本明細書で提供される本発明は、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素A由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび/またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を特に開示する。本発明のホスホケトラーゼ酵素は、下でより詳細に記載されるように、様々な基質を使用し得る。特定の実施形態では、本発明は、キシルロース−5−リン酸からグリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素A由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび/またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、フルクトース−6−リン酸からエリスロース−4−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素A由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび/またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を提供する。なおも別の実施形態では、本発明はセドヘプツロース−7−リン酸からリボース−5−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素A由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび/またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を提供する。なおも別の実施形態では、本発明は、キシルロース−5−リン酸からグリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および/またはフルクトース−6−リン酸からエリスロース−4−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および/またはセドヘプツロース−7−リン酸からリボース−5−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素A由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび/またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を提供する。
宿主細胞内で代謝経路を操作するために、組換え的に発現されたホスホケトラーゼが使用されている。米国特許第7,785,858号明細書を参照されたい。Sonderegger et al.(Applied and Environmental Microbiology,2004,70:5,2892−97)は、エタノールを過剰産生するためのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)中のホスホケトラーゼの使用を記載する。Fleige et al.(Appl Microbial Biotechnol.,2011,91:3,769−76)は、生物が増殖のための唯一の炭素源としてフルクトースを利用する能力を回復させる、改変ラルストニア・オイトロファ(Ralstonia eutropha)株中におけるビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)ホスホケトラーゼ遺伝子(Meile et al.、前出)の発現を記載する。
理論的には、アセチルCoAの3つの分子は、可逆反応中の単一グルコース分子に由来し得る。しかし生物は、典型的に、最大2分子のアセチルCoAのみを産生し、残りの質量はCO2として失われる。CO2の放出は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応である、ピルビン酸からのアセチルCoA形成中に起こる。1つの炭素原子の損失は、アセチルCoA由来代謝産物、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイド分子の生産収率の低下につながる。この反応損失の例外は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびアセチルCoAシンターゼ酵素に依存して、嫌気的アセトゲン中で二酸化炭素をアセチルCoAに還元する、Wood−Ljungdahl経路である。
本発明は、Wood−Ljungdahl経路酵素に依存しない経路を利用して、1分子のグルコースから、3分子のアセチルCoAを潜在的に生成し得る交互の(alternate)代謝過程を提供する。それに代えて、それは特定の生物に見られるホスホケトラーゼ酵素を使用する[例えば、Biology of the Prokaryotes(ed.Lengeler,Drews and Schlegel);Blackwell Science,New York,1999,p.299−301;Meile et al.,J.of Bacteriology,2001,183:9,2929−36;Jeong et al.,J.Microbiol.Biotechnol.,2007,17:5,822−829を参照されたい]。ホスホケトラーゼ酵素は、典型的な代謝に見られるピルビン酸酸化を介さない、キシルロース−5−リン酸またはフルクトース−6−リン酸からの(アセチルリン酸を介する)アセチルCoA形成を可能にする。
ホスホケトラーゼは、それらの基質選択性に基づいて、X5Pのみに作用するキシルロース−5−リン酸(X5P)ホスホケトラーゼと、X5PおよびF6Pの双方に作用するX5P/フルクトース−6−リン酸(F6P)ホスホケトラーゼの2つのタイプに分類されている(Suzuki et al.,Acta Cryst.F66,2010,66:8,941−43)。ホスホケトラーゼは、無機リン酸(Pi)を使用して、X5PまたはF6Pの切断を触媒し、アセチルリン酸(アセチル−P)、H2O、およびグリセルアルデヒド−3−リン酸またはエリスロース−4−リン酸を生成する。引き続いて高エネルギー代謝産物アセチル−Pは、酢酸キナーゼによって酢酸に変換され、経路中のADPからATPが生成される(図1)。1つのグルコースあたり3つのアセチルCoAの最大収率を達成し得るように、アセチルリン酸に加えて、操作された代謝経路を通じて、酵素反応から生成されるグリセルアルデヒド−3−リン酸を再循環させ得る。顕著なことに、ホスホケトラーゼによって生成されるアセチルCoAは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ媒介反応で観察されるような炭素(例えばCO2)の損失を排除する。
ホスホケトラーゼはまた、セドヘプツロース−7−リン酸に作用して、それをリボース−5−リン酸とアセチルリン酸に変換し得る。このようなホスホケトラーゼの非限定的例は、セドヘプツロース−7−リン酸に対する触媒活性を有する、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)ホスホケトラーゼである。
本発明は、生成物収率を向上させるための、アセチルCoA由来代謝産物、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび/またはイソプレノイドの生産における、ホスホケトラーゼ酵素の使用を対象とする。具体的には、以下の平衡状態方程式で表わされる、理論的なイソプレン生成物収率が向上する(生物が、1モルのグルコースから6モルのCO2への完全酸化から、ATPを産生できるという仮説による):
MVA経路のみ
1.5グルコース+2.00 O2→1.00イソプレン+4.00 CO2+5.00 H2O
理論的収率−0.252gイソプレン/gグルコース
DXP経路
1.25グルコース+0.50 O2→1.00イソプレン+2.50 CO2+3.50 H2O
理論的収率−0.302gイソプレン/gグルコース
MVA+ホスホケトラーゼ経路
1.22グルコース+0.33 O2→1.00イソプレン+2.33 CO2+3.32 H2O
理論的収率−0.309gイソプレン/gグルコース
メバロン酸依存生合成経路は、例えば、ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)およびイソペンテニルピロリン酸(IPP)などのイソプレノイド前駆体分子の生成に、特に重要である。上方メバロン酸経路の酵素は、グルコースから生成されるアセチルCoAを、3つの酵素反応を通じてメバロン酸に変換する。理論に束縛されることなく、アセチルCoA生合成を増大させるためのホスホケトラーゼポリペプチドの使用によって生成される細胞内E4P、GAP、およびAc−P貯留の増大は、上方メバロン酸依存生合成経路の生産性増大をもたらし得て、それはメバロン酸の生合成と、結果的に、DMAPPおよびIPPなどの下流イソプレノイド前駆体分子の生合成とを実質的に増大させる(図1)。さらに、アセチルCoAの生合成増大は、脂肪酸、アミノ酸、およびアセトンなどのアセチルCoA由来代謝産物の合成増大をもたらし得る(図1)。したがって、この交互の(alternate)PKL経路による、細胞内量CoA(intracellular amount−CoA)生産の増大は、商業的応用に有利である。
アセトンは、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)などの特定の微生物によって産生される。それは、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ(EC2.3.1.9)による、2分子のアセチルCoAのアセトアセチルCoAへの縮合で開始する。次に、アセトアセチルCoAは、酢酸または酪酸との反応によってアセト酢酸に変換されて、アセチルCoAまたはブチリルCoAの生産がもたらされる。この反応は、アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ(EC2.8.3.8)などの酵素によって触媒される。アセトアセチルCoAトランスフェラーゼは、大腸菌(E.coli)またはC.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)などの様々な生物から知られている。しかし、3−オキソ酸CoAトランスフェラーゼ(EC2.8.3.5)またはコハク酸CoAリガーゼ(EC6.2.1.5)などの他の酵素もまた、この反応を触媒し得る。反応の最後のステップでは、アセト酢酸は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.4)によって触媒される脱炭酸ステップによって、アセトンに変換される。アセトンは、引き続いて、アセトン、イソプレン、およびプロペンに関して、その内容全体を参照によって本明細書に明示的に援用する、国際公開第2013/07786号パンフレットに記載されるようにして、イソプロパノール、イソブテンおよび/またはプロペンに変換され得る。
したがって、特定の態様では、本発明は、増大した細胞内量のエリスロース−4−リン酸、増大した細胞内量のグリセルアルデヒド−3−リン酸、および/または増大した細胞内量のリン酸がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した細胞内量のエリスロース−4−リン酸、増大した細胞内量のグリセルアルデヒド−3−リン酸、および/または増大した細胞内量のリン酸を産生する。
いくつかの態様では、本発明は、増大した細胞内量のアセチルCoAがある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した細胞内量のアセチルCoAを産生する。
特定の態様では、本発明は、メバロン酸の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸とを含んでなり、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した量のメバロン酸を産生する。
その他の態様では、本発明は、イソプレノイド前駆体の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸とを含んでなり、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した量のイソプレノイド前駆体を産生する。
なおも別の態様では、本発明は、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、(i)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(ii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、細胞は、回収可能量のイソプレンを産生できる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレンの生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、(i)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(ii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して、増大した量のイソプレンを産生する。
なおも別の態様では、本発明は、イソプレノイドを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、(i)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(ii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、細胞は、回収可能量のイソプレノイドを産生できる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレノイドの生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、(i)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(ii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレノイド産生細胞と比較して、増大した量のイソプレノイドを産生する。
その他の態様では、本発明は、アセチルCoA由来代謝産物を産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は、回収可能量のアセチルCoA由来代謝産物を産生できる。特定の実施形態では、本発明は、アセチルCoA由来代謝産物の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まない細胞のアセチルCoA由来代謝産物の産生と比較して、増大した量のアセチルCoA由来代謝産物を産生する。
本明細書の態様のいずれにおいても、本発明は、組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり得て、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)をはじめとする遺伝子の1つまたは複数の活性が調節されて、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が改善するようにさらに操作し得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、(i)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、(ii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、(iii)1つまたは複数の遺伝子の活性が調節されて、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するようにさらに操作され、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して、増大した量のイソプレンを産生する。
いくつかの実施形態では、本発明は、イソプレノイドを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドコードする、1つまたは複数の異種核酸と、(i)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、(ii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、(iii)1つまたは複数の遺伝子の活性が調節されて、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するようにさらに操作され、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレノイド産生細胞と比較して、増大した量のイソプレノイドを産生する。
その他の実施形態では、本発明は、アセチルCoA由来代謝産物の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、1つまたは複数の遺伝子の活性が調節されて、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するようにさらに操作され、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まない細胞のアセチルCoA由来代謝産物産生と比較して、増大した量のアセチルCoA由来代謝産物を産生する。
一般技術
特に断りのない限り、本発明の実施は、当該分野の技術範囲内である、(組換え技術をはじめとする)従来の分子生物学技術、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学を採用する。このような技術は、文献、“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第2版(Sambrook et al.,1989);“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait編,1984);“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney編,1987);“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.);“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.,編.,1987,and periodic updates);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis et al.,編,1994).Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)、およびMarch,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)で詳しく説明され、当業者に、本出願で使用される多くの用語について、一般的指針を提供する。
定義
「イソプレン」という用語は、2−メチル−1,3−ブタジエン(CAS#78−79−5)を指す。それは、3,3−ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)からのピロリン酸除去からの、直接的および最終揮発性C5炭化水素生成物であり得る。これは、IPP分子のDMAPP分子への結合または重合を伴わなくてもよい。「イソプレン」という用語は、本明細書で特に断りのない限り、通常、その生産方法に限定されることは意図されない。
本明細書の用法では、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、および融合ポリペプチドを含む。
本明細書の用法では、「単離ポリペプチド」は、2、5、10、20、50以上の異なるポリペプチドライブラリーなどのポリペプチドライブラリーの一部でなく、それが自然界で一緒に存在する少なくとも1つの構成要素から分離される。単離ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって得られ得る。
「異種ポリペプチド」とは、宿主細胞とは異なる生物、種、または株に由来する核酸配列によってコードされる、ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、自然界で同一宿主細胞に見られる、野生型ポリペプチドと同じでない。
本明細書の用法では、「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のどちらかで、共有結合的に共に連結した2つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび/またはリボヌクレオチドを指す。
「組換え核酸」とは、それに関心のある核酸が由来する生物の天然ゲノム中で、関心のある核酸の側面に位置する1つまたは複数の核酸(例えば、遺伝子)を含まない、関心のある核酸を意味する。したがって用語は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミドまたはウイルスに、または原核生物または真核生物ゲノムDNAに、組み込まれた組換えDNA、またはその他の配列から独立した別個の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じる、cDNA、ゲノムDNA断片、またはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。
「異種核酸」は、宿主細胞とは異なる生物、種または株に由来する核酸配列を意味する。いくつかの実施形態では、異種核酸は、天然で同一宿主細胞に見られる野生型核酸と同じでない。例えば、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)からのホスホケトラーゼ遺伝子によってコードされ、大腸菌(E.coli)を形質転換するのに使用される核酸は、異種核酸である。
本明細書の用法では、「ホスホケトラーゼ」、「ホスホケトラーゼ酵素」、または「ホスホケトラーゼポリペプチド」という用語は、同義的に使用されて、5−リン酸(5−phosphate)をグリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸に変換し、および/またはフルクトース−6−リン酸をエリスロース−4−リン酸およびアセチルリン酸に変換するポリペプチドを指す。一般に、ホスホケトラーゼは、ケトースに作用する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース−5−リン酸から、グリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、フルクトース−6−リン酸から、エリスロース−4−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−7−リン酸から、生成物(例えばリボース−5−リン酸)およびアセチルリン酸への変換を触媒する。
本明細書の用法では、「発現調節配列」は、興味深い核酸の転写を誘導する核酸配列を意味する。発現調節配列は、構成的または誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現調節配列は、「天然」または異種であり得る。天然発現調節配列は、発現される遺伝子と同じ生物、種、または株に由来する。異種発現調節配列は、発現される遺伝子と異なる生物、種、または株に由来する。「誘導性プロモーター」は、環境的または発生的調節下において、活性のプロモーターである。
「作動可能に連結する」とは、核酸発現制御配列(プロモーターなど)と第2の核酸配列の間の機能的連結を意味し、発現調節配列は、第2の配列に対応する、核酸の転写を誘導する。
本明細書の用法では、「最少培地(単数)」または「最少培地(複数)」という用語は、細胞増殖で可能な最少栄養素を含有して、通常はアミノ酸が不在である増殖培地を指す。最少培地は、典型的に、(1)細菌増殖のための炭素源;(2)細菌種および増殖条件間で変動し得る様々な塩;および(3)水を含有する。炭素源は、下でより詳細に考察されるように、グルコースのような単糖類から、酵母抽出物などの他のバイオマスのより複雑な加水分解物まで、著しく変動し得る。塩は、通常、マグネシウム、窒素、リン、およびイオウなどの必須元素を提供して、細胞がタンパク質および核酸を合成できるようにする。最少培地はまた、特定のプラスミドの維持などについて選択するために、抗生物質などの選択的薬剤によって補足し得る。例えば、微生物が、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの特定の抗生物質に耐性があれば、抵抗性を欠く細胞が増殖するのを防ぐために、その抗生物質を培地に添加し得る。培地は、特定のアミノ酸などの所望の生理学的または生化学的特性について選択するために、必要に応じて、その他の化合物で補足し得る。
本明細書の用法では、「イソプレノイド」という用語は、各単位が特定パターンに配列された5つの炭素原子からなる、2つ以上の炭化水素単位から構成される天然有機化合物クラスの大規模かつ多様なクラスを指す。本明細書の用法では、「イソプレン」は、「イソプレノイド」の定義から明示的に除外される。
本明細書の用法では、「テルペノイド」という用語は、多様な様式で構築および修飾されて、グループ構成員中で使用されるイソプレノイド単位数に基づいてグループ分けされた、五炭素イソプレノイド単位に由来する有機分子の大規模かつ多様なクラスを指す。ヘミテルペノイドは、1つのイソプレノイド単位を有する。モノテルペノイドは、2つのイソプレノイド単位を有する。セスキテルペノイドは、3つのイソプレノイド単位を有する。ジテルペノイドは、4つのイソプレン単位を有する。セスタテルペノイドは、5つのイソプレノイド単位を有する。トリテルペノイドは、6つのイソプレノイド単位を有する。テトラテルペノイドは、8つのイソプレノイド単位を有する。ポリテルペノイドは、8つを超えるイソプレノイド単位を有する。
本明細書の用法では、「イソプレノイド前駆体」は、テルペノイドまたはイソプレノイドの生合成において、生物によって使用される任意の分子を指す。イソプレノイド前駆体分子の非限定的例としては、例えば、メバロナート(例えばメバロン酸(MVA))、イソペンテニルピロリン酸(IPP)、およびジメチルアリル二リン酸(DMAPP)が挙げられる。
本明細書の用法では、「質量収率」という用語は、百分率として表される、組換え細胞によって消費されたグルコース質量で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を指す。
「比生産性」とは、生成物生成時間、細胞密度、および培養物容積で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を意味する。
「力価」は、培養液の容積で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を意味する。
本明細書の用法では、「細胞生産性指標(CPI)」という用語は、培養物中に生じた組換え細胞の質量で除した、組換え細胞によって産生された生成物の質量を指す。
本明細書で特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書の用法では、単数の用語「a」、「an」、および「the」は、文脈上明白に別段の記載がない限り、複数への言及を含む。
本明細書全体を通じて記載されるあらゆる最大数値限界は、あたかもより低い数値限界が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより低い数値限界を含むことが意図される。本明細書全体を通じて示されるあらゆる最小数値限界は、あたかもより高い数値限界が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより高い数値限界を含む。本明細書全体を通じて示されるあらゆる数値範囲は、あたかもより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記載されているかのように、このようなより広い数値範囲に含まれるあらゆるより狭い数値範囲を含む。
ホスホケトラーゼポリペプチドを発現する組換え細胞
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース−5−リン酸からグリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および/またはフルクトース−6−リン酸からエリスロース−4−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース−5−リン酸からグリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース−6−リン酸からエリスロース−4−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−7−リン酸から、生成物(例えばリボース−5−リン酸)およびアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論により拘束されることなく、本明細書に記載されるホスホケトラーゼの発現は、炭水化物源から生成されるアセチルリン酸量の増大をもたらし得る。このアセチルリン酸は、アセチルCoAに変換され得て、次にそれは、MVA経路の酵素機能によって使用され、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび/またはイソプレノイドが生成され得て、またはそれは、MVA経路の酵素機能によって使用されて、アセチルCoA由来代謝産物が生成され得る。
本明細書の用法では、「アセチルCoA由来代謝産物」という用語は、アセチルCoAから前記代謝産物への触媒性変換から生成される、代謝産物を指し得る。変換は、一段階反応または多段階合成反応であり得る。例えば、アセトンは、1)アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼによる、2分子のアセチルCoAのアセトアセチルCoAへの縮合;2)アセチルCoAまたはブチリルCoAの生成をもたらす、酢酸または酪酸との反応による、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換;および3)アセト酢酸デカルボキシラーゼによって触媒される脱炭酸ステップによる、アセト酢酸のアセトンへの変換の三段階反応(例えば多段階合成反応)によってアセチルCoAから生成される、アセチルCoA由来代謝産物である。アセトンは、引き続いてイソプロパノール、イソブテンおよび/またはプロペンに変換され得て、それらもまたアセチルCoA由来代謝産物であることが、本明細書で明示的に検討される。いくつかの実施形態では、アセチルCoA由来代謝産物は、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、および脂肪酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アセチルCoA由来代謝産物は、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、コハク酸、リジン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アセチルCoA由来代謝産物は、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、およびプロペンからなる群から選択される。したがって炭水化物基質から生成されるこれらの化合物(例えば、アセチルCoA、アセチルCoA由来代謝産物、アセチル−P、E4Pなど)の量が増大してもよい。
アセチル−PおよびアセチルCoAの生産は、増大をより高い細胞内濃度に反映させずに、増大させ得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ反応が起こっているにもかかわらず、細胞内アセチル−PまたはアセチルCoA濃度は不変であり、または低下することさえある。
例示的なホスホケトラーゼポリペプチドおよび核酸
例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なホスホケトラーゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。(例えば、図2〜24および実施例2を参照されたい)。それに加えて、表1および表2は、本発明の実施形態で使用してもよい、異なる生物種からの特定の例示的なホスホケトラーゼの非限定的一覧を提供する。
例示的なホスホケトラーゼの生化学的特性としては、タンパク質発現、タンパク質溶解度、および活性が挙げられるが、これに限定されるものではない。ホスホケトラーゼはまた、異なる生物タイプ(例えば、グラム陽性細菌、ラン藻、放線菌)間の多様性、通性低温嫌気性菌、所望の種の近縁種(例えば、大腸菌(E.coli))、および熱耐性をはじめとするが、これに限定されるものではない、その他の特性に基づいて選択し得る。
場合によっては、生物のゲノム中にホスホフルクトキナーゼ遺伝子が欠失していれば、特定の生物からのホスホケトラーゼを選択し得る。
さらに別の実施例では、ホスホケトラーゼは、アミノ酸配列の二次構造および/または実施例1に記載される方法に基づいて選択し得る。
なおも別の例では、ホスホケトラーゼは、実施例6に記載されるような生体外アッセイに基づいて選択し得る。
なおも別の例では、ホスホケトラーゼは、実施例7に記載されるような生体内アッセイに基づいて選択し得る。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、(a)ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる、組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、組換え細胞にトランスケトラーゼ活性(tktAB)欠陥があるステップと;(b)組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、(c)観察された細胞増殖の量に基づいて、前記ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性の存在を判定するステップとを含んでなる、ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性の存在を判定する方法である。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、(a)ホスホケトラーゼ活性を有することが疑われるポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる、組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、組換え細胞にトランスケトラーゼ活性(tktAB)欠陥があるステップと;(b)組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、(c)細胞増殖が観察された場合、ホスホケトラーゼ活性があるポリペプチドを同定するステップとを含んでなる、ホスホケトラーゼ活性があるポリペプチドを同定する方法である。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、(a)ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる、組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、組換え細胞にトランスケトラーゼ活性(tktAB)欠陥があるステップと;(b)組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、(c)細胞増殖の存在に基づいて、前記ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を検出するステップとを含んでなる、ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を組換え細胞内で検出する方法である。
本明細書で提供されるように、ホスホケトラーゼ活性は、アセチルCoA由来代謝産物、イソプレノイド前駆体(例えばIPP)、イソプレン、および/またはイソプレノイドの生産を改善し得る。本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼを含んでなる組換え宿主であって、細胞は、少なくとも1つの関心のある特性を示して、アセチルCoA由来代謝産物、イソプレノイド前駆体(例えばIPP)、イソプレン、および/またはイソプレノイドの生産を改善する。
いくつかの態様では、少なくとも1つの関心のある特性は、比生産性、収率、力価、および細胞性能指数(例えば増殖)からなる群から選択されるが、これに限定されるものではない。本明細書の用法では、「性能指標」は、計算された、親分子と比較した単位当たり活性を指す。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの態様では、性能指標の計算で使用される親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。いくつかの実施形態では、親分子は、定義上、1の性能指標を有する。その他の実施形態では、1を超える性能指標(PI>1.0)は、親分子と比較して改善されたホスホケトラーゼ(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)活性を示す。
特定の実施形態では、本明細書の用途のための適切なホスホケトラーゼとしては、可溶性ホスホケトラーゼが挙げられる。タンパク質溶解度の測定技術は、当該技術分野で周知である。タンパク質溶解度を測定する技術としては、本明細書の実施例で開示されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書の用途のためのホスホケトラーゼとしては、少なくとも20%の溶解度があるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ溶解度は、約5%〜約100%、約10%〜約100%、約15%〜約100%、約20%〜約100%、約25%〜約100%、約30%〜約100%、約35%〜約100%、約40%〜約100%、約45%〜約100%、約50%〜約100%、約55%〜約100%、約60%〜約100%、約65%〜約100%、約70%〜約100%、約75%〜約100%、約80%〜約100%、約85%〜約100%、または約90%〜約100%のいずれかである。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ溶解度は、約5%〜約100%である。いくつかの実施形態では、溶解度は、5%〜100%である。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ溶解度は、約100、90、80、70、60、50、40、30、20または10未満のいずれかであるが、約5%以上である。いくつかの実施形態では、溶解度は、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または95%のいずれかを超える。
所望の動態特性があるホスホケトラーゼは、イソプレンの生産を増大させる。動態特性としては、比活性、Kcat、Ki、およびKmが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様では、kcatは、少なくとも約0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.1、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、16.6、16.8、17.0、17.2、17.4、17.6、17.8、18.0、18.2、18.4、18.6、18.8、19.0、19.2、19.4、19.6、19.8、20.0、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、または800である。その他の態様では、kcatは、少なくとも約0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.92.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.1、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、または16.6である。
いくつかの態様では、Kmは、少なくとも約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、または56である。その他の態様では、kmは、少なくとも約2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、または22である。
興味深い特性としては、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まない組換え細胞と比較して増大した、細胞内活性、比生産性、収率、および細胞性能指標が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、比生産性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。一実施形態では、比生産性は、約40mg/L/OD/hrである。いくつかの実施形態では、収率は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。別の実施形態では、MVA収率は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。別の実施形態では、イソプレン収率は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。
その他の実施形態では、本明細書に記載されるホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドと、完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸とを含んでなる組換え細胞の(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖、または(d)細胞内アセチルリン酸の産生をはじめとするが、これに限定されるものではない興味深い特性の性能指標値が、ホスホケトラーゼ活性を有する親ポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1を超える、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8を超える、または10を超え、またはそれを上回る。
その他の実施形態では、完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、組換え細胞内の(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドのF6P比活性をはじめとするが、これに限定されるものではない興味深い特性の性能指標値が、ホスホケトラーゼ活性を有する親ポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1を超える、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8を超える、または10を超え、またはそれを上回る。
その他の実施形態では、(i)ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、組換え細胞の(a)イソプレン収率、タンパク質溶解度または(b)イソプレン比生産性をはじめとするが、これに限定されるものではない興味深い特性の性能指標値が、ホスホケトラーゼ活性を有する親ポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1を超える、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8を超える、または10を超え、またはそれを上回る。
その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書で提供されるのは、微生物から単離されたホスホケトラーゼである。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性細菌、嫌気性細菌、好熱性細菌、好冷細菌、好塩性細菌またはラン藻からなる群から単離される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼは、真菌から単離される。その他の態様では、例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。その他の態様では、例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。その他の態様では、例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。なおも別の態様では、例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。
使用し得る他のホスホケトラーゼとしては、B.ロングム(B.longum)、L.プランタルム(L.plantarum)、C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)、L.ロイテリー(L.reuteri)、L.パラプランタラム(L.paraplantarum)、R.パルストリス(R.palustris)、ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)、B.アニマリス(B.animalis)、B.ブレビ(B.breve)、G.バギナリス(G.vaginalis)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、M.パルジス(M.paludis)、パントエア属(Pantoea)種、R.アクアチリス(R.aquatilis)、N.パンクチフォルメ(N.punctiforme)、S.アベルミチリス(S.avermitilis)、およびT.フスカ(T.fusca)が挙げられるが、これに限定されるものではない。使用し得る追加的なホスホケトラーゼとしては、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、およびクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
標準法を使用して、ペプチドが、D−フルクトース−6−リン酸またはD−キシルロース−5−リン酸をアセチル−Pに変換する能力を測定することで、ポリペプチドが、ホスホケトラーゼペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。次にアセチル−Pは、分光光度法で検出し得るフェリルアセチルヒドロキサム酸に変換し得る(Meile et al.,J.Bact.183:2929−2936,2001)。本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼペプチド活性を有すると同定される任意のポリペプチドは、本発明で使用するのに適する。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース−5−リン酸から、グリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、フルクトース−6−リン酸から、エリスロース−4−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−7−リン酸からリボース−5−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース−5−リン酸からグリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および/またはフルクトース−6−リン酸からエリスロース−4−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および/またはセドヘプツロース−7−リン酸からリボース−5−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、ホスホケトラーゼ核酸は、本明細書に記載されるホスホケトラーゼ核酸配列のいずれかと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号52のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号53のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号54のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号55のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号56のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号57のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号58のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号59のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号60のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号61のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号62のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号63のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号64のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号65のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号66のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、シアノセイス属(Cyanothece)種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号67のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号68のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号69のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、リステリア・グレイー(Listeria grayi)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号70のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号71のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号72のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号73のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)ホスホケトラーゼ遺伝子によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号74および76のいずれか1つと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号75のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号77のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号78のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号79のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号80のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号81のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号82のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号83のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号84のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号85のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ナイセリア属(Neisseria)種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号86のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号87のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または87%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号88のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または88%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号89のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)ホスホケトラーゼ遺伝子によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号90および91のいずれか1つと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号92のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または92%の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号1によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号2によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号3によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号4によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号5によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号6によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号7によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、65%、または60%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号8によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号9によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号10によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、65%、または60%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号11によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号12によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号13によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では,ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号14によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、65%、または60%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では,ホスホケトラーゼポリペプチドは、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号15によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、65%、または60%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号16によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、または50%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号17によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトミセス属(Streptomyces)種ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号18によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、または50%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号19によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号20によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、または50%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では,ホスホケトラーゼポリペプチドは、シアノセイス属(Cyanothece)種ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号21によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、65%、または60%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、はネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号22によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号23によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、リステリア・グレイー(Listeria grayi)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号24によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号25によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号26によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号27によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号28によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号29によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号30によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号31によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号32によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号33によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号34によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号35によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号36によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号37によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号38によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号39によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ナイセリア属(Neisseria)種ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号40によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはエレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号41によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはアエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号42によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号43によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号44によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号45によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号46によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、70%、または65%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号47によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号48によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号49によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号50によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、と、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)ホスホケトラーゼアミノ酸配列:配列番号51によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチド少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性を有し得る。
本明細書で使用し得るホスホケトラーゼ酵素の追加的な例は、特にホスホケトラーゼ酵素に関する全ての開示に関して、参照によって本明細書に援用する、米国特許第7,785,858号明細書および国際公開第2011/159853号パンフレットに記載される。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、本明細書に記載されるように、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離される。その他の態様では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またははネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離される。その他の態様では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離される。なおも別の態様では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離される。
本明細書の実施形態のいずれにおいても、組換え細胞は、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)からなる群から選択される遺伝子の活性の1つまたは複数を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、組換え細胞は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)をはじめとする遺伝子の1つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
組換え細胞を使用して増大した量のアセチルCoAおよびアセチル由来代謝産物を生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、アセチルCoAを生産する方法である。いくつかの態様では、アセチルCoAを生産する方法は、(a)本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するように操作された、アセチルCoAを産生できる組換え細胞(上述の組換え細胞のいずれかをはじめとする)またはそれらの子孫を含んでなる組成物を培養するステップと;(b)メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。いくつかの態様では、アセチルCoAを生産する方法は、アセチルCoAの生産に適した条件下で、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養して、組換え細胞にアセチルCoAを産生させるステップを含んでなる。いくつかの態様では、アセチルCoAを生産する方法は、アセチルCoAを回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書に記載されるように、アセチルCoAを生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと;(b)アセチルCoAを生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、実施例7に記載されるようにして、生体内スクリーニングアッセイから同定されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに組換え細胞は、細胞を最少培地中で培養した際に、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回る濃度で、アセチルCoAを産生し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
本明細書でまた提供されるのは、アセチルCoA由来代謝産物を生産する方法である。いくつかの態様では、アセチルCoA由来代謝産物を生産する方法は、(a)本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するように操作された、アセチルCoA由来代謝産物を産生できる組換え細胞(上述の組換え細胞のいずれかをはじめとする)またはそれらの子孫を含んでなる組成物を培養するステップと;(b)メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。いくつかの態様では、アセチルCoA由来代謝産物を生産する方法は、アセチルCoA由来代謝産物の生産に適した条件下で、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養して、組換え細胞にアセチルCoA由来代謝産物を産生させるステップとを含んでなる。いくつかの態様では、アセチルCoAを生産する方法は、アセチルCoA由来代謝産物を回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書に記載されるように、アセチルCoA由来代謝産物を生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を培養するステップであって、細胞がホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと;(b)アセチルCoA由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、実施例7に記載されるようにして、生体内スクリーニングアッセイから同定されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに組換え細胞は、細胞を最少培地中で培養した際に、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回る濃度で、アセチルCoA由来代謝産物を産生し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
本明細書の実施形態のいずれかでは、アセチルCoA由来代謝産物は、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、または脂肪酸の1つまたは複数であり得る。本明細書の実施形態のいずれかでは、アセチルCoA由来代謝産物は、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、リジン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸の1つまたは複数であり得る。いくつかの実施形態では、アセチルCoA由来代謝産物は、コハク酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、アセチルCoA由来代謝産物は、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、またはプロペンの1つまたは複数であり得る。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、アセチルCoA由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルCoA由来代謝産物を生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の産生、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、アセチルCoA由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルCoA由来代謝産物を生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、アセチルCoA由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルCoA由来代謝産物を生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の産生、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、アセチルCoA由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルCoA由来代謝産物を生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
ホスホケトラーゼポリペプチドとMVA経路の1つまたは複数のポリペプチドとを発現する組換え細胞
メバロン酸依存性生合成経路(MVA経路)は、全ての高等真核生物および特定の細菌に存在する、主要代謝経路である。タンパク質プレニル化、細胞膜保守、タンパク質固着、およびN−グリコシル化などの多様なプロセスで使用される分子の生成に重要であるのに加えて、メバロン酸経路は、テルペン、テルペノイド、イソプレノイド、およびイソプレン生合成のための基礎原料の役割を果たす、イソプレノイド前駆体分子DMAPPおよびIPPの主要な供給源を提供する。
完全MVA経路は、上流および下流経路の2つのグループに細分化し得る。MVA経路の上流部分では、(a)(i)チオラーゼ活性または(ii)アセトアセチルCoAシンターゼ活性、(b)HMG−CoA還元酵素活性、および(c)HMG−CoAシンターゼ酵素活性のいずれかを有するポリペプチドの作用によって、細胞代謝中に生成されたアセチルCoAがメバロン酸に変換される。最初に、アセチルCoAが、チオラーゼまたはアセトアセチルCoAシンターゼ(アセチルCoAおよびマロニルCoAを使用する)の作用によって、アセトアセチルCoAに変換される。次に、アセトアセチルCoAが、HMG−CoAシンターゼの酵素作用によって、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoA(HMG−CoA)に変換される。このCoA誘導体は、HMGCoA還元酵素によってメバロン酸に還元され、これはイソプレノイド生産のメバロン酸経路の律速段階である。下流MVA経路では、メバロン酸は、次にメバロン酸キナーゼ作用によって、メバロン酸5−リン酸に変換され、それは引き続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性によって、5−ジホスホメバロン酸に変換される。最後に、メバロン酸5−ピロリン酸デカルボキシラーゼ酵素の活性によって、5−ジホスホメバロン酸からIPPが生成される。
したがって特定の実施形態では、本発明の組換え細胞は、MVA経路を通じて、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)キシルロース−5−リン酸からグリセルアルデヒド−3−リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力があるホスホケトラーゼをコードする、異種遺伝子、(ii)1つまたは複数のMVAポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種遺伝子、および(iii)宿主細胞内における、アセトアセチルCoAからのメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、またはイソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する1つまたは複数の異種遺伝子を含んでなる。別の実施形態では、本発明の組換え細胞は、(i)フルクトース6−リン酸からエリスロース4−リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力があるホスホケトラーゼをコードする、異種遺伝子、(ii)1つまたは複数のMVAポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種遺伝子、および(iii)宿主細胞内における、アセトアセチルCoAからのメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する1つまたは複数の異種遺伝子を含んでなる、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞である。
上流MVA経路ポリペプチド
MVA経路の上流部分は、(a)(i)チオラーゼ活性または(ii)アセトアセチルCoA合成活性、(b)HMG−CoA還元酵素、および(c)HMG−CoAシンターゼ酵素活性のいずれかを有するポリペプチドの作用によって、メバロン酸に変換される最初の基質として、細胞代謝中に生じるアセチルCoAを使用する。最初に、アセチルCoAが、チオラーゼまたはアセトアセチルCoAシンターゼ(アセチルCoAおよびマロニルCoAを利用する)の作用によって、アセトアセチルCoAに変換される。次に、アセトアセチルCoAは、HMG−CoAシンターゼの酵素作用によって、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoA(HMG−CoA)に変換される。このCoA誘導体は、HMG−CoA還元酵素によってメバロン酸に還元され、これはイソプレノイド生成のメバロン酸経路の律速段階である。
上流MVA経路ポリペプチドの非限定的例としては、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ(AA−CoAチオラーゼ)ポリペプチド、アセトアセチルCoAシンターゼポリペプチド、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAシンターゼ(HMG−CoAシンターゼ)ポリペプチド、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoA還元酵素(HMG−CoA還元酵素)ポリペプチドが挙げられる。上流MVA経路ポリペプチドとしては、上流MVA経路ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的な上流MVA経路核酸としては、上流MVA経路ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なMVA経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。したがって、上流MVA経路ポリペプチドをコードする任意の遺伝子を、本発明で使用し得ることが、本明細書で検討される。
特定の実施形態では、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaS遺伝子の様々な選択肢が、単独で、または上流MVA経路からの1つまたは複数のタンパク質をコードするその他のmvaEおよびmvaS遺伝子との組み合わせで、本発明の範囲内で検討される。別の実施形態では、本発明の範囲内で、(i)3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoAシンターゼ(HMG−CoAシンターゼ)ポリペプチドおよび3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA還元酵素(HMG−CoA還元酵素)ポリペプチドをコードする1つまたは複数のその他の遺伝子との組み合わせで、アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子が検討される。したがって、特定の態様では、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、本明細書で検討される遺伝子組み合わせのいずれかを組換え細胞内で発現させ得る。
本明細書で使用し得る上流MVA経路ポリペプチドの追加的な非限定的例は、国際公開第2009/076676号パンフレット;国際公開第2010/003007号パンフレット、および国際公開第2010/148150号パンフレットに記載される。
mvaEおよびmvaSポリペプチドをコードする遺伝子
特定の実施形態では、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaS遺伝子の様々な選択肢が、単独で、または上流MVA経路からの1つまたは複数のタンパク質をコードするその他のmvaEおよびmvaS遺伝子との組み合わせで、本発明の範囲内で検討される。L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、およびE.ファエカリス(E.faecalis)中で、mvaE遺伝子は、チオラーゼおよびHMG−CoA還元酵素活性の双方を持つポリペプチドをコードする。事実上、mvaE遺伝子産物は、真正細菌中で発見された最初のIPP生合成の二機能性酵素、および天然で別のタンパク質に融合するHMG−CoA還元酵素の最初の例に相当する(Hedl,et al.,J Bacteriol.2002年4月;184(8):2116−2122)。他方、mvaS遺伝子は、HMG−CoAシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
したがって、組換え細胞(例えば、大腸菌(E.coli)は、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からの1つまたは複数のmvaEおよびmvaS遺伝子を発現して、メバロン酸を産生するように改変し得る。1つまたは複数のmvaEおよびmvaS遺伝子は、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、1つまたは複数のmvaEおよびmvaS遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、1つまたは複数のmvaEおよびmvaS遺伝子の異種性発現で、遺伝子の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、1つまたは複数のmvaEおよびmvaS遺伝子発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
例示的なmvaEポリペプチドおよび核酸
mvaE遺伝子は、チオラーゼおよびHMG−CoA還元酵素活性の双方を持つポリペプチドをコードする。mvaE遺伝子によってコードされるポリペプチドのチオラーゼ活性が、アセチルCoAをアセトアセチルCoAに変換するのに対し、ポリペプチドのHMG−CoA還元酵素の酵素活性は、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAをメバロン酸に変換する。例示的なmvaEポリペプチドおよび核酸としては、mvaEポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
変異mvaEポリペプチドとしては、mvaEポリペプチド活性(すなわちアセチルCoAをアセトアセチルCoAに変換する能力、ならびに3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAをメバロン酸に変換する能力)を保ちながら、その中で1つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けたものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的であり得て、このような置換アミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされ得て、またはコードされ得ない。標準的な20のアミノ酸「アルファベット」が、それらの側鎖類似性に基づいて、化学物質ファミリーに分類されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)のあるアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである(すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸が、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸で置換される)。「非保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである(すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸が、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸で置換される)。
mvaEポリペプチド内にアミノ酸置換を導入して、分子の機能性を改善し得る。例えば、基質に対するmvaEポリペプチドの結合親和性を増大させ、またはアセチルCoAをアセトアセチルCoAに変換する能力および/または3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAをメバロン酸に変換する能力を改善するアミノ酸置換をmvaEポリペプチドに導入し得る。いくつかの態様では、変異mvaEポリペプチドは、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。
一態様では、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、および/またはイソプレノイドを生成するために、分解されないまたは分解を起こしにくいmvaEタンパク質を使用し得る。使用し得る、分解されないまたは分解を起こしにくいmvaEの遺伝子産物の例としては、生物E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、E.ファエカリス(E.faecalis)、およびL.グレイー(L.grayi)からのものが挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者は、任意の標準的分子生物学的技術によって、大腸菌(E.coli)BL21(DE3)中でmvaEタンパク質を発現させて、断片の不在を探し得る。例えば、断片の不在は、Hisタグ媒介精製に続いて、Safestain染色されたSDS−PAGEゲル上で同定し得て、またはメバロン酸、イソプレン、またはイソプレノイド産生大腸菌(E.coli)BL21内で発現される場合は、本明細書に記載される検出方法を使用して同定し得る。
Hedl et al.,(J Bacteriol.2002年4月;184(8):2116−2122)に記載されるものなどの標準法を使用して、アセトアセチルCoAチオラーゼならびにHMG−CoA還元酵素活性を測定することで、ポリペプチドがmvaE活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なアッセイでは、アセトアセチルCoAチオラーゼ活性が、分光光度計によって測定され、アセトアセチルCoAの形成またはチオ開裂に伴う302nmにおける吸光度の変化が、モニターされる。アセトアセチルCoAの合成を判定するための各反応の標準アッセイ条件は、1mMのアセチルCoA、10mMのMgCl2、50mMのトリス、pH10.5であり、反応は酵素の添加によって開始される。アッセイは、200μlの最終容量を採用し得る。アッセイでは、1酵素単位(eu)が、1分間の1μmolアセトアセチルCoA中の合成またはチオ開裂に相当する。別の例示的なアッセイでは、分光光度計によって、340nmにおけるNADP(H)の出現または消失によって、HMG−CoA還元酵素活性をモニターし得る。HMG−CoAのメバロン酸への還元脱アシル化を示すために測定される各反応の標準アッセイ条件は、0.4mMのNADPH、1.0mMの(R,S)−HMG−CoA、100mMのKCl、および100mMのKxPO4、pH6.5である。アッセイは、200μlの最終容量を採用する。反応は、酵素を添加することで開始される。アッセイでは、1euは、1分間の1μmolのNADP(H)中の代謝回転に相当する。これは、0.5μmolのHMG−CoAまたはメバロン酸の代謝回転に相当する。
代案としては、組換え細胞内のメバロン酸の生成は、制限なしに、ガスクロマトグラフィー(米国特許出願公開第2005/0287655A1号明細書を参照されたい)またはHPLC(米国特許出願公開第2011/0159557号明細書A1を参照されたい)によって測定し得る。例示的なアッセイとして、1つまたは複数の抗生物質で補足されたLBブロスを含有する振盪管に、培養物を接種して、34℃、250rpmで、14時間培養し得る。次に、1%グルコース、0.1%酵母抽出物、および200μMのIPTGで補足されたTM3培地を含有するウェルプレート内で、培養物を0.2の最終ODに希釈し得る。次にプレートをBreath Easierメンブレン(Diversified Biotech)で密封し、振盪機/インキュベーター内で、34℃、600rpmで24時間培養する。次に1mLの各培養物を3,000×gで5分間遠心分離する。次に上清を20%硫酸に添加して、氷上で5分間インキュベートする。次に混合物を3000×gで5分間遠心分離して、HPLC分析のために上清を収集する。サンプル中のメバロン酸濃度は、メバロン酸(Sigma)の標準曲線と比較することで判定される。グルコース濃度は、当該技術分野で公知のいずれかの方法に従って、グルコースオキシダーゼアッセイを実施することでさらに測定し得る。HPLCを使用して、各サンプルの屈折率応答と、既知濃度の様々なメバロン酸を含有する溶液を通過させて得られる検量線とを比較することにより、メバロン酸レベルを定量化し得る。
例示的なmvaE核酸としては、mvaEポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なmvaEポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なmvaE核酸としては、例えば、リステリア・グレイー(Listeria grayi)DSM 20601、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)EG2、エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)、および/またはエンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)から単離されたmvaE核酸が挙げられる。リステリア・グレイー(Listeria grayi)DSM 20601 mvaE遺伝子によってコードされるmvaE核酸は、配列番号95と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)mvaE遺伝子によってコードされるmvaE核酸は、配列番号96と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)EG2mvaE遺伝子によってコードされるmvaE核酸は、配列番号97と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)mvaE遺伝子によってコードされるmvaE核酸は、配列番号98と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)mvaE遺伝子によってコードされるmvaE核酸は、以前、メバロン酸を産生する大腸菌(E.coli)で開示されたmvaE遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る(米国特許出願公開第2005/0287655A1号明細書;Tabata,K.and Hashimoto,S.−I.Biotechnology Letters 26:1487−1491,2004を参照されたい)。
mvaE核酸は、組換え細胞内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、mvaE核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、mvaE核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、mvaE核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
例示的なmvaSポリペプチドおよび核酸
mvaS遺伝子は、HMG−CoAシンターゼ活性を持つポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルCoAを3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA(HMG−CoA)に変換し得る。例示的なmvaSポリペプチドおよび核酸としては、mvaSポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
変異mvaSポリペプチドとしては、mvaSポリペプチド活性(すなわちアセトアセチルCoAを3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAに変換する能力)を保ちながら、その中で1つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けたものが挙げられる。mvaSポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子機能性を改善し得る。例えば、mvaSポリペプチドの基質に対する結合親和性を増大させ、またはアセトアセチルCoAを3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAに変換する能力を改善するアミノ酸置換を、mvaSポリペプチドに導入し得る。いくつかの態様では、変異mvaSポリペプチドは、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。
Quant et al.(Biochem J.,1989,262:159−164)に記載されるものなどの標準法を使用して、HMG−CoAシンターゼ活性を測定することで、ポリペプチドがmvaS活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なアッセイでは、303nmにおける吸光度の変化をモニターすることで、アセトアセチルCoAのエノール形態の消失を分光光度的に測定することで、HMG−CoAシンターゼ活性をアッセイし得る。30℃で、50mmのトリス/HCl、pH8.0、10mMのMgCl2、および0.2mMのジチオスレイトールを含有する、標準1mlアッセイシステム;5mM−アセチルリン酸、10,MアセトアセチルCoA、および5μlの抽出物サンプルを添加し得て、アセチルCoA(100μM)および10単位のPTAの同時添加がそれに続く。次にHMG−CoAシンターゼ活性をアセチルCoA添加前後の速度差として測定する。使用された条件下(pH8.0、10mM−MgCl2)におけるアセトアセチルCoAの吸収係数は、12.2×103M−1cm−1である。定義上、1単位の酵素活性は、1分あたり1μmolのアセトアセチルCoAの変換を引き起こす。
代案としては、組換え細胞内のメバロン酸の生成は、制限なしに、ガスクロマトグラフィー(米国特許出願公開第2005/0287655A1号明細書を参照されたい)またはHPLC(米国特許出願公開第2011/0159557号明細書A1を参照されたい)によって測定し得る。例示的なアッセイとして、培養物を、1つまたは複数の抗生物質で補足されたLBブロスを含有する振盪管に接種して、34℃、250rpmで、14時間培養し得る。次に、1%グルコース、0.1%酵母抽出物、および200μMのIPTGで補足されたTM3培地を含有するウェルプレート内で、培養物を0.2の最終ODに希釈し得る。次に、プレートをBreath Easierメンブレン(Diversified Biotech)で密封し、振盪機/インキュベーター内で、34℃、600rpmで24時間培養する。次に、1mLの各培養物を3,000×gで5分間遠心分離する。次に、上清を20%硫酸に添加して、氷上で5分間インキュベートする。次に、混合物を3000×gで5分間遠心分離して、HPLC分析のために上清を収集する。サンプル中のメバロン酸濃度は、メバロン酸(Sigma)の標準曲線と比較することで判定される。グルコース濃度は、当該技術分野で公知のいずれかの方法に従って、グルコースオキシダーゼアッセイを実施することでさらに測定し得る。HPLCを使用して、各サンプルの屈折率応答と、既知濃度の様々なメバロン酸を含有する溶液を通過させて得られる検量線とを比較することにより、メバロン酸レベルを定量化し得る。
例示的なmvaS核酸としては、mvaSポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なmvaSポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なmvaS核酸としては、例えば、リステリア・グレイー(Listeria grayi)DSM 20601、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)EG2、エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)、および/またはエンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)から単離されたmvaS核酸が挙げられる。リステリア・グレイー(Listeria grayi)DSM 20601 mvaS遺伝子によってコードされるmvaS核酸は、配列番号99と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)mvaS遺伝子によってコードされるmvaS核酸は、配列番号100と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)EG2 mvaS遺伝子によってコードされるmvaS核酸は、配列番号101と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)mvaS遺伝子によってコードされるmvaS核酸は、配列番号102と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)mvaS遺伝子によってコードされるmvaS核酸は、以前、メバロン酸を産生する大腸菌(E.coli)で開示されたmvaE遺伝子と、少なくとも約99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有し得る(米国特許出願公開第2005/0287655A1号明細書;Tabata、K.and Hashimoto,S.−I.Biotechnology Letters 26:1487−1491,2004を参照されたい)。
mvaS核酸は、組換え細胞内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、mvaS核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、mvaS核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、mvaS核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子
アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子(別名nphT7)は、マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有して、2つのアセチルCoA分子からアセトアセチルCoAを合成する最小の活性(例えば、皆無の活性)を有する酵素をコードする遺伝子である。nphT7に関する教示については、例えば、その内容を本明細書に明示的に援用する、Okamura et al.,PNAS Vol 107,No.25,pp.11265−11270(2010)を参照されたい。ストレプトミセス属(Streptomyces)の放線菌CL190株からのアセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子は、特開2008−61506A号公報および米国特許出願公開第2010/0285549号明細書に記載される。アセトアセチルCoAシンターゼはまた、アセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素とも称され得る。使用し得る代表的なアセトアセチルCoAシンターゼ(またはアセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素)は、GenbankAB540131.1である。
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれにおいても、マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する能力を有する酵素を使用し得る。このような酵素の非限定的例は、本明細書に記載される。本明細書に記載される特定の実施形態では、マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する、ストレプトミセス属(Streptomyces)の放線菌に由来するアセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子を使用し得る。このようなアセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子の一例は、アミノを有するタンパク質をコードする遺伝子である。このようなタンパク質は、マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有するアセトアセチルCoAシンターゼに対応する配列番号103のアミノ酸配列を有し、2つのアセチルCoA分子からアセトアセチルCoAを合成する活性を有しない。
一実施形態では、配列番号103のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ストレプトミセス属(Streptomyces)種CL190株の放線菌類から入手されるゲノムDNAをテンプレートとして、および特開第2008−61506A号公報を参照してデザインし得る1対のプライマーを使用して、核酸増幅法(例えばPCR)によって得られ得る。
本明細書に記載されるように、本発明で使用するためのアセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子は、ストレプトミセス属(Streptomyces)種CL190株の放線菌類からの配列番号103のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子に限定されない。マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する能力を有して、2つのアセチルCoA分子からアセトアセチルCoAを合成しない、タンパク質をコードする任意の遺伝子を本明細書に記載する方法で使用し得る。特定の実施形態では、アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子は、配列番号103のアミノ酸配列と高度に類似し、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有して、マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有する、タンパク質をコードする遺伝子であり得る。「高度に類似」または「実質的に同一」という表現は、例えば、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、および少なくとも約99%の同一性を指す。上で使用されるように、同一性は、異なるアミノ酸配列および配列番号103のアミノ酸配列中のアミノ酸残基間の同一性の百分率に相当し、それは配列類似性を検索するプログラムを使用して、配列番号103および異なるアミノ酸配列の、アミノ酸配列のアライメントを実施することで計算される。
その他の実施形態では、アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子は、1つ以上アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって、配列番号103のアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を有し、マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有する、タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。本明細書では、「より多くのアミノ酸」という表現は、例えば、2〜30個のアミノ酸、好ましくは2〜20個のアミノ酸、より好ましくは2〜10個のアミノ酸、最も好ましくは2〜5個のアミノ酸を指す。
なおも別の実施形態では、アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号103のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの部分または全体とハイブリダイズでき、マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードできる、ポリヌクレオチドからなってもよい。本明細書では、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションは、60℃で2回のSSC洗浄条件下における結合維持に相当する。ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(2001)に記載される方法などの従来の既知の方法によって実施し得る。
本明細書に記載されるように、配列番号103のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルCoAシンターゼをコードする遺伝子は、例えば、ストレプトミセス属(Streptomyces)種CL190株から得られたのではない放線菌類などの、潜在的にあらゆる生物から単離し得る。さらに、本明細書の用途のためのアセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子は、当該技術分野で知られている方法によって、配列番号103のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを改変することで得られ得る。ヌクレオチド配列の変異誘発は、クンケル法またはギャップド二本鎖法、またはそれらのどちらかに類似した方法などの既知の方法によって実施し得る。例えば、変異誘発は、変異誘発キット(例えば製品名;Mutant−KおよびMutant−G(TAKARA Bio))、部位特異的変異誘発のための製品名;LA PCR invitro Mutagenesisシリーズキット(TAKARA Bio)などを使用して、実施してもよい。
配列番号103のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルCoAシンターゼの活性は、下述するように評価し得る。具体的には、評価されるタンパク質をコードする遺伝子を、その中で遺伝子が発現し得るように、最初に宿主細胞に導入し、クロマトグラフィーなどの技術によるタンパク質の精製がそれに続く。評価される得られたタンパク質含有する緩衝液に、基質としてマロニルCoAおよびアセチルCoAを添加し、例えば、所望の温度(例えば、10℃〜60℃)での培養がそれに続く。反応完了後、失われた基質量および/または生成された生成物量(アセトアセチルCoA)を判定する。したがって試験されるタンパク質が、マロニルCoAおよびアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するかどうかを評価し、合成程度を評価することが可能である。このような場合、評価される得られたタンパク質を含有する緩衝液に、基質としてアセチルCoAのみを入れて、失われた基質量および/または生成された生成物量を同様に判定することで、タンパク質が2つのアセチルCoA分子から、アセトアセチルCoAを合成する活性を有するかどうかを調べることが可能である。
メバロン酸の生産増大能力がある組換え細胞
本明細書に記載される組換え細胞(例えば組換え細菌細胞)は、本明細書に記載される様々な酵素経路に対する任意の操作なしの同一細胞を上回る量および/または濃度で、メバロン酸を産生し得る。したがって、本明細書に記載される様々な経路の調節のために操作されている組換え細胞(例えば細菌細胞)は、メバロン酸の生産向上に有用である。
したがって、特定の態様では、本発明は、メバロン酸の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸とを含んでなり、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した量のメバロン酸を産生する。
特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
一実施形態では、組換え細胞は、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaSポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピーをさらに含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、アセトアセチルCoAシンターゼと、上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸とをさらに含んでなる。
一実施形態では、組換え細胞は、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)からなる群から選択される、遺伝子の1つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、組換え細胞は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)をはじめとする遺伝子の1つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
一態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回る容積生産性で、メバロン酸を産生し得る。特定の実施形態では、組換え細胞は、2.00g/L/hrを超えるメバロン酸を産生し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約1.0g/L/hr、1.2g/L/hr、1.4g/L/hr、1.6g/L/hr、1.8g/L/hr、2.0g/L/hr、2.2g/L/hr、2.4g/L/hr、2.6g/L/hr、2.8g/L/hr、3.0g/L/hr、3.2g/L/hr、3.4g/L/hr、3.6g/L/hr、3.8g/L/hr、4.0g/L/hr、4.2g/L/hr、4.4g/L/hr、4.6g/L/hr、4.8g/L/hr、5.0g/L/hr、5.2g/L/hr、5.4g/L/hr、5.6g/L/hr、5.8g/L/hr、6.0g/L/hrを超える、ならびにこれらの数字間の任意の数値のメバロン酸を産生し得る。
一態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回る力価で、メバロン酸を産生し得る。これらの組換え細胞は、約48時間の発酵後に、100g/Lを超えるピーク力価のメバロン酸を産生し得る。代案としては、組換え細胞は、48時間の発酵後に、包括的に、約50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L、210g/L、220g/L、230g/L、240g/L、250g/L、260g/L、270g/L、280g/L、290g/L、300g/Lを超える、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のピーク力価のメバロン酸を産生し得る。
その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、MVA経路に向かう炭素流を増大させ、したがって同様に操作されていない細胞と比較して、より高い力価のメバロン酸を産生する、1つまたは複数の変異をさらに含んでなる。このような実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るピーク力価で、メバロン酸を産生する。一実施形態では、組換え細胞は、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)からなる群から選択される、遺伝子の1つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、組換え細胞は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)をはじめとする遺伝子の1つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
一態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るメバロン酸の細胞生産性指数(CPI)で、メバロン酸を産生し得る。組換え細胞は、少なくとも約3.0(g/g)のメバロン酸CPIを有し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、少なくとも約1(g/g)、2(g/g)、3(g/g)、4(g/g)、5(g/g)、6(g/g)、7(g/g)、8(g/g)、9(g/g)、10(g/g)、11(g/g)、12(g/g)、13(g/g)、14(g/g)、15(g/g)、20(g/g)、25(g/g)、または30(g/g)の、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のメバロン酸のCPIを有し得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、MVA経路に向かう炭素流を増大させる1つまたは複数の変異をさらに含んでなり、それは、同様に操作されていない細胞と比較して、メバロン酸のより高い細胞生産性指標(CPI)をもたらす。さらに、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るCPIを有する。一実施形態では、組換え細胞は、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)からなる群から選択される、遺伝子の1つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)遺伝子をはじめとする、1つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
さらに、本明細書に記載される細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るグルコースからのメバロン酸の質量収率を有する。組換え細胞は、グルコースから、少なくとも約28%のメバロン酸の質量収率を生じ得る。代案としては、組換え細胞は、グルコースから、包括的に、少なくとも約25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、または55%の、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のメバロン酸の質量収率を産生し得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、MVA経路に向かう炭素流を増大させる1つまたは複数の変異をさらに含んでなり、それは、同様に操作されていない細胞と比較して、メバロン酸の質量収率をもたらす。さらに、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るメバロン酸の質量収率を有する。一実施形態では、組換え細胞は、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)からなる群から選択される、遺伝子の1つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)遺伝子をはじめとする、1つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
一態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピーを欠く同一細胞と比較して、発酵ブロス中により少量の酢酸を蓄積する一方で、メバロン酸を産生する。組換え細胞は、48時間の発酵中に、4.5g/L未満の酢酸を発酵ブロス中に蓄積する一方で、増大したメバロン酸レベルを生じ得る。代案としては、組換え細胞は、48時間の発酵中に、包括的に、約8.0g/L、7.5g/L、7.0g/L、6.5g/L、6.0g/L、5.5g/L、5.0g/L、4.5g/L、4.0g/L、3.5g/L、3.0g/L、2.5g/L、2.0g/L、または1.5g/L未満の、ならびにこれらの数字の間の任意の数値酢酸を発酵ブロス中に蓄積する一方で、増大したメバロン酸レベルを生じ得る。特定の実施形態では、発酵ブロス中の酢酸蓄積低下は、発酵稼働中の細胞生存率を改善し得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、同様に操作されていない細胞と比較して、発酵ブロス中により少量の酢酸を蓄積する一方で、MVA経路に向かう炭素流を増大させて、メバロン酸レベルの増大をもたらす、1つまたは複数の変異をさらに含んでなる。特定の実施形態では、発酵ブロス中の酢酸蓄積低下は、発酵稼働中の細胞生存率を改善し得る。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるメバロン酸産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の産生、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるメバロン酸産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるメバロン酸産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の産生、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるメバロン酸産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
組換え細胞を使用して増大した量のメバロン酸を生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、メバロン酸を生産する方法である。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、(a)本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するように操作された、メバロン酸を産生できる組換え細胞(上述の組換え細胞のいずれかをはじめとする)またはそれらの子孫を含んでなる組成物を培養するステップと;(b)メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸の生産に適した条件下で、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養して、組換え細胞にメバロン酸を産生させるステップとを含んでなる。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書に記載されるように、メバロン酸を生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸と並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと;(b)メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
さらに、組換え細胞は、細胞を最少培地中で培養した際に、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸と並んで、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回る濃度で、メバロン酸を産生し得る。特定の実施形態では、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
メバロン酸を生産するための本方法は、2.00g/L/hrのメバロン酸を超える容積生産性を有する細胞を使用して、メバロン酸を生産し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約1.0g/L/hr、1.2g/L/hr、1.4g/L/hr、1.6g/L/hr、1.8g/L/hr、2.0g/L/hr、2.2g/L/hr、2.4g/L/hr、2.6g/L/hr、2.8g/L/hr、3.0g/L/hr、3.2g/L/hr、3.4g/L/hr、3.6g/L/hr、3.8g/L/hr、4.0g/L/hr、4.2g/L/hr、4.4g/L/hr、4.6g/L/hr、4.8g/L/hr、5.0g/L/hr、5.2g/L/hr、5.4g/L/hr、5.6g/L/hr、5.8g/L/hr、6.0g/L/hrを超える、ならびにこれらの数字間の任意の数値のメバロン酸を産生し得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
他の実施形態では、メバロン酸を生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸と並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと;(b)メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、48時間の発酵後に、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回るピーク力価がある、メバロン酸を産生する。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
メバロン酸を生産する本方法は、48時間に発酵後に、約100g/Lピーク力価のメバロン酸を超えるピーク力価を生じ得る細胞を使用して、メバロン酸を生産し得る。代案としては、組換え細胞は、48時間の発酵後に、包括的に、約50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L、210g/L、220g/L、230g/L、240g/L、250g/L、260g/L、270g/L、280g/L、290g/L、300g/Lを超える、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のピーク力価のメバロン酸を産生し得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
他の実施形態では、メバロン酸を生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸と並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと;(b)メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回る、メバロン酸のCPIを有する。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
メバロン酸を生産するための本方法は、細胞を使用して、少なくとも約3.0(g/g)のメバロン酸のCPIで、メバロン酸を生産し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、少なくとも約1(g/g)、2(g/g)、3(g/g)、4(g/g)、5(g/g)、6(g/g)、7(g/g)、8(g/g)、9(g/g)、10(g/g)、11(g/g)、12(g/g)、13(g/g)、14(g/g)、15(g/g)、20(g/g)、25(g/g)、または30(g/g)の、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のメバロン酸のCPIを有し得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
特定の実施形態では、メバロン酸を生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸と並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと;(b)メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞と比較して、低下した酸素取り込み速度(OUR)を示す。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを発現する組換え細胞は、ホスホケトラーゼを発現しない組換え細胞と比較して、OURに最大で1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍または7倍の低下を示す。
本明細書で提供されるのは、上述の細胞のいずれかを使用して、メバロン酸の生産を向上させる方法である。細胞によるメバロン酸の生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上させ得る。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
メバロン酸の生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現がない、メバロン酸産生細胞によるメバロン酸の生産と比較して、約1,000,000倍(例えば、約1〜約500,000倍、約1〜約50,000倍,約1〜約5,000倍、約1〜約1,000倍、約1〜約500倍、約1〜約100倍、約1〜約50倍、約5〜約100,000倍、約5〜約10,000倍、約5〜約1,000倍、約5〜約500倍、約5〜約100倍、約10〜約50,000倍、約50〜約10,000倍、約100〜約5,000倍、約200〜約1,000倍、約50〜約500倍、または約50〜約200倍)向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、MVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
その他の態様では、本明細書に記載される方法は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現がない、メバロン酸産生細胞によるメバロン酸の生産と比較して、少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍、または1,000,000倍のいずれかで、メバロン酸の生産向上を提供し得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、MVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている。
さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載される方法で細胞を培養し得る。例えば、いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼ遺伝子を内在性に有しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を34℃の最少培地中で培養するステップであって、組換え細胞が、低から中程度のプラスミドコピーで、強力なプロモーター制御下において、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと、;(b)メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、メバロン酸を生産するステップとを含んでなる、メバロン酸を生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の生産、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、メバロン酸を生産するステップとを含んでなる、メバロン酸を生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、メバロン酸を生産するステップとを含んでなる、メバロン酸を生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の生産、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、メバロン酸を生産するステップとを含んでなる、メバロン酸を生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および(ii)上流MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
イソプレンを産生できる組換え細胞
イソプレン(2−メチル−1,3−ブタジエン)は、幅広い用途で利用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造をはじめとする、多数の化学薬品組成物およびポリマーの合成において、中間体または出発原料として用いられる。イソプレンはまた、多数の植物および動物によって天然に合成される重要な生物学的材料である。
イソプレンは、イソプレンシンターゼの酵素作用によって、DMAPPから生成される。そのため、理論に束縛されることなく、上述の組成物および方法のいずれかによって、メバロン酸経路を含んでなる組換え細胞内で、E4P、GAP、Ac−P、および/またはアセチルCoAの細胞産生を増大させることは、より大量のイソプレン生産も同様にもたらすと考えられる。グルコースからのメバロン酸生成のモル収率を増大させることは、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(例えば下流MVA経路)の、およびイソプレンおよびイソプレノイド生産のためのその他の適切な酵素の、適切な酵素活性レベルと組み合わせると、グルコースから生成されるイソプレノイド前駆体、イソプレンおよび/またはイソプレノイドのより高いモル収率につながる。
本明細書に記載されるように、本発明は、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドコードする、1つまたは複数の異種核酸および(i)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸(すなわち、上流MVA経路および下流MVA経路)および(ii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、細胞は、回収可能量のイソプレンを産生できる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレンの生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、(i)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(ii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドコードする、1つまたは複数の異種核酸および細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して、増大した量のイソプレンを産生する。
イソプレンの生産はまた、酵素活性が調節されて、メバロン酸生成と、引き続くイソプレノイド前駆体、イソプレノイド、および/またはイソプレン生産に向かう炭素流が増大される、酵素経路操作の1つまたは複数をさらに含んでなる、本明細書に記載される組換え宿主細胞のいずれかを使用して実施し得る。アセチルCoA生成のためのホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大させるために操作された様々な酵素経路を有する、本明細書に記載される組換え細胞をメバロン酸生産と、引き続くイソプレノイド前駆体、イソプレノイド、および/またはイソプレン生産のために使用し得る。一実施形態では、組換え細胞は、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)からなる群から選択される、遺伝子の1つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)遺伝子をはじめとする、1つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
下流MVA経路のポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される組成または方法のいずれかに記載される細胞は、下流メバロン酸(MVA)経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、下流MVA経路ポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、下流MVA経路をコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流MVA経路をコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流MVA経路をコードする内在性核酸は、強力プロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性下流MVA経路ポリペプチドを過剰発現するように操作される。いくつかの態様では、下流MVA経路をコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
下流メバロン酸生合成経路は、メバロン酸キナーゼ(MVK)、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)を含んでなる。いくつかの態様では、下流MVA経路は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IDI)をさらに含んでなり得る。本明細書で提供される細胞は、イソプレンシンターゼ、1つまたは複数の上流MVA経路ポリペプチド、および/または1つまたは複数の下流MVA経路ポリペプチドをコードする、少なくとも1つの核酸を含んでなり得る。下流MVA経路のポリペプチドは、(a)メバロン酸をメバロン酸5−リン酸にリン酸化する;(b)メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換する;および(c)メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸をメバロン酸5−リン酸にリン酸化する酵素は、M.マゼイ(M.mazei)メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス属(Lactobacillus)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス属(Streptococcus)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属(Streptomyces)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属(Streptomyces)CL190メバロン酸キナーゼポリペプチド、およびM.ブルトニイ(M.Burtonii)メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群に由来し得る。別の態様では、メバロン酸をメバロン酸5−リン酸にリン酸化する酵素は、M.マゼイ(M.mazei)メバロン酸キナーゼである。
いくつかの態様では、下流MVA経路ポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、下流MVA経路ポリペプチドをコードする異種核酸の2つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、下流MVA経路をコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流MVA経路をコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流MVA経路をコードする異種核酸は、強力プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流MVA経路をコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、異種下流MVA経路ポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)、またはメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)からのポリペプチドである。
下流MVA経路ポリペプチドをコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込まれ得て、または細胞内で安定して発現され得る。下流MVA経路ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター上にさらに存在し得る。
例示的な下流MVA経路ポリペプチドを以下にさらに提供する:(i)メバロン酸キナーゼ(MVK);(ii)ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK);(iii)ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD);および(iv)イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IDI)。具体的には、下流MVKポリペプチドは、メタノサルシナ属(Methanosarcina)に由来し得て、より具体的には、下流MVKポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)に由来し得る。いくつかの実施形態では、下流MVKポリペプチドは、M.ブルトニイ(M.burtonii)に由来し得る。下流MVA経路ポリペプチドの追加的な例は、下流MVK経路ポリペプチドおよび下流MVK経路ポリペプチド変異体に関して、その内容全体を明示的に参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第2010/0086978号明細書にある。
下流MVA経路ポリペプチドとしては、下流MVA経路ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的な下流MVA経路核酸としては、下流MVA経路ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的な下流MVA経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、より良いイソプレン生産の結果をもたらす、下流MVA経路ポリペプチド変異体もまた使用し得る。
いくつかの態様では、下流MVA経路ポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)、またはメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)からのポリペプチドである。いくつかの態様では、MVKポリペプチドは、ラクトバチルス属(Lactobacillus)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス属(Streptococcus)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属(Streptomyces)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属(Streptomyces)CL190メバロン酸キナーゼポリペプチド、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)メバロン酸キナーゼポリペプチド、およびM.ブルトニイ(M.Burtonii)メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。本明細書に記載されるいずれかのプロモーター(例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載されて、本開示の実施例で同定されるプロモーター)を使用して、本明細書に記載されるMVAポリペプチドのいずれかの発現を駆動し得る。
本明細書に記載される細胞のいずれでも、IDI核酸(例えば、IDIをコードする内在性または異種核酸)を含んでなり得る。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼポリペプチド(イソペンテニル二リン酸ΔイソメラーゼまたはIDI)は、イソペンテニル二リン酸(IPP)とジメチルアリル二リン酸(DMAPP)の相互変換を触媒する(例えば、IPPをDMAPPに変換し、および/またはDMAPPをIPPに変換する)。例示的なIDIポリペプチドとしては、IDIポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。(本明細書に記載されるものなどの)標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞内抽出物中で、または生体内で、IPPおよびDMAPPを相互転換する能力を測定することで、ポリペプチドがIDIポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なIDI核酸としては、IDIポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なIDIポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、(本明細書に記載されるような、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大するように操作されている宿主細胞をはじめとする)本明細書に記載される組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、またはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性イソプレンシンターゼ経路ポリペプチドを過剰発現するように操作される。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属(Pueraria)またはポプラ属(Populus)またはウラジロハコヤナギ(Populus alba)×ヤマナラシ(Populus tremula)などの雑種からのポリペプチドである。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の2つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。イソプレシンターゼンをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
例示的なイソプレンシンターゼ核酸としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)をイソプレンに変換する。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドとしては、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも1つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、イソプレンシンターゼ変異体は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ変異体は、改善された安定性(例えば、熱安定性)、および/または改善された溶解度などのその他の改善された特性を有する。
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞抽出物中で、または生体内で、DMAPPをイソプレンに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えば、Silver et al.,J.Biol.Chem.270:13010−13016,1995に記載されるようにして、測定し得る。1つの例示的なアッセイでは、窒素流下で、DMAPP(Sigma)を蒸発するまで乾燥させて、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH8.2中で100mMの濃度に再水和して、−20℃で保存し得る。アッセイを実施するために、金属ねじ蓋およびテフロン被覆ケイ素隔壁付き20mlのHeadspaceバイアル(Agilent Technologies)内の25μLの細胞抽出物に、5μLの1M MgCl2、1mMの(250μg/ml)DMAPP、65μLの植物抽出緩衝液(PEB)(50mMのTris−HCl、pH8.0、20mMのMgCl2、5%グリセロール、および2mMのDTT)の溶液を添加して、振盪しながら37℃で15分間培養し得る。反応は、200μLの250mM EDTAを添加することでクエンチし、GC/MSによって定量化し得る。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属(Pueraria)からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプラ属(Populus)からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプライソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズイソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属(Pueraria)またはポプラ属(Populus)または雑種ウラジロハコヤナギ(Populus alba)×ヤマナラシ(Populus tremula)からのポリペプチドまたはそれらの変異体である。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、マメ亜科(Faboideae)などのマメ科(Fabaceae)に由来する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、プエラリア・モンタナ(Pueraria montana)(クズ)(Sharkey et al.,Plant Physiology 137:700−712,2005)、プエラリア・ロバタ(Pueraria lobata)、ポプラ(ウラジロハコヤナギ(Populus alba)、セイヨウハコヤナギ(Populus nigra)、コットンウッド(Populus trichocarpa)、またはウラジロハコヤナギ(Populus alba)×ヤマナラシ(tremula)(CAC35696)など(Miller et al.,Planta 213:483−487,2001)、アスペン(ポプルス・トレムロイデス(Populus tremuloides)など(Silver et al.,JBC 270(22):13010−1316,1995)、ヨーロッパナラ(Quercus obur)(Zimmerらに付与された国際公開第98/02550号パンフレット)からのポリペプチドまたは核酸、またはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ(Pueraria montana)、プエラリア・ロバタ(Pueraria lobata)、ポプルス・トレムロイデス(Populus tremuloides)、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)、セイヨウハコヤナギ(Populus nigra)、またはコットンウッド(Populus trichocarpa)からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ(例えば、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)からのイソプレンシンターゼまたはその変異体)をコードする核酸は、コドン最適化される。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは核酸(例えば、ポプラ属(Populus)からの天然ポリペプチドまたは核酸)である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドまたは核酸でない。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドまたは核酸の変異体(例えば、ポプラ属(Populus)からの野生型または天然ポリペプチドまたは核酸の変種)である。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、変種である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変種である。いくつかの態様では、変種は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された触媒活性などの改善された活性を有する。活性(例えば、触媒活性)の増大は、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%のいずれかであり得る。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、少なくとも約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、または100倍のいずれかである。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、約10%〜約100倍(例えば、約20%〜約100倍、約50%〜約50倍、約1倍〜約25倍、約2倍〜約20倍、または約5倍〜約20倍)である。いくつかの態様では、変種は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された溶解度を有する。溶解度の増大は、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%のいずれかであり得る。溶解度の増大は、少なくとも約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、または100倍のいずれかであり得る。いくつかの態様では、溶解度の増大は、約10%〜約100倍(例えば、約20%〜約100倍、約50%〜約50倍、約1倍〜約25倍、約2倍〜約20倍、または約5倍〜約20倍)である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、天然起源イソプレンシンターゼの変異体であり、天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された安定性(熱安定性など)を有する。
いくつかの態様では、変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約110%、少なくとも約120%、少なくとも約130%、少なくとも約140%、少なくとも約150%、少なくとも約160%、少なくとも約170%、少なくとも約180%、少なくとも約190%、少なくとも約200%の活性を有する。変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、配列類似性を共有し得る。いくつかの態様では、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、少なくとも約40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%のいずれかのアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様では、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、約70%〜約99.9%、約75%〜約99%、約80%〜約98%、約85%〜約97%、または約90%〜約95%のアミノ酸配列同一性のいずれかを有する。
いくつかの態様では、変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼ中に、変異を含んでなる。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換、少なくとも1つのアミノ酸挿入、および/または少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、変異体と、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの間で異なるアミノ酸残基の数は、例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50以上のアミノ酸残基など、1つまたは複数であり得る。天然起源イソプレンシンターゼとしては、例えば、葛イソプレンシンターゼ、ポプライソプレンシンターゼ、ヨーロッパナライソプレンシンターゼ、および柳イソプレンシンターゼなど、植物からの任意のイソプレンシンターゼが挙げられる。いくつかの態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)からのイソプレンシンターゼの変異体である。いくつかの態様では、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)からのイソプレンシンターゼの変異体は、少なくとも1種のアミノ酸置換、少なくとも1種のアミノ酸挿入、および/または少なくとも1種のアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、トランケート型ウラジロハコヤナギ(Populus alba)イソプレンシンターゼである。いくつかの態様では、変異体(例えば、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)からのイソプレンシンターゼの変異体をコードする核酸は、コドン最適化される(例えば、その中で異種イソプレンシンターゼが発現される宿主細胞に基づいてコドン最適化される)。
本明細書で提供されるイソプレンシンターゼポリペプチドは、イソプレンシンターゼおよびイソプレンシンターゼ変異体に関して、その内容全体を明示的に参照によって本明細書に援用する、国際公開第2009/132220号パンフレット、国際公開第2010/124146号パンフレット、および米国特許出願公開第2010/0086978号明細書に記載される、イソプレンシンターゼまたはイソプレンシンターゼ変異体のいずれかであり得る。
本明細書に記載されるプロモーター(例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載されて、本開示の実施例で同定されるいずれかのプロモーター)を使用して、本明細書に記載されるイソプレンシンターゼのいずれかの発現を駆動し得る。
適切なイソプレンシンターゼとしては、Genbank受入番号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070、およびAY182241によって同定されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載される組成物、またはイソプレンシンターゼをコードする微生物を作成する方法をはじめとする方法のいずれかで、使用し得るイソプレンシンターゼのタイプは、国際公開第2009/076676号パンフレット、国際公開第2010/003007号パンフレット、国際公開第2009/132220号パンフレット、国際公開第2010/031062号パンフレット、国際公開第2010/031068号パンフレット、国際公開第2010/031076号パンフレット、国際公開第2010/013077号パンフレット、国際公開第2010/031079号パンフレット、国際公開第2010/148150号パンフレット、国際公開第2010/124146号パンフレット、国際公開第2010/078457号パンフレット、国際公開第2010/148256号パンフレット、国際公開第2012/058494号パンフレット、および米国特許第8,173,410号明細書にもまた記載される。
イソプレン生合成経路
イソプレンは、2種の異なるアルコール、3−メチル−2−ブテン−1−オール、および2−メチル−3−ブテン−2−オールから生成され得る。例えば、二段階イソプレン生合成経路では、シンターゼ(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールシンターゼ)などの酵素によって、ジメチルアリル二リン酸が2−メチル−3−ブテン−2−オールに変換され、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼによる、2−メチル−3−ブテン−2−オールのイソプレンへの変換がそれに続いた。別の例として、三段階イソプレン生合成経路では、ジメチルアリル二リン酸を3−メチル−2−ブテン−1−オールに変換できるホスファターゼまたはシンターゼ(例えば、ゲラニオールシンターゼまたはファルネソールシンターゼ)のどちらかによって、ジメチルアリル二リン酸が3−メチル−2−ブテン−1−オールに変換され、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼによって、3−メチル−2−ブテン−1−オールが2−メチル−3−ブテン−2−オールに変換され、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼによって、2−メチル−3−ブテン−2−オールがイソプレンに変換される。例えば、米国特許出願公開第20130309742A1号明細書、および米国特許出願公開第20130309741A1号明細書を参照されたい。
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される組成物または方法のいずれかに記載される細胞(本明細書に記載されるように改変された宿主細胞を含む)は、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼ、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼ、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼからなる群から選択される、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする、1つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞が、野生型細胞と比較して、イソプレン生合成経路の内在性ポリペプチドを過剰発現するように改変される。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸の2つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
例示的なイソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸としては、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1オールシンターゼポリペプチドなどの、イソプレン生合成経路のポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なイソプレン生合成経路のポリペプチド、およびイソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、イソプレン生合成経路のポリペプチドの変異体(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチド)は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、ホスファターゼである。例示的なホスファターゼとしては、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)または大腸菌(Escherichia coli)からのホスファターゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、テルペンシンターゼ(例えば、ゲラニオールシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、リナロールシンターゼまたはネロリドールシンターゼ)である。例示的なテルペンシンターゼとしては、スイートバジル(Ocimum basilicum)、レモンエゴマ(Perilla citriodora)、エゴマ(Perilla frutescens)、シナモマム・テヌイピル(Cinnamomum tenuipile)、トウモロコシ(Zea mays)またはイネ(Oryza sativa)からのテルペンシンターゼが挙げられる。追加的な例示的テルペンシンターゼとしては、クラルキア・ブレウェリ(Clarkia breweri)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セトエゴマ(Perilla setoensis)、エゴマ(Perilla frutescens)、サルナシ(Actinidia arguta)、マタタビ(Actinidia polygama)、クソニンジン(Artemesia annua)、スイートバジル(Ocimum basilicum)、ミズハッカ(Mentha aquatica)、トマト(Solanum lycopersicum)、タルウマゴヤシ(Medicago truncatula)、コットンウッド(Populus trichocarpa)、エゾヘビイチゴ(Fragaria vesca)、またはオランダイチゴ(Fragaria ananassa)からのテルペンシンターゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、テルペンシンターゼは、3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。例えば、本明細書に記載されるテルペンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸から3−メチル−2−ブテン−1−オールへの変換を触媒し得る(例えば、3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼ)。いくつかの態様では、本明細書に記載されるテルペンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸から2−メチル−3−ブテン−2−オールへの変換を触媒し得る(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールシンターゼ)。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド(例えば、アキンコラ・ターチアリカルボニス(Aquincola tertiaricarbonis)からの2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド)またはその変異体である。いくつかの態様では、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチドは、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼポリペプチド(例えば、カステラニエラ・デフラグランス(Castellaniella defragrans)Genbank受入番号FR669447からのリナロールデヒドラターゼイソメラーゼポリペプチド)またはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチドは、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼポリペプチド(例えば、カステラニエラ・デフラグランス(Castellaniella defragrans)Genbank受入番号FR669447からのリナロールデヒドラターゼイソメラーゼポリペプチド)またはその変異体である。
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、DMAPPをイソプレンに変換する能力を測定することで、ポリペプチドが所望のイソプレン生合成経路酵素活性(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼ活性、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼ活性、および3−メチル−2−ブテン−1−オール活性)を有するかどうかを判定し得る。例えば、米国特許出願公開第20130309742A1号明細書、および米国特許出願公開第20130309741A1号明細書を参照されたい。
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチド(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチド)は、変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチド(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチド)は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体である。いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと比較して、改善された触媒活性などの改善された活性を有する。活性(例えば、触媒活性)の増大は、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%のいずれかであり得る。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、少なくとも約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、または100倍のいずれかである。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、約10%〜約100倍(例えば、約20%〜約100倍、約50%〜約50倍、約1倍〜約25倍、約2倍〜約20倍、または約5倍〜約20倍)である。いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと比較して、改善された溶解度を有する。溶解度の増大は、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%のいずれかであり得る。溶解度の増大は、少なくとも約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、または100倍のいずれかであり得る。いくつかの態様では、溶解度の増大は、約10%〜約100倍(例えば、約20%〜約100倍、約50%〜約50倍、約1倍〜約25倍、約2倍〜約20倍、または約5倍〜約20倍)である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路ポリペプチドは、イソプレン生合成経路の天然起源ポリペプチドの変異体であり、イソプレン生合成経路の天然起源ポリペプチドと比較して、改善された安定性(熱安定性など)を有する。
いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチド)の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約110%、少なくとも約120%、少なくとも約130%、少なくとも約140%、少なくとも約150%、少なくとも約160%、少なくとも約170%、少なくとも約180%、少なくとも約190%、少なくとも約200%の活性を有する。変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと、配列類似性を共有し得る。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチド)と、少なくとも約40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%のいずれかのアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチド)と、約70%〜約99.9%、約75%〜約99%、約80%〜約98%、約85%〜約97%、または約90%〜約95%のいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチド)中に、変異を含んでなる。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換、少なくとも1つのアミノ酸挿入、および/または少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の変異体と、野生型または天然起源ポリペプチドの間で異なるアミノ酸残基の数は、例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50以上のアミノ酸残基など、1つまたは複数であり得る。いくつかの態様では、変異体(例えば、2−メチル−3−ブテン−2−オールデヒドラターゼポリペプチド、2−メチル−3−ブテン−2−オールイソメラーゼポリペプチド、および3−メチル−2−ブテン−1−オールシンターゼポリペプチド)をコードする核酸は、コドン最適化される(例えば、イソプレン生合成経路の異種ポリペプチドがその中で発現される宿主細胞に基づいて、コドン最適化される)。
本明細書に記載されるプロモーター(例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載される本開示の実施例で同定されるプロモーター)のいずれかを使用して、本明細書に記載されるイソプレン生合成経路のポリペプチドのいずれかの発現を駆動し得る。
DXP経路ポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、(本明細書に記載されるようにホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大させるように操作されている宿主細胞をはじめとする)本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞は、DXSポリペプチドまたはその他のDXP経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、細胞は、DXSポリペプチドまたはその他のDXP経路ポリペプチドをコードする内在性核酸の染色体のコピーをさらに含んでなる。いくつかの態様では、大腸菌(E.coli)細胞は、IDIポリペプチドおよびDXSポリペプチドまたはその他のDXP経路ポリペプチドをコードする、1つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、1つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチド、IDIポリペプチド、およびDXSポリペプチドまたはその他のDXP経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、1つのプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、IDIポリペプチド、およびDXSポリペプチドまたはその他のDXP経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、複数のプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、IDIポリペプチド、およびDXSポリペプチドまたはその他のDXP経路ポリペプチドをコードする。
例示的なDXSポリペプチドとしては、DXSポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。(本明細書に記載されるものなどの)標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびD−グリセルアルデヒド3−リン酸を1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがDXSポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なDXSポリペプチドおよび核酸およびDXS活性を測定する方法は、国際公開第2009/076676号パンフレット、国際公開第2010/003007号パンフレット、国際公開第2009/132220号パンフレット、および米国特許第2009/0203102号明細書、米国特許第2010/0003716号明細書、および米国特許第2010/0048964号明細書に、より詳細に記載される。
例示的なDXP経路ポリペプチドとしては、DXP経路ポリペプチドの1つまたは2つ以上の活性を有する、DXSポリペプチド、DXRポリペプチド、MCTポリペプチド、CMKポリペプチド、MCSポリペプチド、HDSポリペプチド、HDRポリペプチド、およびポリペプチド(例えば、融合ポリペプチド)のいずれかが挙げられるが、これに限定されるものではない。特に、DXP経路ポリペプチドとしては、DXP経路ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なDXP経路核酸としては、DXP経路ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なDXP経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なDXP経路ポリペプチド、および核酸、およびDXP経路ポリペプチド活性を測定する方法は、国際公開第2010/148150号パンフレットにより詳細に記載される。
例示的なDXSポリペプチドとしては、DXSポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。(本明細書に記載されるものなどの)標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびD−グリセルアルデヒド3−リン酸を1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがDXSポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なDXSポリペプチド、および核酸、およびDXS活性を測定する方法は、国際公開第2009/076676号パンフレット、国際公開第2010/003007号パンフレット、国際公開第2009/132220号パンフレット、および米国特許第2009/0203102号明細書、米国特許第2010/0003716号明細書、および米国特許第2010/0048964号明細書により詳細に記載される。
特に、DXSポリペプチドは、ピルビン酸およびD−グリセルアルデヒド3−リン酸を1−デオキシ−D−キシルロース5−リン酸(DXP)に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびD−グリセルアルデヒド3−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがDXSポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
DXRポリペプチドは、1−デオキシ−D−キシルロース5−リン酸(DXP)を2−C−メチル−D−エリスリトール4−リン酸(MEP)に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、DXPを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがDXRポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
MCTポリペプチドは、2−C−メチル−D−エリスリトール4−リン酸(MEP)を4−(シチジン5’−ジホスホ)−2−メチル−D−エリスリトール(CDP−ME)に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、MEPを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがMCTポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
CMKポリペプチドは、4−(シチジン5’−ジホスホ)−2−C−メチル−D−エリスリトール(CDP−ME)を2−ホスホ−4−(シチジン5’−ジホスホ)−2−C−メチル−D−エリスリトール(CDP−MEP)に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、CDP−MEを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがCMKポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
MCSポリペプチドは、2−ホスホ−4−(シチジン5’−ジホスホ)−2−C−メチル−D−エリスリトール(CDP−MEP)を2−C−メチル−D−エリスリトール2、4−シクロ二リン酸(ME−CPPまたはcMEPP)に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、CDP−MEPを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがMCSポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
HDSポリペプチドは、2−C−メチル−D−エリスリトール2、4−シクロ二リン酸を(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブテ−2−エン−1−イル二リン酸(HMBPPまたはHDMAPP)に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ME−CPPを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがHDSポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
HDRポリペプチドは、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチルブテ−2−エン−1−イル二リン酸をイソペンテニル二リン酸(IPP)およびジメチルアリル二リン酸(DMAPP)に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、HMBPPを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがHDRポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
下流MVA経路、イソプレンシンターゼ、IDI、およびDXP経路ポリペプチドの起源生物
イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路、および/または下流MVA経路核酸(およびそれらがコードするポリペプチド)は、イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路、および/または下流MVA経路核酸を天然に含有する、任意の生物から得られ得る。イソプレンは、細菌、酵母、植物、および動物などの多様な生物によって、天然に形成される。いくつかの生物が、イソプレンを生成するためのMVA経路を含有する。イソプレンシンターゼ核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得られ得る。MVA経路核酸は、例えば、MVA経路を含有する任意の生物から得られ得る。IDIおよびDXP経路核酸は、例えば、IDIおよびDXP経路を含有する任意の生物から得られ得る。
イソプレンシンターゼ、DXP経路、IDI、および/またはMVA経路核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、またはラン藻から単離され得る。例示的な起源生物としては、例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)(例えば、S.セレビシエ(S.cerevisiae)種などの酵母、エシェリキア属(Escherichia)(例えば、大腸菌(E.coli)種などの細菌、またはメタノサルシナ属(Methanosarcina)の種(例えば、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、葛またはポプラ(例えば、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)またはウラジロハコヤナギ(Populus alba)×ヤマナラシ(Populus tremula)CAC35696)またはアスペン(例えば、ポプルス・トレムロイデス(Populus tremuloides))などの植物が挙げられる。使用し得る例示的なイソプレンシンターゼ、IDI、および/またはMVA経路ポリペプチド起源は、国際公開第2009/076676号パンフレット、国際公開第2010/003007号パンフレット、国際公開第2009/132220号パンフレット、国際公開第2010/031062号パンフレット、国際公開第2010/031068号パンフレット、国際公開第2010/031076号パンフレット、国際公開第2010/013077号パンフレット、国際公開第2010/031079号パンフレット、国際公開第2010/148150号パンフレット、国際公開第2010/078457号パンフレット、および国際公開第2010/148256号パンフレットにもまた記載される。
いくつかの態様では、起源生物は、サッカロミセス属(Saccharomyces)種、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)種、ピチア属(Pichia)種、またはカンジダ属(Candida)種などの酵母である。
いくつかの態様では、起源生物は、B.リケニフォルミス(B.licheniformis)またはB.サブチリス(B.subtilis)などのバチルス属(Bacillus)の株、P.シトレア(P.citrea)などのパントエア属(Pantoea)の株、P.アルカリゲネス(P.alcaligenes)などのシュードモナス属(Pseudomonas)の株、S.リビダンス(S.lividans)またはS.ルビギノーサス(S.rubiginosus)などのストレプトミセス属(Streptomyces)の株、大腸菌(E.coli)などのエシェリキア属(Escherichia)の株、Enterobacterの株、ストレプトコッカス属(Streptococcus)の株、またはメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)などの古細菌の株などの細菌である。
本明細書の用法では、「バチルス属(Bacillus)」としては、B.サブチリス(B.subtilis)、B.リケニフォルミス(B.licheniformis)、B.レンタス(B.lentus)、B.ブレビス(B.brevis)、B.ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)、B.アルカロフィルス(B.alkalophilus、B.アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B.クラウシイ(B.clausii)、B.ハロデュランス(B.halodurans)、B.メガテリウム(B.megaterium)、B.コアギュランス(B.coagulans)、B.サーキュランス(B.circulans)、B.ロータス(B.lautus)、およびB.チューリンギエンシス(B.thuringiensis)をはじめとするが、これに限定されるものではない、当業者に知られているような「バチルス属(Bacillus)」内の全ての種が挙げられる。バチルス属(Bacillus)は、分類学の再編成を継続的に受けていることが認識されている。したがって本属は、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(GeoBacillus stearothermophilus)」と命名されている、B.ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)などの生物をはじめとするが、これに限定されるものではない、再分類された種を含むことが意図される。酸素の存在下における耐性内生胞子の生成は、バチルス属(Bacillus)を決定付ける特徴と見なされるが、この特徴は、最近命名された、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus)、アンフィバチルス属(Amphibacillus)、アネウリニバチルス属(Aneurinibacillus)、アノキシバチルス属(Anoxybacillus)、ブレビバチルス属(Brevibacillus)、フィロバチルス属(Filobacillus)、グラシリバチルス属(Gracilibacillus)、ハロバチルス属(Halobacillus)、パエニバチルス属(Paenibacillus)、サリバシルス属(Salibacillus)、サーモバチルス属(Thermobacillus)、ウレイバチルス属(Ureibacillus)、およびバルジバチルス属(Virgibacillus)にも当てはまる。
いくつかの態様では、起源生物は、グラム陽性細菌である。非限定的例としては、ストレプトミセス属(Streptomyces)(例えば、S.リビダンス(S.lividans)、S.コエリカラー(S.coelicolor)、またはS.グリセウス(S.griseus)、およびバチルス属(Bacillus)の株が挙げられる。いくつかの態様では、起源生物は、大腸菌(E.coli)またはシュードモナス属(Pseudomonas)種などのグラム陰性細菌である。
いくつかの態様では、起源生物は、マメ亜科(Faboideae)などのマメ科(Fabaceae)からの植物などの植物である。いくつかの態様では、起源生物は、葛、ポプラ(ウラジロハコヤナギ(Populus alba)×ヤマナラシ(Populus tremula)CAC35696など)、アスペン(ポプルス・トレムロイデス(Populus tremuloidesなど)、またはヨーロッパナラ(Quercus robur)である。
いくつかの態様では、起源生物は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ユーグレナ藻類、クロミスタ、または渦鞭毛藻類などの藻類である。
いくつかの態様では、起源生物は、形態学に基づいて、以下の群のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である:クロオコッカス目(Chroococcales)、プレウロカプサ目(Pleurocapsales)、ユレモ目(Oscillatoriales)、ネンジュモ目(Nostocales)、またはスティゴネマ目(Stigonematales)。
イソプレンの生産増大能力がある組換え細胞
(本明細書に記載されるような、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大させるように操作されている宿主細胞をはじめとする)本明細書に記載される組換え細胞は、同一条件下で培養された場合に、異種核酸ホスホケトラーゼポリペプチドの1つまたは複数のコピー、MVA経路ポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を欠く同一細胞を上回る濃度で、イソプレンを産生する能力を有する。細胞は、IDIポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に由来する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(LactoBacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(LactoBacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(LeucoNostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(LactoBacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(SchizoSaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(LeucoNostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(LactoBacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)に由来する。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、コリネバクテリウム属(Corynebacteria)種(例えばC.グルタミカム(C.glutamicum))である。
一実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
いくつかの態様では、ホスホケトラーゼをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、MVA経路ポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸は、宿主細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる異種核酸である。その他の態様では、1つまたは複数の異種核酸は、プラスミドに組み込まれる。なおも別の態様では、1つまたは複数の異種核酸配列の少なくとも1つがプラスミドに組み込まれる一方で、1つまたは複数の異種核酸の少なくとも1つは細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる。組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレン産生細胞と比較して、少なくとも5%高い量のイソプレンを産生し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、または15%高い、ならびにこれらの数の間の任意の数値分高いイソプレンを産生し得る。
本発明の一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、メバロン酸(MVA)経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、DXP経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞である。細胞は、IDIポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。1つまたは複数の異種核酸のいずれでも、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、誘導性プロモーターと作動可能に連結し得て、または誘導性および構成的プロモーターの組み合わせと作動可能に連結し得る。1つまたは複数の異種核酸は、さらに、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および/または中程度のプロモーターと、作動可能に連結し得る。ホスホケトラーゼ、メバロン酸(MVA)経路ポリペプチド、DXP経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数を、宿主細胞のゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。1つまたは複数の異種核酸は、ベクター上にさらに存在し得る。
本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに従った細胞によるイソプレンの生産は、向上させ得る(例えば、ホスホケトラーゼポリペプチド、イソプレンシンターゼポリペプチド、MVA経路ポリペプチド、および/またはDXP経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現によって向上させる)。本明細書の用法では、イソプレンの生産「向上」とは、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレンの細胞生産性指標(CPI)増大、イソプレンの力価増大、イソプレンの質量収率増大、および/またはイソプレンの比生産性増大を指す。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するE4P、GAP、Ac−P、および/またはアセチルCoA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている。
本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレンの生産は、約5%から約1,000,000倍向上させ得る。特定の態様では、イソプレンの生産は、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレンの生産と比較して、約10%〜約1,000,000倍(例えば、約1〜約500,000倍、約1〜約50,000倍、約1〜約5,000倍、約1〜約1,000倍、約1〜約500倍、約1〜約100倍、約1〜約50倍、約5〜約100,000倍、約5〜約10,000倍、約5〜約1,000倍、約5〜約500倍、約5〜約100倍、約10〜約50,000倍、約50〜約10,000倍、約100〜約5,000倍、約200〜約1,000倍、約50〜約500倍、または約50〜約200倍)向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するMVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレンの生産と比較して、イソプレンの生産向上が提供される。
その他の態様では、本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレンの生産は、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレンの生産と比較して、少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍、または1,000,000倍のいずれかで、向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するMVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレンの生産と比較して、イソプレンの生産向上が提供される。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるイソプレン産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の産生、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、(e)イソプレン収率タンパク質溶解度または(f)イソプレン比生産性が、さらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるイソプレン産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、(d)イソプレン収率タンパク質溶解度または(e)イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるイソプレン産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の産生、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、(e)イソプレン収率タンパク質溶解度または(f)イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるイソプレン産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、(d)イソプレン収率タンパク質溶解度または(e)イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
組換え細胞を使用してイソプレンを生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養するステップを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。一態様では、イソプレンは、本明細書に記載されるような任意のホスホケトラーゼポリペプチド、1つまたは複数のMVA経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養することで、生産し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
別の態様では、イソプレンは、本明細書に記載される酵素経路のいずれかの調節と、ホスホケトラーゼペプチド、MVA経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸とを含んでなる、組換え細胞を培養することで、生産し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。イソプレンは、本明細書に記載される細胞のいずれかから、本明細書に記載される方法のいずれかによって、生産し得る。グルコースなどの六炭糖および/またはキシロースなどの五炭糖をはじめとするが、これに限定されるものではない炭水化物からイソプレンを生産する目的で、細胞のいずれかを使用し得る。
したがって、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、ホスホケトラーゼポリペプチドとイソプレンシンターゼとをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、細胞を培養するステップと、(b)イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
細胞は、上述のMVA経路ポリペプチド(例えば完全MVA経路)、および上述のイソプレンシンターゼポリペプチド(例えばクズ属(Pueraria)イソプレンシンターゼ)のいずれかをコードする、1つまたは複数の核酸分子をさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれか1つであり得る。本明細書に記載されるイソプレンシンターゼまたはそれらの変異体のいずれか、本明細書に記載される宿主細胞株のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および/または本明細書に記載されるベクターのいずれかもまた使用して、本明細書に記載される方法で使用し得る本明細書に記載されるエネルギー源のいずれか(例えば、グルコースまたはキシロース)を使用して、イソプレンを生産し得る。いくつかの態様では、イソプレンを生産する方法は、イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)に由来する。
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドと、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaSポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップと、(b)イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。細胞は、上述の下流MVA経路ポリペプチド(例えば、MVK、PMK、MVD、および/またはIDI)をコードする1つまたは複数の核酸分子、および上述のイソプレンシンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップと、(b)イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。細胞は、上述の下流MVA経路ポリペプチド(例えば、MVK、PMK、MVD、および/またはIDI)をコードする1つまたは複数の核酸分子、および上述のイソプレンシンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。
ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流動増大のために操作された様々な酵素経路を有する、本明細書に記載される組換え細胞を使用して、イソプレンを生産し得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)からなる群から選択される、遺伝子の1つまたは複数の活性が増大するようにさらに操作し得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)遺伝子をはじめとする、1つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
いくつかの態様では、生産されたイソプレンの量が、ピーク絶対生産性時点で測定される。いくつかの態様では、細胞ピーク絶対生産性は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。いくつかの態様では、生産されたイソプレンの量が、ピーク比生産性時点で測定される。いくつかの態様では、細胞ピーク比生産性は、本明細書で開示される細胞あたりのイソプレン量のいずれかに関する。いくつかの態様では、生産されたイソプレンの累積総量が測定される。いくつかの態様では、細胞累積総生産性は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。
いくつかの態様では、(細胞が培養中にある実施例では)本明細書に記載される細胞のいずれかは、1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000nmoleイソプレン/g湿潤細胞重量/hr(nmole/gwcm/hr)以上のいずれかをほぼ超える、またはそのいずれかのイソプレンを産生する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約2〜約100nmole/gwcm/hr、約100〜約500nmole/gwcm/hr、約150〜約500nmole/gwcm/hr、約500〜約1,000nmole/gwcm/hr、約1,000〜約2,000nmole/gwcm/hr、または約2,000〜約5,000nmole/gwcm/hrなど、約2〜約5,000nmole/gwcm/hrである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約20〜約5,000nmole/gwcm/hr、約100〜約5,000nmole/gwcm/hr、約200〜約2,000nmole/gwcm/hr、約200〜約1,000nmole/gwcm/hr、約300〜約1,000nmole/gwcm/hr、または約400〜約1,000nmole/gwcm/hrである。
いくつかの態様では、培養中の細胞は、約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000ngイソプレン/g湿潤細胞重量/hr(ng/gwcm/h)以上のイソプレンを生成する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約2〜約100ng/gwcm/h、約100〜約500ng/gwcm/h、約500〜約1,000ng/gwcm/h、約1,000〜約2,000ng/gwcm/h、または約2,000〜約5,000ng/gwcm/hなどの約2〜約5,000ng/gwcm/hである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約20〜約5,000ng/gwcm/h、約100〜約5,000ng/gwcm/h、約200〜約2,000ng/gwcm/h、約200〜約1,000ng/gwcm/h、約300〜約1,000ng/gwcm/h、または約400〜約1,000ng/gwcm/hである。
いくつかの態様では、培養中の細胞は、1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000mgイソプレン/Lブロス(mg/Lbroth、式中、ブロス容積は、細胞および細胞培地の容積を含む)以上のいずれかをほぼ超える、またはそのいずれかである、イソプレンの累積力価(総量)を生成する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約2〜約5,000mg/Lbrothなどの約2〜約100mg/Lbroth、約100〜約500mg/Lbroth、約500〜約1,000mg/Lbroth、約1,000〜約2,000mg/Lbroth、または約2,000〜約5,000mg/Lbrothである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約20〜約5,000mg/Lbroth、約100〜約5,000mg/Lbroth、約200〜約2,000mg/Lbroth、約200〜約1,000mg/Lbroth、約300〜約1,000mg/Lbroth、または約400〜約1,000mg/Lbrothである。
いくつかの態様では、培養中の細胞によって産生されるイソプレンは、容量基準で発酵発生気体の少なくとも約1、2、5、10、15、20、または25%を構成する。いくつかの態様では、イソプレンは、発生気体の容量基準で約5〜約15%、約15〜約25%、約10〜約20%、または約1〜約10%などの約1〜約25%を構成する。
特定の実施形態では、イソプレンを生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、(i)1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の核酸、および(ii)イソプレンシンターゼと並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと、(b)イソプレンを生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞と比較して、低下した酸素取り込み速度(OUR)を示す。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数の異種コピーを発現する組換え細胞は、ホスホケトラーゼを発現しない組換え細胞と比較して、OURに最大で1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍または7倍の低下を示す。
本明細書でまた提供されるのは、イソプレン生産を向上させる能力がある細胞を含んでなる、イソプレンを生産する方法である。本明細書に記載される細胞によるイソプレンの生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上させ得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に由来する。いくつかの実施態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(LactoBacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(LactoBacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(LeucoNostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(LactoBacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(SchizoSaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(LeucoNostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(LactoBacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)に由来する。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)に由来する。なおも別の実施態様では、ホスホケトラーゼは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)に由来する。本明細書の用法では、イソプレンの生産「向上」とは、ホスホケトラーゼポリペプチドMVA経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレンの細胞生産性指標(CPI)増大、イソプレンの力価増大、イソプレンの質量収率増大、および/またはイソプレンの比生産性増大を指す。イソプレンの生産は、約5%〜約1,000,000倍向上させ得る。イソプレンの生産は、ホスホケトラーゼ酵素を内在性に発現しないイソプレン産生細胞によるイソプレンの生産と比較して、約10%〜約1,000,000倍(例えば、約50%〜約1,000,000倍、約1〜約500,000倍、約1〜約50,000倍、約1〜約5,000倍、約1〜約1,000倍、約1〜約500倍、約1〜約100倍、約1〜約50倍、約5〜約100,000倍、約5〜約10,000倍、約5〜約1,000倍、約5〜約500倍、約5〜約100倍、約10〜約50,000倍、約50〜約10,000倍、約100〜約5,000倍、約200〜約1,000倍、約50〜約500倍、または約50〜約200倍)向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ホスホケトラーゼ経路を通過するMVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている、宿主細胞を含んでなり、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない、イソプレン産生細胞によるイソプレンの生産と比較して、イソプレンの生産向上が提供される。
その他の態様では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される細胞によるイソプレンの生産向上を対象とする(例えばホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上される)。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に由来する。いくつかの実施態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(LactoBacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(LactoBacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(LeucoNostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(LactoBacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(SchizoSaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(LeucoNostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(LactoBacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)に由来する。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)に由来する。なおも別の実施態様では、ホスホケトラーゼは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)に由来する。イソプレンの生産は、約5%〜約1,000,000倍向上させ得る。イソプレンの生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現がないイソプレン産生細胞によるイソプレンの生産と比較して、約10%〜約1,000,000倍(例えば、約50%〜約1,000,000倍、約1〜約500,000倍、約1〜約50,000倍、約1〜約5,000倍、約1〜約1,000倍、約1〜約500倍、約1〜約100倍、約1〜約50倍、約5〜約100,000倍、約5〜約10,000倍、約5〜約1,000倍、約5〜約500倍、約5〜約100倍、約10〜約50,000倍、約50〜約10,000倍、約100〜約5,000倍、約200〜約1,000倍、約50〜約500倍、または約50〜約200倍)向上させ得る。イソプレンの生産はまた、ホスホケトラーゼをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現がないイソプレン産生細胞によるイソプレンの生産と比較して、少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍、または1,000,000倍のいずれかで、向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、MVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている、宿主細胞を含んでなり、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレンの生産と比較して、イソプレンの生産向上が提供される。
さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載される方法で細胞を培養し得る。例えば、いくつかの態様では、イソプレンを生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼ遺伝子を内在性に有しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を34℃の最少培地中で培養するステップであって、組換え細胞が、(i)低から中程度のプラスミドコピーで、強力なプロモーター制御下において、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種遺伝子の1つまたは複数のコピー、(ii)MVA経路ポリペプチド(上流MVA経路および下流MVA経路)の1つまたは複数のポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を異種性に発現するステップと、(b)イソプレンを生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に由来する。いくつかの実施態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(LactoBacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(LactoBacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(LeucoNostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(LactoBacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(SchizoSaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(LeucoNostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(LactoBacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)に由来する。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)に由来する。なおも別の実施態様では、ホスホケトラーゼは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)に由来する。いくつかの態様では、イソプレンを生産する方法は、イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の生産、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、(e)イソプレン収率タンパク質溶解度または(f)イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、(d)イソプレン収率タンパク質溶解度、または(e)イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の生産、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、(e)イソプレン収率タンパク質溶解度または(f)イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、(d)イソプレン収率タンパク質溶解度または(e)イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産増大能力がある組換え細胞
イソプレノイドは、多数の生物中で、MVA経路の最終生成物であるイソプレノイド前駆体分子の合成から生成され得る。上述のように、イソプレノイドは、重要なクラスの化合物に相当し、例えば、食品および飼料補給剤、フレーバーおよび臭気化合物、および抗がん、抗マラリア、抗真菌、および抗菌化合物を含む。
分子クラスとして、イソプレノイドは、化合物に含まれるイソプレン単位数に基づいて分類される。モノテルペンは、10個の炭素または2個のイソプレン単位を含んでなり、セスキテルペンは、15個の炭素または3個のイソプレン単位を含んでなり、ジテルペンは、20炭素または4個のイソプレン単位を含んでなり、セステルテルペンは、25個の炭素または5個のイソプレン単位を含んでなり、以下同じように続く。ステロイド(一般的に約27個の炭素を含んでなる)は、イソプレノイドの切断または再構成生成物である。
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子IPPおよびDMAPPから生成され得る。これらの多様な化合物は、これらの比較的単純な汎用前駆体から誘導され、保存的ポリプレニルピロリン酸シンターゼのグループによって合成される(Hsieh et al.,Plant Physiol.2011年3月;155(3):1079−90)。それらの特有の生理学的機能を反映する、これらの直鎖プレニルピロリン酸の様々な鎖長は、一般に、アリル性基質(ジメチルアリル二リン酸(C5−DMAPP)、ピロリン酸ゲラニル(C10−GPP)、ピロリン酸ファルネシル(C15−FPP)、ゲラニルゲラニルピロリン酸(C20−GGPP))と、対応する数のイソペンテニルピロリン酸(C5−IPP)との縮合反応を通じて、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの非常に発達した活性部位によって判定される(Hsieh et al.,Plant Physiol.2011年3月;155(3):1079−90)。
イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドは、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド生成増大のための、ホスホケトラーゼをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる、組換え宿主細胞のいずれかを使用して生成し得る。いくつかの態様では、これらの細胞は、上述のMVA経路、IDI、および/またはDXP経路のポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸とをさらに含んでなる。理論により拘束されることなく、上述の組成物および方法のいずれかによって、組換え細胞内で、メバロン酸の細胞産生を増大させることは、同様により大量のイソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイド生成をもたらすと考えられる。グルコースからのメバロン酸生成のモル収率を増大させることは、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、およびイソプレンおよびイソプレノイド生成のためのその他の適切な酵素の適切な酵素活性レベルとグルコースを組み合わせると生成される、イソプレンをはじめとするイソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドのより高いモル収率につながる。本明細書に記載される、メバロン酸生成への炭素流動増大のために操作された様々な酵素経路を有する組換え細胞を使用して、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生成し得る。いくつかの態様では、組換え細胞をさらに改変して、rpiA、rpe、tktA、talB、ptaおよび/またはeutDからなる群から選択される、遺伝子の1つまたは複数の活性を増大させ得る。別の態様では、これらの株をさらに改変して、zwf、pfkA、fba、gapA、ackA、gltAおよび/またはpts遺伝子をはじめとする、1つまたは複数の遺伝子の活性を低下させ得る。
イソプレノイドのタイプ
本発明の組換え細胞は、イソプレノイドおよびイソプレノイド前駆体分子DMAPPおよびIPPの産生を増大できる。イソプレノイドの例としては、制限なしに、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、より高級なポリテルペノイドが挙げられる。いくつかの態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール(すなわち3−メチル−2−ブテン−1−オール)、イソプレノール(すなわち3−メチル−3−ブテン−1−オール)、2−メチル−3−ブテン−2−オール、またはイソ吉草酸である。いくつかの態様では、モノテルペノイドは、制限なしに、ピロリン酸ゲラニル、ユーカリプトール、リモネン、またはピネンであり得る。いくつかの態様では、セスキテルペノイドは、ピロリン酸ファルネシル、アルテミシニン、またはビサボロールである。いくつかの態様では、ジテルペノイドは、制限なしに、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、またはアフィジコリンであり得る。いくつかの態様では、トリテルペノイドは、制限なしに、スクアレンまたはラノステロールであり得る。イソプレノイドはまた、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択し得る。
いくつかの態様では、テトラテルペノイドは、リコペンまたはカロテン(カロテノイド)である。本明細書の用法では、「カロテノイド」という用語は、植物の葉緑体および有色体中、藻類などのいくつかのその他の光合成生物の葉緑体および有色体中、ある種の真菌およびいくつかの細菌中に生じる、一群の天然有機色素を指す。カロテノイドとしては、酸素含有キサントフィルおよび酸素非含有カロテンが挙げられる。いくつかの態様では、カロテノイドは、キサントフィルおよびカロテンからなる群から選択される。いくつかの態様では、キサントフィルは、ルテインまたはゼアキサンチンである。いくつかの態様では、カロテノイドは、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチンまたはリコペンである。
その他の実施形態では、イソプレノイドは、制限なしに、レチノール、レチニルパルミテート、レチノイン酸、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、またはキサントフィルβ−クリプトキサンチンなどのビタミンAの形態であり得る。なおも別の実施形態では、イソプレノイドは、制限なしに、トコフェロール(例えば、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、またはδトコフェロール)またはトコトリエノール(例えば、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、またはδトコトリエノール)などのビタミンEの形態であり得る。
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書の組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、上述のホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、ならびにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする、1つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであり得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、または同様に誘導性プロモーターと作動可能に連結し得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターとさらに作動可能に連結し得る。代案としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結し得る。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するように改変し得る。
いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の2つ以上のコピーを含んでなり得る。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、イソプレノイド前駆体分子をより複雑なイソプレノイド化合物に変換する。例示的なシンターゼポリペプチドとしては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドの少なくとも1つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、改善された安定性(例えば、熱安定性)、および/または改善された溶解度などのその他の改善された特性を有する。例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸としては、制限なしに、ゲラニル二リン酸(GPP)シンターゼ、ピロリン酸ファルネシル(FPP)シンターゼ、およびゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)シンターゼ、または任意のその他の既知のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドなどのポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
本発明のいくつかの態様では、本明細書の組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、ピロリン酸ファルネシル(FPP)シンターゼをコードする、1つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。FPPシンターゼポリペプチドは、内在性遺伝子によってコードされる内在性ポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、FPPシンターゼポリペプチドは、大腸菌(E.coli)中で、内在性ispA遺伝子によってコードされる。FPPシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、または同様に誘導性プロモーターと作動可能に連結し得る。FPPシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターとさらに作動可能に連結し得る。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性FPPシンターゼポリペプチドを過剰発現するように改変し得る。
いくつかの態様では、FPPシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、FPPシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の2つ以上のコピーを含んでなり得る。いくつかの態様では、FPPシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、FPPシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。
FPPシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。FPPシンターゼをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞抽出物中で、または生体内で、IPPを高級イソプレノイドに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。これらの方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第7,915,026号明細書、Hsieh et al.,Plant Physiol.2011年3月;155(3):1079−90;Danner et al.,Phytochemistry.2011年4月12日[印刷前のデジタル出版];Jones et al.,J Biol Chem.2011年3月24日[印刷前のデジタル出版]];Keeling et al.,BMC Plant Biol.2011年3月7日;11:43; Martin et al.,BMC Plant Biol.2010年11月21日;10:226;Kumeta&Ito,Plant Physiol.2010年12月;154(4):1998−2007;およびKollner&Boland,J Org Chem.2010年8月20日;75(16):5590−600に記載される。
イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産増大能力がある組換え細胞
(本明細書に記載されるような、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大させるように操作されている宿主細胞をはじめとする)本明細書に記載される組換え細胞(例えば組換え細菌細胞)は、同一条件下で培養された場合に、ホスホケトラーゼをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、MVA経路ポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を欠く同一細胞を上回る量および/または濃度で、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを産生する能力を有する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に由来する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(LactoBacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(LactoBacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(LeucoNostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(LactoBacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(SchizoSaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(LeucoNostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(LactoBacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)に由来する。
一実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、コリネバクテリウム属(Corynebacteria)種(例えばC.グルタミカム(C.glutamicum))である。
いくつかの態様では、ホスホケトラーゼをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、MVA経路ポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数のコピー、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸は、宿主細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる異種核酸である。その他の態様では、1つまたは複数の異種核酸は、プラスミドに組み込まれる。なおも別の態様では、1つまたは複数の異種核酸配列の少なくとも1つがプラスミドに組み込まれる一方で、1つまたは複数の異種核酸の少なくとも1つは細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる。組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド生産細胞と比較して、少なくとも5%高いイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド量を産生し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、または15%高い、ならびにこれらの数の間の任意の数値分高いイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを産生し得る。
本発明の一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、メバロン酸(MVA)経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、DXP経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞である。細胞は、IDIポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。1つまたは複数の異種核酸のいずれでも、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、誘導性プロモーターと作動可能に連結し得て、または誘導性および構成的プロモーターの組み合わせと作動可能に連結し得る。1つまたは複数の異種核酸は、さらに、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および/または中程度のプロモーターと、作動可能に連結し得る。ホスホケトラーゼ、メバロン酸(MVA)経路ポリペプチド、DXP経路ポリペプチド、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の1つまたは複数を、宿主細胞のゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。1つまたは複数の異種核酸は、ベクター上にさらに存在し得る。
本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに従った細胞によるイソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体の生産は、向上させ得る(例えば、ホスホケトラーゼポリペプチド、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチド、MVA経路ポリペプチド、および/またはDXP経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現によって向上させる)。本明細書の用法では、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産「向上」とは、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの細胞生産性指標(CPI)増大、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの力価増大、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの質量収率増大、および/またはイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの比生産性増大を指す。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するE4P、GAP、Ac−P、および/またはアセチルCoA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている。
本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、約5%〜約1,000,000倍向上させ得る。特定の態様では、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産と比較して、約10%〜約1,000,000倍(例えば、約1〜約500,000倍、about1〜約50,000倍、about1〜約5,000倍、about1〜約1,000倍、約1〜約500倍、約1〜約100倍、約1〜約50倍、約5〜約100,000倍、約5〜約10,000倍、約5〜約1,000倍、約5〜約500倍、約5〜約100倍、約10〜約50,000倍、約50〜約10,000倍、約100〜約5,000倍、約200〜約1,000倍、約50〜約500倍、または約50〜約200倍)向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するMVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産と比較して、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産向上が提供される。
その他の態様では、本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産と比較して、少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍、または1,000,000倍のいずれかで、向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するMVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産と比較して、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産向上が提供される。
本発明の一態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、1つまたは複数の完全MVA経路(すなわち、上流MVA経路および下流MVA経路)ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼをコードする1つまたは複数の異種核酸および/またはDXP経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞が提供される。細胞は、IDIポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。さらにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、FPPシンターゼポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に由来する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(LactoBacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(LactoBacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(LeucoNostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(LactoBacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(SchizoSaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(LeucoNostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(LactoBacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
別の実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、コリネバクテリウム属(Corynebacteria)種(例えばC.グルタミカム(C.glutamicum))である。1つまたは複数の異種核酸は、1つまたは複数のベクター上にさらに存在し得る。
本明細書で提供されるのは、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産向上を提供し得る組換え細胞である。細胞によるイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、完全MVA経路(すなわち、上流MVA経路および下流MVA経路)の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上させ得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に由来する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(LactoBacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(LactoBacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(LeucoNostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(LactoBacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(SchizoSaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(LeucoNostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(LactoBacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)に由来する。
一実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、コリネバクテリウム属(Corynebacteria)種(例えばC.グルタミカム(C.glutamicum))である。本明細書の用法では、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産「向上」は、ホスホケトラーゼ、完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチド、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド生産細胞生産性指標(CPI)の増大、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド力価の増大、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド質量収率の増大、および/またはイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド比生産性の増大を指す。イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、約5%〜約1,000,000倍向上させ得る。イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現がない細胞によるイソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、約10%〜約1,000,000倍(例えば、約1〜約500,000倍、約1〜約50,000倍、約1〜約5,000倍、約1〜約1,000倍、約1〜約500倍、約1〜約100倍、約1〜約50倍、約5〜約100,000倍、約5〜約10,000倍、約5〜約1,000倍、約5〜約500倍、約5〜約100倍、約10〜約50,000倍、約50〜約10,000倍、約100〜約5,000倍、約200〜約1,000倍、約50〜約500倍、または約50〜約200倍)向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、MVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体の生産向上が提供される。
本明細書に記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、向上させ得る(例えば、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現、下流MVA経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸によって向上させる)。
イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、約5%〜約1,000,000倍向上させ得る。イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産は、天然細胞(例えば、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸と、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸とを発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞による、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産と比較して、約10%〜約1,000,000倍(例えば、約1〜約500,000倍、約1〜約50,000倍、約1〜約5,000倍、約1〜約1,000倍、約1〜約500倍、約1〜約100倍、約1〜約50倍、約5〜約100,000倍、約5〜約10,000倍、約5〜約1,000倍、約5〜約500倍、約5〜約100倍、約10〜約50,000倍、約50〜約10,000倍、約100〜約5,000倍、約200〜約1,000倍、約50〜約500倍、または約50〜約200倍)向上させ得る。
その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞はまた、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現しないイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド産生組換え細胞による、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産と比較して、少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍数、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍、または1,000,000倍のいずれかで向上させ得る、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産を提供し得る。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の産生、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の産生、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド産生組換え細胞であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
組換え細胞を使用してイソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体分子を生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼおよびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞(例えば組換え細菌細胞)を培養するステップを含んでなる、イソプレノイド前駆物質分子および/またはイソプレノイドを生産する方法である。特定の実施形態では、組換え細胞は、上流MVA経路ポリペプチドおよび下流MVA経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の1つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドは、本明細書に記載される細胞のいずれかから、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、生産し得る。グルコースなどの六炭糖をはじめとする炭水化物から、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産する目的で、細胞のいずれかを使用し得る。
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)sp.、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドと、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaSポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップと、(b)イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。細胞は、上述の下流MVA経路ポリペプチド(例えば、MVK、PMK、MVD、および/またはIDI)をコードする1つまたは複数の核酸分子、および上述のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。本明細書に記載されるポリプレニルピロリン酸シンターゼまたはその変異体のいずれか、本明細書に記載される宿主細胞株のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および/またはベクター本明細書に記載されるのいずれかもまた使用して、本明細書に記載されるエネルギー源(例えば、グルコースまたは任意のその他の六炭糖)のいずれかを使用して、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産し得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産する方法は、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)sp.、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドと、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaSポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップと、(b)イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。細胞は、上述の下流MVA経路ポリペプチド(例えば、MVK、PMK、MVD、および/またはIDI)をコードする1つまたは複数の核酸分子、および上述のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。本明細書に記載されるポリプレニルピロリン酸シンターゼまたはその変異体のいずれか、本明細書に記載される宿主細胞株のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および/または本明細書に記載されるベクターのいずれかもまた使用して、本明細書に記載されるエネルギー源(例えば、グルコースまたは任意のその他の六炭糖)のいずれかを使用して、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産し得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産する方法は、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産する方法は、同様に、(a)ホスホケトラーゼを内在性に有しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を培養するステップであって、組換え細胞が、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと;(b)イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体産生細胞と比較して、より高い量のイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを産生する。
イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産する本方法は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まない、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞と比較して、少なくとも5%高い量のイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、または15%高いイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを産生し得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産する方法は、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書で提供されるのは、上述の細胞のいずれかを使用して、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体分子生産を向上させる方法である。細胞によるイソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼをコードしおよび/またはL.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaSポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、下流MVA経路ポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上させ得る。本明細書の用法では、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの生産「向上」は、ホスホケトラーゼ、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチド、下流MVA経路ポリペプチド、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)からのmvaEおよびmvaSポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド生産の細胞生産性指標(CPI)増大、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの力価増大、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの質量収率増大、および/またはイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドの比生産性増大を指す。イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドの生産は、約5%〜約1,000,000倍向上させ得る。イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現がない細胞によるイソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドの生産と比較して、約10%〜約1,000,000倍(例えば、約1〜約500,000倍、約1〜約50,000倍、約1〜約5,000倍、約1〜約1,000倍、約1〜約500倍、約1〜約100倍、約1〜約50倍、約5〜約100,000倍、約5〜約10,000倍、約5〜約1,000倍、約5〜約500倍、約5〜約100倍、約10〜約50,000倍、約50〜約10,000倍、約100〜約5,000倍、約200〜約1,000倍、約50〜約500倍、または約50〜約200倍)向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、方法は、MVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている組換え宿主細胞を含んでなり、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体の生産向上が提供される。
イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドの生産もまた、本明細書に記載される方法によって、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸の発現がないイソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイド産生細胞によるイソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドの生産と比較して、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍数、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍、または1,000,000倍のいずれかで、向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、方法は、MVA生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている組換え宿主細胞を含んでなり、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、イソプレノイドおよび/またはイソプレノイド前駆体の生産向上が提供される。
さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載される方法で細胞を培養し得る。例えば、いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産する方法は、(a)ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaE遺伝子およびmvaS遺伝子を内在性に有しない、(大腸菌(E.coli)細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない)組換え細胞を34℃の最少培地中で培養するステップであって、組換え細胞が、低から中程度のプラスミドコピーで、強力なプロモーター制御下において、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の1つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと、(b)イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなり、いくつかの態様では、方法は、イソプレノイド前駆体分子および/またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の生産、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号8と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号24と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号25と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号26と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号27と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号28と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号29と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号30と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号31と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、(a)グルコース上の細胞増殖、(b)キシロース上の細胞増殖、(c)細胞内アセチルリン酸の生産、または(d)グルコース−6−リン酸上の細胞増殖のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体および/またはイソプレノイドを生産する方法であって、組換え細胞は、(i)ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号11と少なくとも65%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、(ii)完全MVA経路の1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸、および(iii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含んでなり、(i)のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、(a)タンパク質溶解度、(b)タンパク質発現、または(c)フルクトース−6−リン酸(F6P)比活性のパラメータの1つまたは複数で、1.0を超える性能指標値を有する、組換え細胞。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号32と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号33と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号34と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号35と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号36と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号37と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号38と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号39と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号40と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号41と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号42と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号43と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号44と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号45と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号46と、少なくとも90%の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド(例えばE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼ)と比較して、1.1を超えるなど、1.2を超えるなど、1.4を超える、1.6を超える、1.8を超える、2を超える、2.2を超える、2.4を超える、2.6を超える、2.8を超える、3を超える、3.2を超える、3.4を超える、3.6を超える、3.8を超える、4を超える、4.2を超える、4.4を超える、4.6を超える、4.8を超える、5を超える、5.2を超える、5.4を超える、5.6を超える、5.8を超える、6を超える、6.2を超える、6.4を超える、6.6を超える、6.8を超える、7を超える、7.2を超える、7.4を超える、7.6を超える、7.8を超える、8を超える、8.2を超える、8.4を超える、8.6を超える、8.8、9を超える、9.2を超える、9.4を超える、9.6を超える、9.8、または10を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜0.5、約0.25〜0.75、約0.5〜1、約0.75〜1.25、約1〜1.5、約1.25〜1.75、約1.5〜2、約1.75〜2.25、約2〜2.5、約2.25〜2.75、約2.5〜3、約2.75〜3.25、約3〜3.5、約3.25〜3.75、約3.5〜4、約3.75〜4.25、約4〜4.5、約4.25〜4.75、約4.5〜5、約4.75〜5.25、約5〜5.5、約5.25〜5.75、約5.5〜6、約6.25〜6.75、約6.5〜7、約6.75〜7.25、約7〜7.5、約7.75〜8.25、約8〜8.5、約8.25〜8.75、約8.5〜9、約8.75〜9.25、約9〜9.5、約9.25〜9.75、または約9.5〜10以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約0.1〜2、約1〜3、約2〜4、約3〜5、約4〜6、約5〜7、約6〜8、約7〜9、または約8〜10以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上増大する。
ベクター
本明細書に記載される組成物および方法のいずれかにおいて、適切なベクターを使用し得る。例えば、適切なベクターを使用して、特定の宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli))中で、ホスホケトラーゼ、mvaEおよびanmvaSポリペプチドをはじめとするがこれに限定されるものではない上流MVA経路ポリペプチド、下流MVA経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、またはポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードする、遺伝子の1つまたは複数のコピーの発現を最適化し得る。いくつかの態様では、ベクターは選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーの例としては、抗生物質耐性核酸(例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール)および/または宿主細胞に対する栄養上の利点などの代謝上の利点をもたらす核酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼ;mvaEおよびanmvaSポリペプチドをはじめとするがこれに限定されるものではない上流MVA経路ポリペプチド;下流MVA経路ポリペプチド;L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaS核酸;イソプレンシンターゼ;またはポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸の1つまたは複数のコピーが、選択マーカーなしで宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
本明細書で特性解析され、または本開示の実施例で使用される、ベクターのいずれかを本発明で使用し得る。
形質転換方法
ホスホケトラーゼ、mvaEおよびanmvaSポリペプチドをはじめとするがこれに限定されるものではない上流MVA経路ポリペプチド、下流MVA経路ポリペプチド、および/または下流MVA経路ポリペプチドをコードする核酸の1つまたは複数のコピーを、適切な技術を使用して細胞中に挿入し得る。さらに、形質転換、電気穿孔、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入(例えば、リポフェクション媒介またはDEAE−デキストリン媒介形質移入または組換えファージウイルスを使用した形質移入)、リン酸カルシウムDNA沈殿によるインキュベーション、DNA被覆マイクロプロジェクタイルでの高速衝撃、およびプロトプラスト融合などの、宿主細胞にDNAコンストラクトまたはベクターを導入するための標準的な技術を使用して、イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路、および/またはポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸またはそれらを含有するベクターを、宿主細胞(例えば、本明細書に記載される植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または細菌細胞)中に挿入し得る。一般的形質転換技術は、当該技術分野で公知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.(編.)Chapter 9,1987;Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,1989;およびCampbell et al.,Curr.Genet.16:53−56,1989を参照されたい)。導入された核酸は、染色体DNAに組み込まれ、または染色体外自己複製配列として維持され得る。形質転換体は、当該技術分野で公知の任意の方法によって選択し得る。形質転換体を選択する適切な方法は、国際公開第2009/076676号パンフレット、米国特許出願公開第2009/0203102号明細書、国際公開第2010/003007号パンフレット、米国特許出願公開第2010/0048964号明細書、国際公開第2009/132220号パンフレット、および米国特許出願公開第2010/0003716号明細書に記載される。
例示的な宿主細胞
当業者は、発現ベクターが、特定の宿主株について遺伝子発現を最適化する特定構成要素を含有するように、デザインされることを認識するであろう。このような最適化構成要素としては、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書で言及されるベクターおよび構成要素は、例示的な目的のために記載され、本発明の範囲を狭めることは意図されない。
遺伝子を異種性に発現するのに使用し得る任意の細胞またはそれらの子孫を使用して、1つまたは複数のホスホケトラーゼを発現させ得る。特定の実施形態では、細胞(例えば組換え細胞)は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
上述のおよび本明細書のホスホケトラーゼをコードする異種核酸がある細胞(例えば組換え細胞)はまた、1つまたは複数のMVA経路ペプチド、イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路ポリペプチド(e)、および/またはピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドを発現する、1つまたは複数の異種核酸によって操作し得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定的例としては、コリネバクテリウム属(Corynebacteria)(例えばC.グルタミカム(C.glutamicum))、ストレプトミセス属(Streptomyces)(例えば、S.リビダンス(S.lividans)、S.コエリカラー(S.coelicolor)、またはS.グリセウス(S.griseus))、バチルス属(Bacillus)、リステリア属(Listeria)(例えば、L.モノサイトゲネス(L.monocytogenes)またはラクトバチルス属(Lactobacillus)(例えばラクトバチルス属(L.)種)の株が挙げられる。いくつかの実施形態では、起源生物は、大腸菌(E.coli)、シュードモナス属(Pseudomonas)種、またはH.ピロリ(H.pylori)などのグラム陰性細菌である。
グラム陽性またはグラム陰性細菌をはじめとする細菌細胞を使用して、上述の異種遺伝子のいずれかを発現させ得る。具体的には、mvaEおよびmvaS遺伝子は、P.シトレア(P.citrea)、B.サブチリス(B.subtilis)、B.リケニフォルミス(B.licheniformis)、B.レンタスB.lentus)、B.ブレビス(B.brevis)、B.ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)、B.アルカロフィルス(B.alkalophilus、B.アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B.クラウシイ(B.clausii)、B.ハロデュランス(B.halodurans)、B.メガテリウム(B.megaterium)、B.コアギュランス(B.coagulans)、B.サーキュランス(B.circulans)、B.ロータス(B.lautus)、B.チューリンギエンシス(B.thuringiensis)、S.アルバス(S.albus)、S.リビダンス(S.lividans)、S.コエリカラー(S.coelicolor)、S.グリセウス(S.griseus)、シュードモナス属(Pseudomonas)種、およびP.アルカリゲネス(P.alcaligenes)細胞のいずれか1つの中で発現され得る。
本発明の組成物および方法で宿主細胞として使用し得る、多数のタイプの嫌気性細胞がある。本発明の一態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞は、偏性嫌気性細胞およびその子孫である。偏性嫌気性菌は、典型的に、酸素が存在する条件では、たとえ増殖したとしても、十分に増殖しない。小量の酸素は存在してもよいものと理解され、すなわち、低レベルの酸素に対して偏性嫌気性菌が有する、いくらかの耐性レベルがある。一態様では、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドを産生するように改変された偏性嫌気性菌は、本明細書に記載される方法および/または組成物のいずれかのための宿主細胞の役割を果たし得て、存在する酸素量が嫌気性菌の増殖、維持、および/または発酵に有害でない実質的酸素非含有条件下で増殖される。
本発明の別の態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかで記載されおよび/または使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞およびその子孫である。通性嫌気性菌は、酸素が存在すれば、好気性呼吸(例えば、TCA回路の利用)によって細胞ATPを産生し得る。しかし通性嫌気性菌は、酸素不在下でもまた増殖し得る。これは、より多量の酸素の存在下で死滅し、または不十分に増殖する、偏性嫌気性菌とは対照的である。したがって一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物および/または方法のいずれかのための宿主細胞の役割を果たし得て、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドを産生するように改変し得る。通性嫌気性宿主細胞は、存在する酸素量が嫌気性菌の増殖、維持、および/または発酵に有害でない、実質的に酸素非含有の条件下で増殖し得て、または代案としてはより多量の酸素の存在下で増殖し得る。
宿主細胞はさらに、糸状菌細胞およびその子孫であり得る。(例えば、Berka&Barnett,Biotechnology Advances,(1989),7(2):127−154を参照されたい)。いくつかの態様では、糸状菌細胞は、トリコデルマ・ロンギブラキアツム(Trichoderma longibrachiatum)、T.ビリデ(T.viride)、T.コニンギイ(T.koningii)、T.ハルジアヌム(T.harzianum)、ペニシリウム属(Penicillium)種、フミコラ・インソレンス(Humicolainsolens)、H.ラヌギノース(H.lanuginose)、H.グリセア(H.grisea)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)種、C.ルクノウェンス(C.lucknowense)、グリオクラジウム属(Gliocladium)種、A.オリゼ(A.oryzae)、A.ニガー(A.niger)、ショウユコウジカビ(A.sojae)、A.ジャポニカス(A.japonicus)、A.ニデュランス(A.nidulans)、またはA.アワモリ(A.awamori)などのアスペルギルス属(Aspergillus)種、F.ロゼウム(F.roseum)、F.グラミヌム(F.graminum)、F.セレアリス(F.cerealis)、F.オキシスポラム(F.oxysporum)、またはF.ベネナツム(F.venenatum)などのフザリウム属(Fusarium)種、N.クラッサ(N.crassa)などのニューロスポラ属(Neurospora)種、ヒポクレア属(Hypocrea)種、M.ミーヘイ(M.miehei)などのケカビ属(Mucor)種、クモノスカビ属(Rhizopus)種またはエメリセラ属(Emericella)種のいずれかであり得る。いくつかの態様では、真菌は、A.ニデュランス(A.nidulans)、A.アワモリ(A.awamori)、A.オリゼ(A.oryzae)、A.アクレアトウス(A.aculeatus)、A.ニガー(A.niger)、A.ジャポニカス(A.japonicus)、T.リーゼイ(T.reesei)、T.ビリデ(T.viride)、F.オキシスポラム(F.oxysporum)、またはF.ソラニ(F.solani)である。特定の実施形態では、本明細書において利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許公開第2011/0045563号明細書に記載されるものが挙げられる。
宿主細胞はまた、サッカロミセス属(Saccharomyces)種、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)種、ピチア属(Pichia)種、またはカンジダ属(Candida)種などの酵母であり得る。いくつかの態様では、サッカロミセス属(Saccharomyces)種は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である(例えば、Romanos et al.,Yeast,(1992),8(6):423−488を参照されたい)。特定の実施形態では、本明細書で利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許第7,659,097号明細書、および米国特許出願公開第2011/0045563号明細書に記載されるものが挙げられる。
宿主細胞は、さらに、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ユーグレナ藻類、クロミスタ、または渦鞭毛藻類などの藻類種であり得る。(例えば、Saunders&Warmbrodt,“Gene Expression in Algae and Fungi,Including Yeast,”(1993),National Agricultural Library,Beltsville,MDを参照されたい)。特定の実施形態では、本明細書において利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許公開第2011/0045563号明細書に記載されるものが挙げられる。いくつかの態様では、宿主細胞は、形態学に基づいて、以下の群のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である:クロロコックム目(Chlorococcales)、プレウロカプサ目(Pleurocapsales)、ユレモ目(Oscillatoriales)、ネンジュモ目(Nostocales)、またはスティゴネマ目(Stigonematales)。(例えば、Lindberg et al.,Metab.Eng.,(2010)12(1):70−79を参照されたい)。特定の実施形態では、本明細書で利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許出願公開第2010/0297749号明細書;米国特許出願公開第2009/0282545号明細書、および国際公開第2011/034863号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
大腸菌(E.coli)宿主細胞を使用して、任意の数の生物から1つまたは複数のホスホケトラーゼ酵素を発現させ得る。特定の実施形態では、細胞(例えば組換え細胞)は、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ストレプトミセス属(Streptomyces)種、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)、シアノセイス属(Cyanothece)種、および/またはネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・グレイー(Listeria grayi)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・サッカロリチクス(Enterococcus saccharolyticus)、エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)種、メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)、テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)、および/またはマイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)、キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)、マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)、グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)、グラニュリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ストレプトコッカス・アウストラリス(Streptococcus australis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、および/またはマイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表1、表2および/または図面3〜24に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の1つまたは複数のコピーを含んでなる。
これらの細胞はまた、1つまたは複数のMVA経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路ポリペプチド、および/またはピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸によって操作し得る。一態様では、宿主細胞は、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸と並んで、上述のおよび本明細書のホスホケトラーゼをコードする1つまたは複数の核酸を発現する、メバロン酸を産生できる大腸菌(Escherichia coli)(大腸菌(E.coli)株またはその子孫の組換え細胞である。大腸菌(E.coli)宿主細胞は、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸と並んで、上述のおよび本明細書のホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を欠く同一細胞を上回る、量、ピーク力価、および細胞生産性で、メバロン酸を産生し得る。さらに、大腸菌(E.coli)内で、1つまたは複数のMVA経路ペプチドを発現する1つまたは複数の異種核酸と並んで、上述のおよび本明細書のホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現する核酸は、染色体コピーであり得る(例えば大腸菌(E.coli)染色体に組み込まれる)。その他の態様では、大腸菌(E.coli)細胞は培養中にある。いくつかの態様では、1つまたは複数のホスホケトラーゼ酵素は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、および/またはエンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)に由来する。任意の態様では、1つまたは複数のホスホケトラーゼ酵素は、本明細書で開示されるような任意のホスホケトラーゼ酵素である。
例示的な宿主細胞修飾
クエン酸シンターゼ経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルCoAの縮合を触媒して、トリカルボン酸(TCA)回路の代謝産物である、クエン酸を形成する(Ner,S.et al.1983.Biochemistry,22:5243−5249;Bhayana,V.and Duckworth,H.1984.Biochemistry 23:2900−2905)。大腸菌(E.coli)内では、gltAによってコードされるこの酵素は、二量体サブユニットの三量体のように挙動する。六量体形態は、酵素が、NADHによってアロステリックに調節され得るようにする。この酵素は、幅広く試験されている(Wiegand,G.,and Remington,S.1986.Annual Rev.Biophysics Biophys.Chem.15:97−117;Duckworth et al.1987.Biochem Soc Symp.54:83−92;Stockell,D.et al.2003.J.Biol.Chem.278:35435−43;Maurus,R.et al.2003.Biochemistry.42:5555−5565)。NADHによるアロステリックな阻害を回避するために、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)NADH非感受性クエン酸シンターゼによる置換またはその添加が考察された(Underwood et al.2002.Appl.Environ.Microbiol.68:1071−1081;Sanchez et al.2005.Met.Eng.7:229−239)。
どちらも基質としてアセチルCoAを有するために、クエン酸シンターゼによって触媒される反応は、メバロン酸経路の最初のステップを触媒するチオラーゼと直接競合する(Hedl et al.2002.J.Bact.184:2116−2122)。したがって、当業者は、クエン酸シンターゼ発現を調節して(例えば、酵素活性を低下させる)、より多くの炭素をメバロン酸経路に流動させ得て、それによってメバロン酸、イソプレンおよびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。クエン酸シンターゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%低下する。いくつかの態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の活性を低下させることで調節される。これは、NADH非感受性クエン酸シンターゼをコードする導入遺伝子による、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体置換によって、またはバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)に由来する、NADH非感受性クエン酸シンターゼをコードする導入遺伝子を使用することで、達成し得る。クエン酸シンターゼの活性はまた、合成構成的低発現性プロモーターによって内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモーターを置換することで、調節し得る(例えば、低下させる)。クエン酸シンターゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。クエン酸シンターゼの活性の低下は、クエン酸シンターゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多量の炭素流をもたらし得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、クエン酸シンターゼ(gltA)の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。クエン酸シンターゼイソ酵素の活性調節(例えば、低下)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、クエン酸シンターゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
ホスホトランスアセチラーゼおよび/または酢酸キナーゼが関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ(((i)pta(Shimizu et al.1969.Biochim.Biophys.Acta 191:550−558 または(ii)eutD(Bologna et al.2010.J of Microbiology.48:629−636)によって大腸菌(E.coli)内でコードされるが、アセチルCoAとアセチルリン酸(アセチル−P)の間の可逆的変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ(ackAによって大腸菌(E.coli)内でコードされる)(Kakuda,H.et al.1994.J.Biochem.11:916−922)は、アセチル−Pを使用して酢酸を形成する。これらの遺伝子は、大腸菌(E.coli)内でオペロンとして転写され得る。これらは一緒に、ATPの放出と共に、酢酸の異化を触媒する。したがって、ホスホトランスアセチラーゼの活性を高めることで、アセチルCoAに向かうアセチル−Pの量を増大させることが可能である。特定の実施形態では、強化は、上方制御されたプロモーターを染色体中の遺伝子上流に配置させることで、または遺伝子のコピーをプラスミド上の適切なプロモーターの後に配置させることで、達成される。酢酸に向かうアセチルCoAの量を低下させるために、酢酸キナーゼ遺伝子(例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子)の活性を低下させまたは弱め得る。特定の実施形態では、減衰は、酢酸キナーゼ(ackA)を欠失させることで達成される。これはクロラムフェニコールカセットによって遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで実施される。いくつかの態様では、酢酸キナーゼの活性は、内在性酢酸キナーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性酢酸キナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。特定の実施形態では、酢酸処理を施したキナーゼ遺伝子の弱力化は、ホスホトランスアセチラーゼ(pta)遺伝子の発現を妨害することで、実施されるべきである。酢酸は、様々な理由で大腸菌(E.coli)によって産生される(Wolfe,A.2005.Microb.Mol.Biol.Rev.69:12−50)。理論により拘束されることなく、ackAの欠失は、(ackAはアセチルCoAを利用するので)酢酸生成に転用される炭素量の低下をもたらし得て、したがってメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび/またはイソプレノイドを増大させる。
いくつかの態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、弱力化された内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現、または増大されたホスホトランスアセチラーゼを有しない細胞と比較して、低下した量の酢酸を産生する。生成する酢酸の量の低下は、当業者に知られている既知の日常的アッセイによって測定し得る。酢酸の量は、内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現またはホスホトランスアセチラーゼ遺伝子発現に分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%低下する。
ホスホトランスアセチラーゼ(ptaおよび/またはeutD)の活性は、酵素のその他の分子操作によって増大させ得る。酵素活性の増大は、操作が実施されなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性増大は少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%増大する。一実施形態では、ptaの活性は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、ホスホトランスアセチラーゼ(ptaおよび/またはeutD)の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。ホスホトランスアセチラーゼイソ酵素の活性調節(例えば、増大)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、ホスホトランスアセチラーゼ(ptaおよび/またはeutD)イソ酵素の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
酢酸キナーゼ(ackA)の活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%低下する。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、酢酸キナーゼ(ackA)の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。酢酸キナーゼイソ酵素の活性調節(例えば、低下)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、酢酸キナーゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
場合によっては、内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性酢酸遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
乳酸デヒドロゲナーゼが関与する経路
大腸菌(E.coli)内では、D乳酸は、酵素乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhAによってコードされる − 図1)を通じて、ピルビン酸から生成される(Bunch,P.et al.1997.Microbiol.143:187−195)。乳酸の生成はNADHの酸化を伴い、したがって酸素が制限されており、全ての還元当量に対応し得ない場合に、乳酸が生成する。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因になり得る。したがって、メバロン酸生成(および所望ならば、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイド生成)への炭素流動を改善するために、当業者は、酵素の活性を低下させることなどによって、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節し得る。
したがって、一態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性の弱力化によって調節し得る。このような弱力化は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失によって達成され得る。当業者に知られている乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を弱力化するその他の方法もまた、使用してもよい。乳酸デヒドロゲナーゼが関与する経路を操作することで、組換え細胞は、弱力化された内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、低下した量の乳酸を産生する。生成する乳酸量の低下は、当業者に知られている既知の日常的アッセイによって測定し得る。乳酸の量は、分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%低下する。
乳酸デヒドロゲナーゼの活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%低下する。
したがって、場合によっては、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
グリセルアルデヒド3−リン酸が関与する経路
グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)は、グリセルアルデヒド3−リン酸の1,3−ビスホスホ−D−グリセリン酸塩への変換を触媒する、解糖の重要な酵素である(Branlant G.and Branlant C.1985.Eur.J.Biochem.150:61−66)。
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ発現を調節して(例えば、酵素活性を低下させて)、フルクトース6−リン酸およびキシルロース5−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによってメバロン酸、イソプレンおよびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%低下する。または100%。いくつかの態様では、内在性グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させることで、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、内在性グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はまた、同一反応を触媒するが、NADPHでなくNADHを生じる、バチルス属(Bacillus)酵素によって置換され得る。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性の低下は、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性調節(例えば、低下)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)イソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
エントナー・ドウドロフ経路が関与する経路
エントナー・ドウドロフ(ED)経路は、エンデン・メイヤーホフ・パルナス(EMP−解糖)経路の代替物である。大腸菌(E.coli)のようないくつかの生物がEDおよびEMP経路の双方を持つ一方で、その他の生物はそのどちらか一方のみを有する。バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)がEMP経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)はED経路のみを有する(Peekhaus and Conway.1998.J.Bact.180:3495−3502;Stulke and Hillen.2000.Annu.Rev.Microbiol.54,849−880;Dawes et al.1966.Biochem.J.98:795−803)。フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)は、エントナー・ドウドロフ経路と相互作用して、フルクトース−1,6−二リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)およびグリセルアルデヒド3−リン酸(GAP)への変換を可逆的に触媒する(Baldwin S.A.,et.al.,Biochem J.(1978)169(3):633−41)。
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(edd)が、6−ホスホ−D−グルコン酸塩から1分子のH2Oを除去して、2−デヒドロ−3−デオキシ−D−グルコン酸塩6−リン酸を形成するのに対し、2−ケト−3−デオキシグルコン酸6−リン酸アルドラーゼ(eda)は、アルドール切断を触媒する(Egan et al.1992.J.Bact.174:4638−4646)。2つの遺伝子は、オペロン中にある。
ホスホケトラーゼ経路に向けられ得る代謝産物はまた、ED経路にも転用され得る。代謝産物が、ED経路に失われるのを回避するために、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子(例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子)および/または2−ケト−3−デオキシグルコン酸6−リン酸アルドラーゼ遺伝子(例えば、内在性2−ケト−3−デオキシグルコン酸6−リン酸アルドラーゼ遺伝子)活性が弱力化される。弱力化を達成する一方法は、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(edd)および/または2−ケト−3−デオキシグルコン酸6−リン酸アルドラーゼ(eda)を欠失させることである。これはクロラムフェニコールまたはカナマイシンカセットによって片方または双方の遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで達成し得る。これらの酵素機能がなければ、より多くの炭素がホスホケトラーゼ酵素に流動し得て、したがってメバロン酸、イソプレンまたはイソプレノイドの収率を増大させる。
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(edd)および/または2−ケト−3−デオキシグルコン酸6−リン酸アルドラーゼ(eda)の活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%低下される。
場合によっては、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子および/または内在性2−ケト−3−デオキシグルコン酸6−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子および/または内在性酢酸キナーゼ−2−ケト−3−デオキシグルコン酸6−リン酸アルドラーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
ホスホケトラーゼ経路に向けられ得る代謝産物はまた、ED経路またはEMP経路にも転用され得る。代謝産物の欠損を回避して、フルクトース−6−リン酸(F6P)濃度を増大させるために、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(例えば、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ)活性が弱力化される。場合によっては、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。いくつかの態様では、弱力化は、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)を欠失させることで達成される。欠失は、クロラムフェニコールまたはカナマイシンカセットによって遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで達成し得る。いくつかの態様では、フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性は、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。これらの酵素機能がなければ、より多くの炭素がホスホケトラーゼ酵素に流動し得て、したがって、メバロン酸、イソプレン、またはイソプレノイドの収率を増大させる。フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%低下される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。フルクトース二リン酸アルドラーゼイソ酵素の活性調節(例えば、低下)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、フルクトース二リン酸アルドラーゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
ペントースリン酸経路の酸化分岐が関与する経路
大腸菌(E.coli)は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソースとペントースを分解し、細胞様々な同化経路のための中間体を提供する。それはまた、NADPHの主な産生者でもある。ペントースリン酸経路は、酸化分岐(グルコース6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホグルコノラクトナーゼ(pgl)または6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(gnd)のような酵素がある)、および非酸化分岐(トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼ(talAまたはtalB)、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼ、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)および/またはリブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)などの酵素がある)から構成される(Sprenger.1995.Arch.Microbiol.164:324−330)。
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、ペントースリン酸経路の非酸化分岐(トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼ、リボース−5−リン酸イソメラーゼA、リボース−5−リン酸イソメラーゼB、および/またはリブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ)の発現を調節し(例えば、酵素活性を増大させ)、フルクトース6−リン酸およびキシルロース5−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによって、メバロン酸、イソプレンおよびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼ活性の増大は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%増大する。いくつかの態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼ、および(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼの活性を増大させることで、調節される。これは合成構成的高発現性プロモーターによって、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼ遺伝子プロモーターを置換することで達成し得る。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼをコードする遺伝子はまた、適切なプロモーターの後のプラスミド上にクローン化し得る。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼの活性の増大は、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼの発現増大を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。
本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。任意の本発明の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスアルドラーゼ(talAまたはtalB)の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。任意の本発明の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホグルコノラクトナーゼ(pgl)、6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(gnd)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼ(talAまたはtalB)、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼ、リボース−5−リン酸エピメラーゼ、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)および/またはリブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)イソ酵素の活性調節(例えば、低下または増大)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(zwf)イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)イソ酵素の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスアルドラーゼ(talAまたはtalB)イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼを調節し得る(例えば、酵素活性を低下させる)。いくつかの態様では、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(zwf)(例えば、内在性グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ遺伝子)の活性は、低下または弱力化し得る。特定の実施形態では、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼを欠失させることで、弱力化が達成される。いくつかの態様では、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼの活性は、内在性グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼの活性を低下させることで調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、内在性グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(zwf)の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性調節(例えば、低下)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。
ホスホフルクトキナーゼが関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、フルクトース−6−リン酸のリン酸化を触媒する、解糖の重要な酵素である。大腸菌(E.coli)は、pfkAおよびpfkBによってコードされる2つのイソ酵素を有する。細胞内のホスホフルクトキナーゼ活性の大部分は、pfkAに起因する(Kotlarz et al.1975 Biochim.Biophys.Acta 381:257−268)。
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、ホスホフルクトキナーゼ発現を調節して(例えば、酵素活性を低下させて)、フルクトース−6−リン酸およびキシルロース−5−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによってメバロン酸、イソプレン、およびイソプレノイドの最終生産量を増大させる。ホスホフルクトキナーゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%低下される。または100%。いくつかの態様では、ホスホフルクトキナーゼの活性は、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。ホスホフルクトキナーゼの活性の低下は、ホスホフルクトキナーゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多量の炭素流をもたらし得る。
本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、フルクトース−6−リン酸(fructose 6−phosphate)(pfkAおよび/またはpfkB)の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。フルクトース−6−リン酸イソ酵素の活性調節(例えば低下)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、フルクトース−6−リン酸イソ酵素の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が関与する経路
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸からアセチルCoAへの脱炭酸を触媒し、遺伝子aceE、aceF、およびlpdAによってコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、いくつかの調節因子によって調節される。したがって、当業者は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を調節することで、アセチルCoAを増大させ得る。変化は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性および/または発現の増大(例えば、持続的発現)であり得る。これは、例えば、PL.6(aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg−λプロモーター、Genbank NC_001416、配列番号14)のような強力な構成的プロモーターを、オペロンの前に配置させる、または1つまたは複数の合成構成的発現プロモーターを使用するなどの異なる方法によって、達成され得る。
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、(a)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(E1)、(b)ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、および(c)ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の1つまたは複数の酵素の活性を増大させることで、調節される。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性増大のために、これらの酵素をコードする遺伝子の任意の1、2または3つを操作し得るものと理解される。別の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサーの活性の弱力化によって調節し得て、詳細は下述される。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失によって弱力化し得る。
場合によっては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする1つまたは複数の遺伝子は、内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増大させる別の方法は、細胞に、(a)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(E1)、(b)ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、および(c)ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群からの1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種核酸を導入することである。
これらの方法のいずれかを使用することで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が調節されていない細胞と比較して、組換え細胞は、増大した量のアセチルCoAを生じ得る。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現調節を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。
ホスホトランスフェラーゼ系が関与する経路
ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS)は、解糖作用中間体ホスホエノールピルビン酸(PEP)によって提供されるエネルギーに依存するプロセス中で、その炭水化物基質を膜を越えて輸送し、同時にリン酸化する多要素システムである。PTSを調節する遺伝子は、大部分がオペロン中でクラスター化する。例えば、大腸菌(Escherichia coli)のptsオペロン(ptsHIcrr)は、ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系(PTS)の中核を成す3つのタンパク質、HPr(ptsH)、酵素I(ptsI)、およびEIIIGlc(crr)タンパク質をコードする、ptsH、ptsI、およびcrr遺伝子から構成される。これらの3つの遺伝子は複合オペロンに編成され、その中では、遠位遺伝子crrの発現の大部分が、ptsI内のプロモーター領域から開始される。ptsオペロンの遺伝子に加えて、ptsGは、ホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的輸送体、ptsGをコードする。このプロモーター領域からの転写は、異化産物活性化タンパク質(CAP)−環状AMP(cAMP)の正の制御下にあり、グルコース(PTS基質)の存在下における増殖中に増大される。さらにppsA遺伝子は、ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS)の活性に必要なホスホエノールピルビン酸(PEP)を生成するための、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼをコードする。炭素流は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路またはPTS経路を通じて、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼによって誘導される。その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Postma,P.W.,et al.,Microbiol Rev.(1993),57(3):543−94)を参照されたい。
本明細書に記載される特定の実施形態では、オペロンの下方制御(例えば弱力化)は、宿主細胞による酢酸利用を高め得る。PTSオペロンの下方制御は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、複合体の活性低下は、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%低下される。特定の実施形態では、弱力化は、ptsオペロンを欠失させることで達成される。いくつかの態様では、PTS系の活性は、内在性ptsオペロンの活性を低下させることで調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、ptsオペロン中の内在性プロモーターを置換することで達成し得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ptsオペロンの活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、EI(ptsI)の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、EIICBGlc(ptsG)の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、EIIAGlc(crr)の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、HPr(ptsH)の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。グルコース取り込みのためのPEPプールを増大させながら、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを通じて失われる炭素を低下させるために、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ(ppsA)の活性を増大させ得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ(ppsA)の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意のさらなる態様では、PTSは下方制御され、グルコース輸送経路は上方制御される。グルコース輸送経路としては、ガラクトース(galP)およびグルコキナーゼ(glk)が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ptsオペロンは下方制御され、ガラクトース(galP)遺伝子は上方制御され、グルコキナーゼ(glk)遺伝子は上方制御される。PTSのイソ酵素の活性調節(例えば低下)もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする1つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、PTSイソ酵素の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。
キシロース利用が関与する経路
本明細書に記載される特定の実施形態では、植物バイオマスに由来する糖を、メバロン酸など、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび/またはイソプレノイドなどの所望の生成物に変換するのに、キシロースの利用が望ましい。生物によっては、キシロース利用は、代謝のためのフルクトース−6−リン酸への変換のために、ペントースリン酸経路の利用を必要とする。生物は、グルコースによる異化代謝産物抑制の不活性化、またはその他の生物に見られるキシロースオペロンからの遺伝子の異種性発現のどちらかによる、キシロース利用向上のために、操作し得る。キシルロース経路は、ホスホケトラーゼ経路によるメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび/またはイソプレノイドの生産を高めるように、下述されるように操作し得る。
キシロース取り込みの強化、そしてキシルロース−5−リン酸への変換と、それに続くホスホケトラーゼ経路への直接流入は、有利である。理論により拘束されることなく、これは炭素流が、ペントースリン酸経路をバイパスできるようにする(が、必要に応じて、いくらかのグリセルアルデヒド−3−リン酸がPPP中に循環されてもよい)。キシルロキナーゼの発現向上を利用して、キシルロース−5−リン酸の総生産量を増大させ得る。キシルロキナーゼの発現および活性の最適化を利用して、ホスホケトラーゼ経路のある株中でキシロース利用を高め得る。所望のキシルロキナーゼは、宿主の内在性酵素、または宿主に適合性の任意の異種キシルロキナーゼのどちらであってもよい。一実施形態では、キシロースオペロンのその他の構成要素(例えば、キシロースイソメラーゼ)を過剰発現させて、便益を増大させ得る。別の実施形態では、その他のキシロース経路酵素(例えば、キシロース還元酵素)を弱力化する(例えば、活性低下または欠失)必要があるかもしれない。
したがって本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ酵素を有するように操作された宿主細胞は、内在性形態または異種形態のどちらかのキシルロースイソメラーゼおよび/またはキシルロキナーゼを過剰発現して、メバロナート、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび/またはイソプレノイドの全収率および生産性が改善するようにさらに操作し得る。
ペントースリン酸経路のトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素が関与する経路
嫌気性またはヘテロ発酵性増殖できるいくつかの微生物は、解糖経路の代わりに、またはそれに加えて、ホスホケトラーゼ経路を組み入れている。この経路は、ペントースリン酸経路酵素である、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの活性に依存する。したがって、本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ酵素を有するように操作された宿主細胞は、内在性形態または異種形態のどちらかのトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現して、経路流束を改善し、潜在的に毒性の中間体レベルを低下させ、中間体の非生産的経路への転用を低下させ、メバロナート、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび/またはイソプレノイドの全収率および生産性が改善するように、さらに操作し得る。
変異の組み合わせ
本明細書に記載される酵素および/または酵素経路のいずれかについて、本明細書に記載される酵素および/または酵素経路の(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14個の)任意の組み合わせを調節する分子操作が、明示的に検討されるものと理解される。組み合わせの列挙を容易にするために、クエン酸シンターゼ(gltA)をAと表し、ホスホトランスアセチラーゼ(pta)をBと表し、酢酸キナーゼ(ackA)をCと表し、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)をDと表し、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gap)をEと表し、およびピルビン酸デカルボキシラーゼ(aceE、aceF、および/またはlpdA)をFと表し、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(edd)をGと表し、2−ケト−3−デオキシグルコン酸6−リン酸アルドラーゼ(eda)Hをと表し、ホスホフルクトキナーゼをIと表し、トランスアルドラーゼをJと表し、トランスケトラーゼをKと表し、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼをLと表し、リボース−5−リン酸エピメラーゼをMと表し、キシルロキナーゼをNと表し、キシロースイソメラーゼをOと表し、およびキシリトール還元酵素をPと表し、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpi)をQと表し、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)をRと表し、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ(pps)をSと表し、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba)をTと表し、EI(ptsI)をUと表し、EIICBGlc(ptsG)をVと表し、EIIAGlc(crr)をWと表し、HPr(ptsH)をXと表し、ガラクトース(galP)をYと表し、グルコキナーゼ(glk)をZと表し、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)をAAと表す。上で考察されるように、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を増大させるために、ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体のaceE、aceF、および/またはlpdA酵素を単独で、3酵素の内2つを、または3酵素の内3つを使用し得る。したがって、本明細書でA−Mと称する任意のおよび全ての酵素組み合わせが明示的に検討され、A−AAと称する任意のおよび全ての酵素組み合わせについても同様である。さらに、上述の任意の組み合わせは、本明細書に記載される酵素および/または酵素経路のいずれか(例えば、ホスホケトラーゼ、MVA経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、DXP経路ポリペプチド)と組み合わせて使用し得る。
生成増大のためのその他の制御因子および要素
その他の分子操作を使用して、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させ得る。一方法は、メバロン酸経路に供給する経路に対する負の制御因子の効果を削減し、低下させまたは排除することである。例えば、場合によっては、遺伝子aceEF−lpdAはオペロン中にあり、4番目の遺伝子はpdhR上流にある。遺伝子pdhRは、そのオペロンの転写の負の制御因子である。ピルビン酸不在下では、それはその標的プロモーターに結合して、転写を抑制する。それはまた、ndhおよびcyoABCDを同様に調節する(Ogasawara,H.et al.2007.J.Bact.189:5534−5541)。一態様では、pdhR制御因子の欠失は、ピルビン酸の供給を改善し得て、したがって、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドの生成を改善する。
別の実施形態では、結果として得られた上述の株のいずれかをさらに改変して、エントナー・ドウドロフ経路の活性を調節し得る。ホスホグルコン酸デヒドラターゼまたはアルドラーゼをコードする遺伝子は、弱力化または欠失させ得る。別の実施形態では、結果として生じる上述の株のいずれかもまた、酢酸キナーゼまたはクエン酸シンターゼの活性を低下させまたは除去するように改変してもよい。別の実施形態では、株のいずれか結果として生じる株はまた、ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させまたは除去するように改変してもよい。別の実施形態では、上述の結果として生じる株のいずれかはまた、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節するように改変してもよい。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、その活性を低下させることで調節し得る。別の実施形態では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼおよび(または)リボース−5−リン酸エピメラーゼなどの、ペントースリン酸経路の非酸化分岐からの酵素を過剰発現させ得る。
その他の態様では、宿主細胞をさらに改変して、セドヘプツロース−1,7−ビスホスファターゼ/フルクトース−1,6−二リン酸アルドラーゼおよびセドヘプツロース−1,7−ビスホスファターゼ/フルクトース−1,6−二リン酸ホスファターゼをコードする異種核酸を導入することで、細胞内アセチル−リン酸濃度を増大させ得る。特定の実施形態では、これらの分子操作を有する宿主細胞は、弱力化されまたは欠失しているトランスアルドラーゼ(talB)およびホスホフルクトキナーゼ(pfkAおよび/またはpfkB)遺伝子と組み合わせ得て、それによってエリスロース4−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、およびグリセルアルデヒド3−リン酸のセドヘプツロース7−リン酸およびフルクトース1−リン酸へのより迅速な変換を可能にする(図5を参照)。
その他の態様では、PGLが欠失している細胞(様々な大腸菌(E.coli)株など)内への6−ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)の導入を使用して、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドの生成を改善し得る。PGLは、染色体への組み込みまたはプラスミドなどの染色体外媒介物を使用した、コード遺伝子導入によって、導入してもよい。
本明細書に記載される様々な酵素経路を調節するための宿主細胞(例えば、細菌宿細胞)変異は、メバロン酸生成に向けて炭素流を増大させるが、それに加えて、本明細書に記載される宿主細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチド、ならびにmvaEおよびmvaS遺伝子産物をはじめとするがこれに限定されない上流および下流MVA経路からのその他の酵素をコードする遺伝子を含んでなる。MVA経路ポリペプチドの非限定的例としては、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ(AA−CoAチオラーゼ)ポリペプチド、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAシンターゼ(HMG−CoAシンターゼ)ポリペプチド、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoA還元酵素(HMG−CoA還元酵素)ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMDC)ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ(IPK)ポリペプチド、IDIポリペプチド、およびMVA経路ポリペプチドの2つ以上の活性を有するポリペプチド(例えば、融合ポリペプチド)が挙げられる。MVA経路ポリペプチドとしては、MVA経路ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なMVA経路核酸としては、MVA経路ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なMVA経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
使用し得るMVA経路ポリペプチドの非限定的例は、国際公開第2009/076676号パンフレット;国際公開第2010/003007号パンフレット、および国際公開第2010/148150号パンフレットに記載される。
例示的な細胞培養液
本明細書の用法では、「最少培地」または「最少培地」という用語は、常時ではないが、通常、1つまたは複数のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上のアミノ酸)の存在がない、細胞増殖に可能な最少栄養素を含有する増殖培地を指す。最少培地は、典型的に、(1)細菌増殖のための炭素源;(2)細菌種および培養条件の間で変動し得る、様々な塩類;および(3)水を含有する。下でより詳細に考察されるように、炭素源は、グルコースのような単糖類から、酵母抽出物などのその他のバイオマスのより複雑な加水分解物まで、顕著に変動し得る。塩類は、概してマグネシウム、窒素、リン、およびイオウなどの不可欠な構成要素を提供し、細胞がタンパク質と核酸を合成できるようにする。最少培地はまた、抗生物質などの選択的作用因子で補足して、特定のプラスミドの維持などについて選択し得る。例えば、微生物が、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの特定の抗生物質に耐性を示す場合、耐性を欠く細胞が増殖するのを妨ぐために、その抗生物質を培地に添加し得る。培地は、必要に応じてその他の化合物で補足して、特定のアミノ酸などの所望の生理学的または生化学的特性について選択し得る。
任意の最少培地調合物を使用して、宿主細胞を培養し得る。例示的な最少培地調合物としては、例えば、M9最少培地およびTM3最少培地が挙げられる。1リットルのM9最少培地あたり、以下を含有する:(1)200mlの無菌M9塩(1リットルあたり、64gのNa2HPO4−7H2O、15gのKH2PO4、2.5gのNaCl、および5.0gのNH4Cl);(2)2mlの1M MgSO4(無菌);(3)20mlの20%(w/v)グルコース(またはその他の炭素源);および(4)100μlの1M CaCl2(無菌)。1リットルのTM3最少培地あたり、以下を含有する:(1)13.6gのK2HPO4;(2)13.6gのKH2PO4;(3)2gのMgSO4 *7H2O;(4)2gのクエン酸一水和物;(5)0.3gのクエン酸第二鉄アンモニウム;(6)3.2gの(NH4)2SO4;(7)0.2gの酵母抽出物;および(8)1mlの1000×微量成分溶液;pHは約6.8に調節され、溶液は濾過滅菌される。1リットルの1000×微量成分あたり、以下を含有する:(1)40gのクエン酸一水和物;(2)30gのMnSO4 *H2O;(3)10gのNaCl;(4)1gのFeSO4 *7H2O;(4)1gのCoCl2 *6H2O;(5)1gのZnSO4 *7H2O;(6)100mgのCuSO4 *5H2O;(7)100mgのH3BO3;および(8)100mgのNaMoO4 *2H2O;pHは約3.0に調節される。
追加的な例示的最少培地は、以下を含む:(1)リン酸カリウムK2HPO4、(2)硫酸マグネシウムMgSO4 *7H2O、(3)クエン酸一水和物C6H8O7 *H2O、(4)クエン酸第二鉄アンモニウムNH4FeC6H5O7、(5)酵母抽出物(biospringerからの)、(6)1000×修正微量金属溶液、(7)硫酸50%w/v、(8)foamblast 882(Emerald Performance Materials)、および(9)マクロ塩類溶液3.36ml。全ての構成要素を脱イオンH2Oに共に添加して溶解し、次に加熱滅菌する。室温への冷却に続いて、pHを水酸化アンモニウム(28%)で7.0に調節して、所定容積にする。滅菌およびpH調節後、ビタミン溶液およびスペクチノマイシンを添加する。
宿主細胞は、任意の炭素源を使用して培養し得る。「炭素源」という用語は、宿主細胞または生物によって代謝されることができる、1つまたは複数の炭素含有する化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するのに使用される細胞培地としては、宿主細胞の生存率維持または増殖に適した任意の炭素源が挙げられる。いくつかの態様では、炭素源は、炭水化物(単糖、二糖類、オリゴ糖、または多糖類など)、または転化糖(例えば、酵素処理スクロースシロップ)である。
いくつかの態様では、炭素源は、酵母抽出物、または酵母抽出物の1つまたは複数の構成要素を含む。いくつかの態様では、酵母抽出物の濃度は、0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、または0.01%(w/v)の酵母抽出物である。いくつかの態様では、炭素源は、酵母抽出物(またはその1つまたは複数の構成要素)と、グルコースなどの別の炭素源との双方を含む。
例示的な単糖類としては、グルコースおよびフルクトースが挙げられ;例示的なオリゴ糖としては、乳糖およびスクロースが挙げられ;および例示的な多糖類としては、デンプンおよびセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、C6糖(例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース)およびC5糖(例えば、キシロースまたはアラビノース)が挙げられる。
例示的な細胞培養条件
本発明の組換え細胞の維持および増殖に適した材料および方法は、例えば、実施例セクションで後述される。細菌培養の維持および増殖に適したその他の材料および方法もまた、技術分野で周知である。例示的な技術は、国際公開第2009/076676号パンフレット、米国特許出願公開第2009/0203102号明細書、国際公開第2010/003007号パンフレット、米国特許出願公開第2010/0048964号明細書、国際公開第2009/132220号パンフレット、米国特許出願公開第2010/0003716号明細書、Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al.,編),米国微生物学会(American Society for Microbiology),Washington,D.C.(1994)、またはBrock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA.にある。いくつかの態様では、細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチド;ならびにmvaEおよびmvaS遺伝子産物をはじめとするがこれに限定されるものではない上流および下流MVA経路からのその他の酵素;宿主細胞中に挿入された核酸によってコードされるイソプレンシンターゼ、DXP経路(例えば、DXS)、IDI、またはPGLポリペプチドの発現ができるようにする条件下で、培地中で培養される。
標準的細胞培養条件を使用して、細胞を培養し得る(例えば、国際公開第2004/033646号パンフレットと、その中で引用される参考文献を参照されたい)。いくつかの態様では、細胞は、適切な温度、ガス混合物、およびpH(約20°C〜約37°C、約6%〜約84%CO2、およびpH約5〜約9など)で、増殖され維持される。いくつかの態様では、細胞は、適切な細胞培地中で35°Cで増殖される。いくつかの態様では、発酵のためのpH範囲は、約pH5.0〜約pH9.0(約pH6.0〜約pH8.0または約6.5〜約7.0など)である。細胞は、宿主細胞の要件に基づいて、好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で増殖し得る。さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、細胞を培養し得る。例えば、いくつかの実施形態では、組換え細胞(大腸菌(E.coli)細胞など)は、低コピー数から中程度コピー数プラスミド中で、強力なプロモーターの制御下にある、ホスホケトラーゼポリペプチド;ならびにmvaEおよびmvaS遺伝子産物をはじめとするが、これに限定されるものではない上流からの酵素;L.グレイー(L.grayi)、E.フェシウム(E.faecium)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)および/またはE.ファエカリス(E.faecalis)からのmvaEおよびmvaSポリペプチドをコードする、1つまたは複数の異種核酸を含んでなり、34℃で培養される。
使用し得る標準的培養条件と、バッチ、流加、または連続発酵などの発酵様式は、国際公開第2009/076676号パンフレット、米国特許出願公開第2009/0203102号明細書、国際公開第2010/003007号パンフレット、米国特許出願公開第2010/0048964号明細書、国際公開第2009/132220号パンフレット、米国特許出願公開第2010/0003716号明細書に記載される。バッチおよび流加発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は、Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.にある。
いくつかの態様では、細胞は、グルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」とは、添加されるグルコースの量が、細胞によって消費されるグルコース量の約105%以下(約100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10%など)であることを意味する。特定の態様では、培地に添加されるグルコースの量は、特定期間中に細胞によって消費されるグルコースの量と、ほぼ同じである。いくつかの態様では、細胞増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量が支持し得る速度で、細胞が増殖するように、グルコースの添加量を制限することで制御される。いくつかの態様では、グルコースは、細胞の培養時間中に蓄積されない。様々な態様において、細胞は、グルコース制限条件下で、約1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、または70時間以上培養される。様々な態様において、細胞は、細胞が培養される総時間の5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95、または100%以上にわたって、グルコース制限条件下で培養される。いかなる特定の理論による拘束も意図されないが、グルコース制限条件は、細胞のより良好な制御を可能にすると考えられる。
いくつかの態様では、組換え細胞は、バッチ培養中で増殖される。組換え細胞はまた、流加培養または連続培養中で増殖させ得る。さらに、組換え細胞は、上述の最少培地のいずれかをはじめとするが、これに限定されるものではない最少培地中で培養し得る。最少培地は、1.0%(w/v)以下のグルコースまたは任意のその他の六炭糖で、さらに補足し得る。具体的には、最少培地は、1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、または0.1%(w/v)のグルコースで補足し得る。さらに、最少培地は、0.1%(w/v)以下の酵母抽出物で補足し得る。具体的には、最少培地は、0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、または0.01%(w/v)のグルコースで補足し得る。代案としては、最少培地に、1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、または0.1%(w/v)グルコースおよびwith0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、または0.01%(w/v)の酵母抽出物を添加し得る。
例示的な精製法
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、生産された化合物を回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、イソプレンを回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、イソプレンは、吸収ストリッピングによって回収される(例えば、米国特許公開第2011/0178261号明細書を参照されたい)。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、異種ポリペプチドを回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、テルペノイドまたはカロテノイドを回収するステップをさらに含む。
適切な精製法は、米国特許出願公開第2010/0196977A1号明細書に、より詳細に記載される。
本明細書全体を通じて、様々な特許、特許出願およびその他の各種文献(例えば学術誌論文)に言及する。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および文献の開示は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
本発明は、例証として提供され制限を意図するものではない、以下の実施例を参照してさらに理解される得る。
実施例1:ホスホケトラーゼの同定
組換え細胞内における、アセチル補酵素A由来(アセチルCoA由来)代謝産物、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの改善された生産のために使用し得るホスホケトラーゼを同定するために、NCBIウェブサイトにあるCDARTプログラムを使用して、既知のホスホケトラーゼ領域構造に一致する全ての遺伝子産物を選択した。(Geer L et al.(2002),“CDART:protein homology by domain architecture.”,Genome Res.12(10)1619−23)。最初の領域構造検索からのrefseq配列を選択することで、配列をさらに精緻化する。次に、配列類似性に基づいて、配列を22の別個の群にクラスター化した(Clustering by Passing Messages Between Data Points.Brendan J.Frey and Delbert Dueck,University of Toronto Science 315,972−976,February 2007)。簡単に述べると、アミノ酸配列は、ClustalWを使用して多重アライメントした。ペアワイズパーセント同一性(PID)を計算した。これは、操作上で定義され、この場合には、整列された残基にわたって同一の残基の数であった。式、K=−Ln(1−D−(D.D)/5)によって、PIDを距離に変換した(Kimura,M.The neutral Theory of Molecular Evolution,Camb.Univ.Press,1983,page 75)。負の距離は、上のアルゴリズムにおける類似性スコアとして使用された。中程度の類似性は、各データ点の選択性として使用された。この方法を使用して、22個のクラスターが画定された(図3〜24)。各クラスターからの中心代表的配列のアミノ酸配列をコードするDNAを合成した(図2および表1)。完全ホスホケトラーゼ領域不在のために、クラスターからの中心代表が、活性ホスホケトラーゼを代表しそうにないと判定された場合は、クラスターからの交互の(alternate)ホスホケトラーゼが、DNA合成のために選択された(表1)。
エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)ホスホケトラーゼを含有するクラスター8、およびクラスター8と大部分の相同性を共有するクラスター11中のClustalWを使用したペアワイズアラインメントによって、互いに90%未満同一であるタンパク質配列をコードするDNAが、タンパク質合成のためにデザインされた(表2)。
実施例2:ホスホフルクトキナーゼを欠く細菌ゲノム中のホスホケトラーゼの同定
アノテートされたホスホケトラーゼ(PKL)を有するが、解糖を通過する炭素流にとって重要な酵素であるアノテートされたホスホフルクトキナーゼ(PFK)を有しない、細菌ゲノムの検索を実施した。これらの基準に適合する数種の生物、そしてこの一覧からの5つのPKL、具体的には、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJN(配列番号47)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)NRRLB−30929(配列番号48)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)DSM20093(配列番号49)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)Bd1(配列番号50)、およびビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)IPLA20015(配列番号51)からのPKLを、高活性とグルコースからのイソプレンの収率増大研究のために選択した。生物の完全一覧からのPKLの大部分は特徴付けられていないので、選択された5つのPKLは、配列多様性、および文献から得られ得る高活性の最善の状況証拠に基づいた。ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)からのPKLが7の最適pH値を示す(Sgorbati B.,et al.,Antonie van Leeuwenhoek 1976(42),49−57)、一方で、その他のPKLの至適pHは、典型的に6前後である(Heath EC.,et al.,J Bio Chem 1957,1009−1029)。ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)は、燃料エタノール工場から汚染菌として単離され、おそらくは細胞量とエネルギーのためのF6PまたはX5Pのどちらかに対するPKLの活性によって、グルコースおよびキシロースの双方の上で増殖を示した(Liu S.,et al.,J Ind Microbiol Biotechnol 2008(35),75−81)。ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)およびビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)の株は、グルコースまたはキシロースのどちらを唯一の炭素源として良好に成長できることから、これらからのPKLが選択された(Palframan RJ.,et al.,Curr Issues Intest Microbiol 2003(4),71−75)。
実施例3:同定されたホスホケトラーゼ酵素のクローニング
ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)インファンチス(infantis)亜株、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、およびクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から得られるPKLを酵素活性についてそれぞれアッセイした。ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)インファンチス(infantis)亜株PKLは、5.7±1.16mMのKm、4.56±0.2sec−1のkcat、および0.79±0.2mM−1sec−1のkcat/Kmを有し、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)PKLは、10.4±1.03mMのKm、1.35±0.04sec−1のkcat、および0.13±0.1mM−1sec−1のkcat/Kmを有し、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)PKLは、10.3±0.67mMのKm、2.18±0.05sec−1のkcat、および0.21±0.06mM−1sec−1のkcat/Kmを有することが分かった。ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)インファンチス(infantis)亜株、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、またはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)PKLをコードするコンストラクトを対照として使用して、生体外および生体内活性について候補PKL酵素をスクリーニングした。
エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)PKLのアミノ酸配列(配列番号93)は、GenBankから入手されて、大腸菌(E.coli)中の最適化発現について、GeneArt最適化ソフトウェアで処理された。PKL遺伝子の前に2つの塩基対を付加してBspHI部位を形成し、SacI部位を停止コドンの直後に挿入した。合成されたPKL遺伝子は、GeneArtカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローン化した。次に、E.ガリナーラム(E.gallinarum)PKL遺伝子をNcoI/SacI−消化pTrcHis2Bベクター(LifeTechnologies、Carlsbad、CA)にサブクローニングして、プラスミドpCMP1321を形成した(表5、図25)。
ATCC15697株、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)亜株インファンチス(infantis)の染色体DNAは、ATCC(Manassas、VA)から入手された。B.ロングム(B.longum)PKLをコードする遺伝子は、製造業者(Life Technologies,Carlsbad,CA)のプロトコルに従って、プライマーCMP283:5’−ctgtatTCATGAcgagtcctgttattggcacc−3’およびCMP284:5’−ctctatGAATTCTCACTCGTTGTCGCCAGCG−3’、およびポリメラーゼHerculaseを使用した、染色体DNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。PCR産物は、精製前にEcoRIおよびBspHI制限酵素で消化した。精製後、GeneArt Seamless Cloning Kit(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、およそ2500bpの断片をEcoRI/NcoI−消化pTrcHis2B(Invitrogen,Carlsbad,CA)にアセンブルし、プラスミドpCMP1090を形成した(表5)。
クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)PKLをコードする対照プラスミドの構築では、ATCCBAA−98株の染色体DNAがATCC(Manassas、VA)から入手された。クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)PKLをコードする遺伝子は、製造業者(Life Technologies,Carlsbad,CA)のプロトコルに従って、プライマーCacetpTrcHisBF:5’−taaggaggaataaaccatgcaaagtataataggaaaacataaggatgaagg−3’およびCacetpTrcHisBR:5’−ttctagaaagcttcgttatacatgccactgccaattagttatttc−3’、およびtheポリメラーゼHerculaseを使用した、染色体DNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。PCR産物を精製し、GeneArt Seamless Cloning Kit(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、EcoRI/NcoI−消化pTrcHis2B(Invitrogen,Carlsbad,CA)に構築しプラスミドpCMP1364を形成した(表3)。
ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、およびクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)(配列番号94)のそれぞれに由来するPKLタンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌(E.coli)中の発現についてコドン最適化され、GeneOracle(Mountain View,CA)によって合成された。これらのコドン最適化PKL遺伝子をPCRによって増幅し、製造業者の推奨プロトコルに従ってGeneArt Seamless Cloning Kit(Life Technologies)を使用して、pTrcHis2B発現プラスミド中にサブクローニングした。下の表5は、プラスミド構築のために使用されたプライマーpMCS530〜pMCS535を列挙する。PKL酵素をPtrcプロモーター下流にクローン化し、IPTGによるホスホケトラーゼ遺伝子の誘導性発現を可能にした(表6、図26〜31)。
表1、表2、およびクラスター1〜22(図3〜24を参照されたい)に列挙される各生物に由来するPKLタンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌(E.coli)発現についてコドン最適化され合成される。これらのコドン最適化PKL遺伝子は、Ptrcプロモーター下流でpTrcHis2B発現プラスミドにサブクローニングされて、IPTGによるホスホケトラーゼ遺伝子の誘導性発現を可能にする。
実施例4:生体外実験で同定されたPKLを発現する株の構築
表5に列挙されるプラスミドで、CMP1133株(BL21,Δpgl PL.2mKKDyl,GI1.2gltA,yhfSFRTPyddVIspAyhfS,thiFRTtruncIspA)を形質転換し、20μg/mlのカナマイシンを含有するルリア・ベルターニプレート上でコロニーを選択することで、PKL発現株を構築した。製造業者(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)によって推奨されるプロトコルを使用して、カナマイシンマーカーを除去し、示される株を形成した(表7)。
それぞれ同定されたPKLを発現するPKL発現株は、表1、表2、およびクラスター1〜22(図3〜24を参照されたい)に列挙されるPKLをコードするプラスミドで、CMP1133株(BL21,Δpgl PL.2mKKDyl,GI1.2gltA,yhfSFRTPyddVIspAyhfS,thiFRTtruncIspA)形質転換し、20μg/mlカナマイシンを含有するルリア・ベルターニプレート上で、コロニーを選択することで構築される。製造業者(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)によって推奨されるプロトコルを使用して、カナマイシンマーカーが除去される。
実施例5:同定されたPKLの発現および溶解度の比較
pTrcHis2BB.ロングム(B.longum)(CMP1183株)、pTrcHis2B E.ガリナーラム(E.gallinarum)(CMP1328株)、pTrcHis2B C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)(CMP1366株)、pTrcHis2B B.デンチウム(B.dentium)PKL(MCS545株)、pTrcHis2B B.ビフィダム(B.bifidum)(MCS546株)、pTrcHis2B B.ガリクム(B.gallicum)PKL(MCS547株)、pTrcHis2B L.ブフネリ(L.buchneri)PKL(MCS548株)、pTrcHis2B B.フィトフィルマンス(B.phytofirmans)PKL(MCS549株)、またはpTrcHis2B C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKL最適化(MCS550株)を発現する株をLB培地中で培養し、約0.5のOD600で200μMのIPTGによって誘導し、30℃または34℃の温度で4時間にわたり誘導した。4mlの培養ブロスを3000rpmで10分間遠心処理して、細胞を収集した。細胞ペレットを0.1%DNAaseおよび0.5mMAEBSFを添加した2mlの50mM MES、50mM NaCl、pH6.0に再懸濁した。フレンチ圧力セル(American Instrument Company)を14,000psiで使用して、細胞懸濁液を溶解した。次に溶解産物をエッペンドルフ5804R遠心分離機内で、4℃、15,000RPMで10分間遠心分離した。上清およびペレットを分離した。ペレットは、溶解50mM MES、50mM NaCl pH6.0緩衝液に再懸濁した。上清およびペレット化サンプルを4〜12%SDS−PAGEゲル電気泳動によって分析した。可溶性−対−ペレット化(不溶性)ホスホケトラーゼ画分を比較することで、溶解度を評価した。
結果は、最適化C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKL(図32A、レーン9)が、コドン最適化されていない(図32A、レーン3)C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKLと比較して、より高いレベルを発現したことを示した。B.デンチウム(B.dentium)(図32A、レーン4)、B.ビフィダム(B.bifidum)(図32A、レーン5)、およびB.ガリクム(B.gallicum)(図32A、レーン6)PKLは全て、C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKL(図32A、レーン3)と同様のレベルで発現し、大部分が可溶性であった(図32B)。比較すると、L.ブフネリ(L.buchneri)(レーン7)およびB.フィトフィルマンス(B.phytofirmans)(レーン8)は、ほぼ完全に不溶性であった(図32B)。
表1、表2、およびクラスター1〜22(図3〜24を参照されたい)で列挙される同定されたPKLを発現する株をLB培地中で培養し、約0.5のOD600で、200μM IPTGによって誘導し、30℃または34℃の温度で4時間誘導する。4mlの培養ブロスを3000rpmで10分間遠心処理して、細胞を収集する。細胞ペレットを0.1%DNAaseおよび0.5mMAEBSFを添加した2mlの50mM MES、50mM NaCl、pH6.0に再懸濁する。フレンチ圧力セル(American Instrument Company)を14,000psiで使用して、細胞懸濁液を溶解する。次に溶解産物をエッペンドルフ5804R遠心分離機内で、4℃および15,000RPMで10分間遠心分離する。上清およびペレットを分離する。ペレットは、溶解緩衝液(50mM MES、50mM NaCl pH6.0)に再懸濁する。上清およびペレット化サンプルを4〜12%SDS−PAGEゲル電気泳動によって分析する。可溶性−対−ペレット化(不溶性)ホスホケトラーゼ画分を比較することで、溶解度を評価する。
実施例6:同定されたPKLを発現する株中のホスホケトラーゼ活性の生体外スクリーニング
pTrcHis2B B.ロングム(B.longum)(株CMP1183)、pTrcHis2B E.ガリナーラム(E.gallinarum)(株CMP1328)、pTrcHis2B C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)(株CMP1366)、pTrcHis2B B.デンチウム(B.dentium)PKL(株MCS545)、pTrcHis2B B.ビフィダム(B.bifidum)(株MCS546)、pTrcHis2B B.ガリクム(B.gallicum)PKL(株MCS547)、pTrcHis2B L.ブフネリ(L.buchneri)PKL(株MCS548)、pTrcHis2B B.フィトフィルマンス(B.phytofirmans)PKL(株MCS549)、またはpTrcHis2B C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKL最適化(株MCS550)発現する株を、誘導前に37℃で50μg/mlカルベニシリン添加LB培地中で培養した。10μM、25μM、50μM、または100μMのIPTGによる誘導に続いて、培養物を34℃の振盪機の30分間移した。細胞を4℃および10,000rpmで10分間遠心分離して収集した。精製に先だって、細胞ペレットを−80℃で保存した。精製のために、PKL細胞ペレットを50mM MES pH6.0、50mM NaCL、0.5mM AEBSF、0.1mg/ml DNaseIに再懸濁した。フレンチプレスを繰り返し通過させることで細胞を溶解し、50,000rpmで60分間の超遠心によって清澄化した。B.ロングム(B.longum)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)、C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)、B.デンチウム(B.dentium)、B.ビフィダム(B.bifidum)、B.ガリクム(B.gallicum)、L.ブフネリ(L.buchneri)、B.フィトフィルマンス(B.phytofirmans)、またはC.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)からのPKLを含有する清澄化溶解産物を50mM MES、50mM NaCl、pH6で平衡化したDEAE HiTrapFFカラムに装入し、50mM MES、1M NaCl、pH6への勾配で溶出した。得られた画分をSDS−PAGEによって分析した。PKLを含有する画分を貯留し、G25脱塩カラムを使用して、50mM MES、50mM NaCL pH6.0中に脱塩した。さらに50mM MES、50mM NaCL、pH6で平衡化したMonoQ 10/100GLカラムを使用して、1M NaClの塩勾配で、精製を達成した。その内容全体を参照によって本明細書に援用する、L.Meile et.al.,Bacteriol.,2001,183:2929−2936 and Frey et.al.,Bioorganic Chem.,2008,36:121−127に記載されるヒドロキサム酸アッセイの規模縮小バージョンを使用して、各PKLによって形成されるAcPの量を測定した。アッセイは、37℃で96ウェルプレート(Costarカタログ番号9017)構成で実施した。各300μlの反応物は、1mM TPP、10mMリン酸カリウムpH6.0、50mM MES pH6、10mM MgCl2、5mM F6P、および濃度250nMのPKLを含有した。タイムポイントは、様々な間隔で測定した。反応を停止させるために、60μlの反応混合物pH6.5で60μlの2Mヒドロキシルアミンと混合し、室温で10分間インキュベートした。0.1M HCl中の40μlの15%TCA、40μlの4MHCl、および40μlの5%FeCl3の添加を使用して、タンパク質を沈殿させ、AcPの検出を可能にした。次にサンプルを3000rpmで10分間遠心分離した。上清の200μlのサンプルをマイクロタイタープレートおよびプレートリーダーに移し、形成されるAcP量に伴う吸光度の変化を505nmでモニターした。
結果は、最適化C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKLが、F6P活性を有し、コドン最適化されていないC.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKLと比較して、より高い量のAcPを生産したことを示した(図33)。B.デンチウム(B.dentium)は、コドン最適化されていないC.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKLと同様のPKLF6P活性を有した。B.デンチウム(B.dentium)およびB.ガリクム(B.gallicum)PKLは、顕著なF6P活性を有し、E.ガリナーラム(E.gallinarum)PKLのF6P活性と同等であった。比較すると、L.ブフネリ(L.buchneri)PKL(図33)およびB.フィトフィルマンス(B.phytofirmans)PKLはF6P活性を示さず、これは、これらのPKLがほぼ完全に不溶性であるという発見によって支持された。
表1、表2、およびクラスター1〜22(図3〜24を参照されたい)中に列挙される同定されたPKLを発現する株を誘発前に、37℃で50μg/mlカルベニシリン添加LB培地中で培養する。10μM、25μM、50μM、または100μMのIPTGによる誘導に続いて、培養物を34℃で振盪機に30分間移した。細胞を4℃および10,000rpmで10分間遠心分離して収集する。精製のために、PKL細胞ペレットを50mM MES pH6.0、50mM NaCL、0.5mM AEBSF、0.1mg/ml DNaseIに再懸濁する。フレンチプレスを繰り返し通過させることで細胞を溶解し、50,000rpmで60分間の超遠心によって清澄化する。PKLを含有する清澄化溶解産物を50mMMES、50mMNaCl、pH6で平衡化したDEAE HiTrap FFカラムに装入し、50mM MES、1M NaCl、pH6への勾配で溶出する。得られた画分をSDS−PAGEによって分析する。PKLを含有する画分を貯留し、G25脱塩カラムを使用して、50mM MES、50mM NaCL pH6.0中に脱塩する。さらに50mM MES、50mM NaCL、pH6で平衡化したMonoQ 10/100GLカラムを使用して、1M NaClの塩勾配で、精製を達成する。L.Meile et.al.,Bacteriol.,2001,183:2929−2936、およびFrey et.al.,Bioorganic Chem.,2008,36:121−127に記載されるヒドロキサム酸アッセイの規模縮小バージョンを使用して、各PKLによって形成されるAcPの量を測定する。アッセイは、37℃で96ウェルプレート(Costarカタログ番号9017)構成で実施される。各300μl反応物は、1mM TPP、10mMリン酸カリウムpH6.0、50mM MES pH6、10mM MgCl2、5mM F6P、およびPKL濃度250nMを含有する。タイムポイントは、様々な間隔で測定される。反応を停止させるために、60μlの反応混合物pH6.5で60μlの2Mヒドロキシルアミンと混合し、室温で10分間インキュベートする。0.1M HCl中の40μlの15%TCA、40μlの4MHCl、および40μlの5%FeCl3の添加を使用して、タンパク質を沈殿させ、AcPの検出を可能にする。次にサンプルを3000rpmで10分間遠心分離する。上清の200μlのサンプルをマイクロタイタープレートおよびプレートリーダーに移し、形成されるAcP量に伴う吸光度の変化を505nmでモニターする。
実施例7:同定されたホスホケトラーゼ(PKL)を発現する株中のホスホケトラーゼ活性の生体内スクリーニング
トランスケトラーゼ(tkt)活性がない変異株中で、ホスホケトラーゼ(PKL)酵素の生体内活性を評価した。トランスケトラーゼは、大腸菌(E.coli)中の全ての芳香族ビタミンおよびアミノ酸の基材である、エリスロース−4−リン酸(E4P)生産に関与する。したがってトランスケトラーゼ活性不在下における、グルコースを炭素源とする最少培地上の大腸菌(E.coli)の増殖は、芳香族栄養要求性のために可能でない(Zhao and Winkler 1994)。トランスケトラーゼはまた、キシルロース−5−リン酸(X5P)と、セドヘプツロース−7−リン酸(S7P)およびグリセルアルデヒド−3−リン酸(GAP)との相互変換にも関与し、tkt活性は、ペントースリン酸経路から解糖に戻る唯一の出口であることから、キシロースを炭素源とする最少培地上のtkt変異体の増殖もまた可能でない。ホスホケトラーゼは、F6PからE4Pを生成し、X5PからGAPを生成するので、機能酵素は、グルコース(F6P活性を示す)またはキシロース(X5PおよびF6P活性の双方を示す)上での培養に際して、tkt変異体の増殖欠陥をレスキューし得る。したがって補足変異体の増殖を利用して、ホスホケトラーゼ酵素の異なる生体内機能を試験し得る。
株構築
PCRによるKeioコレクションからの変異体を増幅し、P1形質導入を実施し、GeneBridges挿入(製造業者のプロトコル)、PCR増幅(Pfu TurboまたはHerculase、製造業者のプロトコル)を実施し、プラスミドを形質転換し、株を成長および増殖させるための標準分子生物学的技術が使用された。簡単に述べると、大腸菌(E.coli)には2つのトランスケトラーゼ酵素ゲノムがあるので、トランスケトラーゼヌル変異体を作成するためには、どちらもノックアウトしなくてはならなかった。tktB中のカナマイシン挿入断片をKeioコレクションからのPCRによって増幅し、BL21へのリコンビニアリングによって導入した。tktBの中抗生物質耐性カセットをPCRによって確認し、次にpCP20プラスミドを使用してループアウトさせた(表5)。次に、同一方法によってtktA変異をL21に導入し、引き続いてP1形質導入によってtktB変異体に導入して、トランスケトラーゼヌル変異株を作成した(表6)。このDW809株は、芳香族アミノ酸供給に実質的に寄与しないカザミノ酸と、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、p−アミノ安息香酸、2−3−ジヒドロキシ安息香酸、p−ヒドロキシベンゾエート、およびピリドキシンを含む全ての芳香族化合物の追加的補給剤とを添加したM9グルコース最少培地上でのみ増殖した(Zhao and Winkler,1994で示される)。この6つの芳香族化合物とピリドキシンとの組み合わせは、本明細書で引き続いて「芳香族補給剤」と称される。次に異なるホスホケトラーゼ酵素を保有するプラスミドをトランスケトラーゼ変異株に形質転換して、芳香族補給剤およびカルベニシリンを添加したM9グルコースカザミノ酸上の増殖について選択した(表6)。次に、芳香族補給剤なしで、M9グルコースまたはキシロースのどちらかの上で、Enzyscreen Growth Profiler(Enzyscreen,BV)上の増殖について株をアッセイし、ホスホケトラーゼ酵素を発現しない対照株と比較した。ホスホケトラーゼ酵素は、20μMおよび60μMの2つの異なる濃度のIPTGによって、トランスケトラーゼヌル変異体中で誘導された。
トランスケトラーゼヌル変異体株を表1、表2、またはクラスター1〜22(図3〜24を参照されたい)に列挙される同定されたPKLで形質転換して、芳香族補給剤およびカルベニシリンを添加したM9グルコースカザミノ酸上の増殖について選択する。次に、芳香族補給剤なしで、M9グルコースまたはキシロースのどちらかの上で、Enzyscreen Growth Profiler(Enzyscreen,BV)上の増殖について株をアッセイし、ホスホケトラーゼ酵素を発現しない対照株と比較する。ホスホケトラーゼ酵素は、20μMおよび60μMの2つの異なる濃度のIPTGによって、トランスケトラーゼヌル変異体中で誘導される。
結果
このアッセイでは、トランスケトラーゼ変異体は、補給剤を添加した場合のみグルコース上で増殖し(図34)、補給剤添加または無添加のキシロース上では増殖しなかった(図36)。異なるホスホケトラーゼを発現するトランスケトラーゼヌル変異体の増殖は、これらの酵素の生体内示差挙動を強調した。E.ガリナーラム(E.gallinarum)PKLは、グルコースおよびキシロースのどちらの上でも最良の能力を示し、補給剤不在下でトランスケトラーゼ変異体の増殖を維持するのに十分なF6PおよびX5P活性を示した(図35および37を参照されたい)。C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)PKLもまた、グルコースおよびキシロースのどちらの上でも芳香族補給剤不在下におけるトランスケトラーゼ変異体の増殖を可能にしたが(図35および37)、グルコース上での培養に際して、60μMのIPTG濃度で細胞増殖に対する有害効果を有すると思われた(図35)。
実施例8:PKL発現株の細胞内アセチルリン酸測定
イソプレン産生大腸菌(E.coli)株を構築して、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJN、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)NRRL B−30929、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)DSM 20093、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)Bd1、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)IPLA 20015からのホスホケトラーゼ、または表1、表2、またはクラスター1〜22からのPKLを発現させる(図面3〜24を参照されたい)。ホスホケトラーゼを発現しなかった株を対照として使用する。
(i)材料
TM3培地レシピ(1リットルの発酵培地あたり):
13.6gのK2HPO4、13.6gのKH2PO4、2gのMgSO4*7H2O、2gのクエン酸一水和物、0.3gのクエン酸第二鉄アンモニウム、3.2gの(NH4)2SO4、0.2gの酵母抽出物、1mlの1000×微量金属溶液。全ての成分を合わせて、diH2Oに溶解する。水酸化アンモニウム(30%)によってpHを6.8に調節し、所定容積にする。培地を0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。pH調節および滅菌後、グルコース10.0gおよび抗生物質を添加する。
1000×微量金属溶液(1リットルの発酵培地あたり)
40gのクエン酸*H2O、30gのMnSO4*H2O、10gのNaCl、1gのFeSO4*7H2O、1gのCoCl2*6H2O、1gのZnSO4*7H2O、100mgのCuSO4*5H2O、100mgのH3BO3、100mgのNaMoO4*2H2O。各成分を1つずつ、diH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで約3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
(ii)実験手順
完全MVA経路と、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJN、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)NRRLB−30929、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)DSM20093、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)Bd1、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)IPLA20015からのPKL、または表1、表2、またはクラスター1〜22(図3〜24を参照されたい)からのPKLを発現する細胞をルリア・ベルターニブロス+抗生物質中で一晩培養する。翌日、(250mL調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の)50μg/mLのカルベニシリンを含有する20mLのTM3培地中で0.05のOD600に希釈して、34℃および200rpmで培養する。2時間の増殖後、OD600を測定して、200μMのIPTGを添加する。さらに3.5時間後、1.5mlのサンプルを遠心分離して、上清を廃棄し、ペレットを100μLの乾燥氷冷メタノールに再懸濁する。
(iii)細胞内アセチルリン酸測定
アセチルリン酸を抽出するために、1.5mLの大腸菌(E.coli)細胞を0.57〜2.26のODに培養して、遠心分離によって遠心沈殿させて、100μLの乾燥氷冷メタノールをペレットに添加する。メタノールでクエンチしたサンプルを−20℃でで数日間保存する。さらなるサンプル処理は、穏やかな細胞再懸濁、−9℃で5分間の遠心分離、および清浄なバイアルへの上清の吸引を含む。ペレットを75μLの含水の2%酢酸で、再度2回抽出する。各抽出後、細胞破片を−9℃における遠心分離によってペレット化し、全ての3回の抽出からの上清を合わせて貯留し、1μLのトリブチルアミンを添加する。Thermo Finnigan TSQシステム(Thermo Electron Corporation,San Jose,CA)を使用してLCMSによって、アセチルリン酸の質量分光分析を実施する。XCaliburおよびLCQuanソフトウェア(Thermo Electron Corp)を使用して、システム制御、データ取得、および質量スペクトルデータ評価を実施する。流速0.4mL/分のSynergi MAX−RP 5μM HPLCカラム(150×2mm、Phenomenex)に移動相勾配を適用する。適用される勾配プロファイルは、t=0〜1分に99%Aおよび1%B;t=11分に80%Aおよび20%B;t=12〜14分に75%Bおよび25%C;t=15〜16分に99%Aおよび1%Bであり、ここで溶剤Aは水中の15mMトリブチルアミン/10mM酢酸、溶剤Bはメタノール、溶剤Cは水である。アセチルリン酸の質量検出は、前駆体イオンのm/z値138.9で、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化(ESI−MS/MS)(ESIスプレー電圧2.5〜3.0kV、オン移送管温度390℃)を使用して実施する。アセチルリン酸の濃度は、PO3 −生成イオンによって生成されるピークの積分強度に基づいて判定される(m/z=79.0、衝突エネルギー20V、衝突ガス圧力1.7mTorr、Rt=13.2分)。アセチルリン酸標準物質(Sigma−Aldrich)の注入によって得られる検量線を使用して、細胞抽出物中の代謝産物濃度を計算する。アセチルリン酸の細胞内濃度は、OD=200の培養物の1mL中にある全細胞の積算容積は50mLである、という仮定に基づいて判定される。生成したアセチルリン酸は、ホスホケトラーゼを発現しない対照株と比較して、PKLを発現する株中で評価される。
実施例9:小規模でのホスホケトラーゼを発現する組換え宿主細胞内のイソプレン生産
イソプレン産生大腸菌(E.coli)株を構築して、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJN、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)NRRL B−30929、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)DSM 20093、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)Bd1、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)IPLA 20015からのホスホケトラーゼ、または表1、表2、またはクラスター1〜22からのPKL(図面3〜24を参照されたい)、完全MVA経路およびイソプレンシンターゼを発現させる。ホスホケトラーゼを発現しなかったイソプレン産生株を対照として使用する。
TM3培地レシピ(1リットルの発酵培地あたり):
13.6gのK2HPO4、13.6gのKH2PO4、2gのMgSO4*7H2O、2gのクエン酸一水和物、0.3gのクエン酸第二鉄アンモニウム、3.2gの(NH4)2SO4、0.2gの酵母抽出物、1mlの1000×微量金属溶液。全ての成分を合わせてdiH2Oに溶解する。水酸化アンモニウム(30%)によってpHを6.8に調節し、所定容積にする。培地を0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。pH調節および滅菌後、グルコース10.0gおよび抗生物質を添加する。
1000×微量金属溶液(1リットルの発酵培地あたり)
40gのクエン酸*H2O、30gのMnSO4*H2O、10gのNaCl、1gのFeSO4*7H2O、1gのCoCl2*6H2O、1gのZnSO4*7H2O、100mgのCuSO4*5H2O、100mgのH3BO3、100mgのNaMoO4*2H2O。各成分を1つずつ、diH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで約3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
(ii)実験手順
ルリア・ベルターニブロス+抗生物質中で、細胞を一晩培養する。翌日、(250mL調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の)50μg/mlのスペクチノマイシン、25μg/mLのクロラムフェニコール、および50μg/mLのカルベニシリンを含有する20mLのTM3培地中で、これらを0.1のOD600に希釈して、34℃および200rpmで培養する。2時間の増殖後、OD600を測定して、200μMのIPTGを添加する。発酵経過中に、サンプルを定期的に採取する。各時点で、OD600を測定をする。また、ガスクロマトグラフ質量分光計(GC−MS)(Agilent)ヘッドスペースアッセイを使用して、イソプレン発生気体分析も実施される。全ブロスの100μlのサンプルを96ウェルガラスブロックに入れる。ガラスブロックをアルミホイルで密封し、Thermomixerを使用して、450rpmで振盪しながら34℃で30分間培養する。30分後に、ブロックを70℃の水浴内に2分間保持し、ガスクロマトグラフィー質量分析法を使用して、ヘッドスペース測定中のイソプレンレベルを判定する。報告された比生産性は、培養時間(30分間)および測定されたOD600で除した、μg/L単位のイソプレン量のGCによる読み取りである。
実施例10:15L規模でのホスホケトラーゼを発現する組換え宿主細胞内のイソプレン生産
イソプレン産生大腸菌(E.coli)株を構築して、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJN、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)NRRL B−30929、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)DSM 20093、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)Bd1、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)IPLA 20015からのホスホケトラーゼ、または表1、表2、またはクラスター1〜22からのPKL(図面3〜24を参照されたい)、完全MVA経路およびイソプレンシンターゼを発現させる。イソプレン生産のための15リットル規模の実験において、ホスホケトラーゼを発現しなかったイソプレン産生株を対照として使用する。
(i)材料
培地レシピ(発酵培地1リットルあたり):
7.5gのK2HPO4、2gのMgSO4*7H2O、2gのクエン酸一水和物、0.3gのクエン酸第二鉄アンモニウム、0.5gの酵母抽出物、1.6mLの50%硫酸、1mlの1000×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてDi H2Oに溶解する。この溶液を加熱滅菌する(123℃で20分間)。水酸化アンモニウム(28%)によってpHを7.0に調節し、所定容積にする。滅菌およびpH調節後に、10gのグルコース、8mLのビタミン溶液、および抗生物質を添加する。
1000×修正微量金属溶液(1リットルあたり):
40gのクエン酸*H2O、30gのMnSO4*H2O、10gのNaCl、1gのFeSO4*7H2O、1gのCoCl2*6H2O、1gのZnSO*7H2O、100mgのCuSO4*5H2O、100mgのH3BO3、100mgのNaMoO4*2H2O。各成分をDi H2Oに1つずつ溶解して、HCl/NaOHでpHを3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
ビタミン溶液(1リットルあたり):
1.0gの塩酸チアミン、1.0gのD−(+)−ビオチン、1.0gのニコチン酸、4.0gの塩酸ピリドキシン。各成分をDi H2Oに1つずつ溶解して、HCl/NaOHでpHを3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
マクロ塩溶液(1リットルあたり):
296gのMgSO4*7H2O、296gのクエン酸一水和物、49.6gのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、0.22ミクロンフィルターによって濾過滅菌した。
供給液(1キログラムあたり):
0.590kgのグルコース、0.393kgのDi H2O、7.4gのK2HPO4、および8.9gの100%Foamblast882。全ての成分を混ぜ合わせて、高圧蒸気滅菌した。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は(供給液1キログラムあたり)、5.54mlのマクロ塩溶液、6.55mlのビタミン溶液、0.82mlの1000×修正微量金属溶液である。
(ii)分析
発生気体中のイソプレン、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、iSCAN(Hamilton Sundstrand)、およびHiden HPR20(Hiden Analytical)質量分光計の2つの質量分光計によって、独立して測定される。発酵ブロス中の溶存酸素は、Hamilton Companyによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、4時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、HPLC分析によって判定される。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定される。
実施例11:同定されたホスホケトラーゼを発現する株中のアモルファジエンまたはファルネセンの生産
イソプレノイド産生大腸菌(E.coli)株を構築して、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJN、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)NRRL B−30929、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)DSM 20093、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)Bd1、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)IPLA 20015からのホスホケトラーゼ、または表1、表2、またはクラスター1〜22からのPKL(図面3〜24を参照されたい)、完全MVA経路、およびファルネセンシンターゼまたはアモルファジエンシンターゼをコードするコドン最適化遺伝子を発現させる。アモルファジエンまたはファルネセンの生産実験において、イソプレノイド産生ホスホケトラーゼを発現しなかった株を対照として使用する。
(i)材料
TM3培地レシピ(1リットルの発酵培地あたり):
13.6gのK2HPO4、13.6gのKH2PO4、2gのMgSO4*7H2O、2gのクエン酸一水和物、0.3gのクエン酸第二鉄アンモニウム、3.2gの(NH4)2SO4、0.2gの酵母抽出物、1mlの1000×微量金属溶液。全ての成分を合わせて、diH2Oに溶解する。水酸化アンモニウム(30%)によってpHを6.8に調節し、所定容積にする。次に培地を0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。滅菌およびpH調節後、10.0gのグルコースおよび抗生物質を添加する。
1000×微量金属溶液(1リットルの発酵培地あたり):
40gのクエン酸*H2O、30gのMnSO4*H2O、10gのNaCl、1gのFeSO4*7H2O、1gのCoCl2*6H2O、1gのZnSO4*7H2O、100mgのCuSO4*5H2O、100mgのH3BO3、100mgのNaMoO4*2H2O。各成分を1つずつ、diH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで約3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
(ii)実験手順
ルリア・ベルターニブロス+抗生物質中で、細胞を一晩培養する。翌日、(250mL調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の)50μg/mlのスペクチノマイシン、25μg/mLのクロラムフェニコール、および50μg/mLのカルベニシリンを含有する20mLのTM3培地中で、これらを0.05のOD600に希釈して、34℃および200rpmで培養する。接種前に、先に記載されたようにして、各培養物フラスコに20%(v/v)ドデカン(Sigma−Aldrich)のオーバーレイを添加して、揮発性セスキテルペン生成物を捕捉する(Newman et.al.,2006)。
2時間の増殖後、OD600を測定して、0.05〜0.40mMのイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加する。発酵経過中に、サンプルを定期的に採取する。各時点で、OD600を測定をする。また、ドデカンオーバーレイを酢酸エチル中で希釈することで、有機層内のアモルファジエンまたはファルネセン濃度もアッセイされる。ドデカン/酢酸エチル抽出物は、以前記載されたようにして(Martin et.al.,Nat.Biotechnol.2003,21:96−802)、アモルファジエンのための分子イオン(204m/z)および189m/z断片イオンまたはファルネセンのための分子イオン(204m/z)をモニタリングすることで、GC−MS方法によって分析される。既知濃度のアモルファジエンまたはファルネセンサンプルを注入して、アモルファジエンまたはファルネセンの標準曲線をそれぞれ作成する。アモルファジエンまたはファルネセン標準曲線をそれぞれ使用して、サンプル中のアモルファジエンまたはファルネセンの量を計算する。
実施例12:イソプレン生産のための宿主変異を保有するホスホケトラーゼ発現株の構築
バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJN、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)NRRL B−30929、ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)DSM 20093、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)Bd1、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)IPLA 20015からのPKL、または表1、表2、またはクラスター1〜22からのPKLを含んでなるイソプレン産生株(図面3〜24を参照されたい)は、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、トランスアルドラーゼB(talB)、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ(ppsA)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)をはじめとする遺伝子の1つまたは複数の活性が増大して、ホスホケトーラゼ経路を通過する炭素流が改善するように、さらに操作し得る(図38)。特定の態様では、遺伝子rpiA、rpiB、rpe、tktA、tktB、talB、ppsA、eutD、および/またはptaの活性は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大させ得る。一実施形態では、リボース−5−リン酸イソメラーゼ(rpiAおよび/またはrpiB)の活性は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。別の実施形態では、D−リブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ(rpe)の活性は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。別の実施形態では、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)の活性は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。さらに別の実施形態では、トランスアルドラーゼB(talB)の活性は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。別の実施形態では、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ(ppsA)の活性は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。なおも別の実施形態では、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(ptaおよび/またはeutD)の活性は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。特定の態様では、遺伝子rpiA、rpiB、rpe、tktA、tktB、talB、ppsA、eutD、および/またはptaのイソ酵素は、染色体上のプロモーターおよび/またはrbsを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大させ得る。
これらの株は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホフルクトキナーゼ−1(pfkAおよび/またはpfkB)、フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fba、fbaA、fbaB、および/またはfbaC)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapAおよび/またはgapB)、酢酸キナーゼ(ackA)、クエン酸シンターゼ(gltA)、トランスケトラーゼ(tktAおよび/またはtktB)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、および/またはHPr(ptsH)をはじめとする遺伝子の活性の1つまたは複数を低下させて、ホスホケトラーゼ経路に向かう炭素流を増大させるように、さらに操作し得る(図39)。一実施形態では、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするzwf遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、6−ホスホフルクトキナーゼ−1AをコードするpfkA遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、グリセルアルデヒドー3−リン酸デヒドロゲナーゼAをコードするgapA遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、フルクトース二リン酸アルドラーゼをコードするfba遺伝子が下方制御される。さらに別の実施形態では、クエン酸シンターゼをコードするgltA遺伝子が下方制御される。一実施形態では、酢酸キナーゼをコードするackA遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、EIをコードするptsI遺伝子が下方制御される。一実施形態では、HPrをコードするptsH遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、EIICBGlcをコードするptsG遺伝子が下方制御される。さらに別の実施形態では、EIIAGlcをコードするcrr遺伝子が下方制御される。ptsオペロンは、ホスホトランスフェラーゼ系の遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、株は、ホスホトランスフェラーゼ系(PTS)の活性を低下させ、ホスホケトラーゼ経路に向かう炭素流を増大させるように操作し得る。いくつかの実施形態では、PTSは、ptsオペロンの下方制御によって、下方制御される。特定の態様では、PTSは下方制御されて、グルコース輸送経路は上方制御される。グルコース輸送経路としては、ガラクトース(galP)およびグルコキナーゼ(glk)遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ptsオペロンは下方制御され、ガラクトース(galP)遺伝子は上方制御され、グルコキナーゼ(glk)遺伝子は上方制御される。特定の態様では、遺伝子zwf、pfkA、fba、gapA、ackA、gltA、tktA、ptsG、ptsH、ptsI、および/またはcrrによってコードされるタンパク質のイソ酵素を下方制御して、ホスホケトラーゼ経路に向かう炭素流を増大させ得る。いくつかの実施形態では、pfkB遺伝子は下方制御される。いくつかの実施形態では、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼB(gapB)遺伝子は下方制御される。いくつかの実施形態では、トランスケトラーゼB(tktB)遺伝子は下方制御される。
実施例13:小規模での宿主変異を保有するホスホケトラーゼ発現株によるイソプレンの生産
実施例12に記載されるイソプレン産生株を小規模でのイソプレン生産について評価する。
(i)材料
TM3培地レシピ(1リットルの発酵培地あたり):
13.6gのK2HPO4、13.6gのKH2PO4、2gのMgSO4*7H2O、2gのクエン酸一水和物、0.3gのクエン酸第二鉄アンモニウム、3.2gの(NH4)2SO4、0.2gの酵母抽出物、1mlの1000×微量金属溶液。全ての成分を合わせて、diH2Oに溶解する。水酸化アンモニウム(30%)によってpHを6.8に調節し、所定容積にする。培地を0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。pH調節および滅菌後、グルコース10.0gおよび抗生物質を添加する。
1000×微量金属溶液(1リットルの発酵培地あたり)
40gのクエン酸*H2O、30gのMnSO4*H2O、10gのNaCl、1gのFeSO4*7H2O、1gのCoCl2*6H2O、1gのZnSO4*7H2O、100mgのCuSO4*5H2O、100mgのH3BO3、100mgのNaMoO4*2H2O。各成分を1つずつ、diH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで約3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
(ii)実験手順
ルリア・ベルターニブロス+抗生物質中で、細胞を一晩培養する。翌日、(250mL調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の)50μg/mlのスペクチノマイシン、25μg/mLのクロラムフェニコール、および50μg/mLのカルベニシリンを含有する20mLのTM3培地中で、これらを0.1のOD600に希釈して、34℃および200rpmで培養する。2時間の増殖後、OD600を測定して、200μMのIPTGを添加する。発酵経過中に、サンプルを定期的に採取する。各時点で、OD600を測定をする。また、ガスクロマトグラフ質量分光計(GC−MS)(Agilent)ヘッドスペースアッセイを使用して、イソプレン発生気体分析も実施される。100マイクロリットルの全ブロスを密封GCバイアルに入れて、34℃および200rpmで、30分間の所定時間にわたり培養する。70℃で7分間のインキュベーションからなる熱殺菌ステップに続いて、サンプルをGCに装入する。報告された比生産性は、培養時間(30分間)および測定されたOD600で除した、μg/L単位のイソプレン量のGCによる読み取りである。
実施例14:15L規模での宿主変異を保有するホスホケトラーゼ−発現株によるイソプレンの生産
実施例12に記載されるイソプレン産生株を15L規模でのイソプレン生産について評価する。
(i)材料
培地レシピ(発酵培地1リットルあたり):
7.5gのK2HPO4、2gのMgSO4*7H2O、2gのクエン酸一水和物、0.3gのクエン酸第二鉄アンモニウム、0.5gの酵母抽出物、1.6mLの50%硫酸、1mlの1000×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてDi H2Oに溶解した。この溶液を加熱滅菌した(123℃で20分間)。水酸化アンモニウム(28%)によってpHを7.0に調節し、所定容積にした。滅菌およびpH調節後に、10gのグルコース、8mLのビタミン溶液、および抗生物質を添加した。
1000×修正微量金属溶液(1リットルあたり):
40gのクエン酸*H2O、30gのMnSO4*H2O、10gのNaCl、1gのFeSO4*7H2O、1gのCoCl2*6H2O、1gのZnSO*7H2O、100mgのCuSO4*5H2O、100mgのH3BO3、100mgのNaMoO4*2H2O。各成分をDi H2Oに1つずつ溶解して、HCl/NaOHでpHを3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
ビタミン溶液(1リットルあたり):
1.0gの塩酸チアミン、1.0gのD−(+)−ビオチン、1.0gのニコチン酸、4.0gの塩酸ピリドキシン。各成分をDi H2Oに1つずつ溶解して、HCl/NaOHでpHを3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
マクロ塩溶液(1リットルあたり):
296gのMgSO4*7H2O、296gのクエン酸一水和物、49.6gのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、0.22ミクロンフィルターによって濾過滅菌した。
供給液(1キログラムあたり):
0.590kgのグルコース、0.393kgのDi H2O、7.4gのK2HPO4、および8.9gの100%Foamblast882。全ての成分を混ぜ合わせて、高圧蒸気滅菌した。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は(供給液1キログラムあたり)、5.54mlのマクロ塩溶液、6.55mlのビタミン溶液、0.82mlの1000×修正微量金属溶液である。
(ii)分析
発生気体中のイソプレン、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、iSCAN(Hamilton Sundstrand)、およびHiden HPR20(Hiden Analytical)質量分光計の2つの質量分光計によって、独立して測定される。発酵ブロス中の溶存酸素は、Hamilton Companyによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、4時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、HPLC分析によって判定される。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定される。
実施例15:ホスホケトラーゼ小規模評価のために使用された株
ホスホケトラーゼ発現株は、標準分子生物学的技術を使用して作成され、その中ではMCM−1225(pMCM1225−−pCL Ptrc−E.gallinarumUpper MVA))と共に、特定のPKLがMD−891(BL2+GI1.2gltA yhfSFRTPyddVIspAyhfS thiFRTtruncIspA PGL ML+FRT−PL.2−3cis−RBS10000−mvk(burtonii)ackA::FRT)に形質転換される。株を表10に列挙する。
実施例16:同定されたホスホケトラーゼ(PKL)の発現におけるホスホケトラーゼ活性の生体内スクリーニング
実施例7で上述したように、ホスホケトラーゼ活性について生体内スクリーニングを実施した。宿主細胞のバックグラウンドは、プラスミドpMCS811−pMCS852があるDW−809であり、特徴的なホスホケトラーゼを含有する。
このホスホケトラーゼ(PKL)酵素セットの生体内増殖を評価するために、IPTG−誘導性プロモーターからPKLおよびイソプレンシンターゼの双方を発現するプラスミドで、実施例7に記載されるトランスケトラーゼ二重変異体株であるDW809株を形質転換した(完全な一覧は、表11を参照されたい)。芳香族補給剤を添加したM9グルコース最少培地プレート上の増殖によって個々の形質転換体を同定し、一晩培養して、次に実施例7に記載されるようにして、芳香族補給剤なしのグルコースまたはキシロースのどちらかの上での増殖能力について、Enzyscreen Growth Profilerの上でアッセイした。誘導のために使用したIPTGの濃度範囲は、0、20、40、60、80、100、200、および400μMであった。グルコースまたはキシロース上の増殖について性能指標(PI)を計算するために、成長曲線の特定時点(典型的に30〜40時間目)における対照のODについて、各実験株のODを正規化した。このアッセイでは、増殖について最大PIを示す実験株が、最も好ましい生体内活性のあるPKL酵素を発現した一方で、PIの低い株は、同様に良好には機能しないPKLを発現した。0、100、および400μMにおけるPIが計算され、異なる誘導レベルにおける総合的増殖能力を代表するものであった。これらは、表11で例証される。
実施例17:ホスホケトラーゼ発現株中のイソプレン収率およびイソプレン比生産性の小規模評価
実施例15に記載されるイソプレン産生株を小規模でのイソプレン生産について評価した。
(i)材料と方法
酵母抽出物、MgSO4、グルコース、IPTG、スペクチノマイシン、およびカルベニシリンは、Sigmaから購入された。アルミホイルシール、48ウェル無菌5mLブロック、Breathe Easierシールメンブレン、96ウェルマイクロ力価プレート、および96ウェル円錐底プレートは、VWRから購入された。96ウェルガラスブロックは、Zinsser Analyticから購入された。装置:5973N質量分光計を装着したAgilent 6890 GC、エッペンドルフ遠心分離機5417R、Sorvall Legend RT。
成長速度測定
適切な抗生物質と共に3mlLBの培地を含有する振盪管に、グリセロール培養物原液を接種した。培養物を30℃、220rpmで、およそ15時間培養した。
TM3培地(MgSO4および酵母抽出物なし)、1%グルコース、8mMのMgSO4、0.02%酵母抽出物、および適切な抗生物質を組み合わせることで、補足TM3培地を調製した。2mLの補足TM3に、48ウェル無菌ブロックの各ウェル内で、一晩培養物を0.2の最終OD600で接種した。ブロックをBreathe Easierメンブレンで密封し、600rpmおよび34℃で、2時間培養した。2時間の増殖後、マイクロタイタープレート内でOD600を測定し、様々な濃度のIPTGによって細胞を誘導した。IPTG誘導後4時間にわたり、OD600の読み取りを毎時行った。SpectraMax Plus190(Molecular Devices)を使用して、OD600測定値を判定した。
イソプレン収率アッセイ:
TM3培地(MgSO4および酵母抽出物なし)、1%グルコース、8mMのMgSO4、0.02%酵母抽出物、および適切な抗生物質を組み合わせることで、補足TM3培地を調製した。2mLの補足TM3培地に、48ウェル無菌ブロックの各ウェル内で、0.2の最終OD600で接種した。96ウェルガラスブロック(Zinsser)内で、グルコースまたは酵母抽出物を含まない90μLのTM3培地に、10μLの接種培養物を移してアルミホイルで密封し、34℃および450rpmで24時間培養した。24時間後、ヘッドスペース内のイソプレンの量と培地に残留するグルコースの量をGC/MSによって測定し、イソプレン収率を計算した。
イソプレン比生産性測定:
100μlの培養物を96ウェルガラスブロック内に収集した。ガラスブロックをアルミホイルで密封し、Thermomixer(Eppendorf)を使用して、450rpmで振盪しながら34℃で30分間培養した。30分後、ブロックを70℃の水浴中で2分間インキュベートした。ガラスブロックを室温に放冷し、次にウェルのヘッドスペース内のイソプレンをGC/MSによって測定した。
グルコース測定:
96ウェル円錐底プレート内の300μlの細胞培養物を4℃、3000rpmで10分間遠心処理することで、グルコースサンプルを収集した。上清をDI水で10倍に希釈し、記載されるグルコースオキシダーゼアッセイを使用して、グルコース濃度を測定した。
グルコースオキシダーゼアッセイ:
ABTSを50mM酢酸ナトリウム、pH5の中で可溶化した。グルコースオキシダーゼ(GOX)および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を以下の濃度で添加した:2.74mg/ml ABTS(粉末)、0.1U/ml HRP、1U/ml GOX。容器をホイルで包んで遮光し、4℃で最長7日間保存した。所望の濃度範囲にかけて(すなわち、1mg/mlからの連続2倍希釈)グルコースをミリQ水に溶解して、グルコース標準物質を調製した。10μlの試験サンプル(希釈反応物上清)および/またはグルコース標準物質をマイクロタイタープレートのウェルに入れた。90μlのABTS試薬を添加して、プレートミキサー上で迅速に混合した。アッセイプレートをプレートリーダーに移し、吸光度を420nmで3〜5分間モニターした。データファイルをExcelにエクスポートした。グルコース検量線を使用して、各ウェル内のグルコースの量を計算した。
(ii)結果
(i)2時間目のイソプレン比生産性;(ii)4時間目のイソプレン比生産性;(iii)増殖速度;および(iv)イソプレン収率のそれぞれの性能指標(PI)を計算するために、成長曲線の特定時点(典型的に15〜24時間)における対照の特定のパラメータについて、各実験株を正規化した。このイソプレン生産アッセイでは、これらの評価パラメータについて1.0をgPI値を示した実験株は、評価されたPKLのより良い能力を示した。
実施例18:PKL発現株中の細胞内代謝産物の測定
(i)材料と方法
代謝産物抽出:
代謝産物分析のために使用した株は、実施例17に記載されるのと同一株であった。したがって、これらの株を実施例17に記載される成長条件下で培養し、4時間の増殖後にサンプルを採取して、選択された細胞代謝産物の相対濃度を測定した。500μLの細胞培養物を遠心分離して収集し、上清を廃棄して100μLの乾燥氷冷メタノールをペレットに添加し、ペレットの入った試験管をドライアイス中で即座に冷凍して、保存のために−80℃の冷蔵庫に入れた。代謝産物を抽出するために、細胞ペレットをメタノールで覆い、ガラス棒を用いて再懸濁し、微量遠心機内で試験管を5分間遠心分離して、得られた上清を取り出して清浄な管に入れた。第1の抽出ステップ後に得られた細胞ペレットを40μLの50%メタノール/10mM酢酸アンモニウム混合物に再懸濁し、細胞破片を遠心分離して上清を収集し、第1の抽出後に得られた上清と合わせて貯留した。この抽出処置をもう1度繰り返して、細胞破片からの代謝産物のより完全な除去を確実にした。
抽出および遠心分離中に、細胞含有サンプルを4℃未満に保ち、代謝産物分解を最小化した。最終貯留抽出物を混合し、次に遠心分離によって透明にした。
代謝産物測定:
代謝産物の分析は、TSQ Quantim三連四重極装置(Thermo Scientific)上のLCMSによって実施した。システム制御、データ取得、およびデータ解析は、XCaliburおよびLCQuanソフトウェア(Thermo Scientific)によって実行された。製造会社推奨保護カートリッジを装着したC18 Synergi MAX−RP HPLCカラム(150×2mm、4uM、80A、Phenomenex)に、10μLのサンプルを装入した。MilliQ等級水中の15mMの酢酸+10mMのトリブチラミン(溶媒A)と、Honeywell,Burdick & JacksonからのLCMS等級メタノール(溶媒B)との勾配で、カラムを溶出した。22.5分間の勾配は、次のとおりであった:t=0分間、5%B;t=2分間、5%B;t=6分間、10%B;t=12分間、20%B;t=18分間、67%B;t=19分間、99%B;t=21分間、99%B;;t=21.5分間、5%B;t=22.5分間、5%B;流速0.4mL/分、カラム温度35℃。質量検出は、3.0〜3.5kVのESIスプレー電圧およびイオン移動管の温度350℃で、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を使用して実施された。関心のある代謝産物のために、以下のSRM遷移を選択した:グルコース−6−リン酸(G6P)では259→79、フルクトース−1,6−二リン酸では339→79、ホスホエノールピルビン酸では167→79、6−ホスホグリセリン酸では275→79、リボース−5−リン酸では259→79eV、アセチルリン酸では139→79、およびエリスロース−4−リン酸では199→79。各SRM遷移のスキャン時間は、0.7m/zに設定したスキャン幅で0.1sであった。1.7mTorrの衝突ガスとしてアルゴンを使用し、衝突エネルギーを最適化して、Sigma−Aldrichから購入された対応する標準物質を使用して最大シグナル強度を得た。同一標準物質を使用して、測定された代謝産物の滞留時間を確認した。SRM遷移369→79があるピークは、七炭糖−二リン酸に起因した。測定された代謝産物の濃度は、試料採取中に培養物の光学濃度について正規化されたシグナル強度として表される。
(ii)結果
アセチルリン酸(AcP)の生産について性能指標(PI)を計算するために、成長曲線の特定時点(典型的に30〜40時間)における対照の特定のパラメータについて、それぞれの実験株からの各代謝産物の量を正規化した。このアッセイでは、これらの評価パラメータについて1.0を超えるPI値を示した実験株は、評価されたPKLのより良い能力を示した。
実施例19:ホスホケトラーゼのタンパク質発現および溶解度の判定
(i)材料と方法
評価されたホスホケトラーゼのタンパク質発現および溶解度を判定するのに使用された株は、実施例17に記載されるのと同一株であった。株は、適切な抗生物質を含有するLBブロス中で、34℃で一晩培養した。翌日、100μLの一晩培養物を適切な抗生物質を含有する5mLのLBに添加して、OD(600)が約0.5になるまで34℃で培養した。次に培養物を200μMのIPTGによって誘導し、34℃でさらに6時間培養した。次に細胞を遠心分離して収集し、ペレットを−80℃で保存した。
翌日ペレットを解凍し、0.2mg/ml DNaseIおよび0.5mM AEBSFを添加した100mM Tris、100mM NaCl、pH7.6の中で、それらを4のOD(600)に再懸濁した。次に細胞をフレンチプレスによって個別に溶解し、細胞破片を遠心分離によって除去した。可溶性留分の平均全タンパク質濃度は、標準Bradfordアッセイによる判定で、0.56±0.22mg/mlであった。遠心分離からのペレットは、100mM Tris、100mM NaCl、pH7.6の緩衝液に再懸濁し、各ホスホケトラーゼのパーセント溶解度を判定するために取っておいた。
次に溶解産物を使用して、総タンパク質単位当たりのフルクトース−6−リン酸(F6P)に対するホスホケトラーゼ(PKL)活性量を判定した(μmol/分/mg)。F6Pに対するPKL活性は、生成したアセチルリン酸(AcP)の量を追跡することで判定した。反応混合物(200μL)は、100μLの溶解産物と共に、100mM Tris、100mM NaCl、pH7.6中の10mM MgCl2、10mリン酸カリウム(pH7.6)、1mMチアミン二リン酸、10mM F6P、20mM NaF、8mMヨードアセトアミド、1mMジチオスレイトールを含有する。これらを34℃で30分間培養し、60μLの反応混合物を60μLの2Mヒドロキシルアミン、pH6.5に添加することで、クエンチした。このクエンチ混合物を室温で10分間培養し、次に0.1M HCl中の40μLの15%TCA、40μLの4M HCl、および40μLの5%FeCl3を添加した。次にこの最終混合物を3000rpmで5分間遠心分離した。上清(200μL)を取り出して、505nmで吸光度を測定した。AcPの検量線を使用して、AcPがどのくらい生産されたかを計算した。
濃度測定によって、E.ガリナーラム(E.gallinarum)MCS908対照と比較した、各PKL変異体の相対的発現および溶解度を判定した。各サンプルの可溶性溶解産物をゲルローディング色素と1:1で混合し、SDS−PAGEゲル上で泳動した。フレンチプレスによる溶解後にサンプルの遠心分離から得られた各ペレット(上記を参照されたい)は、ゲルローディング色素で1:1に希釈して、SDS−PAGEゲルに装入した。対照として、E.ガリナーラム(E.gallinarum)MCS908可溶性溶解産物のサンプルを各ゲルに含めた。クーマシーブリリアントブルー染色を使用してゲルを発色させ、ImageQuantTL v2005(GE Health Sciences)濃度測定ソフトウェアを使用して分析した。対照株(E.ガリナーラム(E.gallinarum)MCS908)と比較して、発現した可溶性タンパク質パーセントおよび可溶性対不溶性パーセントを判定した。
(ii)結果
(i)総タンパク質量単位当たり(F6P)比活性(μmol/分/mg);(ii)発現レベル;および(iii)溶解度のそれぞれの性能指標(PI)を計算するために、各実験株を対照の特定のパラメータについて正規化した。(i)のPI値を(ii)のPI値で除算することで、F6P比活性(活性/発現レベル)のPIを判定した。このアッセイでは、これらの評価パラメータについて1.0を超えるPIを示した実験株は、評価されたPKLのより良い能力を示した。
実施例20:フルクトース−6−リン酸およびキシルロース−5−リン酸に対するホスホケトラーゼ活性
本実施例は、フルクトース−6−リン酸(F6P)またはキシルロース−5−リン酸(X5P)上で株を培養した際のPKL活性を判定した。
(i)材料と方法
株は、適切な抗生物質を含有するLBブロス中で、34℃で一晩培養した。翌日、200μLの一晩培養物を適切な抗生物質を含有する5mLのTM3に添加して、34℃で2.5時間培養した。次に培養物を200μMのIPTGによって誘導し、34℃でさらに4時間培養した。次に細胞を遠心分離して収集し、ペレットを−80℃で保存した。
翌日ペレットを解凍し、それらを0.2mg/ml DNaseIおよび0.5mM AEBSFを添加した2mLの100mM HEPES、pH7.8 に再懸濁した。次に細胞をフレンチプレスによって個別に溶解し、細胞破片を遠心分離によって除去した。
溶解産物調製および酵素活性測定:
次に溶解産物を使用して、フルクトース−6−リン酸(F6P)およびキシルロース−5−リン酸(X5P)上のホスホケトラーゼ(PKL)活性の量を判定した。F6PおよびX5Pに対するPKL活性は、生成したアセチルリン酸(AcP)の量を追跡することで判定した。F6P反応混合物(200μL)は、100μLの溶解産物と共に、100mM、HEPES、pH7.8中の10mM MgCl2、10mMリン酸カリウム(pH7.6)、1mMチアミン二リン酸、10mM F6P、20mM NaF、8mMヨードアセトアミド、1mMジチオスレイトールを含有した。これらを34℃で30分間培養し、60μLの反応混合物を60μLの2Mヒドロキシルアミン、pH6.5に添加することで、クエンチした。このクエンチ混合物を室温で10分間培養し、次に0.1M HCl中の40μLの15%TCA、40μLの4M HCl、および40μLの5%FeCl3を添加した。次にこの最終混合物を3000rpmで5分間遠心分離した。上清(200μL)を取り出して、505nmで吸光度を測定した。AcPの検量線を使用して、AcPがどのくらい生産されたかを計算した。同様の方法によってX5P活性を測定した。X5P反応混合物(200μL)は、20μLの溶解産物と共に、100mM HEPES、pH7.8中の10mM MgCl2、10mMリン酸カリウム(pH7.6)、1mMチアミン二リン酸、10mMリボース−5−リン酸、60μg/mLのリブロース−5−リン酸−3−エピメラーゼ、200μg/mLのリボース−5−リン酸イソメラーゼA、20mM NaF、8mMヨードアセトアミド、1mMジチオスレイトールを含有した。幅広い活性X5Pに対するのために、活性は未希釈と、100mM HEPES、pH7.8中の5倍希釈との2つの溶解産物濃度で評価した。
実施例21:ホスホケトラーゼ発現株中のイソプレン生産の14L評価
この実験は、様々なホスホケトラーゼ酵素発現のイソプレン生産に対する影響を評価するために実施した。この実験中の全ての株では、メバロン酸経路由来導入遺伝子、イソプレンシンターゼ、およびホスホケトラーゼ(PKL)を発現する改変大腸菌(E.coli)宿主(BL21誘導産生宿主MD891)が使用され、株の詳細については表17を参照されたい。これらのイソプレン産生株は全て、15L規模の流加培養中で培養した。
妥当な能力測定基準は、グルコース、およびイソプレン力価に対する累積イソプレン収率である。生産性測定基準は、表18に要約される。
(i)材料と方法
培地レシピ(発酵培地1リットルあたり):
7.5gのK2HPO4、2gのMgSO4*7H2O、2gのクエン酸一水和物、0.3gのクエン酸第二鉄アンモニウム、0.5gの酵母抽出物、1.6mLの50%硫酸、1mlの1000×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてDi H2Oに溶解した。この溶液を加熱滅菌した(123℃で20分間)。水酸化アンモニウム(28%)によってpHを7.0に調節し、所定容積にした。滅菌およびpH調節後に、10gのグルコース、8mLのビタミン溶液、および抗生物質(スペクチノマイシンおよびカルベニシリン)を添加して、50mg/Lの標的濃度にした。
1000×修正微量金属溶液(1リットルあたり):
40gのクエン酸*H2O、30gのMnSO4*H2O、10gのNaCl、1gのFeSO4*7H2O、1gのCoCl2*6H2O、1gのZnSO*7H2O、100mgのCuSO4*5H2O、100mgのH3BO3、100mgのNaMoO4*2H2O。各成分をDi H2Oに1つずつ溶解して、HCl/NaOHでpHを3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
ビタミン溶液(1リットルあたり):
1.0gの塩酸チアミン、1.0gのD−(+)−ビオチン、1.0gのニコチン酸、4.0gの塩酸ピリドキシン。各成分をDi H2Oに1つずつ溶解して、HCl/NaOHでpHを3.0に調節し、次に溶液を所定容積にして、0.22ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
マクロ塩溶液(1リットルあたり):
296gのMgSO4*7H2O、296gのクエン酸一水和物、49.6gのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、0.22ミクロンフィルターによって濾過滅菌した。
供給液(1キログラムあたり):
0.590kgのグルコース、0.393kgのDiH2O、7.4gのK2HPO4、および8.9gの100%Foamblast882。全ての成分を混ぜ合わせて、高圧蒸気滅菌した。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は(供給液1キログラムあたり)、5.54mlのマクロ塩溶液、6.55mlのビタミン溶液、0.82mlの1000×修正微量金属溶液である。目標とする100μM IPTGのために:供給物1キログラムあたり1.87mlの無菌10mg/ml溶液を添加する。
この実験は、所望の発酵pH(7.0)および温度(34℃)における、グルコースからのイソプレン生産をモニターするために実施した。各実験を開始するために、大腸菌(E.coli)産生株の適切な冷凍バイアルを解凍して、トリプトン酵母抽出物(LB)培地と適切な抗生物質とを含有するフラスコに接種した。550nm(OD550)における測定で、種菌がほぼ1.0の光学濃度に増殖した後に、500mLを使用して15Lバイオリアクターに接種し、初期タンク容積を5Lにした。
バイオリアクター背圧を0.7バールゲージに維持し、生産生物に酸素を提供するのに使用される入口ガスは、入口ガスを既知の濃度(7.3〜8.3容積%の酸素)に希釈する、工場内設備によって提供される。
バッチ添加される培地には、グルコースが9.7g/Lでバッチ添加された。誘導は、イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することで達成される。細胞のOD550が6になったら、IPTGの無菌溶液を含有するシリンジを添加して、IPTG濃度を100μMにした。pH上昇によってシグナルされるように、ひとたびグルコースが培養物によって消費されたら、グルコース供給液を10g/分以下の速度で供給して代謝要求を満たした。溶存酸素制限が確立された後、固定時点において、温度を34℃から37℃に1時間かけて上昇させた。グルコース上の最大累積イソプレン質量収率を判定するのに十分長い時間、典型的に、合計64時間の経過発酵時間(EFT)にわたり、発酵を実行した。
(ii)結果と分析
発生気体中のイソプレン、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、Hiden HPR20(Hiden Analytical)質量分光計によって独立して判定された。
発酵ブロス中の溶存酸素は、Hamilton Companyによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。
発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、4時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、HPLC分析によって判定された。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定された。
HPLC情報
システム:Waters Alliance 2695
カラム:BioRad−Aminex HPX−87H Ion Exclusion Column 300mm×7.8mm カタログ番号125−0140
カラム温度:50℃
ガードカラム:BioRad−Microguard Cation H refill 30mm×4.6mmカタログ番号125−0129
ランニング緩衝液:0.01N H2SO4
ランニング緩衝液流速:0.6ml/分
近似ランニング圧力:約1100〜1200psi
注入容積:20マイクロリットル
検出器:屈折率(Knauer K−2301)
実行時間:26分間
グルコース上の累積イソプレン収率は、イソプレン総重量(t)/[(供給重量(0)−供給重量(t)+83.5)*0.5826)]に等しく、式中、0.5826は、グルコース供給液中のグルコースの重量%であり、83.5は、t=0で発酵槽にバッチ添加されたこの供給物のグラム数である。単位は、gIsoprene/gglucose*100で、百分率として表される。
IspERは、(mmol/L/hr)単位のイソプレン放出速度である。
比生産性(mg/L/hr/OD)=IspER*68.117g/mol/OD。
OD=光学濃度=550nmにおける吸光度*水中希釈係数。
平滑化比生産性(mg/L/hr/OD)=イソプレン毎時生成ミリグラム(8時間間隔で平均化した)の勾配/ブロス容積*OD。
イソプレン力価(gIsoprene/Laverage broth)は、平均ブロス容積あたりの全発生イソプレンである。これは、IspERを積分して、イソプレン単位をmmolからグラムに変換することで計算される。
結果は、図40および41のグラフで描写され、表15で例証される。
実施例22:解糖およびペントースリン酸経路がブロックされたPKL発現株の増殖の生体内評価
解糖およびペントースリン酸経路についてブロックされた株中のPKL酵素活性の分析では、標準分子生物学的技術を使用して、発現プラスミドのサブセットをMD1041株(HMB GI1.2gltA yhfSFRTPyddVIspAyhfS thiFRTtruncIspA PGL ML,FRT−PL.2−2cis−RBS10000−MVK(burtonii),t zwf::FRT,t pfkA::Frt+t ackA::FRT,t pfkB::Frt)に形質転換した。個々の形質転換体をLB中で一晩培養し、炭素源として1%グルコース−6−リン酸(Sigma)が添加されたTM3培地中で希釈して、0、20、40、60、80、100、200、または400μMIPTGによって誘導した。任意のPKLを発現せず(したがって増殖しない)、E.ガリナーラム(E.gallinarum)からのPKL酵素を発現する(そしてベースライン性能を代表する)MD1041対照株と比較して、または解糖またはペントースリン酸経路中で代謝ブロックされていないWT株(最適増殖のための対照として)と、比較して、Enzyscreen Growth Profiler上の増殖能力について株をアッセイした。
増殖の性能指標(PI)を計算するために、実験的PKL酵素を発現したMD1041誘導体株をE.ガリナーラム(E.gallinarum)からのPKLを発現する株であるMCS1148と比較した(株の一覧については表1を参照されたい)。35時間目の時点および100μMのIPTG誘導レベルは、成長曲線全体にわたる一般的性能の代表として選択された。アッセイプレート間で値を正規化するために、WT株の最大OD値間の差である1.279に基づく修正係数が、E.ガリナーラム(E.gallinarum)PKLを発現する対照株を含有しないプレート内の全ての値に適用された。次に、35時間めの時点で、補正実験的OD値をMCS1148のOD値で除算してPIを計算した。したがってMCS1148のPIは1.0であって、これよりも高い任意の値は、このアッセイにおける増殖のX倍の改善を示唆した。PI値は、表19に示される。
配列
マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)Spyr1からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)OS185からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)LMS2−1からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)ST1からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)ロングム(longum)亜株JDM301からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)KM20からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)S23321種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)E1039からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)CCM4915からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)ATCC11741からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)COH1からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)RKJ300からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)LB400からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)ATCC13950からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ニトロソモナス属(Nitrosomonas)Is79A3種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)972h−からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)メセンテロイデス(mesenteroides)亜株J18からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ストレプトミセス属(Streptomyces)SA3_actG種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)ATCC11577からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)ATCC14672からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
シアノセイス属(Cyanothece)PCC8802種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)NRRL181からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)TX1330からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
リステリア・グレイー(Listeria grayi)DSM20601からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)EC30からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)A21JP2からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
カルノバクテリウム属(Carnobacterium)17−4種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)ATCC35311からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)NBRC12172からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)DAT561からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)158L3−1からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)NEM316からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)PG2からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)シャリス(Challis)株CH1亜系からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)ATCC51147からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)M64からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)ATCC49175からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)ATCC23114からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)MP145からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ナイセリア属(Neisseria)種014口腔分類群F0314株からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)ACS−139−V−Col8からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)ACS−120−V−Col10aからのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)ATCC23330からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)HS−6からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)HS−6からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)SF7からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJNからのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)NRRL B−30929からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ビフィドバクテリウム・ガリクム(Bifidobacterium gallicum)DSM20093からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)Bd1からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)IPLA20015からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
マイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)Spyr1からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
シューワネラ・バルチカ(Shewanella baltica)OS185からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)LMS2−1からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)ST1からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)KM20からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)S23321種からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ブルセラ・ミクロチ(Brucella microti)CCM4915からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)ATCC11741からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)RKJ300からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)LB400からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)ATCC13950からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ニトロソモナス属(Nitrosomonas)Is79A3種からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)972h−からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)ATCC11577からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ストレプトミセス・ガーナエンシス(Streptomyces ghanaensis)ATCC14672からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
シアノセイス属(Cyanothece)PCC8802種からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)NRRL181からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)TX1330からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
リステリア・グレイー(Listeria grayi)DSM20601からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)EC30からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
マイコプラズマ・アリガトリス(Mycoplasma alligatoris)A21JP2からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
カルノバクテリウム属(Carnobacterium)17−4種からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)ATCC35311からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
テトラジェノコッカス・ハロフィルス(Tetragenococcus halophilus)NBRC12172からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
メリッソコッカス・プルトニウス(Melissococcus plutonius)DAT561からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
マイコプラズマ・アルスリチディス(Mycoplasma arthritidis)158L3−1からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)NEM316からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
マイコプラズマ・アガラクチアエ(Mycoplasma agalactiae)PG2からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)シャリス(Challis)株CH1亜系からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
キンゲラ・オラリス(Kingella oralis)ATCC51147からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
マイコプラズマ・フェルメンタンス(Mycoplasma fermentans)M64からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
グラニュリカテラ・アディアセンス(Granulicatella adiacens)ATCC49175からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)ATCC23114からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
マイコプラズマ・クロコディリ(Mycoplasma crocodyli)MP145からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ナイセリア属(Neisseria)種014口腔分類群F0314株からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
エレモコッカス・コレオコラ(Eremococcus coleocola)ACS−139−V−Col8からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
アエロコッカス・ウリナエ(Aerococcus urinae)ACS−120−V−Col10aからのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)ATCC23330からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)HS−6からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)HS−6からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
マイコプラズマ・コランビナム(Mycoplasma columbinum)SF7からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)PKLのアミノ酸配列
コドン最適化されたクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)PKLのアミノ酸配列
L.グレイー(L.grayi)mvaE核酸配列
E.フェシウム(E.faecium)mvaE核酸配列
E.ガリナーラム(E.gallinarum)mvaE核酸配列
E.カセリフラブス(E.casseliflavus)mvaE核酸配列
L.グレイー(L.grayi)mvaS核酸配列
E.フェシウム(E.faecium)mvaS核酸配列
E.ガリナーラム(E.gallinarum)mvaS核酸配列
E.カセリフラブス(E.casseliflavus)mvaS核酸配列
アセトアセチルCoAシンターゼのアミノ酸配列
L.ラクチス(L.lactis)PKL核酸配列
L.ラクチス(L.lactis)PKLアミノ酸配列