破砕した。超遠心(60000rpm 30min)にて可溶性画分を分離し粗酵素抽出液とした。粗酵素液のたんぱく質量を定量するための手順を以下に示す。粗酵素液及び検量線作成のための濃度既知のBSAをそれぞれCBB溶液(ナカライテスク プロテインアッセイCBB溶液)と反応し発色後、酵素活性測定装置(Molecular Divices, spectra max 190)でOD595 nm を測定した。
次に、従来の方法( Denise Kotlars and Henri Buc, Methods in Enzymology (1982) 90: 60-70)に従いPFKの酵素活性を測定した。具体的な手順を以下に示す。酵素活性反応は、100 mM Tris-HCl (pH8.2), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1U/ml glycerol-3-phosphate dehydrogenase, 1U/ml triosephosphate isomerase, 1U/ml aldolase, 0.2 mM NADH, 10 mM fructose-6-phosphate, 粗酵素抽出液を混合後、酵素活性測定装置(Molecular Divices,
spectra max 190)でOD340 nmの経時変化測定した。野生型PFKの活性を1とした時の、弱化型PFKの相対活性を表5にまとめる。
(1)ビオチン充分条件での評価
C.glutamicum ATCC13869ΔsucAΔpfk株を用い、PFK活性弱化によるL-グルタミン酸発酵収率への効果を評価した。CM-Dexプレート培地にて培養して生育した各菌株を、グルコース 30g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.4g、(NH4) 2SO4 15g、FeSO4・7H2O 0.01g、MnSO4・7H2O 0.01g、大豆加水分解液 13.7ml、サイアミン塩酸塩 200μg、ビオチン 300μg、及びCaCO3 50gを純水 1L中に含む培地(KOHを用いてpHは8.0に調整されている)において、31.5℃にて培養した。培養後に培地中のL−グルタミン酸の蓄積量及び菌体量(OD)を
測定した。結果を図10に示す。L-グルタミン酸収率は、野生型PFK発現株と比べて、PFK弱化型発現株が高いことが明らかになった。
次に、上述の培地に培養開始後ODが10-14の適当な複数の時点でペニシリンGを終濃度4U/mlになるように添加し、菌の増殖を止めることで最終菌体量をそろえてL-グルタミン酸の収率を比較した。結果を図11に示す。
以上の結果は、ホスホケトラーゼの導入株においてPFKの弱化がL-グルタミン酸発酵収率の向上に有効であることを示している。
ホスホケトラーゼ活性が増強される細菌を用いたL−グルタミン生産の評価
ビフィドバクテリウム・フラバムAJ11576株(特開昭56−16479号公報)を用いることにより、L−グルタミンの発酵収率の改善に及ぼすホスホケトラーゼ遺伝子の導入の作用を評価した。
AJ11576株は、ビタミンP活性を有する化合物に耐性である。この株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(郵便番号305−8566日本国茨城県つくば市東1丁目1−1中央第6))で、1980年5月6日に寄託され、FERM P−05502の寄託番号を付与された。次にそれは、ブダペスト条約の条項下で国際寄託に移管されて、FERM BP−10381の寄託番号を付与された。
Claims (10)
- 有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌であって、D−キシルロース−5−リン酸ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース−6−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変された細菌。
- 前記有用な代謝産物がアセチル−コエンザイムAに由来する、請求項1記載の細菌。
- 前記有用な代謝産物が、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−プロリン、L−アルギニン、L−ロイシン、L−システイン、コハク酸及びポリヒドロキシブチレートからなる群から選択される、請求項1記載の細菌。
- 本来的にD−キシルロース−5−リン酸ホスホケトラーゼ及びフルクトース−6−リン酸ホスホケトラーゼの活性を有さず、D−キシルロース−5−リン酸ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース−6−リン酸ホスホケトラーゼをコードするDNA断片で形質転換された、請求項1記載の細菌。
- 6−ホスホフルクトキナーゼの活性が低減するようにさらに改変された、請求項1記載の細菌。
- 腸内細菌科属細菌、コリネ型細菌及びバチルス属細菌からなる群から選択される、請求項1記載の細菌。
- エシェリヒア属又はパントエア属に属する、請求項1記載の細菌。
- 有用な代謝産物の製造方法であって、培地中で請求項1〜7のいずれか一項に記載の細菌を培養すること、及び、該培地及び/又は該細菌から前記有用な代謝産物を採取することを含む方法。
- 前記有用な代謝産物がアセチル−コエンザイムAに由来する、請求項8記載の方法。
- 前記有用な代謝産物が、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−プロリン、L−アルギニン、L−ロイシン、L−システイン、コハク酸及びポリヒドロキシブチレートからなる群から選択される、請求項9記載の方法。
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