CN105555952A - 用于乙酰辅酶a-衍生代谢物、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的改善生产的磷酸解酮酶 - Google Patents

用于乙酰辅酶a-衍生代谢物、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的改善生产的磷酸解酮酶 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含异源磷酸解酮酶(PKL)多肽的培养重组细胞以及制备和利用它们的方法，该多肽能够提高乙酰辅酶A-衍生代谢物的产量。在一些实施例中，所述重组细胞还包含一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径的多肽，它们用于产生类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯。

Description

用于乙酰辅酶A-衍生代谢物、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的改善生产的磷酸解酮酶
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2013年4月10日的美国临时专利申请61/810,696和提交于2013年6月12日的美国临时专利申请61/834,359的优先权，它们中每一个的公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及包含异源磷酸解酮酶(PKL)多肽的培养重组细胞以及制备和利用它们的方法，该多肽能够提高乙酰辅酶A-衍生代谢物的产量。在一些实施例中，重组细胞还包含一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径的多肽，它们用于产生类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯。
背景技术
糖酵解允许将碳源代谢转化成中间体化合物如乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)，它是必需生物化合物合成中的一种重要中间体，必需生物化合物包括聚酮化合物、脂肪酸、氨基酸、维生素、异戊二烯、类异戊二烯、酚类物质和生物碱。多个这些乙酰-CoA衍生的代谢物具有工业上的实用性。例如，异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是多种合成聚合物(最值得注意的是合成橡胶)的关键原料。异戊二烯可通过分馏石油获取；然而，这种材料的纯化昂贵且耗时。C5烃类料流的石油裂解仅产生约15％的异戊二烯。每年约800,000吨的顺式-聚异戊二烯产自异戊二烯的聚合；大多数这种聚异戊二烯用于轮胎和橡胶工业。另外将异戊二烯共聚合用作其它产品中的合成弹性体，其它产品例如鞋类、机械产品、医用产品、体育用品和胶乳。异戊二烯也可由多种微生物、植物和动物物种天然产生。具体地，已经鉴定了天然生物合成异戊二烯的两种途径：甲羟戊酸(MVA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途径。
类异戊二烯也是展示出工业上的实用性的乙酰-CoA-衍生代谢物。例如，类异戊二烯用于药学产品并且用作生物燃料、食品添加剂、以及其它特定化学品。已经鉴定了超过29,000种类异戊二烯化合物，并且每年发现新的类异戊二烯。类异戊二烯可分离自天然产物，例如利用类异戊二烯前体分子作为基础构件以形成相对复杂结构的类异戊二烯的微生物和植物物种。类异戊二烯对大多数存活生物和细胞来说是至关重要的，它提供维持细胞膜流动性和电子传输的手段。实质上，类异戊二烯在植物中的功能与天然杀虫剂一样多样化，产生与肉桂、丁香和生姜相关联的香味。此外，药物和化学领域使用类异戊二烯作为药剂、营养制剂、矫味剂和农业害虫控制剂。考虑到它们在生物学体系中的重要性和广泛的用途，类异戊二烯已经成为科学家关注的焦点。
近来在异戊二烯、类异戊二烯前体分子和类异戊二烯制备方面的发展公开了制备异戊二烯和类异戊二烯的方法，该方法在速率、滴度和纯度方面能够足以符合稳定商业工艺的需求(参见例如国际专利申请公布WO2009/076676A2和美国专利7,915,026)；然而，仍需要另选的途径以改善其产量和收率。
例如，理论上三个乙酰-CoA分子可在一个平衡反应中来源于单个葡萄糖分子。然而，生物体通常仅产生最多两个乙酰-CoA分子，剩余部分以CO2形式损失。CO2的释放发生在从丙酮酸形成乙酰-CoA期间，这是一个由丙酮酸脱氢酶催化的反应。损耗一个碳原子导致乙酰-CoA-衍生代谢物、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯分子的生产收率降低。这种反应损耗的一个例外是Wood-Ljungdahl途径，它依赖一氧化碳脱氢酶和乙酰-CoA合酶以在厌氧产乙酸菌(anaerobicacetogens)中将二氧化碳还原成乙酰-CoA。
因此需要的是利用另选代谢过程的重组细胞，它们能够潜在地利用不依赖Wood-Ljungdahl途径酶的途径，在异戊二烯、类异戊二烯前体分子和类异戊二烯的制备中从一个葡萄糖分子中产生三个乙酰-CoA分子。
本文描述的本发明解决这些问题并且也提供附加的有益效果。
在整个本说明书中，参考各种专利、专利申请和其它类型的公布(例如期刊文章)。本文引用的所有专利、专利申请和公布的公开据此全文以引用方式并入用于各种目的。
发明内容
本文提供的本发明尤其公开了培养的重组细胞、这些细胞的组合物和利用这些细胞提高代谢中间体如4-磷酸赤藓糖(E4P)、3-磷酸甘油醛(GAP)和乙酰磷酸(Ac-P)的产量以及提高类异戊二烯前体、异戊二烯、类异戊二烯和/或来源于乙酰-CoA的分子如氨基酸的产量的方法。
因此，在一个方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:1至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:2至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:3至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:4至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:5至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:6至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:7至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:9至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:10至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:12至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:13至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:14至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:15至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:16至少65％的序列同一性
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:17至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:18至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:19至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:20至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:21至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:22至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:23至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:24至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:25至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:26至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:27至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:28至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:29至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:30至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:31至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:32至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:33至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:34至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:35至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:36至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:37至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:38至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:39至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:40至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:41至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:42至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:43至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:44至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:45至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:46至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:47至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:48至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:49至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:50至少65％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:51至少65％的序列同一性。
在一些方面，在上文和/或本文的任何实施例中，在合适培养基中培养重组细胞来增加以下项中的一个或多个：细胞内4-磷酸赤藓糖的量、细胞内3-磷酸甘油醛的量、或细胞内磷酸的量。在其它方面，在上文和/或本文的任何实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽能够由5-磷酸木酮糖合成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。在其它方面，在上文和/或本文的任何实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽能够由6-磷酸果糖合成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。
在其它方面，本文提供了在上文和/或本文的任何实施例中公开的能够产生异戊二烯的重组细胞，其中该重组细胞还包含(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中在合适培养基中培养重组细胞来提供异戊二烯的产生。在上文和/或本文的任何实施例中公开的细胞的另一方面，完整MVA途径的一种或多种多肽选自(a)使两个乙酰-CoA分子缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶；(b)使乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合以形成HMG-CoA的酶(例如HMG合酶)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(d)使甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；和(f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。在上文和/或本文的任何实施例中公开的细胞的另一方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸是植物异戊二烯合酶多肽。在上文和/或本文的任何实施例中公开的细胞的另一方面，植物异戊二烯合酶多肽是来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂交体银白杨x欧洲山杨(PopulusalbaxPopulustremula)的多肽。在上文和/或本文的任何实施例中公开的细胞的另一方面，异戊二烯合酶多肽选自山葛(Puerariamontana)或野葛(Puerarialobata)、美洲山杨(Populustremuloides)、银白杨(Populusalba)、黑杨(Populusnigra)和毛果杨(Populustrichocarpa)。在上文和/或本文的任何实施例中公开的细胞的另一方面，重组细胞还包含编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)途径多肽的一种或多种核酸。
在其它方面，本文提供了在上文和/或本文的任何实施例中公开的能够产生类异戊二烯前体的重组细胞，其中该重组细胞还包含编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中在合适培养基中培养重组细胞来提供类异戊二烯前体的产生。
在其它方面，本文提供了在上文和/或本文的任何实施例中公开的能够产生类异戊二烯的重组细胞，其中该重组细胞还包含(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中在合适培养基中培养重组细胞来提供类异戊二烯的产生。
在其它方面，本文提供了能够产生乙酰CoA-衍生代谢物的重组细胞，其中在合适培养基中培养在上文和/或本文的任何实施例中公开的重组细胞来提供乙酰CoA-衍生代谢物的产生。
在一些方面，在上文和/或本文的任何实施例中，将核酸置于诱导型启动子或组成型启动子控制下。在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，将核酸克隆到一个或多个多拷贝质粒中。在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，将核酸整合到细胞的染色体中。
在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，重组细胞是革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、藻类细胞或酵母细胞。在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，重组细胞选自棒状杆菌属(Corynebacteriaspp.)(例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、柠檬泛菌(Pantoeacitrea)、里氏木霉(Trichodermareesei)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，类异戊二烯是倍半萜。在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、里哪醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香烩烯、γ-萜品烯、松油烯和瓦伦烯。
在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，乙酰CoA-衍生代谢物选自聚酮化合物、聚羟基丁酸酯、脂肪醇和脂肪酸。在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，乙酰CoA-衍生代谢物选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、赖氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，乙酰CoA-衍生代谢物选自丙酮、异丙醇、异丁烯和丙烯。
在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，合适培养基包含碳源。在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，碳源为选自单糖、二糖、寡糖、多糖、C6糖、C5糖和转化糖的碳水化合物。
在其它方面，本文提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括：(a)在适于产生异戊二烯的条件下，培养在上文和/或本文的任何实施例中公开的重组细胞，以及(b)产生异戊二烯。
在其它方面，本文提供了生产类异戊二烯前体的方法，该方法包括：(a)在适于产生类异戊二烯前体的条件下，培养在上文和/或本文的任何实施例中公开的重组细胞，以及(b)产生类异戊二烯前体。
在其它方面，本文提供了生产类异戊二烯的方法，该方法包括：(a)在适于产生类异戊二烯的条件下，培养在上文和/或本文的任何实施例中公开的重组细胞，以及(b)产生类异戊二烯。
在其它方面，本文提供了生产乙酰CoA-衍生代谢物的方法，该方法包括：(a)在适于产生乙酰CoA-衍生代谢物的条件下，培养在上文和/或本文的任何实施例中公开的重组细胞，以及(b)产生乙酰CoA-衍生代谢物。
在其它方面，本文提供了用于检测重组细胞中多肽的体内磷酸解酮酶活性的方法，该方法包括：(a)培养包含编码所述多肽的异源核酸的重组细胞，其中重组细胞在用葡萄糖或木糖作为碳源的培养条件下缺失转酮醇酶活性(tktAB)；(b)评估重组细胞的细胞生长；以及(c)基于存在的细胞生长，检测所述多肽的体内磷酸解酮酶活性。
在其它方面，本文提供了具有磷酸解酮酶活性的分离的多肽，其通过本文公开的筛选、鉴定和/或检测中的任一种方法进行制备。
在其它方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性。在其它方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。在其它方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。
在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性。在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。在另一方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。
在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，在合适培养基中培养重组细胞来增加以下项中的一个或多个：细胞内4-磷酸赤藓糖的量、细胞内3-磷酸甘油醛的量、或细胞内乙酰磷酸的量。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽能够由5-磷酸木酮糖合成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽能够由6-磷酸果糖合成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。
在上文或本文所述的任何方面的其它实施例中，完整MVA途径的一种或多种多肽选自(a)使两个乙酰-CoA分子缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶；(b)使乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合以形成HMG-CoA的酶(例如HMG合酶)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(d)使甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；和(f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。
在其它方面，本文提供了能够产生异戊二烯的重组细胞，其中该重组细胞(例如本文提供的任何重组细胞)还包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中在合适培养基中培养该重组细胞来提供异戊二烯的产生，其对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)异戊二烯收率，或(b)异戊二烯比生产率。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸是植物异戊二烯合酶多肽。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，植物异戊二烯合酶多肽是来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂交体银白杨x欧洲山杨(PopulusalbaxPopulustremula)的多肽。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，异戊二烯合酶多肽选自山葛(Puerariamontana)、野葛(Puerarialobata)、美洲山杨(Populustremuloides)、银白杨(Populusalba)、黑杨(Populusnigra)和毛果杨(Populustrichocarpa)。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，重组细胞还包含编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)途径多肽的一种或多种核酸。
在其它方面，本文提供了能够产生类异戊二烯前体的重组细胞，其中在合适培养基中培养该重组细胞(例如本文提供的任何重组细胞)，并且该重组细胞产生所述类异戊二烯前体。
在其它方面，本文提供了产生类异戊二烯的重组细胞，其中该重组细胞(例如本文提供的任何重组细胞)还包含编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中在合适培养基中培养该重组细胞来提供类异戊二烯的产生。
在其它方面，本文提供了能够产生乙酰CoA-衍生代谢物的重组细胞，其中在合适培养基中培养该重组细胞(例如本文提供的任何重组细胞)来提供乙酰CoA-衍生代谢物的产生。
在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，将核酸置于诱导型启动子或组成型启动子控制下。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，将核酸克隆到一个或多个多拷贝质粒中。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，将核酸整合到细胞染色体中。
在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，重组细胞是革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、藻类细胞或酵母细胞。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，重组细胞选自棒状杆菌(Corynebacteria)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、柠檬泛菌(Pantoeacitrea)、里氏木霉(Trichodermareesei)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以及解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，类异戊二烯是倍半萜。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、里哪醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香烩烯、γ-萜品烯、松油烯和瓦伦烯。
在上文和/或本文的任何实施例的其它方面，乙酰CoA-衍生代谢物选自聚酮化合物、聚羟基丁酸酯、脂肪醇和脂肪酸。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，乙酰CoA-衍生代谢物选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、赖氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，乙酰CoA-衍生代谢物选自丙酮、异丙醇、异丁烯和丙烯。
在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，合适培养基包含碳源。在上文或本文所述的任何方面的一些实施例中，碳源为选自单糖、二糖、寡糖、多糖、C6糖、C5糖和转化糖的碳水化合物。
在其它方面，本文还提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括：(a)在适于产生异戊二烯的条件下，培养重组细胞(例如本文提供的任何重组细胞)，以及(b)产生异戊二烯。在其它方面，本文还提供了生产类异戊二烯前体的方法，该方法包括：(a)在适于产生类异戊二烯前体的条件下，培养重组细胞(例如本文提供的任何重组细胞)，以及(b)产生类异戊二烯前体。
在其它方面，本文还提供了生产类异戊二烯的方法，该方法包括：(a)在适于产生类异戊二烯的条件下，培养重组细胞(例如本文提供的任何重组细胞)，以及(b)产生类异戊二烯。
在其它方面，本文还提供了生产乙酰CoA-衍生代谢物的方法，该方法包括：(a)在适于产生乙酰CoA-衍生代谢物的条件下，培养重组细胞(例如本文提供的任何重组细胞)，以及(b)产生乙酰CoA-衍生代谢物。
在其它方面，本文还提供了用于检测重组细胞中多肽的体内磷酸解酮酶活性的方法，该方法包括：(a)培养包含编码所述多肽的异源核酸序列的重组细胞，其中重组细胞在用葡萄糖或木糖作为碳源的培养条件下缺失转酮醇酶活性(tktAB)；(b)评估重组细胞的细胞生长；以及(c)基于存在的细胞生长，检测所述多肽的体内磷酸解酮酶活性。
在其它方面，本文还提供了分离的多肽，其具有通过上文或本文所述的任何方法检测的磷酸解酮酶活性。
附图说明
图1示出存在磷酸解酮酶(PKL)时的工程化代谢途径。PKL已经基于底物偏好分类成两种类型：仅作用于X5P的5-磷酸木酮糖(X5P)磷酸解酮酶(EC4.1.2.9)和以类似活性作用于X5P和F6P的5-磷酸木酮糖/6-磷酸果糖(F6P)磷酸解酮酶(EC4.1.2.22)。在PKL-催化反应中由F6P和/或X5P形成的乙酰磷酸(Ac-P)随后转化成乙酰-CoA用于MVA途径或可转化成乙酸。PKL催化反应的其它产物，即分别由X5P和F6P产生的3-磷酸甘油醛(GAP)和4-磷酸赤藓糖(E4P)，可通过操纵的代谢途径再循环以最大化收率。乙酰-CoA可转化成多种产物例如聚酮化合物、脂肪酸和氨基酸如赖氨酸。
图2是鉴定的PKL的22个簇的中心代表序列的示图。
图3是簇1中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图4是簇2中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图5是簇3中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图6是簇4中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图7是簇5中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图8是簇6中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图9是簇7中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图10是簇8中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图11是簇9中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图12是簇10中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图13是簇11中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图14是簇12中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图15是簇13中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图16是簇14中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图17是簇15中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图18是簇16中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图19是簇17中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图20是簇18中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图21是簇19中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图22是簇20中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图23是簇21中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图24是簇22中鉴定的磷酸解酮酶的示图。
图25示出表达鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)磷酸解酮酶的pCMP1321的质粒图谱。
图26示出表达齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)磷酸解酮酶的pMCS530的质粒图谱。
图27示出表达双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)磷酸解酮酶的pMCS531的质粒图谱。
图28示出表达高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)磷酸解酮酶的pMCS532的质粒图谱。
图29示出表达布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)磷酸解酮酶的pMCS533的质粒图谱。
图30示出表达植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofermans)磷酸解酮酶的pMCS534的质粒图谱。
图31示出表达丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)最优化的磷酸解酮酶的pMCS535的质粒图谱。
图32是一系列SDS-PAGE考马斯染色的凝胶，示出在表达磷酸解酮酶的菌株中的蛋白质表达。A)可溶性蛋白质和B)不溶性蛋白质，它们来自表达长双歧杆菌(B.longum)PKL(泳道1)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)PKL(泳道2)、丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL(泳道3)、齿双歧杆菌(B.dentium)PKL(泳道4)、双歧双歧杆菌(B.bifidum)PKL(泳道5)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)PKL(泳道6)、布氏乳杆菌(L.buchneri)PKL(泳道7)、植物令伯克霍尔德菌(B.phytofermans)PKL(泳道8)和丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)密码子优化的PKL(泳道9)的细胞。
图33是示出在F6P底物的存在下，以Ac-P收率进行测量的长双歧杆菌(B.longum)PKL、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)PKL、丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL、齿双歧杆菌(B.dentium)PKL、双歧双歧杆菌(B.bifidum)PKL、高卢双歧杆菌(B.gallicum)PKL、布氏乳杆菌(L.buchneri)PKL、植物令伯克霍尔德菌(B.phytofermens)PKL和丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)密码子优化的PKL的体外活性的图。
图34是示出在仅具有包含六种芳族化合物和吡哆素的补充剂的葡萄糖上生长的转酮醇酶突变体的图。
图35是示出来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)和丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)的磷酸解酮酶恢复转酮醇酶突变体在无补充剂的葡萄糖上的生长的图。
图36是示出在具有或不具有包含六种芳族化合物和吡哆素的补充剂的木糖上不生长的转酮醇酶突变体的图。
图37是示出来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)和丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)的磷酸解酮酶恢复转酮醇酶突变体在无补充剂的木糖上的生长的图。
图38是示出优选地上调以增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的宿主突变体的示图。用于调节碳通量的受关注的基因包括5-磷酸核糖异构酶A(rpiA)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶A(tktA)、转醛醇酶B(talB)和/或磷酸乙酰转移酶(pta)。
图39是示出优选地下调以增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的宿主突变体的示图。用于调节碳通量的受关注的基因包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA)、果糖二磷酸醛缩酶(fba)、3-磷酸甘油醛脱氢酶A(gapA)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)和/或pts操纵子。
图40示出多种PKL酶在MD891(ackA-)宿主中的累积异戊二烯收率。
图41示出多种PKL酶在MD891(ackA-)宿主中的发酵结束(EOF)异戊二烯滴度。
图42示出根据本文公开的任何组合物、细胞、或方法，适于共表达PKL的质粒的基因质粒图谱。
具体实施方式
本文提供的本发明尤其公开了用于在已经经工程化以表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞中产生乙酰辅酶A-衍生代谢物、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法。本发明的磷酸解酮酶能够利用各种底物，如下文详述。在某些实施例中，本发明提供用于在已经经工程化以表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞中产生乙酰辅酶A-衍生代谢物、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法，该磷酸解酮酶多肽能够催化5-磷酸木酮糖转化成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。在其它实施例中，本发明提供用于在已经经工程化以表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞中产生乙酰辅酶A-衍生代谢物、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法，该磷酸解酮酶多肽能够催化6-磷酸果糖转化成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。在其它实施例中，本发明提供用于在已经经工程化以表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞中产生乙酰辅酶A-衍生代谢物、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法，该磷酸解酮酶多肽能够催化7-磷酸景天庚酮糖转化成5-磷酸核糖和乙酰磷酸。在其它实施例中，本发明提供用于在已经经工程化以表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞中产生乙酰辅酶A-衍生代谢物、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法，该磷酸解酮酶多肽能够催化5-磷酸木酮糖转化成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸和/或催化6-磷酸果糖转化成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸和/或催化7-磷酸景天庚酮糖转化成5-磷酸核糖和乙酰磷酸。
通过重组表达的磷酸解酮酶已被用于工程化宿主细胞中的代谢途径。参见美国专利7,785,858。Sonderegger等人(AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2004，70:5，2892-97)描述了在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中使用磷酸解酮酶过量生产乙醇。Fleige等人(ApplMicrobialBiotechnol.，2011，91:3，769-76)描述了在改良富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)中表达双歧杆菌磷酸解酮酶基因(Meile等人，同上)，该菌株恢复了生物体利用果糖作为单一碳源生长的能力。
理论上三个乙酰-CoA分子可在一个平衡反应中来源于单个葡萄糖分子。然而，生物体通常仅产生最多两个乙酰-CoA分子，剩余部分以CO2形式损失。CO2的释放发生在从丙酮酸形成乙酰-CoA期间，这是一个由丙酮酸脱氢酶催化的反应。损耗一个碳原子导致乙酰-CoA-衍生代谢物、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯分子的生产收率降低。这种反应损耗的一个例外是Wood-Ljungdahl途径，它依赖一氧化碳脱氢酶和乙酰-CoA合酶以在厌氧产乙酸菌(anaerobicacetogens)中将二氧化碳还原成乙酰-CoA。
本发明提供另选的代谢过程，其能够潜在地利用不依赖Wood-Ljungdahl途径酶的途径从一个葡萄糖分子中产生三个乙酰-CoA分子。相反地，它利用存在于某些生物体中的磷酸解酮酶[参见例如，BiologyoftheProkaryotes(编辑Lengeler，Drews和Schlegel)；BlackwellScience，NewYork，1999，第299-301页；Meile等人，J.ofBacteriology，2001，183:9，2929-36；Jeong等人，J.Microbiol.Biotechnol.，2007，17:5，822-829]。磷酸解酮酶允许由5-磷酸木酮糖或6-磷酸果糖形成乙酰-CoA(经由乙酰磷酸)，而不是通过典型代谢中的丙酮酸氧化形成乙酰-CoA。
磷酸解酮酶已经基于它们的底物偏好分类成两种类型：仅作用于X5P的5-磷酸木酮糖(X5P)磷酸解酮酶和作用于X5P与F6P的X5P/6-磷酸果糖(F6P)磷酸解酮酶(Suzuki等人，ActaCryst.F66，2010，66:8，941-43)。磷酸解酮酶利用无机磷酸(Pi)催化X5P或F6P的裂解以产生乙酰磷酸(乙酰-P)、H2O和3-磷酸甘油醛或4-磷酸赤藓糖。高能量代谢物乙酰-P随后由乙酸激酶转化成乙酸以在途径中从ADP生成ATP(图1)。除乙酰磷酸之外，酶反应产生的3-磷酸甘油醛可通过调控代谢途径再循环利用，使得能够获得3个乙酰-CoA的最大收率。显著地是，磷酸解酮酶产生乙酰-CoA不发生在丙酮酸脱氢酶介导的反应中观察到的碳损耗(例如CO2)。
磷酸解酮酶也可作用于7-磷酸景天庚酮糖以将其转化成5-磷酸核糖和乙酰磷酸。此种磷酸解酮酶的一个非限制性示例是长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)磷酸解酮酶，它具有对7-磷酸景天庚酮糖的催化活性。
本发明涉及利用磷酸解酮酶产生乙酰-CoA-衍生代谢物、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯以提高产物收率。具体地，理论上的异戊二烯产物收率提高了，由下列平衡公式表示(假设生物体能够通过1摩尔葡萄糖完全氧化成6摩尔CO2来产生ATP)：
仅MVA途径
1.5葡萄糖+2.00O2→1.00异戊二烯+4.00CO2+5.00H2O
理论收率–0.252g异戊二烯/g葡萄糖
DXP途径
1.25葡萄糖+0.50O2→1.00异戊二烯+2.50CO2+3.50H2O
理论收率–0.302g异戊二烯/g葡萄糖
MVA+磷酸解酮酶途径
1.22葡萄糖+0.33O2→1.00异戊二烯+2.33CO2+3.32H2O
理论收率–0.309g异戊二烯/g葡萄糖
依赖甲羟戊酸的生物合成途径对于产生类异戊二烯前体分子如二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)和异戊烯焦磷酸(IPP)来说是尤其重要的。以上甲羟戊酸途径的酶将由葡萄糖产生的乙酰CoA经由三个酶反应转化成甲羟戊酸。不受理论的约束，据信利用用于增加的乙酰CoA生物合成的磷酸解酮酶多肽产生的增加的细胞内E4P、GAP和Ac-P总量可导致以上依赖甲羟戊酸的生物合成途径的生产率提高，该途径将显著增加甲羟戊酸的生物合成，并且因此增加下游的类异戊二烯前体分子如DMAPP和IPP的生物合成(图1)。此外，增加的乙酰-CoA生物合成能够导致增加的乙酰-CoA-衍生代谢物如脂肪酸、氨基酸和丙酮的合成(图1)。通过这种另选PKL途径增加的细胞内-CoA产量因此有利于商业应用。
丙酮由某些微生物如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)产生。它起始于两分子乙酰-CoA通过乙酰-CoA乙酰转移酶(EC2.3.1.9)缩合成乙酰乙酰-CoA。乙酰乙酰-CoA随后通过与乙酸或丁酸的反应转化成乙酰乙酸，导致生成乙酰-CoA或丁酰-CoA。这个反应由酶如乙酰乙酰CoA转移酶(EC2.8.3.8)催化。乙酰乙酰CoA转移酶已知来自多种生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或丙酮丁醇梭菌(C.acetobutyiicum)。然而，其它酶也能够催化这一反应，例如3-含氧酸CoA转移酶(EC2.8.3.5)或琥珀酸CoA连接酶(EC6.2.1.5)。在该反应的最后步骤中，乙酰乙酸通过乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)催化的脱羧步骤转化成丙酮。对于丙酮、异戊二烯和丙烯，如WO2013/07786所述，丙酮可随后转化成异丙醇、异丁烯和/或丙烯，该专利内容明确地全文以引用方式并入本文中。
因此，在某些方面，本发明提供具有增加的细胞内4-磷酸赤藓糖量、增加的细胞内3-磷酸甘油醛量和/或增加的细胞内磷酸量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸，并且其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，产生增加的细胞内4-磷酸赤藓糖量、增加的细胞内3-磷酸甘油醛量和/或增加的细胞内磷酸量。
在一些方面，本发明提供具有增加的细胞内乙酰-CoA量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸，并且其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，产生增加的细胞内乙酰-CoA量。
在某些方面，本发明提供能够提高甲羟戊酸产量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和编码一种或多种以上MVA途径的多肽的一种或多种核酸，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，产生增量的甲羟戊酸。
在其它方面，本发明提供能够提高类异戊二烯前体产量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，产生增量的类异戊二烯前体。
在其它方面，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；和(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中该细胞能够产生可回收量的异戊二烯。在某些实施例中，本发明能够提高异戊二烯产量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；和(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的异戊二烯产生细胞相比，产生增量的异戊二烯。
在其它方面，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；和(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中该细胞能够产生可回收量的类异戊二烯。在某些实施例中，本发明能够提高类异戊二烯产量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；和(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的类异戊二烯产生细胞相比，产生增量的类异戊二烯。
在其它方面，本发明提供能够产生乙酰CoA-衍生代谢物的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸，其中该细胞能够产生可回收量的乙酰CoA-衍生代谢物。在某些实施例中，本发明能够提高乙酰CoA-衍生代谢物产量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的乙酰CoA-衍生代谢物产生细胞相比，产生增量的乙酰CoA-衍生代谢物。
在本文任一个方面，本发明提供重组细胞，其中该细胞可包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸，并且还可经工程化以调节一种或多种以下基因的活性：包括5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)，从而改善通过磷酸解酮酶途径的碳通量。
在一些实施例中，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；并且(iii)进一步经工程化以调节一种或多种基因的活性，从而提高通过磷酸解酮酶途径的碳通量，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的异戊二烯产生细胞相比，产生增量的异戊二烯。
在一些实施例中，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸；并且(iii)进一步经工程化以调节一种或多种基因的活性，从而提高通过磷酸解酮酶途径的碳通量，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的类异戊二烯产生细胞相比，产生增量的类异戊二烯。
在其它实施例中，本发明提供能够提高乙酰CoA-衍生代谢物产量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸，并且进一步经工程化以调节一种或多种基因的活性，从而提高通过磷酸解酮酶途径的碳通量，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的乙酰CoA-衍生代谢物产生细胞相比，产生增量的乙酰CoA-衍生代谢物。
一般技术
除非另外指明，实施本发明将利用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们在本领域技术范围内。此类技术在以下文献中得到充分说明：“MolecularCloning:ALaboratoryManual”，第二版(Sambrook等人，1989)；“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait编辑，1984)；“AnimalCellCulture”(R.I.Freshney编辑，1987)；“MethodsinEnzymology”(AcademicPress，Inc.)；“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(F.M.Ausubel等人编辑，1987，以及定期更新)；“PCR:ThePolymeraseChainReaction”，(Mullis等人编辑，1994)；Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology，第2版，J.Wiley&Sons(NewYork，N.Y.1994)；和March，AdvancedOrganicChemistryReactions，MechanismsandStructure，第4版，JohnWiley&Sons(NewYork，N.Y.1992)，它们为本领域的技术人员提供在本申请中使用的多个术语的一般指导。
定义
术语“异戊二烯”是指2-甲基-1,3-丁二烯(CAS#78-79-5)。它可为直接的和最终的挥发性C5烃产物，来自去除了焦磷酸的3,3-二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)。它可不涉及IPP分子与DMAPP分子的连接或聚合。除非本文另外指明，术语“异戊二烯”一般来讲并非旨在进行限制其制备方法。
如本文所用，术语“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。
如本文所用，“分离的多肽”不是多肽库的一部分，例如2、5、10、20、50或更多个不同多肽的库，并且它与其天然存在时在一起的至少一个组分分离。分离的多肽可例如通过表达编码该多肽的重组核酸获得。
“异源多肽”设置由来源于不同于宿主细胞的生物体、物种、或菌株的核酸序列编码的多肽。在一些实施例中，异源多肽与天然存在于相同宿主细胞的野生型多肽不同。
如本文所用，“核酸”是指两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸以单链或双链形式共价连接在一起。
“重组核酸”是指受关注的核酸不含在受关注的核酸所来源的生物体天然存在的基因组中，侧面与受关注的核酸相接的一个或多个核酸(例如基因)。术语因此包括例如结合到载体中的重组DNA、结合到自主复制质粒或病毒中的重组DNA、或结合到真核生物或原核生物的基因组DNA中的重组DNA，或者重组DNA作为独立于其它序列的独立分子存在(例如通过PCR或限制性内切酶消化制备的cDNA、基因组DNA片段、或cDNA片段)。
“异源核酸”是指由来源于不同于宿主细胞的生物体、物种、或菌株的核酸序列。在一些实施例中，异源核酸与天然存在于相同宿主细胞的野生型核酸不同。例如，由来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的磷酸解酮酶基因编码并用于转化大肠杆菌(E.coli)的核酸是异源核酸。
如本文所用，术语“磷酸解酮酶(phosphoketolase/phosphoketolaseenzyme)”或“磷酸解酮酶多肽”互换使用并且是指将5-磷酸转化成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸和/或将6-磷酸果糖转化成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸的多肽。一般来讲，磷酸解酮酶作用于酮醣。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽催化5-磷酸木酮糖转化成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽催化6-磷酸果糖转化成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽催化7-磷酸景天庚酮糖转化成一种产物(例如5-磷酸核糖)和乙酰磷酸。
如本文所用，“表达控制序列”是指引导受关注核酸转录的核酸序列。表达控制序列可为启动子，例如组成型或诱导型启动子，或者增强子。表达控制序列可为“天然的”或异源的。天然表达控制序列来源于表达基因的相同生物体、物种、或菌株。异源表达控制序列来源于表达基因的不同生物体、物种、或菌株。“诱导型启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。
“可操作地连接”是指在核酸表达控制序列(例如启动子)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。
如本文所用，术语“基本培养基(minimalmedium/minimalmedia)”是指包含供细胞生长的最小限度营养物质的培养基，其一般不包含氨基酸。基本培养基通常包含：(1)用于细菌生长的碳源；(2)各种盐，它们可根据菌种和生长条件而变化；和(3)水。碳源可变化很大，从单糖如葡萄糖变为较复杂的其它生物质的水解产物如酵母提取物，这在下文中详述。盐一般提供必需元素如酶、氮、磷和硫，使得细胞合成蛋白质和核酸。基本培养基也可补充有选择剂如抗生素，用于选择以保持某些质粒等。例如，如果微生物对某些抗生素如氨苄青霉素或四环素有抗性，那么可将该抗生素加入培养基以防止缺乏该抗性的细胞生长。培养基可补充有其它化合物，它们是选择期望生理或生物化学特性所必需的，例如特定氨基酸等。
如本文所用，术语“类异戊二烯”是指较大的和各种不同种类的天然存在种类有机化合物，它们由两个或更多个烃单元构成，并且每个单元包含排列成特定图案的五个碳原子。如本文所用，“异戊二烯”被明确地排除出“类异戊二烯”的定义。
如本文所用，术语“类萜”是指较大的和各种不同种类的有机分子，它们来源于以多种方式装配并修饰的五碳类异戊二烯单元，并且基于在基团构件中所用的类异戊二烯单元数进行基团分类。类半萜具有一个类异戊二烯单元。类单萜具有两个类异戊二烯单元。类倍半萜具有三个类异戊二烯单元。类二萜具有四个异戊二烯单元。类倍半萜具有五个类异戊二烯单元。类三萜具有六个类异戊二烯单元。类四萜具有八个类异戊二烯单元。类多萜具有超过八个类异戊二烯单元。
如本文所用，“类异戊二烯前体”是指生物体用于类萜或类异戊二烯生物合成的任何分子。类异戊二烯前体分子的非限制性示例包括例如甲羟戊酸(例如甲瓦龙酸(MVA))、异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)。
如本文所用，术语“质量收率”是指重组细胞产生的产物质量除以重组细胞消耗的葡萄糖质量，表达为百分比。
“比生产率”是指重组细胞产生的产物质量除以产物的产生时间、细胞密度和培养物体积。
“滴度”是指重组细胞产生的产物质量除以培养物体积。
如本文所用，术语“细胞生产率指数(CPI)”是指重组细胞产生的产物质量除以在培养物中产生的重组细胞质量。
除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本领域(本发明涉及的领域)的普通技术人员一般理解的含义相同。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。
预期在整个本说明书中给定的每一最大数值限度包括每一更低数值限度，如同此类更低数值限度明确地写入本文。在整个本说明书中给定的每一最小数值限度包括每一更高数值限度，如同此类更高数值限度明确地写入本文。在整个本说明书中给定的每一数值范围将包括落在此种更宽数值范围内的每一更窄数值范围，如同此类更窄数值范围明确地写入本文。
表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞
磷酸解酮酶催化5-磷酸木酮糖转化成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸和/或催化6-磷酸果糖转化成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽能够催化5-磷酸木酮糖转化成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽能够催化6-磷酸果糖转化成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽催化7-磷酸景天庚酮糖转化成一种产物(例如5-磷酸核糖)和乙酰磷酸。因此，不受理论的约束，如本文所示的磷酸解酮酶的表达可导致由碳水化合物源产生的乙酰磷酸量增加。这种乙酰磷酸可转化成乙酰-CoA，其随后可由MVA途径的酶活性利用以产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯，或者可被利用以产生乙酰-CoA-衍生代谢物。
如本文所用，术语“乙酰-CoA-衍生代谢物”可指代谢物，其通过将乙酰-CoA催化转化成所述代谢物获得。该转化可为一步反应或多步反应。例如，丙酮是乙酰-CoA衍生代谢物，其由乙酰-CoA通过三步反应产生(例如多步反应)：1)由乙酰-CoA乙酰转移酶将两分子乙酰-CoA缩合成乙酰乙酰-CoA；2)通过与乙酸或丁酸的反应将乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸，产生乙酰-CoA或丁酰-CoA；以及3)通过由乙酰乙酸脱羧酶催化的脱羧步骤将乙酰乙酸转化成丙酮。丙酮可随后转化成异丙醇、异丁烯和/或丙烯，它们在本文中也被明确地认为是乙酰-CoA-衍生代谢物。在一些实施例中，乙酰CoA-衍生代谢物选自聚酮化合物、聚羟基丁酸酯、脂肪醇和脂肪酸。在一些实施例中，乙酰CoA-衍生代谢物选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、赖氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一些实施例中，乙酰CoA-衍生代谢物选自丙酮、异丙醇、异丁烯和丙烯。因此可提高由碳水化合物底物产生的这些化合物(例如乙酰-CoA、乙酰-CoA-衍生代谢物、乙酰-P、E4P等)的量。
乙酰-P和乙酰-CoA的产量可得到提高，并且该提高不反映为较高的细胞内浓度。在某些实施例中，即使磷酸解酮酶反应正在发生，细胞内乙酰-P或乙酰-CoA浓度将保持不变或甚至降低。
示例性磷酸解酮酶多肽和核酸
示例性磷酸解酮酶核酸包括编码具有至少一种磷酸解酮酶多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性磷酸解酮酶多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸，以及来源于本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸(参见例如，图2-24和实例2)。另外，表1和表2提供来自不同物种的某些示例性磷酸解酮酶的非限制性列表，它们可用于本发明的实施例。
示例性磷酸解酮酶的生物化学特性包括但不限于蛋白质表达、蛋白质溶解度和活性。磷酸解酮酶也可基于其它特性进行选择，包括但不限于不同类型生物体(例如革兰氏阳性菌、蓝细菌、放线菌)、兼性低温好氧菌、期望菌种的近亲(例如大肠杆菌(E.coli))和嗜热细菌之间的差异。
在一些情况下，如果生物体在其基因组中缺失磷酸果糖激酶基因，可选择来自某些生物体的磷酸解酮酶。
在另一个示例中，可基于氨基酸序列的二级结构和/或实例1所述方法选择磷酸解酮酶。
在另一个示例中，可基于如实例6所述的体外测定选择磷酸解酮酶。
在另一个示例中，可基于如实例7所述的体内测定选择磷酸解酮酶。在一些方面，本文提供了用于测定体内多肽的磷酸解酮酶活性存在的方法，该方法包括(a)培养包含编码所述多肽的异源核酸序列的重组细胞，其中重组细胞在用葡萄糖或木糖作为碳源的培养条件下缺失转酮醇酶活性(tktAB)；(b)评估重组细胞的细胞生长；以及(c)基于观察到的细胞生长量，测定体内所述多肽的磷酸解酮酶活性的存在。在一些方面，本文提供了鉴定具有磷酸解酮酶活性的多肽的方法，该方法包括(a)培养包含编码怀疑具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列的重组细胞，其中重组细胞在用葡萄糖或木糖作为碳源的培养条件下缺失转酮醇酶活性(tktAB)；(b)评估重组细胞的细胞生长；以及(c)当观察到细胞生长时，鉴定具有磷酸解酮酶活性的多肽。在一些方面，本文提供了用于检测重组细胞中多肽的体内磷酸解酮酶活性的方法，该方法包括(a)培养包含编码所述多肽的异源核酸序列的重组细胞，其中重组细胞在用葡萄糖或木糖作为碳源的培养条件下缺失转酮醇酶活性(tktAB)；(b)评估重组细胞的细胞生长；以及(c)基于存在的细胞生长，检测所述多肽的体内磷酸解酮酶活性。
如本文所提供，磷酸解酮酶活性可改善乙酰-CoA-衍生代谢物、类异戊二烯前体(例如IPP)、异戊二烯和/或类异戊二烯的产量。本文提供了包含磷酸解酮酶的重组宿主，其中细胞展示至少一个受关注的特性以改善乙酰-CoA-衍生代谢物、类异戊二烯前体(例如IPP)、异戊二烯和/或类异戊二烯的产量。
在一些方面，至少一个受关注的特性选自但不限于比生产率、收率、滴度和细胞性能指数(例如细胞生长)。如本文所用，“性能指数”是指相对于亲本分子的每单位计算活性。在本文公开的任何实施例的一些方面，用于计算性能指数的亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在一些实施例中，亲本分子具有根据定义为一的性能指数。在其它实施例中，大于一的性能指数(PI>1.0)指示与亲本分子(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比改善的磷酸解酮酶活性。
在某些实施例中，适用于本文的磷酸解酮酶包括可溶性磷酸解酮酶。用于测量蛋白质溶解度的技术是本领域熟知的。用于测量蛋白质溶解度的技术包括本文实例中公开的那些。在一些实施例中，用于本文的磷酸解酮酶包括具有至少20％溶解度的那些。在一些实施例中，磷酸解酮酶溶解度为介于约5％至约100％，约10％至约100％，约15％至约100％，约20％至约100％，约25％至约100％，约30％至约100％，约35％至约100％，约40％至约100％，约45％至约100％，约50％至约100％，约55％至约100％，约60％至约100％，约65％至约100％，约70％至约100％，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，或约90％至约100％之间的任何值，在一些实施例中，磷酸解酮酶溶解度为约5％至约100％。在一些实施例中，溶解度介于5％和100％之间。在一些实施例中，磷酸解酮酶溶解度为小于约100，90，80，70，60，50，40，30，20，或10，但是不小于约5％的任何值。在一些实施例中，溶解度为大于约5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，或95％的任何值。
具有期望的动力学特性的磷酸解酮酶提高异戊二烯的产量。动力学特性包括但不限于比活性、Kcat、Ki和Km。在一些方面，kcat为至少约0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4，2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0，5.2，5.4，5.6，5.8，6.0，6.2，6.4，6.6，6.8，7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0，8.1，8.2，8.4，8.6，8.8，9.0，9.2，9.4，9.6，9.8，10.0，10.2，10.4，10.6，10.8，11.0，11.2，11.4，11.6，11.8，12.0，12.2，12.4，12.6，12.8，13.0，13.2，13.4，13.6，13.8，14.0，14.2，14.4，14.6，14.8，15.0，15.2，15.4，15.6，15.8，16.0，16.2，16.4，16.6，16.8，17.0，17.2，17.4，17.6，17.8，18.0，18.2，18.4，18.6，18.8，19.0，19.2，19.4，19.6，19.8，20.0，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，300，400，500，600，700，或800。在其它方面，kcat为至少约0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.92.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0，5.2，5.4，5.6，5.8，6.0，6.2，6.4，6.6，6.8，7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0，8.1，8.2，8.4，8.6，8.8，9.0，9.2，9.4，9.6，9.8，10.0，10.2，10.4，10.6，10.8，11.0，11.2，11.4，11.6，11.8，12.0，12.2，12.4，12.6，12.8，13.0，13.2，13.4，13.6，13.8，14.0，14.2，14.4，14.6，14.8，15.0，15.2，15.4，15.6，15.8，16.0，16.2，16.4，或16.6。
在一些方面，Km为至少约1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13，13.5，14，14.5，15，16，17，17.5，18，18.5，19，19.5，20，20.5，21，21.5，22，22.5，23，23.5，24，24.5，25，25.5，26，26.5，27，27.5，28，28.5，29，29.5，30，30.5，31，31.5，32，32.5，33，33.5，34，34.5，35，35.5，36，36.5，37，37.5，38，38.5，39，39.5，40，40.5，41，41.5，42，42.5，43，43.5，44，44.5，45，45.5，46，46.5，47，47.5，48，48.5，49，49.5，50，50.5，51，51.5，52，52.5，53，53.5，54，54.5，55，55.5，或56。在其它方面，km为至少约2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13，13.5，14，14.5，15，16，17，17.5，18，18.5，19，19.5，20，20.5，21，21.5，或22。
受关注的特性包括但不限于：与不包含磷酸解酮酶多肽的重组细胞相比提高的细胞内活性、比生产率、收率和细胞性能指数。在一些实施例中，比生产率提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，67，8，9，10倍或更多倍。在一个实施例中，比生产率为约40mg/L/OD/hr。在一些实施例中，收率提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，MVA收率提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，异戊二烯收率提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。
在其它实施例中，包含如本文所示具有磷酸解酮酶活性的多肽和编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸的重组细胞的受关注特性包括但不限于(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，或(d)细胞内乙酰磷酸的产生，它们的性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为大于1，例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。
在其它实施例中，在还包含编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸的重组细胞中具有磷酸解酮酶活性的多肽的受关注特性包括但不限于(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)F6P比活性，它们的性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为大于1，例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。
在其它实施例中，重组细胞包含(i)具有磷酸解酮酶活性的多肽，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其受关注特性包括但不限于(a)异戊二烯产生蛋白质溶解度或(b)异戊二烯比生产率，它们的性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为大于1，例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。
在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文提供了分离自微生物的磷酸解酮酶。在一些方面，磷酸解酮酶分离自革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、好氧细菌、厌氧细菌、嗜热细菌、嗜冷细菌、嗜盐细菌或蓝细菌。在一些方面，磷酸解酮酶分离自真菌。在其它方面，示例性磷酸解酮酶核酸包括例如分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的磷酸解酮酶。在其它方面，示例性磷酸解酮酶核酸包括例如分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)的磷酸解酮酶。在其它方面，示例性磷酸解酮酶核酸包括例如分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)的磷酸解酮酶。在其它方面，示例性磷酸解酮酶核酸包括例如分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)的磷酸解酮酶。
可使用的其它磷酸解酮酶包括但不限于来自长双歧杆菌(B.longum)、植物乳杆菌(L.plantarum)、丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、类植物乳杆菌(L.paraplantarum)、沼泽红假单胞菌(R.palustris)、点形念珠藻(Nostocpunctiforme)、动物双歧杆菌(B.animalis)、短双歧杆菌(B.breve)、阴道加德纳菌(G.vaginalis)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、M.paludis、泛菌属(Panteoasp.)、水生拉恩菌(R.aquatilis)、点形念珠藻(N.punctiforme)、阿维链霉菌(S.avermetilis)和禾草腥黑粉菌(T.fusca)的磷酸解酮酶。可使用的附加磷酸解酮酶包括但不限于植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。
可用于确定多肽是否具有磷酸解酮酶肽活性的标准方法通过测量肽将D-6-磷酸果糖或D-5-磷酸木酮糖转化成乙酰-P的能力进行。随后将乙酰-P转化成铁氧乙酰羟肟酸，其可通过分光光度计进行检测(Meile等人，J.Bact.183：2929-2936，2001)。如本文所述，鉴定具有磷酸解酮酶肽活性的任何多肽适用于本发明。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽催化5-磷酸木酮糖转化成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽催化6-磷酸果糖转化成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽能够催化7-磷酸景天庚酮糖转化成5-磷酸核糖和乙酰磷酸。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽催化5-磷酸木酮糖转化成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸和/或催化6-磷酸果糖转化成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸和/或催化7-磷酸景天庚酮糖转化成5-磷酸核糖和乙酰磷酸。
在本文所述的任何实施例中，磷酸解酮酶核酸可具有与本文所述的任何磷酸解酮酶核酸序列至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:52至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:53至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:54至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:55至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:56至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:57至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:58至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:59至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由Rhodococcusimtechensis磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:60至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:61至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:62至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:63至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:64至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:65至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:66至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由蓝丝菌属(Cyanothecesp.)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:67至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:68至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由屎肠球菌(Enterococcusfaecium)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:69至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由格氏李斯特菌(Listeriagrayi)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:70至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:71至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:72至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:73至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:74和76中任一个至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:75至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:77至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:78至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:79至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由格氏链球菌(Streptococcusgordonii)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:80至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由口金氏菌(Kingellaoralis)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:81至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由发酵支原体(Mycoplasmafermentans)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:82至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:83至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由人支原体(Mycoplasmahominis)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:84至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:85至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:86至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由Eremococcuscoleocola磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:87至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由脲气球菌(Aerococcusurinae)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:88至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由金格杆菌(Kingellakingae)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:89至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:90和91中任一个至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。在一些实施例中，由鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)磷酸解酮酶基因编码的磷酸解酮酶核酸可具有与SEQIDNO:92至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。
在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:1编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:2编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:3编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:4编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:5编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:6编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:7编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，65％，或60％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由屎肠球菌(Enterococcusfaecium)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:8编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:9编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:10编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，65％，或60％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:11编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由Rhodococcusimtechensis磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:12编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:13编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:14编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，65％，或60％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:15编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，65％，或60％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:16编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:17编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由链霉菌属(Streptomycessp.)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:18编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:19编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:20编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由蓝丝菌属(Cyanothecesp.)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:21编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，65％，或60％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:22编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由屎肠球菌(Enterococcusfaecium)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:23编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由格氏李斯特菌(Listeriagrayi)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:24编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:25编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:26编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:27编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:28编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:29编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:30编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:31编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:32编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:33编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由格氏链球菌(Streptococcusgordonii)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:34编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由口金氏菌(Kingellaoralis)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:35编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由发酵支原体(Mycoplasmafermentans)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:36编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:37编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由人支原体(Mycoplasmahominis)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:38编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:39编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:40编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由Eremococcuscoleocola磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:41编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由脲气球菌(Aerococcusurinae)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:42编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由金格杆菌(Kingellakingae)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:43编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:44编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:45编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:46编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，70％，或65％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:47编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:48编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:49编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:50编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽可具有与由双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)磷酸解酮酶氨基酸序列SEQIDNO:51编码的磷酸解酮酶多肽至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，80％，75％，或70％的序列同一性。
可用于本文的磷酸解酮酶的附加示例描述于美国专利7,785,858和WO2011/159853中，它们以引用方式并入本文，尤其是针对关于磷酸解酮酶的所有公开。
在一些方面，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含编码如本文所述具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列。在一些实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它方面，具有磷酸解酮酶活性的多肽分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它方面，具有磷酸解酮酶活性的多肽分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在其它方面，具有磷酸解酮酶活性的多肽分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。
在本文任何实施例中，重组细胞还可经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：它们选自5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，重组细胞还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
使用重组细胞产生增量乙酰-CoA和乙酰-衍生代谢物的方法
本文还提供了产生乙酰-CoA的方法。在一些方面，产生乙酰-CoA的方法包括：(a)培养包含能够产生乙酰-CoA的重组细胞或其子代的组合物，该重组细胞已经经工程化以提高通过如本文所述的磷酸解酮酶途径的碳通量(包括上文所述的任何重组细胞)；以及(b)产生甲羟戊酸。在一些方面，产生乙酰-CoA的方法包括以下步骤：在适于产生乙酰-CoA的条件下培养本文所述的任何重组细胞，以及允许重组细胞产生乙酰-CoA。在一些方面，产生乙酰-CoA的方法还包括回收乙酰-CoA的步骤。
如本文所述，产生乙酰-CoA的方法包括以下步骤：(a)培养不内源表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该细胞异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝；以及(b)产生乙酰-CoA。在某些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的任何生物体。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们鉴定自如实例7所述的体内筛选测定。另外，当细胞在基本培养基中培养时，重组细胞可产生的乙酰-CoA浓度大于缺失一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源基因拷贝的相同细胞的乙酰-CoA浓度，该异源基因来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在某些实施例中，本文所述的一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝是整合到宿主细胞染色体中的异源核酸。
本文还提供了产生乙酰-CoA衍生代谢物的方法。在一些方面，产生乙酰-CoA衍生代谢物的方法包括：(a)培养包含能够产生乙酰-CoA衍生代谢物的重组细胞或其子代的组合物，该重组细胞已经经工程化以提高通过如本文所述的磷酸解酮酶途径的碳通量(包括上文所述的任何重组细胞)；以及(b)产生甲羟戊酸。在一些方面，产生乙酰-CoA衍生代谢物的方法包括以下步骤：在适于产生乙酰-CoA衍生代谢物的条件下培养本文所述的任何重组细胞，以及允许重组细胞产生乙酰-CoA衍生代谢物。在一些方面，产生乙酰-CoA的方法还包括回收乙酰-CoA衍生代谢物的步骤。
如本文所述，产生乙酰-CoA衍生代谢物的方法包括以下步骤：(a)培养不内源表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该细胞异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝；以及(b)产生乙酰-CoA衍生代谢物。在某些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的任何生物体。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们鉴定自如实例7所述的体内筛选测定。另外，当细胞在基本培养基中培养时，重组细胞可产生的乙酰-CoA衍生代谢物浓度大于缺失一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源基因拷贝的相同细胞的乙酰-CoA浓度，该异源基因来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在某些实施例中，本文所述的一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝是整合到宿主细胞染色体中的异源核酸。
在本文任何实施例中，乙酰CoA-衍生代谢物可为聚酮化合物、聚羟基丁酸酯、脂肪醇和脂肪酸中的一种或多种。在本文任何实施例中，乙酰CoA-衍生代谢物可为选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的一种或多种氨基酸。在一些实施例中，乙酰-CoA-衍生代谢物是琥珀酸。在本文任何实施例中，乙酰CoA-衍生代谢物可为丙酮、异丙醇、异丁烯、或丙烯中的一种或多种。
本文也提供了产生乙酰-CoA-衍生代谢物的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，以及产生所述乙酰-CoA-衍生代谢物。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
另外，本文提供了产生乙酰-CoA-衍生代谢物的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性，以及产生所述乙酰-CoA-衍生代谢物。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文还提供了产生乙酰-CoA-衍生代谢物的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，以及产生所述乙酰-CoA-衍生代谢物。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文提供了产生乙酰-CoA-衍生代谢物的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性，以及产生所述乙酰-CoA-衍生代谢物。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
表达磷酸解酮酶多肽和MVA途径的一种或多种多肽的重组细胞
依赖甲羟戊酸的生物合成途径(MVA途径)是存在于所有高等真核生物和某些细菌中的关键代谢途径。除了对用于多个不同过程如蛋白质异戊二烯化、细胞膜维持、蛋白质锚固和N-糖基化的分子制备重要之外，甲羟戊酸途径还提供类异戊二烯前体分子DMAPP和IPP的主要来源，它们用作生物合成萜、类萜、类异戊二烯和异戊二烯的基础。
完整的MVA途径可细分成两类：上游途径和下游途径。在MVA途径的上游部分，在细胞代谢期间产生的乙酰Co-A经由多肽作用转化成甲羟戊酸，该多肽具有：(a)(i)硫解酶活性或(ii)乙酰乙酰-CoA合酶活性，(b)HMG-CoA还原酶活性，和(c)HMG-CoA合酶活性。首先，乙酰Co-A经由硫解酶或乙酰乙酰-CoA合酶(其利用乙酰-CoA和丙二酰-CoA)的作用转化成乙酰乙酰CoA。接下来，乙酰乙酰-CoA通过HMG-CoA合酶活性的酶作用转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)。这种Co-A衍生物由HMG-CoA还原酶还原成甲羟戊酸，它是类异戊二烯产生的甲羟戊酸途径的限速步骤。在下游MVA途径，甲羟戊酸随后经由甲羟戊酸激酶的作用转化成甲羟戊酸-5-磷酸，其随后通过磷酸甲羟戊酸激酶的酶活性转化成5-二磷酸甲羟戊酸。最后，IPP通过甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶的酶活性由5-二磷酸甲羟戊酸形成。
因此，在某些实施例中，本发明的重组细胞是具有经由MVA途径产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯能力的重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码能够由5-磷酸木酮糖合成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸的磷酸解酮酶的异源基因，(ii)编码一种或多种MVA多肽的一种或多种异源基因，和(iii)涉及甲羟戊酸、类异戊二烯前体、或异戊二烯或类异戊二烯生物合成的一种或多种异源基因，其使得宿主细胞能够由乙酰乙酰-CoA合成甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯。在其它实施例中，本发明的重组细胞是具有产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯能力的重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码能够由6-磷酸果糖合成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸的磷酸解酮酶的异源基因，(ii)编码一种或多种MVA多肽的一种或多种异源基因，和(iii)涉及甲羟戊酸、类异戊二烯前体、或异戊二烯或类异戊二烯生物合成的一种或多种异源基因，其使得宿主细胞能够由乙酰乙酰-CoA合成甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯。
上游MVA途径多肽
MVA途径的上游部分利用在细胞代谢期间产生的乙酰Co-A作为初始底物，经由多肽作用转化成甲羟戊酸，该多肽具有：(a)(i)硫解酶活性或(ii)乙酰乙酰-CoA合酶活性，(b)HMG-CoA还原酶活性，和(c)HMG-CoA合酶活性。首先，乙酰Co-A经由硫解酶或乙酰乙酰-CoA合酶(其利用乙酰-CoA和丙二酰-CoA)的作用转化成乙酰乙酰CoA。接下来，乙酰乙酰-CoA通过HMG-CoA合酶的酶作用转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)。这种Co-A衍生物由HMG-CoA还原酶还原成甲羟戊酸，它是类异戊二烯产生的甲羟戊酸途径的限速步骤。
上游MVA途径多肽的非限制性示例包括乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、乙酰乙酰-CoA合酶多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽。上游MVA途径多肽可包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种上游MVA途径多肽的活性。示例性上游MVA途径核酸包括编码具有至少一种上游MVA途径多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括天然存在的多肽和核酸，它们来自本文所述的任何来源的生物体。因此，本文预期编码上游MVA途径多肽的任何基因可用于本发明。
在某些实施例中，设想来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的不同选项的mvaE和mvaS基因单独或与编码来自上游MVA途径蛋白质的一种或多种其它mvaE和mvaS基因的组合在本发明的范围内。在其它实施例中，设想乙酰乙酰-CoA合酶基因与一种或多种其它基因的组合在本发明的范围之内，它们编码：(i)3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽。因此，在某些方面，设想的任何基因组合可以本文所述的任何方式在重组细胞中表达。
本文可使用的上游MVA途径多肽附加的非限制性示例描述于国际专利申请公布WO2009/076676；WO2010/003007和WO2010/148150中。
编码mvaE和mvaS多肽的基因
在某些实施例中，设想来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的不同选项的mvaE和mvaS基因单独或与编码来自上游MVA途径蛋白质的一种或多种其它mvaE和mvaS基因的组合在本发明的范围内。在格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和粪肠球菌(E.faecalis)中，mvaE基因编码具有硫解酶和HMG-CoA还原酶活性的多肽。事实上，mvaE基因产物提供存在于真细菌中的IPP生物合成的第一双官能酶和天然融合到另一蛋白质上的HMG-CoA还原酶的第一示例(Hedl等人，JBacteriol.2002年4月；184(8):2116-2122)。另一方面，mvaS基因编码具有HMG-CoA合酶活性的多肽。
因此，重组细胞(例如大肠杆菌(E.coli))可经工程化以表达来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的一种或多种mvaE和mvaS基因，用于产生甲羟戊酸。一种或多种mvaE和mvaS基因可在多拷贝质粒上表达。质粒可为高拷贝质粒、低拷贝质粒、或中拷贝质粒。另选地，一种或多种mvaE和mvaS基因可整合到宿主细胞染色体中。对于一种或多种mvaE和mvaS基因在质粒上或作为宿主细胞染色体整合部分的异源表达，基因表达可由诱导型启动子或组成型表达启动子驱动。启动子可为一种或多种mvaE和mvaS基因的强表达驱动启动子，它可为弱表达驱动启动子，或者它可为中表达驱动启动子。
示例性mvaE多肽和核酸
mvaE基因编码具有硫解酶和HMG-CoA还原酶活性的多肽。由mvaE基因编码的多肽的硫解酶活性将乙酰Co-A转化成乙酰乙酰CoA，而多肽的HMG-CoA还原酶活性将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化成甲羟戊酸。示例性mvaE多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸，以及来源于本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸，它们具有至少一种mvaE多肽活性。
突变型mvaE多肽包括其中一个或多个氨基酸残基已经发生氨基酸取代，然而保留了mvaE多肽活性(即，将乙酰Co-A转化成乙酰乙酰CoA的能力以及将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化成甲羟戊酸的能力)的那些多肽。氨基酸取代可为保守取代或非保守取代，并且此类取代氨基酸残基可为或可不为由遗传密码编码的残基。标准的二十个氨基酸“字母表”已被基于它们的侧链相似性分为化学家族。那些家族包括带有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学相似侧链的氨基酸残基取代的取代(即，用另一个具有碱性侧链的氨基酸取代具有碱性侧链的氨基酸)。“非保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学不同侧链的氨基酸残基取代的取代(即，用另一个具有芳族侧链的氨基酸取代具有碱性侧链的氨基酸)。
可在mvaE多肽中引入氨基酸取代以改善分子功能。例如，氨基酸取代提高mvaE多肽与其底物的结合亲和力，或者改善其将乙酰Co-A转化成乙酰乙酰CoA的能力和/或将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化成甲羟戊酸的能力，可将该取代引入mvaE多肽。在一些方面，突变型mvaE多肽包含一个或多个保守氨基酸取代。
在一个方面，不降解或不易于降解的mvaE蛋白质可用于产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯。可使用的不降解或不易于降解的mvaE基因产物的示例包括但不限于来自生物体屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)、粪肠球菌(E.faecalis)和格雷氏李斯特菌(L.grayi)的那些。本领域的技术人员可在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中表达mvaE蛋白质，并且通过任何标准分子生物学技术寻找缺失的片段。例如，可在Safestain染色的SDS-PAGE凝胶上鉴定缺失片段，随后进行His-标记介导的纯化，或者当在产生甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的大肠杆菌(E.coli)BL21中表达时，使用本文所述的检测方法。
标准方法，例如Hedl等人所述的那些(JBacteriol.2002年4月；184(8):2116–2122)，可通过测量乙酰乙酰-CoA硫解酶以及HMG-CoA还原酶的活性，用于测定是否多肽具有mvaE活性。在一个示例性测定中，乙酰乙酰-CoA硫解酶活性通过分光光度计进行测量以监测302nm的吸光度变化，其伴随着乙酰乙酰-CoA的形成或硫解而变化。用于测定乙酰乙酰-CoA合成的每个反应的标准测定条件为1mM乙酰-CoA，10mMMgCl2，50mMTris，pH10.5，并且反应通过加入酶而启动。测定可使用200μl的最终体积。对于测定，1个酶单位(eu)代表1分钟内合成或硫解1μmol乙酰乙酰-CoA。在另一个示例性测定中，HMG-CoA还原酶活性可通过用分光光度计监测340nm处NADP(H)的出现或消失来监测。测量示出HMG-CoA还原脱酰成甲羟戊酸的每个反应的标准测定条件为0.4mMNADPH，1.0mM(R,S)-HMG-CoA，100mMKCl，和100mMKxPO4，pH6.5。测定使用200μl的最终体积。反应通过加入酶来启动。对于测定，1eu代表在1分钟内代谢周转了1μmolNADP(H)。这对应于代谢周转0.5μmolHMG-CoA或甲羟戊酸。
另选地，可非限制地通过气相色谱法(参见美国专利申请公布：US2005/0287655A1)或HPLC(参见美国专利申请公布：2011/0159557A1)测量重组细胞中的甲羟戊酸产量。作为示例性测定，可将培养物接种到包含补充有一种或多种抗生素的LB发酵液的振荡管中，并且在34℃下以250rpm培养14h。接下来，将培养物稀释到带孔板中至最终OD为0.2，板中包含TM3培养基，其补充有1％葡萄糖，0.1％酵母提取物，和200μMIPTG。板随后用BreathEasier膜(DiversifiedBiotech)密封并在34℃，在摇动器/培养箱中以600rpm培养24小时。1mL各种培养物随后以3,000×g离心5分钟。随后将上清液加到20％硫酸中，并在冰上培养5分钟。然后将混合物以3000×g离心5分钟，并且收集上清液用于HPLC分析。样品中的甲羟戊酸浓度通过与甲羟戊酸(Sigma)标准曲线的比较进行测定。可根据本领域已知的任何方法测定葡萄糖氧化酶，从而另外测量葡萄糖浓度。利用HPLC，可通过比较每个样品的折射率响应对运行各种包含已知浓度甲羟戊酸的溶液产生的校准曲线来定量甲羟戊酸浓度。
示例性mvaE核酸包括编码具有至少一种mvaE多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性mvaE多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸，以及来源于本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸。示例性mvaE核酸包括例如分离自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)DSM20601、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)EG2、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和/或铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)的mvaE核酸。由格氏李斯特菌(Listeriagrayi)DSM20601mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与SEQIDNO:95至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。由屎肠球菌(Enterococcusfaecium)mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与SEQIDNO:96至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。由鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)EG2mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与SEQIDNO:97至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。由铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与SEQIDNO:98至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。由粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与之前在大肠杆菌(E.coli)中公开用于产生甲羟戊酸的mvaE基因至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性(参见US2005/0287655A1；Tabata，K.和Hashimoto,S.-I.BiotechnologyLetters26:1487-1491，2004)。
mvaE核酸可在重组细胞中的多拷贝质粒上表达。质粒可为高拷贝质粒、低拷贝质粒、或中拷贝质粒。另选地，mvaE核酸可整合到宿主细胞染色体中。对于mvaE核酸在质粒上或作为宿主细胞染色体整合部分的异源表达，核酸表达可由诱导型启动子或组成型表达启动子驱动。启动子可为mvaE核酸的强表达驱动启动子，它可为弱表达驱动启动子，或者它可为中表达驱动启动子。
示例性mvaS多肽和核酸
mvaS基因编码具有HMG-CoA合酶活性的多肽。这种多肽可将乙酰乙酰CoA转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)。示例性mvaS多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸，以及来源于本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸，它们具有至少一种mvaS多肽活性。
突变型mvaS多肽包括其中一个或多个氨基酸残基已经发生氨基酸取代，然而保留了mvaS多肽活性(即，将乙酰乙酰CoA转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA的能力)的那些多肽。可在mvaS多肽中引入氨基酸取代以改善分子功能。例如，氨基酸取代提高mvaS多肽与其底物的结合亲和力，或者改善其将乙酰乙酰CoA转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA的能力，可将该取代引入mvaS多肽。在一些方面，突变型mvaS多肽包含一个或多个保守氨基酸取代。
标准方法，例如Quant等人所述的那些(BiochemJ.，1989，262:159-164)，可通过测量HMG-CoA合酶活性用于测定是否多肽具有mvaS活性。在示例性测定中，HMG-CoA合酶活性可通过分光光度曲线进行测定，该方法通过监测303nm处的吸光度变化来测量烯醇形式的乙酰乙酰-CoA的消失。标准的1mL测定体系包含50mm-Tris/HCl，pH8.0，10mM-MgCl2和0.2mM-二硫苏糖醇，温度为30℃；并且可加入5mM-乙酰磷酸，10,M-乙酰乙酰-CoA和5μ1提取物样品，随后同时加入乙酰-CoA(100μM)和10单位PTA。随后将HMG-CoA合酶活性测量为加入乙酰-CoA之前和之后的速率差值。在使用条件下的乙酰乙酰-CoA的吸收系数(pH8.0，10mM-MgCl2)为12.2×103M-1cm-1。根据定义，1单位酶活性导致每分钟1μMol乙酰乙酰-CoA被转化。
另选地，可非限制地通过气相色谱法(参见美国专利申请公布：US2005/0287655A1)或HPLC(参见美国专利申请公布：2011/0159557A1)测量重组细胞中的甲羟戊酸产量。作为示例性测定，可将培养物接种到包含补充有一种或多种抗生素的LB发酵液的振荡管中，并且在34℃下以250rpm培养14h。接下来，将培养物稀释到带孔板中至最终OD为0.2，板中包含TM3培养基，其补充有1％葡萄糖，0.1％酵母提取物，和200μMIPTG。板随后用BreathEasier膜(DiversifiedBiotech)密封并在34℃，在摇动器/培养箱中以600rpm培养24小时。1mL各种培养物随后以3,000×g离心5分钟。随后将上清液加到20％硫酸中，并在冰上培养5分钟。然后将混合物以3000×g离心5分钟，并且收集上清液用于HPLC分析。样品中的甲羟戊酸浓度通过与甲羟戊酸(Sigma)标准曲线的比较进行测定。可根据本领域已知的任何方法测定葡萄糖氧化酶，从而另外测量葡萄糖浓度。利用HPLC，可通过比较每个样品的折射率响应对运行各种包含已知浓度甲羟戊酸的溶液产生的校准曲线来定量甲羟戊酸浓度。
示例性mvaS核酸包括编码具有至少一种mvaS多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性mvaS多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸，以及来源于本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸。示例性mvaS核酸包括例如分离自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)DSM20601、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)EG2、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和/或铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)的mvaS核酸。由格氏李斯特菌(Listeriagrayi)DSM20601mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与SEQIDNO:99至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。由屎肠球菌(Enterococcusfaecium)mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与SEQIDNO:100至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。由鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)EG2mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与SEQIDNO:101至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。由铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与SEQIDNO:102至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性。由粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与之前在大肠杆菌(E.coli)中公开用于产生甲羟戊酸的mvaE基因至少约99％，98％，97％，96％，95％，95％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，或85％的序列同一性(参见US2005/0287655A1；Tabata，K.和Hashimoto,S.-I.BiotechnologyLetters26:1487-1491，2004)。
mvaS核酸可在重组细胞中的多拷贝质粒上表达。质粒可为高拷贝质粒、低拷贝质粒、或中拷贝质粒。另选地，mvaS核酸可整合到宿主细胞染色体中。对于mvaS核酸在质粒上或作为宿主细胞染色体整合部分的异源表达，核酸表达可由诱导型启动子或组成型表达启动子驱动。启动子可为mvaS核酸的强表达驱动启动子，它可为弱表达驱动启动子，或者它可为中表达驱动启动子。
乙酰乙酰-CoA合酶基因
乙酰乙酰-CoA合酶基因(akanphT7)是编码具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的活性并具有由两个乙酰-CoA分子合成乙酰乙酰-CoA的最小活性(例如无活性)的酶的基因。参见例如Okamura等人，PNAS第107卷，第25期，第11265-11270页(2010)，其内容明确地并入本文中，用于教导nphT7。来自放线菌类链霉菌(Streptomyces)CL190菌株的乙酰乙酰-CoA合酶基因描述于日本专利公布(Kokai)2008-61506A和US2010/0285549中。乙酰乙酰-CoA合酶也可称为乙酰CoA：丙二酰CoA乙酰转移酶。可使用的代表性乙酰乙酰-CoA合酶(或乙酰CoA：丙二酰CoA乙酰转移酶)是GenbankAB540131.1。
在本文所述实施例的任何方面，可使用具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的能力的酶。此种酶的非限制性示例如本文所述。在本文所述的某些实施例中，可使用乙酰乙酰-CoA合酶基因，其来源于放线菌类链霉菌(Streptomyces)，具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的活性。此种乙酰乙酰-CoA合酶基因的一个示例是编码具有氨基的蛋白质的基因。此种具有氨基酸序列SEQIDNO:103的蛋白质对应于具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的活性并且不具有由两个乙酰-CoA分子合成乙酰乙酰-CoA活性的乙酰乙酰-CoA合酶。
在一个实施例中，编码具有氨基酸序列SEQIDNO:103的蛋白质的基因可通过核酸扩增方法(例如PCR)获得，该方法利用获取自放线菌类链霉菌属(Streptomycessp.)CL190菌株的基因组DNA作为模板和可参考日本专利公布(Kokai)2008-61506A设计的一对引物。
如本文所述，用于本发明的乙酰乙酰-CoA合酶基因不限于编码具有氨基酸序列SEQIDNO:103的蛋白质的基因，其来自放线菌类链霉菌属(Streptomycessp.)CL190菌株。编码具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的能力、并且无由两个乙酰-CoA分子合成乙酰乙酰-CoA的能力的蛋白质的任何基因可用于本文描述的方法。在某些实施例中，乙酰乙酰-CoA合酶基因可为编码具有氨基酸序列的蛋白质的基因，该氨基酸序列与氨基酸序列SEQIDNO:103具有高度相似性或基本上与其相同，并且该蛋白质具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的功能。表达“高度相似的”或“基本上相同的”是指，例如，至少约80％的同一性，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，和至少约99％的同一性。如上文所用，同一性值对应于在不同氨基酸序列和氨基酸序列SEQIDNO:103之间的氨基酸残基的同一性百分比，其通过进行氨基酸序列SEQIDNO:103与不同氨基酸序列的比对进行计算，并且使用程序搜索序列相似性。
在其它实施例中，乙酰乙酰-CoA合酶基因可为编码具有氨基酸序列的蛋白质的基因，该氨基酸序列来源于发生1个或多个氨基酸取代、删除、添加、或插入的氨基酸序列SEQIDNO:103，并且该蛋白质具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的功能。本文表达“多个氨基酸”是指例如2至30个氨基酸，优选地2至20个氨基酸，更优选地2至10个氨基酸，并且最优选地2至5个氨基酸。
在其它实施例中，乙酰乙酰-CoA合酶基因可由能够在严格条件下杂交至一部分或全部具有编码氨基酸序列SEQIDNO:103的核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸组成，并且该多核苷酸能够编码具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的功能的蛋白质。本文在严格条件下的杂交对应于在60℃用SSC洗涤两次的条件下保持结合。杂交可通过常规已知方法进行，例如描述于J.Sambrook等人，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第3版，ColdSpringHarborLaboratory(2001)中的方法。
如本文所述，编码乙酰乙酰-CoA合酶的基因具有不同于氨基酸序列SEQIDNO:103的氨基酸序列，该基因可潜在分离自任何生物体，例如非得自链霉菌属(Streptomycessp.)CL190菌株的放线菌。此外，用于本文的乙酰乙酰-CoA合酶基因可通过本领域已知方法修饰编码氨基酸序列SEQIDNO:103的多核苷酸获得。核苷酸序列的诱变可通过已知方法进行，例如Kunkel方法或缺口双链体方法或类似于以上任一种的方法。例如，诱变可利用诱变试剂盒(例如产品名称；Mutant-K和Mutant-G(TAKARABio))进行定点诱变，产品名称；LAPCR体外诱变系列试剂盒(TAKARABio)等。
具有不同于氨基酸序列SEQIDNO:103的氨基酸序列的乙酰乙酰-CoA合酶活性可如下所述进行评估。具体地，将编码待评估蛋白质的基因首先引入宿主细胞，使得该基因可在该处表达，随后通过例如色谱法的技术纯化蛋白质。加入丙二酰-CoA和乙酰-CoA到缓冲液中作为底物，缓冲液包含待评估的蛋白质，随后例如在期望温度下(例如10℃至60℃)孵育。在反应完成后，测定底物损耗量和/或产生的产物(乙酰乙酰-CoA)量。因此，评估测试蛋白质是否具有由丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的功能及评估合成程度是可能的。在这种情况下，通过单独加入乙酰-CoA到缓冲液中作为底物并且测定底物损耗量和/或以相似方式产生的产物量来检查该蛋白质是否具有由两个乙酰-CoA分子合成乙酰乙酰-CoA的活性是可能的，缓冲液包含待评估的获取蛋白质。
能够提高甲羟戊酸产量的重组细胞
本文所述的重组细胞(例如重组细菌细胞)可产生甲羟戊酸，其产生量和/或浓度大于对本文所述的各种酶途径无任何操纵的相同细胞。因此，已经经工程化以调节本文所述的各种途径的重组细胞(例如细菌细胞)可用于提高甲羟戊酸产量。
因此，在某些方面，本发明提供能够提高甲羟戊酸产量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和编码一种或多种以上MVA途径的多肽的一种或多种核酸，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，产生增量的甲羟戊酸。
在某些方面，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的任何生物体。
在一个实施例中，重组细胞还包含一个或多个拷贝的异源核酸，其编码来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE和mvaS多肽。在另一个实施例中，重组细胞还包含乙酰乙酰-CoA合酶和编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸。
在一个实施例中，重组细胞还可经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：它们选自5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，重组细胞还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在一个方面，本文所述的重组细胞可以比缺失一个或多个编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸拷贝的相同细胞更高的体积生产率产生甲羟戊酸。在某些实施例中，重组细胞可产生大于2.00g/L/hr的甲羟戊酸。另选地，重组细胞可产生大于约1.0g/L/hr，1.2g/L/hr，1.4g/L/hr，1.6g/L/hr，1.8g/L/hr，2.0g/L/hr，2.2g/L/hr，2.4g/L/hr，2.6g/L/hr，2.8g/L/hr，3.0g/L/hr，3.2g/L/hr，3.4g/L/hr，3.6g/L/hr，3.8g/L/hr，4.0g/L/hr，4.2g/L/hr，4.4g/L/hr，4.6g/L/hr，4.8g/L/hr，5.0g/L/hr，5.2g/L/hr，5.4g/L/hr，5.6g/L/hr，5.8g/L/hr，6.0g/L/hr的甲羟戊酸，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。
在一个方面，本文所述的重组细胞可以比缺失一个或多个编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸拷贝的相同细胞更高的滴度产生甲羟戊酸。这些重组细胞在发酵48小时后可产生大于约100g/L的甲羟戊酸峰值滴度。另选地，重组细胞在发酵48小时后可产生大于约50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L，150g/L，160g/L，170g/L，180g/L，190g/L，200g/L，210g/L，220g/L，230g/L，240g/L，250g/L，260g/L，270g/L，280g/L，290g/L，300g/L的甲羟戊酸峰值滴度，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。
在其它实施例中，本文所述的重组细胞还包含一个或多个突变，它们增加朝向MVA途径的碳通量，并且因此可产生比尚未进行相似工程化的细胞更高滴度的甲羟戊酸。在此类实施例中，本文所述的重组细胞可以比缺失一个或多个编码具有磷酸解酮酶活性的磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝的相同细胞更高的峰值滴度产生甲羟戊酸。在一个实施例中，重组细胞还可经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：它们选自5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，重组细胞还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在一个方面，本文所述的重组细胞可以比缺失一个或多个编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸拷贝的相同细胞更高的甲羟戊酸细胞生产率指数(CPI)产生甲羟戊酸。重组细胞可具有至少约3.0(g/g)的甲羟戊酸CPI。另选地，重组细胞可具有至少约1(g/g)，2(g/g)，3(g/g)，4(g/g)，5(g/g)，6(g/g)，7(g/g)，8(g/g)，9(g/g)，10(g/g)，11(g/g)，12(g/g)，13(g/g)，14(g/g)，15(g/g)，20(g/g)，25(g/g)，或30(g/g)的甲羟戊酸CPI，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。
在某些实施例中，本文所述的重组细胞还包含一个或多个突变，它们增加朝向MVA途径的碳通量，导致比尚未进行相似工程化的细胞更高的甲羟戊酸细胞生产率指数(CPI)。另外，本文所述的重组细胞具有比缺失一个或多个编码具有磷酸解酮酶活性的磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝的相同细胞更高的CPI。在一个实施例中，重组细胞还可经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：它们选自5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，这些重组细胞还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
另外，本文所述的细胞具有比缺失一个或多个编码具有磷酸解酮酶活性的磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝的相同细胞更高的由葡萄糖产生甲羟戊酸的质量收率。重组细胞可具有至少约28％的由葡萄糖产生甲羟戊酸的质量收率。另选地，重组细胞可具有至少约25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，或55％的由葡萄糖产生甲羟戊酸的质量收率，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。
在某些实施例中，本文所述的重组细胞还包含一个或多个突变，它们增加朝向MVA途径的碳通量，导致比尚未进行相似工程化的细胞更高的甲羟戊酸质量收率。另外，本文所述的重组细胞具有比缺失一个或多个编码具有磷酸解酮酶活性的磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝的相同细胞更高的甲羟戊酸质量收率。在一个实施例中，重组细胞还可经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：它们选自5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，这些重组细胞还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在一个方面，本文所述的重组细胞产生甲羟戊酸，同时在发酵液中积聚比缺失一个或多个编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸拷贝的相同细胞更少的乙酸。经48小时发酵后，重组细胞可产生增量的甲羟戊酸，同时在发酵液中积聚小于4.5g/L的乙酸。另选地，经48小时发酵后重组细胞可产生增量的甲羟戊酸，其在发酵液中积聚小于约8.0g/L，7.5g/L，7.0g/L，6.5g/L，6.0g/L，5.5g/L，5.0g/L，4.5g/L，4.0g/L，3.5g/L，3.0g/L，2.5g/L，2.0g/L，或1.5g/L的乙酸，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。在某些实施例中，在发酵液中减少的乙酸积聚可改善发酵期间的细胞活力。
在某些实施例中，本文所述的重组细胞还包含一个或多个突变，它们增加朝向MVA途径的碳通量，这导致比尚未进行相似工程化的细胞增量的甲羟戊酸，同时在发酵液中积聚更少的乙酸。在某些实施例中，在发酵液中减少的乙酸积聚可改善发酵期间的细胞活力。
本文也提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的甲羟戊酸生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
另外，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的甲羟戊酸生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文还提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的甲羟戊酸生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的甲羟戊酸生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
使用重组细胞产生增量甲羟戊酸的方法
本文还提供了产生甲羟戊酸的方法。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法包括：(a)培养包含能够产生甲羟戊酸的重组细胞或其子代的组合物，该重组细胞已经经工程化以提高通过如本文所述的磷酸解酮酶途径的碳通量(包括上文所述的任何重组细胞)；以及(b)产生甲羟戊酸。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法包括以下步骤：在适于产生甲羟戊酸的条件下培养本文所述的任何重组细胞，以及允许重组细胞产生甲羟戊酸。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
如本文所述，产生甲羟戊酸的方法包括以下步骤：(a)培养不内源表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该细胞异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生乙酰-CoA。在某些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的任何生物体。另外，当细胞在基本培养基中培养时，重组细胞可产生的甲羟戊酸浓度大于缺失一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源基因拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸的相同细胞的乙酰-CoA浓度，该异源基因来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在某些实施例中，编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个异源核酸拷贝是整合到宿主细胞染色体中的异源核酸，该异源核酸来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。
用于产生甲羟戊酸的本发明方法可利用具有大于2.00g/L/hr的甲羟戊酸体积生产率的细胞产生甲羟戊酸。另选地，重组细胞可产生大于约1.0g/L/hr，1.2g/L/hr，1.4g/L/hr，1.6g/L/hr，1.8g/L/hr，2.0g/L/hr，2.2g/L/hr，2.4g/L/hr，2.6g/L/hr，2.8g/L/hr，3.0g/L/hr，3.2g/L/hr，3.4g/L/hr，3.6g/L/hr，3.8g/L/hr，4.0g/L/hr，4.2g/L/hr，4.4g/L/hr，4.6g/L/hr，4.8g/L/hr，5.0g/L/hr，5.2g/L/hr，5.4g/L/hr，5.6g/L/hr，5.8g/L/hr，6.0g/L/hr的甲羟戊酸，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
在其它实施例中，产生甲羟戊酸的方法可包括以下步骤：(a)培养不内源表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该细胞异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生乙酰-CoA，其中该重组细胞在发酵48小时候后以比缺失一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源基因拷贝的相同细胞更高的峰值滴度产生甲羟戊酸。在某些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的生物体。
用于产生甲羟戊酸的本发明方法可利用在发酵48小时后能够产生大于约100g/L峰值滴度的甲羟戊酸的细胞产生甲羟戊酸。另选地，重组细胞在发酵48小时后可产生大于约50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L，150g/L，160g/L，170g/L，180g/L，190g/L，200g/L，210g/L，220g/L，230g/L，240g/L，250g/L，260g/L，270g/L，280g/L，290g/L，300g/L的甲羟戊酸峰值滴度，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
在其它实施例中，产生甲羟戊酸的方法可包括以下步骤：(a)培养不内源表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该细胞异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生乙酰-CoA，其中该重组细胞具有高于缺失一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源基因拷贝的相同细胞的甲羟戊酸CPI。在某些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的生物体。
用于产生甲羟戊酸的本发明方法可利用具有至少约3.0(g/g)的甲羟戊酸CPI的细胞产生甲羟戊酸。另选地，重组细胞可具有至少约1(g/g)，2(g/g)，3(g/g)，4(g/g)，5(g/g)，6(g/g)，7(g/g)，8(g/g)，9(g/g)，10(g/g)，11(g/g)，12(g/g)，13(g/g)，14(g/g)，15(g/g)，20(g/g)，25(g/g)，或30(g/g)的甲羟戊酸CPI，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
在某些实施例中，产生甲羟戊酸的方法可包括以下步骤：(a)培养不内源表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该细胞异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生甲羟戊酸，其中该重组细胞显示比缺失一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源基因拷贝的相同细胞更低的摄氧速率(OUR)。在某些实施例中，表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个异源基因拷贝的重组细胞显示比不表达磷酸解酮酶的重组细胞高达1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或7倍的OUR降低。
本文提供了利用任何上述细胞用于提高的甲羟戊酸产量的方法。细胞的甲羟戊酸产量可通过表达编码磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源核酸得到提高。在某些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的生物体。
甲羟戊酸产量与通过不表达编码磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源核酸的甲羟戊酸生产细胞的甲羟戊酸产量相比可提高约1,000,000倍(例如约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞已经进一步经工程化以增加MVA生产的碳通量。在某些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的生物体。
在其它方面，本文所述方法可提供提高的甲羟戊酸产量，该产量与通过不表达编码磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源核酸的甲羟戊酸生产细胞的甲羟戊酸产量相比可提高至少约以下任何倍数：5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，500倍，1000倍，2000倍，5000倍，10,000倍，20,000倍，50,000倍，100,000倍，200,000倍，500,000倍，或1,000,000倍。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞已经进一步经工程化以增加MVA生产的碳通量。
此外，可利用较具体的细胞培养条件在本文所述方法中培养细胞。例如，在一些方面，用于产生甲羟戊酸的方法包括以下步骤：(a)在34℃基本培养基中培养不内源具有磷酸解酮酶基因的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该重组细胞在低至中拷贝质粒上并且在强启动子的控制下异源表达一个或多个编码磷酸解酮酶的异源基因拷贝；以及(b)产生甲羟戊酸。在某些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的生物体。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
本文也提供了产生甲羟戊酸的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，以及产生所述甲羟戊酸。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
另外，本文提供了产生甲羟戊酸的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性，以及产生所述甲羟戊酸。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文还提供了产生甲羟戊酸的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，以及产生所述甲羟戊酸。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文提供了产生甲羟戊酸的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码上游MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性，以及产生所述甲羟戊酸。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
能够产生异戊二烯的重组细胞
异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是一种重要的有机化合物，广泛用于多种用途。例如，使用异戊二烯作为多种化学组合物和聚合物合成的中间体或原料，包括合成橡胶制备。异戊二烯也是由多种植物和动物天然合成的重要生物材料。
异戊二烯通过异戊二烯合酶的酶作用产自DMAPP。因此，不受理论的约束，认为通过任何上述组合物和方法提高具有甲羟戊酸途径的重组细胞中E4P、GAP、Ac-P和/或乙酰-CoA的细胞产量将同样得到更高的异戊二烯产量。当结合用于异戊二烯和类异戊二烯产生的合适的甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯二磷酸异构酶(例如下游MVA途径)和其它合适的酶的酶活性水平时，提高葡萄糖产生甲羟戊酸的摩尔收率转换为更高的葡萄糖产生类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的摩尔收率。
如本文所述，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和(i)编码完整MVA途径(即，上游MVA途径和下游MVA途径)的一种或多种多肽的一种或多种核酸；和(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中该细胞能够产生可回收量的异戊二烯。在某些实施例中，本发明能够提高异戊二烯产量的重组细胞，其中该细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸和(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；和(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中该细胞与不包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的异戊二烯产生细胞相比，产生增量的异戊二烯。
异戊二烯的产生也可通过使用本文所述的任何重组宿主细胞来完成，该重组宿主细胞还包含一种或多种酶途径操纵，其中调节酶活性以提高朝向甲羟戊酸产生和随后的类异戊二烯前体、类异戊二烯和/或异戊二烯产生的碳流。本文所述的重组细胞具有各种酶途径，其经操纵以提高通过磷酸解酮酶途径的碳流以产生可用于甲羟戊酸产生和随后的类异戊二烯前体、类异戊二烯和/或异戊二烯产生的乙酰-CoA。在一个实施例中，重组细胞还可经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：它们选自5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，这些重组细胞还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
编码下游MVA途径多肽的核酸
在本发明的一些方面，在本文所述的任何组合物或方法中描述的细胞还包含编码下游甲羟戊酸(MVA)途径多肽的一种或多种核酸。在一些方面，下游MVA途径多肽是内源多肽。在一些方面，编码下游MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码下游MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码下游MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至强启动子。在一个特定方面，相对于野生型细胞，该细胞经工程化以过表达内源下游MVA途径多肽。在一些方面，编码下游MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至弱启动子。
下游甲羟戊酸生物合成途径包含甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)。在一些方面，下游MVA途径还可包含异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。本文提供的细胞可包含至少一种编码异戊二烯合酶、一种或多种上游MVA途径多肽和/或一种或多种下游MVA途径多肽的核酸。下游MVA途径的多肽可为(a)使甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸；(b)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸；和(c)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的任何酶。更具体地，使甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶可来自马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶、乳杆菌(Lactobacillus)甲羟戊酸激酶多肽、沙克乳杆菌(Lactobacillussakei)甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲羟戊酸激酶多肽、链球菌(Streptococcus)甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)CL190甲羟戊酸激酶多肽和布氏拟甲烷球菌(M.Burtonii)甲羟戊酸激酶多肽。在另一方面，使甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶是马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶。
在一些方面，下游MVA途径多肽是异源多肽。在一些方面，细胞包含一个以上的编码下游MVA途径多肽的异源核酸拷贝。在一些方面，编码下游MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码下游MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码下游MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子。在一些方面，编码下游MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至弱启动子。在一些方面，异源下游MVA途径多肽是来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、或马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)的多肽。
编码下游MVA途径多肽的核酸可整合到细胞基因组中或可在细胞中稳定表达。编码下游MVA途径多肽的核酸可另外在载体上。
下文也提供了示例性下游MVA途径多肽：(i)甲羟戊酸激酶(MVK)；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)；和(iv)异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。具体地，下游MVK多肽可来自菌属甲烷八叠球菌(Methanosarcina)以及更具体地，下游MVK多肽可来自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)。在一些实施例中，下游MVK多肽可来自布氏拟甲烷球菌(M.Burtonii)。下游MVA途径多肽的附加示例可见于美国专利申请公布2010/0086978，其内容针对下游MVK途径多肽和下游MVK途径多肽变体明确地全文以引用方式并入本文中。
下游MVA途径多肽包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种下游MVA途径多肽的活性。示例性下游MVA途径核酸包括编码具有至少一种下游MVA途径多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性下游MVA途径多肽和核酸包括天然存在的多肽和核酸，它们来自本文所述的任何来源的生物体。此外，也可使用提供较好的异戊二烯产量结果的下游MVA途径多肽变体。
在一些方面，下游MVA途径多肽是来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、或马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)的多肽。在一些方面，MVK多肽选自乳杆菌(Lactobacillus)甲羟戊酸激酶多肽、沙克乳杆菌(Lactobacillussakei)甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲羟戊酸激酶多肽、链球菌(Streptococcus)甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)CL190甲羟戊酸激酶多肽、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)甲羟戊酸激酶多肽和布氏拟甲烷球菌(M.Burtonii)甲羟戊酸激酶多肽。本文所述的任何一种启动子(例如本文所述并在本公开实例中鉴定的启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子)可用于驱动本文所述的任何MVA多肽的表达。
本文所述的任何一种细胞可包含IDI核酸(例如编码IDI的内源或异源核酸)。异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯二磷酸Δ-异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)与二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)的互相转化(例如将IPP转化成DMAPP和/或将DMAPP转化成IPP)。示例性IDI多肽包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种IDI多肽的活性。可使用标准方法(例如本文所述的那些方法)，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内互相转化IPP与DMAPP的能力，确定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性IDI核酸包括编码具有至少一种IDI多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性IDI多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸，以及来源于本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸。
编码异戊二烯合酶多肽的核酸
在本发明的一些方面，在本文所述的任何组合物或方法中描述的细胞(包括已经经工程化以提高通过如本文所述的磷酸解酮酶途径的碳通量的宿主细胞)还包含编码异戊二烯合酶多肽或具有异戊二烯合酶活性的多肽的一种或多种核酸。在一些方面，异戊二烯合酶是内源多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸可操作地连接至强启动子。在一个特定方面，相对于野生型细胞，该细胞经工程化以过表达内源异戊二烯合酶途径多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸可操作地连接至弱启动子。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂交体如银白杨x欧洲山杨(PopulusalbaxPopulustremula)的多肽。
在一些方面，异戊二烯合酶多肽是异源多肽。在一些方面，细胞包含一个以上的编码异戊二烯合酶途径多肽的异源核酸拷贝。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至弱启动子。
编码异戊二烯合酶多肽的核酸可整合到宿主细胞基因组中或可在细胞中稳定表达。编码异戊二烯合酶多肽的核酸可另外在载体上。
示例性异戊二烯合酶核酸包括编码具有至少一种异戊二烯合酶多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。异戊二烯合酶多肽将二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性异戊二烯合酶多肽包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种异戊二烯合酶多肽的活性。示例性异戊二烯合酶多肽和核酸包括天然存在的多肽和核酸，它们来自本文所述的任何来源的生物体。此外，异戊二烯合酶变体可具有改善的活性如改善的酶活性。在一些方面，异戊二烯合酶变体具有其它改善的特性，例如改善的稳定性(例如热稳定性)和/或改善的溶解度。
可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内将DMAPP转化成异戊二烯的能力，确定多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。可测量在细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性，例如如Silver等人，J.Biol.Chem.270:13010-13016，1995所述。在一个示例性测定中，DMAPP(Sigma)可在氮气流下蒸发至干燥并再水合至在pH8.2的100mM磷酸钾缓冲液中100mM的浓度，并且存储在-20℃。为了进行测定，将5μL1MMgCl2，1mM(250μg/ml)DMAPP，65μL植物提取缓冲液(PEB)(50mMTris-HCl，pH8.0，20mMMgCl2，5％甘油，和2mMDTT)的溶液加入在20mL顶部空间的小瓶中的25μL细胞提取物中，小瓶带有金属螺帽和特氟隆涂覆的硅膜(AgilentTechnologies)，并且37℃下振荡培养15分钟。反应可通过加入200μL250mMEDTA淬灭并通过GC/MS定量。
在一些方面，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是来自葛属(Pueraria)或其变体的异戊二烯合酶。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是来自杨属(Populus)或其变体的异戊二烯合酶。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是杨树异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是野葛(kudzu)异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂交体银白杨x欧洲山杨(PopulusalbaxPopulustremula)、或它们的变体的多肽。
在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸来自蝶形花科(Fabaceae)家族如蝶形花亚科(Faboideaesubfamily)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自山葛(Puerariamontana)(野葛(kudzu))(Sharkey等人，PlantPhysiology137:700-712，2005)、野葛(Puerarialobata)、杨树(如银白杨(Populusalba)、黑杨(Populusnigra)、毛果杨(Populustrichocarpa)、或银白杨x欧洲山杨(Populusalbaxtremula)(CAC35696)(Miller等人，Planta213:483-487，2001)、白杨(aspen)(如美洲山杨(Populustremuloides))(Silver等人，JBC270(22):13010-1316，1995)、英国橡树(EnglishOak)(夏栎(Quercusrobur))(Zimmer等人，WO98/02550)、或它们的变体的多肽或核酸。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是来自山葛(Puerariamontana)、野葛(Puerarialobata)、美洲山杨(Populustremuloides)、银白杨(Populusalba)、黑杨(Populusnigra)、或毛果杨(Populustrichocarpa)或它们的变体的异戊二烯合酶。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是来自银白杨(Populusalba)或其变体的异戊二烯合酶。在一些方面，编码异戊二烯合酶(例如来自银白杨(Populusalba)或其变体的异戊二烯合酶)的核酸是经密码子优化的。
在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是天然存在的多肽或核酸(例如来自杨属(Populus)的天然存在的多肽或核酸)。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型或天然存在的多肽或核酸。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核酸的变体(例如来自杨属(Populus)的野生型或天然存在的多肽或核酸的变体)。
在一些方面，异戊二烯合酶多肽是变体。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的活性如改善的催化活性。活性(例如催化活性)的提高可为至少约以下任何值：10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％。在一些方面，活性如催化活性的提高为至少约以下任何倍数：1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，75倍，或100倍。在一些方面，活性如催化活性的提高为约10％至约100倍(例如约20％至约100倍，约50％至约50倍，约1倍至约25倍，约2倍至约20倍，或约5倍至约20倍)。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的溶解度。溶解度的提高可为至少约以下任何值：10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％。在一些方面，溶解度的提高可为至少约以下任何倍数：1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，75倍，或100倍。在一些方面，溶解度的提高为约10％至约100倍(例如约20％至约100倍，约50％至约50倍，约1倍至约25倍，约2倍至约20倍，或约5倍至约20倍)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是天然存在的异戊二烯合酶变体，并且与天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的稳定性(例如热稳定性)。
在一些方面，变体具有至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约110％，至少约120％，至少约130％，至少约140％，至少约150％，至少约160％，至少约170％，至少约180％，至少约190％，至少约200％的野生型或天然存在的异戊二烯合酶的活性。变体可具有与野生型或天然存在的异戊二烯合酶的序列相似性。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体可具有与野生型或天然存在的异戊二烯合酶至少约以下任何值的氨基酸序列同一性：40％，50％，60％，70％，75％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，或99.9％。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合酶变体具有野生型或天然存在的异戊二烯合酶以下任何值的氨基酸序列同一性：约70％至约99.9％，约75％至约99％，约80％至约98％，约85％至约97％，或约90％至约95％。
在一些方面，变体具有在野生型或天然存在的异戊二烯合酶中的一个突变。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸取代，至少一个氨基酸插入，和/或至少一个氨基酸删除。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸取代。在一些方面，在变体和野生型或天然存在的异戊二烯合酶之间不同的氨基酸残基数目可为一个或多个，例如1，2，3，4，5，10，15，20，30，40，50，或更多个氨基酸残基。天然存在的异戊二烯合酶可包括来自植物的任何异戊二烯合酶，例如野葛(kudzu)异戊二烯合酶、杨树(poplar)异戊二烯合酶、英国橡树(EnglishOak)异戊二烯合酶和柳树(willow)异戊二烯合酶。在一些方面，变体是来自银白杨(Populusalba)的异戊二烯合酶变体。在一些方面，来自银白杨(Populusalba)的异戊二烯合酶变体具有至少一个氨基酸取代、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸删除。在一些方面，该变体是截短的银白杨(Populusalba)异戊二烯合酶。在一些方面，编码变体(例如来自银白杨(Populusalba)的异戊二烯合酶变体)的核酸是经密码子优化的(例如，基于其中表达异源异戊二烯合酶的宿主细胞经密码子优化)。
本文提供的异戊二烯合酶多肽可为在WO2009/132220、WO2010/124146和美国专利申请公布：2010/0086978中描述的任何异戊二烯合酶或异戊二烯合酶变体，它们的内容针对异戊二烯合酶和异戊二烯合酶变体全文以引用方式并入本文中。
本文所述的任何一种启动子(例如本文所述并在本公开实例中鉴定的启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子)可用于驱动本文所述的任何异戊二烯合酶的表达。
合适的异戊二烯合酶包括但不限于通过GenBank登录号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所识别的那些。可用于本文所述的任何一种组合物或方法(包括制备编码异戊二烯合酶的细胞的方法)的异戊二烯合酶类型也描述于国际专利申请公布WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220、WO2010/031062、WO2010/031068、WO2010/031076、WO2010/013077、WO2010/031079、WO2010/148150、WO2010/124146、WO2010/078457、WO2010/148256、WO2012/058494和美国专利8,173,410中。
异戊二烯生物合成途径
异戊二烯可由两种不同的醇产生，3-甲基-2-丁烯-1-醇和2-甲基-3-丁烯-2-醇。例如，在两步异戊二烯生物合成途径中，通过酶如合酶(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇合酶)将二甲烯丙基二磷酸转化成2-甲基-3-丁烯-2-醇，随后通过2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶将2-甲基-3-丁烯-2-醇转化成异戊二烯。又如，在三步异戊二烯生物合成途径中，通过能够将二甲烯丙基二磷酸转化成3-甲基-2-丁烯-1-醇的磷酸酶或合酶(例如香叶醇合酶或金合欢醇合酶)将二甲烯丙基二磷酸转化成3-甲基-2-丁烯-1-醇，3-甲基-2-丁烯-1-醇被2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶转化成2-甲基-3-丁烯-2-醇，并且2-甲基-3-丁烯-2-醇被2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶转化成异戊二烯。参见例如，美国专利申请公布：US20130309742A1和美国专利申请公布：US20130309741A1。
在本发明的一些方面，在本文所述的任何组合物或方法中描述的细胞(包括已经如本文所述进行修饰的宿主细胞)还包含编码异戊二烯生物合成途径多肽的一种或多种核酸，该多肽选自2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶。在一些方面，异戊二烯生物合成途径的多肽是内源多肽。在一些方面，编码异戊二烯生物合成途径的多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯生物合成途径的多肽的内源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯生物合成途径的多肽的内源核酸可操作地连接至强启动子。在一个特定方面，相对于野生型细胞，该细胞经工程化以过表达内源异戊二烯生物合成途径的多肽。在一些方面，编码异戊二烯生物合成途径的多肽的内源核酸可操作地连接至弱启动子。
在一些方面，异戊二烯生物合成途径的多肽是异源多肽。在一些方面，细胞包含一个以上的编码异戊二烯生物合成途径多肽的异源核酸拷贝。在一些方面，编码异戊二烯生物合成途径的多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯生物合成途径的多肽的异源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯生物合成途径的多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子。在一些方面，编码异戊二烯生物合成途径的多肽的异源核酸可操作地连接至弱启动子。
编码异戊二烯生物合成途径多肽的核酸可整合到宿主细胞基因组中或可在细胞中稳定表达。编码异戊二烯生物合成途径多肽的核酸可另外在载体上。
编码异戊二烯生物合成途径多肽的示例性核酸包括编码多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸，它们具有至少一种异戊二烯生物合成途径多肽的活性，例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽。示例性异戊二烯生物合成途径多肽和编码异戊二烯生物合成途径多肽的核酸包括天然存在的多肽和核酸，它们来自本文所述的任何来源的生物体。此外，异戊二烯生物合成途径多肽的变体(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽)可具有改善的活性，例如改善的酶活性。
在一些方面，异戊二烯生物合成途径的多肽是磷酸酶。示例性磷酸酶包括来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或大肠杆菌(Escherichiacoli)的磷酸酶。在一些实施例中，磷酸酶是3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽或其变体。在一些方面，异戊二烯生物合成途径的多肽是萜合酶(例如香叶醇合酶、金合欢醇合酶、里哪醇合酶或橙花叔醇合酶)。示例性萜合酶包括来自罗勒(Ocimumbasilicum)、柠檬紫苏(Perillacitriodora)、紫苏(Perillafrutescans)、细毛樟(Cinnamomomtenuipile)、玉米(Zeamays)或水稻(Oryzasativa)的萜合酶。另外的示例性萜合酶包括来自仙女扇(Clarkiabreweri)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、Perillasetoyensis、紫苏(Perillafrutescens)、软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)、葛枣猕猴桃(Actinidiapolygama)、黄花蒿(Artemesiaannua)、罗勒(Ocimumbasilicum))、水薄荷(Menthaaquatica)、番茄(Solanumlycopersicum)、蒺藜苜蓿(Medicagotrunculata)、毛果杨(Populustrichocarpa)、野草莓(Fragariavesca)、或草莓(Fragrariaananassa)的萜合酶。在一些实施例中，萜合酶是3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽或其变体。例如，本文所述的萜合酶可催化二甲烯丙基二磷酸转化成3-甲基-2-丁烯-1-醇(例如3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶)。在一些方面，本文所述的萜合酶可催化二甲烯丙基二磷酸转化成2-甲基-3-丁烯-2-醇(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇合酶)。在一些方面，异戊二烯生物合成途径多肽是2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽(例如来自Aquincolatertiaricarbonis的2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽)或其变体。在一些方面，2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽是里哪醇脱水酶-异构酶多肽(例如来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌(Castellanielladefragrans)GenBank登录号FR669447的里哪醇脱水酶-异构酶多肽)或其变体。在一些方面，异戊二烯生物合成途径的多肽是2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽或其变体。在一些方面，2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽是里哪醇脱水酶-异构酶多肽(例如来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌(Castellanielladefragrans)GenBank登录号FR669447的里哪醇脱水酶-异构酶多肽)或其变体。
可使用标准方法，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内将DMAPP转化成异戊二烯的能力，确定多肽是否具有期望的异戊二烯生物合成途径酶活性(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶活性、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶活性和3-甲基-2-丁烯-1-醇活性)。参见例如，美国专利申请公布：US20130309742A1和美国专利申请公布：US20130309741A1。
在一些方面，异戊二烯生物合成途径多肽(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽)是变体。在一些方面，异戊二烯生物合成途径多肽(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽)是野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽的变体。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽相比具有改善的活性如改善的催化活性。活性(例如催化活性)的提高可为至少约以下任何值：10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％。在一些方面，活性如催化活性的提高为至少约以下任何倍数：1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，75倍，或100倍。在一些方面，活性如催化活性的提高为约10％至约100倍(例如约20％至约100倍，约50％至约50倍，约1倍至约25倍，约2倍至约20倍，或约5倍至约20倍)。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽相比具有改善的溶解度。溶解度的提高可为至少约以下任何值：10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％。在一些方面，溶解度的提高可为至少约以下任何倍数：1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，75倍，或100倍。在一些方面，溶解度的提高为约10％至约100倍(例如约20％至约100倍，约50％至约50倍，约1倍至约25倍，约2倍至约20倍，或约5倍至约20倍)。在一些方面，异戊二烯生物合成途径多肽是异戊二烯生物合成途径天然存在的多肽的变体，并且与天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽相比具有改善的稳定性(例如热稳定性)。
在一些方面，变体具有至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约110％，至少约120％，至少约130％，至少约140％，至少约150％，至少约160％，至少约170％，至少约180％，至少约190％，至少约200％的野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽)的活性。变体可具有与野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽的序列相似性。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合成途径多肽的变体可具有与野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽)至少约以下任何值的氨基酸序列同一性：40％，50％，60％，70％，75％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，或99.9％。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽的变体具有与野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽)以下任何值的氨基酸序列同一性：约70％至约99.9％，约75％至约99％，约80％至约98％，约85％至约97％，或约90％至约95％。
在一些方面，变体具有在野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽)中的突变。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸取代，至少一个氨基酸插入，和/或至少一个氨基酸删除。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸取代。在一些方面，在变体和野生型或天然存在的异戊二烯生物合成途径多肽之间不同的氨基酸残基数目可为一个或多个，例如1，2，3，4，5，10，15，20，30，40，50，或更多个氨基酸残基。在一些方面，编码变体(例如2-甲基-3-丁烯-2-醇脱水酶多肽、2-甲基-3-丁烯-2-醇异构酶多肽和3-甲基-2-丁烯-1-醇合酶多肽)的核酸是经密码子优化的(例如，基于其中表达异源异戊二烯生物合成途径多肽的宿主细胞经密码子优化)。
本文所述的任何一种启动子(例如本文所述并在本公开实例中鉴定的启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子)可用于驱动本文所述的任何异戊二烯生物合成途径多肽的表达。
编码DXP途径多肽的核酸
在本发明的一些方面，在本文所述的任何组合物或方法中描述的细胞(包括已经经工程化以提高通过如本文所述的磷酸解酮酶途径的碳通量的宿主细胞)还包含编码DXS多肽或其它DXP途径多肽的一种或多种异源核酸。在一些方面，细胞还包含编码DXS多肽或其它DXP途径多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面，大肠杆菌(E.coli)细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽或其它DXP途径多肽的一种或多种核酸。在一些方面，一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其它DXP途径多肽。在一些方面，一个质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其它DXP途径多肽。在一些方面，多个质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其它DXP途径多肽。
示例性DXS多肽包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种DXS多肽的活性。可使用标准方法(例如本文所述的那些方法)，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内将丙酮酸和D-3-磷酸甘油醛转化成1-脱氧-D-5-磷酸木酮糖的能力，确定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS多肽和核酸以及测量DXS活性的方法详述于国际公布WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220和美国专利公布US2009/0203102、2010/0003716及2010/0048964中。
示例性DXP途径多肽包括但不限于以下任何多肽：DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽和具有一种、两种、或多种DXP途径多肽活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，DXP途径多肽包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种DXP途径多肽的活性。示例性DXP途径核酸包括编码具有至少一种DXP途径多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性DXP途径多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸，以及来源于本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸。示例性DXP途径多肽和核酸以及测量DXP途径多肽活性的方法详述于国际公布WO2010/148150中。
示例性DXS多肽包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种DXS多肽的活性。可使用标准方法(例如本文所述的那些方法)，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内将丙酮酸和D-3-磷酸甘油醛转化成1-脱氧-D-5-磷酸木酮糖的能力，确定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS多肽和核酸以及测量DXS活性的方法详述于国际公布WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220和美国专利公布US2009/0203102、2010/0003716及2010/0048964中。
具体地，DXS多肽将丙酮酸和D-3-磷酸甘油醛转化成1-脱氧-D-5-磷酸木酮糖(DXP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内转化丙酮酸和D-3-磷酸甘油醛的能力，确定多肽是否具有DXS多肽活性。
DXR多肽将1-脱氧-D-5-磷酸木酮糖(DXP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸(MEP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内转化DXP的能力，确定多肽是否具有DXR多肽活性。
MCT多肽将2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸(MEP)转化成4-(胞苷5’-二磷酸)-2-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内转化MEP的能力，确定多肽是否具有MCT多肽活性。
CMK多肽将4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)转化成2-磷酸-4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内转化CDP-ME的能力，确定多肽是否具有CMK多肽活性。
MCS多肽将2-磷酸-4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内转化CDP-MEP的能力，确定多肽是否具有MCS多肽活性。
HDS多肽将2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸转化成(E)-4-羟基-3-甲基-2-烯-1-丁基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内转化ME-CPP的能力，确定多肽是否具有HDS多肽活性。
HDR多肽将(E)-4-羟基-3-甲基-烯-1-丁基二磷酸转化成异戊烯二磷酸(IPP)和二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)。可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内转化HMBPP的能力，确定多肽是否具有HDR多肽活性。
下游MVA途径、异戊二烯合酶、IDI和DXP途径多肽的来源生物体
异戊二烯合酶、IDI、DXP途径和/或下游MVA途径核酸(以及它们编码的多肽)可获取自天然包含异戊二烯合酶、IDI、DXP途径和/或下游MVA途径核酸的任何生物体。异戊二烯由多种生物体天然形成，例如细菌、酵母、植物和动物。一些生物体包含产生异戊二烯的MVA途径。异戊二烯合酶核酸可获取自例如包含异戊二烯合酶的任何生物体。MVA途径核酸可获取自例如包含MVA途径的任何生物体。IDI和DXP途径核酸可获取自例如包含IDI和DXP途径的任何生物体。
异戊二烯合酶、IDI、DXP途径和/或MVA途径核酸的核酸序列可分离自细菌、真菌、植物、藻类、或蓝细菌。示例性的来源生物体包括例如酵母如酵母属(Saccharomyce)菌种(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))、细菌如埃希氏菌(Escherichia)菌种(例如大肠杆菌(E.coli)或甲烷八叠球菌(Methanosarcina)菌种(例如马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei))、植物如野葛(kudzu)或杨树(poplar)(例如银白杨(Populusalba)或银白杨x欧洲山杨(Populusalbaxtremula)CAC35696)或白杨(aspen)(例如美洲山杨(Populustremuloides))。可使用的异戊二烯合酶、IDI和/或MVA途径多肽的示例性来源也描述于国际专利申请公布WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220、WO2010/031062、WO2010/031068、WO2010/031076、WO2010/013077、WO2010/031079、WO2010/148150、WO2010/078457和WO2010/148256。
在一些方面，来源生物体是酵母，例如酵母属(Saccharomycessp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomycessp.)、毕赤酵母属(Pichiasp.)、或假丝酵母属(Candidasp.)
在一些方面，来源生物体是细菌，例如芽孢杆菌(Bacillus)如地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的菌株、泛菌(Pantoea)如柠檬泛菌(P.citrea)的菌株、假单胞菌(Pseudomonas)如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)的菌株、链霉菌(Streptomyces)如青链霉菌(S.lividans)或锈棕色链霉菌(S.rubiginosus)的菌株、埃希氏菌(Escherichia)如大肠杆菌(E.coli)的菌株、肠杆菌(Enterobacter)的菌株、链球菌(Streptococcus)的菌株、或古细菌(Archaea)如马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)的菌株。
如本文所用，“芽孢杆菌(Bacillus)”包括“芽孢杆菌(Bacillus)”内的所有菌种，本领域技术人员已知的包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌((B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经认识到芽孢杆菌(Bacillus)持续发生分类学上的重组。因此，预期菌属包括已经发生重分类的菌种，包括但不限于生物体例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，其目前命名为“嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)。”在存在氧气的情况下产生抵抗性内生孢子被认为是限定芽孢杆菌(Bacillus)的特性，但是这种特性也应用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)、兼性芽孢杆菌(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus)、厌氧芽抱杆菌(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、米洛斯线芽孢杆菌(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌(Gracilibacillus)、嗜盐芽孢杆菌(Halobacillus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌(Virgibacillus)。
在一些方面，来源生物体是革兰氏阳性菌。非限制性示例包括链霉菌(Streptomyces)(例如变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor))、或灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌(Bacillus)的菌株。在一些方面，来源生物体是革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonassp.)
在一些方面，来源生物体是植物，例如来自来自蝶形花科(Fabaceae)家族如蝶形花亚科(Faboideaesubfamily)的植物。在一些方面，来源生物体是野葛(kudzu)、杨树(poplar)(诸如银白杨x欧洲山杨(Populusalbaxtremula)CAC35696)、白杨(aspen)(诸如美洲山杨(Populustremuloides))、或夏栎(Quercusrobur)。
在一些方面，来源生物体是藻类，例如绿藻、红藻、灰胞藻(glaucophyte)、绿蜘藻(chlorarachniophyte)、类眼虫(euglenid)、色藻(chromista)、或沟鞭藻类(dinoflagellate)。
在一些方面，来源生物体是蓝细菌，例如基于形态归类为任何以下类别的蓝细菌：色球蓝细菌(Chroococcale)、宽球蓝细菌(Pleurocapsale)、颤蓝细菌(Oscillatoriale)、念珠蓝细菌(Nostocales)、或真枝蓝细菌(Stigonematales)。
能够提高异戊二烯产量的重组细胞
当在相同条件下培养时，本文所述的重组细胞(包括如本文所述已经经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的宿主细胞)具有产生浓度大于缺失一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝、一个或多个编码MVA途径多肽的异源核酸拷贝和一种或多种编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的相同细胞的异戊二烯的能力。细胞还可包含编码IDI多肽的一种或多种异源核酸。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽来自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽来自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在其它实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞是棒状杆菌属(Corynebacteriaspp.)(例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))。
在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。
在一些方面，一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝、一个或多个编码MVA途径多肽的异源核酸拷贝和一种或多种编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸是整合到宿主细胞的染色体核苷酸序列中的异源核酸。在其它方面，一种或多种异源核酸整合到质粒中。在其它方面，一种或多种异源核酸中的至少一种整合到细胞的染色体核苷酸序列中，而一种或多种异源核酸序列中的至少一种整合到质粒中。重组细胞可产生比不包含磷酸解酮酶多肽的异戊二烯产生细胞多至少5％的异戊二烯量。另选地，重组细胞可产生大于约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，或15％的异戊二烯，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。
在本发明的一个方面，本文提供了包含一种或多种编码如本文所述的磷酸解酮酶多肽的异源核酸、一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽的异源核酸、一种或多种编码DXP途径多肽的异源核酸和一种或多种编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的重组细胞。细胞还可包含编码IDI多肽的一种或多种异源核酸。一种或多种异源核酸中的任一种可被可操作地连接至组成型启动子、可被可操作地连接至诱导型启动子、或者可被可操作地连接至诱导型和组成型启动子的组合。另外，一种或多种异源核酸可被可操作地连接至强启动子、弱启动子和/或中启动子。一种或多种编码磷酸解酮酶、甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽的异源核酸可整合到宿主细胞的基因组中或者可在细胞中稳定表达。一种或多种异源核酸可另外在载体上。
细胞根据本文所述的任何组合物或方法产生异戊二烯可被增强(例如通过表达一种或多种编码磷酸解酮酶多肽、异戊二烯合酶多肽、MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的异源核酸得到增强)。如本文所用，“增强的”异戊二烯产生是指通过本文所述的任何组合物或方法描述的细胞与不具有一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸的细胞相比提高的异戊二烯细胞生产率指数(CPI)、提高的异戊二烯滴度、提高的异戊二烯质量收率和/或提高的异戊二烯比生产率。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞已经经工程化以增加通过用于E4P、GAP、Ac-P和/或乙酰-CoA产生的磷酸解酮酶途径的碳通量。
通过本文所述的重组细胞的异戊二烯产生可被增强约5％至约1,000,000倍。在某些方面，异戊二烯产生与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸的细胞的异戊二烯产生相比可提高约10％至约1,000,000倍(例如约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞已经经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至甲羟戊酸生产的碳通量的细胞的异戊二烯产生相比增强的异戊二烯产生。
在其它方面，通过本文所述的重组细胞的异戊二烯产生与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸的细胞的异戊二烯产生相比也可增强至少约以下任何倍数：5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，500倍，1000倍，2000倍，5000倍，10,000倍，20,000倍，50,000倍，100,000倍，200,000倍，500,000倍，或1,000,000倍。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞已经经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至甲羟戊酸生产的碳通量的细胞的异戊二烯产生相比增强的异戊二烯产生。
本文也提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的异戊二烯生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。在其它实施例中，性能指数值参数还包括(e)异戊二烯生产蛋白质溶解度或(f)异戊二烯比生产率。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
另外，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的异戊二烯生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。在其它实施例中，性能指数值参数还包括(d)异戊二烯生产蛋白质溶解度或(e)异戊二烯比生产率。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
另外，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的异戊二烯生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。在其它实施例中，性能指数值参数还包括(e)异戊二烯生产蛋白质溶解度或(f)异戊二烯比生产率。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的异戊二烯生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。在其它实施例中，性能指数值参数还包括(d)异戊二烯生产蛋白质溶解度或(e)异戊二烯比生产率。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
利用重组细胞生产异戊二烯的方法
本文也提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括培养本文所述的任何重组细胞。在一个方面，异戊二烯可通过培养重组细胞来产生，该重组细胞包含一种或多种编码如本文所述的任何磷酸解酮酶多肽、一种或多种MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在某些实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。
在另一方面，异戊二烯可通过培养重组细胞来产生，包括调节本文所述的任何酶途径和一种或多种编码磷酸解酮酶肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在某些实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。异戊二烯可由本文所述的任何细胞并根据本文所述的任何方法来产生。任何细胞可用于由碳水化合物产生异戊二烯的目的，碳水化合物包括但不限于六碳糖如葡萄糖和/或五碳糖如木糖。
因此，本文提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括在合适条件下培养包含一种或多种编码磷酸解酮酶多肽和异戊二烯合酶的异源核酸的细胞以产生异戊二烯，以及(b)产生异戊二烯。在某些实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicumi)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。
细胞还可包含一种或多种编码上述MVA途径(例如完整MVA途径)多肽和任何上述异戊二烯合酶多肽(例如葛属(Pueraria)异戊二烯合酶)的核酸分子。在一些方面，重组细胞可为本文所述的任一种细胞。本文所述的任何异戊二烯合酶或其变体、本文所述的任何宿主细胞菌株、本文所述的任何启动子和/或本文所述的任何载体也可用于产生异戊二烯，本文所述的任何能量来源(例如葡萄糖或木糖)可用于本文所述的方法。在一些方面，生产异戊二烯的方法还包括回收异戊二烯的步骤。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。
在某些方面，本文提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括在适于产生异戊二烯的条件下培养包含一种或多种异源核酸的重组细胞，该异源核酸编码来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)的磷酸解酮酶多肽、来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE和mvaS多肽，以及(b)产生异戊二烯。该细胞还可包含一种或多种编码上述下游MVA途径(例如MVK、PMK、MVD和/或IDI)多肽和任何上述异戊二烯合酶多肽的核酸分子。在一些方面，重组细胞可为本文所述的任何细胞。
在某些方面，本文提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括在适于产生异戊二烯的条件下培养包含一种或多种异源核酸的重组细胞，该异源核酸编码来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)的磷酸解酮酶多肽，以及(b)产生异戊二烯。该细胞还可包含一种或多种编码上述下游MVA途径(例如MVK、PMK、MVD和/或IDI)多肽和任何上述异戊二烯合酶多肽的核酸分子。在一些方面，重组细胞可为本文所述的任何细胞。
本文所述的重组细胞具有各种酶途径，它们经操纵以增加通过磷酸解酮酶途径至甲羟戊酸产生的碳流，该重组细胞可用于产生异戊二烯。在一些方面，重组细胞还可经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：它们选自5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，这些重组细胞还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在一些方面，产生的异戊二烯量在峰值绝对生产率时间点进行测量。在一些方面，细胞的峰值绝对生产率为约本文公开的任何异戊二烯量。在一些方面，产生的异戊二烯量在峰值比生产率时间点进行测量。在一些方面，细胞的峰值比生产率为约本文公开的每细胞任何异戊二烯量。在一些方面，测量累积的异戊二烯总产量。在一些方面，细胞的累积总生产率为约本文公开的任何异戊二烯量。
在一些方面，本文所述的任何细胞(例如培养物中的细胞)以大于约以下任何或约以下任何的生产率产生异戊二烯：1，10，25，50，100，150，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1,000，1,250，1,500，1,750，2,000，2,500，3,000，4,000，5,000，或更多纳摩尔异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(nmole/gwcm/hr)。在一些方面，异戊二烯量为约2至约5,000nmole/gwcm/hr，例如约2至约100nmole/gwcm/hr，约100至约500nmole/gwcm/hr，约150至约500nmole/gwcm/hr，约500至约1,000nmole/gwcm/hr，约1,000至约2,000nmole/gwcm/hr，或约2,000至约5,000nmole/gwcm/hr。在一些方面，异戊二烯量介于约20至约5,000nmole/gwcm/hr，约100至约5,000nmole/gwcm/hr，约200至约2,000nmole/gwcm/hr，约200至约1,000nmole/gwcm/hr，约300至约1,000nmole/gwcm/hr，或约400至约1,000nmole/gwcm/hr之间。
在一些方面，培养物中的细胞以大于或约1，10，25，50，100，150，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1,000，1,250，1,500，1,750，2,000，2,500，3,000，4,000，5,000，10,000，100,000，或更多ng异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(ng/gwcm/h)的生产率产生异戊二烯。在一些方面，异戊二烯量介于约2至约5,000ng/gwcm/h之间，例如介于约2至约100ng/gwcm/h，约100至约500ng/gwcm/h，约500至约1,000ng/gwcm/h，约1,000至约2,000ng/gwcm/h，或约2,000至约5,000ng/gwcm/h之间。在一些方面，异戊二烯量介于约20至约5,000ng/gwcm/h，约100至约5,000ng/gwcm/h，约200至约2,000ng/gwcm/h，约200至约1,000ng/gwcm/h，约300至约1,000ng/gwcm/h，或约400至约1,000ng/gwcm/h之间。
在一些方面，培养物中的细胞产生的异戊二烯的累积滴度(总量)大于约以下任何或为以下任何：1，10，25，50，100，150，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1,000，1,250，1,500，1,750，2,000，2,500，3,000，4,000，5,000，10,000，50,000，100,000，或更多mg异戊二烯/L发酵液(mg/L发酵液，其中发酵液体积包括细胞体积和细胞培养基体积)。在一些方面，异戊二烯量介于约2至约5,000mg/L发酵液，例如介于约2至约100mg/L发酵液，约100至约500mg/L发酵液，约500至约1,000mg/L发酵液，约1,000至约2,000mg/L发酵液，或约2,000至约5,000mg/L发酵液。在一些方面，异戊二烯量介于约20至约5,000mg/L发酵液，约100至约5,000mg/L发酵液，约200至约2,000mg/L发酵液，约200至约1,000mg/L发酵 液，约300至约1,000mg/L发酵液，或约400至约1,000mg/L发酵液。
在一些方面，在培养物中的细胞产生的异戊二烯包含按体积计至少约1，2，5，10，15，20，或25％的发酵尾气。在一些方面，异戊二烯包含按体积计约1至约25％的尾气，例如5至约15％，约15至约25％，约10至约20％，或约1至约10％的尾气。
在某些实施例中，生产异戊二烯的方法可包括以下步骤：(a)培养不内源表达磷酸解酮酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该细胞异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝以及(i)表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种核酸和(ii)异戊二烯合酶，以及(b)产生异戊二烯，其中该重组细胞显示比缺失一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源基因拷贝的相同细胞更低的摄氧速率(OUR)。在某些实施例中，表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个异源基因拷贝的重组细胞显示比不表达磷酸解酮酶的重组细胞高达1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或7倍的OUR降低。
本文也提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括具有增强的异戊二烯产生能力的细胞。通过本文所述细胞的异戊二烯产生可通过表达一种或多种编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸、编码完整MVA途径多肽的一种或多种多肽的一个或多个异源核酸拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸而得到增强。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，磷酸解酮酶来自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在其它实施例中，磷酸解酮酶来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。如本文所用，“增强的”异戊二烯产生是指通过本文所述的任何组合物或方法描述的细胞与不具有一种或多种编码磷酸解酮酶多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞相比提高的异戊二烯细胞生产率指数(CPI)、提高的异戊二烯滴度、提高的异戊二烯质量收率和/或提高的异戊二烯比生产率。异戊二烯产生可被增强约5％至约1,000,000倍。异戊二烯产生与不内源表达磷酸解酮酶的异戊二烯产生细胞的异戊二烯产生相比可提高约10％至约1,000,000倍(例如约50％至约1,000,000倍，约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，本文所述方法包括宿主细胞已经经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至甲羟戊酸生产的碳通量的异戊二烯产生细胞的异戊二烯产生相比增强的异戊二烯产生。
在其它方面，本文所述方法涉及本文所述细胞增强的异戊二烯产生(例如通过表达一种或多种编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸得到增强)。。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，磷酸解酮酶来自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在其它实施例中，磷酸解酮酶来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。异戊二烯产生可被增强约5％至约1,000,000倍。异戊二烯产生与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸的异戊二烯产生细胞的异戊二烯产生相比可提高约10％至约1,000,000倍(例如约50％至约1,000,000倍，约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)。异戊二烯产生与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶的异源核酸的异戊二烯产生细胞的异戊二烯产生相比也可增强至少约以下任何倍数：5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，500倍，1000倍，2000倍，5000倍，10,000倍，20,000倍，50,000倍，100,000倍，200,000倍，500,000倍，或1,000,000倍。在本文所述的某些实施例中，本文所述方法包括宿主细胞已经经工程化以增加MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加甲羟戊酸生产的碳通量的细胞的异戊二烯产生相比增强的异戊二烯产生。
此外，可利用较具体的细胞培养条件在本文所述方法中培养细胞。例如，在一些方面，用于生产异戊二烯的方法包括以下步骤：(a)在34℃基本培养基中培养不内源具有磷酸解酮酶基因的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其中该重组细胞在低至中拷贝质粒上并且在强启动子的控制下异源表达(i)一个或多个编码磷酸解酮酶的异源基因拷贝，(ii)编码MVA途径(上游MVA途径和下游MVA途径)的一种或多种多肽一个或多个异源核酸拷贝，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生异戊二烯。。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，磷酸解酮酶来自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在其它实施例中，磷酸解酮酶来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些方面，生产异戊二烯的方法还包括回收异戊二烯的步骤。
本文也提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，以及产生所述异戊二烯。在其它实施例中，性能指数值参数还包括(e)异戊二烯生产蛋白质溶解度或(f)异戊二烯比生产率。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
另外，本文提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性，和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性，以及产生所述异戊二烯。在其它实施例中，性能指数值参数还包括(d)异戊二烯生产蛋白质溶解度或(e)异戊二烯比生产率。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，以及产生所述异戊二烯。在其它实施例中，性能指数值参数还包括(e)异戊二烯生产蛋白质溶解度或(f)异戊二烯比生产率。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文提供了生产异戊二烯的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸，其中具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性，以及产生所述异戊二烯。在其它实施例中，性能指数值参数还包括(d)异戊二烯生产蛋白质溶解度或(e)异戊二烯比生产率。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
能够提高类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量的重组细胞
类异戊二烯可在多种生物体中通过合成类异戊二烯前体分子来产生，类异戊二烯前体分子是MVA途径的最终产物。如上所述，类异戊二烯代表一类重要的化合物，并且包括例如食品和饲料补充剂、风味和气味化合物、以及抗癌、抗疟、抗真菌和抗细菌化合物。
作为一类分子，类异戊二烯基于化合物中包含的异戊二烯单元的数目进行分类。单萜包含十个碳或两个异戊二烯单元，倍半萜包含15个碳或三个异戊二烯单元，二萜包含20个碳或四个异戊二烯单元，倍半萜包含25个碳或五个异戊二烯单元等。类固醇(一般包含约27个碳)是裂解的或重排的类异戊二烯产物。
类异戊二烯可由类异戊二烯前体分子IPP和DMAPP产生。这些不同的化合物来源于这些相对简单的常见前体并且通过保守的聚异戊二烯焦磷酸合酶家族合成(Hsieh等人，PlantPhysiol.2011年3月；155(3)：1079-90)。这些线性异戊二烯焦磷酸的不同链长反映出它们不同的生理功能，一般通过聚异戊二烯焦磷酸合酶高度发达的活性位点，经由烯丙基底物(二甲烯丙基二磷酸(C5-DMAPP)、香叶基焦磷酸(C10-GPP)、焦磷酸法尼酯(C15-FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(C20-GGPP))与相应数量的异戊烯焦磷酸(C5-IPP)的缩合反应进行测定(Hsieh等人，PlantPhysiol.2011年3月；155(3)：1079-90)。
类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产生可通过使用任何包含编码磷酸解酮酶的一个或多个异源核酸拷贝的重组宿主细胞来完成，用于提高类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量。在一些方面，这些细胞还包含如上所述编码MVA途径、IDI和/或DXP途径的多肽的一种或多种异源核酸，以及编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸。不受理论的约束，认为通过任何上述组合物和方法提高重组细胞中甲羟戊酸的细胞产量将类似地得到更高的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产量。当结合用于异戊二烯和类异戊二烯产生的合适的甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯二磷酸异构酶和其它合适的酶的酶活性水平时，提高葡萄糖产生甲羟戊酸的摩尔收率转换为更高的葡萄糖产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯(包括异戊二烯)的摩尔收率。本文所述的重组细胞具有多种酶途径，它们经操纵用于增加甲羟戊酸产生的碳流，该重组细胞用于产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。在一些方面，重组细胞还可经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：选自rpiA、rpe、tktA、talB、pta和/或eutD。在另一方面，这些菌株还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括zwf、pfkA、fba、gapA、ackA、gltA和/或pts。
类异戊二烯类型
本发明的重组细胞能够提高类异戊二烯和类异戊二烯前体分子DMAPP和IPP的产量。类异戊二烯示例包括但不限于类半萜、类单萜、类倍半萜、类二萜、类倍半萜、类三萜、类四萜和更高的类多萜。在一些方面，类半萜为异戊烯醇(即，3-甲基-2-丁烯-1-醇)、异戊二烯醇(即，3-甲基-3-丁烯-1-醇)、2-甲基-3-丁烯-2-醇、或异戊酸。在一些方面，类单萜非限制地可为香叶基焦磷酸、桉叶脑、柠檬烯、或蒎烯。在一些方面，类倍半萜为焦磷酸法尼酯、青蒿素、或红没药醇。在一些方面，类二萜非限制地可为香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、植醇、紫杉醇、毛喉素、或蚜肠霉素。在一些方面，类三萜非限制地可为角鲨烯或羊毛甾醇。类异戊二烯也可选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、里哪醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香烩烯、γ-萜品烯、松油烯和瓦伦烯。
在一些方面，类四萜为番茄红素或胡萝卜素(类胡萝卜素)。如本文所用，术语“类胡萝卜素”是指一组天然存在的有机色素，它们产生于植物的叶绿体和色质体、一些其它光合作用生物体如藻类、一些类型的真菌和一些细菌中。类胡萝卜素包括含氧叶黄素和不含氧胡萝卜素。在一些方面，类胡萝卜素选自叶黄素和胡萝卜素。在一些方面，叶黄素是黄体素或玉米黄质。在一些方面，类胡萝卜素是α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄质或番茄红素。
在其它实施例中，类异戊二烯可为维生素A的形式，非限制地例如视黄醇、棕榈酸视黄酯、视黄酸、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、或叶黄素β-隐黄质。在其它实施例中，类异戊二烯可为维生素E的形式，非限制地例如生育酚(例如α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、或Δ-生育酚)或生育三烯酚(例如α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、或Δ-生育三烯酚)。
编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸
在本发明的一些方面，在本文任何组合物或方法中描述的细胞还包含如上所述一种或多种编码磷酸解酮酶多肽的核酸、以及一种或多种编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸。聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽可为内源多肽。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸可被可操作地连接至组成型启动子，或者类似地可被可操作地连接至诱导型启动子。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸另外可被可操作地连接至强启动子。另选地，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸可被可操作地连接至弱启动子。具体地，相对于野生型细胞，细胞可经工程化以过表达内源聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽。
在一些方面，聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽是异源多肽。本发明的细胞可包含一个以上的编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸拷贝。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸可操作地连接至弱启动子。
编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸可整合到宿主细胞基因组中或可在细胞中稳定表达。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸可另外在载体上。
示例性聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸包括编码具有至少一种聚异戊二烯焦磷酸合酶活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽将类异戊二烯前体分子转化成较复杂的类异戊二烯化合物。示例性聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种异戊二烯合酶多肽的活性。示例性聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽和核酸包括天然存在的多肽和核酸，它们来自本文所述的任何来源的生物体。此外，聚异戊二烯焦磷酸合酶变体可具有改善的活性如改善的酶活性。在一些方面，聚异戊二烯焦磷酸合酶变体具有其它改善的特性，例如改善的稳定性(例如热稳定性)和/或改善的溶解度。示例性聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸可包括编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸，该多肽非限制地例如香叶基二磷酸(GPP)合酶、焦磷酸法尼酯(FPP)合酶和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶、或任何其它已知的聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽。
在本发明的一些方面，在本文任何组合物或方法中描述的细胞还包含编码焦磷酸法尼酯(FPP)的一种或多种核酸。FPP合酶多肽可为由内源基因编码的内源多肽。在一些方面，FPP合酶多肽由大肠杆菌(E.coli)的内源ispA基因编码。编码FPP合酶多肽的内源核酸可被可操作地连接至组成型启动子，或者类似地可被可操作地连接至诱导型启动子。编码FPP合酶多肽的内源核酸另外可被可操作地连接至强启动子。具体地，相对于野生型细胞，该细胞可经工程化以过表达内源FPP合酶多肽。
在一些方面，FPP合酶多肽是异源多肽。本发明的细胞可包含一个以上的编码FPP合酶多肽的异源核酸拷贝。在一些方面，编码FPP合酶多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码FPP合酶多肽的异源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子。
编码FPP合酶多肽的核酸可整合到宿主细胞基因组中或可在细胞中稳定表达。编码FPP合酶的核酸可另外在载体上。
可使用标准方法通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内将IPP转化成更高等类异戊二烯的能力，确定多肽是否具有聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽活性。这些方法是本领域熟知的并且描述于例如美国专利：7,915,026；Hsieh等人，PlantPhysiol.2011年3月；155(3):1079-90；Danner等人，Phytochemistry.2011年4月12日[刊行前在线发表]；Jones等人，JBiolChem.2011年3月24日[刊行前在线发表]；Keeling等人，BMCPlantBiol.2011年3月7日；11:43；Martin等人，BMCPlantBiol.2010年10月21日；10:226；Kumeta&Ito，PlantPhysiol.2010年12月；154(4):1998-2007；和&Boland，JOrgChem.2010Aug20；75(16):5590-600中。
能够提高类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量的重组细胞
当在相同条件下培养时，本文所述的重组细胞(例如重组细菌细胞)(包括如本文所述已经经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的宿主细胞)具有产生量和/或浓度大于缺失一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝、一个或多个编码MVA途径多肽的异源核酸拷贝和一种或多种编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸的相同细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的能力。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽来自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽来自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在其它实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。
在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在另一个实施例中，重组细胞是棒状杆菌属(Corynebacteriaspp.)(例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))。
在一些方面，一个或多个编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸拷贝、一个或多个编码MVA途径多肽的异源核酸拷贝和一种或多种编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸是整合到宿主细胞的染色体核苷酸序列中的异源核酸。在其它方面，一种或多种异源核酸整合到质粒中。在其它方面，一种或多种异源核酸中的至少一种整合到细胞的染色体核苷酸序列中，而一种或多种异源核酸序列中的至少一种整合到质粒中。重组细胞可产生比不包含磷酸解酮酶多肽的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生细胞多至少5％的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯量。另选地，重组细胞可产生大于约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，或15％的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯，包括端值在内，以及在这些数值之间的任何数值。
在本发明的一个方面，本文提供了包含一种或多种编码如本文所述的磷酸解酮酶多肽的异源核酸、一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽的异源核酸、一种或多种编码DXP途径多肽的异源核酸和一种或多种编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸的重组细胞。细胞还可包含编码IDI多肽的一种或多种异源核酸。一种或多种异源核酸中的任一种可被可操作地连接至组成型启动子、可被可操作地连接至诱导型启动子、或者可被可操作地连接至诱导型和组成型启动子的组合。另外，一种或多种异源核酸可被可操作地连接至强启动子、弱启动子和/或中启动子。一种或多种编码磷酸解酮酶、甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXP途径多肽和聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸可整合到宿主细胞的基因组中或者可在细胞中稳定表达。一种或多种异源核酸可另外在载体上。
细胞根据本文所述的任何组合物或方法产生类异戊二烯和/或类异戊二烯前体可被增强(例如通过表达一种或多种编码磷酸解酮酶多肽、聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽、MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的异源核酸得到增强)。如本文所用，“增强的”类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生是指通过本文所述的任何组合物或方法描述的细胞与不具有一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸的细胞相比提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯细胞生产率指数(CPI)、提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯滴度、提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯质量收率和/或提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯比生产率。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞已经经工程化以增加通过用于E4P、GAP、Ac-P和/或乙酰-CoA产生的磷酸解酮酶途径的碳通量。
通过本文所述的重组细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生可被增强约5％至约1,000,000倍。在某些方面，类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸的细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生相比可提高约10％至约1,000,000倍(例如约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞已经经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至甲羟戊酸生产的碳通量的细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生相比增强的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生。
在其它方面，通过本文所述的重组细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸的细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生相比也可增强至少约以下任何倍数：5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，500倍，1000倍，2000倍，5000倍，10,000倍，20,000倍，50,000倍，100,000倍，200,000倍，500,000倍，或1,000,000倍。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞已经经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加通过磷酸解酮酶途径至甲羟戊酸生产的碳通量的细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生相比增强的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生。
在本发明的一个方面，提供了包含编码磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源核酸、编码一种或多种完整MVA途径(即，上游MVA途径和下游MVA途径)多肽的一种或多种异源核酸、编码聚异戊二烯焦磷酸合酶的一种或多种异源核酸和/或编码DXP途径多肽的一种或多种异源核酸的重组细胞。细胞还可包含编码IDI多肽的一种或多种异源核酸。另外，聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽可为FPP合酶多肽。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽来自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽来自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在其它实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在另一个实施例中，重组细胞是棒状杆菌属(Corynebacteriaspp.)(例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))。一种或多种异源核酸可另外在一种或多种载体上。
本文提供了重组细胞，其能够提供提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量。细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生可通过表达编码磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源核酸、编码完整MVA途径(即，上游MVA途径和下游MVA途径)的一种或多种多肽的一种或多种异源核酸和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸得到增强。在某些实施例中，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，磷酸解酮酶多肽来自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽来自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在其它实施例中，具有磷酸解酮酶活性的多肽来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)。在另一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在其它实施例中，本文所述的重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一个实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在另一个实施例中，重组细胞是棒状杆菌属(Corynebacteriaspp.)(例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))。如本文所用，“增强的”类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生是指通过本文所述的任何组合物或方法描述的细胞与不具有编码磷酸解酮酶、完整MVA途径的一种或多种多肽和聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生的细胞生产率指数(CPI)、提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯滴度、提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯质量收率和/或提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯比生产率。类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生可被增强约5％至约1,000,000倍。类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产生与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶的异源核酸的细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生相比可增强约10％至约1,000,000倍(例如约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，重组宿主细胞已经经工程化以增加MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加甲羟戊酸生产的碳通量的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产生细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产生相比增强的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生。
本文所述细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产生可得到增强(例如通过表达编码磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源核酸、编码下游MVA途径多肽的一种或多种异源核酸和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸得到增强，该磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Biifdobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生可被增强约5％至约1,000,000倍。类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产生与天然存在细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生相比可增强约10％至约1,000,000倍(例如约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)，该天然存在的细胞例如不表达编码来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Biifdobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)的磷酸解酮酶的多肽的一种或多种异源核酸、以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸、并且其已经经工程化以增加甲羟戊酸产生的碳通量的细胞。
在其它实施例中，本文所述的重组细胞可产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯，其与不表达编码磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源核酸的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生重组细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生相比也可增强至少约以下任何倍数：5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，500倍，1000倍，2000倍，5000倍，10,000倍，20,000倍，50,000倍，100,000倍，200,000倍，500,000倍，或1,000,000倍。
本文还提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
另外，本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文还提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文提供了能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯前体生产重组细胞，其中该重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
利用重组细胞产生类异戊二烯和/或类异戊二烯前体分子的方法
本文还提供了产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法，该方法包括培养重组细胞(例如重组细菌细胞)，其包含一种或多种异源核酸编码磷酸解酮酶和聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽。在某些实施例中，重组细胞还包含编码上游MVA途径多肽和下游MVA途径多肽的一种或多种一种或多种异源核酸。类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯可由本文所述的任何细胞并根据本文所述的任何方法来产生。可使用任何细胞用于由碳水化合物产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的目的，碳水化合物包括六碳糖如葡萄糖。
在某些方面，本文提供了产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法，该方法包括在适于产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的条件下培养包含一种或多种异源核酸的重组细胞，该异源核酸编码来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)的磷酸解酮酶多肽、来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE和mvaS多肽，以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。该细胞还可包含一种或多种编码上述下游MVA途径(例如MVK、PMK、MVD和/或IDI)多肽和任何上述聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸分子。在一些方面，重组细胞可为本文所述的任何细胞。本文所述的任何聚异戊二烯焦磷酸合酶或其变体、本文所述的任何宿主细胞菌株、本文所述的任何启动子和/或本文所述的任何载体也可用于利用本文所述的任何能量来源(例如葡萄糖或任何其它六碳糖)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
在某些方面，本文提供了产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法，该方法包括在适于产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的条件下培养包含一种或多种异源核酸的重组细胞，该异源核酸编码来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)的磷酸解酮酶多肽、来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE和mvaS多肽，以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。该细胞还可包含一种或多种编码上述下游MVA途径(例如MVK、PMK、MVD和/或IDI)多肽和任何上述聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸分子。在一些方面，重组细胞可为本文所述的任何细胞。本文所述的任何聚异戊二烯焦磷酸合酶或其变体、本文所述的任何宿主细胞菌株、本文所述的任何启动子和/或本文所述的任何载体也可用于利用本文所述的任何能量来源(例如葡萄糖或任何其它六碳糖)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法可相似地包括以下步骤：(a)培养不内源具有磷酸解酮酶的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)，其中该重组细胞异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝；以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯，其中该重组细胞在与不包含磷酸解酮酶多肽的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产生细胞进行比较时产生更大量的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。
用于产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的本发明方法在与不包含磷酸解酮酶多肽的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产生重组细胞进行比较时可产生至少5％更大量的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。另选地，重组细胞可产生大于约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，或15％的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯，包括端值在内。在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
本文提供了利用任何上述细胞用于提高的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体分子产量的方法。细胞的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产生可通过表达编码磷酸解酮酶和/或来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE和mvaS多肽的一种或多种异源核酸、编码下游MVA途径多肽的一种或多种异源核酸和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸得到增强。如本文所用，“增强的”类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生是指通过本文所述的任何组合物或方法描述的细胞与不具有编码磷酸解酮酶、聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽、下游MVA途径多肽、来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)的mvaE和mvaS多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生的细胞生产率指数(CPI)、提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯滴度、提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯质量收率和/或提高的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯比生产率。类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产生可被增强约5％至约1,000,000倍。类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产生与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸的细胞的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产生相比可增强约10％至约1,000,000倍(例如约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，该方法包括重组宿主细胞已经经工程化以增加MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加甲羟戊酸生产的碳通量的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产生细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产生相比增强的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生。
类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产生也可通过本文所述方法得到增强，与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生细胞的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产生相比增强至少约以下任何倍数：10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，500倍，1000倍，2000倍，5000倍，10,000倍，20,000倍，50,000倍，100,000倍，200,000倍，500,000倍，或1,000,000倍。在本文所述的某些实施例中，该方法包括重组宿主细胞已经经工程化以增加MVA生产的碳通量，从而提供与不表达一种或多种编码磷酸解酮酶肽的异源核酸并且尚未经工程化以增加甲羟戊酸生产的碳通量的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产生细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产生相比增强的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生。
此外，可利用较具体的细胞培养条件在本文所述方法中培养细胞。例如，在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法包括以下步骤：(a)在34℃基本培养基中培养重组细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞)，其包含编码磷酸解酮酶多肽的异源核酸并且不内源具有来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE基因和mvaS基因，其中重组细胞在低至中拷贝质粒上并且在强启动子控制下异源表达编码磷酸解酮酶多肽的一个或多个基因拷贝，磷酸解酮酶多肽来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)；以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。在一些方面，该方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
本文还提供了产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，以及产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
另外，本文提供了产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性，以及产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文还提供了产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长，以及产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
本文提供了产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的方法，该方法包括培养能够增加通过磷酸解酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中重组细胞包含：(i)编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中该多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性，(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，和(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸解酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性，以及产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。在其它实施例中，任何所述参数的所述性能指数值与具有磷酸解酮酶活性的亲本多肽(例如来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶)相比为任何以下值：例如大于1.1，例如大于1.2，大于1.4，大于1.6，大于1.8，大于2，大于2.2，大于2.4，大于2.6，大于2.8，大于3，大于3.2，大于3.4，大于3.6，大于3.8，大于4，大于4.2，大于4.4，大于4.6，大于4.8，大于5，大于5.2，大于5.4，大于5.6，大于5.8，大于6，大于6.2，大于6.4，大于6.6，大于6.8，大于7，大于7.2，大于7.4，大于7.6，大于7.8，大于8，大于8.2，大于8.4，大于8.6，大于8.8，9，大于9.2，大于9.4，大于9.6，大于9.8，或大于10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数与亲本分子相比提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5倍或更多倍。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至0.5，约0.25至0.75，约0.5至1，约0.75至1.25，约1至1.5，约1.25至1.75，约1.5至2，约1.75至2.25，约2至2.5，约2.25至2.75，约2.5至3，约2.75至3.25，约3至3.5，约3.25至3.75，约3.5至4，约3.75至4.25，约4至4.5，约4.25至4.75，约4.5至5，约4.75至5.25，约5至5.5，约5.25至5.75，约5.5至6，约6.25至6.75，约6.5至7，约6.75至7.25，约7至7.5，约7.75至8.25，约8至8.5，约8.25至8.75，约8.5至9，约8.75至9.25，约9至9.5，约9.25至9.75，或约9.5至10或更高。在其它实施例中，细胞性能指数大于亲本分子以下任一数值：约0.1至2，约1-3，约2-4，约3-5，约4-6，约5-7，约6-8，约7-9，或约8-10或更高。在一些实施例中，亲本分子是来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的磷酸解酮酶。在其它实施例中，细胞内活性提高至少约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10倍或更多倍。
载体
合适的载体可用于本文所述的任何组合物和方法。例如，合适载体可用于优化在特定宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli))中编码磷酸解酮酶、上游MVA途径多肽(包括但不限于mvaE和mvaS多肽)、下游MVA途径多肽、异戊二烯合酶、或聚异戊二烯焦磷酸合酶的一个或多个基因拷贝的表达。在一些方面，载体包含选择性标记。选择性标记的示例包括但不限于抗生素抗性核酸(例如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博莱霉素、新霉素、或氯霉素)和/或赋予代谢优势的核酸，例如在宿主细胞上的营养优势。在一些方面，磷酸解酮酶、上游MVA途径多肽(包括但不限于mvaE和mvaS多肽)、下游MVA途径多肽、来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE和mvaS核酸、异戊二烯合酶、或聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸的一个或多个拷贝整合到无选择性标记的宿主细胞基因组中。
本文表征的或本公开实例中使用的任一个载体可用于本发明。
转化方法
编码磷酸解酮酶、上游MVA途径多肽(包括但不限于mvaE和mvaS多肽)、下游MVA途径多肽和/或下游MVA途径多肽的一个或多个拷贝的核酸可利用合适的技术插入细胞。另外，异戊二烯合酶、IDI、DXP途径和/或聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸或包含它们的载体可利用标准技术插入宿主细胞(例如本文所述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、或细菌细胞)，标准技术用于将DNA构建体或载体引入宿主细胞，例如转化、电穿孔、细胞核显微注射、转导、转染(例如微脂粒感染介导的或DEAE-Dextrin介导的转染或使用重组噬菌体病毒的转染)、与磷酸钙DNA沉淀物一起孵育、用DNA涂覆的微粒子高速轰击和原生质体融合。一般转化技术是本领域已知的(参见例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人(编辑)第9章，1987；Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor，1989；和Campbell等人，Curr.Genet.16:53-56，1989)。引入的核酸可整合到染色体DNA中或保持作为染色体外复制序列。可通过本领域任何已知的方法选择转化体。选择转化体的合适方法描述于国际公布WO2009/076676、美国专利公布2009/0203102、WO2010/003007、美国公布2010/0048964、WO2009/132220和美国公布2010/0003716。
示例性宿主细胞
本领域的技术人员将认识到表达载体设计用于包含某些组分，它们优化某些宿主菌株的基因表达。此类优化组分包括但不限于复制起点、启动子和增强子。本文提及的载体和组分描述用于示例性目的，并且不意味着缩窄本发明范围。
可用于异源表达基因的任何细胞或其子代可用于表达一种或多种磷酸解酮酶。在某些实施例中，细胞(例如重组细胞)包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的任何生物体。
带有如上文和本文所述编码磷酸解酮酶的异源核酸的细胞(例如重组细胞)也可经工程化以具有表达一种或多种MVA途径肽、异戊二烯合酶、IDI、DXP途径多肽和/或聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸。在一些实施例中，宿主细胞是革兰氏阳性菌。非限制性示例包括棒状杆菌(Corynebacteria)(例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))、链霉菌(Streptomyces)(例如变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、或灰色链霉菌(S.griseus))、芽孢杆菌(Bacillus)、李斯特氏菌(Listeria)(例如单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes))或乳杆菌(Lactobacillus)(例如乳杆菌(L.spp))的菌株。在一些实施例中，来源生物体是革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、或幽门螺旋杆菌(H.pylori)。
细菌细胞，包括革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，可用于表达任何上述异源基因。具体地，mvaE和mvaS基因可在以下任一种细胞中表达：柠檬泛菌(P.citrea)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、白色葡萄球菌(S.albus)、变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、灰色链霉菌(S.griseus)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)和产碱假单胞菌(P.alcaligenes)细胞。
存在多种类型的厌氧细胞，它们可用作本发明组合物和方法的宿主细胞。在本发明的一个方面，在本文所述的任何组合物和方法中描述的细胞是专性厌氧细胞及其子代。专性厌氧菌通常在存在氧气的条件下(如果如此的话)生长不良。应当理解，少量的氧可能存在，即，专性厌氧菌对低氧气含量有一定耐受水平。在一个方面，专性厌氧菌经工程化以产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯，该专性厌氧菌可用作本文所述任何方法和/或组合物的宿主细胞，并且在基本上无氧的条件下生长，其中存在的氧量对厌氧菌的生长、维持和/或发酵无害。
在本发明的另一方面，在本文所述的任何组合物或方法中描述和/或使用的宿主细胞是兼性厌氧细胞及其子代。如果存在氧气，兼性厌氧菌可通过有氧呼吸产生细胞ATP(例如利用TCA循环)。然而，兼性厌氧菌也可在缺乏氧气的情况下生长。这与专性厌氧菌相反，专性厌氧菌在存在大量氧气的情况下死亡或生长不良。在一个方面，因此，兼性厌氧菌可用作本文提供的任何组合物和方法的宿主细胞，并且可经工程化以产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯。兼性厌氧宿主细胞可在基本上无氧的条件下生长，其中存在的氧量对厌氧菌的生长、维持和/或发酵无害，或者另选地可在存在大量氧气的情况下生长。
宿主细胞另外可为丝状真菌细胞及其子代。(参见例如Berka&Barnett，BiotechnologyAdvances，(1989)，7(2):127-154)。在一些方面，丝状真菌细胞可为以下任何细胞：长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、绿色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum)、青霉属(Penicilliumsp.)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏绵状毛腐质霉(H.lanuginose)、灰腐质霉(H.grisea)、金孢子菌属(Chrysosporiumsp.)、勒克瑙金孢子菌(C.lucknowense)、粘帚霉属(Gliocladiumsp.)、曲霉属(Aspergillussp.)如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、酱油曲霉(Asojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)、或泡盛曲霉(A.awamori)、镰孢属(Fusariumsp.)如粉红镰孢菌(F.roseum)、禾谷镰孢菌(F.graminum)、谷类镰孢菌(F.cerealis)、尖孢镰孢菌(F.oxysporuim)、或镶片镰孢菌(F.venenatum)、脉孢菌属(Neurosporasp.)如粗糙脉孢菌(N.crassa)、肉座菌属(Hypocreasp.)、毛霉属(Mucorsp.)如米赫毛霉(M.miehei)、根霉属(Rhizopussp.)或裸壳孢属(Emericellasp.)。在一些方面，真菌是构巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(A.niger)、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉(T.reesei)、绿色木霉(T.viride)、尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、或腐皮镰孢菌(F.solani)。在某些实施例中，本文所用的质粒或质粒组分包括在美国专利公布US2011/0045563中描述的那些。
宿主细胞也可为酵母，例如酵母属(Saccharomycessp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomycessp.)、毕赤酵母属(Pichiasp.)、或假丝酵母属(Candidasp.)。在一些方面，酵母属(Saccharomycessp.)是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(参见例如Romanos等人，Yeast，(1992)，8(6):423-488)。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利7,659,097和美国专利公布US2011/0045563中描述的那些。
宿主细胞另外可为藻类物种，例如绿藻、红藻、灰胞藻(glaucophyte)、绿蜘藻(chlorarachniophyte)、类眼虫(euglenid)、色藻(chromista)、或沟鞭藻类(dinoflagellate)。(参见例如Saunders&Warmbrodt，“GeneExpressioninAlgaeandFungi，IncludingYeast，”(1993)，NationalAgriculturalLibrary，Beltsville，MD)。在某些实施例中，本文所用的质粒或质粒组分包括在美国专利公布US2011/0045563中描述的那些。在一些方面，宿主细胞是蓝细菌，例如基于形态归类为任何以下类别的蓝细菌：色球蓝细菌(Chlorococcale)、宽球蓝细菌(Pleurocapsale)、颤蓝细菌(Oscillatoriale)、念珠蓝细菌(Nostocales)、或真枝蓝细菌(Stigonematales)(参见例如Lindberg等人，Metab.Eng.，(2010)12(1):70-79)。在某些实施例中，本文所用的质粒或质粒组分包括在美国专利公布US2010/0297749；US2009/0282545和国际专利申请WO2011/034863中描述的那些。
大肠杆菌(E.coli)宿主细胞可用于表达来自任何数量生物体的一种或多种磷酸解酮酶。在某些实施例中，细胞(例如重组细胞)包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和/或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、田鼠种布氏杆菌(Brucellamicroti)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Rhodococcusimtechensis、杀虫剂降解伯克氏菌(Burkholderiaxenovorans)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonassp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、链霉菌属(Streptomycessp.)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、加纳链霉菌(Streptomycesghanaensis)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)和/或费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、解糖肠球菌(Enterococcussaccharolyticus)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短吻鳄支原体(Mycoplasmaalligatoris)、肉杆菌属(Carnobacteriumsp.)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和/或关节支原体(Mycoplasmaarthritidis)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、口金氏菌(Kingellaoralis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、人支原体(Mycoplasmahominis)、鳄鱼支原体(Mycoplasmacrocodyli)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、Eremococcuscoleocola、苛养颗粒链菌(Granulicatellaelegans)、副血链球菌(Streptococcusparasanguinis)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、金格杆菌(Kingellakingae)、澳大利亚链球菌(Streptococcusaustralis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)和/或鸽支原体(Mycoplasmacolumbinum)。在一些实施例中，重组细胞包含一个或多个编码磷酸解酮酶的异源核酸拷贝，它们分离自表1、表2和/或图3-24中列出的任何生物体。
这些细胞也可经工程化以具有编码一种或多种MVA途径多肽、异戊二烯合酶、IDI、DXP途径多肽和/或聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸。在一个方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)(大肠杆菌(E.coli))菌株或其子代的能够产生甲羟戊酸的重组细胞，其表达编码上文和本文所述的磷酸解酮酶的一种或多种核酸以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸。大肠杆菌(E.coli)宿主细胞可产生甲羟戊酸，其产生甲羟戊酸的量、峰值滴度和细胞生产率大于缺失编码上文和本文所述的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸的相同细胞。此外，在大肠杆菌(E.coli)中编码上文和本文所述的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸可为染色体拷贝(例如整合到大肠杆菌(E.coli)染色体中的拷贝)。在其它方面，大肠杆菌(E.coli)细胞在培养物中。在一些方面，一种或多种磷酸解酮酶来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)和/或鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)。在任何方面，一种或多种磷酸解酮酶是本文公开的任何磷酸解酮酶。
示例性宿主细胞修饰
柠檬酸合酶途径
柠檬酸合酶催化草酰乙酸和乙酰-CoA缩合以形成柠檬酸，它是一种三羧酸(TCA)循环中的代谢物(Ner，S.等人1983.Biochemistry，22:5243-5249；Bhayana，V.和Duckworth，H.1984.Biochemistry23:2900-2905)。在大肠杆菌(E.coli)中，这种由gltA编码的酶表现为类似二聚体亚基的三聚物。六聚物形式允许酶受NADH的别构调控。这种酶已经得到了广泛研究(Wiegand，G.和Remington，S.1986.AnnualRev.BiophysicsBiophys.Chem.15:97-117；Duckworth等人1987.BiochemSocSymp.54:83-92；Stockell，D.等人2003.J.Biol.Chem.278:35435-43；Maurus，R.等人2003.Biochemistry.42：5555-5565)。为了避免NADH的别构抑制，已经考虑用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NADH-不敏感的柠檬酸合酶进行取代或予以补充(Underwood等人2002.Appl.Environ.Microbiol.68:1071-1081；Sanchez等人2005.Met.Eng.7:229-239)。
由柠檬酸合酶催化的反应与硫解酶催化的甲羟戊酸途径第一步直接竞争，因为它们均具有乙酰-CoA作为底物(Hedl等人2002.J.Bact.184：2116-2122)。因此，本领域的技术人员可调控柠檬酸合酶的表达(例如降低酶活性)以允许较多的碳通量进入甲羟戊酸途径，从而提高甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的最终产量。柠檬酸合酶活性的降低可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的降低。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％。在一些方面，柠檬酸合酶的活性通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性进行调控。这可通过用编码NADH-不敏感的柠檬酸合酶的转基因或用来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的、编码NADH-不敏感的柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体取代来完成。柠檬酸合酶的活性也可通过用合成的组成型低表达启动子取代内源柠檬酸合酶基因启动子进行调控(例如降低)。也可删除编码柠檬酸合酶的基因。与尚未降低柠檬酸合酶表达的细胞相比，柠檬酸合酶的活性降低可导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低柠檬酸合酶(gltA)的活性。本文也设想柠檬酸合酶同功酶的活性调控(例如降低)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低柠檬酸合酶同功酶的活性。
涉及磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的途径
磷酸转乙酰酶((在大肠杆菌(E.coli)中由(i)pta(Shimizu等人1969.Biochim.Biophys.Acta191:550-558或(ii)eutD(Bologna等人2010.JofMicrobiology.48:629-636)编码，催化在乙酰-CoA和乙酰磷酸(乙酰-P)之间的可逆转化，而乙酸激酶(在大肠杆菌(E.coli)中由ackA编码)(Kakuda，H.等人1994.J.Biochem.11:916-922)使用乙酰-P形成乙酸。在大肠杆菌(E.coli)中这些基因可转录为操纵子。它们一起催化乙酸的异化，同时释放ATP。因此，通过增强磷酸转乙酰酶的活性来增加朝向乙酰-CoA的乙酰-P的量是可能的。在某些实施例中，通过在染色体中将上调启动子置于基因上游，或者将一拷贝基因置于质粒上的充分启动子之后，达到增强效果。为了减少朝向乙酸的乙酰-CoA的量，乙酸激酶基因(例如内源乙酸激酶基因)的活性可被降低或减弱。在某些实施例中，通过删除乙酸激酶(ackA)获得减弱。这通过用氯霉素盒取代基因，随后去除该盒来完成。在一些方面，乙酸激酶的活性通过降低内源乙酸激酶的活性进行调控。这可通过用合成的组成型低表达启动子取代内源乙酸激酶基因启动子来完成。在某些实施例中，应完成乙酸激酶基因的减弱，中断磷酸转乙酰酶(pta)基因的表达。乙酸由大肠杆菌(E.coli)出于各种原因产生(Wolfe，A.2005.Microb.Mol.Biol.Rev.69：12-50)。不受理论的约束，删除ackA可导致转入乙酸产生的碳减少(因为ackA利用乙酰-CoA)，并且从而提高甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的收率。
在一些方面，本文所述的重组细胞与不具有减弱的内源乙酸激酶基因表达或增强的磷酸转乙酰酶的细胞相比产生减量的乙酸。产生的乙酸量的减少可通过本领域技术人员已知的常规测定进行测量。在与当不对内源乙酸激酶基因表达或磷酸转乙酰酶基因表达进行分子操纵的情况进行比较时，乙酸的减少量为至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。
磷酸转乙酰酶(pta和/或eutD)的活性可通过对酶的其它分子操纵而被提高。酶活性的降低可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的提高。在一些情况下，酶活性的提高为提高至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。在一个实施例，pta的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs、或者从质粒中表达它而被提高。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高磷酸转乙酰酶(pta和/或eutD)的活性。本文也设想磷酸转乙酰酶同功酶的活性调控(例如提高)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高磷酸转乙酰酶(pta和/或eutD)同功酶的活性。
乙酸激酶(ackA)的活性也可通过对酶的其它分子操纵而被降低。酶活性的降低可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的降低。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低乙酸激酶(ackA)的活性。本文也设想乙酸激酶同功酶的活性调控(例如降低)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低乙酸激酶同功酶的活性。
在一些情况下，与尚未减弱内源乙酸基因表达的细胞相比，内源乙酸激酶基因的活性减弱导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。
涉及乳酸脱氢酶的途径
在大肠杆菌(E.coli)中，D-乳酸由丙酮酸通过乳酸脱氢酶(由ldhA编码–图1)产生(Bunch，P.等人1997.Microbiol.143：187-195)。乳酸的产生伴随有NADH的氧化，因此当氧气受限并且不能消耗所有还原当量时产生乳酸。因此，乳酸产生可为碳消耗的来源。同样地，为了改善转向甲羟戊酸产生(和异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯产生，如果需要)的碳流，本领域的技术人员可调控乳酸脱氢酶的活性，例如通过降低酶活性进行调控。
因此，在一个方面，乳酸脱氢酶的活性可通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性进行调控。这种减弱可通过删除内源乳酸脱氢酶基因获得。也可使用本领域的技术人员已知的减弱乳酸脱氢酶基因活性的其它方式。通过操纵涉及乳酸脱氢酶的途径，重组细胞与不具有减弱的内源乳酸脱氢酶基因表达的细胞相比产生减量的乳酸。产生的乳酸量的减少可通过本领域技术人员已知的常规测定进行测量。在与当不进行分子操纵的情况进行比较时，乳酸的减少量为至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。
乳酸脱氢酶的活性也可通过对酶的其它分子操纵而被降低。酶活性的降低可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的降低。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。
因此，在一些情况下，与尚未减弱内源乳酸脱氢酶基因表达的细胞相比，内源乳酸脱氢酶基因的活性减弱导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。
涉及3-磷酸甘油醛的途径
3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)是糖酵解的关键酶，催化3-磷酸甘油醛转化成1,3-二磷酸-D-甘油酸(BranlantG.和BranlantC.1985.Eur.J.Biochem.150：61-66)。
为了引导碳流向磷酸解酮酶，可调控3-磷酸甘油醛脱氢酶表达(例如降低酶活性)以允许更多的碳流向6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖，从而降低最终的甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯产量。3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的降低可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的降低。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％。或100％。在一些方面，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性通过降低内源3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性进行调控。这可通过用合成的组成型低表达启动子取代内源3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子来完成。也可删除编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因。编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因也可被催化相同反应，但是产生NADPH而非NADH的芽孢杆菌(Bacillus)酶取代。与尚未降低3-磷酸甘油醛脱氢酶表达的细胞相比，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性降低可导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)的活性。本文也设想3-磷酸甘油醛脱氢酶同功酶的活性调控(例如降低)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)同功酶的活性。
涉及Entner-Doudoroff途径的途径
Entner-Doudoroff(ED)途径是Emden-Meyerhoff-Parnass(EMP–糖酵解)途径的替代途径。一些生物体如大肠杆菌(E.coli)具有ED和EMP途径，而其它生物体仅具有其中之一。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)仅具有EMP途径，而运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)仅具有ED途径(Peekhaus和Conway.1998.J.Bact.180:3495-3502；Stulke和Hillen.2000.Annu.Rev.Microbiol.54，849–880；Dawes等人1966.Biochem.J.98:795-803)。果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)与Entner-Doudoroff途径相互作用并且可逆地催化1,6-二磷酸果糖转化成磷酸二羟丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(GAP)(BaldwinS.A.等人.，BiochemJ.(1978)169(3):633-41)。
磷酸葡糖脱水酶(edd)从6-磷酸-D-葡糖酸中去除一个H2O分子以形成6-磷酸2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸，而2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)催化羟醛裂解(Egan等人1992.J.Bact.174：4638-4646)。两个基因位于操纵子中。
可引入磷酸解酮酶途径的代谢物也可转入ED途径。为了避免ED-途径的代谢物损耗，减弱磷酸葡糖脱水酶基因(例如内源磷酸葡糖脱水酶基因)和/或2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶基因(例如内源2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶基因)的活性。获得减弱的一种方式是删除磷酸葡糖脱水酶(edd)和/或2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)。这可通过用氯霉素或卡那霉素盒取代一个或两个基因，随后去除该盒来完成。无这些酶活性的话，更多的碳可流向磷酸解酮酶，从而提高甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的收率。
磷酸葡糖脱水酶(edd)和/或2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)的活性也可通过酶的其它分子操纵而被降低。酶活性的降低可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的降低。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。
在一些情况下，与不具有减弱的内源磷酸葡糖脱水酶基因和/或内源乙酸激酶2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶基因表达的细胞相比，减弱内源磷酸葡糖脱水酶基因和/或内源2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶基因的活性导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。
可引入磷酸解酮酶途径的代谢物也可转入ED途径或EMP途径。为了避免代谢物损耗并提高6-磷酸果糖(F6P)浓度，减弱果糖二磷酸醛缩酶(例如内源果糖二磷酸醛缩酶)活性。在一些情况下，与尚未减弱内源果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)基因表达的细胞相比，内源果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)基因的活性减弱导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。在一些方面，通过删除果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)获得减弱。删除可通过用氯霉素或卡那霉素盒取代基因，随后去除该盒来完成。在一些方面，果糖二磷酸醛缩酶的活性通过降低内源果糖二磷酸醛缩酶的活性进行调控。这可通过用合成的组成型低表达启动子取代内源果糖二磷酸醛缩酶基因启动子来完成。无这些酶活性的话，更多的碳可流向磷酸解酮酶，从而提高甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的收率。果糖二磷酸醛缩酶的活性也可通过对酶的其它分子操纵而被降低。酶活性的降低可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的降低。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)的活性。本文也设想果糖二磷酸醛缩酶同功酶的活性调控(例如降低)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低果糖二磷酸醛缩酶同功酶的活性。
涉及磷酸戊糖途径的氧化支路的途径
大肠杆菌(E.coli)利用磷酸戊糖途径降解己糖和戊糖并且为细胞提供各种同化途径的中间体。它也是NADPH的主要产生者。磷酸戊糖途径由氧化支路(具有酶如葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)、6-磷酸葡萄糖内酯酶(pgl)或6-磷酸葡糖酸脱氢酶(gnd))和非氧化支路(具有酶如转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶(talA或talB)、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶、5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)和/或核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe))构成(Sprenger.1995.Arch.Microbiol.164:324-330)。
为了引导碳流向磷酸解酮酶，可调控磷酸戊糖途径的非氧化支路(转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶、5-磷酸核糖异构酶A、5-磷酸核糖异构酶B和/或核酮糖-5-磷酸3-表异构酶)表达(例如提高酶活性)以允许更多的碳通量朝向6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖，从而提高甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的最终产量。转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶活性的提高可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的提高。在一些情况下，酶活性的提高至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％。在一些方面，转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶的活性通过提高内源转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶的活性进行调控。这可通过用合成的组成型高表达启动子取代内源转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶基因启动子来完成。编码转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶的基因也可在质粒上克隆于合适启动子之后。与不具有提高的转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶表达的细胞相比，转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶活性的提高可导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。
在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高转酮醇酶(tktA和/或tktB)的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低转酮醇酶(tktA和/或tktB)的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高转醛醇酶(talA或talB)的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)的活性。本文也设想葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)、6-磷酸葡萄糖内酯酶(pgl)、6-磷酸葡糖酸脱氢酶(gnd)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶(talA或talB)、核酮糖-5-磷酸-表异构酶、5-磷酸核糖表异构酶、5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)和/或核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)的同功酶的活性调控(例如降低或提高)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)同功酶的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高转酮醇酶(tktA和/或tktB)同功酶的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低转酮醇酶(tktA和/或tktB)同功酶的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高转醛醇酶(talA或talB)同功酶的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)同功酶的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)同功酶的活性。
为了引导碳流向磷酸解酮酶，可调控葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(例如降低酶活性)。在一些方面，葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)(例如内源葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶基因)的活性可被降低或减弱。在某些实施例中，通过删除葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶获得减弱。在一些方面，葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶的活性通过降低内源葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶的活性进行调控。这可通过用合成的组成型低表达启动子取代内源葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶基因启动子来完成。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)的活性。本文也设想葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶同功酶的活性调控(例如降低)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶同功酶的活性。
涉及磷酸果糖激酶的途径
磷酸果糖激酶是一种糖酵解中的关键酶，它催化6-磷酸果糖的磷酸化。大肠杆菌(E.coli)具有由pfkA和pfkB编码的两种同功酶。细胞中大部分磷酸果糖激酶活性来源于pfkA(Kotlarz等人1975Biochim.Biophys.Acta381:257-268)。
为了引导碳流向磷酸解酮酶，可调控磷酸果糖激酶表达(例如降低酶活性)以允许更多的碳流向6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖，从而降低最终的甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯产量。磷酸果糖激酶活性的降低可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的降低。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％。或100％。在一些方面，磷酸果糖激酶的活性通过降低内源磷酸果糖激酶的活性进行调控。这可通过用合成的组成型低表达启动子取代内源磷酸果糖激酶基因启动子来完成。也可删除编码磷酸果糖激酶的基因。与尚未降低磷酸果糖激酶表达的细胞相比，磷酸果糖激酶的活性降低可导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。
在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低6-磷酸果糖(pfkA和/或pfkB)的活性。本文也设想6-磷酸果糖同功酶的活性调控(例如降低)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低6-磷酸果糖同功酶的活性。
涉及丙酮酸脱氢酶复合物的途径
丙酮酸脱氢酶复合物催化丙酮酸脱羧成乙酰-CoA，它由基因aceE、aceF和lpdA编码的蛋白质构成。那些基因的转录受若干调节子的调控。因此，本领域的技术人员可通过调控丙酮酸脱氢酶复合物的活性增加乙酰-CoA。调控可用于提高丙酮酸脱氢酶复合物的活性和/或表达(例如恒定表达)。这可通过不同方式完成，例如通过将强组成型启动子如PL.6(aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg-λ启动子，GenBankNC_001416，SEQIDNO:14)置于操纵子之前或利用一种或多种合成的组成型表达启动子。
因此，在一个方面，丙酮酸脱氢酶的活性通过提高丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种酶的活性进行调控，该复合物包含(a)丙酮酸脱氢酶(E1)，(b)二氢硫辛酸乙酰转移酶，和(c)二氢硫辛酸脱氢酶。应当理解，可调控编码这些酶的任一种、两种或三种基因以提高丙酮酸脱氢酶的活性。在另一方面，丙酮酸脱氢酶复合物的活性可通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏物的活性进行调控，这在下文中进一步详述。内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏物的活性可通过删除内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏物基因而被减弱。
在一些情况下，编码丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因是内源基因。用于提高丙酮酸脱氢酶复合物的活性的另一种方式是通过向细胞中引入一种或多种异源核酸，其编码来自(a)丙酮酸脱氢酶(E1)，(b)二氢硫辛酸乙酰转移酶，和(c)二氢硫辛酸脱氢酶的一种或多种多肽。
通过利用这些方法中的任一种，与其中不调控丙酮酸脱氢酶活性的细胞相比，重组细胞可产生增量的乙酰Co-A。与尚未调控丙酮酸脱氢酶表达的细胞相比，调控丙酮酸脱氢酶的活性可导致更多的碳通量进入依赖甲羟戊酸的生物合成途径。
涉及转移酶体系的途径
依赖磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸转移酶体系(PTS)是一种多组分体系，其在一个依赖由糖酵解中间体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)提供能量的过程中同时转运并磷酸化它的碳水化合物底物通过膜。调控PTS的基因大多数聚集在操纵子中。例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)的pts操纵子(ptsHIcrr)由ptsH、ptsI和crr基因构成，它们编码依赖磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸转移酶体系(PTS)的三种中心蛋白质：HPr(ptsH)、酶I(ptsI)和EIIIGlc(crr)蛋白质。将这三种基因组织在复合操纵子中，其中远端基因crr的主要表达部分从ptsI内的启动子区域开始。除了pts操纵子基因之外，ptsG编码磷酸转移酶体系的葡萄糖特异性转运蛋白ptsG。从这个启动子区域开始的转录处于分解代谢物激活因子蛋白质(CAP)-环状AMP(cAMP)的正控制下，并且在存在葡萄糖(PTS底物)的生长期间增强。此外，ppsA基因编码用于产生磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，它是磷酸转移酶体系(PTS)活性必需的。碳通量由磷酸烯醇式丙酮酸合成酶导向通过丙酮酸脱氢酶途径或PTS途径。参见Postma，P.W.等人，MicrobiolRev.(1993)，57(3):543-94)，该文献全文以引用方式并入本文。
在本文所述的某些实施例中，pts操纵子的下调(例如减弱)可增强宿主细胞的乙酸利用率。PTS操纵子活性的下调可为与当尚未发生有效调控时比较，任何量的比活性或总活性的降低。在一些情况下，复合物活性的降低为降低至少约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。在某些实施例中，通过删除pts操纵子获得减弱。在一些方面，PTS体系的活性通过降低内源pts操纵子的活性进行调控。这可通过用合成的组成型低表达启动子取代在pts操纵子内的内源启动子来完成。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低pts操纵子的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低EI(ptsI)的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低EIICBGlc(ptsG)的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低EIIAGlc(crr)的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低HPr(ptsH)的活性。为了减少通过丙酮酸脱氢酶的碳损耗同时增加用于葡萄糖摄取的PEP总量，可提高磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA)的活性。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以提高磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA)的活性。在本发明的任何其它方面，下调PTS并且上调葡萄糖转运途径。葡萄糖转运途径包括但不限于半乳糖(galP)和葡糖激酶(glk)。在一些实施例中，下调pts操纵子，上调半乳糖(galP)基因，并且上调葡糖激酶(glk)基因。本文也设想PTS同功酶的活性调控(例如降低)。在本发明的任何方面，本文提供了重组细胞，其包含编码如本文所公开的磷酸解酮酶多肽的一种或多种异源表达的核酸，并且进一步经工程化以降低PTS同功酶的活性。
涉及利用木糖的途径
在本文所述的某些实施例中，期望利用木糖以将来源于植物生物质的糖转化成期望产物，例如甲羟戊酸，例如类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯。在一些生物体中，木糖利用需要使用磷酸戊糖途径转化将6-磷酸果糖用于代谢。生物体可经工程化以增强木糖利用率，这或者通过灭活葡萄糖的分解代谢物阻遏，或者通过异源表达来自其它生物体中存在的木糖操纵子的基因。木酮糖途径可如下所述进行工程化以增强经由磷酸解酮酶途径的甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的产量。
增强木糖摄取和向5-磷酸木酮糖的转化，随后直接进入磷酸解酮酶途径将具有有益效果。不受理论的约束，这允许碳通量转向磷酸戊糖途径的旁路(虽然一些3-磷酸甘油醛可按需循环进入PPP)。增强的木酮糖激酶表达可用于提高5-磷酸木酮糖的总体产量。木酮糖激酶表达和活性的优化可用于增强菌株中磷酸解酮酶途径的木糖利用。期望的木酮糖激酶可为内源宿主的酶或者任何与宿主相容的异源木酮糖激酶。在一个实施例中，可过表达木糖操纵子的其它组分以获得提高的有益效果(例如木糖异构酶)。在另一个实施例中，可能需要减弱其它木糖途径酶(例如木糖还原酶)(例如降低或删除活性)。
因此，经工程化以具有如本文所述的磷酸解酮酶的宿主细胞可进一步经工程化以过表达内源形式或异源形式的木酮糖异构酶和/或木酮糖激酶，从而改善甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的总体收率和生产率。
涉及磷酸戊糖途径的转醛醇酶和转酮醇酶的途径
一些微生物能够厌氧或异形发酵生长，它们除糖酵解途径外还包含磷酸解酮酶途径，或者包含磷酸解酮酶途径代替糖酵解途径。这种途径依赖磷酸戊糖途径酶转醛醇酶和转酮醇酶的活性。因此，经工程化以具有如本文所述的磷酸解酮酶的宿主细胞可进一步经工程化以过表达内源形式或异源形式的转醛醇酶和转酮醇酶，从而改善途径通量、降低潜在的毒性中间体的含量、减少中间体去往非生产途径的转向、并且改善甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的总体收率和生产率。
突变组合
应当理解，对于本文所述的任何酶和/或酶途径，清楚地设想调控本文所述的酶和/或酶途径的任何组合(两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、或十四个)的分子操纵。为了便于表述组合，将柠檬酸合酶(gltA)命名为A，磷酸转乙酰酶(pta)命名为B，乙酸激酶(ackA)命名为C，乳酸脱氢酶(ldhA)命名为D，3-磷酸甘油醛脱氢酶(gap)命名为E，并且丙酮酸脱羧酶(aceE、aceF和/或lpdA)命名为F，磷酸葡糖脱水酶(edd)命名为G，2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)命名为H，磷酸果糖激酶命名为I，转醛醇酶命名为J，转酮醇酶命名为K，核酮糖-5-磷酸-表异构酶命名为L，5-磷酸核糖表异构酶命名为M，木酮糖激酶命名为N，木糖异构酶命名为O，并且木糖醇还原酶命名为P，5-磷酸核糖异构酶(rpi)命名为Q，D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)命名为R，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(pps)命名为S，果糖二磷酸醛缩酶(fba)命名为T，EI(ptsI)命名为U，EIICBGlc(ptsG)命名为V，EIIAGlc(crr)命名为W，HPr(ptsH)命名为X，半乳糖(galP)命名为Y，葡糖激酶(glk)命名为Z，6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)命名为AA。如上所述，丙酮酸脱羧酶复合物的aceE、aceF和/或lpdA酶可单独使用，或者使用三种酶中的两种、或三种酶中的三种以提高丙酮酸脱羧酶活性。因此，明确地设想本文命名为A-M的任何及所有酶组合以及命名为A-AA的任何及所有酶组合。此外，上文所述的任何组合可用于与本文所述的任何酶和/或酶途径进行组合(例如磷酸解酮酶、MVA途径多肽、异戊二烯合酶、DXP途径多肽)。
用于提高产量的其它调节子和因子
可使用其它分子操纵以提高朝向甲羟戊酸产生的碳流。一种方法用于减少、降低或消除供给甲羟戊酸途径的途径负调节子的功效。例如，在一些情况下，基因aceEF-lpdA位于操纵子中，在pdhR上游带有第四基因。基因pdhR是其操纵子转录的负调节子。在不存在丙酮酸时，它结合它的目标启动子并阻遏转录。它也以相同方式调控ndh和cyoABCD(Ogasawara，H.等人2007.J.Bact.189：5534-5541)。在一个方面，删除pdhR调节子可改善丙酮酸供应，并且从而改善甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯的产量。
在其它实施例中，上文所述的任何所得菌株可进一步经工程化以调节Entner-Doudoroff途径的活性。可减弱或删除编码磷酸葡糖脱水酶或醛缩酶的基因。在其它实施例中，上文所述的任何所得菌株也可经工程化以降低或去除乙酸激酶或柠檬酸合酶的活性。在其它实施例中，所得菌株的任何菌株也可经工程化以降低或去除磷酸果糖激酶的活性。在其它实施例中，上文所述的任何所得菌株也可经工程化以调节3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性。3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性可通过降低其活性进行调节。在其它实施例中，可过表达来自磷酸戊糖途径的非氧化支路的酶，例如转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)5-磷酸核糖表异构酶。
在其它方面，通过引入编码景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶/果糖-1,6–二磷酸醛缩酶和景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶/果糖-1,6–二磷酸磷酸酶的异源核酸，宿主细胞可进一步经工程化以提高细胞内乙酰磷酸的浓度。在某些实施例中，具有这些分子操纵的宿主细胞可与减弱的或删除的转醛醇酶(talB)和磷酸果糖激酶(pfkA和/或pfkB)基因组合，从而允许4-磷酸赤藓糖、磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛更快地转化成7-磷酸景天庚酮糖和1-磷酸果糖(参见图5)。
在其它方面，将6-磷酸葡萄糖内酯酶(PGL)引入缺失PGL的细胞(例如各种大肠杆菌(E.coli)菌株)可用于改善甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯的产量。可通过引入利用染色体整合或染色体外载体如质粒的编码基因引入PGL。
除了宿主细胞(例如细菌宿主细胞)用于调节如本文所述提高朝向甲羟戊酸产生的碳通量的各种酶途径的突变外，本文所述的宿主细胞还包含编码磷酸解酮酶多肽、以及来自上游和下游MVA途径的其它酶的基因，包括但不限于mvaE和mvaS基因产物。MVA途径多肽的非限制性示例包括乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽和具有两种或更多种MVA途径多肽活性的多肽(例如融合多肽)。MVA途径多肽可包括多肽、多肽片段、肽和融合多肽，它们具有至少一种上游MVA途径多肽的活性。示例性MVA途径核酸包括编码具有至少一种MVA途径多肽活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括天然存在的多肽和核酸，它们来自本文所述的任何来源的生物体。
可使用的MVA途径多肽的非限制性示例描述于国际专利申请公布WO2009/076676；WO2010/003007和WO2010/148150中。
示例性细胞培养基
如本文所用，术语“基本培养基”是指包含供细胞生长的最小限度营养物质的培养基，其一般(但不是总是)不包含一种或多种氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种氨基酸)。基本培养基通常包含：(1)用于细菌生长的碳源；(2)各种盐，它们可根据菌种和生长条件而变化；和(3)水。碳源可变化很大，从单糖如葡萄糖变为较复杂的其它生物质的水解产物如酵母提取物，这在下文中详述。盐一般提供必需元素如酶、氮、磷和硫，使得细胞合成蛋白质和核酸。基本培养基也可补充有选择剂如抗生素，用于选择以保持某些质粒等。例如，如果微生物对某些抗生素如氨苄青霉素或四环素有抗性，那么可将该抗生素加入培养基以防止缺乏该抗性的细胞生长。培养基可补充有其它化合物，它们是选择期望生理或生物化学特性所必需的，例如特定氨基酸等。
任何基本培养基制剂可用于培养宿主细胞。示例性基本培养基制剂包括例如M9基本培养基和TM3基本培养基。每升M9基本培养基包含(1)200mL无菌M9盐(每升含64gNa2HPO4-7H2O，15gKH2PO4，2.5gNaCl，和5.0gNH4Cl)；(2)2mL1MMgSO4(无菌)；(3)20mL20％(w/v)葡萄糖(或其它碳源)；和(4)100μl1MCaCl2(无菌)。每升TM3基本培养基包含(1)13.6gK2HPO4；(2)13.6gKH2PO4；(3)2gMgSO4*7H2O；(4)2g一水合柠檬酸；(5)0.3g柠檬酸铁铵；(6)3.2g(NH4)2SO4；(7)0.2g酵母提取物；和(8)1mL1000X痕量元素溶液；将pH调节至～6.8并且溶液经过滤除菌。每升1000X痕量元素包含：(1)40g一水合柠檬酸；(2)30gMnSO4*H2O；(3)10gNaCl；(4)1gFeSO4*7H2O；(4)1gCoCl2*6H2O；(5)1gZnSO4*7H2O；(6)100mgCuSO4*5H2O；(7)100mgH3BO3；和(8)100mgNaMoO4*2H2O；将pH调节至～3.0。
另外的示例性基本培养基包括(1)磷酸氢二钾K2HPO4，(2)硫酸镁MgSO4*7H2O，(3)一水合柠檬酸C6H8O7*H2O，(4)柠檬酸铁铵NH4FeC6H5O7，(5)酵母提取物(来自biospringer)，(6)1000X改良痕量金属溶液，(7)硫酸50％w/v，(8)消泡剂foamblast882(EmeraldPerformanceMaterials)，和(9)MacroSaltsSolution3.36ml。所有成分一起加入并溶解在去离子H2O中并随后加热灭菌。在冷却至室温后，用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0并适量至体积。在灭菌并调节pH后加入维生素溶液和奇放线菌素。
任何碳源可用于培养宿主细胞。术语“碳源”是指一种或多种含碳化合物，它们能够被宿主细胞或生物体代谢。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可包括适于维持宿主细胞活力或供宿主细胞生长的碳源。在一些方面，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖、或多糖)、或转化糖(例如酶处理的蔗糖浆)。
在一些方面，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种组分。在一些方面，酵母提取物的浓度为0.1％(w/v)，0.09％(w/v)，0.08％(w/v)，0.07％(w/v)，0.06％(w/v)，0.05％(w/v)，0.04％(w/v)，0.03％(w/v)，0.02％(w/v)，或0.01％(w/v)的酵母提取物。在一些方面，碳源包括酵母提取物(或其一种或多种组分)和另一种如葡萄糖。
示例性单糖包括葡萄糖和果糖；示例性寡糖包括乳糖和蔗糖，并且示例性多糖包括淀粉和纤维素。示例性碳水化合物包括C6糖(例如果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(例如木糖或阿拉伯糖)。
示例性细胞培养条件
适于维持本发明的重组细胞并供其生长的材料和方法如下所述，例如在实例部分。适于维持细菌培养物并供其生长的其它材料和方法实本领域熟知的。示例性技术可见于国际公布WO2009/076676、美国专利公布2009/0203102、WO2010/003007、美国公布2010/0048964、WO2009/132220、美国公布2010/0003716、ManualofMethodsforGeneralBacteriologyGerhardt等人编辑)、AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.(1994)或BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版(1989)SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA。在一些方面，细胞在培养基中培养，培养条件允许表达磷酸解酮酶多肽以及来自上游和下游MVA途径的其它酶，包括但不限于mvaE和mvaS基因产物、异戊二烯合酶、DXP途径(例如DXS)、IDI、或PGL多肽，它们由插入宿主细胞的核酸编码。
标准细胞培养条件可用于培养细胞(参见例如，WO2004/033646及其引用的参考文献)。在一些方面，细胞在合适的温度、气体混合物和pH下(例如在约20℃至约37℃，约6％至约84％CO2，并且在介于约5至约9的pH下)生长并维持。在一些方面，细胞在35℃的合适培养基中生长。在一些方面，发酵的pH范围介于约pH5.0至约pH9.0之间(例如约pH6.0至约pH8.0或约6.5至约7.0)。细胞可基于宿主细胞的需求在厌氧、缺氧、或有氧条件下生长。此外，可利用较具体的细胞培养条件培养细胞。例如，在一些实施例中，在强启动子控制下，在低至中拷贝质粒中，重组细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)包含一种或多种异源核酸，其编码磷酸解酮酶多肽以及来自上游的酶，包括但不限于mvaE和mvaS基因产物mvaE和mvaS多肽，它们来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)，并且该重组细胞在34℃下培养。
标准培养条件和可使用的发酵模式，例如分批发酵、分批补料发酵、或连续发酵，描述于国际公布WO2009/076676、美国专利公布2009/0203102、WO2010/003007、美国公布2010/0048964、WO2009/132220、美国公布2010/0003716中。分批发酵和分批补料发酵是本领域常见的和熟知的，并且实例可见于Brock，Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版(1989)SinauerAssociates，Inc。
在一些方面，细胞在有限葡萄糖条件下培养。“有限葡萄糖条件”是指加入的葡萄糖量少于或为约105％(例如约100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，或10％)的细胞消耗葡萄糖量。在特定方面，加入培养基的葡萄糖量大约与在特定时期细胞消耗的葡萄糖量相同。在一些方面，细胞生长速率受到有限的葡萄糖加入量的控制，使得细胞以细胞培养基中的葡萄糖量可维持的速率生长。在一些方面，葡萄糖在细胞培养期间不积聚。在各种方面，细胞在有限葡萄糖条件下培养大于或约1，2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，50，60，或70小时。在各种方面，细胞在有限葡萄糖条件下培养大于或约5，10，15，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，95，或100％的总细胞培养时间。虽然不旨在受任何具体理论的约束，据信有限葡萄糖条件可允许更有利的细胞调控。
在一些方面，重组细胞以分批培养方式生长。重组细胞也可以分批补料或连续培养方式生长。另外，重组细胞可在基本培养基中培养，包括但不限于任何上述基本培养基。基本培养基还可补充有1.0％(w/v)葡萄糖，或者任何其它六碳糖，或更少的糖。具体地，基本培养基可补充有1％(w/v)，0.9％(w/v)，0.8％(w/v)，0.7％(w/v)，0.6％(w/v)，0.5％(w/v)，0.4％(w/v)，0.3％(w/v)，0.2％(w/v)，或0.1％(w/v)葡萄糖。另外，基本培养基可补充0.1％(w/v)或更少的酵母提取物。具体地，基本培养基可补充有0.1％(w/v)，0.09％(w/v)，0.08％(w/v)，0.07％(w/v)，0.06％(w/v)，0.05％(w/v)，0.04％(w/v)，0.03％(w/v)，0.02％(w/v)，或0.01％(w/v)酵母提取物。另选地，基本培养基可补充有1％(w/v)，0.9％(w/v)，0.8％(w/v)，0.7％(w/v)，0.6％(w/v)，0.5％(w/v)，0.4％(w/v)，0.3％(w/v)，0.2％(w/v)，或0.1％(w/v)葡萄糖，并且补充有0.1％(w/v)，0.09％(w/v)，0.08％(w/v)，0.07％(w/v)，0.06％(w/v)，0.05％(w/v)，0.04％(w/v)，0.03％(w/v)，0.02％(w/v)，或0.01％(w/v)酵母提取物。
示例性纯化
在一些方面，本文所述的任何方法还包括回收产生的化合物的步骤。在一些方面，本文所述的任何方法还包括回收异戊二烯的步骤。在一些方面，通过吸收反萃取回收异戊二烯(参见例如美国公布2011/0178261)。在一些方面，本文所述的任何方法还包括回收异源多肽的步骤。在一些方面，本文所述的任何方法还包括回收类萜或类胡萝卜素的步骤。
合适的纯化方法详述于美国专利申请公布US2010/0196977A1中。
在整个本说明书中，参考各种专利、专利申请和其它类型的公布(例如期刊文章)。本文引用的所有专利、专利申请和公布的公开据此全文以引用方式并入用于各种目的。
参考以下实例可进一步理解本发明，它们通过例证的方式提供并且并非旨在为限制性的。
实例：
实例1：鉴定磷酸解酮酶
为了鉴定可用于重组细胞中改善的乙酰辅酶A-衍生(乙酰-CoA-衍生)代谢物、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯产生的磷酸解酮酶，在NCBI网中的址CDART程序用于选择所有基因产物，它们与已知的磷酸解酮酶结构域构造一致(GeerL等人(2002)，“CDART:proteinhomologybydomainarchitecture.”，GenomeRes.12(10)1619-23)。通过从初始结构域构造搜索中选择refseq序列，进一步精选序列。接下来，基于序列相似性将序列分为22个不同的组(ClusteringbyPassingMessagesBetweenDataPoints.BrendanJ.Frey和DelbertDueck，UniversityofTorontoScience315，972–976，2007年2月)。简而言之，氨基酸序列使用ClustalW进行多重比对。计算成对百分比同一性(Pairwisepercentidentities，PIDs)。这进行可操作地定义并且在这种情况下它是与比对残基相同的残基数。将PIDs转化成通过式K＝-Ln(1-D-(D.D)/5)表示的距离(Kimura，M.TheneutralTheoryofMolecularEvolution，Camb.Univ.Press，1983，第75页)。负距离用作上式中的相似性得分。中等相似性用作每个时间点的优选要求。使用这种方法定义22个簇(图3-24)。合成编码每个簇的中心代表性序列的氨基酸序列的DNA(图2和表1)。在其中来自簇的中心代表性序列经测定由于缺失完整的磷酸解酮酶结构域而不可能代表活性磷酸解酮酶的情况下，选择来自该簇的一种替代磷酸解酮酶进行DNA合成(表1)。
表1：中心代表性序列
N/D指示未完成
*取代了中心代表性烟曲霉(Aspergillusfumigatus)Af293(NCBI编号70999652)
编码簇8内使用ClustalW进行的彼此及与簇11(其具有与簇8的最大相似性)的成对比对少于90％相同的蛋白质序列(包含鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)磷酸解酮酶)的DNA被设计用于蛋白质合成(表2)。
表2：来自簇8和簇11的序列
表3：来自簇8的序列—氨基酸序列同一性百分比
表4：来自簇11的序列—氨基酸序列同一性百分比
簇11参考AA 磷酸解酮酶AA序列 氨基酸％同一性
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:32 99
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:33 65
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:34 89
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:35 74
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:36 69
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:37 79
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:38 65
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:39 68
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:40 77
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:41 67
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:42 68
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:43 74
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:44 84
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:45 79
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:46 66
实例2：鉴定在缺失磷酸果糖激酶的细菌基因组中的磷酸解酮酶
对具有注解磷酸解酮酶(PKL)但是不具有注解磷酸果糖激酶(PFK)的细菌基因组进行搜索，它是通过糖酵解的碳通量的关键酶。选择适合这些标准的若干生物体，以及来自五种PKL的这一列表的特定PKL进行高活性和葡萄糖至异戊二烯的高收率研究，PKL来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)PsJN(SEQIDNO:47)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)NRRLB-30929(SEQIDNO:48)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)DSM20093(SEQIDNO:49)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)Bd1(SEQIDNO:50)和双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)IPLA20015(SEQIDNO:51)。因为来自生物体全列表的大多数PKL尚未进行表征，五种PKL的选择基于序列差异和可从文献中获取的最好的高活性环境证据进行。来自齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)的PKL显示最佳为7的pH(SgorbatiB.等人，AntonievanLeeuwenhoek1976(42)，49-57)，而其它PKL的pH最佳值通常为6左右(HeathEC.等人，JBioChem1957，1009-1029)。从燃料乙醇植物中分离作为污染物的布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)，并且其显示在葡萄糖和木糖上生长，据推测通过对F6P或X5P的PKL活性获得细胞质量和能量(LiuS.等人，JIndMicrobiolBiotechnol2008(35)，75-81)。选择来自双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)的PKL是因为这些菌株能够以葡萄糖或木糖作为单一碳源生长良好(PalframanRJ.等人，CurrIssuesIntestMicrobiol2003(4)，71-75)。
实例3：克隆鉴定的磷酸解酮酶
获取自长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的PKL每个测定其酶活性。长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)PKL具有5.7±1.16mM的Km，4.56±0.2sec-1的kcat，和0.79±0.2mM-1sec-1的kcat/Km，鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)PKL具有10.4±1.03mM的Km，1.35±0.04sec-1的kcat，和0.13±0.1mM-1sec-1的kcat/Km，并且发现丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)PKL具有10.3±0.67mM的Km，2.18±0.05sec-1的kcat，和0.21±0.06mM-1sec-1的kcat/Km。编码长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)PKL的构建体用作筛选候选PKL酶的体内和体外活性的对照。
鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)PKL的氨基酸序列(SEQIDNO:93)获取自GenBank并在GeneArt优化软件中进行处理以获得在大肠杆菌(E.coli)中的优化表达。将两个碱基对加到PKL基因前方以形成BspHI位点，并且将一个SacI位点插入终止密码子之后。将合成的PKL基因克隆到GeneArt抗卡那霉素克隆质粒中。随后将鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)PKL基因亚克隆到NcoI/SacI-消化的pTrcHis2B载体(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)中以形成质粒pCMP1321(表5，图25)。
长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)菌株ATCC15697的染色体DNA获取自ATCC(Manassas，VA)。编码长双歧杆菌(B.longum)PKL的基因通过聚合酶链反应(PCR)从染色体DNA进行扩增，PCR利用引物CMP283:5’-ctgtatTCATGAcgagtcctgttattggcacc-3’和CMP284:5’-ctctatGAATTCTCACTCGTTGTCGCCAGCG-3’，以及根据制造商规程利用聚合酶Herculase(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。PCR产物在纯化前用EcoRI和BspHI限制性酶消化。在纯化后，利用GENEART无缝克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将大约2500bp片段组装成EcoRI/NcoI-消化的pTrcHis2B(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从而形成质粒pCMP1090(表5)。
为了构建编码丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)PKL的对照质粒，菌株ATCCBAA-98的染色体DNA获取自ATCC(Manassas，VA)。编码丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)PKL的基因通过聚合酶链反应(PCR)从染色体DNA进行扩增，PCR利用引物CacetpTrcHisBF:5’-taaggaggaataaaccatgcaaagtataataggaaaacataaggatgaagg-3’和CacetpTrcHisBR:5’-ttctagaaagcttcgttatacatgccactgccaattagttatttc-3’，以及根据制造商规程利用聚合酶Herculase(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。纯化PCR产物并利用GENEART无缝克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将大约2500bp的片段组装成EcoRI/NcoI-消化的pTrcHis2B(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从而形成质粒pCMP1364(表3)。
编码来源于齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofermans)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(SEQIDNO:94)中每个的PKL蛋白质的核酸序列经密码子优化以在大肠杆菌(E.coli)中表达，并且通过基因Oracle(MountainView，CA)合成。这些经密码子优化的PKL基因根据制造商推荐的规程使用GeneArt无缝克隆试剂盒(LifeTechnologies)，通过PCR进行扩增并亚克隆到pTrcHis2B表达质粒中。下表5列出用于构建质粒pMCS530至pMCS535的引物。将PKL酶克隆到pTrc启动子下游以允许通过IPTG诱导型表达磷酸解酮酶基因(表6，图26-31)。
表5：用于构建质粒的引物
表6：编码PKL的质粒
质粒 描述
pCMP1321 pTrcHis2B鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)PKL，Carb
pCMP1090 pTrcHis2B长双歧杆菌(B.longum)PKL，Carb
pCMP1364 pTrcHis2B丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL，Carb
pMCS530 pTrcHis2B齿双歧杆菌(B.dentium)PKL，Carb
pMCS531 pTrcHis2B双歧双歧杆菌(B.bifidum)PKL，Carb
pMCS532 pTrcHis2B高卢双歧杆菌(B.gallicum)PKL，Carb
pMCS533 pTrcHis2B布氏乳杆菌(L.buchneri)PKL，Carb
pMCS534 pTrcHis2B植物令伯克霍尔德菌(B.phytofermans)PKL，Carb
pMCS535 pTrcHis2B丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)优化的PKL，Carb
Carb指示羧苄青霉素
编码来源于表1、表2和簇1-22(参见图3-24)中列出的每个生物体的PKL蛋白质的核酸序列经密码子优化以在大肠杆菌(E.coli)中表达并合成。这些经密码子优化的PKL基因被亚克隆到pTrcHis2B表达质粒的pTrc启动子下游以允许通过IPTG诱导型表达磷酸解酮酶基因。
实例4：构建表达鉴定的PKL的菌株用于体外研究
PKL表达菌株通过用表5中列出的质粒转化菌株CMP1133(BL21，ΔpglPL.2mKKDyl，GI1.2gltA，yhfSFRTPyddVIspAyhfS，thiFRTtruncIspA)并在Luria-Bertani板上选择包含20μg/ml卡那霉素的菌落进行构建。利用制造商(GeneBridges，Heidelberg，Germany)推荐的规程去除卡那霉素标记，从而形成指示菌株(表7)。
表7：大肠杆菌菌株的描述
每个PKL表达菌株表达鉴定的PKL，它们通过用表1、表2和簇1-22(参见图3-24)中列出的质粒转化菌株CMP1133(BL21，ΔpglPL.2mKKDyl，GI1.2gltA，yhfSFRTPyddVIspAyhfS，thiFRTtruncIspA)并在Luria-Bertani板上选择包含20μg/ml卡那霉素的菌落进行构建。利用制造商(GeneBridges，Heidelberg，Germany)推荐的规程去除卡那霉素标记。
实例5：比较鉴定PKL的表达和溶解度
表达pTrcHis2B长双歧杆菌(B.longum)(菌株CMP1183)、pTrcHis2B鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)(菌株CMP1328)、pTrcHis2B丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)(菌株CMP1366)、pTrcHis2B齿双歧杆菌(B.dentium)PKL(菌株MCS545)、pTrcHis2B双歧双歧杆菌(B.bifidum)(菌株MCS546)、pTrcHis2B高卢双歧杆菌(B.gallicum)PKL(菌株MCS547)、pTrcHis2B布氏乳杆菌(L.buchneri)PKL(菌株MCS548)、pTrcHis2B植物令伯克霍尔德菌(B.phytofermans)PKL(菌株MCS549)、或优化pTrcHis2B丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL(菌株MCS550)的菌株在LB培养基中生长，在OD600～0.5时用200μMIPTG诱导，并且在30℃或34℃的温度下诱导4小时。通过以3000rpm将4mL培养液离心10分钟收获细胞。细胞沉淀物重悬在带有0.1％DNAase和0.5mMAEBSF的2ml50mMMES，50mMNaClpH6.0中。细胞悬浮液用法式细胞破碎器在14,000psi(AmericanInstrumentCompany)下裂解。溶胞产物随后在4℃下，在Eppendorf5804R离心机中以15,000rpm离心10分钟。分离上清液和沉淀物。将沉淀物重悬在裂解50mMMES，50mMNaClpH6.0缓冲液中。上清液和沉淀物样品通过4-12％SDS-PAGE凝胶电泳进行分析。通过比较可溶物对沉淀物(不溶物)的磷酸解酮酶级分评估溶解度。
结果显示优化的丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL(图32A，泳道9)与尚未经密码子优化的丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL(图32A，泳道3)相比以更高水平表达。齿双歧杆菌(B.dentium)(图32A，泳道4)、双歧双歧杆菌(B.bifidium)(图32A，泳道5)和高卢双歧杆菌(B.gallicum)(图32A，泳道6)PKL均以与丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL(图32A，泳道3)相似的水平表达并且是最易溶的(图32B)。在比较中，布氏乳杆菌(L.buchneri)(泳道7)和植物令伯克霍尔德菌(B.phytofermans)(泳道8)是几乎完全不溶的(图32B)。
表达在表1、表2和簇1-22(参见图3-24)中列出的鉴定PKL的菌株在LB培养基中生长，在OD600～0.5时用200μMIPTG诱导，并且在30℃或34℃的温度下诱导4小时。通过以3000rpm将4mL培养液离心10分钟收获细胞。细胞沉淀物重悬在带有0.1％DNAase和0.5mMAEBSF的2ml50mMMES，50mMNaClpH6.0中。细胞悬浮液用法式细胞破碎器在14,000psi(AmericanInstrumentCompany)下裂解。溶胞产物随后在4℃下，在Eppendorf5804R离心机中以15,000rpm离心10分钟。分离上清液和沉淀物。将沉淀物重悬在裂解缓冲液(50mMMES，50mMNaClpH6.0)中。上清液和沉淀物样品通过4-12％SDS-PAGE凝胶电泳进行分析。通过比较可溶物对沉淀物(不溶物)的磷酸解酮酶级分评估溶解度。
实例6：体外筛选表达鉴定PKL的菌株中的磷酸解酮酶活性
表达pTrcHis2B长双歧杆菌(B.longum)(菌株CMP1183)、pTrcHis2B鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)(菌株CMP1328)、pTrcHis2B丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)(菌株CMP1366)、pTrcHis2B齿双歧杆菌(B.dentium)PKL(菌株MCS545)、pTrcHis2B双歧双歧杆菌(B.bifidum)(菌株MCS546)、pTrcHis2B高卢双歧杆菌(B.gallicum)PKL(菌株MCS547)、pTrcHis2B布氏乳杆菌(L.buchneri)PKL(菌株MCS548)、pTrcHis2B植物令伯克霍尔德菌(B.phytofermans)PKL(菌株MCS549)、或优化pTrcHis2B丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL(菌株MCS550)的菌株在诱导前，在37℃的具有50μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中生长。在与10μM、25μM、50μM、或100μMIPTG一起孵育后，将培养物转移到34℃摇动器中30分钟。通过在4℃下以10,000rpm离心10分钟收获细胞。细胞沉淀物在纯化前存储在-80℃。为了进行纯化，将PKL细胞沉淀物重悬在50mMMESpH6.0，50mMNaCL，0.5mMAEBSF，0.1mg/mlDNaseI中。细胞通过重复通过法式细胞破碎器裂解并且通过在50,000rpm下超速离心60分钟进行澄清。澄清的溶胞产物包含来自长双歧杆菌(B.longum)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)、齿双歧杆菌(B.dentium)、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、植物令伯克霍尔德菌(B.phytofermans)、或丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)的PKL，将其载入DEAEHiTrapFF柱，该柱在50mMMES，50mMNaCl，pH6中平衡并用50mMMES，1MNaCl，pH6进行梯度洗脱。所得级分通过SDS-PAGE进行分析。收集包含PKL的级分并用G25脱盐柱在50mMMES，50mMNaCLpH6.0中脱盐。使用在50mMMES，50mMNaCL，pH6中平衡的MonoQ10/100GL柱，用至1MNaCl的盐梯度进行进一步纯化。由每种PKL形成的AcP的量使用异羟肟酸测定的缩微型式进行测量，这描述于L.Meile等人，Bacteriol.，2001，183:2929-2936，和Frey等人，BioorganicChem.，2008，36:121-127，它们全文并入本文以作参考。在37℃下，在96-孔板(Costar目录号9017)中进行测定。每个300μl反应包含1mMTPP，10mM磷酸钾，pH6.0，50mMMESpH6，10mMMgCl2，5mMF6P和浓度为250nM的PKL。以不同间隔取时间点。为了终止反应，使60μl反应混合物与pH6.5的60μl2M羟胺混合，在室温下孵育10分钟。加入在0.1MHCl中的40μl15％TCA，40μl4MHCl，和40μl5％FeCl3，它们用于沉淀蛋白质并检测AcP。样品随后以3000rpm离心10分钟。将200μl上清液样品转移到微滴定板和读板机中，并且监测在505nm的吸光度变化，其与形成的AcP量相关联。
结果显示优化的丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL与尚未经密码子优化的丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL(图33)相比具有F6P活性并且产生更大量的AcP。齿双歧杆菌(B.dentium)具有与尚未经密码子优化的丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL相似的PKLF6P活性。齿双歧杆菌(B.dentium)和高卢双歧杆菌(B.gallicum)PKL具有显著的F6P活性并且与鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)PKLF6P活性相当。在比较中，布氏乳杆菌(L.buchneri)PKL(图33)和植物令伯克霍尔德菌(B.phytofermans)PKL不展示F6P活性，这受到这些PKL几乎完全不可溶的发现的支持。
表达在表1、表2和簇1-22(参见图3-24)中列出的鉴定PKL的菌株在诱导前，在37℃的具有50μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中生长。在与10μM、25μM、50μM、或100μMIPTG一起孵育后，将培养物转移到34℃摇动器中30分钟。通过在4℃下以10,000rpm离心10分钟收获细胞。为了进行纯化，将PKL细胞沉淀物重悬在50mMMESpH6.0，50mMNaCL，0.5mMAEBSF，0.1mg/mlDNaseI中。细胞通过重复通过法式细胞破碎器裂解并且通过在50,000rpm下超速离心60分钟进行澄清。澄清的溶胞产物包含PKL，将其载入DEAEHiTrapFF柱，该柱在50mMMES，50mMNaCl，pH6中平衡并用50mMMES，1MNaCl，pH6进行梯度洗脱。所得级分通过SDS-PAGE进行分析。收集包含PKL的级分并用G25脱盐柱在50mMMES，50mMNaCLpH6.0中脱盐。使用在50mMMES，50mMNaCL，pH6中平衡的MonoQ10/100GL柱，用至1MNaCl的盐梯度进行进一步纯化。由每种PKL形成的AcP的量使用异羟肟酸测定的缩微型式进行测量，这描述于L.Meile等人，Bacteriol.，2001，183:2929-2936，和Frey等人，BioorganicChem.，2008，36:121-127。在37℃下，在96-孔板(Costar目录号9017)中进行测定。每个300μl反应包含1mMTPP，10mM磷酸钾，pH6.0，50mMMESpH6，10mMMgCl2，5mMF6P和浓度为250nM的PKL。以不同间隔取时间点。为了终止反应，使60μl反应混合物与pH6.5的60μl2M羟胺混合，在室温下孵育10分钟。加入在0.1MHCl中的40μl15％TCA，40μl4MHCl，和40μl5％FeCl3，它们用于沉淀蛋白质并检测AcP。样品随后以3000rpm离心10分钟。将200μl上清液样品转移到微滴定板和读板机中，并且监测在505nm的吸光度变化，其与形成的AcP量相关联。
实例7：体内筛选表达鉴定的磷酸解酮酶(PKL)的菌株中的磷酸解 酮酶活性
磷酸解酮酶(PKL)的体内活性在不具有转酮醇酶(tkt)活性的突变菌株中进行评估。转酮醇酶负责产生4-磷酸赤藓糖(E4P)，这是大肠杆菌(E.coli)中所有芳族维生素和氨基酸的底物。在缺失转酮醇酶活性的情况下，由于芳族营养缺陷，大肠杆菌(E.coli)在带有葡萄糖作为碳源的基本培养基中的生长因此变得不可能(Zhao和Winkler，1994)。转酮醇酶也涉及5-磷酸木酮糖(X5P)与7-磷酸景天庚酮糖(S7P)和3-磷酸甘油醛(GAP)的互相转化，并且tkt突变体在带有木糖作为碳源的基本培养基上的生长也是不可能的，因为tkt活性是从磷酸戊糖途径返回糖酵解的仅有出口。因为磷酸解酮酶从F6P产生E4P，并且从X5P产生GAP，当在葡萄糖(指示F6P活性)或木糖(指示X5P和F6P活性)上生长时，官能酶可拯救tkt突变体的生长缺陷。互补突变体的生长因此可用于测试磷酸解酮酶的不同体内活性。
菌株构建
使用用于通过PCR从Keio集中扩增突变、进行P1转导、进行GeneBridges插入(制造商规程)、PCR扩增(PfuTurbo或Herculase，制造商规程)、转化质粒、以及生长并增殖菌株的标准分子生物学技术。简而言之，因为在大肠杆菌(E.coli)基因组中存在两种转酮醇酶，它们均必须被敲除以产生转酮醇酶无效突变体。tktB中的卡那霉素插入通过PCR从Keio集中扩增，并且通过重组引入BL21。tktB中的抗生素抗性盒通过PCR确认，并且随后使用pCP20质粒除去(表5)。随后通过相同方法将tktA突变引入BL21，并且然后通过P1转导引入tktB突变体，从而产生转酮醇酶无效突变菌株(表6)。这种菌株，DW809，仅在具有酪蛋白氨基酸的M9葡萄糖基本培养基上生长，该培养基基本上不供应芳族氨基酸和另外的所有芳族化合物，包括酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、p-氨基苯甲酸、2-3-二羟基苯甲酸、p-羟基苯甲酸和吡哆素(如Zhao和Winkler所述，1994)。本文随后将六种芳族化合物和吡哆素的这种组合称作“芳族补充剂。”具有不同磷酸解酮酶的质粒随后转化到转酮醇酶突变菌株中，并且选择用于在具有芳族补充剂和羧苄青霉素的M9葡萄糖酪蛋白氨基酸上生长(表6)。随后测定菌株在EnzyscreenGrowthProfiler(Enzyscreen，BV)上，在无芳族补充剂的M9葡萄糖或木糖上的生长，并且与不表达磷酸解酮酶的对照菌株进行比较。磷酸解酮酶在转酮醇酶无效突变体中以两种不同的IPTG浓度，20μM和60μM，进行诱导。
转酮醇酶无效突变菌株用在表1、表2和簇1-22(参见图3-24)中列出的鉴定PKL转化，并且选择用于在具有芳族补充剂和羧苄青霉素的M9葡萄糖酪蛋白氨基酸上生长。随后测定菌株在EnzyscreenGrowthProfiler(Enzyscreen，BV)上，在无芳族补充剂的M9葡萄糖或木糖上的生长，并且与不表达磷酸解酮酶的对照菌株进行比较。磷酸解酮酶在转酮醇酶无效突变体中以两种不同的IPTG浓度，20μM和60μM，进行诱导。
表8：测试tktA和tktB突变存在的引物
引物名称 序列
tktA test for catgcgagcatgatccagagatttctga
tktA test rev gcttgtccgcaaacggacatatcaaggt
tktB test for cagctcccatgagcgaagcggagt
tktB test rev gacgcgtcagcgtcgcatccggca
tktB B test for gctgcgatcgactgactatcgcaccga
tktB B test rev cagacgcctggcccacgttgtggatca
tktA B test for gcagcggacgggcgagtagattgcgca
tktA B test rev gtgatctacaacacgccttatctat
表9：表达PKL的工程化菌株
结果
在这个测定中，转酮醇酶突变体在仅具有补充剂的葡萄糖上生长(图34)并且在具有或不具有补充剂的木糖上不生长(图36)。表达不同磷酸解酮酶的转酮醇酶无效突变体的生长突出了这些酶的不同体内作用。鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)PKL显示对葡萄糖和木糖的最佳性能，指示用于维持转酮醇酶突变体在缺乏补充剂的情况下生长的足够F6P和X5P活性(参见图35和37)。丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum)PKL也允许转酮醇酶突变体在缺乏芳族补充剂的情况下，在葡萄糖和木糖上生长(图35和37)，但是当在葡萄糖上生长时，在60μM的IPTG浓度下看起来对细胞生长具有有害效应(图35)。
实例8：测量表达PKL的菌株中的细胞内乙酰磷酸
构建产生异戊二烯的大肠杆菌(E.coli)菌株以表达来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)PsJN、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)NRRLB-30929、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)DSM20093、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)Bd1、或双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)IPLA20015的磷酸解酮酶、或来自表1、表2、或簇1-22的PKL(参见图3-24)。使用不表达磷酸解酮酶的菌株作为对照。
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4*7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物0.2g，1000X痕量金属溶液1mL。所有成分一起加入并溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并适量至体积。培养基用0.22微米过滤器过滤除菌。在调节pH并灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)
柠檬酸*H2O40g，MnSO4*H2O30g，NaCl10g，FeSO4*7H2O1g，CoCl2*6H2O1g，ZnSO4*7H2O1g，CuSO4*5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O100mg。每种组分一次溶解一种在diH2O中。用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且溶液随后适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
(ii)实验程序
表达完整MVA途径和来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)PsJN、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)NRRLB-30929、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)DSM20093、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)Bd1、或双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)IPLA20015的PKL、或来自表1、表2、或簇1-22(参见图3-24)的PKL的细胞在Luria-Bertani发酵液+抗生素中生长过夜。次日，在包含50ug/mL羧苄青霉素的20mLTM3培养基中(在250-mL带挡板锥形瓶中)将它们稀释至OD600为0.05，并且在34℃和200rpm条件下孵育。在生长2h后，测量OD600并加入200uMIPTG。在附加的3.5小时后，离心1.5mL样品，弃去上清液并将沉淀物重悬在100uL干冰致冷甲醇中。
(iii)细胞内乙酰磷酸测定。
为了提取乙酰磷酸，将生长至OD0.57-2.26的1.5mL大肠杆菌细胞通过离心沉淀，并且将100μl干冰致冷的甲醇加入沉淀物。甲醇淬灭的样品储存在-20℃下若干天。进一步的样品处理包括轻柔的细胞重悬浮、在-9℃的5-分钟离心并将上清液抽吸到清洁小瓶中。沉淀物用包含2％乙酸的75μl水再提取两次。在每次提取后，细胞碎片通过在-9℃的离心进行沉淀，来自所有三次提取的上清液汇集在一起并与1μl三丁胺混合。通过LCMS的乙酰磷酸质谱分析使用ThermoFinniganTSQ系统(ThermoElectronCorporation，SanJose，CA)进行。系统控制、数据采集和质谱数据评估使用XCalibur和LCQuan软件(ThermoElectronCorp)进行。以0.4mL/min的流量将移动相梯度施用于SynergiMAX-RP5μMHPLC柱(150×2mM，Phenomenex)。施用的梯度特征为t＝0-1分钟时99％A和1％B；t＝11分钟时80％A和20％B；t＝12-14分钟时75％B和25％C；t＝15-16分钟时99％A和1％B，其中溶剂A为15mM三丁胺/10mM乙酸水溶液，溶剂B为甲醇，并且溶剂C为水。乙酰磷酸的质量使用电喷雾电离(ESI-MS/MS)在负离子模式(ESI电喷雾电压为2.5-3.0kV，离子管温度为390℃)下进行检测，前体离子的m/z值为138.9。乙酰磷酸浓度基于PO3 -产物离子(m/z＝79.0，碰撞能量20V，碰撞气体压力1.7mTorr，Rt＝13.2分钟)生成的峰值累积强度进行测定。通过注入乙酰磷酸标准物(Sigma-Aldrich)获得的校准曲线用于计算细胞提取物中代谢物的浓度。乙酰磷酸的细胞内浓度基于以下假设进行测定：1mL培养物在OD＝200的所有细胞累积体积为50μl。评估表达PKL的菌株与不表达磷酸解酮酶的对照菌株产生的乙酰磷酸。
实例9：在小规模表达磷酸解酮酶的重组宿主细胞中产生异戊二烯
构建产生异戊二烯的大肠杆菌(E.coli)菌株以表达来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)PsJN、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)NRRLB-30929、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)DSM20093、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)Bd1、或双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)IPLA20015的磷酸解酮酶、或来自表1、表2、或簇1-22的PKL(参见图3-24)、完整MVA途径和异戊二烯合酶。使用不表达磷酸解酮酶的异戊二烯产生菌株作为对照。
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4*7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物0.2g，1000X痕量金属溶液1mL。所有成分一起加入并溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并适量至体积。培养基用0.22微米过滤器过滤除菌。在调节pH并灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)
柠檬酸*H2O40g，MnSO4*H2O30g，NaCl10g，FeSO4*7H2O1g，CoCl2*6H2O1g，ZnSO4*7H2O1g，CuSO4*5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O100mg。每种组分一次溶解一种在diH2O中。用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且溶液随后适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
(ii)实验程序
细胞在Luria-Bertani发酵液+抗生素中生长过夜。次日，在包含50ug/ml奇放线菌素、25ug/mL氯霉素和50ug/mL羧苄青霉素的20mLTM3培养基中(在250-mL带挡板锥形瓶中)将它们稀释至OD600为0.1，并且在34℃和200rpm条件下孵育。在生长2h后，测量OD600并加入200uMIPTG。在发酵期间有规律的取样。在每个时间点，测量OD600。另外，使用气相色谱-质谱联用分析仪(GC-MS)(Agilent)顶部空间测定进行异戊二烯的废气分析。将完整发酵液的100μl样品置于96-孔玻璃框中。玻璃框用铝箔密封并在34℃下孵育，同时利用Thermomixer在450rpm下振荡30分钟。在30分钟后，将玻璃框保持在70℃水浴中2分钟并使用气相色谱-质谱联用分析仪测定顶部空间中的异戊二烯含量。报告的比生产率是GC读出的以ug/L表示的异戊二烯量除以孵育时间(30分钟)和测得的OD600。
实例10：在15-L规模表达磷酸解酮酶的重组宿主细胞中产生异戊二烯
构建产生异戊二烯的大肠杆菌(E.coli)菌株以表达来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)PsJN、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)NRRLB-30929、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)DSM20093、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)Bd1、或双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)IPLA20015的磷酸解酮酶、或来自表1、表2、或簇1-22的PKL(参见图3-24)、完整MVA途径和异戊二烯合酶。产生异戊二烯的菌株不表达磷酸解酮酶，在用于产生异戊二烯的15升规模实验中将其用作对照。
(i)材料
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，50％硫酸1.6mL，1000X改良痕量金属溶液1mL。所有成分一起加入并溶解在DiH2O中。将这种溶液加入灭菌(123℃20分钟)。用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0并适量至体积。在灭菌并调节pH后加入葡萄糖10g、维生素溶液8mL和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
柠檬酸*H2O40g，MnSO4*H2O30g，NaCl10g，FeSO4*7H2O1g，CoCl2*6H2O1g，ZnSO*7H2O1g，CuSO4*5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O100mg。每种组分一次溶解一种在DiH2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且随后溶液适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
维生素溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g，D-(+)-生物素1.0g，烟酸1.0g，盐酸吡哆辛4.0g。每种组分一次溶解一种在DiH2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且随后溶液适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
Macro盐溶液(每升)：
MgSO4*7H2O296g，一水合柠檬酸296g，柠檬酸铁铵49.6g。所有组分溶解在水中，适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
进料溶液(每千克)：
葡萄糖0.590kg，DiH2O0.393kg，K2HPO47.4g，和100％Foamblast8828.9g。所有组分混合在一起并高压灭菌。在高压灭菌进料溶液后，将营养物质补充剂加入在无菌纱布中的进料瓶。在灭菌后，加入的进料为(每千克进料溶液)，Macro盐溶液5.54ml，维生素溶液6.55ml，1000X改良痕量金属溶液0.82ml。
(ii)分析
废气中的异戊二烯、氧气、氮气和二氧化碳含量独立地通过两台质谱仪进行测定，两台质谱仪分别是iSCAN(HamiltonSundstrand)和HidenHPR20(HidenAnalytical)质谱仪。发酵液中的溶解氧通过带有HamiltonCompany提供的光学传感器的卫生可灭菌探头进行测量。发酵液中的柠檬酸、葡萄糖、乙酸和甲羟戊酸浓度通过HPLC分析测定以4小时间隔取样的发酵液样品。发酵液样品中的浓度通过比较折射率响应对以前使用已知浓度的标准物产生的校准曲线进行测定。
实例11：在表达鉴定的磷酸解酮酶的菌株中产生紫穗槐二烯或金合欢 烯
构建产生类异戊二烯的大肠杆菌(E.coli)菌株以表达来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)PsJN、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)NRRLB-30929、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)DSM20093、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)Bd1、或双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)IPLA20015的磷酸解酮酶、或来自表1、表2、或簇1-22的PKL(参见图3-24)、完整MVA途径和编码金合欢烯合酶或紫穗槐二烯合酶的经密码子优化的基因。产生类异戊二烯的菌株不表达磷酸解酮酶，在用于产生紫穗槐二烯或金合欢烯的实验中将其用作对照。
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4*7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物0.2g，1000X痕量金属溶液1mL。所有成分一起加入并溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并适量至体积。培养基随后用0.22微米过滤器过滤除菌。在灭菌并调节pH后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)：
柠檬酸*H2O40g，MnSO4*H2O30g，NaCl10g，FeSO4*7H2O1g，CoCl2*6H2O1g，ZnSO4*7H2O1g，CuSO4*5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O100mg。每种组分一次溶解一种在diH2O中。用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且溶液随后适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
(ii)实验程序
细胞在Luria-Bertani发酵液+抗生素中生长过夜。次日，在包含50ug/ml奇放线菌素、25ug/mL氯霉素和50ug/mL羧苄青霉素的20mLTM3培养基中(在250-mL带挡板锥形瓶中)将它们稀释至OD600为0.05，并且在34℃和200rpm条件下孵育。如前文所述(Newman等人，2006)，在接种前，将20％(v/v)十二烷(Sigma-Aldrich)的叠层加入每个培养烧瓶以捕集蒸发的倍半萜产物。
在生长2h后，测量OD600并加入0.05-0.40mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)。在发酵期间有规律的取样。在每个时间点，测量OD600。另外，通过稀释十二烷叠层到乙酸乙酯中测定有机层中的紫穗槐二烯或金合欢烯浓度。十二烷/乙酸乙酯提取物通过GC–MS方法，如前文所述(Martin等人，Nat.Biotechnol.2003，21:96–802)，通过监测紫穗槐二烯的分子离子(204m/z)和189m/z片段离子或金合欢烯的分子离子(204m/z)进行分析。将已知浓度的紫穗槐二烯或金合欢烯样品注入以分别产生紫穗槐二烯或金合欢烯的标准曲线。分别使用紫穗槐二烯或金合欢烯的标准曲线计算样品中的紫穗槐二烯或金合欢烯的量。
实例12：构建包含用于产生异戊二烯的宿主突变的表达磷酸解酮酶的 菌株。
产生异戊二烯的菌株包含来自植物令伯克霍尔德菌(Burkholderiaphytofirmans)PsJN、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)NRRLB-30929、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)DSM20093、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)Bd1、或双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)IPLA20015的PKL、或者来自表1、表2、或簇1-22的PKL(参见图3-24)，该菌株可进一步经工程化以提高一种或多种以下基因的活性：包括5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)，从而改善通过磷酸解酮酶途径的碳通量(图38)。在某些方面，以下基因rpiA、rpiB、rpe、tktA、tktB、talB、ppsA、eutD和/或pta的活性可通过改变在染色体上的启动子和/或rbs、或者通过从质粒中将其表达而被提高。在一个实施例中，5-磷酸核糖异构酶(rpiA和/或rpiB)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs、或者从质粒中表达它而被提高。在另一个实施例中，D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs、或者从质粒中表达它而被提高。在另一个实施例中，转酮醇酶(tktA和/或tktB)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs、或者从质粒中表达它而被提高。在另一个实施例中，转醛醇酶B(talB)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs、或者从质粒中表达它而被提高。在另一个实施例中，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs、或者从质粒中表达它而被提高。在其它实施例中，磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs、或者从质粒中表达它而被提高。在某些方面，以下基因rpiA、rpiB、rpe、tktA、tktB、talB、ppsA、eutD和/或pta的同功酶可通过改变在染色体上的启动子和/或rbs、或者通过从质粒中将其表达而被提高。
这些菌株还可经工程化以降低一种或多种以下基因的活性：包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)，从而增加进入磷酸解酮酶途径的碳通量(图39)。在一个实施例中，编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的zwf基因下调。在另一个实施例中，编码6-磷酸果糖激酶-1A的pfkA基因下调。在另一个实施例中，编码3-磷酸甘油醛脱氢酶A的gapA基因下调。在另一个实施例中，编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因下调。在另一个实施例中，编码柠檬酸合酶的gltA基因下调。在一个实施例中，编码乙酸激酶的ackA基因下调。在另一个实施例中，编码EI的ptsI基因下调。在一个实施例中，编码HPr的ptsH基因下调。在另一个实施例中，编码EIICBGlc的ptsG基因下调。在另一个实施例中，编码EIIAGlc的crr基因下调。pts操纵子编码磷酸转移酶体系的基因。在一些实施例中，菌株可经工程化以降低磷酸转移酶体系(PTS)的活性，从而增加进入磷酸解酮酶途径的碳通量。在一些实施例中，通过下调pts操纵子下调PTS。在某些方面，下调PTS并且上调葡萄糖转运途径。葡萄糖转运途径包括但不限于半乳糖(galP)和葡糖激酶(glk)基因。在一些实施例中，下调pts操纵子，上调半乳糖(galP)基因，并且上调葡糖激酶(glk)基因。在某些方面，可下调由以下基因zwf、pfkA、fba、gapA、ackA、gltA、tktA、ptsG、ptsH、ptsI和/或crr编码的蛋白质的同功酶以增加进入磷酸解酮酶途径的碳通量。在一些实施例中，pfkB基因下调。在一些实施例中，3-磷酸甘油醛脱氢酶B(gapB)基因下调。在一些实施例中，转酮醇酶B(tktB)基因下调。
实例13：通过包含宿主突变的表达磷酸解酮酶的菌株小规模产生异戊 二烯
评估如实例12所述的产生异戊二烯的菌株小规模产生异戊二烯的能力。
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4*7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物0.2g，1000X痕量金属溶液1mL。所有成分一起加入并溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并适量至体积。培养基用0.22微米过滤器过滤除菌。在调节pH并灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)
柠檬酸*H2O40g，MnSO4*H2O30g，NaCl10g，FeSO4*7H2O1g，CoCl2*6H2O1g，ZnSO4*7H2O1g，CuSO4*5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O100mg。每种组分一次溶解一种在diH2O中。用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且溶液随后适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
(ii)实验程序
细胞在Luria-Bertani发酵液+抗生素中生长过夜。次日，在包含50ug/ml奇放线菌素、25ug/mL氯霉素和50ug/mL羧苄青霉素的20mLTM3培养基中(在250-mL带挡板锥形瓶中)将它们稀释至OD600为0.1，并且在34℃和200rpm条件下孵育。在生长2h后，测量OD600并加入200uMIPTG。在发酵期间有规律的取样。在每个时间点，测量OD600。另外，使用气相色谱-质谱联用分析仪(GC-MS)(Agilent)顶部空间测定进行异戊二烯的废气分析。将一百微升全部发酵液置于密封GC小瓶中并在34℃和200rpm条件下培养30分钟的固定时间。在加热杀灭步骤后，继续在70℃孵育7分钟，将样品载入GC。报告的比生产率是GC读出的以ug/L表示的异戊二烯量除以孵育时间(30分钟)和测得的OD600。
实例14：通过包含宿主突变的表达磷酸解酮酶的菌株以15-L规模产 生异戊二烯
评估如实例12所述的产生异戊二烯的菌株以15-L规模产生异戊二烯的能力。
(i)材料
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，50％硫酸1.6mL，1000X改良痕量金属溶液1mL。所有成分一起加入并溶解在DiH2O中。将这种溶液加入灭菌(123℃20分钟)。用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0并适量至体积。在灭菌并调节pH后加入葡萄糖10g、维生素溶液8mL和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
柠檬酸*H2O40g，MnSO4*H2O30g，NaCl10g，FeSO4*7H2O1g，CoCl2*6H2O1g，ZnSO*7H2O1g，CuSO4*5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O100mg。每种组分一次溶解一种在DiH2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且随后溶液适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
维生素溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g，D-(+)-生物素1.0g，烟酸1.0g，盐酸吡哆辛4.0g。每种组分一次溶解一种在DiH2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且随后溶液适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
Macro盐溶液(每升)：
MgSO4*7H2O296g，一水合柠檬酸296g，柠檬酸铁铵49.6g。所有组分溶解在水中，适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
进料溶液(每千克)：
葡萄糖0.590kg，DiH2O0.393kg，K2HPO47.4g，和100％Foamblast8828.9g。所有组分混合在一起并高压灭菌。在高压灭菌进料溶液后，将营养物质补充剂加入在无菌纱布中的进料瓶。在灭菌后，加入的进料为(每千克进料溶液)，Macro盐溶液5.54ml，维生素溶液6.55ml，1000X改良痕量金属溶液0.82ml。
(ii)分析
废气中的异戊二烯、氧气、氮气和二氧化碳含量独立地通过两台质谱仪进行测定，两台质谱仪分别是iSCAN(HamiltonSundstrand)和HidenHPR20(HidenAnalytical)质谱仪。发酵液中的溶解氧通过带有HamiltonCompany提供的光学传感器的卫生可灭菌探头进行测量。发酵液中的柠檬酸、葡萄糖、乙酸和甲羟戊酸浓度通过HPLC分析测定以4小时间隔取样的发酵液样品。发酵液样品中的浓度通过比较折射率响应对以前使用已知浓度的标准物产生的校准曲线进行测定。
实例15：用于小规模评估磷酸解酮酶的菌株
使用标准分子生物学技术生成磷酸解酮酶表达菌株，其中将特定的PKL转化到MD-891(BL2+GI1.2gltAyhfSFRTPyddVIspAyhfSthiFRTtruncIspApglmL+FRT-PL.2-3cis-RBS10000-mvk(burtonii)ackA::FRT)与MCM-1225(pMCM1225--pCLPtrc-鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)上游MVA))中。菌株在表10中列出。
表10：用于小规模评估磷酸解酮酶的菌株
实例16：体内筛选表达鉴定的磷酸解酮酶(PKL)的磷酸解酮酶活性
如上文实例7所示进行以下磷酸解酮酶活性的体内筛选。宿主细胞背景是带有包含不同磷酸解酮酶的质粒pMCS811-pMCS852的DW-809。
为了对这组磷酸解酮酶(PKL)进行体内生长评估，如实例7所述的菌株DW809是转酮醇酶双突变菌株，其用表达PKL和异戊二烯合酶的质粒从IPTG-诱导型启动子开始进行转化(参见表11的完整列表)。如实例7所述，单个转化子通过在具有芳族补充剂的M9葡萄糖基本培养基平板上生长进行鉴定，生长过夜，随后在EnzyscreenGrowthProfiler上测定在无芳族补充剂的葡萄糖或木糖上的生长性能。用于诱导的IPTG浓度范围为0，20，40，60，80，100，200，和400μM。为了计算在葡萄糖或木糖上生长的性能指数(PI)，每种实验菌株的OD在生长曲线中的特定时间点对对照的OD进行归一化(通常介于30和40小时之间)。显示最高的生长PI的实验菌株表达具有最优选体内活性的PKL酶，而具有低PI的菌株表达在这个测定中也有作用的PKL。计算在0、100和400μM的PI，并且它们是在不同诱导水平的代表性总体生长性能。这些在表11中示出。
表11：在葡萄糖或木糖上生长的性能指数(PI)
实例17：小规模评估在表达磷酸解酮酶的菌株中的异戊二烯收率和异 戊二烯比生产率
评估如实例15所述的产生异戊二烯的菌株小规模产生异戊二烯的能力。
(i)材料和方法
酵母提取物、MgSO4、葡萄糖、IPTG、奇放线菌素和羧苄青霉素购自Sigma。铝箔密封件、48-孔无菌5mL框、BreatheEasier密封膜、96-孔微滴定板和96-孔锥形底板购自VWR。96-孔玻璃框购自ZinsserAnalytic。设备：配有5973N质谱仪的Agilent6890GC，Eppendorf离心机5417R，SorvalllegendRT。
生长速率测量：
包含3mLLB培养基及合适抗生素的振荡管用甘油培养物原液接种。培养物在30℃，220rpm条件下培养大约15小时。
通过混合TM3培养基(无MgSO4和酵母提取物)，1％葡萄糖，8mMMgSO4，0.02％酵母提取物和合适抗生素制备补充TM3培养基。2mL补充TM3用过夜培养物在48-孔无菌框的每个孔中接种至最终OD600为0.2。框用BreatheEasier膜密封并在34℃下以600rpm孵育2小时。在生长2小时后，OD600在微滴定板中进行测量，并且细胞用不同浓度的IPTG诱导。在IPTG诱导4小时后，每小时读取OD600读数。使用SpectraMaxPlus190(MolecularDevices)测定OD600。
异戊二烯收率测定：
通过混合TM3培养基(无MgSO4和酵母提取物)，1％葡萄糖，8mMMgSO4，0.02％酵母提取物和合适抗生素制备补充TM3培养基。2mL补充TM3培养基在48-孔无菌框的每个孔中接种至最终OD600为0.2。将10μl接种过的培养物转移到在96-孔玻璃框(Zinsser)中的90μl无葡萄糖或酵母提取物的TM3培养基中并用铝箔密封，并且在34℃和450rpm条件下孵育24小时。在24小时后，在顶部空间中的异戊二烯量通过GC/MS进行测量，并且使用在培养基中剩余的葡萄糖量计算异戊二烯收率。
异戊二烯比生产率测量：
将100μl培养物置于96-孔玻璃框中。玻璃框用铝箔密封并在34℃下孵育，同时利用Thermomixer(Eppendorf)在450rpm下振荡30分钟。在30分钟后，将框在70℃水浴中孵育2分钟。使玻璃框冷却至室温，并且随后通过GC/MS测量孔的顶部空间中的异戊二烯。
葡萄糖测量：
通过在4℃下，在96-孔锥形底板中以3000rpm离心300μl细胞培养物10分钟来收集葡萄糖样品。在DI水中将上清液稀释10倍，并且使用描述的葡萄糖氧化酶测定测量葡萄糖浓度。
葡萄糖氧化酶测定：
将ABTS在pH5的50mM乙酸钠中增溶。加入葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)至以下浓度：2.74mg/mlABTS(粉末)，0.1U/mlHRP，1U/mlGOX。容器包裹在锡箔中以在4℃下避光保存7天。通过将葡萄糖溶解在MilliQ水中至一系列期望的浓度范围(即，从1mg/ml开始连续2x稀释)制备葡萄糖标准物。加入10μl测试样品(稀释反应上清液)和/或葡萄糖标准物至微滴定板的孔中。加入90μlABTS试剂并在板式混合器上快速混合。将测定板转移到读板机上并监测420nm吸光度3-5分钟。数据文件输出到Excel。葡萄糖校准曲线用于计算每个孔中的葡萄糖量。
表12：GC/MS的异戊二烯检测参数
(ii)结果
计算以下每个的性能指数(PI)：(i)2小时的异戊二烯比生产率；(ii)4小时的异戊二烯比生产率；(iii)生长速率；和(iv)异戊二烯收率，每个实验菌株在生长曲线的特定时间点对对照的特定参数进行归一化(通常介于15-24小时之间)。对这些评估参数显示大于1.0的PI值的实验菌株指示这种异戊二烯生产测定中的评估PKL的较好性能。
表13：以下每个的PI：(i)2小时的异戊二烯比生产率；(ii)4小 时的异戊二烯比生产率；(iii)生长速率；和(iv)异戊二烯收率
实例18：测量表达PKL的菌株中的细胞内代谢物
(i)材料和方法
代谢物提取：
用于代谢物分析的菌株是如实例17所述的相同菌株。因此，这些菌株在如实例17所示的生长条件下生长并且在生长4小时后取样测定所选细胞代谢物的相对浓度，离心收集500uL细胞培养物，弃去上清液，加入100uL干冰致冷甲醇至沉淀物，并且将带有沉淀物的管立即在干冰中立即冷冻并置于-80℃冰箱中进行储存。为了提取代谢物，用甲醇覆盖的细胞沉淀物使用玻璃棒重悬浮，管在微离心机中离心5分钟并且移除所得上清液并置于洁净管中。在第一提取步骤后获取的细胞沉淀物重悬在40uL50％甲醇/10mM乙酸铵混合物中，离心细胞碎片，并且收集上清液并与在第一次提取后获得的上清液汇集在一起。再次重复这一提取过程以确保从细胞碎片中完全移除代谢物。
在提取-离心期间，带有细胞的样品保存在低于4℃条件下以最小化代谢物降解。混合最终收集的提取物并随后离心使其澄清。
代谢物测量：
通过在TSQQuantim三重四极杆仪(ThermoScientific)上的LCMS进行代谢物分析。用XCalibur和LCQuan软件(ThermoScientific)完成系统控制、数据采集和数据分析。将10uL样品施用于C18SynergiMAX-RPHPLC柱(150x2mM，4uM，80A，Phenomenex)，该柱配有制造商推荐的保护柱套。该柱用在MilliQ-级水(溶剂A)和来自Honeywell，Burdick&Jackson的LCMS-级甲醇(溶剂B)中的15mM乙酸+10mM三丁胺进行梯度洗脱。22.5分钟梯度如下：t＝0分钟，5％B；t＝2分钟，5％B；t＝6分钟，10％B；t＝12分钟，20％B；t＝18分钟，67％B；t＝19分钟，99％B；t＝21分钟，99％B；；t＝21.5分钟，5％B；t＝22.5分钟，5％B，流量0.4mL/min，柱温35℃。质量检测使用电喷雾电离在负离子模式(ESI电喷雾电压为3.0-3.5kV并且离子管温度为350℃)下进行。选择以下SRM转换用于受关注的代谢物：259→79：6-磷酸葡萄糖(G6P)，339→79：1,6-二磷酸果糖，167→79：磷酸烯醇式丙酮酸，275→79：6-磷酸甘油酸，259→79eV：5-磷酸核糖，139→79：乙酰磷酸，以及199→79：4-磷酸赤藓糖。每个SRM转换的扫描时间为0.1s，扫描宽度设置为0.7m/z。使用氩气作为在1.7mTorr下的碰撞气体，并且碰撞能量经优化以获得最大信号强度，利用购自Sigma-Aldrich的相应标准物。相同标准物用于验证测量代谢物的保留时间。SRM转换369→79的峰值对应于庚糖-二磷酸。测量代谢物的浓度表达为在取样期间对培养物光密度进行归一化后的信号强度。
(ii)结果
为了计算产生乙酰磷酸(AcP)的性能指数(PI)，来自相应实验菌株每种代谢物的量在生长曲线中的特定时间点对对照的特定参数进行归一化(通常介于30和40小时之间)。对这些评估参数显示大于1.0的PI值的实验菌株指示这种测定中的评估PKL的较好性能。
表14：产生以下物质的PI：(i)乙酰磷酸(AcP)
实例19：测定磷酸解酮酶的蛋白质表达和溶解度
(i)材料和方法
用于测定评估磷酸解酮酶的蛋白质表达和溶解度的菌株是与如实例17所述的相同菌株。菌株在34℃下，在带有合适抗生素的LB发酵液中生长过夜。次日，将100uL过夜培养物加入带有合适抗生素的5mLLB并且在34℃生长至OD(600)为～0.5。随后用200uMIPTG诱导培养物并且在34℃下再孵育6小时。随后离心收获细胞，并且将沉淀物存储在-80℃。
次日，解冻沉淀物并将它们重悬在带有0.2mg/mlDNaseI和0.5mMAEBSF的100mMTris100mMNaClpH7.6中至OD(600)为4。随后通过法式压碎机单个裂解细胞，并且离心移除细胞碎片。可溶解级分的平均总蛋白质浓度为0.56±0.22mg/ml，这通过标准Bradford分析进行测定。离心沉淀物重悬在100mMTris100mMNaClpH7.6缓冲液中并存储以测定每种磷酸解酮酶的百分比溶解度。
随后溶胞产物用于测定在6-磷酸果糖(F6P)上的一定量磷酸解酮酶(PKL)活性/单位总蛋白质(μmol/min/mg)。在F6P上的PKL活性按照生成的乙酰磷酸(AcP)量进行测定。反应混合物(200uL)包含在100mMTris100mMNaClpH7.6中的10mMMgCl2，10mM磷酸钾(pH7.6)，1mM二磷酸硫胺素，10mMF6P，20mMNaF，8mM碘乙酰胺，1mM二硫苏糖醇，其带有100uL的溶胞产物。这些在34℃孵育30分钟并且通过加入60uL反应混合物至pH6.5的60uL2M羟胺中进行淬灭。这种淬灭混合物在室温下孵育10分钟，并且随后加入在0.1MHCl中的40uL15％TCA，40uL4MHCl和40uL5％FeCl3。这种最终混合物随后在3000rpm下离心5分钟。移除上清液(200uL)，并且测量505nm的吸光度。使用AcP校准曲线计算产生了多少AcP。
每种PKL突变体的相对于鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)MCS908对照的相对表达和溶解度通过密度计量学进行测定。每种样品的可溶性溶胞产物以1:1与凝胶加载染料混合并在SDS-PAGE凝胶上电泳。样品离心后经由法式破碎机裂解(参见上文)获取的每种沉淀物以1:1用凝胶加载染料稀释并加载到SDS-PAGE凝胶上。将鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)MCS908可溶性溶胞产物的样品加到每个凝胶上作为对照。使用考马斯亮蓝染料对凝胶染色，并且使用ImageQuantTLv2005(GEHealthSciences)密度计量学软件进行分析。表达的可溶解蛋白质百分比和可溶物对不溶物的百分比相对于对照菌株(鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)MCS908)进行测定。
(ii)结果
计算以下每个的性能指数(PI)：(i)(F6P)比活性每单位总蛋白质(μmol/min/mg)；(ii)表达水平；和(iii)每种实验菌株的溶解度对对照的特定参数进行归一化。F6P比活性(活性/表达水平)的PI通过将(i)的PI值除以(ii)的PI值进行测定。对这些评估参数显示大于1.0的PI的实验菌株指示这种测定中的评估PKL的较好性能。
表15：每种PKL的溶解度和表达
实例20：在6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖上的磷酸解酮酶活性
这个实例测定当菌株在6-磷酸果糖(F6P)或5-磷酸木酮糖(X5P)上生长时的PKL活性。
(i)材料和方法
菌株在34℃下，在带有合适抗生素的LB发酵液中生长过夜。次日，将200uL过夜培养物加入带有合适抗生素的5mLTM3并且在34℃下生长2.5小时。随后用200uMIPTG诱导培养物并且在34℃下再孵育4小时。随后离心收获细胞，并且将沉淀物存储在-80℃。
次日，解冻沉淀物并将它们重悬在带有0.2mg/mlDNaseI和0.5mMAEBSF的100mMHEPESpH7.8中。随后通过法式压碎机单个裂解细胞，并且离心移除细胞碎片。
溶胞产物制备和酶活性测定：
随后溶胞产物用于测定在6-磷酸果糖(F6P)和5-磷酸木酮糖(X5P)上的一定量磷酸解酮酶(PKL)活性。在F6P和X5P上的PKL活性按照生成的乙酰磷酸(AcP)量进行测定。F6P反应混合物(200uL)包含在100mMHEPESpH7.8中的10mMMgCl2，10mM磷酸钾(pH7.6)，1mM二磷酸硫胺素，10mMF6P，20mMNaF，8mM碘乙酰胺，1mM二硫苏糖醇，其带有100uL的溶胞产物。这些在34℃孵育30分钟并且通过加入60uL反应混合物至pH6.5的60uL2M羟胺中进行淬灭。这种淬灭混合物在室温下孵育10分钟，并且随后加入在0.1MHCl中的40uL15％TCA，40uL4MHCl和40uL5％FeCl3。这种最终混合物随后在3000rpm下离心5分钟。移除上清液(200uL)，并且测量505nm的吸光度。使用AcP校准曲线计算产生了多少AcP。使用类似方法测量X5P活性。X5P反应混合物(200uL)包含在100mMHEPESpH7.8中的10mMMgCl2，10mM磷酸钾(pH7.6)，1mM二磷酸硫胺素，10mM5-磷酸核糖，60ug/mL核酮糖-5-磷酸3-表异构酶，200ug/mL5-磷酸核糖异构酶A，20mMNaF，8mM碘乙酰胺，1mM二硫苏糖醇，其带有20uL的溶胞产物。由于在X5P上的广泛活性范围，在溶胞产物的两个浓度上测量活性：未稀释的和五倍稀释到100mMHEPESpH7.8中。
表16：在F6P或X5P上的PKL活性
实例21：在表达磷酸解酮酶的菌株中的异戊二烯产生的14L评估
进行这一实验以评估表达各种磷酸解酮酶对异戊二烯产生的效应。在这个实验中的所有菌株使用经修饰的大肠杆菌(E.coli)宿主(BL21来源的生产宿主MD891)，其表达来自甲羟戊酸途径的引入基因、异戊二烯合酶和磷酸解酮酶(PKL)，菌株详细信息参见表17。所有这些异戊二烯产生菌株以15-L规模在分批补料培养物中生长。
相关的性能量度是在葡萄糖上的异戊二烯收率和异戊二烯滴度。生产率量度汇总在表18中。
表17：菌株列表
(i)材料和方法
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，50％硫酸1.6mL，1000X改良痕量金属溶液1mL。所有成分一起加入并溶解在DiH2O中。将这种溶液加入灭菌(123℃20分钟)。用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0并适量至体积。在灭菌并调节pH后加入葡萄糖10g、维生素溶液8mL和抗生素(奇放线菌素和羧苄青霉素)至目标浓度50mg/L。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
柠檬酸*H2O40g，MnSO4*H2O30g，NaCl10g，FeSO4*7H2O1g，CoCl2*6H2O1g，ZnSO*7H2O1g，CuSO4*5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O100mg。每种组分一次溶解一种在DiH2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且随后将溶液适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
维生素溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g，D-(+)-生物素1.0g，烟酸1.0g，盐酸吡哆辛4.0g。每种组分一次溶解一种在DiH2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，并且随后溶液适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
Macro盐溶液(每升)：
MMgSO4*7H2O296g，一水合柠檬酸296g，柠檬酸铁铵49.6g。所有组分溶解在水中，适量至体积并用0.22微米过滤器过滤除菌。
进料溶液(每千克)：
葡萄糖0.590kg，DiH2O0.393kg，K2HPO47.4g，和100％Foamblast8828.9g。所有组分混合在一起并高压灭菌。在高压灭菌进料溶液后，将营养物质补充剂加入在无菌纱布中的进料瓶。在灭菌后，加入的进料为(每千克进料溶液)，Macro盐溶液5.54ml，维生素溶液6.55ml，1000X改良痕量金属溶液0.82ml。对于100μMIPTG的目标：每千克进料加入1.87ml无菌的10mg/ml溶液。
进行这个实验以监测在期望发酵pH(7.0)和温度(34℃)的由葡萄糖产生的异戊二烯产量。为了开始每个实验，将大肠杆菌(E.coli)生产菌株的合适冷冻小瓶解冻并接种到具有胰蛋白胨-酵母提取物(LB)培养基和合适抗生素的烧瓶中。在种菌生长至在550nm(OD550)测得为大约1.0的光密度后，500mL用于接种15-L生物反应器并适量至初始罐体积5L。
注入气体用于保持生物反应器背压为0.7巴并用于为生产生物体提供氧气，通过室内设施供气，该设施将注入气体稀释至已知浓度(7.3至8.3体积％氧气)。
分批培养基具有9.7g/L的葡萄糖。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)完成诱导。当细胞的OD550为6时，加入包含IPTG无菌溶液的注射器以使IPTG浓度达到100μM。一旦葡萄糖被培养物消耗(标志为pH升高)，以小于或等于10g/min的速率加入葡萄糖进料溶液以满足代谢需求。在确定溶解氧限度后的固定时间，经一个小时将温度从34℃升高至37℃。进行足够长时间的发酵以测定在葡萄糖上的最大累积异戊二烯质量收率，通常进行总计64小时的已发酵时间(EFT)。
(ii)结果和分析
废气中的异戊二烯、氧气、氮气和二氧化碳含量独立地通过HidenHPR20(HidenAnalytical)质谱仪进行测定。
发酵液中的溶解氧通过带有HamiltonCompany提供的光学传感器的卫生可灭菌探头进行测量。
发酵液中的柠檬酸、葡萄糖、乙酸和甲羟戊酸浓度通过HPLC分析测定以4小时间隔取样的发酵液样品。发酵液样品中的浓度通过比较折射率响应对以前使用已知浓度的标准物产生的校准曲线进行测定。
HPLC信息
系统：WatersAlliance2695
柱：BioRad-AminexHPX-87HIonExclusionColumn300mm×7.8mm目录号125-0140
柱温：50C
保护柱：BioRad-MicroguardCationHrefill30mm×4.6mm目录号125-0129
运行缓冲液：0.01NH2SO4
运行缓冲液流量：0.6mL/分钟
大约运行压力：～1100-1200psi
注射体积：20微升
检测器：折射率(KnauerK-2301)
运行时间：26分钟
在葡萄糖上的累积异戊二烯收率等于异戊二烯总重量(t)/[(进料Wt(0)-进料Wt(t)+83.5)*0.5826)]，其中0.5826是在葡萄糖进料溶液中的葡萄糖重量％，并且83.5是在t＝0时，这种分批进入发酵罐的进料的克数。单位是g异戊二烯/g葡萄糖*100，以百分比表示。
IspER是异戊二烯逸出速率(mmol/L/hr)。
比生产率(mg/L/hr/OD)＝IspER*68.117g/mol/OD。
OD＝光密度＝在550nm的吸光度*在水中的稀释系数。
平滑比生产率(mg/L/hr/OD)＝每小时产生的异戊二烯微克数斜率(经过8小时间隔的平均值)/发酵液体积*OD。
异戊二烯滴度(g异戊二烯/L平均发酵液)是总生成异戊二烯/平均发酵液体积。通过积分IspER并将异戊二烯单位从mmol转换成克进行计算。
结果在图40和41中图示并在表15中示出。
表18：异戊二烯生产率量度
实例22：在阻断糖酵解和磷酸戊糖途径PKL表达菌株中的生长的体 内评估
为了分析在阻断糖酵解和磷酸戊糖途径的菌株中的PKL酶活性，使用标准分子生物学技术将一子组表达质粒转化到菌株MD1041(HMBGI1.2gltAyhfSFRTPyddVIspAyhfSthiFRTtruncIspApglmL，FRT-PL.2-2cis-RBS10000-MVK(burtonii)，tzwf::FRT，tpfkA::Frt+tackA::FRT，tpfkB::Frt)中。单个转化体在LB中生长过夜，稀释到具有1％6-磷酸葡萄糖(Sigma)作为碳源的TM3培养基中，并且用0，20，40，60，80，100，200，或400μMIPTG诱导。在EnzyscreenGrowthProfiler上测定菌株的生长性能，与不表达任何PKL(并且因此不生长)MD1041对照菌株进行比较，与表达来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的PKL酶(并且是代表性的基线性能)的菌株进行比较、或与不代谢阻断糖酵解和磷酸戊糖途径的WT菌株(作为最佳生长的对照)进行比较。
为了计算生长的性能指数(PI)，表达实验PKL酶的MD1041来源的菌株与MCS1148进行比较，它是表达来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的PKL的菌株(参见表1的菌株列表)。选择35小时的时间点和100μMIPTG的诱导水平作为整个生长曲线代表性的一般性能。为了对测定板之间的值进行归一化，基于WT菌株最大OD值之间的差值的修正因子1.279被应用于在不含表达鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)PKL的对照菌株的板中的所有值。随后通过将修正后的实验OD值除以在35小时时间点的MCS1148的OD值计算PI。MCS1148的PI因此是1.0，并且高于这个值的任何值指示这一测定中对生长X倍的改善。PI值在表19中示出。
表19：在阻断糖酵解和磷酸戊糖途径PKL表达菌株中的PI值

Claims (61)

1.一种能够增加通过磷酸转酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中所述重组细胞包含编码具有磷酸转酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中所述多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性。
2.一种能够增加通过磷酸转酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中所述重组细胞包含：(i)编码具有磷酸转酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中所述多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸转酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。
3.一种能够增加通过磷酸转酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中所述重组细胞包含：(i)编码具有磷酸转酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中所述多肽包含与SEQIDNO:8至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸转酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:23至少90％的序列同一性。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:24至少90％的序列同一性。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:25至少90％的序列同一性。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:26至少90％的序列同一性。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:27至少90％的序列同一性。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:28至少90％的序列同一性。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:29至少90％的序列同一性。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:30至少90％的序列同一性。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:31至少90％的序列同一性。
13.一种能够增加通过磷酸转酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中所述重组细胞包含编码具有磷酸转酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中所述多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性。
14.一种能够增加通过磷酸转酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中所述重组细胞包含：(i)编码具有磷酸转酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中所述多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中包含具有(i)的磷酸转酮酶活性的所述多肽的所述重组细胞对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)在葡萄糖上的细胞生长，(b)在木糖上的细胞生长，(c)细胞内乙酰磷酸的产生，或(d)在6-磷酸葡萄糖上的细胞生长。
15.一种能够增加通过磷酸转酮酶途径的碳通量的重组细胞，其中所述重组细胞包含：(i)编码具有磷酸转酮酶活性的多肽的异源核酸序列，其中所述多肽包含与SEQIDNO:11至少65％的序列同一性；和(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中具有(i)的磷酸转酮酶活性的所述多肽对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)蛋白质溶解度，(b)蛋白质表达，或(c)6-磷酸果糖(F6P)比活性。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:32至少90％的序列同一性。
17.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:33至少90％的序列同一性。
18.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:34至少90％的序列同一性。
19.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:35至少90％的序列同一性。
20.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:36至少90％的序列同一性。
21.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:37至少90％的序列同一性。
22.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:38至少90％的序列同一性。
23.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:39至少90％的序列同一性。
24.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:40至少90％的序列同一性。
25.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:41至少90％的序列同一性。
26.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:42至少90％的序列同一性。
27.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:43至少90％的序列同一性。
28.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:44至少90％的序列同一性。
29.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:45至少90％的序列同一性。
30.根据权利要求13-15中任一项所述的重组细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:46至少90％的序列同一性。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的重组细胞，其中在合适培养基中培养所述重组细胞来增加以下项中的一个或多个：细胞内4-磷酸赤藓糖的量、细胞内甘油醛-3-磷酸的量、或细胞内磷酸的量。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的重组细胞，其中所述具有磷酸转酮酶活性的多肽能够由5-磷酸木酮糖合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的重组细胞，其中所述具有磷酸转酮酶活性的多肽能够由6-磷酸果糖合成4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。
34.根据权利要求2-12或14-33中任一项所述的重组细胞，其中所述完整MVA途径的一种或多种多肽选自(a)使两个乙酰-CoA分子缩合以形成乙酰乙酰辅酶A的酶；(b)使乙酰乙酰辅酶A与乙酰-CoA缩合以形成HMG-CoA的酶(例如HMG合酶)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(d)使甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；和(f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。
35.一种能够产生异戊二烯的重组细胞，其中权利要求1-30中任一项所述的重组细胞还包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中在合适培养基中培养所述重组细胞来提供所述异戊二烯的产生，所述异戊二烯对于一个或多个以下参数具有大于1.0的性能指数值：(a)异戊二烯收率，或(b)异戊二烯比生产率。
36.根据权利要求35所述的重组细胞，其中所述编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸是植物异戊二烯合酶多肽。
37.根据权利要求36所述的重组细胞，其中所述植物异戊二烯合酶多肽是来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂交体银白杨x欧洲山杨(PopulusalbaxPopulustremula)的多肽。
38.根据权利要求36所述的重组细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽选自山葛(Puerariamontana)、野葛(Puerarialobata)、美洲山杨(Populustremuloides)、银白杨(Populusalba)、黑杨(Populusnigra)和毛果杨(Populustrichocarpa)。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞还包含编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)途径多肽的一种或多种核酸。
40.一种能够产生类异戊二烯前体的重组细胞，其中在合适培养基中培养权利要求1-34中任一项所述的重组细胞，并且所述重组细胞产生所述类异戊二烯前体。
41.一种能够产生类异戊二烯的重组细胞，其中权利要求1-34中任一项所述的重组细胞还包含编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中在合适培养基中培养所述重组细胞来提供所述类异戊二烯的产生。
42.一种能够产生乙酰CoA-衍生代谢物的重组细胞，其中在合适培养基中培养权利要求1-34中任一项所述的重组细胞来提供所述乙酰CoA-衍生代谢物的产生。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的重组细胞，其中将所述核酸置于诱导型启动子或组成型启动子控制下。
44.根据权利要求1-42中任一项所述的重组细胞，其中将所述核酸克隆到一个或多个多拷贝质粒中。
45.根据权利要求1-42中任一项所述的重组细胞，其中将所述核酸整合到所述细胞的染色体中。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞是革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、藻类细胞或酵母细胞。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞选自棒状杆菌(Corynebacteria)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、柠檬泛菌(Pantoeacitrea)、里氏木霉(Trichodermareesei)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
48.根据权利要求41所述的重组细胞，其中所述类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。
49.根据权利要求41所述的重组细胞，其中所述类异戊二烯是倍半萜。
50.根据权利要求41所述的重组细胞，其中所述类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、里哪醇、苧烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、桧烯、γ-萜品烯、松油烯(terpindene)和朱栾倍半萜。
51.根据权利要求42所述的重组细胞，其中所述乙酰CoA-衍生代谢物选自聚酮化合物、聚羟基丁酸酯、脂肪醇和脂肪酸。
52.根据权利要求42所述的重组细胞，其中所述乙酰CoA-衍生代谢物选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、赖氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
53.根据权利要求42所述的重组细胞，其中所述乙酰CoA-衍生代谢物选自丙酮、异丙醇、异丁烯和丙烯。
54.根据权利要求35或40-42中任一项所述的重组细胞，其中所述合适培养基包含碳源。
55.根据权利要求54所述的重组细胞，其中所述碳源为选自单糖、二糖、寡糖、多糖、C6糖、C5糖和转化糖的碳水化合物。
56.一种生产异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在适于产生异戊二烯的条件下，培养权利要求35所述的重组细胞；以及(b)产生异戊二烯。
57.一种生产类异戊二烯前体的方法，所述方法包括：(a)在适于产生类异戊二烯前体的条件下，培养权利要求40所述的重组细胞；以及(b)产生类异戊二烯前体。
58.一种生产类异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在适于产生类异戊二烯的条件下，培养权利要求41所述的重组细胞；以及(b)产生类异戊二烯。
59.一种生产乙酰CoA-衍生代谢物的方法，所述方法包括：(a)在适于产生乙酰CoA-衍生代谢物的条件下，培养权利要求42所述的重组细胞；以及(b)产生乙酰CoA-衍生代谢物。
60.一种用于检测重组细胞中多肽的体内磷酸转酮酶活性的方法，所述方法包括：(a)在用葡萄糖或木糖作为碳源的培养条件下培养包含编码所述多肽的异源核酸序列的重组细胞，其中所述重组细胞缺失转酮醇酶活性(tktAB)；(b)评估所述重组细胞的细胞生长；以及(c)基于所存在的细胞生长，检测所述多肽的体内磷酸转酮酶活性。
61.一种分离的多肽，所述分离的多肽具有通过权利要求60所述的方法检测到的磷酸转酮酶活性。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107841523A (zh) * 2017-10-19 2018-03-27 浙江大学 利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
EP2984105B1 (en) 2013-04-10 2019-05-22 Danisco US Inc. Phosphoketolases for improved production of acetyl coenzyme a-derived metabolites, isoprene, isoprenoid precursors, and isoprenoids
US20170298363A1 (en) * 2014-09-18 2017-10-19 Genomatica, Inc Non-natural microbial organisms with improved energetic efficiency
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US20200377559A1 (en) * 2017-03-24 2020-12-03 Danisco Us Inc Reduction of acetate and glycerol in modified yeast having an exogenous ethanol-producing pathway
KR20200095534A (ko) 2017-12-07 2020-08-10 지머젠 인코포레이티드 발효에 의한 (6e)-8-히드록시제라니올의 제조를 위해 조작된 생합성 경로
JP2021506316A (ja) 2017-12-21 2021-02-22 ザイマージェン インコーポレイテッド ネペタラクトールオキシドレダクターゼ、ネペタラクトールシンターゼ、及びネペタラクトンを産生する能力がある微生物
BR112020017374A2 (pt) * 2018-03-01 2020-12-29 Total Raffinage Chimie Vias metabólicas com rendimento de carbono aumentado
CN109929883A (zh) * 2019-04-02 2019-06-25 烟台华康荣赞生物科技有限公司 重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用
WO2021063958A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-08 Global Bioenergies Improved means and methods for increasing the yield of acetyl-coa from glucose

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101090964A (zh) * 2004-08-10 2007-12-19 味之素株式会社 磷酸转酮酶用于生产有用的代谢物的用途
WO2011159853A1 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Recombinant host cells comprising phosphoketolases
WO2012149491A2 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Danisco Us Inc. Recombinant microorganisms for enhanced production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids
WO2012149469A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Danisco Us Inc. Production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids using genes encoding polypeptides having thiolase, hmg-coa synthase and hmg-coa reductase enzymatic activities
US8415136B1 (en) * 2011-11-09 2013-04-09 Amyris, Inc. Production of acetyl-coenzyme a derived isoprenoids

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR669447A (fr) 1929-02-09 1929-11-15 Dispositif pour arrêter automatiquement un moteur d'automobile après une période de temps prédéterminée
DE19629568C1 (de) 1996-07-15 1998-01-08 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Herstellung von Isopren
US7172886B2 (en) 2001-12-06 2007-02-06 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of isopentenyl pyrophosphate
AU2003234790A1 (en) 2002-05-10 2003-11-11 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing mevalonic acid
CA2501574C (en) 2002-10-04 2013-12-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the biological production of 1,3-propanediol with high yield
ATE463564T1 (de) * 2004-08-10 2010-04-15 Ajinomoto Kk Verwendung von phosphoketolase zur herstellung geeigneter metabolite
MX284139B (es) 2006-05-26 2011-02-18 Amyris Biotechnologies Inc Produccion de isoprenoides.
JP4986547B2 (ja) 2006-09-04 2012-07-25 株式会社Ａｄｅｋａ 新規なアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、それをコードするＤＮＡ配列、当該酵素の製造方法および当該酵素を利用したメバロン酸の製造方法
WO2009005704A1 (en) * 2007-07-03 2009-01-08 The Regents Of The University Of California Methods of increasing isoprenoid or isoprenoid precursor production
SG162265A1 (en) 2007-12-13 2010-07-29 Danisco Us Inc Compositions and methods for producing isoprene
WO2009100231A2 (en) 2008-02-06 2009-08-13 The Regents Of The University Of California Short chain volatile isoprene hydrocarbon production using the mevalonic acid pathway in genetically engineered yeast and fungi
SG165884A1 (en) 2008-04-23 2010-11-29 Goodyear Tire & Rubber Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
US7632995B2 (en) 2008-05-09 2009-12-15 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of hybrid corn variety CH852179
CA2729801A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods for producing isoprene free of c5 hydrocarbons under decoupling conditions and/or safe operating ranges
HU3516U (en) 2008-07-31 2008-11-28 Zoltan Kuthi Anti-theft protection of draining for fuel tanks
US8470581B2 (en) 2008-09-15 2013-06-25 Danisco Us Inc. Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation
WO2010031076A2 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Conversion of prenyl derivatives to isoprene
WO2010031077A1 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Increased isoprene production using mevalonate kinase and isoprene synthase
SG169641A1 (en) 2008-09-15 2011-04-29 Danisco Us Inc Systems using cell culture for production of isoprene
EP2334788A1 (en) 2008-09-15 2011-06-22 Danisco US Inc. Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway
CN102333866B (zh) 2008-12-30 2015-04-29 丹尼斯科美国公司 生产异戊二烯和共同产物的方法
US8324442B2 (en) 2009-03-03 2012-12-04 Amyris, Inc. Microbial derived isoprene and methods for making the same
US20100297749A1 (en) 2009-04-21 2010-11-25 Sapphire Energy, Inc. Methods and systems for biofuel production
AU2010238770A1 (en) 2009-04-23 2011-11-03 Danisco Us Inc. Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants
JP4760951B2 (ja) 2009-05-08 2011-08-31 トヨタ自動車株式会社 ブタノール生産能を有する組換え微生物及びブタノールの製造方法
TWI434921B (zh) 2009-06-17 2014-04-21 Danisco Us Inc 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統
TWI427149B (zh) 2009-06-17 2014-02-21 Danisco Us Inc 使用ｄｘｐ及ｍｖａ途徑之改良之異戊二烯製造
EP2477478B1 (en) 2009-09-15 2016-11-30 Sapphire Energy, Inc. A system for transformation of the chloroplast genome of scenedesmus sp. and dunaliella sp.
EP2513021A2 (en) 2009-12-18 2012-10-24 Danisco US Inc. Purification of isoprene from renewable resources
EP2857518A3 (en) 2009-12-23 2015-04-22 Danisco US Inc. Compositions and methods of PGL for the increased production of isoprene
JP2014502148A (ja) 2010-10-27 2014-01-30 ダニスコ・ユーエス・インク イソプレン生産の向上を目的としたイソプレン合成酵素変異体
KR101989637B1 (ko) 2011-07-12 2019-06-14 사이언티스트 오브 포춘 에스.에이. 유용한 대사산물의 생산을 위한 재조합 미생물
EP3339426B1 (en) * 2011-10-07 2022-08-24 Danisco US Inc. Utilization of phosphoketolase in the production of mevalonate, isoprenoid precursors, and isoprene
EP2850196A4 (en) 2012-05-16 2016-03-09 Glycos Biotechnologies Inc MICROORGANISMS AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF ISOPRENE
EP2984105B1 (en) 2013-04-10 2019-05-22 Danisco US Inc. Phosphoketolases for improved production of acetyl coenzyme a-derived metabolites, isoprene, isoprenoid precursors, and isoprenoids

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101090964A (zh) * 2004-08-10 2007-12-19 味之素株式会社 磷酸转酮酶用于生产有用的代谢物的用途
WO2011159853A1 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Recombinant host cells comprising phosphoketolases
WO2012149491A2 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Danisco Us Inc. Recombinant microorganisms for enhanced production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids
WO2012149469A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Danisco Us Inc. Production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids using genes encoding polypeptides having thiolase, hmg-coa synthase and hmg-coa reductase enzymatic activities
US8415136B1 (en) * 2011-11-09 2013-04-09 Amyris, Inc. Production of acetyl-coenzyme a derived isoprenoids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTA PAPINI ET AL.: "Physiological characterization of recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing the Aspergillus nidulans phosphoketolase pathway: validation of activity through 13C-based metabolic flux analysis", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
XIANHUA YIN ET AL.: "The gene encoding xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (xfp) is conserved among Bifidobacterium species within a more variable region of the genome and both are useful for strain identification", 《FEMS MICROBIOLOGY LETTERS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107841523A (zh) * 2017-10-19 2018-03-27 浙江大学 利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法

Also Published As

Publication number Publication date
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EP3425049A1 (en) 2019-01-09
US20210139878A1 (en) 2021-05-13
SG11201508186XA (en) 2015-11-27

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