CN102753697A - 改良的使用dxp和mva途径的异戊二烯生产 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于从培养的细胞生产异戊二烯的方法，其中使用DXP途径和MVA途径的不同组分，或与DXP途径和MVA途径有关的组分、铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽和异戊二烯合酶。本发明也提供了包括这些培养的细胞的组合物。

Description

改良的使用DXP和MVA途径的异戊二烯生产
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年6月17日提交的美国临时专利申请号61/187,941、2009年6月17日提交的美国临时专利申请号61/187,930、2010年3月17日提交的美国临时专利申请号61/314,985和2010年3月17日提交的美国临时专利申请号61/314,979的优先权，所有这些申请的公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般地涉及组合物和方法，所述组合物和方法用于改善使用DXP途径和MVA途径从培养的细胞生产异戊二烯。
背景技术
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是用于多种合成聚合物、特别是合成橡胶的关键起始材料。多种微生物、植物和动物物种天然地产生异戊二烯。具体地，已经鉴定了异戊二烯的生物合成的两个途径：甲羟戊酸(MVA)途径和非-甲羟戊酸(DXP)途径(图19A)。但是，从天然存在的生物体生产异戊二烯的产率在商业上不具有吸引力。每年从异戊二烯的聚合生产约800,000吨的顺式-聚异戊二烯；这些聚异戊二烯中大部分用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯也经共聚化而用作其它产品例如鞋类、机械产品、医疗产品、体育用品和胶乳中的弹性体。
目前，轮胎和橡胶工业是基于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶获自非洲雨林中的橡胶树或植物的乳状汁液。合成橡胶主要是基于丁二烯聚合物。对于这些聚合物，作为乙烯和丙稀生产中的共同产物而获得丁二烯。
虽然可以通过分馏石油来获得异戊二烯，但是该物质的纯化是昂贵且耗时的。碳氢化合物的C5流的石油裂解仅产生约15％的异戊二烯。因此，需要更经济的用于生产异戊二烯的方法。特别地，需要以足以满足稳健的商业过程的需要的速率、效价和纯度生产异戊二烯的方法。同样需要用于从廉价的起始材料生产异戊二烯的系统。
发明内容
除了别的以外，本发明提供了用于生产增加的量的异戊二烯的组合物和方法，其中使用不同的DXP途径基因和多肽以及不同的MVA途径基因和多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因和多肽、异戊二烯合酶、和任选的与DXP途径有关的不同基因和多肽、与MVA途径有关的不同基因和多肽以及IDI基因和多肽。在一个方面，本发明表征了已经工程化成生产增加的量的异戊二烯的细胞或培养的细胞，其中使用不同的DXP途径基因和多肽、不同的MVA途径基因和多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因和多肽、异戊二烯合酶基因和多肽、和任选的DXP途径相关的基因和多肽、MVA途径相关的基因和多肽以及IDI基因和多肽的组合。
在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含：(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含：(i)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽，(ii)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码DXP途径多肽和/或MVA途径多肽，和(iii)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。
在一些实施方式中，DXP途径多肽选自：DXS(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)、DXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)、MCT(4-二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK(4-二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS(2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶)和HDR(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶)。在一些实施方式中，DXP途径多肽是DXS、HDS或HDR。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽。
在一些实施方式中，MVA途径多肽选自：乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AA-辅酶A硫解酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)和异戊烯基磷酸激酶(IPK)。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽。
在一个实施方式中，DXP和MVA途径可以在细胞或培养的细胞中以任意比率存在，以从每个途径以任意比例生产异戊二烯。在另一个实施方式中，使用DXP途径生产约10％-50％的异戊二烯，使用MVA途径生产剩余部分。在另一个实施方式中，使用DXP途径生产至少约50％的异戊二烯，使用MVA途径生产剩余部分。
在一些实施方式中，本发明提供了细胞或培养的细胞，其生产大于约400纳摩尔异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(nmole/gwcm/hr)的异戊二烯。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞将细胞培养基中超过约0.002％的碳转化成异戊二烯。
在一些实施方式中，本发明提供了细胞或培养的细胞，其中在发酵运行期间维持HMBPP和DMAPP的水平低于1mM。在其它实施方式中，本发明提供了培养的细胞，其中在发酵的指数期内维持HMBPP和DMAPP的水平低于1mM。在其它实施方式中，本发明提供了细胞或培养的细胞，其中晚期DXP途径酶、尤其是IspG和IspH维持在与使Dxr的磷酸化水平最小化相一致的水平。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽包括：黄素氧还蛋白(例如，黄素氧还蛋白I)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(例如，铁氧还蛋白I)、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶以及编码它们的基因或多肽(例如，fpr和fldA)。
在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含：(i)异源核酸，其编码铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，其编码铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含IspG和fldA。在另一个实施方式中，细胞或培养的细胞包含IspG、fldA和IspH。在一些实施方式中，铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI多肽。
在一些实施方式中，培养的细胞包含：(i)异源核酸，其编码黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，其编码黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI多肽。
在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，碳源例如但不限于：碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分或前述2种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，在限制葡萄糖条件下培养细胞。
在其它方面，本发明提供了生产异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和(b)生产异戊二烯。在一个实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽。在其它实施方式中，培养的细胞生产大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在其它实施方式中，细胞从细胞培养基中消耗的碳中超过约0.02摩尔％被转化成异戊二烯。
在一个方面，本发明表征了生产异戊二烯的方法，例如使用本文所述的任一种细胞来生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，方法包括：培养细胞，所述细胞包含(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，并生产异戊二烯。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、异戊二烯合酶多肽和DXP途径多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，DXP途径多肽选自：DXS(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)、DXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)、MCT(4-二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK(4-二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS(2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶)和HDR(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶)。在一些实施方式中，DXP途径多肽是DXS、HDS或HDR。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽。在一些实施方式中，方法包括：在足以生产大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，方法包括：在足以将细胞培养基中超过约0.002％(mol/mol)的碳转化成异戊二烯的条件下，培养细胞。
在多个实施方式中，在稳定期中生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)大于在生长期的相同时间段内生产的异戊二烯的量，或是约2倍或更多倍。在一些实施方式中，气相包含大于或约9.5％(体积)的氧，并且气相中的异戊二烯的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限。在具体的实施方式中，(i)气相中异戊二烯的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限；并且(ii)细胞生产大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。
在一些实施方式中，仅在稳定期生产异戊二烯。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都生产异戊二烯。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)大于在生长期的相同时间段内生产的异戊二烯的量，或是约2、3、4、5、10、20、30、40、50倍或更多倍。
在一个方面，本发明表征了包含异戊二烯的组合物和系统。在一些实施方式中，组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯(w/w)，组合物中挥发性有机级分是异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃的总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物具有重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％的1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，组合物具有大于约2mg异戊二烯，并具有重量占组合物中所有C5烃总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％或100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，组合物具有小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，组合物还具有大于约2mg的异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物包含(i)包含异戊二烯的气相和(ii)生产大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯的培养的细胞。在一些实施方式中，组合物包含封闭的系统，并且气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L的异戊二烯(当针对培养了1小时的1mL 1OD600进行校正时)。在一些实施方式中，组合物包含开放的系统，并且气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L的异戊二烯(当以1vvm的速率鼓泡时)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分包含重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分包含重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％的除了异戊二烯的以外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分具有重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级分具有大于约2mg异戊二烯，并且具有重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％或100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级分中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，气相的挥发性有机级分具有小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级分还具有大于约2mg异戊二烯。
在本发明的任意组合物的一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在气相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在液相(例如冷凝物)中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在固相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯吸附至固体支持物，例如包括二氧化硅和/或活性炭的支持物。在一些实施方式中，组合物包括乙醇。在一些实施方式中，组合物包括约75％至约90重量％的乙醇，例如约75％至约80％、约80％至约85％或约85％至约90重量％的乙醇。在一些实施方式中，组合物包含约4％至约15重量％的异戊二烯，例如约4％至约8％、约8％至约12％或约12％至约15重量％的异戊二烯。
在一些实施方式中，本发明的特征还在于包括本文描述的任意细胞和/或组合物的系统。在一些实施方式中，系统包括反应器，其反应室包含培养的细胞，所述细胞生产大于约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在一些实施方式中，系统不是封闭系统。在一些实施方式中，从系统中回收至少一部分的异戊二烯。在一些实施方式中，系统包括包含异戊二烯的气相。在多个实施方式中，气相包含本文描述的任意组合物。
在一个方面，本发明提供了包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中，如下生产聚异戊二烯：(i)使本文描述的任意组合物中的异戊二烯聚合，或(ii)使从本文描述的任意组合物回收的异戊二烯聚合。在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺式-1，4-聚异戊二烯。
在本发明的任意组合物、系统、和方法的一些实施方式中，生产气相中的非可燃浓度的异戊二烯。在一些实施方式中，气相包含小于约9.5％(体积)的氧。在一些实施方式中，气相包含大于或约9.5％(体积)的氧，并且气相中的异戊二烯的浓度小于燃烧下限或大于燃烧上限。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约0％至约100％(体积)的氧，例如约10％至约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约0％至约99％(体积)的氮。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约1％至约50％(体积)的CO2。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码DXP途径相关的多肽。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养的细胞生产大于或约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养的细胞将大于或约0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6％或更多的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000或更多ng的异戊二烯/克细胞的细胞湿重/hr(ng/gwcm/h)生产异戊二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000或更多mg异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)生产异戊二烯的累积效价(总量)。本文公开了异戊二烯生产的其它示例性速率和异戊二烯生产的总量。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，通过使用源自它们的突变型DXP途径多肽和核酸，可以进一步增加异戊二烯生产。在一些实施方式中，突变型DXP途径多肽是去除了铁硫簇调节物(iscR)的HDR多肽。在一些实施方式中，突变型DXP途径多肽是仅生产DMAPP或与IPP相比生产大量DMAPP的突变型HDR多肽。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，通过增加经过DXP途径和/或MVA途径的碳通量，可以进一步增加异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过避免在DXP途径下游的代谢物和/或使用DXP途径多肽作为底物的其它途径的中间体对DXS活性的任何反馈抑制，可以增加碳通量。在一些实施方式中，使用DXP途径多肽作为底物(例如，DXP)的其它途径是硫胺素(维生素B1)或吡哆醛(维生素B6)途径。在一些实施方式中，通过表达来自不同生物体的DXP途径多肽(其不会受到DXP途径的下游产物的抑制)，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过解调节葡萄糖摄取，可以增加碳通量。在其它实施方式中，通过使DXP途径和/或MVA途径所需的前体之间的平衡最大化，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过利用分别升高或降低丙酮酸盐或G-3-P的效应来重新指导碳通量，可以实现DXP途径前体丙酮酸盐和甘油醛-3-磷酸(G-3-P)的平衡。在一些实施方式中，通过使用CRP(cAMP受体蛋白)-删除的突变体，可以增加碳通量。
在一些实施方式中，通过使用含有丙酮酸脱氢酶E1亚基变体的菌株(其含有一个或多个DXP途径基因或一个或多个属于DXP途径和MVA途径的基因)，可以增加碳通量。在一些实施方式中，丙酮酸脱氢酶(PDH)E1亚基变体具有一个E636Q点突变。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，可以如下进一步增加异戊二烯生产：通过利用DXP途径的下游基因或多肽，通过将异源萜合酶核酸或内源萜合酶核酸的副本拷贝导入细胞中，所述萜合酶包括、但不限于：罗勒烯合酶、法呢烯合酶和青蒿素合酶。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，在一些实施方式中，载体包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至T7启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的T7启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至内源启动子，例如内源碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合进入不含选择性标志物的细胞染色体中。
在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、和DXP途径、MVA途径中的任意一个或多个核酸以及异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期中比在生长期中更有活性的启动子或因子的控制之下。在一个实施方式中，也包括IDI核酸用于IDI表达，以生产比不使用IDI时更高量的异戊二烯。例如，一个或多个铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、IDI核酸或异戊二烯合酶核酸可以置于稳定期∑因子(例如RpoS)的控制之下。在一些实施方式中，一个或多个铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、MVA途径核酸、IDI核酸或异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期中可诱导的启动子(例如可被在稳定期中有活性的响应调节物诱导的启动子)的控制之下。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，在非诱导条件下培养细胞，所述细胞表达铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、异戊二烯合酶多肽和DXP途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，在非诱导条件下培养细胞，所述细胞表达铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、IDI多肽和异戊二烯合酶多肽。例如，非诱导条件是不进行Trc启动子调节的基因构建体的IPTG-诱导的表达的条件。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了第一种DXP途径多肽以外，细胞表达第二种DXP途径多肽，包括DXS(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)、DXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)、MCT(4-二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK(4-二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS(2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶)和HDR(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种DXP途径多肽以外，细胞表达两种或更多种DXP途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种DXP途径多肽以外，细胞表达2、3、4、5、6或7种DXP途径多肽。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了第一种MVA途径多肽以外，细胞表达第二种MVA途径多肽，包括乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AA-辅酶A硫解酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)和异戊烯基磷酸激酶(IPK)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种MVA途径多肽以外，细胞表达两种或更多种MVA途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种MVA途径多肽以外，细胞表达2、3、4、5、6或7种MVA途径多肽。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、IDI核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、异戊二烯合酶核酸、DXP途径核酸和/或IDI核酸的核酸也包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的多肽，所述植物例如葛属(例如越南葛藤或葛根)或白杨(例如美洲山杨、银白杨、欧洲黑杨、毛果杨或杂交体、银白杨x欧洲山杨)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌细胞(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌或灰色链霉菌细胞)或蓝细菌细胞(例如，Thermosynechococcus细胞例如Thermosynechococcus elongates细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如，埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；或泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞)或蓝细菌细胞(例如，Thermosynechococcus细胞例如Thermosynechococcus elongates细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如，木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属细胞，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如，耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻或亚麻仁的一种或多种多肽。
在一个方面，本发明表征了由本发明的任意组合物或方法生产的产物。
附图说明
图1是针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化的野葛(kudzu)异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。atg起始密码子以斜体表示，终止密码子以加粗字体表示，添加的PstI位点以下划线标示。
图2是pTrcKudzu的图谱。
图3A、B和C是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。RBS以下划线标示，野葛异戊二烯合酶起始密码子以加粗大写字母表示，终止密码子以加粗大写斜体字母表示。载体骨架是pTrcHis2B。
图4是pETNHisKudzu的图谱。
图5A、B和C是pETNHisKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图6是pCL-lac-Kudzu的图谱。
图7A、B和C是pCL-lac-Kudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
图8A的图显示了在无载体的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8B的图显示了在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8C的图显示了在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8D的图显示了在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图9A的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间的OD。
图9B的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间生产的异戊二烯。
图10A的图显示了柠檬泛菌(Pantoea citrea)中异戊二烯的生产。对照细胞中无重组野葛异戊二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图10B的图显示了表达pCL-lac Kudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图10C的图显示了表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图11的图显示了表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中异戊二烯的生产。BG3594comK是无质粒的枯草芽孢杆菌菌株(天然的异戊二烯生产)。CF443-BG3594comK是具有pBSKudzu的枯草芽孢杆菌菌株(重组的异戊二烯生产)。y轴上的IS表示异戊二烯。
图12是pBS Kudzu #2的核苷酸序列(SEQ ID NO：56)。
图13是针对在耶氏酵母属(Yarrowia)中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。
图14是包含针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的pTrex3g的图谱。
图15是载体pSPZ1(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。
图16是针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的合成的野葛(越南葛藤(Pueraria montana))异戊二烯基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。
图17是合成的杂交白杨(poplar)(银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populus tremula))异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。ATG起始密码子以加粗表示，终止密码子以下划线标示。
图18A显示了载体pYLA1、pYL1和pYL2的构建示意图。
图18B显示了载体pYLA(POP1)的构建示意图。
图18C显示了载体pYLA(KZ1)的构建示意图。
图18D显示了载体pYLI(KZ1)的构建示意图。
图18E显示了载体pYLI(MAP29)的构建示意图。
图18F显示了载体pYLA(MAP29)的构建示意图。
图19显示了异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(基于F.Bouvier等人，Progress in Lipid Res.44：357-429，2005)。以下描述包括该途径中的每种多肽的替代性名称，以及公开了用于测定指明的多肽的活性的测定法的参考文献(这些文献中的每一篇皆通过引用方式整体并入本文，尤其是关于测定MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性的测定法的那些)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶，MvaE，EC 2.3.1.9.测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；HMGS；羟基甲基戊二酰-辅酶A合酶，MvaS，EC 2.3.3.10.测定法：J.Bacteriol.，184：4065-4070，2002；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶，MvaE，EC 1.1.1.34.测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC2.7.1.36.测定法：Curr Genet 19：9-14，1991.PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8，EC 2.7.4.2，测定法：Mol Cell Biol.，11：620-631，1991；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVD1，EC 4.1.1.33.测定法：Biochemistry，33：13355-13362，1994；IDI；异戊烯-二磷酸δ-异构酶，IDI1，EC 5.3.3.2.Assay：J.Biol.Chem.264：19169-19175，1989.DXP Pathway：DXS；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC 2.2.1.7.测定法：PNAS，94：12857-62，1997；DXR；1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶，dxr，EC 2.2.1.7.测定法：Eur.J.Biochem.269：4446-4457，2002；MCT；4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶，IspD，EC 2.7.7.60.测定法：PNAS，97：6451-6456，2000；CMK；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶，IspE，EC 2.7.1.148.测定法：PNAS，97：1062-1067，2000；MCS；2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶，IspF，EC4.6.1.12.测定法：PNAS，96：11758-11763，1999；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶，ispG，GcpE，EC 1.17.4.3.测定法：J.Org.Chem.，70：9168-9174，2005；HDR；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶，IspH，LytB，EC 1.17.1.2.测定法：JACS，126：12847-12855，2004。
图20中的图显示了由不含(左侧)或含有(右侧)野葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株生产的异戊二烯的GC-MS分析的结果。箭头表示真实的异戊二烯标准物的洗脱时间。
图21是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的图谱。
图22A-D是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。
图23A的图显示了在BL21/pTrcKudzukan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23B的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23C的图显示了在BL21/pTrcKudzu DXS kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23D的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23E的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23F的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23G的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu DXS中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23H的图显示了在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中，从葡萄糖生产异戊二烯。箭头指示以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。黑色菱形代表OD600，黑色三角形代表异戊二烯生产率(μg/L)，白色方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图24是p9796-白杨的图谱。
图25A-25B是p9796-白杨的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)。
图26是pTrcPoplar的图谱。
图27A-27C是pTrcPoplar的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)。
图28是pTrcKudzu yIDI Kan的图谱。
图29是pTrcKudzu yIDI Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)。
图30是pTrcKudzu DXS Kan的图谱。
图31A-33C是pTrcKudzu DXS Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)。
图32是pCL PtrcKudzu的图谱。
图33A-33C是pCL PtrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)。
图34是pCL PtrcKudzu A3的图谱。
图35A-35C是pCL PtrcKudzu A3的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。
图36是pCL PtrcKudzu yIDI的图谱。
图37A-37C是pCL PtrcKudzu yIDI的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。
图38是pCL PtrcKudzu DXS的图谱。
图39A-39D是pCL PtrcKudzu DXS的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)。
图40的图显示了从生物质原料生产异戊二烯。图板A显示了从玉米秸秆生产异戊二烯，图板B显示了从甘蔗渣生产异戊二烯，图板C显示了从软木浆生产异戊二烯，图板D显示了从葡萄糖生产异戊二烯，图板E显示了不用额外的原料从细胞生产异戊二烯。灰色方框代表在接种后的指明的时间培养物的OD600测量值，黑色三角形代表在接种后的指明的时间异戊二烯的产量。
图41A的图显示了在未添加葡萄糖的培养物中，由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图41B的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的葡萄糖原料转化糖生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图41C的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的转化糖原料生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图41D的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的AFEX玉米秸秆原料生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图42的图显示了酵母提取物对生产异戊二烯的影响。图板A显示了加入不同量的酵母提取物的发酵罐内的光密度的时间进程。图板B显示了加入不同量的酵母提取物的发酵罐内的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了酵母提取物对于补料分批培养物中生长的大肠杆菌生产异戊二烯的影响。
图43的图显示了从500L的生物反应器中由含有pTrcKudzu+yIDI+DXS质粒的大肠杆菌细胞生产的异戊二烯。图板A显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中的光密度的时间进程。图板B显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了从加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。
图44是pBS Kudzu#2的图谱。
图45A的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的生长。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。
图45B的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的异戊二烯生产。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表具有pBSKudzu的芽孢杆菌(重组的异戊二烯生产)。
图46A-46D描绘了用于异戊二烯生产的空载体(对照)、HgS和HgS-FldA菌株的生长速率和比生产率。
图46E是pBAD33的图谱。
图46F和46G是pBAD33的核苷酸序列(SEQ ID NO：51)。
图46H是pTrcHgS-pBAD33的图谱。
图46I和46J是pTrcHgS-pBAD33的核苷酸序列(SEQ ID NO：52)。
图46K是pTrcHgSfldA-pBAD33的图谱。
图46L和46M是pTrcHgSfldA-pBAD33的核苷酸序列(SEQ IDNO：53)。
图47显示了菌株REM19-22相对于REM23-26的生长和异戊二烯生产。在时间0当培养物处于约0.2-0.25的ODλ600nm时，用200uM IPTG，诱导两组菌株中异戊二烯合酶的表达和实验组菌株中T.elongatus基因的表达。在图中显示的数据是在将IPTG加入培养物中以后4小时得到的数据。在30℃在TM3中摇动培养细胞。亲代菌株与实验组菌株的对比表明，GI1.0-dxs、GI1.2-dxs、GI1.5-dxs和GI-1.6-dxs实验菌株的异戊二烯生产分别比亲代菌株增加了10％、20％、30％和80％。
图48显示了在菌株REM23-2中积累的GcpE产物HDMAPP的增加的水平。在5小时IPTG-诱导期，测定REM19-26(菌株指示在x轴上)的DXP代谢物和更大的类异戊二烯分子的浓度。在图例中指示了测定的DXP代谢物和类异戊二烯：DXP，1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸；MEP，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸；cMEPP，2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸；HDMAPP，(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸；DMAPP，二甲基烯丙基二磷酸酯；IPP，异戊烯基二磷酸酯；FPP，法呢基焦磷酸酯。
图49显示了菌株REM29与REMH86相比异戊二烯生产的比生产率。
图50描述了使用RED/ET系统将GI 1.X-启动子系列插入在dxs前面的策略的卡通表示。在3小时摇瓶发酵期间，每30分钟，测定REM29(蓝色)和REMH86(黄色)的生长速率(同样培养的菌株)和异戊二烯生产。在时间0，用400uM IPTG诱导两种培养物。在发酵过程中，从诱导以后的第一时间点开始，实验菌株产生了比亲代菌株高约16％的异戊二烯水平。
图51是T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5的图谱。
图52是用于制备菌株REM23-26的Ptac-gcpE-petF-petH/pK184构建体的图谱。
图53A-53B显示了用于制备菌株REMH76和REMH86的T7-(-3)alba/pBBR1MCS-5(上图)和T7-MTE alba/pBBR1MCS-5(下图)构建体的卡通表示。
图54是用于制备菌株REM31和REM29的Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184构建体的图谱。
图55A-55C是T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5的核苷酸序列(SEQID NO：73)。
图56A-56B是Ptac-gcpE-petF-petH/pK184的核苷酸序列(SEQ IDNO：74)。
图57A-57C是T7-(-3_alba/pBBR1MCS-5的核苷酸序列(SEQ IDNO：75)。
图58A-58C是T7-MTE alba/pBBR1MCS-5的核苷酸序列(SEQ IDNO：76)。
图59A-59B是Ptab-gcpE-LytB-petF-petH/pK184的核苷酸序列(SEQID NO：77)。
图60A-60B表明，ΔiscR BL21(DE3)支持增加的异戊二烯生产。图板60A显示了REM12相对于在其它方面同基因的ΔiscR菌株REM13的比生产率。在诱导菌株携带的IPTG-可诱导的异戊二烯合酶和DXP酶以后4.5小时和8小时，测定异戊二烯水平。显示了来自每个菌株的3个生物副本的三组(A-C)的数据。误差棒描绘了每组的生物副本之间发生的标准差。从该数据可以确定，在4.5小时和8小时时间点，从ΔiscR菌株产生的异戊二烯水平分别比野生型菌株生产的水平平均高40％和73％。图板60B显示了REM12和REM13异戊二烯生产菌株的生长速率。在8小时实验过程中，通过定期测量培养物在600nm的光密度，监测描绘在图板A中的相同菌株的生长速率。时间0对应着将50uM IPTG加入培养物中的时间。在30℃在TM3中摇动培养细胞。与更低的异戊二烯生产野生型(REM12)菌株相比，更高的异戊二烯生产菌株ΔiscR(REM13)以降低的速率生长。
图61是使用RED/ET系统删除iscR基因座的策略的卡通表示。
图62是T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5的卡通表示。
图63是DXP操纵子pET24a的卡通表示。
图64A-64C是T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5的核苷酸序列(SEQID NO：78)。
图65A-65D是DXP操纵子pETt24a的核苷酸序列(SEQ ID NO：79)。
图66是使用RED/ET系统删除ispG和ispH的策略的卡通表示。
图67是用于制备菌株MD09-219/GI1.6-gcpE-lytB-yidi/pCRII-TOPO(Kan)的GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO构建体的卡通表示。
图68描述了磷酸戊糖(PPP)途径和Entner-Doudoroff(ED)途径(Fraenkel，J.Bact.95：1267-1271(1965)，它通过引用整体并入本文)。
图69是pDu-39的图谱。
图70是pMCM596pET24(MEA)alba-dxs-yIDI的图谱。
图71A-71B是pDu-39的核苷酸序列(SEQ ID NO：108)。
图72A-72C是MCM596的核苷酸序列(SEQ ID NO：109)。
图73A-C是pMCM596的核苷酸序列(SEQ ID NO：110)。
图74显示了经由DXP途径(大肠杆菌、Chlorobium tepidum TLS、集胞藻属PCC6803、紫色粘杆菌PCC 7421、肉毒梭菌B1菌株Okra、结核分枝杆菌CDC1551)和经由MVA途径(黄色粘球菌DK 1622、Gramellaforsetii KT0803、约氏黄杆菌UW101、约氏乳杆菌NCC 533、加氏乳杆菌ATCC 33323和乳酸乳球菌乳酸亚种Il1403)合成类异戊二烯的微生物中DXS序列的对比。注意到在2组微生物的位置200-260处的氨基酸序列的差异。
图75A和75B是pDU-9的核苷酸序列。
图76是pDu9-pET-16b rev-yIDI的图谱。
图77描述了GB-CMP-GI1.X-yidi构建体设计。最终的构建体由与片段B(Frag B)融合的片段A(Frag A)组成，以建立GI1.X启动子文库，其转录在上游具有氯霉素抗生素抗性标志物的yIDI，并将50碱基对同源性区域侧接到染色体上的希望的整合位点。
图78描述了pDW33的质粒图谱。pBR322-质粒复制起点；lacIq-lac阻遏蛋白；Ptrc-trc启动子；lac操纵子-lac阻遏蛋白结合位点；银白杨IspS(MEA)-编码异戊二烯合酶的基因；rrn终止子-转录终止子；bla-β内酰胺酶基因。
图79(包括5个图板：图79A、79B、79C、79D和79E)显示了菌株CMP272、REMG39和REM H8_12的15-L规模发酵对比结果：生长、异戊二烯生产和碳的成品收率。图板(A)是异戊二烯效价(g/L培养液)；图板(B)是生产异戊二烯的培养物的比生产率；图板(C)是由光密度(550nm)描绘的细胞生长；图板(D)是由呼吸显示的细胞生长(碳形成速率，CER)；图板(E)是从碳至产物的总产率百分比(克异戊二烯重量/克碳原料重量*100)。发酵条件描述在实施例24的部分F(CMP272)、G(REMG39)和实施例29的部分E(REM H8_12)中。
图80(包括3个图板，80A、80B和80C)显示了菌株CMP272、REMG39和REM H8_12的大规模发酵对比的结果：DXP代谢物。图板(A-C)显示了图79描绘的相同细胞。在每个图板的下面，显示了描述代谢物特性的图例。DXP，1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸；MEP，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸；CDP-ME，4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇；CDP-MEP，2-磷酸-4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇；cMEPP，2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸；HDMAPP，1-羟基-2甲基-2-丁烯-4-基4-二磷酸；DMAPP，二甲基烯丙基二磷酸酯；IPP，异戊烯基二磷酸酯；FPP，法呢基焦磷酸酯。
图81(包括2个图板：图81A和81B)描述了一个将GI1.X fldA插入BL21(DE3)染色体中的策略。图板(A)显示了内源的150碱基对BL21(DE3)fldA基因座。GI1.X fldA PCR片段内与染色体上的希望的5’和3’整合位点具有同源性的区域，被描绘为灰色块状箭头。半箭头线显示了用于验证构建体与染色体对合的PCR引物的位置。显示了核糖体结合位点(RBS)、编码的fldA mRNA的起始密码子和在要用GI1.X启动子系列替换的fldA的上游的内源DNA。图板(B)显示了经由Gene Bridges方法制备的313碱基对BL21(DE3)GI1.X fldA区域(菌株REM I6_4的GI1.6fldA)。插入的GI1.X启动子序列显示为黑色块状箭头；指示了使用Gene Bridges插入方法制备的FTR疤痕序列的放置。
图82描述了GI1.6fldA/pCL的质粒图谱。repA-质粒复制蛋白；aad-氨基糖苷腺苷酰转移酶；M13正向和M13Reverse-各个引物的结合位点；RBS-核糖体结合位点；fldA-大肠杆菌fldA基因。
图83描述了GI1.6fldA-IspG/pCL的质粒图谱。与图82相同的质粒基础：FldA-大肠杆菌fldA基因；IspG-大肠杆菌ispG基因。
图84描述了GI1.6IspG/pCL的质粒图谱。与图82和83相同的质粒基础：IspG-大肠杆菌ispG基因。
图85(包括2个图板，图85A和85B)描述了菌株REMC9_12、REME7_12和REMD6_12的小规模对比。图板(A)是异戊二烯生产相对于生长的比生产率(SP)。y1轴，异戊二烯生产的比生产率(μg/L/OD/hr)；y2轴，细胞密度(OD600)。比生产率(实心条)和OD600(菱形)。在诱导(600uMIPTG)后3和4.5h，测量至少2个生物副本。图板(B)是细胞内代谢物浓度。cMEPP：2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸；HDMAPP-羟基二甲基烯丙基二磷酸酯；DMAPP-二甲基烯丙基二磷酸酯；IPP-异戊烯基二磷酸酯。Y轴：代谢物浓度，mM。在诱导(600uM IPTG)后3.75h，进行显示的测量；单独的实验样品来自(A)；副本产生类似的结果。
图86(包括2个图板：图86A和86B)显示了菌株REMG2_11、REMG4_11和REMG39的小规模对比的结果。图板(A)是异戊二烯生产相对于生长的比生产率。y1轴，异戊二烯生产的比生产率(μg/L/OD/hr)；y2轴，细胞密度(OD600)。比生产率(实心条)和OD600(菱形)。在诱导(400uMIPTG)后1和3.5h，测量至少2个生物副本。图板(B)是菌株的细胞内代谢物浓度。y轴是代谢物浓度，mM。cMEPP：2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸；HDMAPP-羟基二甲基烯丙基二磷酸酯。显示的测量是在诱导(400uMIPTG)后3.5h来自(A)的样品；副本产生类似的结果(第1-3行：REM G2_11；第4-6行：REM G4_11；第7-9行：REMG39)。
图87描述了pEWL454的质粒图谱。质粒基础是pK184。p15A ori-质粒复制起点；RBS-核糖体结合位点；kan-卡那霉素抗生素抗性标志物。
图88描述了PtacAnabaenaAspA终止子/pEWL454的质粒图谱。这是与图87相同的质粒基础。鱼腥藻属IspH-来自鱼腥藻属的编码IspH酶的基因。
图89描述了菌株REMI7_11，和REMH8_12的异戊二烯生产和细胞内代谢物的比生产率。在诱导(500uM IPTG)后3和3.75h，对比了2个菌株。显示了来自至少2个生物副本的异戊二烯测量结果；没有显示副本的代谢物数据，但是产生了类似的结果。
图90(包括3个图板：图90A、90B和90C)描述了菌株REM H8_12和REM G4_11(A)的15-L规模发酵的结果。图板(A)是REMH 8_12(空心方框)和REM G4_11(空心圆形)的异戊二烯效价(g/L培养液)；图板(B)由光密度(550nm)描绘的细胞生长；图板(C)DXP代谢物。在(C)的下面，显示了描述代谢物特性的图例；关于代谢物的描述，参见图80。
图91描述了DMAPP对Dxr的制备规模灭活的结果。
图92(包括2个图板：92A和92B)描述了携带工程化的DXP途径和更低的MVA途径的菌株REM H8_12和REM I7_11的异戊二烯生产。上图显示了异戊二烯生产，其具体地由于向在[U-13C]-葡萄糖上培养的培养物添加指示浓度的MVA。下图显示了异戊二烯生产，其具体地源自[U-13C]-葡萄糖]。在用IPTG诱导培养物以后指定的时间，进行异戊二烯测量。通过GC-MS监测形成的异戊二烯，在m/z＝67以及m/z＝73进行检测。m/z＝67会报告来自MVA(所有12C)的异戊二烯，m/z＝73会报告源自[U-13C]-葡萄糖的异戊二烯。
图93描述了pDW15的质粒图谱。mob-质粒活动化区域；AacC1(庆大霉素抗性)-氨基糖苷乙酰基转移酶，庆大霉素抗性基因；M13反向和M13正向-各个引物的结合位点；Ptrc，Trc启动子；mvaE和mvaS-分别是编码乙酰乙酰-辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶的粪肠球菌基因；RepA-质粒复制蛋白。
图94描述了PTrp mMVK/pDW15的质粒图谱。与图1相同的质粒基础)。Trp启动子；编码的马氏甲烷八叠球菌MVK-编码甲羟戊酸激酶的马氏甲烷八叠球菌基因；aspA终止子。
图95描述了pMCM900的质粒图谱。FRT-Flip重组酶靶位点；核心Trc启动子-RNA聚合酶结合位点；lac操纵子-LacI结合位点；PMK orf-酵母磷酸甲羟戊酸激酶编码序列；MVD orf-酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码序列；yIDI-酵母异戊烯基二磷酸酯异构酶编码序列；aspA终止子-aspA转录终止子；attTn7下游-glmS-下游重组靶向序列；KanR-卡那霉素抗性基因；R6K ori-质粒复制起点；attTn7上游(pstS)-上游重组靶向序列。
图96描述了在有和没有膦胺霉素存在下，对于在未标记的葡萄糖上培养的菌株REM A2_17，测定相对于培养物密度的比生产率的实验的结果。y1轴，异戊二烯生产的比生产率(μg/L OD hr)；y2轴，细胞密度(OD600nm)。比生产率(实心条)和细胞密度(菱形)。在用0mM或2mM膦胺霉素诱导后大约45分钟，进行测量；二者发生在400uM IPTG诱导后大约3小时。显示的数据是3个生物副本的平均值；显示了比生产率和细胞密度值的误差棒。数据提示，由MVA途径和DXP途径产生的异戊二烯分别占大约59％和41％；MVA通量由在暴露于膦胺霉素过程中生产的异戊二烯相对于在没有抑制剂存在下生产的异戊二烯的量的分数决定。
图97描述了测定膦胺霉素对REM A2_17菌株中DXP和MVA途径代谢物的积累和异戊二烯生产率的影响的实验的结果。在有和没有2mM膦胺霉素存在下(分别是“+FM”和“-FM”)温育45min结束时，在培养物中测量沉淀的细胞(与图96相同的细胞)中的代谢物浓度和异戊二烯生产率。将结果表示为在3个不同的培养物中测得的浓度和速率的平均比。
图98描述了在有和没有膦胺霉素存在下，对于在未标记的和1-13C标记的葡萄糖上生长的菌株REM A2_17，测定比生产率相对于培养物密度的实验的结果。y1轴，异戊二烯生产的比生产率(μg/L OD hr)；y2轴，细胞密度(OD600nm)。比生产率(实心条)和细胞密度(菱形)。泳道1：没有色氨酸且没有膦胺霉素的未标记的培养物；泳道2：没有色氨酸且没有膦胺霉素的1-13C葡萄糖培养物；泳道3：含有50uM色氨酸且没有膦胺霉素的1-13C葡萄糖培养物；泳道4：没有色氨酸且含有2mM膦胺霉素的未标记的培养物；泳道5：含有50uM色氨酸且含有2mM膦胺霉素的1-13C葡萄糖培养物；泳道6：含有50uM色氨酸且含有2mM膦胺霉素的1-13C葡萄糖培养物。在用0mM或2mM膦胺霉素诱导后大约45分钟，进行测量；二者发生在400uM IPTG诱导后大约3小时。显示的数据是2个技术副本的平均值；显示了比生产率值的误差棒。数据提示，对于未标记的培养物，由MVA途径和DXP途径产生的异戊二烯分别占大约52％和48％。类似地，数据提示，57％MVA-通量至43％DXP-通量和49％MVA-通量至51％DXP-通量分别促进了不含有和含有50uM色氨酸的1-13C葡萄糖培养物产生的异戊二烯。由泳道3和6表示的因色氨酸在培养物的生长培养基中的存在所介导的MVK酶的抑制表达，在数据上反映为与生长培养基中没有加入色氨酸时生长的培养物相比总通量降低了24％-34％。对于每个具体的培养物类型，MVA通量由在暴露于膦胺霉素过程中生产的异戊二烯相对于在没有抑制剂存在下生产的异戊二烯的量的分数决定。
图99描述了在有和没有膦胺霉素存在下，对于在3-13C葡萄糖上生长的菌株REM A2_17，测定比生产率相对于培养物密度的实验的结果。y1轴，异戊二烯生产的比生产率(μg/L OD hr)；y2轴，细胞密度(OD600nm)。比生产率(实心条)和细胞密度(菱形)。在用0mM或2mM膦胺霉素诱导后大约1小时，进行测量；二者发生在400uM IPTG诱导后大约3小时。显示的数据是2个技术副本的平均值；显示了比生产率值的误差棒。数据提示，由MVA途径和DXP途径产生的异戊二烯分别占大约58％和42％；MVA通量由在暴露于膦胺霉素过程中生产的异戊二烯相对于在没有抑制剂存在下生产的异戊二烯的量的分数决定。
图100(图板A和B)描述了经由糖酵解从A)1-13C葡萄糖和B)3-13C葡萄糖分解代谢产生的异戊二烯的DXP和MVA途径-特异性的标记模式。黑色圆形表示13C原子在指定的位置处的100％丰度。一半黑色的圆形表示50％的13C丰度，剩余的50％是来自空心圆形显示的葡萄糖中的位置的12C原子。
图101(图板A和B)描述了在有或没有膦胺霉素(分别是+FM和-FM)存在下，在A)1-13C葡萄糖或B)3-13C葡萄糖上生长的REM A2_17菌株中异戊二烯和cMEPP特定同位素标记异构体(cumomer)的计算的分布。
图102(图板A和B)描述了下述物质的GC-MS波谱：A)具有天然的13C丰度的未标记的(合成的)异戊二烯标准物，和B)在3-13C葡萄糖上生长的REM A2_17菌株的异戊二烯。注意到，由于13C富集，与异戊二烯标准物相比，在REM A2_17菌株中，m/z 68、69和70峰的强度比m/z 67峰更高。
图103描述了随着MVA/MEP途径之比而变化的异戊二烯13C同位素富集的结果。
图104描述了用于制备、收集和分析BioisopreneTM产物的一个示例性的仪器。
图105描述的结果显示了天然13C-丰度异戊二烯的13C NMR谱。
图106描述的结果显示了源自MVA/MEP双途径菌株的异戊二烯的13C NMR谱。与C-3相比，C-1和C-2/C-4是13C-富集的，等于或小于噪音水平的信号强度表明在该菌株中MVA和MEP途径对异戊二烯合成的贡献。
图107描述了PL.6fkpB基因座的一部分的简图。在图中描绘的区域的核苷酸序列，用在简图下面列出的323个碱基指出。用灰色显示了具有同源性的5’和3’区域，所述区域用于整合在fkpB上游的PL.6启动子。用黑色粗体文字突出显示的序列表示，在Gene Bridges氯霉素抗性盒环出(loopout)以后在该区域中剩下的外源序列，在该图中称作Gene Bridges疤痕，剩余的FRT(翻转酶识别靶物)位点标有下划线。用正常的黑色文字显示PL.6启动子序列。在该图中指出了-35、-10和RBS(核糖体结合位点)位置。
图108(图板A、B、C、D)描述了4种菌株的异戊二烯生产的对比。图板A，在200uM IPTG的2个时间点时菌株WW119(图板B和C中的菌株的亲代)的典型的异戊二烯生产。如在关于图板B和C的菌株的文本中所述，进行该实验，但是，异戊二烯监测限于2和4小时。在所有菌株的培养期中，以每小时的间隔，监测OD600。图板B显示了在几个IPTG浓度时菌株REM 6_15(PL.6fkpB-ispHδ ΔiscR)的异戊二烯比生产率。图板C显示了在几个IPTG浓度时菌株REM D8_15(PL.6fkpB-ispH)的异戊二烯比生产率。所述数据与ΔiscR挽救PL.6fkpB-ispH导入以后丧失的异戊二烯生产相一致。图板D显示了在几个IPTG浓度时菌株REM D7_15的异戊二烯比生产率。
图109显示了大肠杆菌ispH蛋白印迹的照片。泳道描述如下：泳道1，SeeBluePlus2预染色的标准物，Invitrogen，泳道2，大肠杆菌ispH纯化的标准物(0.4μg)，泳道3，REM A7_15可溶级分，泳道4，REMA7_15不可溶级分，泳道5，REM A8_15可溶级分，泳道6，REM A8_15不可溶级分，泳道6，REM D1_14可溶级分，泳道7，REM D1_14不可溶级分，泳道8，WW103可溶级分，和泳道10，WW103不可溶级分。显影方法：1°Ab抗-兔大肠杆菌ispH在1∶10,000稀释度，2°Ab Alexa Fluor
Figure BDA0000135516370000282
488山羊抗-兔IgG(H+L)，Invitrogen，1∶1,000稀释度；其它细节，参见文本。凝胶是Novagen 4-12％BT凝胶。将装载标准化为相同的OD600。Pel，沉淀物；sup，上清液。
图110显示了大肠杆菌ispH蛋白印迹定量。通过ImageQuant 5.2(Molecular Dynamics)，定量蛋白印迹数据。浅色阴影条表示在可溶级分中发现的ispH的量。深色阴影条表示在不可溶级分中发现的ispH的量。
具体实施方式
除了别的以外，本发明提供了用于生产增加的量的异戊二烯的组合物和方法，其中使用不同的DXP途径基因和多肽、不同的MVA途径基因和多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因和多肽、异戊二烯合酶基因和多肽、和任选的IDI基因和多肽以及与DXP途径和/或MVA途径有关的不同基因和多肽。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第2版，John Wiley and Sons，NewYork(1994)，和Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，N.Y.(1991)为技术人员提供了本发明中使用的很多术语的一般含义。应该理解：本发明不限于所描述的特定的方法、程序和试剂，因为它们是可变的。本领域技术人员还将认识到，也可以使用与本文描述的那些相似或等同的任意方法和材料来实施或测试本发明。本文提供的小标题不是本发明的各个方面或实施方式的限制，而已通过参考作为一个整体的说明书来获得本发明。
本文使用的术语“异戊二烯”或“2-甲基-1，3-丁二烯”(CAS# 78-79-5)是指，从3，3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消除焦磷酸而产生的直接的和最终的挥发性C5烃产物，并且不包括一个或多个异戊烯二磷酸(IPP)分子与一个或多个DMAPP分子的连接或聚合。术语“异戊二烯”一般不意在限于其生产方法。
本文使用的短语“与DXP途径有关的不同基因和多肽”或“DXP途径相关的核酸或多肽”表示与DXP途径多肽或核酸直接地或间接地相互作用的任意核酸或多肽，包括，但不限于萜合酶(例如，罗勒烯合酶、法呢烯合酶和青蒿素合酶)。
除非另有明确指明，否则在本文中使用的术语“一个”、“一种”等是指一个或多个。
在本文中提及“约”某数值或参数包括(并且描述)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括界定该范围的数值。
应该理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括：“包含”、“由......组成”、和“基本上由......组成”的方面和实施方式。
本发明部分地基于下述令人惊讶的发现，即增加的量的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽会增加DXP途径多肽(例如HDS(GcpE或IspG)或HDR多肽(IspH或LytB)表现出的活性。尽管不希望受特定理论的约束，据信，一种或多种内源或异源铁硫相互作用的氧化还原核酸或多肽的增加的表达，会提高含有铁硫簇的DXP途径多肽(例如HDS或HDR)的形成速率和量，和/或稳定化含有铁硫簇的DXP途径多肽(例如HDS或HDR)。这又会通过增加HMBPP和/或DMAPP的合成和减少DXP途径中的cMEPP和HMBPP蓄池，而增加细胞中供给异戊二烯合成的碳通量。例如，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽(黄素氧还蛋白I)在过表达DXP途径多肽(DXS)、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽的细胞中的过表达，会使异戊二烯生产比仅过表达DXP途径多肽、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽的细胞增加约1-2倍。参见实施例8。一种或多种铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽(铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶)、一种或多种DXP途径多肽、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽的过表达，会导致增加的异戊二烯生产。参见实施例9。
因此，在本发明的一个方面，培养的细胞包含：(i)编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽的异源核酸、编码DXP途径多肽的异源核酸和编码异戊二烯合酶的异源核酸，和/或(ii)编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽的内源核酸的副本拷贝。在一些实施方式中，培养的细胞包含：(i)编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽的异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，(ii)编码DXP途径多肽的异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝。
在本发明的另一个方面，提供了生产异戊二烯的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含：(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和(b)生产异戊二烯。
本文使用的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽是，能够将电子转移给含有铁硫簇的多肽的多肽。铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽包括、但不限于：黄素氧还蛋白(例如，黄素氧还蛋白I)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(例如，铁氧还蛋白I)、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、以及编码它们的基因或多肽(例如，fpr或fldA)。例如，DXP途径多肽HDS(GcpE)是处理[4Fe-4S]2+中心的金属酶，并催化cMEPP还原成HMBPP，所述还原是通过在有黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶存在下由[4Fe-4S]2+中心的还原所介导的2个连续的单电子转移来实现(参见，Wolff等人，FEBS Letters，541：115-120(2003))，它通过引用整体并入本文)。类似地，DXP途径多肽HDR(LytB)也是Fe/S蛋白，其催化HMBPP还原成IPP或DMAPP，所述还原是通过在有黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶/NADPH系统存在下的2个连续的单电子转移来实现。参见，例如，Seemann，M.等人Agnew.Chem.Int.Ed.，41：4337-4339(2002)；Wolff，M.等人，FEBS Letters，541：115-120(2003)，它们各自通过引用整体并入本文，特别是关于GcpE、LytB和黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶/NADPH系统的描述)。
本文使用的黄素氧还蛋白是能够转移电子的蛋白，且含有辅基黄素单核苷酸。在大肠杆菌(E.coli)中，黄素氧还蛋白由fldA基因编码，并被含有FAD的蛋白NADPH：铁氧还蛋白氧化还原酶还原，且在类异戊二烯生物合成的DXP途径中起重要作用(实例参见，Kia-Joo，P.等人FEBSLetters，579：3802-3806，2005，它通过引用整体并入本文)。
本文使用的铁氧还蛋白是能够转移电子的蛋白，且含有等量的铁和不稳定的硫，并在类异戊二烯生物合成的DXP途径中起重要作用。例如，已经证实来自植物和蓝细菌的HDS是铁氧还蛋白，而不是黄素氧还蛋白-依赖性的酶(Seemann等人，FEBS Lett.，580(6)：1547-52(2006)，它通过引用整体并入本文)。
本文使用的Fpr会编码黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白NADPH-氧化还原酶，并为HDS和HDR提供经由FldA从NADPH衍生出的必要的电子，以执行它们的催化功能(综述见下述报告：L.A.Furgerson，TheMevalonate-不依赖的Pathway to Isoprenoid Compounds：Discovery，Elucidation，and Reaction Mechanisms，13，2006年2月13日出版，它通过引用整体并入本文)。
本文使用的编码的DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS和HDR多肽是异戊二烯生物合成的DXP途径的组分(图19A)。
DXS多肽会将丙酮酸盐和D-甘油醛-3-磷酸转化成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加DXS多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。
DXR多肽会将1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸(MEP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加DXR多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。
MCT多肽会将2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸(MEP)转化成4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-Me)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加MCT多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。
CMK多肽会将4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)转化成2-磷酸-4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加CMK多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。
MCS多肽会将2-磷酸-4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加MCS多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。
HDS多肽会将2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)转化成(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加HDS多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。
HDR多肽会将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-二磷酸(HMBPP)转化成异戊烯基二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加HDR多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。
异戊二烯合酶多肽会将二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)转化成异戊二烯。
异源的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽可以在多种宿主细胞中表达，例如大肠杆菌(E.coli)、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母和里氏木霉。所有这些细胞生产比单独的天然存在的DXP途径更多的异戊二烯。
如下面进一步讨论的，通过增加铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽的表达的量，可以增强细胞的异戊二烯生产。DXP途径多肽包括DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS和HDR。例如，可以将一个或多个DXP途径核酸导入细胞中，这包括DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS和HDR。DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR核酸可以是异源核酸或内源核酸的副本拷贝。类似地，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸可以是异源核酸或内源核酸的副本拷贝。类似地，异戊二烯合酶核酸可以是异源核酸或内源核酸的副本拷贝。在一些实施方式中，如下增加一种或多种铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR多肽中的一种或多种和异戊二烯合酶多肽的量：通过将一个或多个内源铁硫簇-相互作用的氧化还原启动子或调节区、内源DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR启动子或调节区中的一个或多个、和异戊二烯合酶启动子或调节区替换为其它启动子和/或调节区，后者导致铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR核酸中的一个或多个和异戊二烯合酶核酸的更大转录。
在一些实施方式中，异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸的存在，会造成所述细胞与仅具有这些异源或额外的内源核酸中的一个或2个的对应细胞相比更有重现性地生长和/或存活更久。尽管不希望受特定理论的约束，据信，过表达铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽可以增加一种或多种DXP途径多肽(例如，GcpE和/或LytB)的形成速率或量，或稳定化一种或多种DXP途径多肽(例如，GcpE和/或LytB)，使得一种或多种DXP途径多肽在更长的时间段内具有活性，这又会造成含有异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞与仅具有这些异源或额外的内源核酸中的一个或2个的对应细胞相比更有重现性地生长和/或存活更久。例如，含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞，会比下述细胞更好地生长：仅具有DXP途径核酸的细胞，仅具有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸的细胞，具有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸和DXP途径核酸的细胞，具有铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞，或具有DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞。另外，可以在细胞中表达大量的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，而不造成对细胞的过量毒性。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了第一种DXP途径多肽以外，细胞表达第二种DXP途径多肽，包括DXS(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)、DXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)、MCT(4-二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK(4-二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS(2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶)和HDR(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种DXP途径多肽以外，细胞表达两种或更多种DXP途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种DXP途径多肽以外，细胞表达2、3、4、5、6或7种DXP途径多肽。
另外，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸(例如，DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR)和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXS核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在其它实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、HDS(IspG或GcpE)和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，细胞包含IspG和fldA。在另一个实施方式中，细胞包含IspG、fldA和IspH。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源黄素氧还蛋白核酸、DXS核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在其它实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源黄素氧还蛋白核酸、HDS(IG或GE)核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁氧还蛋白核酸、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶核酸、DXS核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在其它实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁氧还蛋白核酸、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶核酸、HDS(IspG或GcpE)核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、HDR(IspH或LytB)核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，细胞包含IspG和fldA。在另一个实施方式中，细胞包含IspG、fldA和IspH。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽的量，可以增强含有异源黄素氧还蛋白、HDR(IspH或LytB)和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽的量，可以增强含有异源铁氧还蛋白核酸、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶核酸、HDR(IspH或LytB)核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽的量，可以增强含有异源铁氧还蛋白核酸、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶核酸、HDS和HDR核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。
IDI多肽会催化异戊烯基二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)的相互转化。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加细胞中IDI多肽的量，会增加转化成DMAPP的IPP的量(和转化率)，所述DMAPP又被转化成异戊二烯。
IDI核酸可以是异源核酸或内源核酸的副本拷贝。在一些实施方式中，如下增加铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽(例如，DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR)中的一种或多种、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽的量：通过将内源铁硫簇-相互作用的氧化还原启动子或调节区、内源DXP途径启动子或调节区中的一个或多个和IDI启动子或调节区替换为其它启动子和/或调节区，后者导致铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、异戊二烯合酶核酸和IDI核酸的更大转录。
异源的IDI多肽也可以在多种存在异戊二烯合酶的宿主细胞中表达，例如大肠杆菌(E.coli)、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母和里氏木霉。与不使用IDI时相比，所有这些细胞生产更多的异戊二烯。
另外，通过增加细胞表达的DXP途径相关的多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸(例如，DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR)、异戊二烯合酶核酸和任选的IDI核酸的细胞的异戊二烯生产。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，通过使用源自它们的突变型DXP途径多肽或核酸，可以进一步增加异戊二烯生产。在一些实施方式中，突变型DXP途径多肽是去除了铁硫簇调节物(iscR)的HDR多肽。在一些实施方式中，突变型DXP途径多肽是仅生产DMAPP或与IPP相比生产大量DMAPP的突变型HDR多肽。例如，在DXP途径-介导的异戊二烯生产菌株中使用LytBG120D，允许独特地制备几乎完全源自DMAPP的类异戊二烯产物.参见实施例18。
本文使用的iscR是由位于编码大肠杆菌Fe-S簇装配蛋白的基因的上游紧邻处的ORF编码。在DXP途径中，在大肠杆菌菌株中实现指导参与铁硫簇装配的isc操纵子的过表达的基因盒，从该菌株中厌氧地纯化的HDR蛋白被工程化了至少200倍(
Figure BDA0000135516370000371
等人，J Am Chem Soc.126(40)：12847-55(2004)；Schwartz等人，PNAS，98(26)：14751-3(2001)；Akhtar和Jones，Appl.Microbiol.Biotechnol.78(5)：853-62(2008)，它们各自通过引用整体并入本文)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，通过增加经过DXP途径的碳通量，可以进一步增加异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过避免在DXP途径下游的代谢物和/或使用DXP途径多肽(例如，DXR)作为底物的其它途径的中间体对DXS活性的任何反馈抑制，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过再平衡途径酶和维持HMBPP和DMAPP的水平在低于1-2mM DMAPP和1-2mM HMBPP的浓度，可以减轻一些DXP途径多肽(例如，DXR)的反馈抑制。在一些实施方式中，在发酵运行期间，维持HMBPP和DMAPP的水平低于1mM。在其它实施方式中，在发酵的指数期内，维持HMBPP和DMAPP的水平低于1mM。在其它实施方式中，将晚期DXP途径酶、尤其是IspG和IspH维持在与使Dxr的磷酸化水平最小化相一致的水平。
在一些实施方式中，使用DXP途径多肽作为底物(例如，DXP)的其它途径是硫胺素(维生素B1)或吡哆醛(维生素B6)途径。在一些实施方式中，通过表达来自不同生物体的DXP途径多肽(其不会受到DXP途径的下游产物的抑制)，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过解调节葡萄糖摄取，可以增加碳通量。在其它实施方式中，通过使DXP途径所需的前体之间的平衡最大化，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过利用分别升高或降低丙酮酸盐或G-3-P的效应来重新指导碳通量，可以实现DXP途径前体丙酮酸盐和甘油醛-3-磷酸(G-3-P)的平衡。在一些实施方式中，通过使用含有丙酮酸脱氢酶E1亚基变体的菌株(其含有一个或多个DXP途径基因或一个或多个属于DXP途径和MVA途径的基因)，可以增加碳通量。在一些实施方式中，丙酮酸脱氢酶(PDH)E1亚基变体具有一个E636Q点突变。在一些实施方式中，通过使用CRP-删除的突变体，可以增加碳通量。本文使用的CRP(cAMP受体蛋白)是被环AMP活化的正调节蛋白。开始大肠杆菌的某些(分解代谢物敏感的)操纵子的转录，需要RNA聚合酶。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，可以如下进一步增加异戊二烯生产：通过利用DXP途径的下游基因或多肽，通过将异源萜合酶核酸或内源萜合酶核酸的副本拷贝导入细胞中，所述萜合酶包括、但不限于：罗勒烯合酶、法呢烯合酶和青蒿素合酶。
在一些实施方式中，将可再生的碳源用于生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯和任意氧化剂的浓度是在不可燃范围内，以减小或消除在生产或回收异戊二烯过程中可能着火的风险。参见例如，美国申请号61/133,947(它通过引用整体并入本文，尤其是关于实施例13中异戊二烯的可燃性建模和测试)和WO2010/003007。本发明的组合物和方法是合乎需要的，因为它们允许获得高异戊二烯产率/细胞、高碳产率、高异戊二烯纯度、高生产率、低能量使用、低生产成本和投入以及最小的副反应。这种用于生产异戊二烯的有效率的大规模的生物合成方法，提供了用于基于合成的异戊二烯的橡胶的异戊二烯来源，并且提供了替代使用天然橡胶的合乎需要的低成本的替代方式。
在一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸和异戊二烯合酶核酸至少约5、10、20、50、75、100、200、300次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和IDI核酸至少约5、10、20、50、75、100、200、300次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含异源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸和DXP途径相关的核酸或内源的对应核酸的副本拷贝的核酸也包含选择性标志物，例如卡那霉素、氨苄西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素抗生素抗性核酸。
通过向细胞培养基中添加酵母提取物，可以进一步增加所生产的异戊二烯的量。例如，对于所测试的浓度，所生产的异戊二烯的量与细胞培养基中酵母提取物的量成线性比例。相对于在存在酵母提取物的情况下增加葡萄糖的量，在存在葡萄糖的情况下增加酵母提取物的量，可以生产更多的异戊二烯。另外，增加酵母提取物的量允许细胞在更长的时间生产高水平的异戊二烯，并改善细胞的健康。
还使用三种类型的水解的生物质(甘蔗渣、玉米秸秆和软木浆)作为碳源证明了异戊二烯的生产。如果需要，可以在本发明的组合物和方法中使用任意其它生物质碳源。生物质碳源是合乎需要的，因为它们比很多常规的细胞培养基更便宜，从而促进了异戊二烯的经济生产。
在一些实施方式中，在细胞培养基中包括油。参见，例如，美国61/134,094，它通过引用整体并入本文，尤其是关于在细胞培养基中包括的油。在一些实施方式中，在细胞培养基中包括了一种以上的油(例如2、3、4、5、或更多种油)。不被任何特定理论所限，相信：(i)油可以增加细胞中的可用于被转化为异戊二烯的碳的量；(ii)油可以增加细胞中甘油醛3-磷酸和/或丙酮酸盐的量，从而增加经过DXP途径的碳流；和/或(iii)油可以向细胞提供额外的营养物，这是合乎需要的，因为细胞中的多数碳被转化为异戊二烯而不是其它产物。在一些实施方式中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天然地使用DXP途径来生产异戊二烯或经过遗传修饰以包含整个DXP途径的核酸。在一些实施方式中，在添加到细胞培养基中之前，油被部分地或全部地水解以促进宿主细胞对油的利用。
示例性的多肽和核酸
在本发明的组合物和方法中，可以使用不同的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽和核酸、DXP途径多肽和核酸、DXP途径相关的多肽和核酸、异戊二烯合酶多肽和核酸和IDI多肽和核酸。
本文使用的“多肽”包括多肽、蛋白、肽、多肽片段和融合多肽。在一些实施方式中，融合多肽包括第一种多肽(例如，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽或其催化活性片段)的一部分或全部，且可以任选地包括第二种多肽(例如，便利融合多肽的纯化或检测的肽，例如His-标签)的一部分或全部。在一些实施方式中，融合多肽具有两种或更多种DXP途径多肽的活性。
在多个实施方式中，多肽具有至少或约50、100、150、175、200、250、300、350、400、或更多个氨基酸。在一些实施方式中，多肽片段包含来自全长多肽的至少或约25、50、75、100、150、200、300、或更多个连续氨基酸并且具有至少或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的对应的全长多肽的活性。在具体的实施方式中，多肽包括任意天然存在的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的氨基酸序列区段或整个氨基酸序列。在一些实施方式中，相对于野生型(即天然存在的序列)铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的序列，多肽具有一个或多个突变。
在一些实施方式中，多肽是分离的多肽。本文使用的“分离的多肽”不是多肽文库的一部分，所述多肽文库例如2、5、10、20、50或更多个不同多肽的文库；而是分离自天然状态下与其一起产生的至少一个成分。例如通过表达编码多肽的重组核酸，可以获得分离的多肽。
在一些实施方式中，多肽是异源多肽。“异源多肽”是指这样的多肽：其氨基酸序列与在相同宿主细胞中天然表达的另一多肽的氨基酸序列不相同。具体地，异源多肽与天然状态下存在于相同宿主细胞中的野生型多肽不相同。
本文使用的“核酸”是指单链或双链形式的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。在一些实施方式中，核酸是重组核酸。“重组核酸”是指这样的目标核酸：其不含在所述目标核酸所源自的生物体的天然状态下存在的基因组中侧接该目标核酸的一个或多个核酸(例如基因)。因此，该术语包括例如，掺入到载体中、掺入到自我复制型质粒或病毒中、或掺入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独分子(例如，cDNA、基因组DNA片段、或通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA片段)而存在。在多个实施方式中，核酸是重组核酸。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸可操作地连接至编码全部或部分的另一多肽的另一核酸，从而重组核酸编码融合多肽，所述融合多肽包括铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和/或IDI和全部或部分另一多肽(例如促进融合多肽的纯化或检测的肽，例如His-标签)。在一些实施方式中，部分或全部的重组核酸是化学合成的。应该理解：突变，包括单核苷酸突变，可以发生在本文定义的核酸内。
在一些实施方式中，核酸是异源核酸。“异源核酸”是指这样的核酸：其核酸序列与在相同宿主细胞中天然存在的另一核酸的核酸序列不相同。
在具体的实施方式中，核酸包括任意天然存在的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的核酸序列区段或整个核酸序列。在一些实施方式中，核酸包括来自天然存在的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、或更多个连续核苷酸。在一些实施方式中，相对于野生型(即天然存在的序列)铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的序列，核酸具有一个或多个突变。在一些实施方式中，核酸具有增加铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的转录或翻译的一个或多个突变(例如沉默突变)。在一些实施方式中，核酸是编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的任意核酸的简并变体。
“密码子简并性”是指遗传密码的多样性，其允许核苷酸序列变化而不影响所编码的多肽的氨基酸序列。技术人员熟知：特定的宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定氨基酸时表现出的“密码子偏爱”。因此，当合成用于改善宿主细胞中的表达的核酸时，在一些实施方式中合乎需要地将核酸设计为使其密码子使用频率达到宿主细胞的优选密码子使用频率。
示例性的异戊二烯合酶和DXP途径多肽和核酸的登记号列举于附件1(附件1的登记号和它们的相应序列通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。Kegg数据库也包含多个示例性的异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(参见，例如，互联网网址：“genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”和其中的序列，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和/或核酸中的一项或多项具有与2007年12月12日或2008年9月14日公开的序列相同的序列，例如对应于附件1中的登记号的任意序列，或Kegg数据库中的任意序列。另外的示例性的异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和核酸在下面进一步描述。
示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸
如上所述，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化为异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中或在体内测定多肽将DMAPP转化为异戊二烯的能力，使用标准方法来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性的测定法中，按照实施例1描述的摇瓶方法使菌株(例如，本文描述的大肠杆菌/pTrcKudzu菌株)生长，以此来制备细胞提取物。诱导结束后，通过在7000x g离心10分钟沉淀约10mL细胞，并重悬于5ml不含甘油的PEB中。使用弗氏压碎器(French Pressure cell)使用标准程序将细胞裂解。或者，在-80℃冷冻/解冻后，以溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理细胞。
可以按照例如Silver等人，J.Biol.Chem.270：13010-13016，1995及其中的参考文献(其通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶多肽活性的测定法的部分)的描述来测定细胞提取物中异戊二烯合酶多肽的活性。在氮气流下，使DMAPP(Sigma)蒸发至干燥，并在pH8.2的100mM磷酸钾缓冲液中重新水化至100mM的浓度，并储存于-20℃。为了进行测定，将5μL 1M MgCl2、1mM(250μg/ml)DMAPP、65μL植物提取物缓冲液(PEB)(50mM Tris-HCl，pH 8.0，20mM MgCl2，5％甘油，和2mM DTT)的溶液加入到20ml的具有金属螺丝盖和特氟隆包被的硅隔膜的顶空瓶(Agilent Technologies)中的25μL细胞提取物中，并在37℃摇动培养15分钟。通过加入200μL 250mM EDTA使反应猝灭，按照实施例1第II部分的描述通过GC/MS进行定量测定。
示例性的异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，例如蝶型花亚科(Faboideae)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自下列的多肽或核酸：越南葛藤(野葛)(Sharkey等人，PlantPhysiology 137：700-712，2005)，葛根(Pueraria lobata)，白杨(例如银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、或银白杨x欧洲山杨(CAC35696)Miller等，Planta 213：483-487，2001)，白杨(aspen)(例如美洲山杨)Silver等人，JBC 270(22)：13010-1316，1995)，或英国栎(夏栎(Quercus robur))(Zimmer等人，WO98/02550)，其通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达的内容。适宜的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登记号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070、和AY182241(其通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列的内容)中记载的那些。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是的来自夏栎天然存在的多肽或核酸(即，异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然存在的多肽或核酸以外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。
示例性的DXP途径多肽和核酸
示例性的DXP途径多肽包括、但不限于下述多肽中的任一种：DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽和具有一种、两种或更多种DXP途径多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。具体地，DXP途径多肽包括具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的DXP途径核酸包括这样的核酸：其编码具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽。示例性的DXP途径多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
具体地，DXS多肽会将丙酮酸盐和D-甘油醛3-磷酸转化成1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸(DXP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化丙酮酸盐和D-甘油醛3-磷酸的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有DXS多肽活性。
DXR多肽会将1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸(DXP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸(MEP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化DXP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有DXR多肽活性。
MCT多肽会将2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸(MEP)转化成4-(胞苷5’-二磷酸)-2-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化MEP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有MCT多肽活性。
CMK多肽会将4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)转化成2-磷酸-4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化CDP-ME的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有CMK多肽活性
MCS多肽会将2-磷酸-4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化CDP-MEP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有MCS多肽活性。
HDS多肽会将2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸转化成(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸酯(HMBPP或HDMAPP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化ME-CPP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有HDS多肽活性。
HDR多肽会将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸酯转化成异戊烯基二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化HMBPP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有HDR多肽活性。
IDI多肽会将异戊烯基二磷酸酯转化成二甲基烯丙基二磷酸酯。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化异戊烯基二磷酸酯的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有IDI多肽活性。
示例性的MVA途径多肽和核酸
在本发明的一些方面，在本文描述的任意组合物或方法中所述的细胞包含编码MVA途径多肽的核酸。在一些实施方式中，MVA途径多肽是内源多肽。在一些实施方式中，细胞包含编码MVA途径多肽的内源核酸的一个或多个额外的拷贝。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子上。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子上。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至强启动子上。在一个具体实施方式中，将细胞工程化成过表达与野生型细胞有关的内源MVA途径多肽。
在一些实施方式中，MVA途径多肽是异源多肽。在一些实施方式中，细胞包含编码MVA途径多肽的异源核酸的超过一个拷贝。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子上。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子上。
示例性的MVA途径多肽包括乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AA-辅酶A硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽和具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的MVA途径核酸包括这样的核酸：其编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽。示例性的MVA途径多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸。另外，也可以使用MVA途径多肽的变体，其赋予更好的异戊二烯生产结果。
可以使用的MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的类型以及制备编码MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的微生物(例如，兼性厌氧菌例如大肠杆菌)的方法，也描述在国际专利申请公开号WO2009/076676、美国专利申请号12/496,573、12/560,390、12/560,317、12/560,370、12/560,305，和12/560,366和美国临时专利申请号61/187,930、61/187,934和61/187,959中。
本领域技术人员可以容易地选择和/或使用合适的启动子，以优化异戊二烯合酶和/或一种或多种MVA途径多肽和/或一种或多种DXP途径多肽的表达。类似地，本领域技术人员可以容易地选择和/或使用合适的载体(或转移载体)，以优化异戊二烯合酶和/或一种或多种MVA途径多肽和/或一种或多种DXP途径多肽的表达。在一些实施方式中，载体含有选择性标志物。选择性标志物的实例包括、但不限于：抗生素抗性核酸(例如，卡那霉素、氨苄西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素)和/或为宿主细胞提供代谢优势(例如营养优势)的核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶或MVA途径核酸会整合进没有选择性标志物的细胞的染色体中。
示例性的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽和核酸
如上所述，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽在类异戊二烯生物合成的DXP途径中起重要作用。示例性的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽包括具有铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。通过使用氢化酶-连接的试验测量甲硝唑[1-(2-羟基乙基)-2-甲基-5-硝基咪唑]还原的速率(Chen和Blanchard，Analytical Biochem，93：216-222(1979)，它通过引用整体并入本文，尤其是关于铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白的氢化酶-连接的试验)，可以使用标准方法测定多肽是否具有铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽活性。
示例性的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽核酸包括这样的核酸：其编码具有铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽。示例性的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
示例性的分离核酸的方法
使用标准方法，可以分离铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸。从目标来源生物体(例如细菌基因组)获得需要的核酸的方法是分子生物学领域常见的和熟知的(参见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于目标核酸的分离)。例如，如果核酸的序列是已知的(例如本文描述的已知核酸的任意项)，可以通过限制性内切核酸酶消化来产生合适的基因组文库，并可以使用与需要的核酸序列互补的探针进行筛选。一旦分离了序列，则可以使用标准的引物指导的扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,683,202，它通过引用整体并入本文，尤其是关于PCR方法)来扩增DNA，以获得适合于使用合适的载体进行转化的量的DNA。
或者，使用标准方法，可以化学地合成铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸(例如具有已知核酸序列的任意异戊二烯合酶核酸、铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和/或IDI核酸)。
使用标准方法，可以鉴别出可能适用于本文所述的组合物和方法中的其它的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸。例如，可以在生物体例如大肠杆菌中构建已知天然地产生异戊二烯的生物体染色体DNA的粘粒文库，然后就异戊二烯的产生进行筛选。具体地，可以产生这样的粘粒文库，其中基因组DNA的大的区段(35-45kb)被包装进入载体中，并用于转化合适的宿主。粘粒载体的独特之处在于能够容纳大量的DNA。一般地，粘粒载体具有至少一个拷贝的cos DNA序列，其对于异源DNA的包装和随后的环化是必需的。除了cos序列之外，这些载体还包含复制起始点(例如ColEI)和药物抗性标志物(例如对氨比西林或新霉素的核酸抗性)。使用粘粒载体转化合适的细菌宿主的方法在Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989中有完善的描述，其通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法的内容。
通常，为了克隆粘粒，使用适当的限制性内切核酸酶分离异源DNA，并使用合适的连接酶连接至邻近的粘粒载体的cos区域。然后，使含有线性化的异源DNA的粘粒载体与DNA包装介体例如噬菌体反应。在包装过程中，cos位点被切割，并且异源DNA被包装进入细菌病毒颗粒的头部。然后，这些颗粒用于转染合适的宿主细胞，例如大肠杆菌。一旦注射进入细胞，异源DNA在cos粘末端的影响下发生环化。按照这种方式，可以将异源DNA的大区段导入宿主细胞并在其中表达。
用于得到铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸的其它方法包括：通过试验(例如顶空试验(参见例如，美国申请号12/335,071和PCT/US2008/086809，它们通过引用整体并入本文，尤其是关于实施例1和7中的异戊二烯生产的顶空试验))，或通过PCR(使用针对编码一定长度的保守氨基酸(例如，至少3个保守氨基酸)的核苷酸的引物)，筛选宏基因组文库。通过比对已知的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和/或IDI多肽的氨基酸序列，可以鉴别出保守氨基酸。基于已知的异戊二烯合酶多肽的比对的序列，可以鉴定异戊二烯合酶多肽的保守氨基酸。可以使天然产生异戊二烯的生物体经历标准的蛋白纯化方法(其是本领域熟知的)，并且可以使用标准方法测序得到的纯化的多肽。其它方法见文献(参见，例如，Julsing等人，Applied.Microbiol.Biotechnol.75：1377-84，2007；Withers等人，ApplEnviron Microbiol.73(19)：6277-83，2007，其通过引用整体并入本文，尤其是关于鉴定参与异戊二烯合成的核酸)。
另外，基于它们与已知的DXP途径多肽和核酸的初级和/或预测的多肽二级结构上的相似性，可以使用标准的序列比对和/或结构预测程序来鉴定另外的DXP途径多肽和核酸。也可以使用标准的数据库例如swissprot-trembl数据库(互联网网址为“expasy.org”，Swiss Institute ofBioinformatics Swiss-Prot group CMU-1 rue Michel Servet CH-1211Geneva 4，瑞士)来鉴定异戊二烯合酶、黄素氧还蛋白I、DXP途径和/或IDI多肽和核酸。使用标准结构预测程序例如PredictProtein(630West，168Street，BB217，New York，N.Y.10032，USA)的缺省设定，可以预测铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和/或IDI多肽的二级和/或三级结构。或者，可以使用标准方法确定铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和/或IDI多肽的真实的二级和/或三级结构。通过与产生于已知的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸的探针杂交，还可以鉴定另外的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸。
示例性的启动子和载体
本文描述的任意铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸可以包含于一个或多个载体中。因此，本发明还表征了含有编码本文描述的任意铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和/或IDI多肽的一个或多个核酸的载体。本文使用的“载体”是指能够递送并合乎需要地在宿主细胞中表达一种或多种目标核酸的构建体。载体的实例包括、但不限于：质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、粘粒和噬菌体载体。在一些实施方式中，所述载体包含处于表达控制序列控制下的核酸。
本文使用的“表达控制序列”是指指导目标核酸的转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子或增强子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节下有活性的启动子。表达控制序列可操作地连接至待转录的核酸区段上。
在一些实施方式中，载体含有选择性标志物。术语“选择性标志物”是指能够在宿主细胞中表达以允许容易地选择含有导入的核酸或载体的那些宿主细胞的核酸。选择性标志物的实例包括、但不限于：抗生素抗性核酸(例如，卡那霉素、氨苄西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势例如营养优势的核酸。示例性的营养选择性标志物包括本领域已知的那些标志物，例如amdS、argB和pyr4。在用于转化木霉菌属(Trichoderma)的载体系统中有用的标志物是本领域已知的(参见，例如，Finkelstein，Chapter 6 inBiotechnology of Filamentous Fungi，Finkelstein等人，Butterworth-Heinemann编，Boston，MA，Chap.6.，1992；和Kinghorn等人，Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi，Blackie Academicand Professional，Chapman and Hall，London，1992，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于选择性标志物)。在一些实施方式中，选择性标志物是amdS核酸，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞以乙酰胺作为氮源生长。构巢曲霉(A.nidulans)amdS核酸作为选择性标志物的应用，描述在Kelley等人，EMBO J.4：475-479，1985和Penttila等人，Gene 61：155-164，1987(它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于选择性标志物)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、黄素氧还蛋白I、DXP途径或IDI核酸整合进入无选择性标志物的细胞的染色体中。
合适的载体是与所用的宿主细胞相容的那些。合适的载体可以源自，例如，细菌、病毒(例如噬菌体T7或源自M-13的噬菌体)、粘粒、酵母、或植物。用于获得和使用此类载体的程序是本领域人员已知的(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor，1989，其通过引用整体并入本文，尤其是关于载体的使用)。
启动子是本领域熟知的。可以使用任意在宿主细胞中有作用的启动子，在宿主细胞中表达铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸。有多种起始控制区或启动子可用于驱动铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸在多种宿主细胞中的表达，并且是本领域技术人员熟知的(参见，例如，WO 2004/033646和其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于用于表达目标核酸的载体)。事实上任何能够驱动这些核酸的启动子都适合于本发明，包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO、和TPI(用于在酵母属中的表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中的表达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌中的表达)。
在一些实施方式中，使用葡萄糖异构酶启动子(参见，例如美国专利号7,132,527及其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于用于表达目标多肽的启动子和质粒系统)。报道的葡萄糖异构酶启动子突变体可用于改变与葡萄糖异构酶启动子可操作地连接的核酸编码的多肽的表达水平(美国专利号7,132,527)。在多个实施方式中，葡萄糖异构酶启动子包含于低拷贝、中等拷贝、或高拷贝质粒中(美国专利号7,132,527)。
在多个实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸包含于低拷贝质粒(例如，以约1至约4个拷贝/细胞维持的质粒)、中等拷贝质粒(例如，以约10至约15个拷贝/细胞维持的质粒)或高拷贝质粒(例如，以约50或更多个拷贝/细胞维持的质粒)中。在一些实施方式中，异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸可操作地连接至T7启动子。在一些实施方式中，可操作地连接至T7启动子的异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸包含于中等或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸可操作地连接至Trc启动子。在一些实施方式中，可操作地连接至Trc启动子的异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸包含于中等或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸可操作地连接至Lac启动子。在一些实施方式中，可操作地连接至Lac启动子的异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸包含于低拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸可操作地连接至内源性启动子，例如内源性埃希菌属、Panteoa属、芽孢杆菌属、耶氏酵母属、链霉菌属、木霉菌属或Thermosynechococcus启动子或内源性碱性丝氨酸蛋白酶铁硫簇-相互作用的氧化还原启动子、DXP途径启动子、DXP途径相关的启动子、异戊二烯合酶启动子或IDI启动子。在一些实施方式中，可操作地连接至内源性启动子的异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸包含于高拷贝质粒中。在一些实施方式中，载体是不整合到细胞的染色体中的复制质粒。在一些实施方式中，部分或全部载体整合进细胞的染色体中。
在一些实施方式中，载体是任意的这样的载体：当被导入真菌宿主细胞中时，整合进入宿主细胞基因组并且被复制。关于载体的列表，参见Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，互联网网址为“fgsc.net”以及其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于载体)。在下列文献中提供了合适的表达和/或整合载体的另外的实例：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989，Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人(编)1987，Supplement 30，section 7.7.18)；van den Hondel等人in Bennett and Lasure(编)More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press pp.396-428，1991；和美国专利号5,874,276，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于载体的内容。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100、和pENTR/D。
在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸可操作地连接至在真菌宿主细胞中显示出转录活性的适宜的启动子。启动子可以源自编码宿主细胞的内源性或异源性的多肽的一个或多个核酸。在一些实施方式中，启动子可用于木霉菌属宿主。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1和amy。在一些实施方式中，启动子是宿主细胞的天然启动子。例如，在一些实施方式中，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然里氏木霉启动子。在一些实施方式中，启动子是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子并保藏于GenBank，保藏号为D86235，其通过引用整体并入本文，尤其是关于启动子的内容。在一些实施方式中，启动子是真菌宿主细胞的异源的启动子。有用的启动子的其它实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)的基因的启动子(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBOJ.3：1581-1585，1984，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于启动子)；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1、和里氏木霉纤维二糖水解酶1的基因的启动子(EP 137280，其通过引用整体并入本文，尤其是关于启动子)。
在一些实施方式中，表达载体还包括终止序列。终止控制区也可以源自宿主细胞的多个天然基因。在一些实施方式中，终止序列和启动子序列源自相同的来源。在另一个实施方式中，终止序列是宿主细胞内源性的。特别适宜的终止子序列是源自木霉菌株(例如里氏木霉)的cbh1。其它有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶核酸的终止子(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984；它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于真菌终止子)。任选地，可以包括终止位点。为了有效表达多肽，使编码多肽的DNA通过起始密码子可操作地连接至选择的表达控制区，从而表达引起形成合适的信使RNA。
在一些实施方式中，启动子、编码区和终止子全部来自待表达的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸。在一些实施方式中，将铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的编码区插入一般目的表达载体中，从而使其处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，将基因或其一部分插入至强cbh1启动子的下游。
使用标准技术(Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，1982，其通过引用整体并入本文，尤其是关于筛选合适的DNA序列和构建载体)，可以将铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸掺入到载体例如表达载体中。用于连接包含目标核酸(例如铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸)、启动子、终止子、和其它序列的DNA构建体以及用于将它们插入合适的载体中的方法是本领域熟知的。例如，限制性酶可用于切割铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸和载体。然后，可以连接经切割的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸和经切割的载体的相容性末端。一般通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(参见，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989，以及Bennett和Lasure，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego，第70-76页，1991，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于寡核苷酸接头)。另外，可以使用已知的重组技术构建载体(例如，Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)。
在一些实施方式中，可能需要以远高于天然存在的细胞中目前存在的水平过表达铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸。可以通过将编码那些多肽的核酸选择性克隆进入多拷贝质粒或将那些核酸置于强可诱导或组成型启动子下来实现该结果。用于过表达需要的多肽的方法是分子生物学领域常见的和熟知的，实例可以见Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用整体并入本文，尤其是关于克隆技术的内容。
以下资源包括用于本发明的另外的一般性方法的描述：Kreigler，GeneTransfer and Expression；A Laboratory Manual，1990和Ausubel等人，Eds.Current Protocols in Molecular Biology，1994，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于分子生物学和克隆技术的内容。
示例性的来源生物体
从任何天然包含铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸的生物体，可以获得铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸(及其编码的多肽)。如上所述，有多种生物体天然地形成异戊二烯，例如细菌、真菌、植物、和动物。生物体包含用于产生异戊二烯的MVA途径、DXP途径、或MVA与DXP途径二者(图19A)。因此，可以获得DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR核酸，例如，从包含DXP途径或含有MVA与DXP途径二者的任意生物体获得。可以从例如包含MVA途径、DXP途径或MVA与DXP途径二者的任意生物体，获得IDI和异戊二烯合酶核酸。
在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的核酸序列与通过下列任意生物体天然产生的核酸的序列相同。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的氨基酸序列与通过下列任意生物体天然产生的多肽的序列相同。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸或它编码的多肽是源自本文描述的任意生物体的突变体核酸或多肽。本文使用的“源自”是指核酸或多肽的来源，所述核酸或多肽中导入了一个或多个突变。例如，“源自植物多肽”的多肽是指由于向野生型(即天然存在的序列)植物多肽的序列中导入了一个或多个突变而产生的目标多肽。
在一些实施方式中，来源生物体是真菌，其实例有：曲霉属的物种，例如米曲霉和黑曲霉；酵母属的物种，例如酿酒酵母；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；以及木霉属的物种，例如里氏木霉。在一些实施方式中，来源生物体是丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”是指真菌亚门中的所有的丝状形式(参见，Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York)。这些真菌的特征在于营养菌丝体，其具有由壳多糖、纤维素、和其它复合多糖组成的细胞壁。丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母菌不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延长，碳分解代谢是专有性好氧的。丝状真菌亲代细胞可以是下列种的细胞但不限于此：木霉属(例如，里氏木霉，红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的无性型，之前被分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，绿色木霉(Trichoderma viride)，康氏木霉(Trichoderma koningii)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)(Sheir-Neirs等人，Appl.Microbiol.Biotechnol 20：46-53，1984；ATCC No.56765和ATCC No.26921)；青霉属(Penicilliumsp.)，腐质霉属(Humicola sp.)(例如，特异腐质霉(H.insolens)、H.lanuginose、或灰色腐质霉(H.grisea))；金孢属(Chrysosporium sp.)(例如，C.lucknowense)、粘帚霉(Gliocladium sp.)，曲霉属(例如，米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)，构巢曲霉，或泡盛曲霉)(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：7380743，1993和Goedegebuur等人，Genet 41：89-98，2002)，镰菌属(Fusarium sp.)(例如，粉红镰刀菌(F.roseum)、禾谷镰刀菌(F.graminum)、F.cerealis、尖孢镰刀菌(F.oxysporuim)、或F.venenatum)，脉孢霉属(Neurospora sp.)(例如，粗糙脉胞菌(N.crassa)，肉座菌属(Hypocrea sp.)，毛霉菌属(Mucor sp.)(例如，米黑毛霉菌(M.miehei)，根霉属(Rhizopus sp.)，和裸胞壳属(Emericella sp.)(另外见，Innis等，Sci.228：21-26，1985)。术语“木霉菌”或“木霉菌属(Trichoderma sp.)”或“木霉菌(Trichoderma spp.)”是指之前或目前被分类为木霉菌的任意真菌属。
在一些实施方式中，真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌、或茄镰孢(F.solani)。曲霉菌菌株公开于Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743，1993和Goedegebuur等人，Curr Gene 41：89-98，2002，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于真菌的内容。在具体的实施方式中，真菌是木霉的菌株，例如里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的，其非限制性实例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767、和NRRL 15709，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于里氏木霉的菌株的内容。在一些实施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等，Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53，1984，其通过引用整体并入本文，尤其是关于里氏木霉的菌株的内容。
在一些实施方式中，来源生物体是酵母，例如酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、或假丝酵母属(Candida sp)。
在一些实施方式中，来源生物体是细菌，例如芽孢杆菌属的菌株，例如地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)或枯草芽孢杆菌；泛菌属的菌株，例如柠檬泛菌；假单胞菌的菌株，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)；链霉菌属的菌株，例如浅青紫链霉菌(S.lividans)或锈棕色链霉菌(S.rubiginosus)；Thermosynechococcus的菌株，例如T.elongatus；中华根瘤菌属的菌株，例如苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)；螺杆菌属的菌株，例如幽门螺杆菌(H.pylori)；土壤杆菌属的菌株，例如根癌土壤杆菌(根癌土壤杆菌)；异常球菌属的菌株，例如耐辐射球菌(D.radiodurans)，利斯特菌属的菌株，例如单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)；乳杆菌属的菌株，例如L.spp；或埃希菌属的菌株，例如大肠杆菌。
本文使用的“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的落在芽孢杆菌属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、B.lautus和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。认识到：芽孢杆菌属仍然会持续进行分类学上的改组。因此，该属意在包括被重新分类的物种，包括但不限于这样的生物体，例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，其现在被称作“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”。在存在氧的条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义特征，虽然该特征也适用于最近被命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素杆菌属(Aneurinibacillus)、无氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在一些实施方式中，来源生物体是革兰氏阳性细菌。非限制性实例包括下述属的菌株：链霉菌属(例如，浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌(天蓝色链霉菌)、或灰色链霉菌(S.griseus))、芽孢杆菌属、利斯特菌属(例如，单核细胞增生利斯特菌)或乳杆菌属(例如，L.spp)。在一些实施方式中，来源生物体是革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌，假单胞菌属，或幽门螺杆菌。
在一些实施方式中，来源生物体是植物，例如来自豆科的植物，例如蝶型花亚科。在一些实施方式中，来源生物体是野葛、白杨(例如银白杨x欧洲山杨CAC35696)、白杨(例如美洲山杨)、夏栎、拟南芥属(例如拟南芥)或玉蜀黍属(例如玉米)。
在一些实施方式中，来源生物体是藻类，例如绿藻、红藻、灰胞藻(glaucophyte)、chlorarachniophytes、眼虫、假菌界(Chromista)、或腰鞭毛虫(dinoflagellates)。
在一些实施方式中，来源生物体是蓝细菌，例如基于形态分类为下列组的蓝细菌：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)、或真枝藻目(Stigonematales)。在一些实施方式中，蓝细菌是Thermosynechococcus elongates。
示例性的宿主细胞
多种宿主细胞可用于要求保护的发明的方法中表达铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、MVA途径多肽、MVA途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽并生产异戊二烯。示例性的宿主细胞包括来自标题为“示例性的来源生物体”的前一部分中所列的任意生物体的细胞。宿主细胞可以是天然产生异戊二烯的细胞，或者是不天然产生异戊二烯的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP途径天然产生异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶和一种或多种DXP途径多肽和铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽，以增加通过该途径产生的异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP途径天然产生异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶和一种或多种DXP途径核酸、一种或多种铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸和IDI，以增加通过该途径产生的异戊二烯。
示例性的转化方法
使用标准技术，可以将铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸或包含它们的载体插入宿主细胞(例如本文描述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)中，以表达所编码的编码的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和/或IDI多肽。使用下列技术，可以将DNA构建体或载体导入宿主细胞中：例如，转化、电穿孔、细胞核显微注射、转导、转染(例如脂转染介导的或DEAE-糊精介导的转染，或使用重组噬菌体病毒的转染)、与磷酸钙DNA沉淀物一起温育、以DNA包被的微粒高速轰击和原生质体融合。一般性的转化技术是本领域已知的(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人(编)Chapter 9，1987；Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989；和Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法)。在木霉中表达异源多肽的描述见美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；美国专利号7,262,041；WO 2005/001036；Harkki等人，Enzyme Microb.Technol.13：227-233，1991；Harkki等人，Bio Technol.7：596-603，1989；EP 244,234；EP 215,594；和Nevalainen等人，“TheMolecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression ofBoth Homologous and Heterologous Genes，”见Molecular IndustrialMycology，Eds.Leong and Berka，Marcel Dekker Inc.，NY pp.129-148，1992，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于转化和表达方法)。对于曲霉菌株的转化，还参考了Cao等人，(Sci.9：991-1001，2000；EP 238023；和Yelton等人，Proceedings.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，1984(它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法)。导入的核酸可以整合进入染色体DNA或者可以维持为染色体外的复制序列。
可以使用本领域已知的任意方法来选择转化体。在一个非限制性实例中，包含amdS标志物的稳定转化体与不稳定转化体通过下列区分开：在含有乙酰胺的固体培养基上更快的生长速率和形成具有平滑而非不整齐的轮廓圆形菌落。另外，在一些情况下，通过下列进行进一步的稳定性测试：在固体非选择性培养基(例如不含乙酰胺的培养基)上生长转化体，从该培养基收集孢子，和检测随后在含有乙酰胺的选择性培养基上萌芽并生长的这些孢子的百分比。
在一些实施方式中，通过涉及原生质体形成和原生质体转化、然后通过已知方式再生细胞壁的方法转化真菌细胞。在一个具体的实施方式中，制备用于转化的木霉属包括：从真菌菌丝体制备原生质体(参见，Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法)。在一些实施方式中，从萌芽的营养孢子获得菌丝体。以消化细胞壁的酶处理菌丝体，从而产生原生质体。然后通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。这些稳定剂的通常的浓度是0.8M-1.2M。在悬浮培养基中使用约1.2M的山梨醇溶液是合乎需要的。
宿主木霉属的菌株对DNA的摄取依赖于钙离子的浓度。一般而言，在摄取溶液中使用约10mM CaCl2至50mM CaCl2。除了摄取溶液中的钙离子之外，一般包括的其它化合物是：缓冲系统，例如TE缓冲液(10MmTris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。不被任何特定理论所限，相信聚乙二醇的作用是融合细胞膜，因此允许培养基的内容物被递送至木霉属菌株的细胞质并使质粒DNA转移至细胞核。这种融合通常允许多个拷贝的质粒DNA整合进入宿主染色体。
通常在转化中使用含有密度为105至107/mL(例如2x 106/mL)的已经过渗透性处理的木霉属原生质体或细胞的悬浮液。将体积为100μL的这些原生质体或细胞(在合适的溶液中，例如，1.2M山梨醇和50mM CaCl2)与需要的DNA混合。一般而言，向摄取溶液中加入高浓度的PEG。可以向原生质体悬浮液中加入0.1-1体积的25％PEG 4000。在一些实施方式中，向原生质体悬浮液中加入约0.25体积。也可以向摄取溶液中加入添加剂，例如二甲基亚砜、肝素、精脒，氯化钾等并辅助转化。用于其它真菌宿主细胞的类似程序是可以获得的(参见，例如，美国专利号6,022,725和6,268,328，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法)。
一般而言，然后将混合物在约0℃培养10-30分钟的时间段。然后向混合物中加入另外的PEG以进一步增加需要的核酸序列的摄取。一般加入转化混合物体积的5-15倍体积的25％PEG 4000；然而，更大和更小体积可以是合适的。转化混合物体积的约10倍的25％PEG 4000是合乎需要的。加入PEG之后，然后在室温或在冰上培养转化混合物，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后将原生质体悬浮液加入到生长培养基的熔化的等份中。当生长培养基包括生长选择剂(例如，乙酰胺或抗生素)时，其仅允许转化体生长。
可以根据常规方法进行细菌细胞的转化，所述常规方法例如描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，1982的方法，其通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法的内容。
示例性的细胞培养基
本发明还包括生产异戊二烯的细胞或培养的细胞群体。“培养的细胞”是指在允许细胞进行一次或多次细胞分裂的溶液(例如细胞培养基)中的两个或更多个细胞。“培养的细胞”不包括这样的植物细胞：其是包含已经分化为植物组织的细胞的活的多细胞植物的一部分。在多个实施方式中，细胞培养物包含至少或约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000或更多个细胞。
可以使用任意碳源来培养宿主细胞。术语“碳源”是指能够被宿主细胞或生物体代谢的一种或多种含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可以包含适合于维持宿主细胞存活或生长的任意碳源。
在一些实施方式中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖、或多糖)、转化糖(例如，酶处理的蔗糖糖浆)、丙三醇、甘油(例如，生产生物柴油或肥皂的工艺的甘油副产物)、二羟基丙酮、一碳源、油(例如，植物油或菜油，例如玉米油、棕榈油、或大豆油)、动物脂肪、动物油、脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、可再生碳源(例如，生物质碳源，例如水解的生物质碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇、或前述中的两项或多项的任意组合。在一些实施方式中，碳源是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。
示例性的单糖包括葡萄糖和果糖；示例性的寡糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纤维素。示例性的碳水化合物包括C6糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(例如，木糖或阿拉伯糖)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及除了碳水化合物之外的碳源(例如，丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、或来自酵母提取物的成分)。在一些实施方式中，细胞培养基包含碳水化合物以及多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施方式中，微生物多肽是来自酵母或细菌的多肽。在一些实施方式中，植物多肽是来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁。
在一些实施方式中，碳水化合物的浓度是至少或约5g/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的浓度是约50至约400g/L，例如约100至约360g/L，约120至约360g/L，或约200至约300g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的碳水化合物的总量。
在一些实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞。“限葡萄糖的条件”是指加入的葡萄糖的量小于或等于细胞消耗的葡萄糖的量的约105％(例如约100％)。在具体的实施方式中，加入到培养基中的葡萄糖的量约等于特定时间段期间细胞消耗的葡萄糖的量。在一些实施方式中，通过限制加入的葡萄糖的量来控制细胞生长速率，从而细胞在可以被细胞培养基中的葡萄糖的量支持的速率生长。在一些实施方式中，在细胞培养的时间期间，葡萄糖不积累。在多个实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞超过或等于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、或70个小时。在多个实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞超过或等于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的总细胞培养时间长度。不被任何特定理论所限，相信限葡萄糖的条件可以允许更有利的细胞调节。
在一些实施方式中，在存在过量葡萄糖的条件下培养细胞。在具体的实施方式中，加入的葡萄糖的量大于约105％(例如约或大于110％、120％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％)或更高的细胞在特定时间段期间消耗的葡萄糖的量。在一些实施方式中，在细胞培养时间过程中葡萄糖积累。
示例性的脂质是包含一种或多种C4和以上脂肪酸的脂肪酸的任意物质，所述脂肪酸可以是饱和、不饱和、或分支的。
示例性的油是在室温为液态的脂质。在一些实施方式中，脂质包含一种或多种C4或以上的脂肪酸(例如包含一种或多种具有4个或更多个碳的饱和的、不饱和的、或分支的脂肪酸)。在一些实施方式中，油获自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻仁、油质微生物细胞、乌桕、或前述两项或更多项的任意组合。
示例性的脂肪酸包括式RCOOH的化合物，其中“R”是烃。示例性的不饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”包括至少一个碳-碳双键。示例性的不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、异油酸、亚油酸、棕榈油酸、和花生四烯酸。示例性的多不饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”包括多个碳-碳双键。示例性的饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”是饱和的脂肪族基团。在一些实施方式中，碳源包括一种或多种C12-C22脂肪酸，例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸、或C22饱和脂肪酸。在示例性的实施方式中，脂肪酸是棕榈酸。在一些实施方式中，碳源是脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物、或脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物的盐。合适的盐包括但不限于：锂盐、钾盐、钠盐等。甘油二酯和甘油三酯是甘油的脂肪酸酯。
在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的浓度是至少或约1g/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的浓度是约10至约400g/L，例如约25至约300g/L，约60至约180g/L，或约75至约150g/L。在一些实施方式中，该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的总量。在一些实施方式中，碳源包括(1)脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯和(ii)碳水化合物，例如葡萄糖。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯与碳水化合物的比是约1∶1(基于碳)(即，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯中的一个碳/碳水化合物的碳)。在具体的实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的量是约60至180g/L，并且碳水化合物的量是约120至360g/L。
示例性的微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。示例性的植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。
示例性的可再生的碳源包括干酪乳清渗透物、玉米浸液、甜菜糖蜜、大麦芽、和来自前述任意项的成分。示例性的可再生碳源还包括存在于生物质中的葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，所述生物质例如玉米、柳枝稷、甘蔗、发酵过程的细胞废物，以及来自大豆、玉米、或小麦的研磨的蛋白副产物。在一些实施方式中，生物质碳源是木质纤维素、半纤维素、或纤维质材料，例如但不限于草、小麦、麦秸、甘蔗渣、甘蔗渣、软木浆、玉米、玉米芯或稻壳、玉米仁、来自玉米仁的纤维、玉米秸秆、柳枝稷、稻壳产物、或从谷物(如玉米、高粱、黑麦、triticate、大麦、小麦和/或蒸馏谷物)的湿或干研磨生产的副产物。示例性的纤维质材料包括木材、纸和浆废液、草本植物、及果肉。在一些实施方式中，碳源包括任意植物部分，如茎、谷粒、根、或块茎。在一些实施方式中，任意以下植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、黑麦、高粱、triticate、水稻、粟、大麦、木薯、豆类如大豆和豌豆、马铃薯、蕃薯、香蕉、甘蔗、和/或木薯。在一些实施方式中，碳源是生物质水解物，如包含木糖和葡萄糖或包含蔗糖和葡萄糖的生物质水解物。
在一些实施方式中，在添加到细胞培养基中之前预处理可再生碳源(例如生物质)。在一些实施方式中，预处理包括酶预处理、化学预处理、或酶和化学预处理的组合(参见，例如，Farzaneh等人，Bioresource Technology96(18)：2014-2018，2005；美国专利号6,176,176；美国专利号6,106,888；其通过引用整体并入本文，尤其是关于可再生碳源的预处理)。在一些实施方式中，在添加到细胞培养基之前，将可再生碳源部分或全部水解。
在一些实施方式中，在添加到细胞培养基之前，可再生碳源(例如玉米秸秆)经历氨气爆破法(AFEX)预处理(参见，例如，Farzaneh等人，Bioresource Technology 96(18)：2014-2018，2005)。在AFEX预处理过程中，在中等温度(例如约60℃至约100℃)和高压(例如约250psi至约300psi)以液态无水氨将可再生碳源处理约5分钟。然后，迅速释放压力。在该过程中，木质素溶解、半纤维素水解、纤维素的解晶作用和增加的表面积的化学和物理的组合效应使得纤维素和半纤维素几乎能够完全酶促转化为可发酵的糖。AFEX预处理具有以下优点：几乎所有的氨都可以被回收和再利用，剩余的则作为下游过程中的微生物的氮源。另外，AFEX预处理无需洗涤流。因此，AFEX处理之后的干物质回收基本上是100％。AFEX基本上是干—干的过程。经处理的可再生碳源在长时间内是稳定的，并且可以以非常高的固体载量进料到酶促水解或发酵过程中。纤维素和半纤维素在AFEX过程中被良好保存，甚少降解或无降解。对于经历了AFEX预处理的可再生碳源而言，在酶促水解之前，无需中和。AFEX处理的碳源的酶促水解为随后的发酵用途产生清洁的糖流。
在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度是至少或约0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％葡萄糖(w/v)。可以通过使用标准的HPLC方法，使用葡萄糖作为参照物来测定葡萄糖的当量，以测定从碳源生产的葡萄糖的量。在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于约0.1％至约20％葡萄糖，例如约0.1％至约10％葡萄糖，约0.5％至约10％葡萄糖，约1％至约10％葡萄糖，约1％至约5％葡萄糖，或约1％至约2％葡萄糖。
在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种成分。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是至少1克酵母提取物/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、或更多g/L。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是约1至约300g/L，例如约1至约200g/L，约5至约200g/L，约5至约100g/L，或约5至约60g/L。在一些实施方式中，该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的酵母提取物的总量。在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物(或其一种或多种成分)和另一种碳源，例如葡萄糖。在一些实施方式中，酵母提取物与其它碳源的比例是约1∶5，约1∶10，或1∶20(w/w)。
另外，碳源也可以是一碳底物，例如二氧化碳或甲醇。已经报道了在甲基营养酵母(Yamada等人，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543，1989，其通过引用整体并入本文，尤其是关于碳源)和细菌(Hunter等人，Biochemistry，24，4148-4155，1985，其通过引用整体并入本文，尤其是关于碳源)从单一碳源(例如，甲醇、甲醛、或甲酸)生产甘油。这些生物体可以同化单一碳化合物：从甲烷氧化态至甲酸，并且生产甘油。碳同化的途径可以经由核酮糖一磷酸、经由丝氨酸或经由木酮糖一磷酸(Gottschalk，Bacterial  Metabolism，第2版，Springer-Verlag：New York，1986，其通过引用整体并入本文，尤其是关于碳源)。核酮糖一磷酸途径包括甲酸与核酮糖-5-磷酸缩合以形成6碳糖，该6碳糖变为果糖，并最终变为3碳产物甘油醛-3-磷酸。类似地，丝氨酸途径使一碳化合物通过亚甲基四氢叶酸同化进入糖酵解途径。
除了一碳和二碳底物，还已知甲基营养生物体利用多种其它含碳化合物，例如甲胺、葡萄糖胺和多种氨基酸以用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]，第7版，415-32.Editors：Murrell等人，Publisher：Intercept，Andover，UK，1993，其通过引用整体并入本文，尤其是关于碳源)。类似地，假丝酵母属的多个种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153(5)，485-9，1990，其通过引用整体并入本文，尤其是关于碳源)。
在一些实施方式中，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(参见，例如，Pourquie，J.等人，Biochemistry and Genetics of CelluloseDegradation，eds.Aubert等人，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen等人，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于细胞培养基)。示例性的生长培养基是通常商业上制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)培养基，Sabouraud Dextrose(SD)培养基，或酵母培养基(YM)肉汤。也可以使用其它的确定的或合成的生长培养基，用于特定宿主细胞的生长的合适的培养基是微生物或发酵科学领域技术人员已知的。
除了合适的碳源之外，细胞培养基合乎需要地包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、和本领域技术人员已知的适合于培养物生长或增加异戊二烯产量的其它成分(参见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，以及WO 96/35796及其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于细胞培养基和细胞培养条件)。在一些异戊二烯合酶核酸、铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸或IDI核酸处于诱导型启动子控制下的实施方式中，以有效诱导异戊二烯合酶多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽或IDI多肽的表达的浓度，向培养基中合乎需要地加入诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)。在一些实施方式中，细胞培养基具有对应于载体(其具有一种或多种异戊二烯合酶核酸、铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸或IDI核酸)上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性核酸)的抗生素(例如卡那霉素)。
示例性的细胞培养条件
适合于维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域熟知的。示例性的技术可以见Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt等人，eds)，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1994)或Brockin Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于细胞培养技术的内容。在一些实施方式中，在允许表达由插入宿主细胞内的核酸编码的一种或多种异戊二烯合酶多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽或IDI多肽的条件下，在培养基中培养细胞。
可以使用标准的细胞培养条件来培养细胞(参见，例如，WO2004/033646及其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于细胞培养物和发酵条件)。细胞生长并维持于合适的温度、气体混合物、和pH下(例如约20℃至约37℃，在约6％至约84％CO2中，以及在约5至约9的pH下)。在一些实施方式中，细胞在35℃生长于合适的细胞培养基中。在一些实施方式中，例如，在约28℃在合适的培养基中在振荡培养物或发酵罐中培养，直至达到所需要的量的异戊二烯生产。在一些实施方式中，用于发酵的pH范围是约pH 5.0至约pH 9.0(例如约pH 6.0至约pH 8.0，或约6.5至约7.0)。可以基于宿主细胞的需要，在有氧、缺氧或无氧条件下进行反应。用于给定的丝状真菌的示例性培养条件是本领域已知的，可以查阅科学文献和/或从真菌来源处获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)和真菌遗传物质保藏中心(Fungal Genetics Stock Center)。
在多个实施方式中，使用任意已知的发酵模式使细胞生长，例如批式、补料分批、或连续方法。在一些实施方式中，使用批式发酵方法。经典的批式发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的成分，并且在发酵过程中不进行人为改变。因此，在发酵开始时，将需要的宿主细胞接种于细胞培养基，进行发酵，但不向系统中加入任何物质。然而，通常来讲，“批式”发酵是就加入碳源的批而言的，通常会尝试控制因素，例如pH和氧浓度。在批式系统中，系统的代谢物和生物质组成一直在变化，直至发酵停止时。在批式培养物中，细胞经过静止的停滞期进入高速生长对数期，最终到达稳定期，在稳定期生长速率下降或停止。在一些实施方式中，处于对数期的细胞负责大量生产异戊二烯。在一些实施方式中，处于稳定期的细胞生产异戊二烯。
在一些实施方式中，使用标准的批式系统的变体，例如补料分批系统。补料分批发酵方法包括典型的批式系统，只不过随着发酵的进程以增量添加碳源。当分解代谢产物抑制倾向于抑制细胞的代谢并且需要在细胞培养基中具有有限量的碳源时，补料分批系统是有用的。可以使用有限或过量的碳源(例如葡萄糖)进行补料分批发酵。补料分批系统中的实际的碳源浓度是难以测定的，因此根据可测因素例如pH、溶解氧、和废气例如CO2的分压的变化来估计。批式和补料分批发酵是常见的并且是本领域熟知的，其实例可以见Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，其通过引用整体并入本文，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。
在一些实施方式中，使用连续发酵方法。连续发酵是开放的系统，其中连续向生物反应器中添加确定的发酵培养基，并且同时取出等量的条件化培养基以进行处理。连续发酵一般将培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。
连续发酵允许调节影响细胞生长或异戊二烯生产的一个因素或任意数目的因素。例如，一种方法将限制性营养物例如碳源或氮水平维持在固定的速率，并允许所有其它参数适度。在其它系统中，可以持续改变影响生长的多个因素，同时保持细胞浓度恒定(例如通过培养基浊度测定的浓度)。连续系统努力维持稳定状态的生长状况。因此，由于培养基排出而损失的细胞针对发酵物中的生长速率达到平衡。调节用于连续发酵方法的营养物和生长因素的方法和用于使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域熟知的，多种方法描述于Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial  Microbiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，其通过引用整体并入本文，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。
在一些实施方式中，细胞固定于基底上作为整个细胞催化剂并经历发酵条件以生产异戊二烯。
在一些实施方式中，将液体培养物的瓶置于振荡器上以将氧导入液体中并维持培养物的均一性。在一些实施方式中，使用温育器控制温度、湿度、振荡速度、和/或培养物生长的其它条件。最简单的温育器是具有可调节的加热器(通常最高至～65℃)的隔离箱。更精致的温育器还包括降低温度(通过致冷)的能力，或控制湿度或CO2水平的能力。多数温育器包括计时器；一些还可以程序化以在不同的温度、湿度水平等之间循环。温育器的尺寸可以是各种各样的，从台式到小型房间大小的单位。
如果需要，可以改变一部分或全部的细胞培养基以补充营养物和/或避免积累潜在有害的代谢副产物和死亡的细胞。在悬浮培养物的情况下，可以通过离心或过滤悬浮培养物而从培养基中分离细胞，然后将细胞重悬于新鲜的培养基中。在贴壁培养的情况下，可以通过吸液而直接去掉培养基并更换。在一些实施方式中，细胞培养基允许细胞中的至少一部分在连续培养物(例如未稀释的连续培养物)中分裂以进行至少或约5、10、20、40、50、60、65或更多次细胞分裂。
在一些实施方式中，使用组成型或渗漏启动子(例如Trc启动子)，不添加用于诱导与启动子可操作地连接的异戊二烯合酶核酸、铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸或IDI核酸的表达的化合物(例如IPTG)。在一些实施方式中，添加化合物(例如IPTG)以诱导与启动子可操作地连接的异戊二烯合酶核酸、铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸或IDI核酸的表达。
用于使异戊二烯生产与细胞生长解除偶联的示例性方法
除了别的以外，本发明提供了用于增加培养的细胞的异戊二烯生产的组合物和方法。当使用原料时，合乎需要地，来自原料的碳被转化为异戊二烯，而非转化为细胞的生长和维持。在一些实施方式中，细胞生长至低至中等的OD600，然后开始或增大异戊二烯的生产。该策略允许将大部分的碳转化为异戊二烯。
在一些实施方式中，细胞达到的光密度使得它们不再分裂或分裂极为缓慢，但是持续数小时地产生异戊二烯(例如约2、4、6、8、10、15、20、25、30、或更多个小时)。在一些情况中，550nm处的光密度随时间下降(例如，由于细胞裂解而使细胞不再处于对数生长期之后光密度的下降)，并且细胞持续生产大量异戊二烯。在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或约5、10、15、20、25、30、40、50、或60个小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或约50％(例如，小于或约40％、30％、20％、10％、5％或0％)，并且在该时间段期间，细胞生产的异戊二烯是大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(nmole/gwcm/hr)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约2至约5,000nmole/gwcm/hr，例如约2至约100nmole/gwcm/hr，约100至约500nmole/gwcm/hr，约150至约500nmole/gwcm/hr，约500至约1,000nmole/gwcm/hr，约1,000至约2,000nmole/gwcm/hr，或约2,000至约5,000nmole/gwcm/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约20至约5,000nmole/gwcm/hr，约100至约5,000nmole/gwcm/hr，约200至约2,000nmole/gwcm/hr，约200至约1,000nmole/gwcm/hr，约300至约1,000hmole/gwcm/hr，或约400至约1,000nmole/gwcm/hr。
在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或约5、10、15、20、25、30、40、50或60个小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或约50％(例如，小于或约40％、30％、20％、10％、5％或0％)，并且在该时间段期间，细胞生产的异戊二烯的累积效价(总量)是大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约2至约5,000mg/L培养液，例如约2至约100mg/L培养液，约100至约500mg/L培养 液，约500至约1,000mg/L培养液，约1,000至约2,000mg/L培养液，或约2,000至约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约20至约5,000mg/L培养液，约100至约5,000mg/L培养液，约200至约2,000mg/L培养液，约200至约1,000mg/L培养液，约300至约1,000mg/L培养液，或约400至约1,000mg/L培养液。
在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或约5、10、15、20、25、30、40、50或60小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或约50％(例如，小于或约40％、30％、20％、10％、5％或0％)，并且在该时间段期间，细胞将大于或约0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％或8.0％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分比是例如约0.002％至约4.0％，约0.002％至约3.0％，约0.002％至约2.0％，约0.002％至约1.6％，约0.002％至约0.005％，约0.005％至约0.01％，约0.01％至约0.05％，约0.05％至约0.15％，0.15％至约0.2％，约0.2％至约0.3％，约0.3％至约0.5％，约0.5％至约0.8％，约0.8％至约1.0％，或约1.0％至约1.6％。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分比是约0.002％至约0.4％，0.002％至约0.16％，0.04％至约0.16％，约0.005％至约0.3％，约0.01％至约0.3％，或约0.05％至约0.3％。
在一些实施方式中，仅在稳定期生产异戊二烯。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都生产异戊二烯。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或约生长期期间相同时间长度生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。在多个实施方式中，细胞在稳定期生产的异戊二烯大于或约是所生产的异戊二烯总量(例如在发酵过程的一定的时间例如20小时生产的异戊二烯)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高。在多个实施方式中，细胞分裂缓慢或完全不分裂以致于细胞在550nm处的光密度增加小于或约是50％(例如小于或约40％、30％、20％、10％、5％或0％)时生产的异戊二烯大于或约是所生产的异戊二烯总量(例如在发酵过程的一定的时间例如20小时生产的异戊二烯)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高。在一些实施方式中，仅在生长期生产异戊二烯。
在一些实施方式中，将一种或多种异戊二烯合酶核酸、铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸和/或IDI核酸置于在稳定期比在生长期具有更高活性的启动子或因子的控制下。例如，可以将一种或多种异戊二烯合酶核酸、铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸和/或IDI核酸置于稳定期∑因子(例如RpoS)的控制下。在一些实施方式中，将一种或多种异戊二烯合酶核酸、铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸和/或IDI核酸置于在稳定期可诱导的启动子(例如可以被在稳定期有活性的应答调节物诱导的启动子)控制下。
在安全操作范围内生产异戊二烯
除了别的以外，本发明提供了用于增加培养的细胞的异戊二烯生产的组合物和方法。根据其可燃性特征在安全操作水平内生产异戊二烯简化了商业设施的设计和构建，极大地改进了安全操作的能力，并限制了起火的潜在可能。具体地，生产异戊二烯的最佳范围在安全区内，即在异戊二烯浓度的非可燃范围内。在一个这样的方面，本发明表征了用于在异戊二烯浓度的非可燃范围内(在异戊二烯的可燃性包迹之外)生产异戊二烯的方法。
因此，使用了计算机模拟和实验测试来确定异戊二烯(例如在存在O2、N2、CO2、或上述气体中的两种或更多种的任意组合存在时的异戊二烯)的可燃极限，以确保操作的安全性。可燃性包迹的特征在于燃烧下限(LFL)、燃烧上限(UFL)、极限氧浓度(LOC)、和极限压力。对于可燃的系统而言，必须在存在最少量的氧化剂(通常是氧)的情况下有最少量的燃料(例如异戊二烯)。LFL是使燃烧持续所需的最少量的异戊二烯，而UFL是可以存在的最大量的异戊二烯。在该极限之上，混合物富含燃料并且氧的级分太低以致于不能形成可燃混合物。LOC表示形成可燃混合物还需要存在的氧的最小级分。极限温度基于异戊二烯的闪点，其是异戊二烯的燃烧可以传播的最低温度。这些限值对于异戊二烯的浓度、氧化剂的类型和浓度、系统中存在的惰性物、系统的温度和压力是特异性的。在可燃性包迹极限内的成分会使燃烧传播并需要加工设备的设计和操作上的另外的安全考虑。
使用计算机模拟和数学分析和实验测试检测了如下条件。如果需要，可以使用本文描述的方法测试其它条件(例如其它温度、压力、和永久气体成分)以测定LFL、UFL和LOC浓度。
(1)计算机模拟和数学分析
测试组1：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
测试组2：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
以水饱和
测试组3：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
CO2：5wt％-30wt％
(2)用于最终测定可燃极限的实验测试
测试组1：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
测试组2：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
以水饱和
使用模拟软件以产生数种不同测试条件下的系统的可燃特性的估计。CO2没有显示出对于系统的可燃极限的显著性影响。通过实验测试确认了测试组1和2。模拟结果与实验测试结果是一致的。在加入水的情况下仅发现有少许差异。
在40℃和1个大气压下，异戊二烯、O2、N2、和CO2混合物的LOC经测定是9.5vol％。加入高达30％的CO2未对异戊二烯、O2、和N2混合物的可燃特性造成显著影响。在干燥的和水饱和的异戊二烯、O2、和N2系统之间仅显示出少许可燃特性上的差异。极限温度是约-54℃。低于约-54℃的温度太低以致于不能使异戊二烯的燃烧传播。
在一些实施方式中，异戊二烯的LFL范围为约1.5vol.％至约2.0vol％，异戊二烯的UFL范围为约2.0vol.％至约12.0vol.％，这取决于系统中氧的量。在一些实施方式中，LOC是约9.5vol％氧。在一些实施方式中，异戊二烯的LFL是约1.5vol.％至约2.0vol％，异戊二烯的UFL是约2.0vol.％至约12.0vol.％，当温度是约25℃至约55℃(例如约40℃)并且压力是约1个大气压至3个大气压时，LOC是约9.5vol％氧。
在一些实施方式中，在存在小于约9.5vol％氧(即，低于形成异戊二烯的可燃化合物所需的LOC)的情况下生产异戊二烯。在存在大于或约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯的浓度低于LFL(例如低于约1.5vol.％)。例如，可以通过以惰性气体稀释异戊二烯成分(例如，通过持续或周期性加入惰性气体，例如氮气，以保持异戊二烯成分低于LFL)而将异戊二烯的量保持在低于LFL。在存在大于或约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯的浓度高于UFL(例如高于约12vol.％)。例如，可以通过使用以高于UFL的浓度生产异戊二烯的系统(例如本文描述的任意细胞培养系统)将异戊二烯的量保持高于UFL。如果需要，可以使用相对低水平的氧，从而UFL也相对低。在这种情况下，需要较低的异戊二烯浓度以保持高于UFL。
在存在大于或约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯浓度在可燃性包迹内(例如在LFL和UFL之间)。在异戊二烯浓度可以落在可燃性包迹内的一些实施方式中，进行一个或多个步骤以降低起火或爆炸的可能性。例如，可以避免一个或多个燃火源(例如可以产生火星的任何物质)。在一些实施方式中，进行一个或多个步骤以减少异戊二烯的浓度保持在可燃性包迹内的时间。在一些实施方式中，使用感应器来检测异戊二烯的浓度何时接近或落在可燃性包迹内。如果需要，可以在细胞培养过程中的一个或多个时间点测定异戊二烯的浓度，并且，如果异戊二烯的浓度接近或落在可燃性包迹内，可以使用标准方法调节细胞培养条件和/或惰性气体的量。在具体的实施方式中，调节细胞培养条件(例如发酵条件)以使异戊二烯的浓度降低至低于LFL或使异戊二烯的浓度升高至高于UFL。在一些实施方式中，通过以惰性气体稀释异戊二烯成分(例如，通过持续或周期性加入惰性气体以保持异戊二烯成分低于LFL)而将异戊二烯的量保持在低于LFL。
在一些实施方式中，所生产的异戊二烯的量比异戊二烯之外的其它可燃性挥发物(例如一种或多种糖)的量高至少约2、5、10、50、75、或100倍。在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含约0％至约100％(体积)的氧，例如约0％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约90％至约90％或约90％至约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含约0％至约99％(体积)的氮，例如约0％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约90％至约90％或约90％至约99％(体积)的氮。
在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含约1％至约50％(体积)的CO2，例如约1％至约10％，约10％至约20％，约20％至约30％，约30％至约40％，或约40％至约50％(体积)的CO2。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物还包含乙醇。例如，乙醇可用于异戊二烯的提取蒸馏，从而产生包含乙醇和异戊二烯的组合物(例如中间产物流)。合乎需要地，乙醇的量在乙醇的可燃性包迹之外。乙醇的LOC是约8.7vol％，乙醇的LFL在标准条件(例如约1个大气压和约60℉(NFPA69 Standard on Explosion Prevention Systems，2008版，其通过引用整体并入本文，尤其是关于LOC、LFL、和UFL值)下是3.3vol％。在一些实施方式中，在存在小于形成乙醇的可燃混合物所需的LOC的情况下(例如小于约8.7％vol％)生产包含异戊二烯和乙醇的组合物。在存在大于或约形成乙醇的可燃混合物所需的LOC的情况下生产包含异戊二烯和乙醇的组合物的一些实施方式中，乙醇的浓度小于LFL(例如小于约3.3vol.％)。
在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量低于系统中任意燃料(例如异戊二烯或乙醇)的LOC。在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量低于异戊二烯或乙醇的LOC的约60％、40％、30％、20％、10％或5％。在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量比异戊二烯或乙醇的LOC低至少2、4、5、或更多个绝对百分点(vol％)。在具体的实施方式中，氧的量比异戊二烯或乙醇的LOC低至少2个绝对百分点(vol％)(例如，当异戊二烯的LOC是9.5vol％时，氧的浓度低于7.5vol％。在多个实施方式中，燃料(例如异戊二烯或乙醇)的量比该燃料的LFL低或是其约25％、20％、15％、10％或5％。
示例性的异戊二烯生产
除了别的以外，本发明提供了用于增加培养的细胞的异戊二烯生产的组合物和方法，其中使用不同的DXP途径酶，所述酶与铁硫簇-相互作用的氧化还原基因或多肽和异戊二烯合酶基因或多肽以及任选的IDI和DXP途径相关的基因和多肽相组合。在一些实施方式中，在允许细胞生产异戊二烯的条件下，在培养基中培养细胞。“峰值绝对生产率”是指：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行的细胞培养中)期间的废气中的异戊二烯的最大绝对量。“峰值绝对生产率时间点”是指：在发酵运行期间，当废气中的异戊二烯的绝对量是细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间的最大值时的时间点。在一些实施方式中，在峰值绝对生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值绝对生产率是约本文公开的任意的异戊二烯的量。
“峰值比生产率”是指细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间每细胞生产的异戊二烯的最大量。“峰值比生产率时间点”是指：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每细胞生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。峰值比生产率是这样确定的：以总的生产率除以细胞的量，细胞的量如通过600nm处的光密度(OD600)所测定。在一些实施方式中，在峰值比生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值比生产率是约本文公开的任意的异戊二烯的量/细胞。
“累积总生产率”是指在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，生产的异戊二烯的累积的总量。在一些实施方式中，测定异戊二烯的累积的总量。在一些实施方式中，细胞的累积的总生产率是约本文公开的任意的异戊二烯的量。
“相对检测器应答”是指一个化合物(例如异戊二烯)的检测器应答(例如GC/MS面积)与一个或多个化合物(例如所有的C5烃)的检测器应答(例如GC/MS面积)之间的比率。可以按照本文的描述测定检测器应答，例如使用配有Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 250μm；0.25μm膜厚度)的Agilent 6890GC/MS系统进行GC/MS分析。如果需要，可以使用每种化合物的应答因子将相对检测器应答转化为重量百分比。这种应答因子是对于给定量的特定化合物产生多少信号的度量(即，检测器对于特定化合物有多灵敏)。当检测器对于所比较的化合物具有不同的灵敏性时，该应答因子可用作校正因子以将相对检测器应答转化为重量百分比。可替代地，可以通过假设“所比较的化合物的应答因子是相同的”来约计重量百分比。因此，可以假设重量百分比近似等于相对检测器应答。
在一些实施方式中，培养的细胞生产大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole的异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(nmole/gwcm/hr)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约2至约5,000nmole/gwcm/hr，例如约2至约100nmole/gwcm/hr，约100至约500nmole/gwcm/hr，约150至约500nmole/gwcm/hr，约500至约1,000nmole/gwcm/hr，约1,000至约2,000nmole/gwcm/hr，或约2,000至约5,000nmole/gwcm/h。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约20至约5,000nmole/gwcm/hr，约100至约5,000nmole/gwcm/hr，约200至约2,000nmole/gwcm/hr，约200至约1,000nmole/gwcm/hr，约300至约1,000nmole/gwcm/hr，或约400至约1,000nmole/gwcm/hr。
可以按照如美国专利号5,849,970中公开的内容测定异戊二烯的量，单位是nmole/gwcm/hr，该文献通过引用整体并入本文，尤其是关于测定异戊二烯的生产的内容。例如，使用标准气相色谱系统，例如等温(85℃)操作的具有正辛烷/多孔硅C柱(Alltech Associates，Inc.，Deerfield，Ill.)并偶联于RGD2氧化汞还原气体检测器(Trace Analytical，Menlo Park，CA)的系统分析2mL顶空(例如，来自于在32℃以200rpm振荡培养约3小时的密封瓶中的2mL培养物的顶空)中的异戊二烯(参见，例如，Greenberg等人，Atmos.Environ.27A：2689-2692，1993；Silver等人，Plant Physiol.97：1588-1591，1991，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于测定异戊二烯的产生)。通过标准的异戊二烯浓度校正曲线将气相色谱面积单位转化为nmol异戊二烯。在一些实施方式中，通过获得细胞培养物的样品的A600值、然后基于具有已知的A600值的细胞培养物的湿重的校正曲线将A600值转化为细胞的克数，来计算湿细胞重的细胞的克数。在一些实施方式中，通过假设A600值为1的1升培养液(包括细胞培养基和细胞)具有1克湿细胞重来估计细胞的克数。还将该值除以培养物已被温育的小时数，例如3个小时。
在一些实施方式中，培养的细胞生产大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000、或更多ng的异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(ng/gwcm/h)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约2至约5,000ng/gwcm/h，例如约2至约100ng/gwcm/h，约100至约500ng/gwcm/h，约500至约1,000ng/gwcm/h，约1,000至约2,000ng/gwcm/h，或约2,000至约5,000ng/gwcm/h。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约20至约5,000ng/gwcm/h，约100至约5,000ng/gwcm/h，约200至约2,000ng/gwcm/h，约200至约1,000ng/gwcm/h，约300至约1,000ng/gwcm/h，或约400至约1,000ng/gwcm/h。可以通过将如上讨论的单位为nmole/gwcm/hr的异戊二烯的产量值乘以68.1来计算以ng/gwcm/h表示的异戊二烯的量(如以下等式5所描述)。
在一些实施方式中，培养的细胞生产大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的累积效价(总量)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约2至约5,000mg/L培养液，例如约2至约100mg/L培养液，约100至约500mg/L培养液，约500至约1,000mg/L培养液，约1,000至约2,000mg/L培养液，或约2,000至约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约20至约5,000mg/L培养液，约100至约5,000mg/L培养液，约200至约2,000mg/L培养液，约200至约1,000mg/L培养液，约300至约1,000mg/L培养液，或约400至约1,000mg/L培养液。
在一些实施方式中，培养的细胞生产至少约2g/L培养液、至少约2.1g/L培养液、至少约2.2g/L培养液、至少约2.3g/L培养液、至少约2.4g/L培养液、至少约2.5g/L培养液、至少约2.6g/L培养液、至少约2.7g/L培养液、至少约2.8g/L培养液、至少约2.9g/L培养液、至少约3.0g/L培养液、至少约3.2g/L培养液、至少约3.5g/L培养液、至少约3.7g/L培养液或至少约4.0g/L培养液。
以毫克异戊二烯/升顶空(来自摇瓶或类似培养物)表示的异戊二烯的比生产率可以这样测定：在OD600值为约1.0时从细胞培养物中取出1ml样品，将其置于20ml的瓶中，温育30分钟，然后测定顶空中的异戊二烯的量(例如实施例I第II部分中的描述)。如果OD600值不是1.0，则可以通过除以OD600值来将测定值校正为1.0的OD600值。可以通过乘以因子38而将毫克异戊二烯/升顶空的值转化为mg/L培养液/hr/培养液的OD600。可以将单位为mg/L培养液/hr/OD600的值乘以小时数和OD600值来获得单位为毫克异戊二烯/升培养液的累积效价。
发酵罐中的以mg/L培养液/hr表示的瞬时异戊二烯生产速率可以这样测定：取出发酵罐废气的样品，通过例如实施例I第II部分的描述分析其异戊二烯的量(单位是例如毫克异戊二烯/L气体)，并将该数值乘以废气通过每升培养液的速率(例如，在1vvm(空气体积/培养液体积/分钟)时是60L气体/小时)。因此，1mg/L气体的废气水平对应于气流为1vvm时60mg/L培养液/hr的瞬时生产速率。如果需要，可以将单位为mg/L培养液/hr的数值除以OD600值以获得单位为mg/L培养液/hr/OD的比速率。可以通过将此平均废气异戊二烯浓度乘以发酵过程中每升发酵液鼓泡的废气的总量而将以毫克异戊二烯/L气体表示的平均值转化为总产物生产率(异戊二烯克数/升发酵液，mg/L培养液)。因此，在1vvm经10小时的0.5mg/L培养液/hr的平均废气异戊二烯浓度对应于300毫克异戊二烯/L培养液的总产物浓度。
在一些实施方式中，培养的细胞将大于或约0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％或8.0％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在一些实施方式中，碳至异戊二烯的转化百分比是例如约0.002％至约4.0％，约0.002％至约3.0％，约0.002％至约2.0％，约0.002％至约1.6％，约0.002％至约0.005％，约0.005％至约0.01％，约0.01％至约0.05％，约0.05％至约0.15％，0.15％至约0.2％，约0.2％至约0.3％，约0.3％至约0.5％，约0.5％至约0.8％，约0.8％至约1.0％，或约1.0％至约1.6％。在一些实施方式中，碳至异戊二烯的转化百分比是约0.002％至约0.4％，0.002％至约0.16％，0.04％至约0.16％，约0.005％至约0.3％，约0.01％至约0.3％，或约0.05％至约0.3％。
碳至异戊二烯的转化百分比(也称作“％碳产率”)可以这样测定：将所生产的异戊二烯中的摩尔碳除以碳源中的摩尔碳(例如批式和进料的葡萄糖和酵母提取物中的摩尔碳)。将该数值乘以100％以得到百分比数值(如等式1所示)。
等式1
％碳产率＝(所生产的异戊二烯中的摩尔碳)/(碳源中的摩尔碳)*100
为了这个计算，可以假设酵母提取物包含505w/w的碳。举例而言，对于实施例7第VIII部分中描述的500升，可以根据等式2计算碳至异戊二烯的转化百分比。
等式2
％碳产率＝(39.1g异戊二烯*1/68.1mol/g*5C/mol)/[(181221g葡萄糖*1/180mol/g*6C/mol)+(17780g酵母提取物*0.5*1/12mol/g)]*100＝0.042％
对于本文描述的两个500升的发酵(实施例7，第VII和VIII部分)，碳至异戊二烯的转化百分比是0.04％-0.06％。使用如本文描述的14升的系统，达到了0.11％-0.16％的碳产率。
本领域技术人员可以容易地将异戊二烯的生产速率或异戊二烯的生产量转化为任意其它单位。以下列出了用于在单位之间相互转化的示例性的等式。
用于异戊二烯生产速率(总速率和比速率)的单位
等式3
1g异戊二烯/L培养液/hr＝14.7mmol异戊二烯/L培养液/hr(总体积速率)
等式4
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝1nmol异戊二烯/L培养液/hr/OD600(该转化假设OD600值为1的1升培养液具有1克湿细胞重)
等式5
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(给出异戊二烯的分子量)
等式6
1nmol异戊二烯/L气体O2/hr＝90nmol异戊二烯/L培养液/hr(在90L/hr的O2流速每升培养液)
等式7
废气中的1ug异戊二烯/L气体异戊二烯＝在60L气体每L培养液(1vvm)的流速的60ug异戊二烯/L培养液/hr
效价的单位(总效价和比效价)
等式8
1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白＝150nmol异戊二烯/L培养液/OD600(该转化假设OD600值为1的1升培养液具有总共约150mg的细胞蛋白)(比生产率)
等式9
1g异戊二烯/L培养液＝14.7mmol异戊二烯/L培养液(总效价)
如果需要，等式10可用于将任何包括湿细胞重的单位转化为包括干细胞重的对应的单位。
等式10
干细胞重＝(湿细胞重)/3.3
如果需要，可以使用等式11在单位ppm与μg/L之间转化。具体地，“ppm”是指以μg/g(w/w)定义的百万分之几。也可以使用“ppmv”(体积的百万分之几)基于体积来表示气体的浓度，以μL/L(vol/vol)定义。μg/L与ppm(例如，μg分析物/g气体)的转化可以通过测定每升废气的质量(即气体的密度)来进行。例如，在标准温度和压力(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)下，1升空气的密度是约1.29g/L。因此，1ppm(μg/g)的浓度等于STP下的1.29μg/L(等式11)。ppm(μg/g)向μg/L的转化与压力、温度和废气总体成分有关。
等式11
1ppm(μg/g)在标准温度和压力(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)下等于1.29μg/L。
可以使用普适气体定律(等式12)进行μg/L向ppmv的转化(例如，μL分析物/升气体)。例如，1000μg/L气体的废气浓度对应于14.7umol/L气体。普适气体常数是0.082057L.atm K-1mol-1，所以使用等式12，在STP下由14.7umol HG占据的体积等于0.329mL。因此，1000μg/L HG的浓度等于STP下的329ppmv或0.0329％(v/v)。
等式12
PV＝nRT，其中“P”是压力，“V”是体积，“n”是气体的摩尔数，“R”是普适气体常数，“T”是开氏温度。
本文中通常基于重量/体积(w/v)以单位例如μg/L来测定异戊二烯组合物中的杂质的量。如果需要，可以使用等式13将单位为μg/L的测量值转化为mg/m3的单位。
等式13
1μg/L＝1mg/m3
在本发明包括的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞生产的异戊二烯的量是在基本上相同的条件下生长的不含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的相应的细胞生产的异戊二烯的量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。
在本发明包括的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸和编码DXP途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产的异戊二烯的量是在基本上相同的条件下生长的不含异源核酸的相应的细胞生产的异戊二烯的量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有的C5烃总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物中的异戊二烯具有组合物中所有C5烃的检测器应答的大于或约99.90％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％或100％的相对检测器应答。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量为组合物中的所有C5烃的总重量的约99.90％至约99.92％、约99.92％至约99.94％、约99.94％至约99.96％、约99.96％至约99.98％、约99.98％至100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物中除了异戊二烯之外的C5烃具有组合物中所有C5烃的检测器应答的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，组合物中的1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔具有组合物中所有C5烃的检测器应答的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有C5烃的总重量的约0.02％至约0.04％、约0.04％至约0.06％、约0.06％至0.08％、约0.08％至0.10％或约0.10至约0.12％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。
在一些实施方式中，对于组合物中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，对于组合物中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，异戊二烯组合物包含约0.005至约50、例如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5、或约0.01至约0.005μg/的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的除了异戊二烯之外的烃(例如1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含约0.005至约50、例如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5、或约0.01至约0.005μg/L的除了异戊二烯之外的烃。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的蛋白或脂肪酸(例如与天然橡胶天然结合的蛋白或脂肪酸)。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或约10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的α乙炔、戊二烯、乙腈、或1，3-环戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的硫或丙二烯。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或约30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的所有乙炔(例如戊炔-1、丁炔-2、2MB1-3炔和1-戊炔-4炔)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或约2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的异戊二烯二聚体，例如环式异戊二烯二聚体(例如，源自两个异戊二烯单元的二聚化的环式C10化合物)。
在一些实施方式中，组合物包含大于约2mg异戊二烯，例如大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯。在一些实施方式中，组合物中异戊二烯的量是约2至约5,000mg，例如约2至约100mg，约100至约500mg，约500至约1,000mg，约1,000至约2,000mg，或约2,000至约5,000mg。在一些实施方式中，组合物中异戊二烯的量是约20至约5,000mg，约100至约5,000mg，约200至约2,000mg，约200至约1,000mg，约300至约1,000mg，或约400至约1,000mg。在一些实施方式中，组合物中大于或约20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95重量％的挥发性有机级分是异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物包含乙醇。在一些实施方式中，组合物包含约75％至约90重量％的乙醇，例如约75％至约80％、约80％至约85％或约85％至约90重量％的乙醇。在组合物包含乙醇的一些实施方式中，组合物还包含约4％至约15重量％的异戊二烯，例如约4％至约8％、约8％至约12％或约12％至约15重量％的异戊二烯。
示例性的异戊二烯纯化方法
在一些实施方式中，本文所述的任意方法另外包括回收异戊二烯。例如，使用标准技术，可以回收使用本发明的组合物和方法生产的异戊二烯，所述标准技术例如气提、膜增强的分离、分馏、吸附/解吸附、渗透蒸发、从固相热解吸或真空解吸附异戊二烯、或使用溶剂提取固定至或吸附至固相的异戊二烯(参见，例如，美国专利号4,703,007和4,570,029，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯回收和纯化方法)。在一个实施方式中，通过吸收汽提(参见，例如，美国Appl.61/288,142)，回收异戊二烯。在具体的实施方式中，使用醇(例如乙醇、甲醇、丙醇、或其组合)的萃取蒸馏，回收异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的回收包括分离液体形式的异戊二烯(例如异戊二烯的纯溶液或异戊二烯在溶剂中的溶液)。气提包括以持续方式从发酵废气流中获取异戊二烯蒸气。这种获取可以通过数种不同方式进行，包括但不限于：吸附至固相、分入液相、或直接冷凝(例如由于暴露于冷凝旋管或由于压力增加而发生冷凝)。在一些实施方式中，在蒸气的露点以上对稀释的异戊二烯蒸气流进行膜富集，引起液体异戊二烯的冷凝。在一些实施方式中，压缩并冷凝异戊二烯。
异戊二烯的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，从发酵废气中获取异戊二烯蒸气和将异戊二烯转化为液相是同时进行的。例如，可以从废气流中直接冷凝异戊二烯以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气中获取异戊二烯蒸气和将异戊二烯转化为液相是依次进行的。例如，可以使异戊二烯吸附至固相，然后使用溶剂从固相提取。在一个实施方式中，使用在美国临时申请号61/288,142中所述的吸收汽提，回收异戊二烯。
在一些实施方式中，本文所述的任意方法另外包括纯化异戊二烯。例如，可以使用标准技术纯化使用本发明的组合物和方法生产的异戊二烯。纯化是指这样的过程：通过该过程将异戊二烯与生产异戊二烯时存在的一种或多种成分分离开。在一些实施方式中，以实质上纯的液体形式获得异戊二烯。纯化方法的实例包括(i)在液体提取剂中从溶液中蒸馏；和(ii)色谱。本文使用的“纯化的异戊二烯”是指已经与生产异戊二烯时存在的一种或多种成分分离的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯是至少约20％(按重量)，不含在生产异戊二烯时存在的其它成分。在多种实施方式中，异戊二烯是至少或约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％(按重量)纯的。可以通过任何合适方法例如通过柱色谱、HPLC分析或GC-MS分析测定纯度。
在一些实施方式中，通过将气相导入用于生产异戊二烯的细胞培养系统(例如发酵罐)，使在获取异戊二烯的一个或多个回收步骤之后剩余的至少一部分气相再循环。
在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括使异戊二烯聚合。例如，可以使用标准方法使纯化的异戊二烯聚合以形成顺式-聚异戊二烯或其它下游产物(使用标准方法)。相应地，本发明的特征还在于包含聚异戊二烯的轮胎，所述聚异戊二烯例如由本文公开的任何异戊二烯组合物制备而来的顺式1，4-聚异戊二烯和/或反式-1，4-聚异戊二烯。
实施例
实施例纯粹是意在例示本发明，因此不应该被解释为以任何方式限制本发明，实施例也描述并详细叙述了如上所讨论的本发明的方面和实施方式。除非另有指明，否则温度是指摄氏度，压力是在大气压下或接近大气压。前述实施例和详细描述是以举例方式而不是限制性方式提供。
本说明书中引用的所有公开物、专利申请、和专利通过引用方式并入本文，如同每篇公开物、专利申请、或专利皆特别地且单一地通过引用方式并入一样。具体地，为了描述和公开可能用于本发明的组合物和方法的目的，将本文引用的所有公开物明确地通过引用方式并入本文。虽然已经为了清楚理解的目的，通过例示和实例的方式在一定程度上详细描述了前述发明，但是本领域普通技术人员根据本发明的教导显而易见的是，可以对其作出一些变化和修饰而不脱离随附的权利要求的精神或范围。
实施例1：在表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.用于在大肠杆菌中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
从GenBank获得野葛(越南葛藤)异戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白序列(AAQ84170)。从DNA2.0购买针对大肠杆菌中的密码子使用进行了优化的野葛异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：1)。通过以限制性内切核酸酶BspLU11I/PstI消化从提供的质粒中切下异戊二烯合酶基因，进行凝胶纯化，并连接进经NcoI/PstI消化的pTrcHis2B(Invitrogen)。设计构建体，使得异戊二烯合酶基因中的终止密码子在PstI位点的5’。结果是：当构建体被表达时，His-标签不附着于异戊二烯合酶蛋白。通过测序来验证得到的质粒pTrcKudzu(图2和3)。
还将异戊二烯合酶基因克隆进入pET16b(Novagen)。在本例中，将异戊二烯合酶基因插入至pET16b，使得重组异戊二烯合酶蛋白包含N-末端的His标签。使用下列引物集合通过PCR从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因：
pET-His-Kudzu-2F：
5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC(SEQ IDNO：3)和
pET-His-Kudzu-R：
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQID NO：4)。
这些引物在基因的5’末端添加NdeI位点，在3’末端添加BamH1位点。如上所述的质粒pTrcKudzu用作模板DNA，根据生产商的说明书使用Herculase聚合酶(Stratagene)，加入浓度为10pMol的引物。以25μl的总体积进行PCR。以NdeI/BamH1消化PCR产物，并克隆进入经相同的酶消化的pET16b。将连接混合物转化进大肠杆菌Top10(Invitrogen)，通过测序选择正确的克隆。得到的质粒被称作pETNHisKudzu(图4和5)，其中野葛异戊二烯表达自T7启动子。
还将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入低拷贝数的质粒pCL1920。按照上文描述使用引物从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因。正向引物向5’末端添加HindIII位点和大肠杆菌共有RBS。PstI克隆位点已经存在于pTrcKudzu中，恰在终止密码子的3’，所以反向引物被构建为使得最终的PCR产物包括PstI位点。引物的序列是：
HindIII-rbs-Kudzu F：
5’-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC(SEQ ID NO：6)和
BamH1-Kudzu R：
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ ID NO：4)。
使用Herculase聚合酶和浓度为10pmol的引物以及1ng模板DNA(pTrcKudzu)扩增PCR产物。扩增程序包括：30个循环的“95℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，2分钟”。以HindIII和PstI消化产物并连接进也经过HindIII和PstI消化的pCL1920。将连接混合物转化进大肠杆菌Top10。通过测序检查数个转化体。得到的质粒被称作pCL-lac-Kudzu(图6和7)。
II.测定异戊二烯的生产
对于摇瓶培养物，将1ml的培养物从摇瓶转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶目录号51882753；帽目录号5188 2759)。将盖旋紧，将瓶在相同温度下在250rpm振荡温育。30分钟后，从温育箱中取出瓶并按照如下所述进行分析(关于该测定中的一些实验数值，见表1)。
在测定发酵罐中的异戊二烯产量的情况下，从发酵罐的废气中取出样品并按照如下所述直接进行分析(关于该测定中的一些实验数值，见表2)。
使用连接了CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这样的条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至200μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。
III.在含有表达重组异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞的摇瓶中生产异戊二烯
将如上描述的载体导入大肠杆菌菌株BL21(Novagen)以产生菌株BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu和BL21/pETHisKudzu。为了分离，将菌株涂覆于LA(Luria琼脂)+羧苄西林(50μg/ml)，并在37℃温育过夜。将单一菌落接种于250ml振荡培养瓶，其中含有20ml Luria Bertani培养基(LB)和羧苄西林(100μg/ml)。培养物在20℃在200rpm振荡生长过夜。测定过夜培养物的OD600，并将培养物在含有30mlMagicMedia(Invitrogen)+羧苄西林(100μg/ml)的250ml振荡培养瓶中稀释至OD600～0.05。将培养物在30℃在200rpm振荡温育。当OD600达到～0.5-0.8时，加入400μM IPTG，并在30℃在200rpm振荡温育细胞另6个小时。以IPTG诱导后0、2、4和6小时，收集1ml的培养物等分试样，测定OD600，并按照如上的描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图8。
IV.在14升发酵中从BL21/ptrcKudzu生产异戊二烯
从补料分批培养物测定从含有重组野葛异戊二烯合酶基因的大肠杆菌中异戊二烯的大规模生产。对于每升发酵培养基，发酵培养基(TM2)的配方如下：K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO4 3.2g，酵母提取物5g，1000X改良痕量金属溶液(改良痕量金属Solution)1ml。所有成分一起加入和溶于去离子H2O中。使用氢氧化钾(KOH)将pH调节至6.8并定容。以0.22μm滤器过滤除菌最终产物(仅过滤，不高压灭菌)。1000X改良痕量金属溶液的配方如下：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每个成分逐一溶于去离子H2O中，使用HCl/NaOH调节pH至3.0with，然后定容，并以0.22μm滤器过滤除菌。
在需要的发酵、pH 6.7和34℃的温度，在14升生物反应器中进行该实验以监测从葡萄糖形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株BL21/ptrcKudzu的接种物。接种物生长至OD550＝0.6之后，离心2个600ml的瓶并将内容物重悬于70ml上清液中以将细胞沉淀物(70ml OD 3.1的材料)转移至生物反应器。在接种后的多个时间点，取出样品并按照上文描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图9。
实施例2：在表达重组白杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
从GenBank获得白杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶的蛋白序列(CAC35696)(Schnitzler，J-P等人(2005)Planta 222：777-786)。从DNA2.0购买针对大肠杆菌进行了密码子优化的基因(p9796-poplar，图30和31)。通过以限制性内切核酸酶BspLU11I/PstI消化从提供的质粒中切下异戊二烯合酶基因，进行凝胶纯化，并连接进已经NcoI/PstI消化的pTrcHis2B。克隆构建体，使得插入片段中的终止密码子在PstI位点之前，这导致产生这样的构建体：其中His-标签不附着于异戊二烯合酶蛋白。通过测序来验证得到的质粒pTrcPoplar(图26和27)。
实施例3：在表达重组野葛异戊二烯合酶的柠檬泛菌中生产异戊二烯
将实施例1中描述的pTrcKudzu和pCL-lac Kudzu质粒电穿孔进入柠檬泛菌(美国专利号7,241,587)。分别在含有羧苄西林(200μg/ml)或壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化体。从摇瓶中生产异戊二烯并按照实施例1中针对表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株的描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图10。
实施例4：在表达重组野葛异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌中生产异戊二烯
I.用于表达野葛异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌复制质粒的构建
在枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl-comK菌株(BG3594comK)中使用aprE启动子控制下的复制质粒(具有氯霉素抗性盒的pBS19)表达野葛异戊二烯合酶。使用PCR单独扩增异戊二烯合酶、aprE启动子和转录终止子并使它们融合。然后将构建体克隆进入pBS19并转化进枯草芽孢杆菌。
a)aprE启动子的扩增
使用下列引物从枯草芽孢杆菌的染色体DNA扩增aprE启动子CF 797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ IDNO：29)
CF 07-43(-)使aprE启动子融合至Kudzu ispS
5’-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA(SEQID NO：30)
b)异戊二烯合酶基因的扩增
从质粒pTrcKudzu(SEQ ID NO：2)扩增野葛异戊二烯合酶基因。该基因针对大肠杆菌进行密码子优化，由DNA 2.0合成。使用下列引物：
CF 07-42(+)使aprE启动子融合至野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQID NO：31)
CF 07-45(-)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQID NO：32)
c)转录终止子的扩增
使用下列引物从之前测过序的质粒pJHPms382扩增解淀粉芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶的终止子：
CF 07-44(+)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG(SEQID NO：33)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：34)
使用下列引物通过PCR使野葛片段融合至终止子片段：
CF 07-42(+)使aprE启动子融合至野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQID NO：32)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：34)
使用下列引物通过PCR使野葛终止子片段融合至启动子片段：
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ ID NO：35)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：34)
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并以限制性酶MfeI和BamHI消化。使用Qiagen试剂盒凝胶纯化该经消化的DNA片段并连接进载体pBS19，所述载体已经过EcoRI和BamHI消化并进行了凝胶纯化。
将连接混合物转化进大肠杆菌Top 10细胞，在LA+50羧苄西林平板上选择菌落。选择总共6个菌落，在LA+50羧苄西林中生长过夜，然后使用Qiagen试剂盒分离质粒。以EcoRI和BamHI消化质粒以检查插入片段，将三个正确的质粒送去测序，其中使用下列引物：
CF 149(+)aprE启动子的EcoRI起始
5’-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：36)
CF 847(+)pXX 049中的序列(aprE启动子的末端)
5’-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG(SEQ ID NO：37)
CF 07-45(-)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQID NO：32)
CF 07-48(+)用于野葛异戊二烯合酶的测序引物
5’-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG(SEQ ID NO：38)
CF 07-49(+)野葛异戊二烯合酶中的测序
5’-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC(SEQ ID NO：39)
通过测序，被称作pBS Kudzu #2(图44和12)的质粒是正确的，将其转化进枯草芽孢杆菌宿主菌株BG 3594comK。在LA+5氯霉素平板上进行选择。选择转化体并在LA+5氯霉素上划线为单一菌落，然后在LA+5氯霉素中生长直至其达到1.5的OD600。将其在-80℃在存在甘油的瓶中冷冻储存。得到的菌株被称作CF 443。
II.在含有表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌细胞的摇瓶中生产异戊二烯
以来自LA+氯霉素(Cm，25μg/ml)的CF 443的单一菌落接种过夜培养物。培养物在37℃在LB+Cm中在200rpm振荡生长。这些过夜培养物(1ml)用于接种含有25ml Grants II培养基和终浓度为25μg/ml的氯霉素的250ml振荡培养瓶。Grants II培养基的配方是：10g大豆胨，3ml 1MK2HPO4，75g葡萄糖，3.6g脲，100ml 10X MOPS，以水定容至1L，pH7.2；10X MOPS的配方是：83.72g MOPS，7.17g tricine，12g KOH丸，10ml 0.276M K2SO4溶液，10ml 0.528M MgCl2溶液，29.22g NaCl，100ml100X微量营养素，以水定容至1L；100X微量营养素的配方是：1.47gCaCl2*2H2O，0.4g FeSO4*7H20，0.1g MnSO4*H20，0.1g ZnSO4*H2O，0.05g CuCl2*2H2O，0.1g CoCl2*6H2O，0.1g Na2MoO4*2H2O，以水定容至1L。将摇瓶在37℃温育，在第18、24、和44小时取出样品。在第18小时，对CF443和对照菌株的顶空取样。这代表18小时的异戊二烯累积。通过如实施例1描述的气相色谱测定异戊二烯的量。通过表达重组异戊二烯合酶显著增加了异戊二烯的产量(图11)。
III.在14L的发酵中通过CF443生产异戊二烯
从补料分批培养物中测定由含有在复制质粒上的重组野葛异戊二烯合酶基因的枯草芽孢杆菌大规模生产的异戊二烯。在含有大豆粉(Cargill)、磷酸钠和钾、硫酸镁和柠檬酸的溶液、氯化铁和氯化锰的营养培养基中，通过常规补料分批发酵方式培养表达野葛异戊二烯合酶基因的芽孢杆菌菌株CF 443或不表达野葛异戊二烯合酶基因的对照菌株。在发酵之前，使用酶的混合物(包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶)将培养基浸软90分钟(见WO95/04134)。向14L分批发酵罐中进料60％wt/wt葡萄糖(CargillDE99右旋糖，ADM Versadex greens或Danisco转化糖)和99％wt/wt油(西方家用豆油，其中99％wt/wt是加入到细胞培养基之前油的浓度)。当批次中的葡萄糖不可检出时，开始进料。进料速率经数小时渐变，调整以相同的碳要素添加油。使用28％w/v氢氧化铵将pH控制在6.8-7.4。如果起泡沫，则向培养基中加入防沫剂。将发酵温度控制在37℃，以750rpm搅拌发酵培养物。在整个过程中监测多个其它参数，例如pH、DO％、气流、和压力。将DO％维持在20以上。经36小时的时间过程取样并分析细胞生长(OD550)和异戊二烯的生产。这些实验的结果显示于图45A和45B。
IV.野葛异戊二烯合酶(ispS)整合进入枯草芽孢杆菌
将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入整合质粒(pJH101-cmpR)，处于aprE启动子的控制下。在所测的条件下，没有检测到异戊二烯。
实施例5：在木霉中生产异戊二烯
I.用于在里氏木霉中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
由DNA 2.0合成解脂耶氏酵母密码子优化的野葛IS基因(SEQ ID NO：8)(图13)。该质粒作为下列PCR扩增反应的模板：1μl质粒模板(20ng/ul)，1μl引物EL-945(10uM)5’-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG(SEQ IDNO：9)，1μl引物EL-965(10uM)5’-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQ ID NO：10)，1μldNTP(10mM)，5μl 10x PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶缓冲液，1μlPfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶，40μl水，总反应体积为50μl。正向引物在5’末端包含不对应于解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的另外4个核苷酸，但是这4个核苷酸对于克隆进入pENTR/D-TOPO载体是必需的。反向引物在5’末端包含不对应于解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的另外21个核苷酸，但插入这21个核苷酸以克隆进入其它载体骨架。使用MJ Research PTC-200热循环仪，按照如下进行PCR反应：95℃，2分钟(仅第一个循环)；“95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒”(重复27个循环)；最后一个循环后72℃，1分钟。在1.2％E-凝胶上分析PCR产物以确认成功扩增了解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因。
然后根据生产商的说明书，使用TOPO pENTR/D-TOPO克隆试剂盒克隆PCR产物：1μl PCR反应物，1μl盐溶液，1μl TOPO pENTR/D-TOPO载体和3μl水，总反应体积是6μl。将反应物在室温温育5分钟。将1μlTOPO反应物转化进TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA+50μg/ml卡那霉素平板上选择转化体。挑取数个菌落，每个接种于含有LB+50μg/ml卡那霉素的5ml管中，使培养物在37℃在200rpm振荡生长过夜。根据生产商的说明书，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒从过夜培养物分离质粒。对数个质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
编码解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的单一pENTR/D-TOPO质粒用于Gateway克隆进入订制的pTrex3g载体。pTrex3g的构建描述于WO 2005/001036A2。根据生产商关于Gateway LRClonase II Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen)的说明书进行反应：1μl解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因pENTR/D-TOPO供体载体，1μl pTrex3g目的载体，6μl TE缓冲液，pH 8.0，总反应物体积为8μl。将反应物在室温温育1小时，然后加入1μl蛋白酶K溶液，在37℃继续温育10分钟。然后将1μl反应物转化进TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA+50μg/ml羧苄西林平板上选择转化体。挑取数个菌落，每个接种于含有LB+50μg/ml羧苄西林的5ml管中，使培养物在37℃在200rpm振荡生长过夜。根据生产商的说明书，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.)从过夜培养物管中分离质粒。对数个质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
使用Biolistic PDS-1000/HE颗粒递送系统(见WO 2005/001036 A2)进行解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶pTrex3g质粒(图14)向quad缺失里氏木霉菌株的生物弹转化。使用专利公开WO 2005/001036 A2的实施例11所列的程序进行稳定转化体的分离和摇瓶评价。
II.在重组里氏木霉菌株中生产异戊二烯
将如上描述的异戊二烯合酶转化体的1ml的15和36小时的培养物转移至顶空瓶中。将瓶密封并在30℃温育5小时。通过实施例1描述的方法测定顶空气体并鉴定异戊二烯。转化体中有2个显示出痕量的异戊二烯。通过14小时的温育可以增加异戊二烯的量。对于14小时的温育，两个阳性样品显示出约0.5μg/L的异戊二烯水平。未经转化的对照未显示出可检出水平的异戊二烯。该实验证明：当提供外源异戊二烯合酶时，里氏木霉能够从内源前体生产异戊二烯。
实施例6：在耶氏酵母中生产异戊二烯
I.用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶基因的载体的构建起始点是载体pSPZ1(MAP29Spb)。该载体的完整序列(SEQ ID No：11)显示于图15。
使用解脂耶氏酵母菌株GICC 120285的染色体DNA作为模板通过PCR扩增以下片段：URA3基因的无启动子形式，18S核糖体RNA基因的片段，解脂耶氏酵母XPR2基因的转录终止子，以及包含XPR2和ICL1基因的启动子的两个DNA片段。使用以下PCR引物：
ICL13
5’-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC(SEQ ID NO：40)
ICL15
5’-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC(SEQ ID NO：41)
XPR 3
5’-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG(SEQID NO：42)
XPR 5
5’-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC(SEQ IDNO：43)
XPRT3
5’-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG(SEQ IDNO：44)
XPRT5
5’-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG(SEQID NO：45)
Y18S3
5’-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG(SEQ ID NO：46)
Y18S 5
5’-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG(SEQID NO：47)
YURA3
5’-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG(SEQID NO：48)
YURA 50
5’-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG(SEQID NO：49)
YURA 51
5’-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC(SEQ IDNO：50)
对于PCR扩增，根据生产商的说明书，使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)、生产商提供的缓冲液和dNTP、2.5μM的引物和指明的模板DNA。使用下列循环进行扩增：95℃，1分钟；34x(95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，3分钟)，和在72℃，10分钟，然后在4℃温育。
从DNA 2.0获得编码针对在耶氏酵母中表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的合成的DNA分子(图16；SEQ ID NO：12)。在图18中显示了分别携带在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的野葛异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)的完整详细的构建示意图。还构建了对照质粒，其中插入了交配因子基因(MAP29)以替代异戊二烯合酶基因(图18E和18F)。
类似的克隆程序可用于表达白杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶基因。白杨异戊二烯的序列描述于Miller B等人(2001)Planta 213，483-487并显示于图17(SEQ ID NO：13)。在图18A和B中显示了产生分别携带在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的白杨异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(POP1)和pYLI(POP1)的构建示意图。
II.通过解脂耶氏酵母的重组菌株生产异戊二烯
使用SacII消化载体pYLA(KZ1)、pYLI(KZ1)、pYLA(MAP29)和pYLI(MAP29)并通过标准的醋酸锂/聚乙二醇程序转化解脂耶氏酵母菌株CLIB 122至尿苷原养型。简而言之，酵母细胞在YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中生长过夜，通过离心(4000rpm，10分钟)收集，以无菌水洗涤一次并悬于pH 6.0的0.1M醋酸锂中。将200μl的细胞悬浮液等份与线性化的质粒DNA溶液(10-20μg)混合，在室温温育10分钟，在相同的缓冲液中与1ml 50％PEG 4000的混合。将悬浮液在室温再温育1小时，然后在42℃热击2分钟。然后将细胞铺板于SC his leu平板(0.67％酵母氮源，2％葡萄糖，各100mg/L的亮氨酸和组氨酸)。在30℃温育3-4天后出现转化体。
使来自pYLA(KZ1)转化的3个分离体，来自pYLI(KZ1)转化的3个分离体，来自pYLA(MAP29)转化的2个分离体和来自pYLI(MAP29)转化的2个分离体在YEP7培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，pH 7.0)中在30℃振荡生长24小时。通过离心从10ml的培养物收集细胞，重悬于3ml的新鲜YEP7中并置于15ml旋盖瓶中。将瓶在室温温育过夜，轻微(60rpm)振荡。使用如实施例1描述的质谱检测器通过气相色谱分析这些瓶的顶空中的异戊二烯含量。以pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)获得的所有转化体都生产容易检出的量的异戊二烯(0.5μg/L至1μg/L，图20)。在携带肌醇六磷酸酶基因而非异戊二烯合酶基因的对照菌株的顶空中未检出异戊二烯。
实施例7：在表达野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.构建用于在大肠杆菌中生产异戊二烯的编码野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的载体
i)pTrcKudzuKan的构建
将pTrcKudzu(如实施例1所描述)的bla基因替换为赋予卡那霉素抗性的基因。为了除掉bla基因，以BspHI消化pTrcKudzu，以虾碱性磷酸酶(SAP)处理，在65℃热杀灭，然后以Klenow片段和dNTP进行末端填充。从琼脂糖凝胶纯化5kbp大的片段，并连接至kanr基因，所述kanr基因是使用引物MCM22 5’-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG(SEQ ID NO：14)和MCM235’-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQ IDNO：15)从pCR-Blunt-II-TOPO通过PCR扩增而来的；以HindIII和PvuI消化，并进行末端填充。在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择携带赋予卡那霉素抗性的质粒(pTrcKudzuKan)的转化体。
ii)pTrcKudzu yIDI Kan的构建
以PstI消化pTrcKudzuKan，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自酿酒酵母的idi的PCR产物。用于PCR的引物是NsiI-YIDI 1F 5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(SEQ IDNO：16)和PstI-YIDI 1 R 5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC(SEQ ID NO：17)；模板是酿酒酵母基因组DNA。以NsiI和PstI消化PCR产物，并进行凝胶纯化，然后连接。将连接混合物转化进化学感受态TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。分离了数个转化体并测序，得到的质粒被称作pTrcKudzu-yIDI(kan)(图28和29)。
iii)pTrcKudzu DXS Kan的构建
以PstI消化质粒pTrcKudzuKan，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自大肠杆菌的dxs的PCR产物。用于PCR的引物是：MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO：18)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：19)；模板是大肠杆菌基因组DNA。以NsiI和PstI消化PCR产物，并进行凝胶纯化，然后连接。将得到的转化反应物转化进TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。分离了数个转化体并测序，得到的质粒被称作pTrcKudzu-DXS(kan)(图30和31)。
iv)pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)的构建
以PstI消化pTrcKudzu-yIDI(kan)，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自大肠杆菌的dxs的PCR产物(引物MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO：18)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：19)；模板TOP10细胞)，所述PCR产物经过NsiI和PstI消化和凝胶纯化。最终的质粒被称作pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)(图21和22)。
v)pCL PtrcKudzu的构建
使用SspI从pTrcKudzu消化包含来自实施例1的启动子、结构基因和终止子的DNA片段，并进行凝胶纯化。将其连接至经过PvuII消化、SAP处理和热杀灭的pCL1920。将得到的连接混合物转化进TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，选择了两个。pCL PtrcKudzu和pCL PtrcKudzu(A3)具有方向相反的插入片段(图32-35)。
vi)p CL PtrcKudzu yIDI的构建
将来自上述(ii)的NsiI-PstI消化的、凝胶纯化的IDI PCR扩增子连接进已经过PstI消化、SAP处理、和热杀灭的pCL PtrcKudzu。将连接混合物转化进TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，得到的质粒被称作pCL PtrcKudzu yIDI(图36和37)。
vii)p CL PtrcKudzu DXS的构建
将来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的、凝胶纯化的DXS PCR扩增子连接进已经过PstI消化、SAP处理、和热杀灭的pCL PtrcKudzu(A3)。将连接混合物转化进TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，得到的质粒被称作pCL PtrcKudzu DXS(图38和39)。
II.以不同拷贝数表达野葛异戊二烯合酶、idi、和/或dxs的培养物的顶空中的异戊二烯的测定
之前经过质粒pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-yIDI kan(B)、pTrcKudzu-DXS kan(C)、pTrcKudzu-yIDI-DXS kan(D)转化的大肠杆菌BL21(λDE3)的培养物生长于含有50μg/mL卡那霉素的LB中。pCLPtrcKudzu(E)、pCL PtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-yIDI(F)和pCLPtrcKudzu-DXS(G)生长于含50μg/mL壮观霉素的LB中。在时间0点(OD600是约0.5)以400μM IPTG诱导培养物，取出样品以进行顶空异戊二烯测定(见实施例1)。结果显示于图23A-23G。
通过转化将质粒pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)导入大肠杆菌菌株BL21。得到的菌株BL21/pTrc Kudzu IDI DXS在20℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB中过夜生长，并用于接种摇瓶中的含有1％葡萄糖的TM3(13.6gK2PO4，13.6g KH2PO4，2.0g MgSO4*7H2O，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8并以水定容，过滤除菌)。将培养瓶在30℃温育直至达到OD600为0.8，然后以400μM IPTG诱导。在诱导后的不同时间取出样品并按照实施例1的描述测定顶空中的异戊二烯的量。结果显示于图23H。
III.在大肠杆菌/pTrcKudzu yIDI DXS中从生物质生产异戊二烯
测定了菌株BL21pTrcKudzuIDIDXS从三种类型的生物质：甘蔗渣、玉米秸秆和软木浆生产异戊二烯的能力，葡萄糖作为对照。通过酶促水解制备生物质的水解物(Brown，L和Torget，R.，1996，NREL标准测定法Lap-009“Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic生物质”)，以基于葡萄糖当量的稀释度使用。在本例中，葡萄糖当量等于1％的葡萄糖。来自BL21(DE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的新鲜转化的细胞的平板的单一菌落用于接种5ml LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在25℃振荡温育过夜。次日，在25ml TM3+0.2％YE+1％原料中，将过夜培养物稀释至OD600＝0.05。原料是玉米秸秆、甘蔗渣、或软木浆。葡萄糖用作阳性对照，无葡萄糖的状况用作阴性对照。培养物在30℃在180rpm振荡温育。监测培养物的OD600，当其达到OD600＝～0.8时，按照实施例1的描述分析1小时和3小时之时培养物的异戊二烯生产。不诱导培养物。所有的包含添加的原料的培养物生产与葡萄糖阳性对照相等的异戊二烯。实验按照一式两份进行，显示于图40。
IV.在大肠杆菌/pTrcKudzuIDIDXS中从转化糖生产异戊二烯
来自BL21(λDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的新鲜转化的细胞的平板的单一菌落用于接种5mL LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在25℃振荡温育过夜。次日，在25ml TM3+0.2％YE+1％原料中，将过夜培养物稀释至OD600＝0.05。原料是葡萄糖、转化糖或玉米秸秆。通过酶促处理蔗糖糖浆制备转化糖原料(Danisco转化糖)。按照下文的描述(第V部分)制备AFEX玉米秸秆。细胞在30℃生长，当培养物达到OD600为～0.8-1.0时(0小时)，测定第一个样品。按照实施例1的描述，在0、1和3小时分析培养物的生长(如通过OD600所测定)和异戊二烯的生产。结果显示于图41。
V.从AFEX预处理的玉米秸秆制备水解物
从Michigan Biotechnology Institute获得AFEX预处理的玉米秸秆。预处理条件是：60％的水分，1∶1的氨载量，在90℃持续30分钟，然后气干。AFEX预处理的玉米秸秆中的水分含量是21.27％。AFEX预处理的玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖的含量分别是31.7％和19.1％(干重)。糖化过程如下：将20g AFEX预处理的玉米秸秆加入到500ml培养瓶中，瓶中含有5ml 1M柠檬酸钠缓冲液pH 4.8、2.25ml Accellerase 1000、0.1mlGrindamyl H121(来自面包制作工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)、和72.65ml DI水。将培养瓶置于定轨振荡器上并在50℃温育96小时。从振荡器中取出1个样品并使用HPLC分析。水解物含有38.5g/l葡萄糖、21.8g/l木糖、和10.3g/l葡萄糖和/或木糖的低聚物。
VI.酵母提取物对于生长于补料分批培养物中的大肠杆菌生产异戊二烯的效应
按照之前的描述，使用含有如上所述的pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞以14升的规模进行发酵。以指数速率进料酵母提取物(BioSpringer，Montreal，Quebec，Canada)。在40小时的发酵过程中，输送进入发酵罐的酵母提取物的总量是70-830g。在550nm的波长下测定发酵液的光密度。发酵罐内的最终的光密度与加入的酵母提取物的量成比例(图42A)。按照之前的描述测定来自发酵罐的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程而增大(图42B)。所生产的异戊二烯的量与进料的酵母提取物的量成线性比例(图42C)。
VII.在pTrcKudzu DXS yIDI的500L发酵中生产异戊二烯
含有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞(大肠杆菌BL21(λDE3)pTrc Kudzu dxs yidi)的500升发酵用于生产异戊二烯。经15小时的时间段，异戊二烯的水平介于50至300μg/L。基于平均异戊二烯浓度、流经设备的平均流和异戊二烯突破程度，经计算，所收集的异戊二烯的量是约17g。
VIII.生长于补料分批培养物中的大肠杆菌的500L发酵生产的异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分同时加入并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。以氨气(NH3)将pH调节至7.0，并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g和抗生素，并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器过滤除菌。
在500L的生物反应器中以含有pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃时从葡萄糖和酵母提取物形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株的接种物。接种物生长至OD0.15(在550nm测定)后，使用20ml接种含有2.5L大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的生物反应器。在该生物反应器中在30℃生长至OD 1.0，将2.0L转移至500L的生物反应器。
以指数速率进料酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)和葡萄糖。在50小时的发酵过程中输送进入生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别是181.2kg和17.6kg。生物反应器中的光密度随时间的变化显示于图43A。按照之前的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程而增加(图43B)。在50小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是55.1g，生产的时间进程显示于图43C。
实施例8：黄素氧还蛋白I(fldA)的过表达会增加过表达大肠杆菌dxs、酵母菌idi和野葛异戊二烯合酶的菌株中的异戊二烯生产
与IPTG诱导条件相比，携带pTrcKudzuDXSyIDI的BL21(DE3)菌株在非诱导条件下会生产更多的异戊二烯，并观察到积累HMBPP((E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯)，即HDS(GcpE或IspG)的底物。使用携带pTrcKudzuDXSyIDI的BL21(DE3)菌株作为亲代宿主菌株，评估了野葛异戊二烯合酶基因(单独的，和与编码黄素氧还蛋白I的fldA基因组合的)的额外的质粒携带的拷贝的导入对菌株在非诱导条件下的异戊二烯生产的影响(相对于空载体对照菌株)。
这些实验研究了异戊二烯合酶的额外拷贝是否会提高携带pTrcKudzuDXSyIDI构建体的BL21(DE3)菌株在非诱导条件下的异戊二烯生产。在非诱导条件下，异戊二烯合酶可能是限制性的，且野葛酶的额外拷贝可能能够提高菌株的异戊二烯生产的比生产率。所述实验还研究了其它因素是否会促进菌株生产的异戊二烯的适度水平，以及质粒携带的fldA拷贝是否会增加携带pTrcKudzuDXSyIDI构建体的BL21(DE3)菌株在非诱导条件下的异戊二烯生产。由fldA编码的黄素氧还蛋白I的表达水平(与pTrcHgSfldA/pBAD33构建体异位地表达)超过了内源fldA基因座所产生的水平。增加的量的黄素氧还蛋白I可以增加DXP途径酶GcpE(HDS或IspG)和LytB(HDR或IspH)在体内表现出的活性，正如以前在体外所看到的(Seemann，M.等人Agnew.Chem.Int.Ed.，41：4337-4339，2002；Wolff，M.等人FEBS Letters，541：115-120，2003)，且可能提高目标菌株中供异戊二烯合成的碳通量，超过相当的含有pTrcKudzuDXSyIDI的BL21(DE3)对照菌株的碳通量。
使用标准方法(Sambrook等人)(它通过引用整体并入本文，尤其是关于细菌转化)，进行细菌转化和分子生物学技术。从Invitrogen得到大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TOP10。在下述的制备pTrcHgS/pBAD33和pTrcHgSfldA/pBAD33构建体的过程中，使用TOP10细胞。经由化学转化，将载体构建体转化进BL21(DE3)菌株中，用于以后评估异戊二烯生产。
构建体
正向引物
名称：5’fldA NsiI SpeI核糖体结合序列
序列：GG ATGCAT ACTAGT TTCA AGAGG TATTTCACTC ATG(SEO IDNO：54)
特征：NsiI SpeI核糖体结合序列起点
A                          G
与MG1655 fldA基因座同源的区域
引物购自Integrated DNA Technologies(Coralville，Iowa)。根据生产商的说明书，用Herculase II Fusion(Stratagene)进行PCR反应。
反向引物
名称：3’fldA PstI停止
序列：ATC CTGCAG TCA GGCATTGAGAATTTCGTC(SEQ ID NO：55)
特征：PstI停止
T                           C
与MG1655 fldA基因座同源的区域
引物购自Integrated DNA Technologies(Coralville，Iowa)。根据生产商的说明书，用Herculase II Fusion(Stratagene)进行PCR反应。
大肠杆菌12MG1655(环球网地址为：genome.wisc.edu/resources/strains.htm)是用于扩增fldA基因座的基因组模板的来源；使用无菌牙签，将细胞直接地加入PCR反应物中。
使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)，清洁fldA PCR产物。pBAD33描述在，例如，Luz-Maria，G.等人，J.Bacteriology，77：4121-4130，1995，它们通过引用整体并入本文，尤其是关于pBAD33。pTrcKudzu和pTrcKudzuDXSyIDI kan描述在，例如，美国申请号12/335,071和PCT/US2008/086809，它们通过引用整体并入本文，尤其是关于实施例1和7。
在这里，通过将SspI-PstI(1934碱基对)片段(其含有Trc启动子区、核糖体结合序列和源自pTrcKudzu的野葛异戊二烯合酶的编码序列)克隆进pBAD33的SmaI-PstI位点中，构建pTrcHgS/pBAD33。
在这里构建了pTrcHgSfldA/pBAD33。将NsiI-PstI(1471碱基对)消化的PCR扩增的fldA片段(其包括在fldA起点上游的22个碱基对，包括内源核糖体结合序列至fldA基因的终止密码子)克隆进在pTrcHgS/pBAD33中位于异戊二烯合酶开放读码框下游紧邻处的PstI位点。
通过用Sequetech(Mountain View，California)进行的测序，验证构建体。
培养条件
在LB 1.5％琼脂平板上，和在补充了终浓度为0.1％酵母提取物和1.0％葡萄糖的TM3液体培养基(TM3的描述参见，例如，美国申请号12/335,071和PCT/US2008/086809，它们通过引用整体并入本文，尤其是关于TM3液体培养基)中，在25℃和30℃培养细菌。在适宜时，将分别在50μg/ml和10μg/ml的卡那霉素(Kan)和/或氯霉素(Cmp)加入生长培养基中；基于pTrc的构建体编码KanR，基于pBAD33的构建体编码CmpR。通过在600nm测得的光密度，监测细菌生长。
异戊二烯生产的评估
异戊二烯生产的顶空试验如实施例1所述。将每个菌株的比生产率报告为μg/L·OD·小时；记录试验瓶中1900μl顶空：100μl培养液之比。使用Microsoft Office Excel 2003软件，制备描绘每个菌株的生长速率和比生产率的图。
BL21(DE3)菌株的构建和异戊二烯生产的评估
构建下述的BL21(DE3)菌株，并相对于彼此评估异戊二烯生产：BL21(DE3)携带pTrcKudzuDXSyIDI载体和下述任一个：1)空的pBAD33载体(也称作“空载体”)；2)pTrcHgS/pBAD33构建体(也称作“HgS”)，或3)pTrcHgSfldA/pBAD33构建体(称作“HgS-FldA”)。
所有3个BL21(DE3)实验菌株携带KanR和CmpR，并在两个质粒构建体的适当选择下生长。空载体菌株代表亲代对照菌株；HgS菌株代表携带野葛异戊二烯合酶基因的额外的质粒携带的拷贝的亲代菌株；HgS-FldA菌株代表携带黄素氧还蛋白I的额外的质粒携带的拷贝和异戊二烯合酶基因的亲代菌株。
在10ml含有抗生素的补充的TM3培养基中，在25℃摇动(250rpm)培养细菌菌株过夜；在这里和对于以后的实验，在生长培养基中存在50μg/ml卡那霉素和10μg/ml氯霉素。然后将培养物稀释进含有抗生素的新鲜补充的TM3培养基中，至在600nm的光密度为约0.05，并在250ml锥形瓶中，在12.5-25ml含有抗生素的补充的TM3培养基中，在30℃摇动(250rpm)培养。一旦培养物在600nm的光密度达到0.4，通常评估菌株的异戊二烯生产。在最密集地取样的实验中，一旦开始异戊二烯测量，以45分钟间隔检测每个培养物的异戊二烯生产。在图46A-46D中显示了来自2个独立实验的结果，它们描绘了空载体(对照)、HgS和HgS-FldA菌株的生长速率和异戊二烯生产的比生产率。在非诱导条件下培养菌株；这意味着，不进行Trc启动子调节的基因构建体的IPTG-诱导的表达。在这里所述的实验中，由IPTG-可诱导的Trc启动子控制所有质粒携带的目标基因。本领域熟知，Trc启动子在没有IPTG诱导物存在下是有活性的。
在测试的非诱导条件下，从在空载体、HgS和HgS-FldA菌株上进行的异戊二烯顶空试验得到的结果表明，在pTrcHgSfldA/pBAD33构建体上存在的fldA的额外拷贝会大幅增加HgS-FldA菌株的异戊二烯生产，超过HgS和空载体对照菌株的产量。在2个独立实验中，在3.75小时和2.5小时时间段内，观察到HgS-FldA菌株表现出增加的异戊二烯生产的比生产率，比对照菌株分别高了1.5-1.9倍和1.3-1.8倍。观察到的对异戊二烯生产的影响似乎对含有fldA的构建体的存在是特异性的，因为HgS菌株在非诱导条件下生产与空载体对照菌株相当水平的异戊二烯。
实施例9：来自Thermosynechococcus elongatus BP-1的替代性的ispG(gcpE或HDS)和ispH(lytB或HDR)和它们的对应的还原穿梭系统在异戊二烯生产大肠杆菌中的表达会提高异戊二烯生产
在该实施例中，我们证实了来自T.elongates的铁氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP氧化还原酶/NADPH还原系统以及GcpE和LytB酶会提高大肠杆菌BL21(DE3)的异戊二烯生产。
象大肠杆菌一样，T.elongatus会经由DXP途径合成类异戊二烯，但是不携带任何编码黄素氧还蛋白蛋白的基因。以前证实，植物GcpE酶是铁氧还蛋白-依赖性的酶，且黄素氧还蛋白不会支持该酶将cMEPP(ME-CPP)酶促转化成HDMAPP(HMBPP)(参见Seemann等人，FEBSLett.，580(6)：1547-52(2006)，它通过引用整体并入本文)。还在体外证实，T.elongatus的GcpE以及PetF(铁氧还蛋白)、Pet H(铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶)和NADPH可以将cMEPP转化成HDMAPP(Okada和Hase，J Biol Chem，280(21)：20627-9(2005))，它通过引用整体并入本文)。由于在基因组中缺少除了铁氧还蛋白以外的其它小电子载体蛋白，T.elongatus的LytB也可能利用相同的还原穿梭系统作为GcpE。
来自T.elongatus BP-1的GcpE、PetF和PetH的过表达导致REM23-26中增加的异戊二烯生产和升高的cMEPP水平的证实
我们以前已经证实，增加的dxs表达会增加大肠杆菌中经过DXP途径的通量。通过将GI 1.X-启动子系列整合在大肠杆菌BL21(DE3)基因组内dxs基因座上游紧邻处，构建了携带增加的和改变的dxs表达水平的异戊二烯生产菌株(REM19-22)。随后，通过用表达T.elongatus GcpE和它的对应的由petf和petH编码的还原穿梭系统的质粒进行转化，建立菌株实验组REM23-26。评价了亲代菌株和实验菌株的生长、异戊二烯生产和DXP途径代谢物的存在。结果如图47-49所示。
MCM16、MCM640、MCM639、MCM641以及REM19-22的亲代菌 株的构建
根据生产商的说明书，使用来自Gene Bridges GmbH的Red/ET系统，进行在该实施例中描述的GI 1.X-启动子插入和随后的抗生素抗性标志物的环出。使用菌株BL21(DE3)(Invitrogen)。
引物序列
MCM319：5’-ctctctttcggcaacagtcgtaactcctgggtggagtcgaccagtgccagggtcgggtatttggcaatatcaaaactcatatattccaccagctatttgttagtgaataaaagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatNgtcaagggctaatacgactcactatagggctc(SEQ ID NO：57)。
简并的N碱基：A碱基产生GI 1.6-，T碱基产生GI 1.5-，G碱基产生GI1.2-，且C碱基产生GI 1.0-启动子。
MCM320：5’-tcgatacctcggcactggaagcgctagcggactacatcatccagcgtaataaataaacaataagtattaataggcccctgaattaaccctcactaaagggcgg(SEQ ID NO：58)。
MCM327：5’-TTGTAGACATAGTGCAGCGCCA(SEQ ID NO：59)。
GB-DW：5’-aaagaccgaccaagcgacgtctga(SEQ ID NO：60)。
用于制备MCM638-641菌株的策略
在图50中显示了用于将GI1.X-启动子系列插入在dxs前面的策略。使用引物集合MCM319/MCM320，通过PCR，扩增抗生素抗性盒GB-NeoR。引物含有50个与在dxs编码区的5’侧紧邻的区域具有同源性的碱基，以允许在有pRed-ET质粒存在下在电穿孔PCR产物以后在特定基因座处重组。
删除盒的扩增
为了扩增用于插入在dxs基因座上游紧邻处的GI 1.X-启动子的GB-NeoR盒，设计了下述的PCR反应：
1ul(100ng GB-NeoR)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)MCM319
1.25ul引物(10uM)MCM320
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数
95℃x 2分钟，[95℃x 20秒，55℃x 20秒，72℃x 50秒]x 30个循环；72℃x 3分钟，4℃直到冷却(BioRadPCR机器)。
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。得到的储备物是GB-NeoR-GI 1.X-dxs片段。
将GB-NeoR-GI 1.X-dxs PCR产物整合进BL21(DE3)/pRed-ET菌株中
通过电穿孔，将pRed-ET载体(Gene Bridges试剂盒)转化进BL21(DE3)中，得到菌株MCM327(BL21(DE3)/pRed-ET)。将约500ngGB-NeoR-GI 1.x-dxs PCR片段电穿孔进MCM327中。通过在37℃在200rpm摇动，回收在L培养液中的转化体1小时，然后涂布在含有卡那霉素(10μg/ml)的L琼脂上。使用引物GB-DW/MCM327，通过PCR，分析卡那霉素抗性的菌落中GB-NeoR盒和GI 1.X-启动子的存在。使用MCM327和GB-DW引物(Quintara；Berkeley，CA)和鉴别的不同的目标GI 1.X-dxs菌株，对来自许多转化体(MCM617-625)的PCR片段测序。正确的菌株被命名为MCM617(FRT-neo-FRT-GI 1.0-dxs)、MCM618(FRT-neo-FRT-GI1.5-dxs)、MCM623(FRT-neo-FRT-GI 1.2-dxs)和MCM625(FRT-neo-FRT-GI 1.6-dxs)。根据生产商的说明书，使用来自RED/ET试剂盒的pCP20，使卡那霉素抗性盒环出菌株。通过卡那霉素(10μg/ml)抗性的缺失和PCR，验证转化体，从而证实GB-NeoR盒的环出。得到的菌株被命名为MCM638(BL21(DE3)GI 1.0-dxs)、MCM639(BL21(DE3)GI1.5-dxs)、MCM640(BL21(DE3)GI 1.2-dxs)和MCM641(BL21(DE3)GI1.6-dxs)。
分别来自MCM638、MCM640、MCM639和MCM641的亲代菌株REM19-22的构建
使用标准的分子生物学技术(Sambrook等人，1989，它通过引用整体并入本文)，构建在该实施例中描述的T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5。以前已经描述了pBBR1MCS-5质粒(Kovach等人，Biotechniques，16(5)：800-2(1994)，它通过引用整体并入本文，尤其是关于pBBR1MCS的克隆)。在图51中显示了描绘得到的质粒构建体的图像。使用MCM638-641菌株进行这里所述的转化。
引物序列
针对lacI MEARR T7 frag的5’KpnI：5’-GCTGGGTACCCTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCT(SEQ IDNO：61)
针对T7终止子MEARR T7 frag的3’SpeI：5’-标签AACTAGTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAG(SEQ ID NO：62)
M13正向(-20)：5’-GTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：63)
EL-1000：5’-GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC(SEQ ID NO：64)
A-rev：5’-CTCGTACAGGCTCAGGATAG(SEQ ID NO：65)
A-rev2：5’-TTACGTCCCAACGCTCAACT(SEQ ID NO：66)
用于建立REM19-22菌株的策略
T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5电穿孔进菌株MCM638-641中。携带控制着MEARR alba等位基因MD09-173(BL21(DE3)pLysS、pET24a-P.alba(MEA)未标记的(pDu39))的T7聚合酶的载体构建体被用作PCR模板。
T7-MEARR alba片段的扩增
为了扩增用于克隆进pBBR1MCS-5质粒中的T7-MEARR alba片段，进行下述的PCR反应：
1ul(大约120ng MDO9-173)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul针对lacI MEARR T7frag的引物(10uM)5’KpnI
1.25ul针对T7终止子MEARR T7frag的引物(10uM)3’SpeI
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion。
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，63℃x 30秒，72℃x 3分钟]x 29循环；72℃x 5分钟，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)。
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。得到的储备物是T7-MEARR alba片段。
T7-MEARR alba片段克隆进pBBR1MCS-5中
根据生产商的说明书，用KpnI和SpeI(Roche)消化约600ngT7-MEARR alba片段和200ng pBBR1MCS-5质粒。随后使用QiagenQiaQuick凝胶提取试剂盒，组合和清洁消化物。根据生产商建议的方法，使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)，连接约1/4至1/3的清洁的切割的DNA。使用标准的热休克方法(参见，例如，Sambrook等人，1989，它通过引用整体并入本文)，用连接反应物转化化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在L培养液中恢复1小时，然后涂布在含有庆大霉素(10μg/ml)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL，在40μg/ml；Sigma)的L琼脂上。选择白色的庆大霉素抗性的菌落，在含有庆大霉素(10μg/ml)的L培养液中培养过夜，次日收获，用于质粒制备。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒，分离质粒构建体，并首先通过限制性酶消化和电泳(如上所述)，分析T7-MEARR alba片段的假定存在。使用引物M13正向(-20)、EL-1000、A-rev和A-rev2，对目标质粒制品测序(Sequetech；Mountain View，CA)，鉴别正确的T7-MEARRalba/pBBR1MCS-5克隆。
T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5转化进MCM638-641中
为了构建异戊二烯生产菌株REM19-22，通过电穿孔进MCM638-641中，转化T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5质粒。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有庆大霉素(10μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为：REM19(MCM638/T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5)、REM20(MCM640/T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5)、REM21(MCM639/T7-MEARRalba/pBBR1MCS-5)和REM22(MCM641/T7-MEARRalba/pBBR1MCS-5)。
实验菌株REM23-26的构建
通过将Ptac-gcpE-petF-petH/pK184构建体转化进MCM638、MCM640、MCM639和MCM641中，构建了REM23-26。由Gene Oracle，Inc.(Mountain View，CA)合成在该实施例中描述的质粒Ptac-gcpE-petF-petH/pK184，为在大肠杆菌中表达对gcpE、petF和petH进行了密码子优化。以前已经描述了Ptac启动子和aspA终止子序列(Genbank登录号分别是E02927和CP001164)。pK184克隆载体已经描述在，例如，Jobling和Holmes，Nucleic Acids Res.18(17)：5315-6(1990)，它通过引用整体并入本文，尤其是关于pK184克隆载体。在图52中显示了描绘得到的质粒构建体的图像。REM19-22菌株用于本文所述的转化。
用于建立REM23-26菌株的策略
Ptac-gcpE-petF-petH/pK184电穿孔进菌株REM19-22中。由GeneOracle，Inc.提供Ptac-gcpE-petF-petH/pK184的质粒制备。
Ptac-gcpE-petF-petH/pK184转化进REM19-22中
为了构建异戊二烯生产实验菌株REM23-26，通过电穿孔进REM19-22中，转化Ptac-gcpE-petF-petH/pK184质粒。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有卡那霉素(10μg/ml)和庆大霉素(10μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为：REM23(REM19/Ptac-gcpE-petF-petH/pK184)、REM24(REM20/Ptac-gcpE-petF-petH/pK184)、REM25(REM21/Ptac-gcpE-petF-petH/pK184)和REM26(REM22/Ptac-gcpE-petF-petH/pK184)。
分析REM19-26的生长、异戊二烯生产和DXP代谢物产生
在摇瓶异戊二烯顶空试验中以及在DXP代谢物测定研究中，将亲代菌株REM19-22与实验菌株REM23-26进行了对比。在图47和48中，解释了表达T.elongatus GcpE酶对大肠杆菌宿主的DXP代谢物产生和异戊二烯生产的益处。
生长
在30℃在补充了终浓度0.1％酵母提取物和1.0％葡萄糖且包含卡那霉素(10μg/ml)和庆大霉素(10μg/ml)的TM3液体培养基(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0g MgSO4*7H2O)，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调至pH 6.8，并加入适量H20，并过滤除菌)中，培养菌株REM19-26。通过记录使用Eppendorf Biophotometer波谱仪(Eppendorf)测得的培养物在600nm的每个光密度，定期监测生长。
异戊二烯生产
使用顶空试验，分析异戊二烯生产。对于摇瓶培养物，将1ml培养物从摇瓶转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶目录号51882753；帽目录号5188 2759)。旋紧帽，在250rpm摇动下，在相同温度温育瓶。30分钟以后，从培养箱取出瓶，并分析。使用连接了CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这些条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至200μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。将每个菌株的比生产率报告为μg/L OD小时。应当指出，温育30min的试验瓶中1900ul顶空∶100ul培养液之比导致下述的异戊二烯μg/L培养物向比生产率的转化：(通过GC-MS测得的异戊二烯/L)X(38)/(培养物的OD 600nm)。
DXP代谢物积累
分离了如上面所述和在图48中描绘的生产异戊二烯的亲代菌株和实验菌株(分别是REM19-22和REM23-26)的DXP代谢物，并如下定量：
代谢物定量
通过将3.5mL培养物放入装有3.5mL干冰冷却的甲醇的试管中，快速灭活细胞代谢。通过离心，沉淀出细胞碎片，并将上清液装载上含有30mg吸附剂的Strata-X-AW阴离子交换柱(Phenomenex)。重新提取沉淀物2次，第一次使用3mL含有1mM NH4HCO3缓冲液(pH＝7.0)的50％MetOH，第二次使用3mL 75％MetOH/1mM NH4HCO3缓冲液(pH＝7.0)。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，并将上清液连续地装载上相同的阴离子交换柱。在提取和离心步骤中，保持样品低于+4℃。在代谢物洗脱之前，用水和甲醇(各1mL)洗涤阴离子交换柱，并通过加入0.35mL浓NH4OH/甲醇(1∶14，v/v)、然后加入0.35mL浓NH4OH/水/甲醇(1∶2∶12，v/v/v)混合物，洗脱分析物。用30μL冰醋酸中和洗脱液，并通过在微型离心机中离心，进行澄清。
代谢物定量
使用Thermo Scientific TSQ Quantum Access质谱仪(ThermoElectron Corporation，San Jose，CA)，分析代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行所有系统控制、数据获取和质谱数据评价。对于LC-ESI-MS/MS方法，用表1所示的流动相梯度(流速为0.4mL/min)，洗脱配有CC 8/4 Nucleodex β-OH保护筒的手性的Nucleodex β-OH 5μM HPLC柱(100x 2mm，Macherey-Nagel，德国)。样品注射体积是10μL。
表1.用于洗脱代谢物的HPLC梯度。
Figure BDA0000135516370001191
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：245.0(对于IPP和DMAPP)，381.1(对于FPP)，213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，260.0(对于HDMAPP)，和277.0(对于cMEPP)。基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。通过注射购自Echelon BiosciencesInc.的对应标准品，得到校正曲线。基于下述假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
证实T.elongatus BP-1的GcpE、LytB PetF和PetH的过表达会增加 REM31和REM29中的异戊二烯生产
我们已经证实，增加的dxs表达允许增加大肠杆菌内经过DXP途径的通量，而idi基因的额外过表达会显著增加下游类异戊二烯的生产。为了证实表达非黄素氧还蛋白-依赖性的GcpE和LytB酶对经过内源大肠杆菌DXP途径至异戊二烯合成的碳通量的益处，构建了具有dxs和酵母IDI酶的组成型表达的大肠杆菌BL21(DE3)异戊二烯生产菌株。BL21(DE3)GI1.6-dxs菌株MCM641如上所述。携带酵母IDI酶的载体构建体(pDU9-pET-16b rev-yIDI)的构建如本文所述。含有T7-(-3)alba/pBBR1MCS-5和T7-MTE alba/pBBR1MCS-5银白杨异戊二烯合酶的构建体如下面所述。建立了一组源自MCM641的亲代的生产异戊二烯的、过表达IDI的菌株(REM H76和REMH86)，以对比新产生的实验组菌株(REM31和REM29)，它们携带T.elongatus GcpE、LytB和它们的对应的还原穿梭系统(下面描述)。评价了亲代菌株和实验菌株的生长、异戊二烯生产和DXP途径代谢物的存在。结果描绘在图49中。
pDU-9的构建
将来自酿酒酵母的IPP异构酶(yIDI)克隆进载体pET16b(Invitrogen)中。使用模板DNA pTrcKudzu yIDI Kan，使用引物集合Hg-yIDI-R2/Hg-yIDI-F2进行PCR。PCR循环条件：
PCR反应
1ul模板(pMVK1-Fernando氏模板)
5ul 10X PfuII Ultra缓冲液
1ul dNTP
1ul引物(50uM)Hg-MVK-F2-NdeI
1ul引物(50uM)Hg-yIDI-R2
40ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的Pfu UltraII Fusion DNA聚合酶
循环参数：
(95℃ 2分钟，95℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃ 21秒，29X，72℃ 3分钟，4℃直到冷却，使用Eppendorf Mastercycler梯度仪器)
根据生产商的建议，使用QiaQuick PCR纯化试剂盒，纯化PCR产物。将5μL纯化的PCR产物的等分试样连接至事先用NdeI-SAP(虾碱性磷酸酶)消化的、使用T4连接酶(NEB)处理过的Invitrogen pET-16b载体上。在16℃进行连接过夜。
将5μL过夜连接混合物导入Invitrogen TOP10细胞中，并在含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上选择转化体，在37℃温育。使用QiaQuickspin miniprep试剂盒，分离来自转化体的质粒。使用T7启动子和T7终止子(使用Quintara Bio Sequencing Service)，对插入序列测序。得到的质粒r称作pDu-9。
验证序列以后，根据生产商的说明书，将1ul质粒pDu-9转化进BL21(DE3)pLysS hst菌株。在含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂平板上选择转化体，并在37℃温育。
引物序列
Hg-yIDI-R2 5’...cagcagcagGGATCCgacgcgttgttatagca(SEQID NO：111)
Hg-yIDI-F2 5’...cagcagcagCATATGactgccgacaacaatag(SEQID NO：112)
REMD76(MCM641/pDU9-pET-16b rev-yIDI)、REMH76和REMH86 (分别是REMD76/T7-(-3)alba/pBBR1MCS-5和REMD76/T7-MTE  alba/pBBR1MCS-5)的构建
建立REMD76的策略
将pDU9-pET-16b rev-yIDI电穿孔进MCM641中。
pDU9-pET-16b rev-yIDI转化进MCM641中
为了建立BL21(DE3)GI 1.6-dxs yIDI-过表达的菌株REMD76，通过电穿孔，将表达酵母IDI(yIDI)等位基因的pDU9-pET-16b rev-yIDI质粒转化进MCM641中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。选择羧苄西林抗性的菌落，并命名为REMD76。
亲代菌株REMH76和REMH86的制备(分别是REMD76/T7-(-3) alba/pBBR1MCS-5和REMD 76/T7-MTE alba/pBBR1MCS-5)
使用标准的分子生物学技术(参见，例如，Sambrook等人，1989)，构建在该实施例中所述的T7-(-3)alba/pBBR1MCS-5和T7-MTEalba/pBBR1MCS-5构建体。以前已经描述了pBBR1MCS-5质粒(参见，Kovach等人，Biotechniques，16(5)：800-2(1994)，它通过引用整体并入本文，尤其是关于pBBR1MCS-5质粒)。描绘得到的质粒构建体的图像如图53所示。将REMD76菌株用于本文所述的转化。
用于建立REMH76和REMH86菌株的策略
T7-(-3)alba/pBBR1MCS-5和T7-MTE alba/pBBR1MCS-5电穿孔进菌株REMD76中。将携带T7聚合酶控制的(-3)和MTE alba等位基因pDU47-3-pET24a-P.alba(-3)和未标记的pDU42pET24a-P.alba-MTE的载体构建体用作PCR模板。
引物序列
针对lacI MEARR T7 frag的5’KpnI：5’-GCTGGGTACCCTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCT(SEQ IDNO：67)
针对T7终止子MEARR T7 frag的3’SpeI：5’-标签AACTAGTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAG(SEQ ID NO：68)
M13正向(-20)：5’-GTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：69)
EL-1000：5’-GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC(SEQ ID NO：70)
A-rev：5’-CTCGTACAGGCTCAGGATAG(SEQ ID NO：71)
A-rev2：5’-TTACGTCCCAACGCTCAACT(SEQ ID NO：72)
T7-(-3)和T7-MTE alba片段的扩增
为了扩增用于克隆进pBBR1MCS-5质粒中的T7-(-3)和T7-MTE alba片段，进行下述的PCR反应：1ul(大约100ng pDU47-3-pET24a-P.alba(-3)或未标记的pDU42pET24a-P.alba-MTE)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul针对lacI MEARR T7 frag的引物(10uM)5’KpnI
1.25ul针对T7终止子MEARR T7 frag的引物(10uM)3’SpeI
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，63℃x 30秒，72℃x 3分钟.]x 29循环；72℃x 5分钟，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。得到的储备物是T7-(-3)alba片段和T7-MTE alba片段。
T7-(-3)alba和T7-MTE alba片段克隆进pBBR1MCS-5中
根据生产商的说明书，用来自Roche的KpnI和SpeI，消化约600ngT7-(-3)alba片段或T7-MTE alba片段和200ng pBBR1MCS-5质粒。随后组合消化物，并用Qiagen QiaQuick凝胶提取试剂盒净化。根据生产商建议的方法，使用来自New England Biolabs的T4DNA连接酶，连接约1/4至1/3的净化的切割的DNA。
使用标准的热休克方法(Sambrook等人，1989，它通过引用整体并入本文)，用连接反应物转化化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在L培养液中恢复1小时，然后涂布在含有庆大霉素(10μg/ml)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL，在40μg/ml；Sigma)的L琼脂上。选择白色的庆大霉素抗性的菌落，在含有庆大霉素(10μg/ml)的L培养液中培养过夜，并在次日收获，用于质粒制备。使用Qiagen Qiaprep SpinMiniprep试剂盒，分离出质粒构建体，并首先通过限制酶切消化和电泳(如上所述)，分析T7-(-3)alba片段或T7-MTE alba片段的假定存在。使用引物M13正向(-20)、EL-1000、A-rev和A-rev2，对鉴别出的目标质粒制品测序(Sequetech；Mountain View，CA)，并鉴别出正确的T7-(-3)alba/pBBR1MCS-5和T7-MTE alba/pBBR1MCS-5克隆。
实验菌株REM31和REM29的构建
为了建立菌株REM31和REM29，将质粒Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184转化进REMH76和REMH86中。由GeneOracle，Inc.(Mopuntain View，CA)进行在该实施例中描述的大肠杆菌对Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184的合成和密码子优化。以前已经描述了Ptac启动子和aspA终止子序列(分别是Genbank登录号E02927和CP001164)，并也合成地构建。以前已经描述了pK184克隆载体(参见，Jobling和Holmes，Nucleic Acids Res.18(17)：5315-6(1990)，它通过引用整体并入本文，尤其是关于pK184克隆载体)。在图54中显示了描绘得到的质粒构建体的图像。REMH76和REMH86菌株用于本文所述的转化。
用于建立REM31和REM29菌株的策略
Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184电穿孔进菌株REMH76和REMH86菌株中：由Gene Oracle，Inc.提供Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184的质粒制备。
Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184转化进REMH76和REMH86中
为了建立携带T.elognatus GcpE和LytB酶的异戊二烯生产实验菌株(REM31和REM29)，以相对于亲代菌株(REMH76和REMH86)评估在DXP途径通量和异戊二烯生产方面的益处，通过电穿孔，将Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184质粒转化进REMH76和REMH86中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有羧苄西林(50μg/ml)、卡那霉素(10μg/ml)和庆大霉素(10μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为：REM31(REMH76/Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184)和REM29(REMH86/Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184)。
对比REMH76和REMH86与REM31和REM29的生长和异戊二烯生 产
在摇瓶异戊二烯顶空试验中以及在DXP代谢物测定研究中，分别相对于亲代菌株REMH76和REMH86对比了实验菌株REM31和REM29。在图48中，描绘了表达T.elongatus GcpE和LytB酶对大肠杆菌宿主的异戊二烯生产的益处。
生长
在补充了终浓度0.1％酵母提取物和1.0％葡萄糖且包括羧苄西林(50μg/ml)、卡那霉素(10μg/ml)和庆大霉素(10μg/ml)的TM3液体培养基(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0g MgSO4*7H2O)，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8，并加入适量H20，并过滤除菌)中在30℃培养亲代菌株REMH76和REMH86和实验菌株REM31和REM29。通过使用Eppendorf Biophotometer波谱仪(Eppendorf)记录培养物在600nm测得的每个光密度，定期地监测生长。
异戊二烯生产
使用顶空试验，分析异戊二烯生产。对于摇瓶培养物，将1ml培养物从摇瓶转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶目录号51882753；帽目录号5188 2759)。旋紧帽，在250rpm摇动下，在相同温度温育瓶。30分钟以后，从培养箱取出瓶，并分析。使用连接了CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这些条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至200μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。将每个菌株的比生产率报告为μg/L OD小时。温育30min的试验瓶中1900ul顶空：100ul培养液之比导致下述的异戊二烯μg/L培养物向比生产率的转化：(通过GC-MS测得的异戊二烯/L)X(38)/(培养物的OD 600nm)。
DXP代谢物积累
如下所述，分离和定量如上所述的异戊二烯生产亲代菌株(REMH76和REMH86)和实验菌株(REM31和REM29)的DXP代谢物。在图48的图例中讨论了得到的数据。
代谢物提取
通过将3.5mL培养物放入装有3.5mL干冰冷却的甲醇的试管中，快速灭活细胞代谢。通过离心，沉淀出细胞碎片，并将上清液装载上含有30mg吸附剂的Strata-X-AW阴离子交换柱(Phenomenex)。重新提取沉淀物2次，第一次使用3mL含有1mM NH4HCO3缓冲液(pH＝7.0)的50％MetOH，第二次使用3mL 75％MetOH/1mM NH4HCO3缓冲液(pH＝7.0)。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，并将上清液连续地装载上相同的阴离子交换柱。在提取和离心步骤中，保持样品低于+4℃。在代谢物洗脱之前，用水和甲醇(各1mL)洗涤阴离子交换柱，并通过加入0.35mL浓NH4OH/甲醇(1∶14，v/v)、然后加入0.35mL浓NH4OH/水/甲醇(1∶2∶12，v/v/v)混合物，洗脱分析物。用30μL冰醋酸中和洗脱液，并通过在微型离心机中离心，进行澄清。
代谢物定量
使用Thermo Scientific TSQ Quantum Access质谱仪(ThermoElectron Corporation，San Jose，CA)，分析代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行所有系统控制、数据获取和质谱数据评价。对于LC-ESI-MS/MS方法，用表1所示的流动相梯度(流速为0.4mL/min)，洗脱配有CC 8/4 Nucleodex β-OH保护筒的手性的Nucleodex β-OH 5μM HPLC柱(100x 2mm，Macherey-Nagel，德国)。样品注射体积是10μL。
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：245.0(对于IPP和DMAPP)，381.1(对于FPP)，213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，260.0(对于HDMAPP)，和277.0(对于cMEPP)。基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。通过注射购自Echelon BiosciencesInc.的对应标准品，得到校正曲线。基于下述假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
实施例10：删除大肠杆菌BL21(DE3)基因型中的iscR来提高异戊二烯生产
以前的研究表明，受损的Fe-S中心的修复和有活性的4Fe-4S中心在GcpE内的周转或再生，会在DXP-介导的类异戊二烯生物合成中部分地促成由GcpE进行的催化步骤的认识到的瓶颈。已经从工程化成过表达isc操纵子的大肠杆菌中，得到了增加水平的有关的酶LytB(
Figure BDA0000135516370001271
等人，JAm Chem Soc.126(40)：12847-55(2004)，它通过引用整体并入本文)。已经证实，由大肠杆菌isc操纵子编码的酶会在Fe-S簇生源论和维持中起作用(Tokumoto和Takahashi，J.Biochem.，130：63-71(2001)；Djaman等人，J.of Biol.Chem.，279(43)：44590-44599(2004)，它们各自通过引用整体并入本文)。在大肠杆菌中过表达isc操纵子以制备增加水平的含有有活性的4Fe-4S簇的酶(例如GcpE和LytB)的一个替代方案是，去除抑制isc操纵子表达的IscR转录阻遏蛋白(Schwartz等人，PNAS，98(26)：14751-3(2001)，它通过引用整体并入本文)。最近证实，这样的方案对于在大肠杆菌BL21(DE3)中表达梭菌属氢化酶而言是成功的(Akhtar和Jones，Appl.Microbiol.Biotechnol.78(5)：853-62(2008)，它通过引用整体并入本文)。
在该实施例中，我们证实了从大肠杆菌BL21(DE3)基因组中去除iscR会显著提高异戊二烯生产，超过对应的野生型菌株的生产。
从BL21(DE3)/pRed/ET中删除iscR
根据生产商的说明书，使用来自Gene Bridges GmbH的Red/ET系统，进行在该实施例中描述的基因删除和随后的抗生素抗性标志物的环出。使用了菌株BL21(DE3)(Invitrogen)。
使用的引物序列
顶部iscR删除：5’-GGGCGAGTTTGAGGTGAAGTAAGACATGAGACTGACATCTGAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC(SEQ ID NO：80)
底部iscR删除：5’-TTCTTTTTATTAAGCGCGTAACTTAACGTCGATCGCGTCTTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCA(SEQ ID NO：81)
上iscR的5’放大(screen up)：5’-AGCCAGGAGTTGAATATCCTG(SEQ ID NO：82)
下iscR的3’缩小(screen down)：5’-TGATGGACACGAGGATGGTGT(SEQ ID NO：83)
用于建立删除菌株的策略
在图61中显示了用于删除iscR的策略。使用引物集合顶部iscR删除/底部iscR删除(对于iscR基因座的删除)，通过PCR，扩增抗生素抗性盒GB-CmR。所述引物含有50个与侧接iscR基因的区域具有同源性的碱基，以允许在有pRed-ET质粒存在下在电穿孔PCR产物以后在特定基因座处重组。
删除盒的扩增
为了扩增用于删除iscR的GB-CmR盒，设计下述的PCR反应：
1ul(100ng GB-CmR)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)顶部iscR删除
1.25ul引物(10uM)底部iscR删除
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，63℃x 30秒，72℃x 3min]x 29循环；72℃x 5min，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)。
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，以验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。得到的储备物被命名为GB-CmR-iscR片段。
GB-CmR-iscR产物整合进BL21(DE3)基因组中
通过电穿孔，将pRed-ET载体(Gene Bridges)转化进电感受的BL21(DE3)(Invitrogen)中，产生菌株BL21(DE3)/pRed-ET。将约500ngGB-CmR-iscR PCR片段电穿孔进BL21(DE3)/pRed-ET中。在37℃在L培养液中恢复转化体1小时，然后涂布在含有氯霉素(10μg/ml)的L琼脂上。关于GB-CmR-iscR片段对iscR的置换，通过PCR分析氯霉素抗性的菌落，其中使用引物上iscR的5’放大(screen up)/下iscR的3’缩小(screendown)。正确的菌株被命名为REM14::CMP。根据生产商的说明书，使用来自RED/ET试剂盒的pCP20，使氯霉素抗性盒从菌株环出。通过氯霉素(10μg/ml)抗性的丧失和PCR，验证转化体，从而证实GB-CmR盒的环出。得到的菌株被命名为REM14。
建立菌株REM65-1和REM4(REM12和REM13的亲代菌株)
为了分别建立异戊二烯生产菌株REM65-1和REM4菌株，用T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5构建体转化了野生型BL21(DE3)(Invitrogen)和ΔiscR菌株REM14。在图61中显示了含有异戊二烯合酶的载体T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5的图像。在实施例中描述了T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5的构建：来自Thermosynechococcuselongatus BP-1的替代性的ispG(gcpE)和ispH(lytB)和它们的对应的还原穿梭系统在异戊二烯生产大肠杆菌中的表达会提高异戊二烯生产。
T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5转化进BL21(DE3)和REM14中
为了建立异戊二烯生产菌株REM65-1和REM4菌株，通过电穿孔，将T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5质粒转化进BL21(DE3)(Invitrogen)和REM14中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有庆大霉素(10μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为：REM65-1(BL21(DE3)/T7-MEARRalba/pBBR1MCS-5和REM4(REM14/T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5)。
实验菌株REM12和REM13的构建
由DNA2.0(Menlo Park，CA)合成来自大肠杆菌的整个DXP途径，并克隆进pET24a中(参见图63)。
为了建立更高通量DXP途径的生产异戊二烯的REM12和REM13菌株，通过电穿孔，将DXP操纵子pET24a质粒转化进REM65-1和REM4中。在图63中显示了含有DXP途径酶的载体(DXP操纵子pET24a质粒)的图像。
DXP操纵子pET24a转化进REM65-1和REM4中
为了建立实验菌株REM12和REM13菌株，通过电穿孔，将DXP操纵子pET24a质粒转化进REM65-1和REM4中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有庆大霉素(10μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为：REM12(REM65-1/DXP操纵子pET24a)和REM13(REM4//DXP操纵子pET24a)。
分析REM12和REM13的生长和异戊二烯生产
在摇瓶异戊二烯顶空试验中，对比了野生型菌株REM12和否则同基因的ΔiscR菌株REM13。在图60中，解释了大肠杆菌宿主中iscR缺失原因对异戊二烯生产的益处和对生长速率的影响。
生长
在补充了终浓度0.1％酵母提取物和1.0％葡萄糖且包括卡那霉素(10μg/ml)和庆大霉素(10μg/ml)的TM3液体培养基(13.6g K2PO4，13.6gKH2PO4，2.0g MgSO4*7H2O)，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8，并加入适量H20，并过滤除菌)中在30℃培养菌株REM12和REM13。通过使用Eppendorf Biophotometer波谱仪(Eppendorf)记录培养物在600nm测得的每个光密度，定期地监测生长。在时间零点，将50uM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入培养物中，以诱导由菌株携带的异戊二烯合酶和DXP酶的表达，如图60的图例所示。
异戊二烯生产
使用顶空试验，分析异戊二烯生产。对于摇瓶培养物，将1ml培养物从摇瓶转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶目录号51882753；帽目录号5188 2759)。旋紧帽，在250rpm摇动下，在相同温度温育瓶。30分钟以后，从培养箱取出瓶，并分析。使用连接了CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这些条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至200μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。将每个菌株的比生产率报告为μg/L OD小时。应当指出，温育30min的试验瓶中1900ul顶空∶100ul培养液之比导致下述的异戊二烯μg/L培养物向比生产率的转化：(通过GC-MS测得的异戊二烯/L)X(38)/(培养物的OD 600nm)。
实施例11：
通过BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT的ΔispG和/或ΔispH菌株的互补来评价来自不同生物体的替代性的ispG(gcpE)和ispH(lytB)等位基因
我们构建了表达低等甲羟戊酸途径(来自酵母的甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶和IPP异构酶)的大肠杆菌菌株，作为测试来自异源生物体的DXP途径酶的功能性的基础菌株。如果在没有甲羟戊酸存在下培养，该菌株从低等甲羟戊酸途径生产IPP和DMAPP。通过在有甲羟戊酸存在下培养菌株，可以挽救DXP途径的酶的删除。因此，可以在含有低等MVA途径的大肠杆菌中表达异源DXP途径基因的功能性，并渴望在没有甲羟戊酸存在下培养。
MD09-170(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT的构建
引物序列
MCM 161：5’-CACCATGGTATCCTGTTCTGCG(SEQ ID NO：84)
MCM162：5’-TTAATCTACTTTCAGACCTTGC(SEQ ID NO：85)
MCM143：5’-aggaggtggtctcaaATGACTGCCGACAACAATAGTA(SEQ ID NO：86)
MCM144：
5’-aggaggtggtctcagcgctctgcagTTATAGCATTCTATGAATTTGCCTG(SEQ ID NO：87)
从MCM521(BL21 neo-PL.2-mKKDyI)制备P1噬菌体裂解物，并转导进BL21(DE3)中(根据规程12-Genetic Transduction Using P1virprotocol)。在含有卡那霉素(20μg/ml)的L琼脂平板上选择转导子，在37℃温育过夜。通过PCR，证实4个菌落是正确的转导子。选择这些菌落之一，并命名为MD09-169(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::Kan)。根据生产商的说明书，使用来自Gene Bridges GmbH的Red/ET系统的pCP20，使卡那霉素抗性标志物环出该菌株。通过测试对卡那霉素(20μg/ml)的灵敏度，证实正确的环出，然后通过PCR，验证卡那霉素抗性盒的缺失。正确的菌株被命名为MD09-170(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT)。
从MD09-170删除ispG和ispH
根据生产商的说明书，使用来自Gene Bridges GmbH的Red/ET系统，进行在该实施例中描述的基因删除和随后的抗生素抗性标志物的环出。使用了菌株MD09-170。
使用的引物序列
MQ09-18F
5’-GAACAATCACCGGCGCAGTAACAGACGGGTAACGCGGGAGATTTTTCATGaattaaccctcactaaagggcgg(SEQ ID NO：88)
MQ09-18R
5’-CGGGAAGCGAGGCGCTTCCCATCACGTTATTATTTTTCAACCTGCTGAACTAATACGACTCACTATAGGGCTCG(SEQ ID NO：89)
MQ09-19F
5’-TTTTGATATTGAAGTGCTGGAAATCGATCCGGCACTGGAGGCGTAACATGaattaaccctcactaaagggcgg(SEQ ID NO：90)
MQ09-19R
5’-ATTTTCGCATAACTTAGGCTGCTAATGACTTAATCGACTTCACGAATATCTAATACGACTCACTATAGGGCTCG(SEQ ID NO：91)
MQ09-20F 5’-cggcgcagtaacagacgggtaacgcgggagatttttcatg(SEQ IDNO：92)
MQ09-20R 5’-cgcttcceatcacgttattatttttcaacctgctgaac(SEQ ID NO：93)
MQ09-21F 5’-gaagtgctggaaatcgatccggcactggaggcgtaacatg(SEQ IDNO：94)
MQ09-21R 5’-cttaggctgctaatgacttaatcgacttcacgaatatc(SEQ ID NO：95)
用于建立删除菌株的策略
在图66中，显示了用于删除ispG和ispH的策略。使用引物集合MQ09-18F/MQ09-18R或MQ09-19F/MQ09-19R(分别对于ispG或ispH的删除)，通过PCR，扩增抗生素抗性盒GB-CmR。所述引物含有50个与侧接ispG或ispH基因的区域具有同源性的碱基，以允许在有pRed-ET质粒存在下在电穿孔PCR产物以后在特定基因座处重组。
删除盒的扩增
为了扩增用于ispG或ispH删除的GB-CmR盒，设计了下述的PCR反应：
2ul(100ng GB-CmR)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)MQ09-18F/19F
1.25ul引物(10uM)MQ09-18R/19R
2ul DMSO
32ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 20秒，55℃x 20秒，72℃x 50秒]x 29循环；72℃x 3min，
4℃直到冷却(Eppendorf Mastercycler PCR机器)
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，并根据生产商的说明书，使用Qiagen QiaQuick凝胶提取和QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。得到的储备物是：GB-CmR-ispG片段(1.593kb)～180ng/ul和GB-CmR-ispH片段(1.593kb)～165ng/ul。
GB-CmR-ispG或GB-CmR-ispH PCR产物整合进MD09-170/pRed-ET菌株中
通过电穿孔，将pRed-ET载体(Gene Bridges试剂盒)转化进MD09-170中，得到菌株MD09-170/pRed-ET。将约300-500ng GB-CmR-ispG或GB-CmR-ispH PCR片段电穿孔进MD09-170/pRed-ET中。在含有500uM甲羟戊酸(Sigma)的L培养液中在37℃回收转化体1小时，然后涂布在含有氯霉素(5μg/ml)和甲羟戊酸(MVA)(500uM)的L琼脂上。分别使用引物MQ09-20F/MQ09-20R或MQ09-21F/MQ09-21R，通过PCR，分析氯霉素抗性的菌落中GB-CmR盒的存在和ispG或ispH基因的缺失。正确的菌株被命名为MD09-209(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT-ΔispG::Cm)和MD09-210(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT-ΔispH::Cm)。根据生产商的说明书，使用来自RED/ET试剂盒的pCP20，从两种菌株环出氯霉素抗性盒。通过对氯霉素(5μg/ml)的抗性的缺失和PCR，验证转化体，从而证实GB-CmR盒的环出。
得到的菌株被命名为MD09-219(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT-ΔispG::FRT)和MD09-220(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT-ΔispH::FRT)。
来自Thermosynechococcus elongatus BP-1的等位基因与MD09-219和MD09-220的互补
为了测试来自T.elongates的gcpE和lytB基因的功能性(注解)，通过电穿孔，将表达这些构建体或来自大肠杆菌的gcpE和lytB的下述质粒转化进MD09-219和MD09-220中：
1.大肠杆菌：GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO(Kan)(阳性对照)
2.T.elong：Ptac-gcpE-petF-petH/pK184(Kan)
3.T.elong：Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184(Kan)
在含有MVA(500uM)的L培养液中回收来自1.(大肠杆菌)的转化体，并涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为MD09-219/GI1.6-gcpE-lytB-yidi/pCRII-TOPO(Kan)。
在含有MVA(500uM)和IPTG(200uM)的L培养液中回收来自2.(T.elong)或3.(T.elong)的转化体，然后涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)和IPTG(200uM)的L琼脂上。得到的菌株分别被命名为MD09-219/Ptac-gcpE-petF-petH/pK184(Kan)和MD09-219/Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184(Kan)。
在所有平板上得到了几个转化体，表明T.elongatus gcpE和lytB在大肠杆菌中是有功能的。为了证实这一点，在含有卡那霉素(50μg/ml)的L培养液(含有和不含有IPTG(200uM))中培养转化体。
GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO的构建
使用标准的分子生物学技术(参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989，它通过引用整体并入本文，尤其是关于克隆技术)，构建在该实施例中描述的GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO。在图67中显示了描绘得到的质粒构建体的图像。MD09-219和MD09-220_菌株用于本文所述的转化。
引物序列
5’EcoRI-GI 1.X-BamHI gcpE DXP oper：5’-GAG GAA TTC GCGAGC CGT CAC GCC CTT GAC NAT GCC ACA TCC TGA GCA AATAAT TCA ACC ACT AAA CAA ATC AAC CGC GTT TCC CGG AGGTAA CCG GAT CCA AGG AGA TAT ACC ATG CAT AAC CAG GCTCCA ATT CAA CGT AGA(SEQ ID NO：96)
3’PstI idi DXP操纵子：5’-ATA TCC TGC AGT TAT AGC ATT CTATGA ATT TGC CTG TC(SEQ ID NO：97)
M13正向(-20)：5’-GTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：98)
M13 Reverse(-27)：5’-CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO：99)
简并的N碱基：A碱基产生GI 1.6-，T碱基产生GI 1.5-，G碱基产生GI1.2-，且C碱基产生GI 1.0-启动子
用于构建GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO的策略
使用携带T7聚合酶控制的合成DXP操纵子(DXP操纵子pET24a)的载体构建体作为PCR模板。
GI 1.6-gcpE-lytB-yidi片段的扩增
为了扩增用于克隆进pCR-Blunt II-TOPO载体中的GI1.6-gcpE-lytB-yidi片段(在其它GI 1.X-可能性中)，进行下述的PCR反应：
1ul(大约100ng DXP操纵子pET24a)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)5’EcoRI-GI 1.X-BamHI gcpE DXP oper
1.25ul引物(10uM)3’PstI idi DXP操纵子
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，63℃x 30秒，72℃x 3.5min.]x 29循环；72℃x 5min，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)。
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。得到的储备物是GI 1.X-gcpE-lytB-yidi片段。
GI 1.6-gcpE-lytB-yidi片段克隆进pCR-Blunt II-TOPO中
使用Invitrogen的Zero BluntTOPO
Figure BDA0000135516370001362
PCR克隆试剂盒，使用建议的方法，将GI 1.X-gcpE-lytB-yidi片段克隆进pCR-Blunt II-TOPO中。使用标准的热休克方法，用2ul连接反应物转化化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)，并在L培养液中在37℃回收1小时，然后涂布在含有卡那霉素(10μg/ml)的L琼脂上。选择得到的菌落，在含有卡那霉素(10μg/ml)的L培养液中培养过夜，并在次日收获，用于质粒制备。使用QiagenQiaprep Spin Miniprep试剂盒，分离质粒构建体。使用引物M13正向(-20)和M13 Reverse(-27)，对许多质粒制品测序(Quintara；Mountain View，CA)，鉴别正确的GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO克隆。
实施例12：通过解调节葡萄糖摄取来提高大肠杆菌中的异戊二烯生产
在大肠杆菌中，使用由PtsHICRR和运载体PtsG组成的磷酸烯醇丙酮酸运输系统(PTSglc)，运输葡萄糖(参见Tchieu等人，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3(3)：329-46(2001)，它通过引用整体并入本文)。随着被运输进细胞中，葡萄糖被磷酸化，其中磷酸源自磷酸烯醇丙酮酸。得到的葡萄糖-6-磷酸经由糖酵解被代谢，从而再生PEP。葡萄糖运输持续贯穿指数生长，但是随着细胞进入稳定期而被向下调节。为了商业目的，希望使目标分子的生产时间和产率最大化，这在原料运载蛋白被向下调节的情况下难以实现。为了解决该问题，如下删除了PTSglc系统：删除ptsHIcrr，并在一些实施方式中，删除ptsG，并组成性地表达galP和glk，它们分别编码半乳糖透性酶和葡糖激酶。半乳糖透性酶会运输没有磷酸化的葡萄糖，所以必须表达葡糖激酶(参见美国专利申请号20050079617，它们通过引用整体并入本文)。
使用来自Gene Bridges的Red/ET系统，删除了BL21中的ptsHIcrr操纵子。用pRed/ET质粒转化电感受的BL21(Invitrogen)，并通过在冰冷的dH2O中洗涤3-4次，使得到的细胞呈电感受态。使用正向引物和反向引物，扩增GB-cmR盒，其具有至少50个与在ptsH上游紧邻处或在crr下游紧邻处的区域具有同源性的碱基。得到的PCR产物用于转化BL21/pRED，并将转化体涂布在含有葡萄糖(1％)和氯霉素(5μg/ml)的MacConkey琼脂上。白色的生长的转化体是正确的基因型。使用P1转导，将ptsHIcrr敲除体转导进希望的异戊二烯生产宿主中。
通过PCR，从在5’和3’末端上具有至少50碱基对(bp)同源性的菌株KLpts::gal-trc::Cm或KLgalPglk-trc-cat S(参见美国专利申请号20050079617，它通过引用整体并入本文)扩增Ptrc-galP-cat和Ptrc-glk-cat盒，以允许同源重组进具有DXP或MVA或两种途径的BL21中，并表达异戊二烯合酶(实例是来自银白杨的ispS或其变体)，删除ptsHIcrr和/或ptsG。使目标菌株呈感受态，并用pRed/ET质粒转化，在呈感受态以后，用galP-trc-cat盒转化新菌株。在含有1％葡萄糖和氯霉素(5μg/ml)的MacConkey琼脂上，选择转化体。浅粉红色的菌落具有正确的基因型。这些盒中的CAT标志物侧接loxP位点，且可以通过标准方法(Palmeros等人，Gene 18；247(1-2)：255-64(2000)，它通过引用整体并入本文)环出。然后用glk-trc-cat盒转化表达来自Ptrc的galP的菌株，并在含有1％葡萄糖和氯霉素(5μg/ml)的MacConkey琼脂上选择转化体。深红色的菌落是正确的菌落。
得到的菌株具有完整的MVA途径，具有或没有组成性地表达的DXP途径，具有异戊二烯合酶(实例是银白杨IspS或其变体)，缺失ptsHIcrr和/或ptsG，并组成性地表达半乳糖透性酶和葡糖激酶。为了证实这些菌株中的异戊二烯生产与经由PTSglc系统运输葡萄糖的亲代相比被增强和/或延长，在摇瓶(TM3 containing 1％葡萄糖、0.1％酵母提取物)、微型发酵罐(TM3 containing 1％葡萄糖、0.1％酵母提取物)中和在14-升发酵中，测试了菌株。还使用预处理的和糖化的生物质，例如玉米纤维、玉米秸秆、柳枝稷、饲料蜀黍物、软木浆、硬木浆或其它合适的生物质，测试了这些菌株。
与没有ptsHIcrr和/或ptsG删除和组成型表达半乳糖透性酶和葡糖激酶的亲代菌株相比，在具有ptsHIcrr和/或ptsG删除和组成型表达半乳糖透性酶和葡糖激酶的菌株中的异戊二烯生产被增强和/或延长。
实施例13：与异戊二烯合酶的表达相组合的单萜和倍半萜合酶的表达会增加大肠杆菌中异戊二烯的比生产率
在大肠杆菌中，经由DXP途径(也称作非-甲羟戊酸途径和MEP途径)生物合成异戊烯基焦磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)。可以浓缩IPP和DMAPP，以形成香叶基焦磷酸酯(GPP)，并随后被法呢烯合酶(IspA)形成法呢基焦磷酸酯(FPP)。通过用IPP延长FPP，可以将FPP转化成八异戊二烯基焦磷酸酯(OPP)和十一异戊二烯基焦磷酸酯(UPP)。这些产物在大肠杆菌中发挥多种功能，包括DMAPP对tRNA(蛋白合成组分)的异戊二烯化、OPP形成醌(呼吸链组分)和UPP的肽聚糖形成(细胞壁组分)。
通过IPP和DMAPP的生产，可以调节DXP途径的产物。因此，该实施例表明，在大肠杆菌中导入与异戊二烯合酶组合的萜合酶(其利用DXP途径的下游产物)，会导致增加的经过DXP途径的通量和增加的异戊二烯比生产率。
方法
菌株构建
构建了下述菌株。
将罗勒烯合酶、法呢烯合酶和青蒿素合酶克隆进pTrchis2A质粒中，得到pTrcFPP、pTrcAS或pTrcOS。将异戊二烯合酶(例如银白杨的IspS或其变体)克隆进pBBR中，在Ptrc启动子控制下，得到pBBRPtrcalba。
菌株集合1)BL21GI1.6yIDI/pBBRPtrcalba自己，或者与PtrcFPP或pTrcAS或pTrcOS相组合。
菌株集合2)BL21GI1.6yIDIGI1.6DXS/pBBRPtrcalba自己，或者与PtrcFPP或pTrcAS或pTrcOS相组合。
在摇瓶中或在微型发酵罐中，在含有0.1％酵母提取物和1％葡萄糖的TM3中培养菌株集合1)或2)中的菌株。随时间测量异戊二烯的比生产率。
对比来自菌株集合1)的菌株的异戊二烯比生产率。在含有FPP、OS或AS的菌株中的异戊二烯的比生产率高于在没有FPP、OS或AS的菌株中。
对比来自菌株集合2)的菌株的异戊二烯比生产率。在含有FPP、OS或AS的菌株中的异戊二烯的比生产率高于在没有FPP、OS或AS的菌株中。
实施例14：删除或减少进入硫胺素和吡多辛途径的碳以缓解抑制
1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)是大肠杆菌中的3个基本的合成代谢途径(即类异戊二烯、硫胺素和吡哆醛合成)的底物。为了避免来自硫胺素或吡哆醛途径的任何反馈调节(其以后会降低类异戊二烯生产的DXP途径的通量)，我们构建了在硫胺素和/或吡哆醛途径中突变的菌株。
A：在硫胺素合成途径中删除的大肠杆菌菌株的构建
几种酶涉入从DXP生物合成硫胺素。ThiG和ThiH化合，以形成含有铁硫簇的复合物(Leonardi等人FEBS Lett.539(1-3)：95-9(2003)，PMID：12650933，它通过引用整体并入本文)。总之，4-甲基-5-(β-羟基乙基)噻唑磷酸酯的合成需要它们，所述合成是硫胺素合成的限速步骤(Leonardi等人J Biol.Chem.279(17)：17054-62(2004)，PMID：14757766；Vander等人，J.Bacteriol.175(4)：982-92(1993)，PMID：8432721；它们通过引用整体并入本文)。由于它是在限速步骤中，且它是在1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸以后的第一种酶，选择thiG作为要删除的基因。
使用引物GB400thiGF(caggagccagaacgcaactgc(SEQ ID NO：100)和GB400thiGR(CACTTTCGCCTGATGTTCACC(SEQ ID NO：101)以及来自Keio收集库的菌株JW5549的基因组DNA(Baba等人，Mol.Syst.Biol.2006.008(2006)，它通过引用整体并入本文)，得到PCR产物。PCR产物含有卡那霉素盒，其替换大部分thiG基因和在thiG基因两侧的约400碱基对侧接区。
然后使用上述的PCR产物，通过Red/ET重组工程(Gene Bridges，Dresden，德国)，得到BL21(DE3)thiG::Kan突变体。通过扩增和测序，证实它是正确的。该菌株被命名为CMP179。
B：在吡哆醛合成途径中删除的大肠杆菌菌株的构建
PdxJ催化从1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸和1-氨基-丙-2-酮-3-磷酸形成吡多辛-5-磷酸(吡哆醛-5-磷酸的前体，然后是吡哆醛)。后者通过一系列反应生成，所述反应从赤藓糖-4-磷酸开始，这是由D-赤藓糖4-磷酸脱氢酶(epd)催化的第一个反应。因而pdxJ和epd是用于删除吡哆醛生产的良好候选物。但是，已经报道，糖酵解或吡哆醛的合成不需要epd(Seta等人，J.Bacteriol.179(16)：5218-21(1997)，它通过引用整体并入本文)。因而，选择pdxJ作为突变的靶标。
使用引物GB400pdxJF(CAT TCA GTC TCT TGC AGG GGT C(SEQ  ID NO：102)和GB400pdxJR(gcatagtgccgctcatctgcc(SEQ IDNO：103))以及来自Keio收集库的菌株JW2548的基因组DNA(Baba等人2006)，得到PCR产物。PCR产物含有卡那霉素盒，其替换大部分pdxJ基因和在pdxJ基因两侧的约400碱基对侧接区。
然后使用上述的PCR产物，通过Red/ET重组工程(Gene Bridges，Dresden，德国)，得到BL21(DE3)pdxJ::Kan突变体。通过扩增和测序，证实它是正确的。该菌株被命名为CMP180。
C：在硫胺素和吡哆醛合成途径中删除的大肠杆菌菌株的构建
使用来自Gene Bridges(Dresden，德国)的质粒706-Flp，通过Flp-介导的切除，从CMP179和/或CMP180去除卡那霉素盒。然后，通过Red/ET重组工程，使用在部分A中所述的PCR产物来突变BL21(DE3)pdxJ。
D：在thiG和/或pdxJ突变体中经由DXP途径生产异戊二烯
在增强DXP途径通量和表达来自银白杨的IspS(异戊二烯合酶)的不同构建体例如MCM597(BL21(DE3)pLysS pET24(MEA)alba-DXS-yIDI)或MCM719(BL21gi1.6-yIDI gi1.6-dxs，pTrc(MEA)alba))中，评估了thiG、pdxJ或thiG pdxJ突变对经过DXP途径的异戊二烯生产的影响。
在30℃、200RPM，在补充了适当抗生素的HM1培养基(表2)中培养菌株过夜。次日早晨，将它们重新悬浮于补充了适当抗生素的新鲜HM1培养基中至OD＝0.2。在30℃、200RPM温育烧瓶，并定期取样，用于检测OD和异戊二烯生产。
表2：HM1培养基组成
Figure BDA0000135516370001411
当菌株MCM597或MCM719含有thiG、pdxJ或thiG pdxJ突变时，增加了比生产率(ug异戊二烯/OD.h)。
实施例15：平衡丙酮酸盐和G-3-P(甘油醛-3-磷酸)以增加异戊二烯生产
通过使DXP途径所需的两种前体丙酮酸盐和G-3-P(甘油醛-3-磷酸)之间的平衡最大化，可以正面地(更多通量)影响DXP途径的通量，以增加异戊二烯生产。相应地，调节决定进入糖酵解中、进入磷酸戊糖途径(PPP)中和进入Entner-Doudoroff(ED)途径中的通量的酶的表达水平(图68)。在部分B-D中，同时地影响丙酮酸盐和G-3-P的通量。通过利用分别升高或降低丙酮酸盐或G-3-P的效应来重新指导通量，也可以实现DXP途径的两种前体的最佳平衡。部分E用甲羟戊酸途径的共表达证实了该方案。另外，有人提出，通过选择原料(例如，进料葡萄糖+葡糖酸的混合物)，可以实现希望的通量平衡；部分A显示了该方案。可以证实，这些方案的组合可以累加地实现前体平衡，并使异戊二烯的产率最大化；这在部分F中进行测试。
部分A
给已经通过本领域从业人员已知的且在本申请中例证的规程构建的过表达DXP途径的细胞或野生型细胞饲喂不同的碳源，但是更具体地，给细胞饲喂葡萄糖+葡糖酸或单独葡糖酸。对培养物取样，并分析提高的异戊二烯的形成。在用不同浓度的碳源培养细胞的过程中，通过用质谱仪连续地或在特定的时间点监测培养物的顶空，完成该分析。
部分B
遗传工程化部分A中携带过表达的DXP途径的细胞或野生型细胞，以过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶，从而重新指导PPP和ED的通量。通过测量异戊二烯比生产率，可以评估这些突变的效应和益处。
部分C
遗传工程化部分A中携带过表达的DXP途径的细胞或野生型细胞，以限制葡萄糖-6-磷酸异构酶的表达，从而重新指导PPP和ED的通量。通过测量异戊二烯比生产率，可以评估这些突变的效应和益处。
部分D
遗传工程化部分A中携带过表达的DXP途径的细胞或野生型细胞，以限制葡糖酸盐-6-磷酸脱氢酶(gnd)的表达，从而限制磷酸戊糖的通量，并使ED的通量最大化。通过测量异戊二烯比生产率，可以评估这些突变的效应和益处。
部分E
在该部分中，通过甲羟戊酸途径(丙酮酸盐是其唯一前体)的表达水平，调节DXP前体丙酮酸盐。构建细胞，以过表达DXP途径酶以及甲羟戊酸途径酶，并通过选择适当的启动子强度，调节2个途径的表达，使得丙酮酸盐通量与G-3-P通量平衡，且任一种前体都不在细胞中积累。在有zwf、gnd和pgi突变存在下(单独地或以所有可能的组合)，类似的方案具有提高性能的潜力。
部分F
为了可能的累加性，组合在部分B-E中建立的菌株。测试了过表达的DXP途径菌株中zwf和gnd的组合对菌株性能的改善。类似地，预见到pgi和gnd的组合会提供类似的结果。
实施例16：经过含有PDH E1 E636Q亚基变体的菌株中的DXP途径的提高的碳通量
该实施例描述了构建含有丙酮酸脱氢酶E1亚基(PDH)变体的大肠杆菌BL21菌株的方法，所述变体会增加经过DXP途径的碳通量。具体地，这些菌株含有突变体aceE基因，所述基因编码具有E636Q点突变的PDH变体，所述变体具有降低的将丙酮酸盐转化成乙酰基-辅酶A的活性(野生型PDH活性的26％)。另外，认为PDH E636Q变体具有dxs-样活性，该活性导致从丙酮酸盐和甘油醛-3-磷酸的羟醛缩合生产1-脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)。Nemeria等人已经报道了丙酮酸脱氢酶E1 E636Q突变体的聚醛酶活性(J.Biol.Chem.，280(22)，21473-21482(2005)，它通过引用整体并入本文)。与含有野生型PDH E1活性的菌株相比，净效应是增加的进入DXP途径的碳通量和减少的进入乙酰基-CoA的碳通量。
含有PDH E1 E636Q突变体的大肠杆菌BL21菌株的构建如Sauret-Güeto等人(FEBS Lett.，580，736-740(2006)，它通过引用整体并入本文)所述。简而言之，如下中断dxs基因的染色体拷贝：通过将含有氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的盒插入大肠杆菌BL21菌株的dxs基因座中，所述菌株含有一个或多个编码异源甲羟戊酸途径(MVA)的质粒。得到的大肠杆菌BL21MVA+(dxs::CAT)菌株的正常生长需要甲羟戊酸。当在没有甲羟戊酸存在下培养该菌株时，抑制基因突变aceE基因以低至中等频率出现，其挽救存活的克隆免于否则致死的dxs-表型。对aceE基因和有关的启动子区进行测序，以便证实导致PDH E636Q突变体的该错义突变的存在。
用源自大肠杆菌或源自本文所述的异源来源的dxs基因的一个或多个功能拷贝，补足得到的大肠杆菌BL21 dxs::CAT PDH E1 E636Q MVA+菌株。与不具有PDH E1 E636Q变体的菌株相比，得到的菌株表现出提高的进入DXP途径的通量。
另外，用源自大肠杆菌或源自本文所述的异源来源的DXP途径基因、DXP途径相关的基因、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因(例如，fldA或fpr)和/或IDI基因的一个或多个功能拷贝，可以进一步补足得到的大肠杆菌BL21 dxs::CAT PDH E1 E636Q MVA+菌株。
还可以用编码异戊二烯合酶的基因(例如来自银白杨的IspS或本文所述的其变体)的一个或多个拷贝，转化菌株。这些菌株通过DXP和MVA途径生产异戊二烯，在所述途径中，更大比例的异戊二烯源自DXP途径(与MVA途径相比)，与不具有PDH E636Q变体的菌株相比。使用本领域技术人员已知的同位素标记技术，测定DXP与MVA碳通量之比。
如果需要，使用本领域技术人员已知的技术，可以任选地用编码MVA途径的质粒治愈菌株(例如，CHL18或任意其它MVA途径菌株，如在美国专利申请号61/097,186、61/097,189和61/125,336中所述，它们各自通过引用整体并入本文)。
实施例17：CRP的突变会增加进入DXP途径的通量，并增加异戊二烯的生产
分解代谢物阻遏(其中敏感操纵子的转录被某些碳源降低)可能是DXP途径中的通量的主要限制，从而减少可以生产的异戊二烯的量。
CRP(cAMP受体蛋白)-删除突变体可从Keio收集库得到，且可以容易地评估经过DXP途径的异戊二烯生产。已经研究了它的总转录调节的影响(Perrenoud和Sauer，J.Bact.187：3171-3179(2005)，它通过引用整体并入本文)。其它类型的CRP突变体也有益于该过程。一个这样的实例是Eppler和Boos(Eppler和Boos，Mol.Microbiol.33：1221-1231(1999)，它通过引用整体并入本文)所述的CRP突变体。CRP*是cAMP-不依赖的CRP变体。
A：生产异戊二烯的大肠杆菌Crp*突变体的构建
通过P1转导(从大肠杆菌菌株ET25(将从W.Boos得到)制备的裂解物)，将CRP*突变导入异戊二烯生产菌株中，例如MCM597(BL21(DE3)pLysS pET24(MEA)alba-DXS-yIDI)或MCM719(BL21gi1.6-yIDI gi1.6-dxs，pTrc(MEA)alba))，分别形成菌株CMP220和CMP221。
B：经由DXP途径在大肠杆菌Crp*突变体中生产异戊二烯
在30℃、200RPM，在HM1培养基(表3)+适当抗生素+10g/L葡萄糖+1g/L酵母提取物中，培养菌株CMP220和CMP221以及菌株MCM597和MCM719过夜。次日早晨，将它们重新悬浮于新鲜的HM1培养基+适当抗生素+5g/L葡萄糖+1g/L酵母提取物中至OD＝0.2。在30℃、200RPM温育烧瓶，并定期取样测定OD600和异戊二烯生产率。
表3：HM1培养基组成
Figure BDA0000135516370001451
Figure BDA0000135516370001461
与菌株MCM597或MCM719相比，菌株CMP220和CMP221中的比生产率(ug异戊二烯/OD.h)提高。
C：当在葡萄糖/木糖混合物上培养菌株时，经由DXP途径在大肠杆菌Crp*突变体中生产异戊二烯
预处理过的生物质样品含有葡萄糖、木糖和乙酸盐的混合物作为主要组分。葡萄糖的存在通常会阻止大肠杆菌的木糖消耗。CRP*突变将会有助于增加葡萄糖和木糖共同消耗(Cirino等人biotech.Bioeng.95：1167-1176(2006)，它通过引用整体并入本文)。
在30℃、200RPM，在HM1培养基(表3)+适当抗生素+10g/L葡萄糖+1g/L酵母提取物中，培养菌株CMP220和CMP221以及菌株MCM597和MCM719过夜。次日早晨，将它们重新悬浮于新鲜的HM1培养基+适当抗生素+2.5g/L木糖和2.5g/L葡萄糖+1g/L酵母提取物中至OD600＝0.2。在30℃、200RPM温育烧瓶，并定期取样测定OD600、异戊二烯生产率和碳水化合物浓度。通过HPLC(离子排阻柱AminexHPX-87H、300mm X 7.8mm，0.005M H2SO4、0.6mL/min作为流动相)，测定碳水化合物浓度。
尽管菌株MCM597和MCM719显示出二阶段生长曲线，在菌株CMP220和CMP221中的木糖和葡萄糖共同消耗增加。这允许发酵在更短的时间内结束。
实施例18：具有LytBG120D突变的大肠杆菌菌株中增加的异戊二烯生产
该概念的主要内容涉及突变型DXP途径酶LytBG120D的生化测定，以及预期的LytBG10D酶的功能是否可以帮助将我们的目标DXP途径菌株的有关方面用于生物异戊二烯生产。在该实施例中，希望的DXP途径菌株将会经由二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)分子生产大量(如果没有尽可能地接近全部)异戊二烯，所述DMAPP分子直接地源自(E)-4-羟基-3-甲基丁基-2-烯基焦磷酸酯(HMBPP)的LytBG120D催化；这不同于经由IDI酶产生的DMAPP，所述IDI酶将异戊烯基焦磷酸酯(IPP)异构化成DMAPP。
已经报道，大肠杆菌的野生型LytB和许多其它生物体(包括植物和藻类以及其它细菌)共有的LytB酶会生产通常在1∶4至1∶6范围内的比例的DMAPP和IPP(DMAPP∶IPP)。Kia-Joo Puan等人(FEBS Letters，579：3802-3806(2005)，它通过引用整体并入本文)的工作提供的体内数据支持下述假说，即LytBG120D突变体酶可以生产DMAPP，但是不能产生足够水平的IPP来支持IDI缺陷型大肠杆菌的生存力。没有体外数据支持提议的LytBG120D活性已经导入野生型中。
目前，类异戊二烯生产系统从IPP衍生出它们的大量产物。如果确定LytBG120D仅生产DMAPP或大量DMAPP(相对于IPP)，则lytBG120D等位基因在DXP途径-介导的异戊二烯生产菌株中的应用可能允许独特地制备几乎完全源自DMAPP的类异戊二烯产物。
使用大肠杆菌MG1655作为模板，经由基于PCR的方法，制备lytBG12D，并克隆进表达载体(pET-15b)中。为了对比，将野生型lytB克隆进相同的pET-15b表达载体骨架中。一旦已经验证过构建体的序列，将每个构建体移入BL21(DE3)或相容的表达宿主中。从表达菌株中生产LytB和LytBG120D，随后使用标准的亲和纯化方法进行纯化。在测定稳健酶功能的活性评估(在文献中存在的方法)之前，可能需要在厌氧条件下重构蛋白。LytB是含有4Fe-4S簇的酶，且已知对氧是敏感的。或者，如果在那些条件下可以支持每种酶的足够活性，且如果可以实现大量Idi活性的缺失，可以在纯化之前，直接地从细胞裂解物测定LytB和LytBG120D。通过凝胶电泳和/或免疫印迹，测定和定量每种酶的表达。在文献中描述了活性测定，但是可以简要地包括：在以前描述的缓冲液(包括底物HMBPP，且没有Idi活性)中，温育每种酶(纯化的，或包含在细胞提取物内)。在确定的时间以后，使用HPLC方法，测定DMAPP与IPP之比。得到的数据是我们可得到的LytBG120D的第一体外结果。
如果发现LytBG120D仅生产DMAPP，或至少以比IPP更大的丰度生产DMAPP，则将lytBG120D等位基因的使用掺入DXP途径异戊二烯生产菌株中。最初，这如下实现：在支持经过DXP途径至异戊二烯合酶的碳通量的宿主背景内，在异戊二烯生产期下，相对于野生型等位基因过表达lytBG120D基因。作为评估产生与IPP相比增加的DMAPP水平(预期其伴有lytBG120D的过表达)所特有的任何益处的对照，也构建和评估了过表达野生型lytB基因的类似菌株。通过HPLC和/或GC-MS方法，测定由这些菌株产生的DMAPP和IPP以及异戊二烯和其它下游类异戊二烯的水平。
我们过去的发现提示，增加的IPP水平不会被大肠杆菌较好地耐受。此外，我们已经观察到，伴有显著活性的Idi的增加的IPP水平导致更大的下游类异戊二烯产物的合成，其也造成生存力的显著降低。因为LytB生产比DMAPP更大量的IPP，且因为大肠杆菌的内源IdI活性是微小的，也因为DMAPP是异戊二烯合酶的底物，我们当前的DXP系统依赖于源自酵母的IdI的应用。LytBG120在DXP生产菌株中的应用，会去除我们当前的系统对酵母IdI的依赖性(如果确定LytBG120D主要生产DMAPP)。也预见到LytBG120的应用会降低下游类异戊二烯合成的水平，因为IPP(更大的类异戊二烯的大亚基)不可丰富地得到。
实施例19：用于缓解DXP途径的内源调节的宿主变化
DXP途径(大多数原核生物的类异戊二烯生产所必需的)是强烈调节的途径。实际上，它是必要的，但是也需要小量，因为它中枢的代谢中间体甘油醛-3-P和丙酮酸盐转化碳。所以，当与内源基因一起工作时，它可能难以脱离调节。
该问题的一个解决方案可能是，将来自一个生物体的整个DXP途径表达进另一个宿主生物体中，后一个生物体在系统树上是近的或远的。这些宿主生物体包括，但不限于工业生物体，例如大肠杆菌、荧光假单胞菌、运动发酵单胞菌、芽孢杆菌属、酿酒酵母、梭菌属、谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母。在该途径中涉及的所有基因都克隆自一个生物体的事实，确保那些基因生产的酶可以一起工作，以生产最终产物DMAPP。
A：通过克隆大肠杆菌DXP基因来构建表达DXP途径的质粒
将从质粒pTrcHis2A(Invitrogen，Carlsbad，CA)PCR扩增的Ptrc启动子克隆进pBBR1-MCS4质粒(Kovach等人，Gene，166：175-176(1995)，它通过引用整体并入本文)多克隆位点中，剩下在该启动子下游的PstI位点。该质粒被命名为pBBR4Ptrc。使用含有在上游引物上的NsiI位点和RBS和在下游引物上的PstI位点的引物，从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增大肠杆菌基因yajP(dxs)、ispC(dxr)、ispD、ispE、ispF、gcpE、lytB和idi。将所述基因逐个加入质粒上。使用限制酶切消化来检查和选择具有正确朝向的克隆。或者，将终止子导入在ispF后面，且将新的启动子(例如Ptrc)导入由gcpE、lytB和idi组成的操纵子前面。这样产生的质粒被命名为pBBR4PtrcDXPc和pBBR4PtrcDXPc2。
B：通过合成的DNA合成来构建表达密码子优化的DXP途径的质粒
为来自GeneArt(Regensburg，德国)的荧光假单胞菌，设计和定制与上述的操纵子类似的合成操纵子，并进行密码子优化。将它亚克隆进质粒pBBR4Ptrc中，以产生质粒pBBR4PtrcDXPa。
C：大肠杆菌DXP途径在荧光假单胞菌中的表达和它对异戊二烯生产的影响
将为假单胞菌(其它假单胞菌参见专利实施例)优化的ispS(来自白杨的异戊二烯合酶)基因密码子克隆进质粒pHRP309(庆大霉素抗性的)(Parales和Harwood，Gene 133：23-30(1993)，它通过引用整体并入本文)中，并通过双亲代交配转化进荧光假单胞菌ATCC 13525中。通过电穿孔，缉拿该质粒pBBR4PtrcDXPc、PBBR4PtrcDXPc2和pBBR4PtrcDXPa转化进大肠杆菌S17-1中，并在LB+卡那霉素50μg/ml上选择转化体。然后通过双亲代交配，将质粒转化进具有表达IspS的pHRP309的荧光假单胞菌中，并在M9培养基+16mM柠檬酸钠+卡那霉素50μg/ml+庆大霉素50μg/ml上选择，以分别形成菌株CMP222、CMP223和CMP224。
当在HM1培养基+10g/L葡萄糖中培养菌株CMP222、CMP223和CMP224时，异戊二烯比生产率高于没有表达DXP途径的质粒的荧光假单胞菌菌株。
实施例20：影响经由DXP途径的异戊二烯生产的化合物的鉴别
使用一定范围的不同的碳源、氮源或磷源，使用96-孔微孔滴定板，研究了过表达DXP途径酶和异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株的异戊二烯生产和生长。令人惊讶地鉴别出了许多在显著程度上正面地或负面地影响异戊二烯生产的化合物。正面地或负面地影响异戊二烯的比生产率的化合物，可能有助于鉴别影响异戊二烯生产的代谢途径。这样的途径可能直接地涉入异戊二烯生产，或者它们可能具有调节作用。通过例如遗传修饰，可以修饰鉴别的化合物或代谢途径，以优化异戊二烯生产。鉴别的碳源、氮源或磷源也可以直接地补充进培养基中，用于增加异戊二烯生产。
实验规程：
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO4 3.2g，1000X痕量金属溶液1ml。将所有组分顺序地溶解于去离子H2O中。用氢氧化铵(30％)调节pH至6.8，并定容。用0.22微米滤器对培养基进行过滤除菌。在使用之前，将MgSO4*7H2O 2g、酵母提取物0.2g加入培养基中。如果需要，加入碳源至终浓度0.5％。在除菌和pH调节以后，加入需要的抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
菌株：
MCM597
(i)Construction of MCM597(BL21(DE3)pLysS  pet24(MEA)albadxsyIDI
pDU-39的构建
引物序列：
Alba TRC(MEA)-NdeI-F
5’-gaaactgaaaccCATATGgaagctcgtcgttctgc(SEQ ID NO：104)
Alba FLTRC(-)TEV-R
5’-cccgcgcttaCTCGAGgcgttcaaacggcagaatcggttcagtg(SEQ IDNO：105)
通过使用引物集合Alba TRC(MEA)-NdeI-F/Alba FLTRC(-)TER-R和模板pET24 alba HGS(参见美国专利申请号12/335,071中的实施例10，它整体并入本文)扩增基因，构建截短形式的银白杨异戊二烯合酶。PCR反应设定如下：
1ul(pET24a-P.alba)
5ul 10X PfuUltraII Fusion缓冲液
1ul dNTP’s(10mM)
1ul引物(50uM)集合#1正向
1ul引物(50uM)集合#1反向
41ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的Pfu Ultra II Fusion DNA聚合酶
循环参数：
95℃1min.[95℃ 30秒，55℃ 20秒，72℃ 25秒]x 29个循环，72℃3min，
4℃直到冷却(Eppendorf Mastercycler)
以NdeI-XhoI限制性内切核酸酶(Roche)消化PCR产物，根据生产商的说明书，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化。使用T4连接酶(New England BioLabs)，将3μl的纯化产物的等分试样连接至pET-24a载体(Invitrogen)上，所述载体事先经过NdeI-XhoI消化、凝胶纯化并以虾碱性磷酸酶(SAP，Roche)处理。连接在16℃彻夜进行。
将5μL过夜连接混合物的等分试样转化进TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上过夜选择转化体。
根据生产商的说明书，使用QiaQuick旋转试剂盒(Qiagen)从一些转化体分离质粒。通过NdeI-XhoI限制性内切核酸酶消化来验证插入片段，以可商业得到的T7启动子和T7终止子(Quintara Bio Sequencing Service，Berkeley，CA)测序克隆。
正确的质粒被命名为pDu-39(图69)
MCM597的构建
引物序列
MCM270 5’-GATCGGATCCATTCGCCCTTAGGAGGTAAA(SEQID NO：106)
MCM271
5’-GATCGCGGCCGCCAGCTGCAGGACGCGTTGTTATAGCATT(SEQ ID NO：107)
使用引物MCM270/MCM271和模板pMCM72(参见美国专利申请号12/335,071的实施例7，它通过引用整体并入本文)，通过PCR，扩增DXS-yIDI基因。根据生产商Herculase II Fusion(Stratagene)的说明书，设定两个相同的PCR反应。35μL水，10μL缓冲液，1.25μL每种引物，0.5μL dNTP，1μL聚合酶。反应循环如下：95℃，2:00；(95℃ 0:15，55℃0:15，72℃ 1:45)x30；72℃ 3:00，4℃直至冷却。
以BamHI和NotI(Roche)消化得到的PCR片段，然后使用Roche快速连接试剂盒将其连接进经过相同的限制性内切核酸酶消化的pDu39。连接反应物建立如下：10μL，其包含5μL缓冲液1、1μL载体、3μL插入片段和1μL连接酶，在室温温育1小时。将5μL等分试样转化进大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)。在37℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上选择转化体过夜。从一些转化体纯化质粒，并使用Herculase IIFusion(Stratagene)，筛选插入片段的存在。17.5μL水，5μL缓冲液，0.625μL每种引物，0.25μL dNTP，0.5μL聚合酶。反应循环如下：95℃，2:00；(95℃ 0:15，52℃ 0:15，72℃ 0:45)x30；72℃ 3:00，4℃直至冷却。
对含有接近1.5kbp的PCR产物的克隆进行测序(QuintaraBiosciences，Berkeley CA)。正确的质粒被命名为MCM596。然后将质粒转化进电感受的BL21(DE3)pLysS细胞(Invitrogen)，在含有卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/mL)的L琼脂上选择转化体。选择了一个菌落并命名为MCM597。
实验规程
从冷冻瓶取出大肠杆菌菌株MCM597(其过表达来自大肠杆菌的DXP途径酶dxs和来自酿酒酵母的idi和来自银白杨的异戊二烯合酶ispS)的接种物，在LB培养液琼脂平板(含有抗生素)上划线，并在30℃温育过夜。将单个菌落接种进含有葡萄糖作为唯一碳源的TM3培养基中，并在30℃培养过夜。通过离心，洗涤过夜培养物，并重新悬浮于不含有葡萄糖或酵母提取物的新鲜TM3培养基中。然后在20mL TM3培养基中稀释细菌，达到在600nm测量的0.05光密度。对于使用Biolog PM3B微孔滴定板(Biolog，USA)测试不同氮源的作用的实验，在含有0.5％葡萄糖且没有酵母提取物的培养基中稀释细菌。对于使用Biolog PM1和PM2A微孔滴定板(Biolog，USA)测试不同碳源的作用的实验，在含有0.2％酵母提取物且没有葡萄糖或含有0.5％葡萄糖的培养基中稀释细菌。将共120μL培养物分配进Biolog平板的每个孔中，并在定轨摇床(250rpm)上在30℃温育平板。在实验开始时和此后每小时，使用384孔微孔滴定板读数器(Molecular Devices，Spectramax Plus 384)，在600nm测量孔中的光密度，以跟踪细菌的生长。发现biolog平板中的化合物都没有干扰在600nm的光密度测量。生长4-6小时以后，再次测量光密度，将50μL转入2个96孔石英玻璃块(Zinsser，德国)中2次，并用Biomek铝铂带盖(BeckmanCoulter，USA)密封。在450rpm在30℃摇动玻璃块30分钟，然后在70℃热处理12分钟。使用GC-MS(GC 7889A和MSD 5975C，AgilentTechnologies，USA)，测量生产的异戊二烯。为了补偿玻璃块之间的差异，将异戊二烯测量标准化为块平均值。通过将异戊二烯产量除以每个孔的光密度，计算异戊二烯比生产率。一式两份地进行每个Biolog实验。使用统计分析(students T-检验)，鉴别微孔滴定板中统计显著性地(p＜0.1)影响异戊二烯比生产率的化合物。
结果
影响异戊二烯生产的氮源：
当在含有0.5％葡萄糖作为唯一碳源的缺少酵母提取物的培养基上培养携带DXP途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌时，发现许多含有氮的化合物会正面地或负面地影响经过DXP途径的异戊二烯生产。将来自Biolog的PM3B平板用于这些实验。使用统计分析来鉴别最显著地影响异戊二烯生产的化合物(表4)。亚硝酸盐、硝酸盐、氨和尿素的加入没有显著改变异戊二烯比生产率，表明所述细菌在发酵培养基中没有直接缺少氮。增加异戊二烯比生产率的化合物令人惊讶地包括L-谷氨酸、L-天冬氨酸、嘌呤肌苷和鸟苷、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸和L-天冬酰胺。负面地影响异戊二烯比生产率的化合物具体地包括腺嘌呤和L-甲硫氨酸和L-酪氨酸以及其它。这些化合物中的一些参与嘌呤和硫胺素生物合成，它们与DXP途径有关，且因而可能在DXP途径的调节中起重要作用。
在葡萄糖上生长期间影响异戊二烯生产的碳源：
当在含有0.5％葡萄糖和0.2％酵母提取物的发酵培养基中培养携带DXP途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌时，发现一些碳源会以令人惊讶的高程度影响经过DXP途径的异戊二烯比生产率。将来自Biolog的PM1和PM2A碳源平板用于这些实验。使用统计分析来鉴别最显著地影响异戊二烯生产的化合物(表5)。最显著地增加异戊二烯比生产率的化合物包括、但不限于：苯乙胺、丙酸、D-半乳糖醛酸、肌苷、L-半乳糖酸-γ-内酯、D-阿洛酮糖、葡罗酰胺、2-氨基乙醇、D-纤维二糖、蔗糖、粘酸、L-苹果酸、L-苯丙氨酸、2，3-丁二醇、L-鸟氨酸、D-葡糖酸、D-葡糖胺酸、D-甘露糖。预见到，将这些化合物加入葡萄糖饲喂的发酵中，会增加异戊二烯比生产率。发现许多其它化合物会负面地影响比生产率(表5)。这些作用的原因可能是所述化合物或有关的代谢途径的调节作用，使得这些途径是遗传修饰所感兴趣的。
可用于异戊二烯生产的碳源的鉴别：
当在含有一些不同碳源的微孔滴定板中在含有0.2％酵母提取物的培养基中培养携带DXP途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌时，可能鉴别出以令人惊讶的高比生产率生产异戊二烯的碳源。将来自Biolog的PM1碳源平板用于这些实验。在表6中显示了许多导致非常高异戊二烯比生产率的化合物。最显著地增加异戊二烯比生产率的化合物包括，但不限于：D-半乳糖醛酸、D-海藻糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-甘露醇、D-果糖、D-葡萄糖-6-磷酸、α-D-葡萄糖。在不同化合物上培养的培养物的最终的光密度如表6所示。这些碳源中的一些可以用于生产异戊二烯。
表4：影响大肠杆菌中经过DXP途径的异戊二烯比生产率的氮源。仅显示了统计显著性地(p＜0.1)影响异戊二烯比生产率的化合物。已经包括了硝酸盐、亚硝酸盐、氨和尿素，以解释一般氮源的加入不会影响在发酵培养基中的异戊二烯比生产率(用灰色标识)。
Figure BDA0000135516370001551
Figure BDA0000135516370001561
表5：在葡萄糖上生长过程中影响大肠杆菌中经过DXP途径的异戊二烯比生产率的碳源。将所有碳源标准化为仅饲喂葡萄糖的阴性对照。仅显示了统计显著性地(p＜0.1)影响异戊二烯比生产率的化合物。用灰色标识阴性对照。
Figure BDA0000135516370001562
表6：在过表达来自DXP途径的酶和异戊二烯合酶的大肠杆菌中导致高异戊二烯比生产率的碳源。将异戊二烯比生产率标准化为α-D-葡萄糖。在该表中也显示了培养物的最终光密度(OD600)，指示大肠杆菌在具体碳源上的生长。阴性对照没有饲喂任何碳源，并用灰色标识。
Figure BDA0000135516370001572
实施例21：增加的fpr表达会提高异戊二烯生产
在该实施例中，通过提供更多的必需的辅助因子Fpr，我们证实了DXP途径的GcpE和LytB酶的活性的增加，已经证实所述Fpr会正面影响所述酶的体外和体内活性(Seemann，M.等人Agnew.Chem.Int.Ed.，41：4337-4339(2002)；Wolff，M.等人FEBS Letters，541：115-120(2003)，它们通过引用整体并入本文)。Fpr会提供GcpE和LytB必需的电子(经由FldA从NADPH衍生出)，以执行它们的催化功能(综述见L.A.Furgerson的报告，Themevalonate-independent Pathway to Isoprenoid Compounds：Discovery，Elucidation，and Reaction Mechanisms，2006年2月13日公开，它通过引用整体并入本文)。
在工程化的生产异戊二烯的大肠杆菌菌株中，增加了fpr(编码黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白NADPH-氧化还原酶)的表达。我们的以前测试的更高DXP通量的菌株仅生产适度的异戊二烯水平，且观察到积累高水平的cMEPP(2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸)和HMBPP((E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯)。cMEPP和HMBPP DXP中间体分别是GcpE和LytB的底物。增加的量的Fpr可能增加DXP途径酶GcpE和LytB表现出的活性，导致目标菌株中提高的进入异戊二烯合成的碳通量，超过仅生产内源水平的Fpr的相当BL21(DE3)对照菌株的碳通量。通过异戊二烯效价的增加，证实了提高的通量。
通过将组成型高度活性的GI 1.6-启动子掺入fpr开放-读码框的前面，并同时替换内源启动子序列，意图使由fpr编码的黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白NADPH-氧化还原酶以增加的水平从大肠杆菌染色体表达。或者，可以使fpr从多拷贝载体构建体异位表达。对于任一种方法，我们的目标是，在超过内源fldA基因座所产生的水平，表达和积累Fpr。我们的初步的qRT-PCR结果表明，作为增加的fpr-信使水平的结果，GI 1.6-fpr会产生比内源基因座更多的fpr-转录物，且可能积累比对照更多的Fpr。这通过免疫印迹来确认(在我们接收到抗Fpr的抗体以后)。
使用BL21(DE3)高DXP通量菌株作为亲代宿主菌株，评估了增量调节的fpr基因座的导入对异戊二烯生产的影响(与对照菌株相比)。另外，对DXP中间体的代谢物研究会提供关于增加的Fpr水平对GcpE和LytB活性的有益影响的洞察。
最初，构建了下述的BL21(DE3)实验菌株，并评估了与对照(BL21(DE3)GI 1.6-dxs GI 1.6-fpr T7-MEARR alba/pBBR1MCS-5)相比的生长和异戊二烯生产。将该菌株与亲代对照菌株(BL21(DE3)GI 1.6-dxsT7-MEARR alba/pBBR1MCS-5)对比了生长、异戊二烯生产和DXP代谢物积累。
生长
在补充了终浓度0.1％酵母提取物和1.0％葡萄糖并包括适当抗生素的TM3液体培养基(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0g MgSO4*7H2O)，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8，并加入适量H20，并过滤除菌)中，在30℃培养菌株。通过使用Eppendorf Biophotometer波谱仪(Eppendorf)记录培养物在600nm测得的每个光密度，定期监测生长。
异戊二烯生产
使用顶空试验，分析异戊二烯生产。对于摇瓶培养物，将1ml培养物从摇瓶转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶目录号51882753；帽目录号5188 2759)。旋紧帽，在250rpm摇动下，在相同温度温育瓶。30分钟以后，从培养箱取出瓶，并分析。使用连接了CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这些条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至200μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。将每个菌株的比生产率报告为μg/L OD小时。温育30min的试验瓶中1900ul顶空∶100ul培养液之比导致下述的异戊二烯μg/L培养物向比生产率的转化：(通过GC-MS测得的异戊二烯/L)X(38)/(培养物的OD600nm)。
DXP代谢物积累
如下分离和定量生产异戊二烯的亲代菌株和实验菌株的DXP代谢物：
代谢物提取
通过将3.5mL培养物放入装有3.5mL干冰冷却的甲醇的试管中，快速灭活细胞代谢。通过离心，沉淀出细胞碎片，并将上清液装载上含有30mg吸附剂的Strata-X-AW阴离子交换柱(Phenomenex)。重新提取沉淀物2次，第一次使用3mL含有1mM NH4HCO3缓冲液(pH＝7.0)的50％MetOH，第二次使用3mL 75％MetOH/1mM NH4HCO3缓冲液(pH＝7.0)。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，并将上清液连续地装载上相同的阴离子交换柱。在提取和离心步骤中，保持样品低于+4℃。在代谢物洗脱之前，用水和甲醇(各1mL)洗涤阴离子交换柱，并通过加入0.35mL浓NH4OH/甲醇(1∶14，v/v)、然后加入0.35mL浓NH4OH/水/甲醇(1∶2∶12，v/v/v)混合物，洗脱分析物。用30μL冰醋酸中和洗脱液，并通过在微型离心机中离心，进行澄清。
代谢物定量
使用Thermo Scientific TSQ Quantum Access质谱仪(ThermoElectron Corporation，San Jose，CA)，分析代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行所有系统控制、数据获取和质谱数据评价。对于LC-ESI-MS/MS方法，用表7所示的流动相梯度(流速为0.4mL/min)，洗脱配有CC 8/4 Nucleodex β-OH保护筒的手性的Nucleodex β-OH 5μM HPLC柱(100x 2mm，Macherey-Nagel，德国)。样品注射体积是10μL。
表7.用于洗脱代谢物的HPLC梯度。
Figure BDA0000135516370001611
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：245.0(对于IPP和DMAPP)，381.1(对于FPP)，213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，260.0(对于HDMAPP)和277.0(对于cMEPP)。基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。通过注射购自Echelon Biosciences Inc.的对应标准品，得到校正曲线基于下述假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
实施例22：使用异源DXS提高进入DXP途径的碳通量
活生物体会经由2条不同的途径合成类异戊二烯：甲羟戊酸(MVA)途径和2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸(MEP)途径。MEP途径从1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)开始，后者通过缩合丙酮酸盐和甘油醛-3-磷酸而合成。该反应由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)催化。在有些细菌(包括大肠杆菌)中，DXP不仅用作类异戊二烯的前体，而且被用于2种重要的辅因子的生物合成：硫胺素(维生素B1)和磷酸吡哆醇(维生素B6)。
在DXS水平调节大肠杆菌中类异戊二烯合成的速率。该调节的机理之一可能涉及在MEP途径下游的代谢物和/或维生素B1/B6生物合成的中间体对DXS活性的反馈抑制。因此，通过表达来自不同生物体的酶(其不受下游产物的抑制)，可以增加大肠杆菌中进入MEP途径的总通量。由于关于丙酮酸盐或甘油醛-3-磷酸更低的Km或更高的Kcat值，异源的DXS也可能优于天然的大肠杆菌DXS。更早的研究已经证实，大肠杆菌的DXS中的单个Y392F置换会导致酶的体外活性增加2倍，尽管尚未详细研究修饰的酶的催化性质。
用于在大肠杆菌中异源表达的DXS的来源的选择，可以基于下述考虑(参见表8)。首先，可以选择具有编码几个dxs等基因的基因组的生物体。这些生物体包括具有2个或更多个dxs等基因的植物(植物中DXS的不同形式被分类为DXS1和DXS2)和细菌(例如链霉菌属的种)。其次，可以选择这样的细菌，其中经由MEP(或DXP)途径和MVA途径合成类异戊二烯。第三，可以选择这样的细菌，其经由MVA途径合成类异戊二烯，但是在它们的基因组中含有dxs基因的拷贝，所述拷贝是制备维生素辅因子所特别需要的。该组微生物中的DXS序列的特征在于，与大肠杆菌DXS序列的氨基酸203-242相对应的明显更短的环(图74)。
在一组实验中，将来自多种生物体(实例在表8中列出)的DXS导入过表达植物异戊二烯合酶和异戊烯基-二磷酸δ-异构酶(IDI)的大肠杆菌细胞中(大肠杆菌中的IDI活性通常非常低；因此，该酶的增强的表达是提供异戊烯基-二磷酸向二甲基烯丙基-二磷酸(异戊二烯合酶的底物)的有效转化所必需的)。测试了得到的菌株的异戊二烯生产和DXP途径中间体(包括但不限于DXP、MEP、4-(胞苷5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇、2-磷酸-4-(胞苷5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇、2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸和1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸)的积累，并与含有天然大肠杆菌DXS的对照菌株(在与测试的突变体相同的背景下表达)相对比。DXP中间体的浓度的增加和/或含有异源DXS的突变体中异戊二烯形成速率的升高，指示来自特定生物体的酶在大肠杆菌中具有更高的活性，且不会发生积累的产物的反馈抑制。
在另一组实验中，将过表达异源dxs基因或来自大肠杆菌(对照)的dxs的一组突变体导入背景大肠杆菌菌株中，所述菌株含有植物异戊二烯合酶、IDI和MVA途径的几种酶，使得所述菌株当在含有外源性MVA的培养基中生长时，会合成过量的类异戊二烯。测试了DXP途径特有的中间体在这些菌株中的积累。象在前一种情况中一样，与对照相比DXP中间体浓度的增加表明，来自特定生物体的DXS在大肠杆菌中具有比天然酶更高的活性，且不会发生异戊烯基-二磷酸和/或下游类异戊二烯产物的反馈抑制。为了证实特定突变体具有提高的异戊二烯生产速率(具体地由于修饰的DXS)，在有未标记的MVA存在下，在生长在13C-均匀标记的葡萄糖上的细胞中测量了异戊二烯生产速率。在该情况下，通过质谱法分析的异戊二烯的13C组成明确地指示，该化合物是经由DXP途径从标记的葡萄糖合成，而不是从外源性的未标记的MVA合成。
在第3组实验中，进行实验来证实，将在大肠杆菌DXS的位置392处的酪氨酸置换为苯丙氨酸，导致与野生型酶相比更高的进入DXP途径的通量率。对于该实验，野生型和突变的DXS在含有植物异戊二烯合酶和IDI的大肠杆菌菌株中过表达。对比了2个菌株的异戊二烯生产速率和DXP途径中间体的积累。在具有工程化酶的优良性质的菌株中升高的DXP中间体浓度和/或升高的异戊二烯形成速率，证实了突变体酶的优良属性。
表8.具有不同于大肠杆菌的DXS动力学性质的生物体的实例
Figure BDA0000135516370001631
实施例23：增加经过DXP途径的通量的基因组合、基因表达或突变的鉴别
建立了具有高度基因型多样性的细胞群体，以鉴别增加经过DXP途径的通量的基因组合、基因表达或突变。在该实施例中使用了3种不同的方法。首先，使用Multisite Gateway(Invitrogen)规程，装配大肠杆菌内源的或来自异源生物体的基因的组合，并导入大肠杆菌筛选菌株中。其次，建立了来自大肠杆菌或异源生物体的基因组DNA的文库，并导入大肠杆菌筛选菌株中。第三，导入可以导致基因破坏或活化(由于针对转座元件的反向重复序列的内部启动子)的转座子。
A.用于建立合成操纵子的Multisite gateway(Invitrogen)规程
将大肠杆菌内源的或来自异源生物体的基因装配成合成操纵子，随后针对增加的经过DXP途径的通量和得到的异戊二烯生产进行筛选。Multisite Gateway(Invitrogen)试剂盒提供了最多4个离散的DNA“元件”，它们可以装配在一起成为一个操纵子。根据生产商的说明书，将4个基因单个地克隆进pENTR载体中。例如，使用适当的att重组位点(根据生产商的说明书)和可变的RBS(参见Yarchuk等人，J.of Mol.Biol.，226(3)：581-596(1992)，它们通过引用整体并入本文)，通过PCR，扩增DXP途径中的最后2个基因ispG和ispH，以建立具有每个基因的不同表达水平的质粒库。将相同的规程应用于电子载体基因fldA和fpr，根据生产商的说明书，将4个得到的质粒库在一起重组到Gateway目标载体(pDEST-14(Invitrogen)，pET54-DEST或pCOLA-2-DEST(Novagen))上。得到的质粒包含4个基因操纵子，它们具有每个ORF的不同表达水平。然后通过筛选抗生素抗性标志物(卡那霉素或氨苄西林)，将混合的目标载体导入大肠杆菌菌株中，并通过GC-MS(下面描述)筛选得到的库。
B.基因组文库的制备
根据生产商推荐的方案(参见Lynch等人，Nat.Methods，4(1)：87-93(2007)，它们通过引用整体并入本文)，将大肠杆菌内源的或来自异源生物体的基因组DNA克隆进pSMART LCKan载体(Lucigen)中。将来自大肠杆菌BL21和K12菌株、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、清酒乳杆菌、柠檬泛菌、天蓝色链霉菌、S.spheroides、单核细胞增生利斯特菌、根癌土壤杆菌、苜蓿中华根瘤菌和空肠弯曲菌的DNA用于制备文库。然后将大小高达20kb的基因组DNA插入片段导入大肠杆菌菌株中，进行筛选。通过抗生素抗性(卡那霉素)的导入，选择阳性的转化体，混合，并通过GC-MS进行筛选。
C.转座子诱变和基因激活
将转座子导入大肠杆菌中进行筛选，所述转座子可以通过破坏ORF来灭活基因，也可以驱动近端基因的表达(由于转座元件中的内源启动子)。通过将组成型或诱导型启动子插入EZ-Tn5转座子构建载体(Epicentre)的MCS中，制备定制的转座子。内部启动子的实例包括PT7、Ptrc、Ptac、Pbad、Plac、PL(噬菌体λ)、gi系列和Ptet。将这些启动子克隆进转座元件中，并将得到的定制的转座子导入大肠杆菌中。通过抗生素抗性，鉴别包含转座子插入的菌株，混合，并随后通过GC-MS进行筛选。
大肠杆菌菌株和筛选
将质粒库或转座子导入不同的大肠杆菌菌株中进行筛选。通过位于质粒上或转座元件内的抗生素抗性标志物(通常是Kan或Amp)，鉴别出阳性转化体。菌株包括：包含携带在T7启动子控制下的dxs、dxr、idi和IspS(异戊二烯合酶)的质粒的菌株；包含整合的且组成性地表达的dxs、dxr和idi(ispS也整合或从质粒表达)的菌株；表达在T7启动子控制下的整个DXP操纵子的菌株；包含用于异戊二烯生产的DXP途径基因的当前最佳构象的任意菌株，其仍然显示出DXP途径代谢物(例如HDMAPP)的清楚积累。混合单个转化体(按照每个库100-1000个体分组)，并经由96-孔玻璃板中的GC-MS进行筛选。使用连接了5973 MS Leap CTCCombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890 GC/MS系统进行分析(对于2mL和96-孔板方法)。使用Agilent HP-5(5％苯基甲基硅氧烷(15m x 0.25mm x 0.25uM))柱来分离分析物。将取样仪设定为注入100μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/min。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在0.00-0.44分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体，并在0.44min-0.60min打开。在这些条件下，在0.49分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在0μg/L至5600mg/L是线性的(使用校正气体)。然后重新测定阳性库，以证实对异戊二烯生产的任何积极影响。鉴别出在表现出增加的异戊二烯生产的菌株或库中的单个质粒或构建体，以测定对DXP途径通量的积极影响的精确性质。
检查的生物体的基因
检测了包括但不限于下述生物体的基因：拟南芥、玉米、空肠弯曲杆菌、苜蓿中华根瘤菌、幽门螺杆菌、根癌农杆菌、耐辐射球菌、枯草芽孢杆菌、柠檬泛菌、单核细胞增生李斯特菌、乳杆菌属和链霉菌属。
材料
Multisite Gateway试剂盒(Invitrogen)
Lucigen(Clonesmart克隆试剂盒)-文库构建
EZ-Tn5系统(EpiCentre)-基因破坏/活化
质粒
pET-PT7-驱动的完整DXP途径质粒
pET-PT7驱动的dxs、dxr、idi、ispS
pET-用于异戊二烯生产的DXP途径基因的最佳构象
pBBR-PT7或Ptrc ispS
pET-54-DEST，pCOLA-DEST载体(Novagen)
pDEST14，pDEST15(Invitrogen)
实施例24：通过T.elongatus BP-1的GcpE、LytB PetF和PetH在CMP272内的过表达，增加的REMG39中的异戊二烯生产
该实施例进一步证实了，通过T.elongatus BP-1的GcpE、LytB PetF和PetH在CMP272(一种BL21衍生出的宿主)内的过表达，增加的REMG39中的异戊二烯生产。
如下文所述和证实的，增加的dxs和酵母idi的表达允许增加经过大肠杆菌的内源DXP途径的通量。本领域的先前工作(参见，例如，Chao等人，Biotechnol Prog.，18(2)：394-400(2002)和Zhang等人，ProteinExpression and Purification，29(1)：132-139(2003年5月))已经得出结论，即基于T7的表达系统是不稳定的，当进行14L发酵条件时，它们的行为完全是不可预测的。构建了CMP271和以后的CMP272菌株，以便：(1)用源自染色体的表达替换我们当前的T7-控制的基于质粒的酵母isi表达；允许使用基于非-T7的表达菌株进行DXP-介导的异戊二烯生产，和/或(2)导入基因组编码的基因座，其包含低等MVA途径酶和酵母IDI的基因，从而为异戊二烯合酶的最大通量提供足够水平的酵母IDI。
通过经由电穿孔添加包含银白杨异戊二烯合酶等位基因的pDW33，将CMP271菌株制成异戊二烯生产菌株，随后生产菌株CMP272。
将CMP272菌株用作基线宿主，其中已经通过与它们的假定的还原穿梭系统(PetF和PetH)一起添加T.elogatus IspG(GcpE)和IspH(LytB)编码基因而成功地提高了异戊二烯生产。在下面使用T.elongatus的实施例中，已经描述了包含T.elongatus基因的构建体Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184。评价了亲代CMP272和实验菌株REMG39在下述的14L发酵条件下的生长、异戊二烯生产、代谢物特性和碳的成品收率。结果描绘在图77中。
A.菌株CMP271、CMP272和REMG39的构建
根据生产商的说明书，使用来自Gene Bridges GmbH的Red/ET系统，进行在该实施例中描述的GI 1.X-启动子插入和随后的抗生素抗性标志物的环出。使用菌株BL21(Novagene)。如前所述(Thomason等人，2007)，进行P1裂解物制备和转导。
引物
MQ09-10F-5’ggttaatcatttcactcttcaattatctataatgatgagtgatcagaattacatgtgagaaattaattaaccctcactaaagggcggccgcgaa
MQ09-10R-
5’atattccaccagctatttgttagtgaataaaagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatNgtcaagggctaatacgactcactatagggctcgagg
*对于上面的引物序列中GI1.6N＝T的情况。
MQ09-11F-
5’gcccttgacNatgccacatcctgagcaaataattcaaccacttttattcactaacaaatagctggtggaatatatgactgccgacaacaatagtatgccc
*对于上面的引物序列中GI1.6N＝A的情况。
MQ09-11R-
5’gatgcgtccagtaaaataagcattacgttatgctcataaccccggcaaatgtcggggttttttatagcattctatgaatttg
顶部Gb的CMP 5’ACTGAAACGTTTTCATCGCTC
MQ09-12R-5’gatgcgtccagtaaaataagcattacgttatgctc
galMR 5’gtcaggctggaatactcttcg
galMF 5’gacgctttcgccaagtcagg
在图77中描绘了使用Gene Bridges GmbH方法将GI1.X-yidi系列插入大肠杆菌idi基因座中的策略。使用引物集合MQ09-10F/MQ09-10R，通过PCR，扩增含有抗生素抗性盒GB-CMP的片段(Frag A)。使用引物集合MQ09-11F/MQ09-11R，通过PCR，扩增含有GI1.X-yidi的片段(Frag B)。最后，使用引物MQ09-10F和MQ09-11R，制备GB-CMP-GI1.X-yidi片段。MQ09-10F和MQ09-11R引物各自含有至少50个与大肠杆菌idi基因座同源的碱基，它们允许在有pRed-ET质粒存在下在电穿孔PCR产物以后在特定位点处重组。
GB-CMP-GI1.X-yidi片段的扩增
GB-CmR(Frag A)的PCR反应
2ul(100ng GB-CmR)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)MQ09-10F
1.25ul引物(10uM)MQ09-10R
2ul DMSO
32ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
GB-CmR(Frag B)的PCR反应
2ul(100ng GB-CmR)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)MQ09-11F
1.25ul引物(10uM)MQ09-11R
2ul DMSO
32ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
GB-CmR(Frag A+B)的PCR反应
1ul(Frag A)
1ul(Frag B)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)MQ09-10F″
1.25ul引物(10uM)MQ09-11R
2ul DMSO
32ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
Frag A
(95℃ 2分钟，95℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃ 1分钟，29X，72℃ 3min，4℃直到冷却，使用Eppendorf Mastercycler)
Frag B
(95℃ 2分钟，95℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃ 35秒，29X，72℃ 3min，4℃直到冷却，使用Eppendorf Mastercycler)
Frag A & B
(95℃ 2分钟，95℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃ 1.2分钟，29X，72℃ 3min，4℃直到冷却，使用Eppendorf Mastercycler)
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段Frag A、B和A+B，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。将纯化的Frag A和Frag B的储备物用于上述的Frag A+B PCR反应中。得到的纯化的Frag A+B的储备物被称作GB-CMP-GI1.X-yidi。
CMP263的galM基因座的扩增
在30μL H2O中搅拌1个CMP263菌落，然后加热至95℃5min。将得到的溶液离心，以沉淀出碎片，将2μL上清液用作下述PCR反应的模板：
2ul菌落在H2O中(参见上面)
5ul Herculase缓冲液
1ul dNTP’s(100mM)
1ul galMF引物(10uM)
1ul galMR引物(10uM)
39.5ul H2O
+0.5ul来自Stratagene的Herculase Enhanced DNA聚合酶
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，52℃x 30秒，72℃x 60秒]x 30个循环；72℃x 7min，4℃直到冷却(来自ThermoHybaid的PCRExpress热循环仪)。
使用DNA分子量X(Roche)作为梯子，在0.8％E-凝胶(Invitrogen)上测定得到的PCR片段的大小；如关于阴性对照所预期的，从BL21细胞没有得到对应的PCR产物。
GB-CMP GI 1.X-yidi PCR产物整合进BL21/pRed-ET菌株中
使用BIO RAD Gene Pulser系统和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，通过电穿孔，将pRed-ET载体(Gene Bridges试剂盒)转化进BL21中，得到菌株MD08-114(BL21/pRed-ET)。将约400ug纯化的GB-CMP GI1.X-yidi PCR片段电穿孔进MD08-114中。在L培养液中恢复转化体，然后涂布在含有氯霉素(5μg/ml)的L琼脂上。使用顶部Gb的CMP和MQ09-12R引物，通过PCR，分析氯霉素抗性的菌落中GB-CMP GI1.X-yidi序列在目标基因座处的存在。使用MQ09-12R和顶部GB的CMP引物(Quintara；Albany，CA)，对来自许多转化体的PCR片段测序，并鉴别出不同的目标GI1.X-yidi菌株。选择1个包含GI1.6-yidi基因座的氯霉素抗性的克隆(BL21 FRT-CmR-FRT GI1.6(A)-yidi)，并命名为MD09-211。
B.用于建立CMP271菌株的策略
通过P1-介导的转导，将在实施例9中描述的菌株MCM625的GI1.6-dxs::kan基因座导入MD09-211中，将得到的卡那霉素和氯霉素抗性的菌株命名为MD09-221。根据生产商的说明书(GeneBridges)，使用来自pRed-ET试剂盒的pCP20，使菌株MD09-221的抗生素抗性标志物环出。通过对氯霉素(5μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的抗性的丧失，验证目标转化体；选择1个氯霉素和卡那霉素敏感的克隆，并命名为MCM710。通过P1-介导的转导，将在美国申请号61/289,959中描述的菌株MCM521的FRT-Neo-FRT PL.2mKKDyI基因座(包含酵母idi基因的额外拷贝)导入MCM710中。选择1个卡那霉素抗性的克隆，并命名为MCM783。用大肠杆菌K-12MG1655的P1裂解物转导MCM783，在M9培养基(Na2HPO46g/L，KH2PO4 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 0.5g/L，0.1mM CaCl2，2mMMgSO4)+0.4％w/v半乳糖上选择。选择1个利用半乳糖的克隆，并命名为CMP263。
使用引物集合galMF/galMR，通过PCR，验证了galM基因座在17,257碱基对的MG1655(其不是BL21内源的，但是显著被CMP263包含)内的存在；该PCR反应如上所述。使用Gene Bridges GmbH方法，使菌株CMP263内的卡那霉素抗性标志物环出。选择1个卡那霉素敏感的克隆，并命名为CMP271。
C.用于建立CMP272菌株的策略
使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，将pDW33电穿孔进菌株CMP271中。载体构建体包含PTrc-控制的MEARR银白杨等位基因，其编码截短形式的异戊二烯合酶。用于pDW33构建的模板EWL230已经描述在美国公开号2009/0203102和WO 2009/076676中。pDW33载体图谱的图像显示在图78中。
pDW33的构建
构建了pDW33，以便制备生产异戊二烯的大肠杆菌菌株，其包含在Ptrc启动子控制下的截短形式的银白杨异戊二烯合酶(MEA变体)。
菌株DW194的构建：
通过在模板EWL230(aka pTrc-银白杨)上的Quikchange PCR诱变(Stratagene-引物序列参见下表)，构建了包含截短的银白杨异戊二烯合酶(IspS)的质粒。PCR反应和循环参数如下面所述。通过凝胶电泳(E-凝胶，Invitrogen)，使PCR产物显影，然后用1μl DpnI限制性内切核酸酶(Roche)在37℃处理3小时。然后使用微透析膜(MilliPore)，将10μl PCR产物脱盐，并使用标准的分子生物学技术，转化进电感受的大肠杆菌菌株MCM531(前述)。在1ml LB培养基中在30℃回收细胞1.5小时，涂布在含有50μg/ml羧苄西林和5mM甲羟戊酸的LB固体琼脂平板上，然后在37℃温育过夜。次日，关于生长和质粒纯化(Qiagen)，选择阳性菌落(菌株DW194的菌落，参见下面)，最后使用下面列出的引物，通过DNA测序(Quintara)进行确认。最终的质粒pDW33携带编码IspS的截短形式(MEA)的开放读码框。
Figure BDA0000135516370001731
QuikChange PCR反应：
1ul质粒EWL230(aka pTrc银白杨)
5ul 10X PfuUltra HF缓冲液
1ul dNTP(100mM)
1ul(50uM)QC EWL244 MEA F
1ul(50uM)QC EWL244 MEA R
2ul DMSO
39ul去离子H2O
1ul PfuUltra HF聚合酶(Stratagene)
PCR循环参数：
1.95℃ 1min。
2.95℃ 30秒。
3.55℃ 1min。
4.68℃ 6min。
5.回到步骤2-18个循环
6.4℃
截短的银白杨IspS(MEA)的序列
mearrsanyepnswdydyllssdtdesievykdkakkleaevrreinnekaefltllelidnvqrlglgy
rfesdirgaldrfvssggfdavtktslhgtalsfrllrqhgfevsqeafsgfkdqngnflenlkedikailsly
easflalegenildeakvfaishlkelseekigkelaeqvnhalelplhrrtqrleavwsieayrkkedan
qvllelaildynmiqsvyqrdlretsrwwrrvglatklhfardrliesfywavgvafepqysdcrnsva
kmfsfvtiiddiydvygtldelelftdaverwdvnaindlpdymklcflalyntineiaydnlkdkgeni
lpyltkawadlcnaflqeakwlynkstptfddyfgnawksssgplqlvfayfavvqnikkeeienlqky
hdtisrpshifrlcndlasasaeiargetansvscymrtkgiseelatesvmnlidetwkkmnkeklggs
lfakpfvetainlarqshctyhngdahtspdeltrkrvlsvitepilpfer
pDW33的序列：
gtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggt
atggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttt
tgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtata
atgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagcgccgctgagaaaaagcgaagcggc
actgctctttaacaatttatcagacaatctgtgtgggcactcgaccggaattatcgattaactttattattaaa
aattaaagaggtatatattaatgtatcgattaaataaggaggaataaaccatggaagctcgtcgttctgcg
aactacgaacctaacagctgggactatgattacctgctgtcctccgacacggacgagtccatcgaagtata
caaagacaaagcgaaaaagctggaagccgaagttcgtcgcgagattaataacgaaaaagcagaatttct
gaccctgctggaactgattgacaacgtccagcgcctgggcctgggttaccgtttcgagtctgatatccgtgg
tgcgctggatcgcttcgtttcctccggcggcttcgatgcggtaaccaagacttccctgcacggtacggcact
gtctttccgtctgctgcgtcaacacggttttgaggtttctcaggaagcgttcagcggcttcaaagaccaaaac
ggcaacttcctggagaacctgaaggaagatatcaaagctatcctgagcctgtacgaggccagcttcctggc
tctggaaggcgaaaacatcctggacgaggcgaaggttttcgcaatctctcatctgaaagaactgtctgaag
aaaagatcggtaaagagctggcagaacaggtgaaccatgcactggaactgccactgcatcgccgtactc
agcgtctggaagcagtatggtctatcgaggcctaccgtaaaaaggaggacgcgaatcaggttctgctgga
gctggcaattctggattacaacatgatccagtctgtataccagcgtgatctgcgtgaaacgtcccgttggtg
gcgtcgtgtgggtctggcgaccaaactgcactttgctcgtgaccgcctgattgagagcttctactgggccgt
gggtgtagcattcgaaccgcaatactccgactgccgtaactccgtcgcaaaaatgttttctttcgtaaccatt
atcgacgatatctacgatgtatacggcaccctggacgaactggagctgtttactgatgcagttgagcgttgg
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aaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttga
gatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgcc
ggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtcct
tctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatc
ctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccg
gataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcgga
caggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcct
ggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagggggg
cggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcaca
tgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgcc
gcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttc
tccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag
ttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacaccc
gctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggag
ctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaag
gcgaagcggcatgcatttacgttgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgc
ccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccg
gtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaa
gtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacag
tcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaat
ctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaa
agcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccagg
atgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatc
aacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccag
caaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatc
tcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaaca
aaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgg
gcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgat
accgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaac
cagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcac
tggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcatta
atgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttag
cgcgaattgatctg
pDW33转化进CMP271中
进行该步骤，以构建异戊二烯生产菌株CMP272，通过电穿孔，将pDW33质粒转化进CMP271中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为CMP272。
D.用于建立REMG39菌株的策略
使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，将Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184电穿孔进菌株CMP272中。Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184的质粒制备由Gene Oracle，Inc.提供。Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184已经描述在下文中(参见，例如，实施例11)。
Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184转化进CMP272中
为了建立REMG39实验菌株，通过电穿孔，将Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184转化进CMP272中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有羧苄西林(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为REMG39。
E.对比CMP272和REMG39在14L发酵中的生长、异戊二烯生产、DXP代谢物特性和碳的成品收率
在14L发酵条件下，将亲代菌株CMP272与实验菌株REMG39进行了对比。分别在图79和图80A-B中，解释了T.elongatus IspG(GcpE)和IspH(LytB)活性对异戊二烯生产和经过大肠杆菌的其它内源DXP途径的总通量的益处。T.elongatus基因的表达使异戊二烯生产比亲代菌株CMP272提高了约2.7倍。尽管在最初的10小时时段内观察到REM G39菌株的更高的cMEPP水平，在以后的发酵部分中，REMG39菌株积累了比亲代菌株降低的cMEPP中间体水平，该观察与在指数后生长和最大CER生长期间的增加的比生产率相关联(参见图3B-D)。
F.菌株CMP272的大规模发酵
在15L规模，在补料分批培养物中，培养表达来自DXP途径的基因和异戊二烯合酶的大肠杆菌的异戊二烯生产。
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有成分一起加入去离子H2O中，并溶解。将该溶液加热灭菌(123℃ 20分钟)。用氢氧化铵(28％)调节pH至7.0，并定容。葡萄糖10g、维生素汞(Mercury Vitamin)溶液8mL和抗生素在灭菌后加入，并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
维生素汞溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g，D-(+)-生物素1.0g，烟酸1.0g，D-泛酸4.8g，盐酸吡多辛4.0g。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
补料溶液(每千克)：
葡萄糖0.57kg，去离子H2O 0.38kg，K2HPO4 7.5g，和100％Foamblast 10g。将所有组分混合到一起，并高压灭菌。在溶液已经冷却至25℃以后，加入维生素汞溶液6.7mL。
使用大肠杆菌BL21细胞，在15L生物反应器中进行发酵，所述细胞过表达dxp途径中的第一种酶(GI1.6-dxs)、DXP途径(GI1.6y-IDI)、低等MVA途径(PL.2-mKKDyI)中的最后一种酶和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pDW33)，并含有包含恢复的17,257碱基对染色体galM的源自MG1655(菌株名CMP272)的区域。进行该实验，以监测在希望的发酵pH7.0和温度34℃从葡萄糖形成异戊二烯。融化大肠杆菌菌株的冷冻瓶，并接种进用于生物反应器的胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。在接种物生长至在550nm测量(OD550)的光密度1.0以后，使用500mL接种15L生物反应器，并使初始罐体积达到5L。
在指数速率加入补料溶液，直到达到4.8g/min的最高加料速率。在该时间以后，以小于或约等于4.8g/min的速率，补加葡萄糖补料，以满足代谢需要。在45小时发酵过程中递送给生物反应器的葡萄糖的总量是5.6kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，进行诱导。当细胞处于OD 8时，将IPTG注射加入罐中，达到200uM的浓度。
使用Hiden质谱仪，测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵过程而增加，在45小时时达到最大值0.97g/L。
用于计算异戊二烯效价的等式：从t＝0-45小时的∫(即时的异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt[＝]g/L培养液
用于计算比生产率水平的等式：(mg异戊二烯t-mg异戊二烯to)/[(OD550t*L培养液t-OD550to*L培养液to)/(2.7OD*L/g细胞)]/(t-t0)[＝]mg异戊二烯/g细胞/小时
G.菌株REMG39的大规模发酵
在15L规模，在补料分批培养物中，培养表达来自DXP途径的基因和异戊二烯合酶的大肠杆菌的异戊二烯生产。
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有成分一起加入去离子H2O中，并溶解。将该溶液加热灭菌(123℃ 20分钟)。用氢氧化铵(28％)调节pH至7.0，并定容。葡萄糖10g、维生素汞溶液8mL和抗生素在灭菌后加入，并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
维生素汞溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g，D-(+)-生物素1.0g，烟酸1.0g，D-泛酸4.8g，盐酸吡多辛4.0g。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
补料溶液(每千克)：
葡萄糖0.57kg，去离子H2O 0.38kg，K2HPO4 7.5g，和100％Foamblast 10g。将所有组分混合到一起，并高压灭菌。在溶液已经冷却至25℃以后，加入Macro Salt溶液3.4mL、1000X改良痕量金属溶液0.8ml和维生素汞溶液6.7mL 。
Macro Salt溶液(每升)：
MgSO4*7H2O 296g，一水合柠檬酸296g，柠檬酸铁铵49.6g。将所有组分溶解于水中，定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
使用大肠杆菌BL21细胞，在15L生物反应器中进行发酵，所述细胞过表达dxp途径中的第一种酶(GI1.6-dxs)、DXP途径(GI1.6y-IDI)、低等MVA途径(PL.2-mKKDyI)中的最后一种酶、来自T.elongatus的DXP途径的各种其它基因(Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184)和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pDW33)，并含有包含恢复的17,257碱基对染色体galM的源自MG1655(菌株名REMG39)的区域。进行该实验，以监测在希望的发酵pH 7.0和温度34℃从葡萄糖形成异戊二烯。融化大肠杆菌菌株的冷冻瓶，并接种进用于生物反应器的胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。在接种物生长至在550nm测量(OD550)的光密度1.0以后，使用500mL接种15L生物反应器，并使初始罐体积达到5L。
在指数速率加入补料溶液，直到达到4.8g/min的最高加料速率。在该时间以后，以小于或约等于4.8g/min的速率，补加葡萄糖补料，以满足代谢需要。在56小时发酵过程中递送给生物反应器的葡萄糖的总量是7.0kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，进行诱导。当细胞处于OD 5时，将IPTG注射加入罐中，达到300uM的浓度。在36h的运行时间以后，定期分离出整个培养液，包括细胞群，以防止生物反应器的溢流。
使用Hiden质谱仪，测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵过程而增加，在56小时时达到最大值2.7g/L。
用于计算异戊二烯效价的等式：从t＝0-56小时的∫(即时的异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt[＝]g/L培养液
用于计算比生产率水平的等式：(mg异戊二烯t-mg异戊二烯to)/[(OD550t*L培养液t-OD550to*L培养液to)/(2.7OD*L/g细胞)]/(t-t0)[＝]mg异戊二烯/g细胞/小时
实施例25：DXP代谢物测定
A.代谢物提取：处理14L发酵罐样品
通过将几毫升发酵罐培养物抽入预先称重的装有9.0mL干冰冷却的甲醇的试管中，快速灭活细胞代谢。再次称量得到的样品，以计算抽取的细胞培养物的量，然后置于-80℃保存，直到进一步分析。为了提取代谢物，通过在-9℃在4500x g离心4min，沉淀500μL甲醇猝灭的发酵样品。然后重复提取沉淀物2次，第一次使用350μL用5mM乙酸铵水溶液(pH＝7.0)缓冲的85％甲醇，第二次使用350μL在乙酸铵缓冲液中的50％甲醇。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，合并所有3个上清液到一起，用于进一步分析。
代谢物定量
通过在Quantum三元四极质谱仪(Thermo Electron Corporation，San Jose，CA)上的LC-ESI-MS/MS，分析提取的代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行系统控制、数据获取和质谱数据评价。在Synergi 45μM Hydro-RP HPLC柱(150x 2mm，Phenomenex，USA)上进行LC分离，流速为0.4mL/min，柱温度为40℃。LC梯度为t＝0min，12％B；t＝5min，12％B；t＝9min，23％B；t＝20min，99％B；t＝23min，99％B；t＝24min，12％B；t＝29min，12％B，其中溶剂A是在水中的10mM三丁胺/15mM醋酸，溶剂B是LCMS-级甲醇。样品注射体积是10μL。
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，245.0(对于IPP和DMAPP)，260.0(对于HDMAPP)，和277.0(对于cMEPP)，381.1(对于FPP)，520.1(对于CDP-ME)，600.0(对于CDP-MEP)。使用通过注射对应的标准品(Echelon Biosciences Inc)而得到的校正曲线，基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。因为不可得到商业标准品，以任意单位表示CDP-MEP的浓度。基于下述标准假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
实施例26：增加的IspG活性的结果
该实施例证实，当发生在没有增加的FldA表达情况下时，增加的IspG活性对异戊二烯生产是有害的。
使用14-L REMG39得到的数据表明，尽管REMG39中的异戊二烯生产增加，该菌株的IspG活性仍然受到限制；这反映为，REMG39菌株在大部分发酵中保持大约19mM cMEPP水平(参见图80B)。提高IspG活性的一种方法是，增加它的表达，正如用菌株REM E7_12所观察到的(图85B)。但是，经证实，与亲代菌株CMP272相比增加实验菌株REM E7_12中的IspG活性对异戊二烯生产是有害的(图9A)。增加由CMP272菌株背景产生的IspG活性的一种替代方法是，增加fldA表达(实验菌株REMC9_12；图85B)。在小规模测得的增加的IspG活性和内源IspH活性以及提高的来自CMP272背景的异戊二烯生产的最大益处是，共表达fldA和ispG(实验菌株REM D6_12；图85)。
A.实验菌株REM C9_12，REM D6_12，和REM E7_12的构建
使用标准的分子生物学技术(Sambrook等人，1989)，构建GI1.6fldA/pCL、GI1.6fldA-ispG/pCL和GI1.6ispG/pCL。pCL1920(pCL)克隆载体已经描述在出版物中，参见，例如，Lerner，C.G.等人，Nucleic AcidsResearch，Vol.18：4631(1990)。图82-84描绘了得到的质粒构建体。将CMP272菌株用于下述的转化。
将来自菌株REM I6_4的染色体DNA用作PCR模板，用于制备包含GI1.6fldA的PCR片段，将其用于建立GI1.6fldA/pCL。菌株REM I6_4的制备如下所述。将最终源自DXP操纵子pET24a质粒的DNA(参见，例如，实施例11)用作PCR模板，用于制备包含ispG和GI1.6ispG的PCR片段，将其分别用于建立GI1.6fldA-ispG/pCL和GI1.6ispG/pCL。以前已经描述了使用的DXP操纵子pET24a质粒和GI1.6gcpE-lytB-yidi pCRBlunt II TOPO载体PCR模板(参见，例如，实施例11)。
B.制备REM I6_4，即GI1.6fldA/pCL的前体
根据生产商的说明书，使用来自Gene Bridges GmbH的Red/ET系统，进行在该实施例中描述的GI 1.X-启动子插入和随后的抗生素抗性标志物的环出。使用菌株BL21(DE3)(Invitrogen)。将BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案用于所述的电穿孔。
引物
fldA证实-F 5’tgattccgcaagactgcctgt
fldA证实-R 5’ttcggtattaccggtgtcgct
fldA cmpGI1.X-F 5’ctatgattgc ctttatccgt gggcaatttt ccacccccataattaaccctcactaaagggcggccgc
fldA cmpGI1.X-R 5’aagatgccagtgatagccatgagtgaaataacctcttgaaggttacctccgggaaacgcggttgatttgtttagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatngtcaagggcgtgacggctcgc taatacgactcactatagggctcgag
*对于GI1.6fldA的情况，上面的引物序列中的N＝T。
顶部Gb的CMP 5’actgaaacgttttcatcgctc
底部Pgb2 5’ggtttagttcctcaccttgtc
使用图81所示的Gene Bridges GmbH方法，将GI1.X启动子导入内源fldA编码区的上游。使用引物集合jfldA cmpGI1.X-F/fldAcmpGI1.X-R，通过PCR，扩增抗生素抗性盒GB-CMP。引物含有40个与在fldA编码区的5’侧紧邻的区域具有同源性的碱基，以允许在有pRed-ET质粒存在下在电穿孔PCR产物以后在特定基因座处重组。在该图中也描绘了在翻转酶-介导的抗生素标志物切除以后，FRT“疤痕”序列保留。
GB-CmpR-fldA片段的扩增
为了扩增GB-CmpR盒，该盒用于将GI 1.X-启动子插fldA基因座上游紧邻处，设计下述的PCR反应：
1ul模板(100ng GB-CmpR)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)fldA cmpGI1.X-F
1.25ul引物(10uM)fldA cmpGI1.X-R
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，(95℃x 30秒，63℃x 30秒，72℃x 2min.)x 29循环；72℃x 5min.，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在0.8％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。得到的储备物是GB-CmpR-GI 1.X-fldA片段。
GB-CmpR-GI 1.X-fldA PCR产物整合进BL21(DE3)/pRed-ET菌株中
通过电穿孔，将pRed-ET载体(Gene Bridges试剂盒)转化进BL21(DE3)中，得到菌株DW30(BL21(DE3)/pRed-ET)。将纯化的GB-CmpR-GI 1.X-fldA PCR片段电穿孔进DW30中。在L培养液中恢复转化体，然后涂布在含有氯霉素(10μg/ml)的L琼脂上。使用引物fldA证实-F、fldA证实-R、顶部GB的CMP和底部Pgb2，通过PCR，分析氯霉素抗性的菌落中GB-CmpR盒和GI 1.X-启动子的存在。使用fldA证实-R和顶部GB的CMP引物(Sequetech；Mountain View，CA)，对来自许多转化体的PCR片段测序，鉴别出不同的目标GI 1.X-fldA菌株。氯霉素抗性的菌株BL21(DE3)CMP::GI1.6fldA被命名为REM I6_4。
C.用于建立REM C9_12的策略
使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，将GI1.6fldA/pCL电穿孔进CMP272中。使用编码GI1.6fldA的菌株REM I6_4的细胞作为用于载体构建的PCR模板。
引物序列
5’SaII GI1.X-5’cgag gtcgac gcgagccgtcacgcccttgac
3’NruI/SacII fldA stop  -5’gctc tcgcga gagc ccgcggtcaggcattgagaatttcgtcgag
M13(-20)5’GTAAAACGACGGCCAGT
M13 Reverse 5’CAGGAAACAGCTATGAC
GI1.6fldA片段的扩增
为了扩增GI1.6fldA片段，用于将GI1.6fldA片段插入pCL中，设计下述的PCR反应：
1ul模板(大约1ul体积的I6_4细胞)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)5’SalI GI1.X
1.25ul引物(10uM)3’NruI/SacII fldA stop
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，60℃x 30秒，72℃x 3min.]x 29循环；72℃x 5min.，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。得到的储备物是GI 1.6-fldA片段。
GI1.6fldA片段克隆进pCL中
根据生产商的说明书，用SalI(Roche)消化约600ng GI1.6fldA片段，并根据生产商的说明书，用SalI和SmaI(Roche)消化大约200ng pCL质粒。随后组合消化物，并用Qiagen QiaQuick凝胶提取试剂盒净化。根据生产商建议的方法，使用来自New England Biolabs的T4 DNA连接酶，连接约一半的净化的切割的DNA。使用标准的热休克方法(Sambrook等人，1989)，用连接反应物转化化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在L培养液中恢复1小时，然后涂布在含有大观霉素(50μg/ml)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL，在40μg/ml；Sigma)的L琼脂上。选择白色的大观霉素抗性的菌落，在含有大观霉素(50μg/ml)的L培养液中培养过夜，并收获，用于以后的质粒制备。使用Qiagen Qiaprep SpinMiniprep试剂盒，分离质粒构建体。使用引物M13(-20)和M13 Reverse，对目标质粒制品测序(Sequetech；Mountain View，CA)，并鉴别正确的GI1.6fldA/pCL克隆，其已经被命名为菌株REM A1_11(TOP10w/GI1.6fldA/pCL；5’SalI-3’SacII/NruI未切割的(钝的3’)末端PCR片段进入pCL的5’SalI-3’Sma I)。GI1.6fldA/pCL载体图谱的图像如图82所示。
GI1.6fldA/pCL转化进CMP271中
为了建立生产异戊二烯的实验菌株REM C9_12，通过电穿孔，将GI1.6fldA/pCL质粒转化进CMP272中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有大观霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为REM C9_12。
用于建立REM D6_12的策略
使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，将GI1.6fldA-ispG/pCL电穿孔进CMP272中。使用DXP操纵子pET24a质粒作为用于载体构建的PCR模板。
引物序列
5’SacII Ec ispG w/rbs-5’tcca ccgcgg gctc gaa ggag atatacc atg cataac cag gct cca att caa
3’NruI Ec ispG stop-5’gctc tcgcga tta ttt ttc aac ctg ctg aac gtc
M13For-5’gttgtaaaacgacggccagt
5’BamHI Ec ispG w/rbs-5’tacg ggatcc atttga ggag taagcc atg cataac cag gct cca att caa
3’SacI Ec ispG w/stop-5’gctg gagctc cac tta ttt ttc aac ctg ctg aacgtc
pRA42-5’gatgatcaacatgacgcatggc
pRA43-5’cattccgatccgtattggcg
SacII-ispG-3’NruI片段的扩增
为了扩增用于插入GI1.6fldA/pCL中的ispG片段，设计下述的PCR反应：
1ul模板(大约1ul体积的I6_4细胞)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)5’SacII Ec ispG w/rbs
1.25ul引物(10uM)3’NruI Ec ispG stop
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，60℃x 30秒，72℃x 2min.]x 29循环；72℃x 5min.，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。得到的储备物是5’SacII-ispG-3’NruI片段。
GI1.6fldA片段克隆进pCL中
根据生产商的说明书，用Sac II(New England BioLabs)消化约600ng5’SacII-ispG-3’NruI片段，并根据生产商的说明书，用SacII和NruI(NewEngland BioLabs)消化大约200ng GI1.6fldA/CL质粒。随后组合消化物，并用Qiagen QiaQuick凝胶提取试剂盒净化。根据生产商建议的方法，使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)，连接约一半的净化的切割的DNA。使用标准的热休克方法(Sambrook等人，1989)，用连接反应物转化化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在L培养液中恢复1小时，然后涂布在含有大观霉素(50μg/ml)的L琼脂上。选择一些大观霉素抗性的菌落，在含有大观霉素(50μg/ml)的L培养液中培养过夜，并收获，用于以后的质粒制备。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒，分离质粒构建体。使用引物5’SacII Ec ispG、3’NruI Ec ispG stop、M13For、5’BamHI Ec ispG w/rbs、3’SacI Ec ispG w/stop、pRA42和pRA43，对目标质粒制品测序(Sequetech；Mountain View，CA)，并鉴别正确的GI1.6fldA-ispG/pCL克隆，其已经被命名为菌株REM D9_11(TOP10w/GI1.6fldA-ispG/pCL；5’Sac II-3’NruI未切割的(钝的3’末端)PCR片段进入pCL的5’SacII-3’NruI)。GI1.6fldA-ispG/pCL载体图谱的图像如图83所示。
GI1.6fldA-ispG/pCL转化进CMP271中
为了建立生产异戊二烯的实验菌株REM D6_12，通过电穿孔，将GI1.6fldA-ispG/pCL质粒转化进CMP272中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有大观霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为REM D6_12。
E.用于建立REM E7_12的策略
使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，将GI1.6ispG/pCL电穿孔进CMP272中。将GI1.6gcpE-lytB-yidi pCR Blunt II TOPO载体用作用于载体构建的PCR模板。
引物序列
5’SaIIGI1.X-5’cgag gtcgac gcgagccgtcacgcccttgac
3’SacI Ec ispG w/stop-5’gctg gagctc cac tta ttt ttc aac ctg ctg aacgtc
M13For 5’gttgtaaaacgacggccagt
M13Rev 5’tcacacaggaaacagctatga
GI1.6ispG片段的扩增
为了扩增用于插入pCL中的GI1.6ispG片段，设计下述的PCR反应：
1ul模板(大约1ul体积的I6_4细胞)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)5’SaII GI1.X
1.25ul引物(10uM)3’SacI Ec ispG w/stop
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，60℃x 30秒，72℃x 2min.]x 29循环；72℃x 5min.，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。得到的储备物是GI1.6ispG片段。
GI1.6ispG片段克隆进pCL中
根据生产商的说明书，用SalI和SacI(Roche)消化约600ng GI1.6ispG片段和200ng pCL载体。随后组合消化物，并用Qiagen QiaQuick凝胶提取试剂盒净化。根据生产商建议的方法，使用T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs)，连接约一半的净化的切割的DNA。使用标准的热休克方法(Sambrook等人，1989)，用连接反应物转化化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在L培养液中恢复1小时，然后涂布在含有大观霉素(50μg/ml)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL，在40μg/ml；Sigma)的L琼脂上。选择白色的大观霉素抗性的菌落，在含有大观霉素(50μg/ml)的L培养液中培养过夜，并收获，用于以后的质粒制备。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒，分离质粒构建体。使用引物3’SacI Ec ispG w/stop、M13For和M13Rev，对目标质粒制品测序(Sequetech；Mountain View，CA)，并鉴别正确的GI1.6ispG/pCL克隆，其已经被命名为菌株REM H5_11(TOP10w/GI1.6ispG/pCL；5’SalI-3’SacI PCR片段进入pCL的5’SalI-3’SacI)。GI1.6ispG/pCL载体图谱的图像如图84所示。
GI1.6ispG/pCL转化进CMP271中
为了建立生产异戊二烯的实验菌株REM E7_12，通过电穿孔，将GI1.6ispG/pCL质粒转化进CMP272中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有大观霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为REM E7_12。
F.分析实验菌株REM C9_12、REM D6_12和REM E7_12和亲代菌株CMP272的生长、异戊二烯生产和DXP代谢物积累。
分别在图85A和图85B中，在摇瓶试验中以及在DXP代谢物测定研究中，将亲代菌株CMP272与实验菌株(REM C9_12、REM D6_12和REME7_12)进行了对比。在图85A中，显示了在CMP272背景(菌株REME7_12)内表达单独的ispG的异戊二烯生产的有害的约20％降低。在图85A中，也描绘了与从CMP272宿主表达单独的fldA或ispG相比，与ispG一起小规模共表达fldA的异戊二烯生产的增加的益处。观察到REM D6_12菌株与亲代对照菌株CMP272相比异戊二烯生产提高了1.4倍。通过图85B中所述的代谢物特性，指示了增加fldA表达水平对菌株REM C9_12中的大肠杆菌IspG和IspH活性的内源水平的益处，以及提高过表达ispG的菌株REM D6_12内的IspH活性的益处。更具体地，与亲代菌株CMP272相比，菌株REM C9_12中的额外的FldA会降低IspG和IspH底物(分别是cMEPP和HDMAPP)的水平(cMEPP，17％降低；HDMAPP，16％降低)；同时观察到，与过表达单独的ispG的REM E7_12菌株相比，在(fldA和ispG)共同过表达菌株REM D6_12内的额外的FldA会使HDMAPP降低大约4.3倍。
生长
在30℃在TM3液体培养基(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0gMgSO4*7H2O)，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8，并加入适量H20，并过滤除菌)中，培养菌株CMP272、REM C9_12、REM D6_12和REM E7_12作为2-5ml培养物，所述培养基补充了终浓度0.1％酵母提取物和1.0％葡萄糖，并包括大观霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至600uM的浓度，诱导LacI-调节的基因表达。通过使用Eppendorf Biophotometer波谱仪(Eppendorf)记录培养物在600nm测得的每个光密度，定期地监测生长。
异戊二烯生产
使用顶空试验，分析异戊二烯生产。对于摇瓶培养物，将200ul培养物从摇瓶转移至2ml CTC顶空瓶(SUN-SRI 2mL HS瓶，VWR#66020-950，和帽，VWR#66008-170)。旋紧帽，在250rpm摇动下，在相同温度温育瓶。30分钟以后，从培养箱取出瓶，并分析。使用连接了CTCAnalytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(15m x 0.25mm；0.25μm膜厚)来分离分析物。将取样仪设定为注入100μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续0.6分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在0-0.42分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这些条件下，在大约0.49分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至5000μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。将每个菌株的比生产率报告为μg/L OD小时。应当指出，温育30min的试验瓶中1900ul顶空∶100ul培养液之比导致下述的异戊二烯μg/L培养物向比生产率的转化：(通过GC-MS测得的异戊二烯/L)X(38)/(培养物的OD 600nm)。
DXP代谢物积累
分离了如上面所述和在图85B中描绘的生产异戊二烯的亲代菌株和实验菌株(分别是CMP272和REM C9_12、REM D6_12和REM E7_12)的DXP代谢物，并如下定量：
代谢物提取：处理来自小规模实验的样品
为了测量在小规模实验中的代谢物积累，在7500x g、在-9℃离心0.4-1.5mL细胞培养物3min。在离心以后，立即将上清液抽入清洁的试管中，用于分析分泌的代谢物，并将100μL干冰冷却的甲醇加入沉淀的细胞中。然后将得到的样品在-80℃保藏，直到进一步处理。
为了测定分泌的代谢物的浓度，将500μL甲醇加入300μL上清液中，将得到的混合物在20000xg、在4℃离心10min，以去除不溶物，然后进行LCMS分析。
为了从沉淀物提取代谢物(以后称作细胞内代谢物)，将10μL水加入含有甲醇的样品中，将沉淀物重新悬浮于得到的甲醇/水混合液中，并通过在4500x g离心4-min，沉淀出细胞碎片。重新提取沉淀物2次，第一次使用100μL用1mM乙酸铵水溶液(pH＝8.0)缓冲的75％甲醇，第二次使用90μL在乙酸铵缓冲液中的50％甲醇。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，合并所有3次提取的上清液，并通过LCMS进行分析。在提取操作过程中，在可能时将样品保持在冰上或在冷冻离心机中，以使代谢物降解最小化。
代谢物定量
通过在Quantum三元四极质谱仪(Thermo Electron Corporation，San Jose，CA)上的LC-ESI-MS/MS，分析提取的代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行系统控制、数据获取和质谱数据评价。在Synergi 45μM Hydro-RP HPLC柱(150x 2mm，Phenomenex，USA)上进行LC分离，流速为0.4mL/min，柱温度为40℃。LC梯度为t＝0min，12％B；t＝5min，12％B；t＝9min，23％B；t＝20min，99％B；t＝23min，99％B；t＝24min，12％B；t＝29min，12％B，其中溶剂A是在水中的10mM三丁胺/15mM醋酸，溶剂B是LCMS-级甲醇。样品注射体积是10μL。
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，245.0(对于IPP和DMAPP)，260.0(对于HDMAPP)，和277.0(对于cMEPP)，381.1(对于FPP)，520.1(对于CDP-ME)，600.0(对于CDP-MEP)。使用通过注射对应的标准品(Echelon Biosciences Inc)而得到的校正曲线，基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。因为不可得到商业标准品，以任意单位表示CDP-MEP的浓度。基于下述标准假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
实施例27：增加的IspG活性的影响
该实施例证实，作为菌株REM G4_11内IspH活性不足的结果，增加的IspG活性对异戊二烯生产是有害的。
如上面的实施例所述，在CMP272菌株背景内单独的fldA或与ispG组合的增加的表达会提高异戊二烯生产(图85)。将这些知识应用于菌株REMG39，总目标是，提高在该(基准)菌株背景内的IspG活性。换而言之(To reiterate)，REMG39菌株表现出这样的特征：其被认为会反映经过DXP途径朝向异戊二烯生产的通量在IspG活性点处的瓶颈(参见14-LREMG39实施例)。在图86A中，显示了小规模的REM G4_11菌株内增加IspG活性的益处(异戊二烯生产比亲代对照增加了35％)；但是，如图79和80所示，该益处没有转移到大规模发酵。在图80中所示的大规模发酵的结果表明，REM G4_11菌株需要增加的IspH活性；这反映为，在REM G4_1的指数期生长过程中观察到的高(＞15mM)HDMAPP水平(图80C)。
A.实验菌株REM G2_11和REM G4_11的构建
为了进一步提高由REMG39菌株背景产生的IspG活性，将载体构建体GI1.6fldA/CL和GI1.6fldA-ispG/pCL导入菌株中，随后分别制备实验菌株REM G2_11和REM G4_11。
B.用于建立REM G2_11和REM G4_11的策略
使用BIO RAD Gene Pulser系统和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，将GI1.6fldA/pCL和GI1.6fldA-ispG/pCL电穿孔进REMG39中。使用由菌株REM A1_11产生的GI1.6fldA/pCL和由菌株REM D9_11产生的GI1.6fldA-ispG/pCL的质粒制品；这些菌株和构建体如上所述。
GI1.6fldA/pCL和GI1.6fldA-ispG/pCL转化进CMP271中
为了建立生产异戊二烯的实验菌株REM G2_11和REM G4_11，通过电穿孔，分别将GI1.6fldA/pCL和GI1.6fldA-ispG/pCL质粒转化进REMG39中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有大观霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株分别被命名为REM G2_11和REM G4_11。
C.分析实验菌株REM G2_11、REM G4_11和亲代菌株REMG39的生长、异戊二烯生产和DXP代谢物积累
在摇瓶试验中以及在DXP代谢物测定研究中，将亲代菌株REMG39与实验菌株(REM G2_11、REM和REM G4_11)进行了对比。在图86A中，描绘了在REMG39背景内由GI1.6fldA/pCL和GI1.6fldA-ispG/pCL的存在提供的异戊二烯生产的增加。在3.5小时时间点，实验菌株REM G4_11生产的异戊二烯是亲代对照菌株REMG39的约1.35倍，而在3.5小时时间点，REM G2_11生产的异戊二烯是亲代对照的约1.25倍。从图86B可见，发现两个实验菌株REM G2_11和REM G4_11在3.5小时时间点积累比亲代菌株REMG39更少的IspG底物cMEPP(REMG2_11具有亲代对照cMEPP水平的大约66％；REM G4_11具有亲代对照cMEPP水平的大约9％)。但是，REM G4_11菌株没有积累比亲代对照和实验菌株REM G2_11高5.4倍水平的HDMAPP，即IspH的底物(图86B)。
生长
在补充了终浓度0.1％酵母提取物和1.0％葡萄糖且包括大观霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)的TM3液体培养基(13.6g K2PO4，13.6gKH2PO4，2.0g MgSO4*7H2O)，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8，并加入适量H20，并过滤除菌)中在30℃培养菌株REMG39、REMG2_11和REM G4_11，作为2-5ml培养物。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至400uM的浓度，诱导LacI-调节的基因表达。通过使用Eppendorf Biophotometer波谱仪(Eppendorf)记录培养物在600nm测得的每个光密度，定期地监测生长。
异戊二烯生产
使用顶空试验，分析异戊二烯生产。对于摇瓶培养物，将200ul培养物从摇瓶转移至2ml CTC顶空瓶(SUN-SRI 2mL HS瓶，VWR#66020-950，和帽，VWR#66008-170)。旋紧帽，在250rpm摇动下，在相同温度温育瓶。30分钟以后，从培养箱取出瓶，并分析。使用连接了CTCAnalytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(15m x 0.25mm；0.25μm膜厚)，分离分析物。将取样仪设定为注入100μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续0.6分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在0-0.42分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这些条件下，在大约0.49分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至5000μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。将每个菌株的比生产率报告为μg/L OD小时。温育30min的试验瓶中1900ul顶空∶100ul培养液之比导致下述的异戊二烯μg/L培养物向比生产率的转化：(通过GC-MS测得的异戊二烯/L)X(38)/(培养物的OD 600nm)。
DXP代谢物积累
分离了如上面所述和在图10B中描绘的生产异戊二烯的亲代菌株和实验菌株(分别是REMG39和REM G2_11和REM G4_11)的DXP代谢物，并如下定量：
代谢物提取：处理来自小规模实验的样品
为了测量在小规模实验中的代谢物积累，在7500xg、在-9℃离心0.4-1.5mL细胞培养物3min。在离心以后，立即将上清液抽入清洁的试管中，用于分析分泌的代谢物，并将100μL干冰冷却的甲醇加入沉淀的细胞中。然后将得到的样品在-80℃保藏，直到进一步处理。
为了测定分泌的代谢物的浓度，将500μL甲醇加入300μL上清液中，将得到的混合物在20000xg、在4℃离心10min，以去除不溶物，然后进行LCMS分析。
为了从沉淀物提取代谢物(以后称作细胞内代谢物)，将10μL水加入含有甲醇的样品中，将沉淀物重新悬浮于得到的甲醇/水混合液中，并通过在4500x g离心4-min，沉淀出细胞碎片。重新提取沉淀物2次，第一次使用100μL用1mM乙酸铵水溶液(pH＝8.0)缓冲的75％甲醇，第二次使用90μL在乙酸铵缓冲液中的50％甲醇。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，合并所有3次提取的上清液，并通过LCMS进行分析。在提取操作过程中，在可能时将样品保持在冰上或在冷冻离心机中，以使代谢物降解最小化。
代谢物定量
通过在Quantum三元四极质谱仪(Thermo Electron Corporation，San Jose，CA)上的LC-ESI-MS/MS，分析提取的代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行系统控制、数据获取和质谱数据评价。在Synergi 45μM Hydro-RP HPLC柱(150x 2mm，Phenomenex，USA)上进行LC分离，流速为0.4mL/min，柱温度为40℃。LC梯度为t＝0min，12％B；t＝5min，12％B；t＝9min，23％B；t＝20min，99％B；t＝23min，99％B；t＝24min，12％B；t＝29min，12％B，其中溶剂A是在水中的10mM三丁胺/15mM醋酸，溶剂B是LCMS-级甲醇。样品注射体积是10μL。
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，245.0(对于IPP和DMAPP)，260.0(对于HDMAPP)，和277.0(对于cMEPP)，381.1(对于FPP)，520.1(对于CDP-ME)，600.0(对于CDP-MEP)。基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。使用通过注射对应的标准品(Echelon Biosciences Inc)而得到的校正曲线。因为不可得到商业标准品，以任意单位表示CDP-MEP的浓度。基于下述标准假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
D.分析大规模的实验菌株REM G4_11的生长、异戊二烯生产和DXP代谢物积累。
在REM G4_11细胞中存在的增加的HDMAPP高于亲代对照菌株；但是，在REM G4_11细胞中测得的平均的0.63mM HDMAPP细胞内浓度明显小于已经与差的细胞生长和减少的异戊二烯生产相关联的＞10mM细胞内HDMAPP水平(参见图10B)。但是，令人惊讶地，菌株REM G4_11表现地不甚好，在14-L发酵罐规模生产的异戊二烯是亲代对照的大约1/3(图3)。经发现，观察到在小规模的REM G4_11细胞中发生的中等HDMAPP积累在大规模发酵条件下会增大，达到＞20mM的细胞内HDMAPP水平(图4C)。观察到的REM G4_11菌株与亲代对照菌株REMG39相比cMEPP的降低和对应的HDMAPP的增加强烈地提示：在REM G4_11菌株内的IspG活性已经提高，DXP通量中的瓶颈现在存在于REM G4_11菌株中的IspH活性点处。
E.菌株REM G4_11的大规模发酵
亲代菌株REMG39的大规模发酵如上所述。在15L规模，在补料分批培养物中，培养表达来自DXP途径的基因和异戊二烯合酶的大肠杆菌的异戊二烯生产。
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有成分一起加入去离子H2O中，并溶解。将该溶液加热灭菌(123℃ 20分钟)。用氢氧化铵(28％)调节pH至7.0，并定容。葡萄糖10g、维生素汞溶液8mL和抗生素在灭菌后加入，并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl  10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
维生素汞溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g，D-(+)-生物素1.0g，烟酸1.0g，D-泛酸4.8g，盐酸吡多辛4.0g。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
补料溶液(每千克)：
葡萄糖0.57kg，去离子H2O 0.38kg，K2HPO4 7.5g，和100％Foamblast 10g。将所有组分混合到一起，并高压灭菌。在溶液已经冷却至25℃以后，加入Macro Salt溶液3.4mL、1000X改良痕量金属溶液0.8ml和维生素汞溶液6.7mL。
Macro Salt溶液(每升)：
MgSO4*7H2O 296g，一水合柠檬酸296g，柠檬酸铁铵49.6g。将所有组分溶解于水中，定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
使用大肠杆菌BL21细胞，在15L生物反应器中进行发酵，所述细胞过表达dxp途径中的第一种酶(GI1.6-dxs)、DXP途径(GI1.6y-IDI)、低等MVA途径(PL.2-mKKDyI)中的最后一种酶、来自T.elongatus的DXP途径的各种其它基因(Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184)、大肠杆菌ispG和fldA基因(GI1.6fldA-ispG/pCL)和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pDW33)，并含有包含恢复的17,257碱基对染色体galM的源自MG1655(菌株名REM G4_11)的区域。进行该实验，以监测在希望的发酵pH 7.0和温度34℃从葡萄糖形成异戊二烯。融化大肠杆菌菌株的冷冻瓶，并接种进用于生物反应器的胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。在接种物生长至在550nm测量(OD550)的光密度1.0以后，使用500mL接种15L生物反应器，并使初始罐体积达到5L。
在指数速率加入补料溶液，直到达到4.9g/min的最高加料速率。在该时间以后，以小于或约等于4.9g/min的速率，补加葡萄糖补料，以满足代谢需要。在44小时发酵过程中递送给生物反应器的葡萄糖的总量是3.0kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，进行诱导。在给罐首次接种时，初始IPTG浓度是50uM。在接下来的5小时内，注射加入50uM IPTG，使得当细胞处于OD55010时，IPTG浓度达到350uM。
使用Hiden质谱仪，测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵过程而增加，在44小时时达到最大值0.98g/L。
用于计算异戊二烯效价的等式：从t＝0-44小时的∫(即时的异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt[＝]g/L培养液
用于计算比生产率水平的等式：(mg异戊二烯t-mg异戊二烯to)/[(OD550t*L培养液t-OD550to*L培养液to)/(2.7OD*L/g细胞)]/(t-t0)[＝]mg异戊二烯/g细胞/小时
实施例28：DXP代谢物测定
A.代谢物提取：处理14L发酵罐样品。
通过将几毫升发酵罐培养物抽入预先称重的装有9.0mL干冰冷却的甲醇的试管中，快速灭活细胞代谢。再次称量得到的样品，以计算抽取的细胞培养物的量，然后置于-80℃保存，直到进一步分析。为了提取代谢物，通过在-9℃在4500x g离心4min，沉淀500μL甲醇猝灭的发酵样品。然后重复提取沉淀物2次，第一次使用350μL用5mM乙酸铵水溶液(pH＝7.0)缓冲的85％甲醇，第二次使用350μL在乙酸铵缓冲液中的50％甲醇。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，合并所有3个上清液到一起，用于进一步分析。
B.代谢物定量
通过在Quantum三元四极质谱仪(Thermo Electron Corporation，San Jose，CA)上的LC-ESI-MS/MS，分析提取的代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行系统控制、数据获取和质谱数据评价。在Synergi 45μM Hydro-RP HPLC柱(150x 2mm，Phenomenex，USA)上进行LC分离，流速为0.4mL/min，柱温度为40℃。LC梯度为t＝0min，12％B；t＝5min，12％B；t＝9min，23％B；t＝20min，99％B；t＝23min，99％B；t＝24min，12％B；t＝29min，12％B，其中溶剂A是在水中的10mM三丁胺/15mM醋酸，溶剂B是LCMS-级甲醇。样品注射体积是10μL。
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，245.0(对于IPP和DMAPP)，260.0(对于HDMAPP)，和277.0(对于cMEPP)，381.1(对于FPP)，520.1(对于CDP-ME)，600.0(对于CDP-MEP)。基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。使用通过注射对应的标准品(Echelon Biosciences Inc)而得到的校正曲线。因为不可得到商业标准品，以任意单位表示CDP-MEP的浓度。基于下述标准假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
实施例29：IspH酶的表达增加异戊二烯生产，并同时证实维持更高的DXP代谢物水平的积累
该实施例证实了来自鱼腥藻属PCC7120的IspH酶在菌株REMH8_12中的表达会增加异戊二烯生产，并同时证实在表现出增加的IspG活性的REM H8_12菌株中维持更高的DXP代谢物水平的积累。
在上面的实施例中用实验菌株REM G4_11产生的数据指示，在增强的DXP通量菌株内增加的IspG活性需要被足够的IspH活性平衡，才能避免在14L发酵过程中高水平的HDMAPP积累。已经在小规模和大规模实验中将超过10mM的HDMAPP(IspH的底物)细胞内水平与差的细胞生长、降低的经过DXP途径的通量和由此导致的异戊二烯生产菌株的减少的异戊二烯生产相关联。因此，通过过表达鱼腥藻属PCC7120的ispH等位基因，实现了在增强的DXP途径菌株(REM I7_11；下面描述)内增加的IspH活性，由此产生实验菌株REM H8_12。在图89中证实了由鱼腥藻属PCC7120的IpsH的表达所提供的增加的IspH活性对实验菌株REMH8_12的异戊二烯生产的小规模益处。在14L规模，实验菌株REM H8_12生产了为表现出增强的IspG活性(由GI1.6fldA-ispG/pCL提供)的菌株记录的最高(2.6g/L)异戊二烯效价(图90A)。此外，不同于在14L规模的REM G4_11菌株，菌株REM H8_12能够维持经过DXP途径的通量，正如维持的MEPP和cMEPP中间体的积累所指示的(对比图80C至图90C)。
A.实验菌株REM H8_12和亲代菌株REM I7_11的构建。
REM I7_11和REM H8_12是WW119的衍生物。通过用质粒pDW33对菌株WW103电穿孔，构建该菌株(关于WW119的构建，参见实施例30)。WW119表现出提高的DXP-通量，但是产生与以前的亲代菌株CMP272类似的异戊二烯水平；这可能是由于通量在IspG点处的瓶颈。与CMP272菌株相比，WW119包含2个改进。这些有益的修饰包括增加的dxs表达和增加的dxr表达，并在下文中描述。通过将GI1.6fldA-ispG/pCL导入WW119中，制备REM I7_11，并通过将Ptac鱼腥藻属ispH aspA term/pEWL454转入REM I7_11中，制备REM H8_12；通过电穿孔转化方法，将两个质粒整合进它们的对应的宿主菌株中。
引物
5’AseI F-pgl pET-15b 5’cagtct ATTAATatgAAGCAAACAGTTTATATC
3’BamHI R-pgl pET-15b 5’TAGCAGCC GGATCCTTAGTGTGCGTTAACCACCAC
EL-1098：5’TAACTTTAAGGAGGTATACATATGGAGCTCACGCGTGCGGCCGCCTCGAGCTGCAGTACAAATAAAAAAGGCACGTCAG
EL-1099：5’GGATCCGTAATCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGAATTCCTTTC CAGTCGGGAAACCTGTCG
EL-1100：5’CGTCGTTTTACAACGTCGTG
EL-1101：5’GAACTCCAAGACGAGGCAGC
EL-1102：5’GTGATATTGCTGAAGAGCTTGG
EL-1103：5’GGACTCAAGACGATAGTTACC
EL-1104：5’CACGACAGGTTTCCCGACTGG
EL-1150 5’GAGCGCCCAATACGCAAACC
Neo.21 5’GGCGATAGAAGGCGATGC
REM I1_9的pgl基因座的扩增
为了验证/扩增REM I1_9的pgl基因座，设计下述的PCR反应：
1ul模板(大约1ul体积的I1_9细胞)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)5’AseI F-pgl pET-15b
1.25ul引物(10uM)3’BamHI R-pgl pET-15b
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，55℃x 30秒，72℃x 2min.]x 29循环；72℃x 5min.，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增。选择pgl+验证的克隆作为REM I1_9。
pEWL454片段的扩增
为了制备pEWL454，设计下述的PCR反应：
1ul模板(大约1ul体积的pK184w/aspA term载体(Gene Oracle，Inc.))
5ul 10X Pfu Ultra II Fusion DNA聚合酶
2.5ul dNTP’s(10mM)
1.0引物(10uM)EL-1098
1.0引物(10uM)EL-1099
39.5ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的Pfu Ultra II Fusion DNA聚合酶
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，60℃x 30秒，72℃x 52sec.]x 29循环；72℃x 3min.，
4℃直到冷却(MJ Research PTC-200 Peltier热循环仪)
在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增。
菌株REM I1_9描述
使用菌株REM I1_9来克隆鱼腥藻属PCC7120ispH等位基因，其已经为在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化(由Gene Oracle，Inc.提供)。令人惊讶地，Gene Oracle，Inc.不能提供包含希望的克隆的大肠杆菌菌株。因此，使用菌株REM I1_9作为宿主，使用基于存活的策略，以得到Ptac鱼腥藻属ispH aspA term/pEWL454目标克隆。
菌株REM I1_9源自MD09-220(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT-ΔispH::FRT)，且已经在前面予以描述。经由标准的P1lystate/P1转导方法(Thomason等人，.2007)，将菌株MCM625的FRT-neo-FRT-GI1.6-dxs基因座转导进MD09-220的基因组中，将得到的卡那霉素抗性的菌株命名为REM C5_9。使用Gene Bridge的GmbH方法，使抗生素标志物环出，产生菌株REM H5_9。随后，使用标准的P1lystate/P1转导方法(Thomason等人，.2007)，将MG1655的pgl和galP区域转导进菌株REM H5_9中，并在含有0.4％w/v半乳糖和500uM甲羟戊酸的M9琼脂(Na2HPO4 6g/L、KH2PO4 3g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl0.5g/L、0.1mM CaCl2、2mM MgSO4、1.5％琼脂)上选择细胞的生长。通过PCR(参见上面)，验证pgl基因座在利用半乳糖的、甲羟戊酸-依赖性的、卡那霉素敏感的细胞中的存在，并选择一个克隆作为REM I1_9(BL21(DE3)PL.2mKKDyI::FRT-ΔispH::FRT pg]+ FRT::GI1.6-dxs)。
鱼腥藻属PCC7120ispH等位基因克隆进pEWL454中
根据生产商建议的方法，使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)，将约90ng预切割的5’BamHI-3’PstI纯化的DNA片段(其包含为了在大肠杆菌中表达进行了密码子优化的鱼腥藻属PCC7120ispH等位基因)(由Gene Oracle，Inc.提供)连接至预切割的5’BamHI-3’PstI纯化的DNA载体骨架pEWL454(由Gene Oracle，Inc.提供)上，后者在pK184(Jobling和Holmes，1990)衍生的质粒内包含被多克隆位点(MCS)隔开的tac启动子和aspA终止子序列。在pEWL454中存在的aspA终止子序列由GeneOracle，Inc.合成。使用上述的PCR方法，去除在pK184中存在的lac启动子序列，并使用上面详述的寡物(Integrated DNA Technologies)，插入包含在pEWL454内的tac启动子和MCS。根据生产商建议的方法，使用来自New England Biolabs的T4DNA连接酶，连接得到的PCR片段。使用标准的热休克方法(Sambrook等人，1989)，用连接反应物转化化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在L培养液中恢复1小时，然后涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上。选择卡那霉素抗性的克隆，在含有卡那霉素(50μg/ml)的L培养液中培养过夜，并收获用于以后的质粒制备。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒，分离质粒构建体。使用引物EL-1100、EL-1101、EL-1102、EL-1103和EL-1104，对目标质粒制品测序(Quintara；Albany，CA)，鉴别出正确的pEWL454克隆，其已经被命名为菌株EWL454(TOP10w/pEWL454；pK184-衍生的包含Ptac-RBS-NdeI-SacI-MluI-NotI-XhoI-PstI-aspA终止子的克隆载体)。在图87中显示了图解pEWL454的图像。
使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，经由电穿孔，用连接反应物转化水洗过的REM I1_9细胞。在L培养液+500uM甲羟戊酸(可商业地得到，例如，Sigma-Aldrich)中在37℃恢复细胞1小时，然后涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上。选择在没有甲羟戊酸存在下生长的卡那霉素抗性的菌落，在含有卡那霉素(50μg/ml)的L培养液中培养过夜，并收获用于以后的质粒制备；鱼腥藻属ispH等位基因的存在，减轻了细胞的生长对甲羟戊酸的依赖性。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒，分离质粒构建体。使用引物EL-1105和Neo.21，对目标质粒制品测序(Sequetech；Mountain View，CA)，鉴别出正确的Ptac鱼腥藻属ispH aspAterm/pEWL454克隆，其已经被命名为菌株REM F5_12(REM I1_9w/Ptac鱼腥藻属ispH aspA term/pEWL454；5’BamHI-3’PstI合成的片段进入pEWL454的5’BamHI-3’PstI中)。在图88中显示了得到的Ptac鱼腥藻属ispH aspA term/pEWL454构建体的图像。
B.用于建立REM I7_11和REM H8_12的策略
通过将GI1.6fldA-ispG/pCL转化进WW119中，构建了REM I7_11。使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，通过电穿孔，进行转化。使用由菌株REMD9_11产生的GI1.6fldA-ispG/pCL的质粒制品；该菌株和对应的质粒构建体描述在下文中。
通过Ptac鱼腥藻属ispH aspA term/pEWL454的转化，构建了REMH8_12。使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，通过电穿孔，进行转化。从菌株REMF5_12制备Ptac鱼腥藻属ispH aspA term/pEWL454的质粒制品。
将GI1.6fldA-ispG/pCL转化进WW119中，和将Ptac鱼腥藻属ispHaspA term/pEWL454转化进REM I7_11中
为了建立生产异戊二烯的亲代菌株REM I7_11(从它衍生出实验菌株REM H8_12)，通过电穿孔，将GI1.6fldA-ispG/pCL质粒转化进WW119中。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有大观霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为REM I7_11。
然后通过电穿孔，用Ptac鱼腥藻属ispH aspA term/pEWL454转化REM I7_11。在L培养液中恢复转化体，并涂布在含有大观霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。得到的菌株被命名为REM H8_12。
C.分析小规模的实验菌株REM H8_12和亲代菌株REM I7_11的生长、异戊二烯生产和DXP代谢物积累。
在摇瓶试验中以及在DXP代谢物测定研究中，将亲代菌株REM I7_11与实验菌株REM H8_12进行了对比。在图89中，描绘了包含term/pEWL454构建体的Ptac鱼腥藻属ispH aspA的REM H8_12菌株超过亲代对照菌株REM I7_11的异戊二烯生产的增加的益处。在REMH8_12菌株中存在的与亲代菌株REM I7_11相比增加的IspH活性，反映为HDMAPP在3小时和3.75小时时间点平均降低了10倍(图89)。由鱼腥藻属PCC7120ispH等位基因的表达提供的该升高的IspH活性，允许REM H8_12实验菌株的异戊二烯生产比亲代对照增加2.1-3.2倍(图89)。REM H8_12实验菌株也比亲代菌株REM I7_11生长得适度更好(大约快20％)。
生长
在补充了终浓度0.1％酵母提取物和1.0％葡萄糖且包括大观霉素(50μg/ml)和羧苄西林(50μg/ml)的TM3液体培养基(13.6g K2PO4、13.6gKH2PO4、2.0g MgSO4*7H2O)、2.0g一水合柠檬酸、0.3g柠檬酸铁铵、3.2g(NH4)2SO4、0.2g酵母提取物、1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8，并加入适量H20，并过滤除菌)中，在30℃培养菌株REM I7_11和REM H8_12，作为2-5ml培养物。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至500uM浓度，诱导LacI-调节的基因表达。通过使用Eppendorf Biophotometer波谱仪(Eppendorf)记录培养物在600nm测得的每个光密度，定期地监测生长。
异戊二烯生产
使用顶空试验，分析异戊二烯生产。对于摇瓶培养物，将200ul培养物从摇瓶转移至2ml CTC顶空瓶(SUN-SRI 2mL HS瓶，VWR#66020-950，和帽，VWR#66008-170)。旋紧帽，在250rpm摇动下，在相同温度温育瓶。30分钟以后，从培养箱取出瓶，并分析。使用连接了CTCAnalytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(15m x 0.25mm；0.25μm膜厚)来分离分析物。将取样仪设定为注入100μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续0.6分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在0-0.42分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这些条件下，在大约0.49分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至5000μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。将每个菌株的比生产率报告为μg/L OD小时。温育30min的试验瓶中1900ul顶空∶100ul培养液之比导致下述的异戊二烯μg/L培养物向比生产率的转化：(通过GC-MS测得的异戊二烯/L)X(38)/(培养物的OD 600nm)。
DXP代谢物积累
分离了如上面所述和在图89中描绘的异戊二烯生产亲代菌株REMI7_11和实验菌株REM H8_12的DXP代谢物，并如下定量：
代谢物提取：处理来自小规模实验的样品
为了测量在小规模实验中的代谢物积累，在7500xg、在-9℃离心0.4-1.5mL细胞培养物3min。在离心以后，立即将上清液抽入清洁的试管中，用于分析分泌的代谢物，并将100μL干冰冷却的甲醇加入沉淀的细胞中。然后将得到的样品在-80℃保藏，直到进一步处理。
为了测定分泌的代谢物的浓度，将500μL甲醇加入300μL上清液中，将得到的混合物在20000xg、在4℃离心10min，以去除不溶物，然后进行LCMS分析。
为了从沉淀物提取代谢物(以后称作细胞内代谢物)，将10μL水加入含有甲醇的样品中，将沉淀物重新悬浮于得到的甲醇/水混合液中，并通过在4500x g离心4-min，沉淀出细胞碎片。重新提取沉淀物2次，第一次使用100μL用1mM乙酸铵水溶液(pH＝8.0)缓冲的75％甲醇，第二次使用90μL在乙酸铵缓冲液中的50％甲醇。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，合并所有3次提取的上清液，并通过LCMS进行分析。在提取操作过程中，在可能时将样品保持在冰上或在冷冻离心机中，以使代谢物降解最小化。
代谢物定量
通过在Quantum三元四极质谱仪(Thermo Electron Corporation，San Jose，CA)上的LC-ESI-MS/MS，分析提取的代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行系统控制、数据获取和质谱数据评价。在Synergi 45μM Hydro-RP HPLC柱(150x 2mm，Phenomenex，USA)上进行LC分离，流速为0.4mL/min，柱温度为40℃。LC梯度为t＝0min，12％B；t＝5min，12％B；t＝9min，23％B；t＝20min，99％B；t＝23min，99％B；t＝24min，12％B；t＝29min，12％B，其中溶剂A是在水中的10mM三丁胺/15mM醋酸，溶剂B是LCMS-级甲醇。样品注射体积是10μL。
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，245.0(对于IPP和DMAPP)，260.0(对于HDMAPP)，和277.0(对于cMEPP)，381.1(对于FPP)，520.1(对于CDP-ME)，600.0(对于CDP-MEP)。基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。使用通过注射对应的标准品(Echelon Biosciences Inc)而得到的校正曲线。因为不可得到商业标准品，以任意单位表示CDP-MEP的浓度。基于下述标准假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
D.分析14L发酵规模的实验菌株REM H8_12的生长、异戊二烯生产和DXP代谢物积累。
REM_H8_12在14L发酵中生产了2.6g/L异戊二烯(图14A)。与以前关于含有GI1.6fldA-ispG/pCL的菌株REM G4_11所观察到的对应值相比，除了增加的异戊二烯以外，REM H8_12实验菌株在整个14L发酵中维持大约2倍的MEP代谢物(DXR的产物)水平和大于15倍的cMEPP(IspG的底物)水平(对比图80C和图90C)。
E.菌株REM H8_12的大规模发酵
在15L规模，在补料分批培养物中，培养表达来自DXP途径的基因和异戊二烯合酶的大肠杆菌的异戊二烯生产。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl  10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
维生素汞溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g，D-(+)-生物素1.0g，烟酸1.0g，D-泛酸4.8g，盐酸吡多辛4.0g。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
补料溶液(每千克)：
葡萄糖0.57kg，去离子H2O 0.38kg，K2HPO47.5g，和100％Foamblast 10g。将所有组分混合到一起，并高压灭菌。在溶液已经冷却至25℃以后，加入Macro Salt溶液3.4mL、1000X改良痕量金属溶液0.8ml和维生素汞溶液6.7mL。
Macro Salt溶液(每升)：
MgSO4*7H2O 296g，一水合柠檬酸296g，柠檬酸铁铵49.6g。将所有组分溶解于水中，定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
使用大肠杆菌BL21细胞，在15L生物反应器中进行发酵，所述细胞过表达dxp途径中的第一种酶(GI1.6-dxs)、DXP途径(GI1.6y-IDI)、低等MVA途径(PL.2-mKKDyI)中的最后一种酶、来自T.elongatus的DXP途径的各种其它基因(Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184)、大肠杆菌ispG和fldA基因(GI1.6fldA-ispG/pCL)和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pDW33)，并含有包含恢复的17,257碱基对染色体galM的源自MG1655(菌株名REM H8_12)的区域。进行该实验，以监测在希望的发酵pH 7.0和温度34℃从葡萄糖形成异戊二烯。融化大肠杆菌菌株的冷冻瓶，并接种进用于生物反应器的胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。在接种物生长至在550nm测量(OD550)的光密度1.0以后，使用500mL接种15L生物反应器，并使初始罐体积达到5L。
在指数速率加入补料溶液，直到达到5.8g/min的最高加料速率。在该时间以后，以小于或约等于5.8g/min的速率，补加葡萄糖补料，以满足代谢需要。在44小时发酵过程中递送给生物反应器的葡萄糖的总量是4.4kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，进行诱导。当细胞处于OD5507时，将IPTG单次注射加入罐中，达到300uM的浓度。
使用Hiden质谱仪，测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵过程而增加，在44小时达到最大值2.6g/L。
用于计算异戊二烯效价的等式：从t＝0-84小时的∫(即时的异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt[＝]g/L培养液
F.DXP代谢物测定
A.代谢物提取：处理14L发酵罐样品
通过将几毫升发酵罐培养物抽入预先称重的装有9.0mL干冰冷却的甲醇的试管中，快速灭活细胞代谢。再次称量得到的样品，以计算抽取的细胞培养物的量，然后置于-80℃保存，直到进一步分析。为了提取代谢物，通过在-9℃在4500x g离心4min，沉淀500μL甲醇猝灭的发酵样品。然后重复提取沉淀物2次，第一次使用350μL用5mM乙酸铵水溶液(pH＝7.0)缓冲的85％甲醇，第二次使用350μL在乙酸铵缓冲液中的50％甲醇。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，合并所有3个上清液到一起，用于进一步分析。
代谢物定量
通过在Quantum三元四极质谱仪(Thermo Electron Corporation，San Jose，CA)上的LC-ESI-MS/MS，分析提取的代谢物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行系统控制、数据获取和质谱数据评价。在Synergi 45μM Hydro-RP HPLC柱(150x 2mm，Phenomenex，USA)上进行LC分离，流速为0.4mL/min，柱温度为40℃。LC梯度为t＝0min，12％B；t＝5min，12％B；t＝9min，23％B；t＝20min，99％B；t＝23min，99％B；t＝24min，12％B；t＝29min，12％B，其中溶剂A是在水中的10mM三丁胺/15mM醋酸，溶剂B是LCMS-级甲醇。样品注射体积是10μL。
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择先驱离子的下述的m/z值，以SRM模式检测目标代谢物：213.0(对于DXP)，215.0(对于MEP)，245.0(对于IPP和DMAPP)，260.0(对于HDMAPP)，和277.0(对于cMEPP)，381.1(对于FPP)，520.1(对于CDP-ME)，600.0(对于CDP-MEP)。基于由PO3 -产物离子(m/z＝79.0)产生的峰的积分强度，测定代谢物浓度。使用通过注射对应的标准品(Echelon Biosciences Inc)而得到的校正曲线。因为不可得到商业标准品，以任意单位表示CDP-MEP的浓度。基于下述标准假设，计算代谢物的细胞内浓度：在1mL处于OD＝200的培养物中，所有细胞的积分体积是50μL。
实施例30：发现Dxr的明显的生化反馈抑制及其负面效应的减轻
我们做出了令人惊奇的发现，即在DXP菌株中，异戊二烯的生产被关闭，同时细胞仍然处于旺盛的生长期。另外，这些细胞也积累1-脱氧木酮糖-5-磷酸，即Dxr的底物。不受理论的约束，解释该发现的一个可能的假设是，在遗传水平或在生化水平对该途径进行调节。Jawaid等人，PLoSOne，4(12)：e8288(2009)报道称，当在大肠杆菌中过表达时，一部分来自土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)的Dxr蛋白在ser177处被磷酸化。基于突变S177D和S177E导致无活性蛋白的发现，假定该磷酸化会灭活蛋白。我们随后证实，当与二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)或1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸(HMBPP)一起温育时，从大肠杆菌纯化的Dxr会被灭活。此外，证实了具有遗传修饰的脱氧木酮糖磷酸盐(DXP)途径的大肠杆菌菌株会积累DMAPP和/或HMBPP至高于在野生型中观察到的水平。不受理论的约束，基于Dxr的体外灭活和在工程化的DXP途径菌株中观察到的体内代谢物积累的结果，我们假定，该途径的关闭和1-脱氧木酮糖-5-磷酸的积累是由于工程化的菌株中的Dxr体内灭活。我们发现，通过再平衡途径酶和维持HDMAPP和DMAPP的水平在低于1-2mMDMAPP和1-2mM HDMAPP的浓度，可以防止工程化的菌株中该途径的关闭。在图90中例证了这些发现。图90A显示了菌株REM H8_12的异戊二烯生产，通过持续的异戊二烯生产和达到2.6g/L的效价，判断该菌株具有比REMG4_11(平衡较差的DXP途径菌株)改良的DXP途径。在图90的图板B中显示了REM H8_12的生长，同时在图79C中显示了REMG4_11的生长(灰色三角形)。在图90C中显示了REM H8_12的对应的代谢物水平。在8小时之前，HDMAPP水平低于1-2mM，且异戊二烯生产维持30小时或更久的阶段(图90A空心方框)。与此相比，图80C显示了REM G4_11的代谢物水平。HDMAPP水平明显高于1-2mM 10-12小时的时段，且异戊二烯生产仅维持了约10-15小时，比预期缩短15-20小时(图90A空心圆形)。该菌株的最终效价是0.98g/L。
A.方法
菌株描述
REM I7_11-该菌株源自下文详述的CMP271的修饰。用如下所述得到的P1裂解物MCM754，转导CMP271，所述MCM754包含修饰的PL.6启动子(DNA seq.#1)来替代在dxs基因前面的天然启动子。
整合在dxs.gb DNA seq.#1序列中的FRT-neo-FRT PL.x(修饰的)包括上游FRT至(且包括)dxs的ATG
cgcgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttccactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatgggatcggccattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacgatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaataaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacntaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgcaaaggaggtaaaaaaacatg
根据Gene Bridges说明书，环出有关的抗生素标志物，产生菌株WW102。另外用包含命名为gi1.6的启动子的P1裂解物MCM755(DNAseq.#2)，转导该菌株。
FRT-neo-FRT-gi1.x-dxr区域BL21.gb DNA seq#2；序列包括上游FRT至(且包括)dxr的ATG。
actaaagggcggccgcgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttccactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatgggatcggccattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacgatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaataaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattagcccttgacnatgccacatcctgagcaaataattcaaccacttttattcactaacaaatagctggtggaatatatg
靶向该启动子，以替换dxr基因的天然启动子。根据Gene Bridges说明书，环出抗生素标志物，产生菌株WW103。通过电穿孔，用质粒pDW33转化菌株WW103(实施例24部分C)，得到ispS，即异戊二烯合酶表达盒，得到的菌株被命名为WW119。
B.详述的菌株构建方法
菌株CMP271的构建
菌株的构建
P1裂解物MCM754和MCM755的构建如下所述：
引物(由Integrated DNA Technologies；Coralville，Iowa USA提供)
Figure BDA0000135516370002151
C.用于启动子整合的扩增子的建立
PL.6(修饰)-dxs
使用Herculase II Fusion试剂盒(Stratagene)，一式四份地进行PCR反应。
35μL ddH2O
10μL 5x缓冲液
1.25μL 10uM引物MCM320，(凝胶纯化的)
1.25μL 10uM引物MCM347，(凝胶纯化的)
0.5μL dNTP
1μL聚合酶
1μL FRT-PGK-gb2-neo-FRT模板DNA，Gene Bridges目录号K006
如下循环反应：
95℃x 2min，继之以(95℃x 15秒；55℃x 15秒；72℃x 1min)x30循环
72℃x 3分30秒，4℃直到冷却。
gi1.6-dxr
使用Herculase II Fusion试剂盒(Stratagene)，进行4个PCR反应。通过2μL DMSO的存在或不存在，改变反应，退火温度为55℃或60℃。
35μL ddH2O
10μL 5x缓冲液
1.25μL 10uM引物MCM321，IDT(凝胶纯化的)
1.25μL 10uM引物MCM337，IDT(凝胶纯化的)
0.5μL dNTP
1μL聚合酶
1μL FRT-PGK-gb2-neo-FRT模板DNA，Gene Bridges目录号K006
+/-2μL DMSO
如下循环反应：
95℃x 2min，继之以(95℃x 20sec；55℃或60℃x 20sec；72℃x 1min)x30循环
72℃x 3min；4℃直到冷却。
对于每个扩增子，合并4个反应，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)PCR柱进行纯化，在30μL EB中洗脱。
D.扩增子整合到染色体上
在含有羧苄西林(50μg/ml)的L培养液(LB)中，在30℃培养携带pRedET-carb的菌株MCM327(BL21)(GeneBridges)过夜，然后以1∶100稀释进新鲜的LB+carb50中，并在30℃培养2小时。加入130μL 10％阿拉伯糖，在37℃培养细胞约2小时。如下将细胞准备好用于电穿孔：通过在一半培养体积的冰冷的ddH2O中洗涤3次，并重新悬浮于1/10培养体积的相同的ddH2O中。在2mm电穿孔容器中，将100μL细胞悬浮液与3μL DNA扩增子相组合，在25uFD、200欧姆、2.5kV电穿孔(Gene PulserMXcell；BioRad)，并立即用500μL LB猝灭。回收细胞，在37℃摇动1-3小时，然后在含有卡那霉素(10μg/ml)的L琼脂(LA)平板上在37℃选择转化体过夜。
将用每个DNA扩增子转化产生的单个菌落涂布在LA+kan50上，在37℃培养过夜。将克隆接种进5mL LB+kan10中，培养至OD600～1，然后如下冷冻：混合1mL 50％甘油和0.5mL培养物，放在干冰上直到成为固体，然后在-80℃保存。这些操作产生菌株MCM754[PL.6(修饰)dxs]和菌株MCM755(gi1.6dxr)。
使用Herculase II Fusion试剂盒(Stratagene)，扩增整合的启动子，用于菌落PCR测序。
35μL ddH2O
10μL 5x缓冲液
1.25μL 10uM引物GB-DW
1.25μL 10uM引物MCM327(dxs)或MCM330(dxr)
0.5μL dNTP
1μL聚合酶
菌落刮下
如下循环反应：
95℃ 2min；(95℃ 20秒；55℃ 20秒；72℃ 30秒)x 30个循环；72℃3min；4℃直到冷却
在用ExoSAP处理以后，对PCR产物测序(Quintara Biosciences)。
使用引物GB-DW和MCM327，对含有PL.6-dxs的P1裂解物MCM754测序。
5’-Aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgcaaaggaggtaaaaaaacatgagttttgatattgccaaatacccgaccctggcactggtcgactccacccaggagttacgactgtt
使用引物GB-DW和MCM330，对含有gi1.6-dxr的P1裂解物MCM755测序。
5’-aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattagcccttgacaatgccacatcctgagcaaataattcaaccacttttattcactaacaaatagctggtggaatatatgaagcaactcaccattctgggctcgaccggctcgattggttgcagcacgctggacgtggtgcgccataatcccgaacacttccgcgtagttgcgctggtggcaggcaaaaatgtcactcgcatggtagaacagtgcctggaattctctccccgctatgccgtaatggacgatgaagcgagtgcgaaacttcttaaaacgatgctacagcaacaggg
E.从菌株MCM754和MCM755制备P1裂解物。
将100μL各个过夜培养物(LB+kan10)稀释进10mL LB+0.2％葡萄糖+5mM CaCl2中，并在37℃在250rpm摇动培养。30分钟以后，加入100μL来自MG1655的通用P1裂解物，将培养物返回摇床～3小时。将裂解的培养物转移至15mL试管，加入200μL氯仿，并将它涡旋30秒。在4500g离心样品10min，然后将水性上清液转移至新鲜的15mL试管。加入200μL氯仿，并在4℃储存裂解物。
F.酶的克隆和纯化。
通过本领域技术人员众所周知的方法，克隆和纯化来自大肠杆菌的Dxr。将该基因插入供应商所述的pET15b载体中，以包括N-端His标签序列(Invitrogen，Carlsbad，CA)。收获包含质粒并表达蛋白的BL21(λDE3)大肠杆菌培养物，在弗氏细胞压碎器中裂解细胞沉淀物，按照生产商推荐的方案(GE Healthcare，Pittsburg，PA)，使用Ni-NTA柱纯化蛋白。
G.通过与DMAPP和HDMAPP一起温育进行Dxr灭活。
在DMAPP或HMBPP(Echelon Bioscience，Salt Lake City，Utah)的几个浓度，在37℃温育5uM纯化的蛋白2小时，所述DMAPP或HMBPP是在由100mM Tris、100mM NaCl pH 8、5mM MgCl2、0.2mM NADPH、0.2mM DXP和250nM DXR.D组成的缓冲液中，总体积为50μL。根据标准试验，参见，例如，Koppisch等人，Biochemistry，41：236-43(2002)，使用灭活反应混合物的20倍稀释液，定期测量Dxr活性。在灭活反应中没有DMAPP或HMBPP存在下，在类似的条件下，进行酶的对照温育和试验。在适当时，在有20倍稀释的灭活剂(DMAPP或HMBPP)浓度存在下，进行额外的对照活性测定。类似地，用DMAPP灭活酶的更大的等分试样(约400ug)，用于质谱法分析，以验证预期的氨基酸残基修饰。如图92所示，酶活性在灭活温育期间下降，并产生0.72小时的灭活半衰期。
实施例31：用于在大肠杆菌中生产异戊二烯的DXP和MVA途径的共表达
DXP途径和MVA途径的能量学和碳利用效率的对比揭示，DXP途径的碳利用是更有效的，但是在氧化还原平衡方面的效率不如MVA途径。当葡萄糖是碳源时，在DXP途径的碳上的化学计量产率是约85％(每克利用的葡萄糖生产的异戊二烯的克数)。DXP途径的能量平衡的效率不如MVA途径。对于DXP，葡萄糖至异戊二烯缺少3摩尔NAD(P)H/摩尔形成的异戊二烯，且是-2摩尔ATP。对于经由MVA的葡萄糖至异戊二烯的类似对比，该途径生成过量的4摩尔NAD(P)H；ATP是平衡的，但是，碳利用效率仅是约55％。不受理论的约束，通过在单个宿主中组合2个途径，可以制备更平衡的且更有效的生产宿主，以优化氧化还原化学和碳利用效率。
在该实施例中，我们提供了与在实践中可以建立2个途径在单个宿主中的组合相一致的证据。2个途径的组合会导致提高的过程。在48-深孔板(目录号P-5ML-48-C-S Axygen Scientific，California，USA)中设置上述的一系列培养物，其包含2个菌株REM H8_12和REM I7_11，每个孔提供2mL培养物。命名为TM3的培养基如下所述。在补充了1％葡萄糖和0.1％酵母提取物的TM3培养基中在30℃在250rpm培养2个菌株过夜。次日早晨，将2个菌株一式两份地接种进48-深孔板中。给TM3培养基补充1％[U-13C]-葡萄糖和0.1％酵母提取物。在30℃在600rpm(Shel-LabInc.SI6R型冷冻摇动培养箱；Oregon，USA)摇动培养物。在2小时以后，测定培养物OD，然后在定时的间隔至4.25小时结束。在培养2小时时，通过加入400uM IPTG，诱导培养物。在诱导1小时以后，每个菌株的培养物也接受0-8mM(R)-甲羟戊酸[cat#；Sigma M4667]。在定时的间隔，将每个培养物的100μL等分试样转移至98-深孔玻璃板(目录号3600600Zinsser；North America)，立即用不透的粘合铝膜密封，并在Eppendorf热混合仪(Eppendorf；North America.)上在450rpm摇动温育30分钟。通过在第二个Eppendorf热混合仪上在70℃加热7分钟，杀死培养物。将玻璃板转移至Agilent 6890GC，其连接到Agilent 5973MS上，并装配了LEAP CTC CombiPAL自动取样仪用于顶空分析。该柱是Agilent HP-5(5％苯基甲基硅氧烷(15m x 0.25mm x 0.25um))。将100μL气体容积注射上柱。其它条件如下。烤箱温度：37℃(保持等温0.6min)；载气：氦(流速-1mL/min)，分流比为50∶1，在250℃，在注入口上；在质量67或73上的单离子监测模式(SIM)；检测器关闭：0.00min-0.42min；检测器启用：0.42min-0.60min；异戊二烯(2-甲基-1，3丁二烯)的洗脱时间是～0.49min，总分析时间为0.6min。通过本领域技术人员众所周知的方法，进行仪器校正。
用培养物OD600标准化异戊二烯顶空测量，以产生异戊二烯比生产率的度量，单位为μg/L/H/OD。跟踪所有反应4小时。图92A和B显示了该实验的结果。同时地从[U-13C]-葡萄糖(图92图板B)以及从甲羟戊酸(图92图板A)生产异戊二烯。数据表明，2个菌株从[U-13C]-葡萄糖生产的异戊二烯独立于由甲羟戊酸生产的异戊二烯。图92的图板B进一步表明，在0-8mM的甲羟戊酸浓度范围，2个菌株从[U-13C]-葡萄糖的异戊二烯比生产率是相同的。在指示[U-13C]-葡萄糖利用的m/z 73，进行这些测量。同时，异戊二烯比生产率随着甲羟戊酸浓度在相同浓度范围内的递增而增加。在指示甲羟戊酸(所有12C)利用的m/z 67，进行该测量。该实验的总结论是，由DXP途径生产的异戊二烯未受低等MVA途径的甲羟戊酸生成的异戊二烯的影响。
TM3(每升发酵培养基)：
K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物1.0g，1000X改良痕量金属储备溶液1ml。所有成分一起加入去离子H2O中，并溶解。用NH4OH将pH调节至6.8，经0.22微米膜过滤除菌溶液。根据需要，加入灭菌后的抗生素。根据指示，加入灭菌后的U-13C-葡萄糖和[R]-甲羟戊酸。
1000X改良痕量金属储备溶液(每升)：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl  10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
实施例32证实菌株REM A2_17经由双重类异戊二烯生物合成途径生产的异戊二烯
这里描述了生产异戊二烯的大肠杆菌菌株的构建，所述菌株包含外源性的MVA类异戊二烯生物合成途径和增强的DXP生物合成途径。这里显示的数据指示，由菌株REM A2_17生产的异戊二烯同时源自两类类异戊二烯生物合成途径。关于该具体实例，观察到大约3∶2至1∶1的MVA-通量：DXP-通量对异戊二烯生产的贡献；参见图96-102。
菌株REM A2_17的构建
根据生产商的说明书，使用来自Gene Bridges GmbH的Red/ET系统，进行在该实施例中描述的基因组插入。使用了菌株BL21(Novagene)。如以前所述(Thomason等人，2007)，进行P1裂解物制备和转导。已经将pBBR1MCS-5载体描述(Kovach等人，1994)为具有载体构建体MCM82、pMCM296、pDW34、pDW33、GI1.6fldA-ispG/pCL和Ptac鱼腥藻属ispHaspA term/pEWL454(参见，例如，上面的实施例29和WO 2009/076676)。MCM82含有编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)。从由NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和EcoCyc(http://ecocyc.org/)提供的信息，得到启动子、Trp启动子和aspA终止子序列。
pDW15(pBBR1MCS-5上的Ptrc-upper MVA途径)的构建
为了将上部MVA途径插入pBBR1MCS-5载体上，使用引物Upper5′XhoI和Upper3′XbaI，通过PCR从MCM82扩增包含Ptrc、mvaE、mvaS和rrn终止子的完整表达盒。PCR引物序列(表9)、反应和循环参数参见下面。通过凝胶电泳(E-Gel，Invitrogen)，证实约4.2kb PCR产物，然后根据生产商推荐的方案，使用QiaQuick纯化柱(Qiagen)进行纯化。然后以XbaI和XhoI限制性内切核酸酶在37℃过夜处理纯化的PCR产物和pBBR1MCS-5载体。反应条件参见下面。次日，将反应物加热至65℃，以灭活限制性酶，然后连接。在4℃进行连接反应(条件参见下面)过夜。根据生产商推荐的方案，将约5μl连接反应物转化进化学感受的大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在LB中恢复1小时，然后铺板于含有X-gal和10μg/ml庆大霉素的LB平板。选择没有表现出β-半乳糖苷酶活性的菌落，用于通过PCR(使用引物M13Reverse和MCM163)进一步分析，以确认插入片段的存在。纯化(Qiagen)来自这些菌落中的一个的质粒，并完全测序(Quintara Biosciences，关于引物序列参见表9)，以验证其以正确的方向包含完整的上部MVA途径表达盒。在下面和在图93中分别列出了pDW15的序列和图谱。
PCR反应和循环参数：
1μl MCM82(大约30ng)
10μl 5X Herculase缓冲液(Stratagene)
0.5μl dNTP(100mM)
1μl Upper5′XhoI(20uM)
1μl Upper3′XbaI(20uM)
35.5μl去离子H2O
1μl Herculase DNA聚合酶(Stratagene)
1.95℃ 4min。
2.95℃ 20min，52℃ 20秒，72℃ 4分钟，5X
3.95℃ 20min，55℃ 20秒，72℃ 4分钟，25X
4.72℃ 10min，
5.4℃直到冷却
DNA消化：
6μl去离子H2O
2μl 10X缓冲液H(Roche)
10μl DNA(pBBR1MCS-5或PCR插入片段)
1μl XhoI(Roche)
1ul XbaI(Roche)
37℃过夜
65℃ 20min(热杀死)
连接：
2μl diH20
1μl 10X连接酶缓冲液(NEB)
1μl T4 DNA连接酶(NEB)
2μl载体(pBBR1MCS-5)
4μl插入片段(上部MVA表达盒)
4℃ 过夜
微透析(Millipore)和转化进感受态的大肠杆菌(Invitrogen)
表9.PCR和测序引物
  Upper5′XhoI   atgctcgagctgttgacaattaatcatccggctc
  Upper3′XbaI   cgatctagaaaggcccagtctttcgactgagcc
  MCM163
  CF07-58   atgaaaacagtagttattattgatgc
  CF07-59   cttaaatcatttaaaatagc
  CF07-82   atgacaattgggattgataaaattag
  CF07-86   gaaatagccccattagaagtatc
  CF07-87   ttgccaatcatatgattgaaaatc
  CF07-88   gctatgcttcattagatccttatcg
  CF07-89   gaaacctacatccaatcttttgccc
pDW15的序列
accttcgggagcgcctgaagcccgttctggacgccctggggccgttgaatcgggatatgcaggccaaggc
cgccgcgatcatcaaggccgtgggcgaaaagctgctgacggaacagcgggaagtccagcgccagaaac
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gggccgagcgaagcgagccagccggtggccgctcgcggccatcgtccacatatccacgggctggcaagg
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aagcccaagagacggcccgag
PTrp mMVK/pDW15的构建
引物
*通过5’磷酸化来修饰引物
*5’     phos      Ptrp      5’    mMVK
5’-TGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACATGGTATCCTGTTCTGCGCCGGGTAAGA
*3’    phos       aspA     term3’  mMVK
5’-CAAGAAAAAAGGCACGTCATCTGACGTGCCTTTTTTATTTGT ATTAATCTACTTTCAGACCTTGCTCGGTCGG
5’mMVK seq prim 5’-GATACGTATGTTTCTACCTTC
3’mMVK seq prim 5’-GAAGGTAGAAACATACGTATC
EL1003 5’-GATAGTAACGGCTGCGCTGCTACC
MCM                          177
5’-GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTTTAATCTACTTTCAGACCTTGC
PTrp mMVK片段的扩增
用于PTrp mMVK的PCR反应
0.5ul载体模板pDW34
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)5’phos Ptrp 5’mMVK
1.25ul引物(10uM)3’phos aspA term3’mMVK
36ul去离子H2O
+0.5ul来自Stratagene的HerculasII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，60℃x 30秒，72℃x 2min.]x 29循环；72℃x 5min.，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在0.8％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。得到的纯化的储备物被称作PTrp mMVK；应当指出，使用的引物含有5’磷酸化的末端。
PTrp mMVK片段克隆进pDW15中
根据生产商的说明书，用SfoI(New England Biolabs)消化约500ngpDW15质粒。随后根据生产商建议的方法，使用rAPpid碱性磷酸酶(Roche)，去磷酸化SfoI切割的载体。在连接之前，使用Qiagen QiaQuick凝胶提取试剂盒净化消化的/去磷酸化的DNA。根据生产商建议的方法，使用来自New England Biolabs的T4DNA连接酶，将一部分PTrp mMVK片段(5’末端磷酸化的)连接至净化的/SfoI切割的/去磷酸化的pDW15质粒上。使用标准的热休克方法(Sambrook等人，1989)，用连接反应物转化化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在L培养液中恢复1小时，然后涂布在含有庆大霉素(10μg/ml)的L琼脂上。选择庆大霉素抗性的菌落，在含有庆大霉素(10μg/ml)的L培养液中培养过夜，并收获用于以后的质粒制备。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒，分离质粒构建体。使用引物5’mMVK seq prim、3’mMVK seq prim、EL1003和MCM177，对目标质粒制品测序(Sequetech；Mountain View，CA)，鉴别出正确的PTrp mMVK/pDW15克隆；得到的目标克隆已经被命名为菌株REMH914(TOP10w/PTrp mMVK/pDW15；用PTrp mMVK破坏的SfoI位点以与构建体中存在的Ptrc mvaE-mvaS操纵子相同的方向插入；参见图94)。
PTrp mMVK/pDW15的序列
accttcgggagcgcctgaagcccgttctggacgccctggggccgttgaatcgggatatgcaggccaaggc
cgccgcgatcatcaaggccgtgggcgaaaagctgctgacggaacagcgggaagtccagcgccagaaac
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菌株MCM928、BL21t pgl FRT-cmp-FRT-Ptrc-PMK-MVD-yIDI的构 建
整合构建体pMCM900的构建
用氯霉素抗性盒和Trc启动子替换pMCM296的GI1.6启动子和酵母MVK基因。通过使用引物MCM127和MCM375从pMCM883(GeneBridges cmR盒)扩增，建立cmR抗性盒-Ptrc片段。根据生产商的说明书，建立2、50μL反应物，用于含有35μL水、10μL缓冲液、0.5μLdNTP、1.25μL每种引物10uM、1μL质粒模板、1μL聚合酶的HerculaseII Fusion(Agilent #600679)。如下循环反应：95℃，2:00；30x(95℃，0:20；55℃，0:20；72℃，1:00)；72℃，3:00；4℃直到冷却。
在10μL含有5μL DNA、1μL EcoRV、1μL NotI(扩增子)或1μL StuI(pMCM296)、1μL Roche缓冲液H和2μL ddH2O的反应物中，在37℃消化～1.6kb扩增子和质粒pMCM296(下文描述)2小时。在65℃热杀死反应物2小时，然后在Qiagen PCR柱上纯化消化的DNA，并在30μL EB中洗脱。在10μL含有1μL pMCM296、3μL切割的扩增子、5μL缓冲液3和1μL连接酶的Roche Rapid连接试剂盒反应物中，在室温连接洗脱的DNA 1小时。将连接的DNA转化进Invitrogen Pir1化学感受的细胞，在37℃恢复1小时，铺板在LB/cmp 25μg/mL上，然后在37℃培养过夜。纯化得到的质粒，并在启动子区中测序。将克隆4冷冻为pMCM900；参见图95。
cmR-Ptrc-KdyI整合进宿主BL21 t pgl中以建立MCM928
菌株MCM865是菌株MD253(BL21 t pgl pRedET-carb)的等分试样。在LB+carb50中在30℃培养MCM865过夜，然后1∶100稀释进新鲜的LB+carb50中，并在30℃培养2小时。加入130μL 10％阿拉伯糖，在37℃培养细胞约2小时。如下准备细胞用于电穿孔：在一半培养体积的冰冷的ddH2O中洗涤3次，并重新悬浮于1/10培养体积的相同的ddH2O中。在2mm电穿孔容器中，将100μL细胞悬浮液与1μL pMCM900DNA相组合，在25uFD、200欧姆、2.5kV电穿孔，并立即用500μL LB猝灭。回收细胞，在37℃摇动1-3小时，然后在LB cmp5平板上在37℃选择转化体过夜。
在LB cmp5上重新划线以后，在LB cmp5、LB kan10和LB carb50上测试转化体的生长。将cmpR/carbS/kanS克隆冷冻为MCM928。
引物
Figure BDA0000135516370002361
pMCM900的序列
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REM H4_15(菌株REM A2_17的亲代背景)的构建
经由P1-介导的转导，将上述的菌株MCM928的氯霉素标记的PTrcPMK-MVD-yIDI基因座导入菌株WW103中(参见，例如，实施例29和30)。得到的氯霉素抗性的菌株被命名为REM H4_15(BL21pgl+PL.6-dxs，GI1.6-dxr，GI1.6yIDI，CMP::PTrc PMK-MVD-yIDI)。
用于建立REM A2_17的策略
通过将pDW33、PTrp mMVK/pDW15、Ptac鱼腥藻属ispH aspAterm/pEWL454和最后GI1.6fldA-ispG/pCL最初依次质粒转化进菌株REM H4_15中，建立REM A2_17。
使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，经由电穿孔，用pDW33转化水洗过的REM H4_15细胞。在37℃在L培养液中恢复细胞1小时，然后涂布在含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。选择一个羧苄西林抗性的菌落，命名为REM A4_16，随后通过所述的方法用PTrp mMVK/pDW15进行转化；在该情况下，将含有羧苄西林(50μg/ml)和庆大霉素(10μg/ml)的L琼脂用于选择，产生羧苄西林和庆大霉素抗性的菌株REM I4_16。类似地，用Ptac鱼腥藻属ispH aspA term/pEWL454转化REM I4_16，产生羧苄西林(50μg/ml)、庆大霉素(10μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)抗性的菌株REMC5_16。最后，用GI1.6fldA-ispG/pCL转化菌株REM C5_16，产生羧苄西林(50μg/ml)、庆大霉素(10μg/ml)卡那霉素(50μg/ml)和大观霉素(50μg/ml)抗性的菌株REM A2_17。
实施例33使用未标记的、1-13C标记的或3-13C标记的葡萄糖作为唯一碳源，分析菌株REM A2_17在有和没有膦胺霉素存在下的生长、异戊二烯生产和DXP和MVA代谢物积累
以前测得，向包含REM A2_17菌株共有的GI1.6-dxr基因座的大肠杆菌BL21菌株的生长培养基中加入1mM膦胺霉素，可以抑制异戊二烯生产至不可检测的水平。膦胺霉素会抑制DXR酶的活性，所述DXR酶执行内源大肠杆菌DXP途径的定型步骤(Kuzuyama等人，1998)。此外，经发现，将1mM膦胺霉素加入dxr空大肠杆菌BL21菌株(其包含在REMA2_17中存在的相同的异源MVA类异戊二烯生物合成途径酶)的生长培养基中，会维持与在没有膦胺霉素存在下相同的异戊二烯生产水平。该数据指示，DXR抑制剂(膦胺霉素)不会不利地影响经过MVA类异戊二烯生物合成途径的体内通量。
由REM A2_17菌株生产的异戊二烯比生产率
在小规模顶空试验和对应的DXP和MVA代谢物测定研究中，使用与1-13C(Isotec)或3-13C葡萄糖(Omicron Biochemicals，Inc)组合的2mM膦胺霉素，以证实经由在REM A2_17内表达的双重MVA和DXP类异戊二烯生物合成途径同时指向异戊二烯的通量。关于使用1-13C葡萄糖和3-13C葡萄糖来制备源自DXP途径的独特地标记的异戊二烯(其可以与经由MVA途径产生的异戊二烯区分开)的原理，参见下面。在图98和99中显示了使用1-13C和3-13C标记的葡萄糖的顶空试验的结果，其指示，由菌株REM A2_17生产的异戊二烯归因于57-58％MVA-通量和42-43％DXP-通量，这通过异戊二烯比生产率测得。这些结果与在图96中所示的未标记的葡萄糖实验中所观察到的结果几乎相同(58％MVA和41％DXP)。令人感兴趣地，在图101和102中描绘的结果(从REM A2_17生产的异戊二烯中存在的不同的12C和13C同位素比的GC/MS分析得到)提示，生产的异戊二烯分别归因于58-62％MVA和42-38％DXP-通量。该数据与通过异戊二烯比生产率测定所测得的结果相一致。
通过使用色氨酸来抑制MVA途径共有的MVK酶的表达(关于含有PTrp-MVK的载体的图解，参见图94)，进一步支持了在REM A2_17所包含的MVA和DXP类异戊二烯生物合成途径下部的碳至异戊二烯的双通量[色氨酸启动子PTrp控制REM A2_17中MVK的表达；Trp阻遏蛋白当结合色氨酸时会抑制Trp启动子的活性；请参见可从EcoCyc(http://ecocyc.org/)得到的关于trp操纵子的信息]。图98中的数据指示，当在有50uM色氨酸存在下培养REM A2_17时，通向异戊二烯的MVA-通量的比例降低了约8％，产生具有几乎1∶1的通向异戊二烯的MVA-通量：DXP-通量贡献的菌株。
REM 8A2_17菌株中DXP和MVA途径代谢物的积累
图97对比了在有和没有膦胺霉素存在下培养的REM A2_17菌株的DXP和MVA途径代谢物的积累。在代谢物中，通过LC-MS/MS检测和定量甲羟戊酸(MVA途径中间体)、DXP、MEP、CDP-ME、cMEPP、HDMAPP(DXP途径中间体)和IPP和DMAPP(DXP和MVA途径的中间体)。在有膦胺霉素(其抑制DXP至MEP转化)存在下培养的细胞，造成DXP浓度的显著增加和MEP、CDP-ME和cMEPP的浓度的下降，但是没有改变MVA的浓度。在膦胺霉素处理过的样品中观察到的HDMAPP的降低，显著小于其它DXP途径代谢物(例如MEP、CDP-ME和cMEPP)的降低，这大概是由于LC-MS/MS方法对HDMAPP的差灵敏度和与HDMAPP测量有关的大误差。在有膦胺霉素存在下IPP和DMAPP的累积量平均下降了55％，其与异戊二烯生产速率的41％下降相关联。这些数据一起证实，DXP和MVA途径在REM A2_17菌株中是有功能的，且与下述理论相一致：即在没有膦胺霉素存在下培养的细胞中，2个途径促成异戊二烯生产。
使用标记的葡萄糖来测量DXP和MVA途径对异戊二烯生产的贡献的原理
为了证实在REM A2_17菌株中异戊二烯由同时运作的DXP和MVA途径生成，在含有13C同位素的葡萄糖上在特定位置培养上述菌株。如图100所示，当在1-13C葡萄糖上培养细胞时，预期通过MVA途径合成的异戊二烯分子比通过DXP途径合成的分子更富含13C，而当在3-13C葡萄糖上培养细胞时，通过MVA途径合成的异戊二烯分子应当含有比通过DXP途径合成的异戊二烯分子更少的13C，因为当丙酮酸被转化成乙酰基-辅酶A时，13C-标记的碳被释放为13CO2。当2个途径同时运行时，通过2个途径中的每一个生产的异戊二烯分子的标记模式的重叠，表示由细胞生产的异戊二烯的13C标记模式。
异戊二烯标记实验
图101显示了由REM A2_17菌株生产的cMEPP和异戊二烯特定同位素标记异构体(累积同位素标记异构体)的计算相对丰度，所述菌株生长在A)1-13C或B)3-13C葡萄糖上。可以将cMEPP和异戊二烯的特定同位素标记异构体丰度彼此直接对比，因为两种化合物在它们的分子中含有5个碳原子，然而由于除了16O、31P和1H以外的同位素的非常低的天然丰度，可以忽略O、P和H原子的数目的差异。测得的cMEPP特定同位素标记异构体丰度的分布应当等于仅由DXP途径生产的异戊二烯的特定同位素标记异构体分布，且明显不同于在没有膦胺霉素存在下培养的细胞的异戊二烯特定同位素标记异构体的计算分布(对比图101A和9B中的“异戊二烯(-FM)”和cMEPP(-FM)条的振幅)，表明DXP和MVA途径一起促成由REM A2_17菌株合成的异戊二烯。
通过测量在有2mM膦胺霉素存在下生产的异戊二烯的GC波谱(图101和102)，估测在1-13C或3-13C葡萄糖上生长的REM A2_17细胞仅经由MVA途径生产的异戊二烯的特定同位素标记异构体的分布，并通过叠加具有系数
Figure BDA0000135516370002441
和
Figure BDA0000135516370002442
的“异戊二烯(+FM)”和cMEPP特定同位素标记异构体波谱来拟合“异戊二烯(-FM)”波谱(如在“方法”部分中所述)，计算DXP和MVA途径对总异戊二烯生产的相对贡献。基于这些计算，对于使用1-13C和3-13C葡萄糖的实验，估测DXP途径对总异戊二烯生产的相对贡献分别是42％和38％。这些数字接近于从膦胺霉素对总异戊二烯生产速率的抑制估测出的分别为42％和43％的DXP途径贡献。
方法
生长
在TM3液体培养基(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0gMgSO4*7H2O)，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8，并加入适量H20，并过滤除菌)中在34℃培养菌株REM A2_17，所述培养基补充了终浓度1％未标记的葡萄糖和0.1％酵母提取物(图96和97实验)，或补充了终浓度1％未标记的葡萄糖、没有酵母提取物且没有色氨酸；1.0％1-13C葡萄糖(Isotec)、没有酵母提取物且含有或没有50uM色氨酸(图98和101)，或补充了1.0％3-13C葡萄糖(Omicron Biochemicals，Inc.)且没有酵母提取物(图99和10)。所有生长培养基也含有羧苄西林(50μg/ml)、庆大霉素(10μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和大观霉素(50μg/ml)。用400uM IPTG诱导培养物，以后通过加入2mM膦胺霉素(Invitrogen)，抑制一半培养物的DXP通量。通过使用Eppendorf Biophotometer波谱仪(Eppendorf)记录培养物在600nm测得的每个光密度，定期地监测生长。
异戊二烯的GC测量
使用顶空试验，分析异戊二烯生产。对于顶空培养物，将100μL-200ul培养物从摇瓶转移至2ml CTC顶空瓶(SUN-SRI 2mL HS瓶，VWR#66020-950，和帽，VWR#66008-170)。旋紧帽，在250rpm摇动下，在相同温度温育瓶。大约30分钟至1小时以后，从培养箱取出瓶，在70℃热杀死7min，并分析。使用连接了CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(15m x 0.25mm；0.25μm膜厚)来分离分析物。将取样仪设定为注入100μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续0.6分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式，或在覆盖m/z 25-80的全扫描模式，运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在0-0.42分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这些条件下，在大约0.49分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)标准品(SCOTTY
Figure BDA0000135516370002461
分析的气体)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至5000μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。将每个菌株的比生产率报告为μg/L OD小时。应当指出，在试验瓶中温育1800ul顶空∶200ul培养液的比例1小时，导致下述的异戊二烯μg/L培养物向比生产率的转化：(通过GC-MS测得的异戊二烯/L)X(9)/(培养物的OD600nm)。为了定量从13C-标记的葡萄糖生产的异戊二烯的量，将基于未标记的标准品的校正曲线得到的浓度乘以换算因子K，以补偿同位素效应。将换算因子计算为
K＝(∑(Ai)/A67)/(∑(Pi)/P67)，(等式1)
其中Ai是由13C-富集的异戊二烯生成的GC峰的测量强度，Pi是由异戊二烯标准物生成的GC峰的测量强度(下标i＝60...72指示对应峰的m/z值，所述峰包括峰A67和P67)。关于在本文件中提及的实验，对于在1-13C葡萄糖上生长的细胞，将2.901和3.369的换算因子分别应用于无膦胺霉素和2mM膦胺霉素条件，对于在3-13C葡萄糖上生长的细胞，将1.476和1.315的因子分别应用于无膦胺霉素和2mM膦胺霉素条件。
细胞代谢物的LC-MS/MS分析
对于代谢物分析，通过离心，沉淀1.5-5mL细胞培养物，在离心以后，将100或150μL干冰冷却的甲醇加入沉淀的细胞中。然后将得到的样品在-80℃保藏，直到进一步处理。为了提取细胞代谢物，将10或15μL水加入含有甲醇的样品中，将沉淀物重新悬浮于得到的甲醇/水混合液中，然后在4500x g离心细胞碎片4-min。重新提取沉淀物2次，第一次使用90μL用1mM乙酸铵水溶液(pH＝8.0)缓冲的75％甲醇，第二次使用100μL在乙酸铵缓冲液中的50％甲醇。在每次提取以后，通过离心，沉淀出细胞碎片，合并所有3次提取的上清液。在提取操作过程中，在可能时将样品保持在冰上或在冷冻离心机中，以使代谢物降解最小化。
使用处于负模式的电喷雾离子化，通过在TSQ Quantum三元四极质谱仪(Thermo Electron Corporation，San Jose，CA)上的LC-MS/MS，分析提取物。使用XCalibur和LCQuan软件(Thermo Electron Corp)，进行系统控制、数据获取和质谱数据评价。在Synergi 45μM Hydro-RP HPLC柱(150x 2mm，Phenomenex，USA)上进行LC分离，流速为0.4mL/min，柱温度为40℃。LC梯度为t＝0min，12％B；t＝5min，12％B；t＝9min，23％B；t＝20min，99％B；t＝23min，99％B；t＝24min，12％B；t＝29min，12％B，其中溶剂A是在水中的10mM三丁胺/15mM醋酸，溶剂B是LCMS-级甲醇。样品注射体积是10-25μL。
使用负模式的电喷雾离子化，进行质量检测。选择下述的MS/MS转换，用于检测目标代谢物：213→79(对于DXP)，215→79(对于MEP)，245→79(对于IPP和DMAPP)，261→79(对于HDMAPP)，277→79(对于cMEPP)，520.1→79(对于CDP-ME)，227→79(对于MVP)，307→79(对于MVPP)，和147→59(对于MVA)。使用购自Echelon Biosciences Inc.或自己合成的对应标准品，优化其它质谱设置，以得到最高灵敏度。为了定量细胞代谢物的绝对浓度，通过注射已知量的这些标准品，构建了校准表。应当指出，用于代谢物分析的LC-MS/MS方法不能辨别结构上类似的IPP和DMAPP，因此将它们在样品中的量测定为2种化合物的浓度总和。
通过计算峰的相对强度，进行cMEPP的特定同位素标记异构体分布分析，所述峰源自277→79、278→79、279→79、280→79、281→79和282→79MS/MS转换，这些转换对应着该代谢物的M0、M+1、M+2、M+3、M+4和M+5特定同位素标记异构体。在单独的实验中，已经证实，在t≈14.3min(cMEPP的保留时间)，来自在常规葡萄糖上生长的大肠杆菌细胞的提取物没有产生可检测峰，MS/MS转换为272→79、273→79、274→79、275→79、276→79。这些对照测量排除了下述可能性，即当细胞生长在13C-富集的葡萄糖上时，可能与cMEPP共洗脱、但是具有稍微更低的分子量的化合物可以促成由cMEPP产生的MS/MS峰。
13C标记的异戊二烯的特定同位素标记异构体分析
为了测量在13C-葡萄糖上生长的细胞生产的异戊二烯的13C富集，从m/z 58至m/z 68(即在可以源自五碳异戊二烯衍生物的质荷比的范围内)监测GC波谱。图102显示了含有13C的天然丰度的合成异戊二烯和由REMA2_17菌株生产的异戊二烯(生长在3-13C葡萄糖上，并因此富含13C)的典型GC波谱。
根据下面的线性方程组，使用在图102A中所示的数据来计算不含有13C同位素的异戊二烯(所有-12C5异戊二烯)的理论GC谱：
P60＝1.00000*k60
P61＝0.05561*k60+1.00000*k61
P62＝0.01238*k60+0.05561*k61+1.00000*k62
P63＝0.01238*k61+0.05561*k62+1.00000*k63
P64＝0.01238*k62+0.05561*k63+1.00000*k64
P65＝0.01238*k63+0.05561*k64+1.00000*k65
P66＝0.01238*k64+0.05561*k65+1.00000*k66
P67＝0.01238*k65+0.05561*k66+1.00000*k67     (等式2)，
P68＝0.01238*k66+0.05561*k67+1.00000*k68
P69＝0.01238*k67+0.05561*k68+1.00000*k69
P70＝0.01238*k68+0.05561*k69+1.00000*k70
其中P60...P70是由异戊二烯标准物生成的GC峰的测量强度(下标指示对应峰的m/z值)，k60...k70是由所有-12C5异戊二烯产生的GC峰的计算强度(下标指示对应峰的m/z值)，系数1.00000、0.05561和0.05561是3种C5特定同位素标记异构体(每个分子含有0、1或2个13C同位素)的估测相对丰度，假定该C5化合物具有等于1.1％的13C同位素天然丰度(应当指出，在我们的所有-12C5异戊二烯谱的计算中，假定氘的天然丰度太小，不会影响最终的结果)。使用lsqlin解算机(MATLAB 7.0，MathWorks)，得到k60...k70的正值。k69和k70的计算值有效地为零，指示所有-12C5异戊二烯的GC谱不会具有m/z＝69和更高的任何峰。
根据下面的线性方程组，基于如上所述得到的k62...k68的值，进行标记的异戊二烯样品的特定同位素标记异构体分布分析：
A67＝k67*XM0+k66*XM+1+k65*XM+2+k64*XM+3+k63*XM+4+k62*XM+5
A68＝k68*XM0+k67*XM+1+k66*XM+2+k65*XM+3+k64*XM+4+k63*XM+5
A69＝k68*XM+1+k67*XM+2+k66*XM+3+k65*XM+4+k64*XM+5
A70＝k68*XM+2+k67*XM+3+k66*XM+4+k65*XM+5   (等式3)，
A70＝k68*XM+3+k67*XM+4+k66*XM+5
A71＝k68*XM+4+k67*XM+5
A72＝k68*XM+5
其中A67-A72是由13C-富集的异戊二烯生成的GC峰的测量强度(下标指示对应峰的m/z值)，且XM0...XM+5是具有0-5个13C原子的异戊二烯特定同位素标记异构体的相对丰度(XM0对应着异戊二烯分子，其中所有碳原子由同位素12C表示)。使用lsqlin解算机(MATLAB 7.0，MathWorks)，得到XM0...XM+5的非负值。
DXP和MVA途径对异戊二烯生产的相对贡献的测定
通过在MATLAB(MathWorks)中解决下述超定的线性方程系统，估计DXP和MVA途径对总异戊二烯生产的相对贡献(分别是
Figure BDA0000135516370002491
和
Figure BDA0000135516370002492
)：
Figure BDA0000135516370002493
(等式4)，
其中XM0，Isp-FM...XM+4，Isp-FM和XMO，Isp+FM...XM+4，Isp+FM是根据等式3计算的含有0-4个13C原子的异戊二烯特定同位素标记异构体的相对丰度(下标“Isp+FM”和“Isp-FM”分别指示，对有和没有膦胺霉素存在下温育的细胞进行计算)，XM0，cMEPP...XM+4，cMEPP是通过如上所述的LC-MS/MS测量的对应的cMEPP特定同位素标记异构体的相对丰度。
实施例34用于测定经过MVA和MEP途径生成BioIsopreneTM产物的碳通量的13C NMR方法
通过13C NMR波谱学，测定了2个类异戊二烯前体途径(MVA和MEP(DXP)途径)对REM A2_17双途径菌株中的异戊二烯生产的相对贡献，将得到的信息用于计算MVA/MEP定碳比。已经使用类似的技术来测定MVA和MEP途径各自对聚类异戊二烯(Skorupinska-Tudek，K.等人(2008)J.Biol.Chem.，283(30)，第21024-21035页)和异戊二烯(Wagner，W.P.，Helmig，D.和Fall，R.(2000)J.Nat.Prod.，63，第37-40页)的生物合成的贡献。根据从底物至产物的通道碳使用哪个途径，源自13C富集的葡萄糖标记的异戊二烯的标记模式是不同的。这些模式显示在图100A(对于[1-13C]-D-葡萄糖底物)和图100B(对于[3-13C]-D-葡萄糖底物)中。
从图100A可以看出，异戊二烯的3号碳(C-3)没有从任一个途径从[1-13C]-D-葡萄糖底物富集，13C-富集程度等于与12C有关的1.1％天然丰度。相比而言，在两种情况下标记C-5，因而C-5/C-3的富集允许测定13C-标记掺入的总程度。在源自[1-13C]-D-葡萄糖的BiosopreneTM产物的C-5处最大可能的13C富集是50％，如果氧化磷酸戊糖途径在相对于糖酵解显著的通量运行，则更少。通过对比C-1相对于C-2和C-4的富集，测定MVA/MEP途径之比。这显示在图103中。
在经过MVA和MEP途径的碳通量相同(1∶1MVA/MEP比)的情况下，与C-2和C-4相比在C-1处的标记程度在BioIsopreneTM产物中也是相同的，最大富集为25％。在9∶1的MVA/MEP比，C-1仅富集至5％的程度，而C-2和C-4富集至45％的水平。
开发了用于13C-标记的BioIsopreneTM产物的小规模制备、收集和分析的方法，以便测定MVA和MEP(DXP)途径对菌株REM A2_17中的异戊二烯生产的相对贡献。以搅拌瓶形式，在含有[1-13C]-D-葡萄糖(10mg/mL)作为唯一碳源的HM-1培养基中培养菌株，将得到的BioIsopreneTM产物吸附至小碳过滤器上，所述小碳过滤器由装入具有原棉的玻璃巴斯德吸管中的200mg活性炭(Koby filters，MA)组成(方案XX-1)。在34℃过夜生长以后，取下碳过滤器，并用CDCl3(1mL)直接解吸进玻璃NMR试管中。如下得到未标记的异戊二烯的参考谱：将异戊二烯标准物(5μL)(Sigma-Aldrich)稀释进0.75mL氘代氯仿(CDCl3)中，并获得13C NMR谱。
如下通过13C核磁共振波谱学(13C-NMR)测定异戊二烯在每个碳原子处的相对13C-富集：测定与异戊二烯的每个碳原子相对应的信号的相对强度，并将这些值与来自未标记的(天然的13C丰度)异戊二烯的碳信号的相对强度相对比。在运行于125.7MHz处的Varian 500MHz VNMRS系统上，得到13C NMR谱。获取参数是：sw＝30487，at＝1.3sec，dl＝1，nt＝10000，dn＝H1，dm＝yyy，dmm＝w，dpr＝42，dmf＝12600。通过峰高和积分的峰面积，测定13C信号强度。未标记的异戊二烯的13C-NMR谱(％13C＝1.1％)显示在图105中。碳1-4的峰高是类似的，脂族C-5显示出更强烈的信号。
源自双途径菌株REM A2_17的BioIsopreneTM产物的13C NMR谱如图106所示。C-1、2、4和5的信号是显然的，而C-3信号小于或等于噪音水平。C-1、C-2和C-4的相对峰高指示，MVA/MEP途径通量之比大于1∶1且小于2∶1。C-1、2和4相对于C-3和C-5的富集表明，MVA和MEP途径都在菌株REM A2_17中运行，并促成通向异戊二烯的总碳通量。
实施例35fkpB-ispH iscR
在该实施例中，我们证实了，当使用启动子PL.6替换菌株WW119中的操纵子fkpB-ispH的天然启动子来建立菌株REM D8_15时，在菌株WW119中观察到异戊二烯生产从约500下降至600μg/L/H/OD(参见图108)，在菌株REM D8_15中则下降至约50μg/L/H/OD(参见图108)。ΔispR向WW119的添加证实了异戊二烯比生产率的小量降低。向WW119中的导入PL.6fkpB-ispH所观察到的结果是意外的。我们假设，更多的ispH会产生更高的异戊二烯效价。我们进一步证实，当从后一个菌株REMD8_15中删除铁硫簇调节基因iscR以建立菌株REM D6_15时，ΔiscR突变会基本上恢复菌株REM D6_15的异戊二烯生产。这些观察提示ΔiscR和fkpB-ispH之间有益的相互作用，其可以改善经由DXP途径的异戊二烯生产过程。
用于该实施例的菌株的构建
PL.6-fkpB基因座的制备
在大肠杆菌BL21基因组内，ispH基因位于fkpB基因的下游紧邻处，所述fkpB基因编码FKBP-型肽酰-脯氨酰顺反式异构酶。令人感兴趣地，大肠杆菌IspH酶的结构表明，该蛋白具有2个异构化的脯氨酸残基(
Figure BDA0000135516370002521
T.等人，2009)。FkpB可以参与IspH功能的观点，也可以反映为下述事实，即fkpB和ispH开放读码框被仅一个核苷酸隔开，且已经证实会一起转录为ribF-ileS-lspA-fkpB-ispH 5-基因操纵子的最后2个基因(参见http://ecocyc.org/)。
此外，隔开lspA的终止密码子和fkpB的起始密码子的125个碱基的BLAST分析，揭示了在大肠杆菌基因组中出现许多次的高度保守的序列。该通常发现的序列是：
AATCGTAG
Figure BDA0000135516370002522
AAGGCGTTTACGCCGC
Figure BDA0000135516370002524
AA
该序列具有转录终止子的特征，包括可能形成茎环。在上面用加粗的和加下划线的文字(加粗的文字与加粗的文字对合；未加下划线的文字与加下划线的的文字对合)突出显示了具有杂交到一起形成茎环的潜力的碱基。在观察的每种情况下，总是发现该重复序列的位置刚好在单个基因的3’末端的下游，或在彼此相向地转录的2个基因的3’末端的下游。在超过40个分析的区域的编码区内，没有发现重复序列。总之，该信息提示，该序列起转录终止子的功能，并暗示fkpB和ispH被转录为独立的2-基因操纵子的可能性。
我们内部对BL21 14L发酵的转录分析表明，ispH转录物以几乎不可检测的水平存在；该结果与本领域以前报道的结果相一致。类似地，在这些细胞和小规模培养的细胞内，IspH蛋白的水平积累至低水平(关于小规模结果，参见图108)。增加的内源BL21ispH的表达和它对异戊二烯生产的影响，是这里所述的工作的目的。以前描述的PL.6-启动子是被选择用于增量调节ispH的表达的强组成型启动子。基于FkpB和IspH以及fkpB和ispH可能分别共有功能和转录关系(上述)的推测，将PL.6-启动子插入在fkpB开放读码框的上游紧邻处。
根据生产商的说明书，使用来自Gene Bridges GmbH的Red/ET系统，进行在该实施例中描述的PL.6-启动子插入和随后的氯霉素抗性标志物的环出。使用菌株BL21(Novagen)。如以前所述(Thomason等人，2007)，进行P1裂解物制备和转导。BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案用于所述的电穿孔。
引物
5’CMP::fkpB的80bp up
5’-AGATTGCTGCGAAATCGTAGGCCGGATAAGGCGTTTACGC
CGCATCCGGCAAAAATCCTTAAATATAAGAGCAAACCTGCAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC
3’CMP::PL.6-fkpB
5’-AGCGTGAAGTGCACCAGGACGGCGCTATTGCTCTGTACAGATTCAGA
CATGTTTTTACCTCCTTTGCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGTATCA
CCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAATTTATCACCGCA GATGGTTATCTTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG
5’证实CMP::fkpB的80bp up
5’-ACGCATCTTA TCCGGCCTACA
3’证实CMP::PL.6-fkpB
5’-ACCGTTGTTGCGGGTAGACTC
PL.6的5’引物
5’-AGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTG
顶部Gb的CMP
5’-ACTGAAACGTTTTCATCGCTC
底部Pgb2
5’-GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC
在图107中，图解了使用Gene Bridges GmbH方法导入在内源fkpB编码区的上游的PL.6-启动子。使用引物集合5’CMP::fkpB的80bp up和3’CMP::PL.6-fkpB，通过PCR，扩增抗生素抗性盒GB-CMP。5’CMP::fkpB引物的80bp up含有80个与在fkpB编码区的5’紧邻区域具有同源性的碱基，3’CMP::PL.6-fkpB引物含有50个与在fkpB orf(开放读码框)的5’区域具有同源性的碱基，以允许在有pRed-ET质粒存在下，在电穿孔PCR产物以后在特定基因座处重组。在该图中也描绘了在翻转酶-介导的抗生素标志物切除以后，FRT(翻转酶识别靶物)“疤痕”序列保留。
CMP::PL.6fkpB片段的扩增
为了扩增GB-CmpR盒，该盒用于将PL.6-启动子插fkpB基因座上游紧邻处，设计下述的PCR反应：
1ul模板(100ng GB-CmpR)
10ul HerculaseII缓冲液
0.5ul dNTP’s(100mM)
1.25ul引物(10uM)5’CMP::fkpB的80bp up
1.25ul引物(10uM)3’CMP::PL.6-fkpB
35ul去离子H2O
+1ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，60℃x 30秒，72℃x 3min.]x 29循环；72℃x 5min.，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在0.8％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增，并根据生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。得到的储备物是CMP::PL.6fkpB片段。
CMP::PL.6fkpB片段PCR产物整合进BL21/pRed-ET菌株中
通过电穿孔，将pRed-ET载体(Gene Bridges试剂盒)转化进BL21(Novagen)中，得到菌株REM F713(BL21/pRed-ET)。纯化的CMP::PL.6fkpB PCR片段电穿孔进REM F7_13中。在L培养液中恢复转化体，然后涂布在含有氯霉素(10μg/ml)的L琼脂上。使用引物5’证实CMP::fkpB的80bp up和底部Pgb2以及3’证实CMP::PL.6-fkpB和顶部Gb的CMP，通过PCR，分析氯霉素抗性的菌落中GB-CmpR盒和在fkpB上游的PL.6-启动子的存在。使用3’证实CMP::PL.6-fkpB和顶部GB的CMP引物(Sequetech；Mountain View，CA)，对来自许多转化体的PCR片段测序，鉴别出目标PL.6fkpB菌株。氯霉素抗性的菌株BL21 CMP::PL.6fkpB被命名为REM A4_14。
用于建立REM D1_14的策略
验证PL.6fkpB在REMD1_14内的存在
为了证实REM D1_14菌株包含PL.6fkp基因座，设计下述的PCR反应：
大约0.5ul来自菌落的细胞
5ul HerculaseII缓冲液
0.25ul dNTP’s(100mM)
0.625ul引物(10uM)针对PL.6的5’引物
0.625ul引物(10uM)3’证实CMP::PL.6-fkpB
17.5ul去离子H2O
+0.5ul来自Stratagene的HerculaseII fusion
循环参数：
95℃x 2分钟，[95℃x 30秒，60℃x 30秒，72℃x 2min.]x 29循环；72℃x 5min.，
4℃直到冷却(Biometra T3000 Combi Thermocycler)
在2％E-凝胶(Invitrogen)上分离得到的PCR片段，用于验证成功的扩增。
通过P1-介导的转导，将上述的菌株REM A414的氯霉素标记的PL.6fkpB基因座导入菌株WW103中。将得到的氯霉素抗性的菌株命名为REMA9_14。在翻转酶-介导的抗生素盒切除以后，将得到的氯霉素敏感的菌株命名为REM D1_14(BL21pgl+PL.6-dxs，GI1.6-dxr，GI1.6yIDI，PL.2低等MVA途径，CMP::PL.6fkpB)。使用如上所述的引物(针对PL.6的5’引物和3’证实CMP::PL.6-fkpB)，通过PCR，证实在fkpB上游的PL.6-启动子在REM D1_14内的存在。
用于建立REM A8_15的策略
通过P1-介导的转导，将上述的菌株REM14::CMP的氯霉素标记的ΔiscR基因座导入菌株WW103中。将得到的氯霉素抗性的菌株命名为REM A5_15。在翻转酶-介导的抗生素盒切除以后，将得到的氯霉素敏感的菌株命名为REM A8_15(BL21pgl+PL.6-dxs，GI1.6-dxr，GI1.6yIDI，PL.2低等MVA途径，ΔiscR)。
用于建立REM A7_15的策略
通过P1-介导的转导，将菌株REM14::CMP的氯霉素标记的ΔiscR基因座导入菌株REM D1_14中。将得到的氯霉素抗性的菌株命名为REMA2_15。在翻转酶-介导的抗生素盒切除以后，将得到的氯霉素敏感的菌株命名为REM A7_15(BL21pgl+PL.6-dxs，GI1.6-dxr，GI1.6yIDI，PL.2低等MVA途径，CMP::PL.6fkpB，ΔiscR)。
证实IspH在REM D1_14和REM A7_15内增加的积累
蛋白印迹方法
在TM3培养基(1％葡萄糖、0.1％酵母提取物)中培养REM D1_14、REM A7_15、REM A8_15和WW103细胞至限制OD，并通过离心收获细胞，将沉淀物在-80℃储存，直到分析。为了分析，将培养物沉淀重新悬浮于0.05M磷酸钠、0.3M氯化钠、0.02M咪唑、pH 8(含有0.2mg/ml DNA酶I)至100OD/ml。通过重复穿过弗氏细胞压碎器，破碎细胞。然后通过在50,000rpm超速离心30分钟，澄清8ml每种裂解物。去除可溶物，将不溶性沉淀物重新悬浮于8ml 0.05M磷酸钠、0.3M氯化钠、0.02M咪唑、pH 8缓冲液中。按照在iBlot
Figure BDA0000135516370002571
和WesternBreeze
Figure BDA0000135516370002572
用户手册中所述的由Invitrogen推荐的转移和显色技术，使用硝酸纤维素蛋白印迹，分析大肠杆菌ispH表达。使用第一多克隆抗体(由ProSci Inc.在兔中针对纯化的大肠杆菌ispH生产)，探测蛋白印迹。所述检测使用来自Invitrogen的荧光第二抗体，Alexa Fluor488山羊抗-兔IgG(H+L)。粗数据如图109所示。使用ImageQuant 5.2软件，进行样品定量，结果如图110所示。
通过经由蛋白印迹方法测量IspH积累水平，间接地评估菌株REMD1_14和REM A7_15的ispH与菌株REM A8_15和WW103相比增加的表达，所述ispH由位于fkpB-ispH 2基因操纵子上游的PL.6-启动子驱动(参见图109和110)。经测得，与包含内源野生型fkpB-ispH基因座的REMA8_15和WW103菌株相比，包含PL.6fkpB的菌株REM D1_14和REMA7_15的可溶的IspH水平增加了约5倍。
用于建立REM D8_15、REM D7_15和REM D6_15的策略
通过将pDW33分别转化进WW103、REM D1_14、REM A8_15和REM A7_15(上述的菌株)中，建立菌株WW119、REM D8_15、REM D7_15和REM D6_15。
使用BIO RAD Gene Pulser系统(0.1cm容器，目录号165-2089)和生产商(BIO RAD)建议的转化方案，经由电穿孔，用pDW33转化水洗过的REM D1_14、REM A8_15和REM A7_15细胞。在37℃在L培养液中恢复细胞1小时，然后涂布在含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上。为每个菌株选择一个羧苄西林抗性的菌落。将得到的羧苄西林抗性的菌株命名如下：
REM D8_15(BL21pgl+PL.6-dxs，GI1.6-dxr，GI1.6yIDI，PL.2低等MVA途径，PL.6fkpB，和pDW33)；
REM D7_15(BL21pgl+PL.6-dxs，GI1.6-dxr，GI1.6yIDI，PL.2低等MVA途径，ΔiscR，和pDW33)；
REM D6_15 15(BL21pgl+PL.6-dxs，GI1.6-dxr，GI1.6yIDI，PL.2低等MVA途径，PL.6fkpB，ΔiscR，和pDW33)。
用于异戊二烯生产和ispH定量的方法部分
异戊二烯测量。在48-深孔板(目录号P-5ML-48-C-S Axygen Scientific，California，USA)中设置用于测量异戊二烯生产的培养物，每个孔提供2mL培养物。命名为TM3的培养基如下所述。在补充了1％葡萄糖和0.1％酵母提取物的TM3培养基中在30℃在250rpm培养菌株过夜。次日早晨，将菌株一式四份地以1∶100接种进48-深孔板中的孔组内。给培养物覆盖“Breath Easier”TM膜(Electron Microscopy Sciences目录号70536-10)，在30℃在600rpm(Shel-Lab Inc.SI6R型冷冻摇动培养箱；Oregon，USA)连续摇动。在2小时以后，测定培养物OD，然后在定时的间隔至6小时结束。在培养2小时以后，通过向孔1-4的一式四份组中加入50、100、200和400uM IPTG，用IPTG进行诱导。在诱导后2小时时和以后每小时直到6小时，如下对这些培养物取样，用于异戊二烯生产测定：将每个培养物的100μL等分试样转移至98-深孔玻璃板(目录号3600600Zinsser；North America)，立即用不透的粘合铝膜密封，并在Eppendorf热混合仪(Eppendorf；North America.)上在450rpm摇动温育30分钟。通过在第二个Eppendorf热混合仪上在70℃加热7分钟，杀死异戊二烯测定培养物。将玻璃板转移至Agilent 6890GC，其连接到Agilent 5973MS上，并装配了LEAP CTC CombiPAL自动取样仪用于顶空分析。该柱是Agilent HP-5(5％苯基甲基硅氧烷(15m x 0.25mm x 0.25um))。将100μL气体容积注射上柱。其它条件如下。烤箱温度：37℃(保持等温0.6min)；载气：氦(流速-1mL/min)，分流比为50∶1，在250℃，在注入口上；在质量67上的单离子监测模式(SIM)；检测器关闭：0.00min-0.42min；检测器启用：0.42min-0.60min；异戊二烯(2-甲基-1，3丁二烯)的洗脱时间是～0.49min，总分析时间为0.6min。通过本领域技术人员众所周知的方法，进行仪器校正。
用培养物OD600标准化异戊二烯顶空测量，以产生异戊二烯比生产率的度量，单位为μg/L/H/OD。跟踪所有反应4-8小时。来自该实验的令人惊奇的结果是，当将ΔiscR突变与PL.6fkpB-ispH的染色体突变相组合时，会恢复异戊二烯活性。该结果与在下述背景下的iscR相一致：过表达的ispH起调节作用，或至少干扰经过DXP途径的通量。对于高通量，ispH需要过表达，且在这些条件下，预期ΔiscR对该过程是有益的。
通过蛋白印迹验证增加的ispH表达水平。预期用PL.6启动子置换fkpB-ispH操纵子的天然启动子，会升高ispH的水平。这在菌株REMA7_15、REM D1_14中得到确认：使用所述的针对该酶制备的多克隆抗体，通过蛋白印迹与对照菌株REM A8_15和WW103进行对比；启动子交换导致可溶的ispH的5倍增加。在TM3培养基(1％葡萄糖、0.1％酵母提取物)中培养细胞至限制OD，并通过离心收获，将沉淀物在-80℃储存，直到次日。为了分析，将沉淀物重新悬浮于0.05M磷酸钠、0.3M氯化钠、0.02M咪唑、pH 8(含有0.2mg/ml DNA酶I)至100OD/ml。通过重复穿过弗氏细胞压碎器，破碎细胞。然后通过在100,000x g超速离心30分钟，澄清8ml每种裂解物。去除上清液，将沉淀物重新悬浮于8ml缓冲液pH8、0.05M磷酸钠、0.3M氯化钠、0.02M咪唑中。如在用户手册iBlot
Figure BDA0000135516370002591
和WesternBreeze(Vitrogen)中所述，进行蛋白印迹。第一多克隆抗体是针对在大肠杆菌中过表达的纯化的大肠杆菌ispH，并由ProSciInc(Poway，CA)在兔中产生。为了检测，使用来自Invitrogen的荧光第二抗体(Alexa Fluor488山羊抗-兔IgG H+L)。粗数据如图109所示。使用ImageQuant 5.2软件，进行样品定量，结果如图110所示。
TM3(每升发酵培养基)：
K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物1.0g，1000X改良痕量金属储备溶液1ml。所有成分一起加入去离子H2O中，并溶解。用NH4OH将pH调节至6.8，经0.22微米膜过滤除菌溶液。通常加入1％的葡萄糖，并通常将酵母提取物递增至0.1％。根据需要，加入灭菌后的抗生素(有时制备不含有任何MgSO4的TM3培养基，因为该Mg++会导致随时间推移的沉淀。在该情况下，在即将使用之前，从无菌的1M溶液加入MgSO4)。
1000X改良痕量金属储备溶液(每升)：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。将每种组分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米滤器过滤除菌。
附件1
示例性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶核酸和多肽
Figure BDA0000135516370002611
Figure BDA0000135516370002621
Figure BDA0000135516370002641
Figure BDA0000135516370002651
Figure BDA0000135516370002661
示例性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶核酸和多肽
Figure BDA0000135516370002681
Figure BDA0000135516370002691
Figure BDA0000135516370002701
Figure BDA0000135516370002711
Figure BDA0000135516370002721
Figure BDA0000135516370002741
示例性的4-二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶核酸和多肽
Figure BDA0000135516370002751
Figure BDA0000135516370002761
Figure BDA0000135516370002771
Figure BDA0000135516370002781
Figure BDA0000135516370002791
Figure BDA0000135516370002801
Figure BDA0000135516370002811
示例性的4-二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶核酸和多肽
Figure BDA0000135516370002821
Figure BDA0000135516370002831
Figure BDA0000135516370002841
Figure BDA0000135516370002851
Figure BDA0000135516370002861
Figure BDA0000135516370002871
Figure BDA0000135516370002881
示例性的2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶核酸和多肽
Figure BDA0000135516370002941
示例性的1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶核酸和多肽
Figure BDA0000135516370002961
Figure BDA0000135516370002971
Figure BDA0000135516370002981
Figure BDA0000135516370002991
Figure BDA0000135516370003001
Figure BDA0000135516370003011
Figure BDA0000135516370003021
示例性的1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶核酸和多肽
Figure BDA0000135516370003031
Figure BDA0000135516370003041
Figure BDA0000135516370003051
Figure BDA0000135516370003061
Figure BDA0000135516370003071
Figure BDA0000135516370003091
示例性的异戊烯基-二磷酸δ-异构酶核酸和多肽
Figure BDA0000135516370003101
Figure BDA0000135516370003111
Figure BDA0000135516370003121
Figure BDA0000135516370003131
Figure BDA0000135516370003141
示例性的异戊二烯合酶核酸和多肽
Genbank登录号
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241

Claims (8)

1.细胞，其包含：(i)异源核酸，所述异源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽、和异戊二烯合酶多肽，或(ii)内源核酸的副本拷贝，所述内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽、和异戊二烯合酶多肽。
2.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，所述异源核酸或内源核酸编码IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽。
3.如权利要求1或2所述的细胞，其中培养的细胞生产大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。
4.如权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞从细胞培养基中消耗的碳中超过约0.02摩尔％被转化成异戊二烯。
5.一种生产异戊二烯的方法，所述方法包括：
(a)在适合生产异戊二烯的培养条件下，培养细胞，所述细胞包含：(i)异源核酸，所述异源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽、和异戊二烯合酶多肽，或(ii)内源核酸的副本拷贝，所述内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽、和异戊二烯合酶多肽，和
(b)生产异戊二烯。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，所述异源核酸或内源核酸编码IDI(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶)多肽。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中培养的细胞生产大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述细胞从细胞培养基中消耗的碳中超过约0.02摩尔％被转化成异戊二烯。
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Czinkóczky et al. Bioproduction of isoprene and isoprenoids

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