JP5091484B2 - トリコデルマにおける顆粒デンプン加水分解酵素の発現及び顆粒デンプン基質からグルコースシロップを製造する方法 - Google Patents
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Description
本発明の一の態様は、ゼラチン化されてないデンプン基質を、エンド作用アルファアミラーゼと接触させる工程とグルコアミラーゼ活性、特に、顆粒デンプン加水分解活性を有する酵素による糖化工程とを同時に行うことにより、顆粒デンプン基質のゼラチン化温度以下の温度で顆粒デンプンを加水分解して、グルコースに転換する、一段階プロセスに関係する。
awamori var. kawachi)GSHEをコードする異種遺伝子を発現する組み替えトリコデルマレーシ由来のGHSEである。
幾つかの側面において、本発明は遺伝子工学及び分子生物学の分野において日常的に用いられている技術に関係する。Sambrook et al,. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Second Edition (Cold Spring Harbor), [1989]及びAusbel et al., “Current Protocols in Molecular Biology” [1987]には本発明に用いられるそのような技術が記載されている。
「デンプン」という語は、植物の多糖複合体を含むあらゆる物質であって、アミロース及び/又はアミロペクチンを含む化学式(C6H10O5)X(Xは任意の整数)で表されるあらゆる物質を言う。特に、「デンプン」の語は、穀粒、草、塊茎、及び塊根、より具体的には、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ソルガム、豆科植物、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカを含むがこれらに限定されない。
デンプン基質
本発明の方法に用いるデンプン基質は、茎、穀粒、塊根、及び塊茎を含む任意の植物から得られる。特に、好ましい植物は、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、コメ、キビ、オオムギ、キャッサバ、豆及びピーナツ等の豆科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、並びにタピオカを含む。このデンプンは細かく粉砕された生デンプンであるか、あるいは、デンプンの粉砕工程から得られた原料である。特に意図するデンプン基質はトウモロコシデンプン及びコムギデンプンである。本発明に包含される方法に用いる顆粒デンプン基質を調製するために用いる方法は、当業者に良く知られている。これらの利用可能な方法は、ハンマーミル、ローラーミルを用いた全粒穀物の乾燥粉砕及び湿式粉砕を含む。
本発明に包含されるいくつかの態様において、アルファアミラーゼは、E.C.3.2.1.1-3、特に、E.C.3.2.1.1の酵素番号を有する。幾つかの態様において、このアルファアミラーゼは、熱安定性微生物アルファアミラーゼである。好適なアルファアミラーゼは、組換え体及び突然変異体アルファアミラーゼの他に、天然アルファアミラーゼを含む。特に好ましい態様において、このアルファアミラーゼは、バチルス(Bacillus)種由来のものである。好ましいバチルス(Bacillus)種は、バチルススブチルス(B. subtilis)、バチルスステアロセレモフィリス(B. stearothermophilus)、バチルスレンタス(B. lentus)、バチルスリケニフォルミス(B. licheniformis)、バチルスコアギュランス(B. coagulans)、及びバチルスアミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)を含む(米国特許Nos.5,763,385、5,824,532、5,958,739、6,008,026 及び 6,361,809)。特に好ましいアルファアミラーゼは、バチルス(Bacillus)株由来のものであり、バチルスステアロセレモフィリス(B. stearothermophilus)、バチルスアミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)及びバチルスリケニフォルミス(B. licheniformis)である。ATCC 39709、ATCC 11945、ATCC 6598、ATCC 6634、ATCC 8480、ATCC 9945A 及び NCIB8059を有するものも好ましい。
グルコアミラーゼ(EC.3.2.1.3)はデンプンの非還元末端から連続的にグルコース単位を切り離す酵素である。この酵素は、デンプン、アミロース又はアミロペクチンの直鎖又は分岐鎖のグルコシル結合を加水分解することができる。グルコアミラーゼはバクテリア、植物、糸状菌から得ることができるが、本発明に包含される方法に用いるのに好ましいグルコアミラーゼは糸状菌株由来のものである。
。
(1989) 上記、 特に9章及び11章参照のこと)。幾つかの態様において、ストリンジェント条件は、65℃の温度及び0.1x SSC 0.1% SDSに対応する。更なる態様において、GSHE酵素は、リゾプス(Rhizopus)の株から提供される。そのような酵素は、リゾプスニベウス(R. niveus)(CU CONCの取引名で販売されている)のコウジ(Koji)株から提供される。リソプスソルド(Rizopus sold)から提供される酵素は、GLUCZYMEの取引名で販売されている。
No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767及びNRRL 15709を含む。幾つかの好ましい態様において、宿主株は、RL-P37から提供される。RL-P37は、Sheir-Neiss et al., (1984)Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 46-53に開示されている。
安定性は、nGSHEの安定性の水準よりも2倍以上高い。
本発明に従い、本発明に包含されるGHSEをコードするポリヌクレオチドを含むDNA構築体を宿主細胞の中へGSHEを輸送するために構築する。従って、酵素の形で発現されるGHSEポリヌクレオチドを、ベクター、特に、GSHEコード配列に作動可能に結合している調節配列を含む発現ベクターを用いて宿主細胞内へ導入する。
Catalogue of Strains (www. FGSC. net)は参考文献である。適した発現ベクターの例は、Sambrook et al., (1989)上記及び Ausubel (1987)上記、にも開示されており、特に好ましい例はvan den Hondel et al. (1991) in Bennett and Lasure Eds. MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press pp. 396-428である。特に有用なベクターは、pFB6、pBR322、PUC18、pUC100及びpENTR/Dである。
137280A1)。
Academic Press, San Diego (1991) pp70-76)。すなわち、ベクターは既知の組換え技術を用いて構築することができる(例えば、Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology)。1以上の失活した遺伝子を有する糸状菌宿主細胞を得たいときには、既知の方法が用いられる(米国特許Nos.5,246,853、5,475,101 及びWO92/06209参照のこと)。遺伝子失活は全体又は部分的な欠失、失活させるための部位の挿入、又は遺伝子の意図する機能を付与しない他の手段(遺伝子が機能的なタンパク質として発現させない)を用いて行うことができる。クローンされたトリコデルマ(Trichoderma)種又は他の糸状菌宿主細胞由来の任意の遺伝子(例えば、cbh1、cbh2、egl1)は欠失させることができる。幾つかの態様において、既知の方法によりプラスミド内へ、失活させるための所望の遺伝子形態を挿入することにより遺伝子欠失を行う。この欠失プラスミドは、選択マーカーに必要とされる所望の遺伝子コード領域、及び遺伝子コード配列又はそれらの部分内の適切な制限酵素部位で切断される。欠失されるべき遺伝子の一からのフランキングDNA配列はマーカーのどちからの端に残る(好ましくは約0.5乃至2.0kb)。適切な欠失プラスミドは、欠失遺伝子を含み、DNAフランキング配列を含み、及び一本鎖の直鎖部分として除去される選択マーカーを含むフラグメントの形で存在する。
Pourquie J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 及 llmen, M. et al., (1997)Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306に開示されているように、適切な宿主細胞は生体に必要な塩及び栄養を含んだ標準培地で培養される。市販のイーストモルト抽出物(Yeast Malt Extract (YM))ブロス、ルイアバータリン(Luria Bertani (LB))ブロス及びシャボウラウドデキストロース(Sabouraud Dextrose (SD))ブロスについての参考文献もある。
幾つかの態様において、異種GSHEを発現している糸状菌細胞は、バッチ、又は連続発酵条件で育成される。バッチ発酵は、閉鎖システムであり、培地の組成物は発酵の開始時に調整されており、発酵の間変更されることはない。従って、発酵の開始時に培地に所望の微生物を接種する。この方法において、発酵の間はいかなる成分もこのシステムに添加されることはない。古典的なバッチ培養は、閉鎖系であり、発酵の開始時点に培養液の組成が決定され、当該発酵の間は人為的な変更は受けない。従って、発酵の開始時点において、所望の微生物が培養液に接種されると、当該発酵の系には何も添加できない。しかしながら、典型的には、「バッチ」発酵は炭素源の添加に関するバッチであり、pHや酸素濃度等の因子を制御することは頻繁になされる。バッチ方式では、当該方式の代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止されるまで定常的に変化する。バッチ培養においては、細胞は、静的誘導期を経て高成長対数期に緩和され、最終的には、成長速度が減少又は停止する静止期に至る。培養液が未処理の場合には、当該静止期の細胞は、最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞が、最終生成物又は中間体の生産の大部分を担う。
本発明に包含されるGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換された細胞株によるGSHEの発現を評価するために、タンパク質レベル、RNAレベル又は特に、グルコアミラーゼ活性及び/又はグルコアミラーゼ生産等のバイオアッセイにる、アッセイを行うことができる。
g/L以上、25 g/L以上、30g/L以上及び50g/L培養培地以上である。
通常、細胞培養の中で生産されるGSHE(nGSHE又はrGSHE)は、培地の中に分泌され、例えば、この培養培地から、不要な成分を除去することにより精製又は単離される。幾つかのケースにおいて、GSHEは細胞内で生産されるため、細胞溶解物からの回収工程が必要となる。そのようなケースにおいて、当業者が通常用いる技術を用いて、細胞から酵素が精製される。このような技術の例は、親和クロマトグラフィー(Tilbeurgh et al., (1984)
FEBS Lett. 16: 215)、イオン交換クロマトグラフィー法((Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36: 37、Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 314、Bhikhabhai et al., (1984) J.Appl.Biochem. 6: 336及びEllouz et al., (1987) Chromatography 396: 307)、高分解力を有する物質を用いたイオン交換法(Medve et al., (1998) J.ChromatographyA 808: 153)、疎水相互クロマトグラフィー(Tomaz and Queiroz, (1999) J.ChromatographyA 865: 123、二相分離(Brumbauer et al., (1999) Bioseparation 7: 287)、エタノール分離、逆相HPLC、シリカ又はDEAE等のカチオン交換によるクロマトグラフィー、クロマトフォーシング、DSD-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿法及び例えば、Sephadex G-75を用いたゲルろ過である。精製の程度は、GSHEの用途により変動する。精製の必要のない場合もある。
GSHEが無細胞抽出物から提供されるか、又は培養培地(発酵ブロス)からから提供されるかにかかわらず、顆粒デンプンを加水分解し、グルコースシロップを生産するために、GSHEを発現及び分泌する糸状菌細胞、顆粒デンプン基質を含むこの、好ましくはスラリー形態のものを、GSHEとアルファアミラーゼ(referred to herein as simultaneously)に、同時に接触させることが必要である。顆粒デンプンの加水分解は一段階プロセスである。
kgのGZYME997の幅で添加される。
分泌されたGSHE及び糸状菌細胞を含む培養培地中にあるGSHEと接触させる。好ましくは、このGSHEは、顆粒デンプン加水分解活性を有し、 配列番号3又は配列番号6と少なくとも、90%、少なくとも95%、及び少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含むトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)から分泌される。
本発明に包含されている方法において、グルコースシロップは好ましい最終生成物である。しかしながら、グルコースは既知の方法を用いて結晶性デキストロースを生産するために更に精製することもできる。
1999, Nottingham Univar. Sity Press, UKに記載されている。
エチル(すなわち、0.6 AU/g)で加水分解され、少なくとも55%のトウモロコシデンプンが少なくとも90%のグルコースを含グルコースシロップを生産する。その後、残余デンプンが回収され、懸濁され、GSHE及びアルファアミラーゼを用いた第二ラウンドに利用される。第二ラウンドにおいて、少なくとも90%のデンプンが、少なくとも90%のグルコースを生産するため加水分解される。このグルコースシロップは、バキューム等の当業者に既知の方法により濃縮され、グルコース原材料として利用される。
以下の開示及び実施例の章において、以下の略語が使用される。
デンプン基質-精製された及び/又は細かく粉砕された、トウモロコシデンプン、コムギデンプン及びタピオカデンプンが以下の実施例に用いた。
Scientific Instrument Division)バファロー、ニューヨーク)の測定に用いた。異なる30%dsデンプン基質に対する100%可溶化デンプンのブリックスを表3に示し、異なる処理条件下におけるデンプンの相対的可溶化度の計算に用いた。代替的に、5mlのアリコートを10μLのSPEZYME FRED(ジェネンカーインターナショナルインク)を用いて、95℃で5分間インキュベートすることにより異なる条件下における100%可溶化のブリックスを、決定した。高温で処理したサンプルを、85℃で2時間維持した。不溶性固形物を遠心分離により分離し、透明な上清のサンプルを測定した。
A.フミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)GSHE遺伝子のクローニング
凍結スキタリジウムセルモフィリラム(Scytalidium thermophilum)(ATCC 16453、アナモルフ(anamorph)、フミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)
の菌糸からゲノムDNA (配列番号1)を抽出した。この凍結菌糸をコーヒーミルの中でドライアイスと一緒に粉砕し、Easy DNAプロトコル(インビトロジェン)によりDNAを抽出した。クロロホルム/フェノール/イソアミルアルコール抽出工程をこの標準的な手順に追加した。NCBI データベース登録番号#M89475 配列にもとづいてPCRプライマーを設計した。以下のプライマーはpENTR/Dベクター(インビトロジェン)内でクローニングするためのモチーフを含んでいる。
菌糸の胞子を有する約2 cm2のプレート(5日間30℃でPADプレート上で育成したもの)を250mlの4バッフルの振とうフラスコ内の50mlのYEGブロス(5g/Lイースト抽出物及び20g/Lグルコース)に接種し37℃で16乃至20時間200rpmでインキュベーションした。インキュベーションしたものを50mlのコニカルチューブ内に移し2500rpmで10分間遠心して菌糸を回収した。上清を別容器に移した。菌糸のペレットは40mlのフィルターろ過したβ-Dグルカナーゼ溶液を含む250mlの0.22ミクロンCAコーニングフィルターボトルへ移し、形質転換のためのプロトプラストを育成するために30℃で200rpmで2時間インキュベーションした。
パート1-0.6gのアセトアミド(Aldrich,99% 昇華)、1.68gのCsCl、20gのグルコース、20gのKH2PO4の0.6gのMgSO・7H2O、0.6gのCaCl2・2H20,1mlの1000 x 塩(以下参照)をpH5.5に調製し,dH2Oで300mlにメスアップし、滅菌フィルター処理をした。
一般的に、Foreman et al., (Foreman et al. (2003) J.Biol.Chem 278: 31988-31997)に説明されている発酵手順は以下のようである。より具体的には、図5に示した各株に対して2回の発酵を行った。1.5ml凍結スポア懸濁液を5%のグルコースを含む0.8Lのボゲルズ最小培地(Vogels minimal medium)(Davis et al., (1970) Methods in Enzymology 17A, pg 79-143 and Davis, Rowland, NEUROSPORA, CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORGANISM, Oxford Univar. Sity Press,(2000))に接種した。48時間後、各培地を、14Lのバイオラフィット(Biolafitte)発酵槽中にある6.2Lの同じ培地に移した。発酵は25℃、750RPM及び1分間あたり8リットルの空気速度で行った。1時間後、最初に添加されたグルコースが全て消費された。25%(W/W)ラクトースの供給をラクトースの蓄積による炭素制限が生じないように供給した。グルコース及びラクトースの濃度は、グルコースオキシダーゼキット又はラクトースを切断するβガラクトシダーゼを用いたグルコースヘキソキナーゼアッセイキットにより、それぞれモニターされた(Instrumentation Laboratory Co., Lexington, MA)。発酵の進行具合をモニターするため定期的にサンプルを採取した。収集されたサンプルを、50mlの遠心管に移し、International Equipment Company (Needham Heights, MA) clinical centrifugeにおいて3/4スピードで遠心分離した。
酵素活性-GSHE活性は、酵素調製液のアリコートを用いて、50℃、pH4.5、5mlの10%顆粒コーンスターチを含む0.1M酢酸バッファー中で、インキュベーションしたときに、1分間あたりに放出される還元糖のミリグラムを用いて決定される。GSHEの1の単位は、この条件下で1.0mgの還元糖を1分間放出する。
= 1.963)。初期のrGSHE発現の後約72時間、1のみのrGSHEが存在していた(rGSHE3)(表4参照のこと)。
GSHEの比較
(1) pH3乃至7のpH安定性
上で説明したように組換え的に生産されたGSHEの収集サンプル及び天然GSHEの収集サンプルをpH4.5の20 mM酢酸緩衝液を用いて、タンパク質濃度が同じになるように希釈した。その後、pH3乃至7の各pHレベルにおいて、100mMクエン酸/NaOH緩衝液で50℃、30分間反応を行った。
mlの2.0%のNaOHを添加した。チューブを、遠心し、0.5 mlの上清を、ジニトロサリチル酸(DNS)アッセイ(Goto et al., (1994)上記)を用いて還元糖の放出についてアッセイした。
温度安定性はpH5.5で測定した。pH安定性試験と同じ手順を用いた。酵素サンプルを100 mM酢酸緩衝液に同じ濃度になるように希釈し、1.0 mlの希釈酵素を、40℃、50℃、60℃、及び70℃の温度のウォーターバス内で、10分間インキュベートし、活性をpH安定性の試験で述べたのと同様に測定した。結果を表5に示す。
フミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)由来の天然GSHE(nGSHE)及びトリコデルマレーシ(T. reesei)において組換え的に発現されたフミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)(rGSHE)をpH4.5の酢酸緩衝液を用いて同じ濃度になるように希釈した。1mlの希釈物を20mMのpH4.5の酢酸緩衝液中に10%のトウモロコシデンプン(Cargill Foods, Minneapolis, MN)を含むスラリーの中に添加し、50℃において350rpmで振とうした。所定の時間間隔で、100μLのスラリーを採取し、10μLの2%NaOHを添加した。このサンプルを遠沈し、上清をMonarch clinical analyzer (Instrumentation Laboratory, Lexington, MA)において、グルコースオキシダーゼ反応を用いてグルコース(mg グルコース/mgタンパク質)をアッセイした。図9に示すように、トウモロコシデンプンの加水分解はnGSHEと比較してrGSHEがわずかに低かった。
A. アスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)遺伝子のクローニング
実施例1で説明した方法に従って、アスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)株の凍結菌糸からゲノムDNAを抽出した。PCRプライマー配列はアスペルギウスアワモリvar.カワチ(A. awamori var. kawachi)グルコアミラーゼ GAI(Hayashida et al. (1989) Agric.Biol.Chem. 53: 923-929)に基づいて設計された。このGAIはGSHEである。Gateway(インビトロジェン)ディレクショナルモチーフCACCを含、CAC CAT GTC GTT CCG ATC TCT TCT C (配列番号9)を有するRSH10fプライマー、及び、CTA CCG CCA GGT GTC GGT CAC (配列番号10)を有するRSH10rプライマーを用いた。
kbのPCR産物をゲル精製(ゲル精製キット、キアゲン)し、ゲートウェイシステムプロトコルに従いpENTR/D(インビトロジェン)内へクローンした。このベクターを化学的に適したTop10大腸菌(インビトロジェン)内へ形質転換しカナマイシン選択をした。幾つかのクローンからのプラスミドDNAを正しいサイズの挿入を確認するために制限消化した。幾つかのクローンからのGAI遺伝子挿入を配列決定した(Sequetech, Mountain View, CA)(配列番号4)。一のクローンからのプラスミドDNA、pENTR/D_Ak33xx#1、をpTrex3g/andS消化ベクターDNAと共にLRクロナーゼ反応(インビトロジェン、ゲートウェイシステム)に添加した。LRクロナーゼ反応における組換えは、消化ベクターのCmR及びccdB遺伝子とpENTR/Dベクターからのアスペルギウスカワチ(A. kawachi)GAIとを置き換えた。この組換えは、GAIを消化ベクターのcbh1プロモーター及びターミネータの間に方向付けて挿入する。48及び50bpのAttB組換え部位配列は、それぞれグルコアミラーゼの上流及び下流にそれぞれ残っていた。図3を参照していただきたい。この実施例において、フミコーラグリセア(H. griseag)gla1は、アスペルギウスカワチ(A. kawachi)GAIに置き換えられる。2μLのLRクロナーゼ反応物を化学的に適合なTop10大腸菌内へ形質転換し、一晩カルベニシリン選択条件下でインキュベートした。クローンからのプラスミドDNA、pTrex3g_Akxx#3をcbh1プロモーター:GAI:cbh1ターミネーター:amdSを含む発現カセットを切り離すためにXbalで消化した。この6.7kbカセットは標準技術を用いたアガロース抽出により精製され、公知の入手可能なQM6a株由来のトリコデルマレーシ(T. reesei)の株内へ形質転換された。
トリコデルマレーシ(T. reesei)の胞子懸濁液を、MABA形質転換プレートの中心から6 cmのところに広げた(5×107-5×108胞子/mlの懸濁液を150μL)。このプレートをその後、チャンバー内で風乾した。ストッピングスクリーン(Stopping screens)(BioRad 165-2336)及びマクロキャリアホルダー(macrocarrier holders)(BioRad 1652322)を70%のエタノールに浸し、風乾した。ドリライトデシキャント(DriRite desiccant)を小さなペトリ皿の上に置き、ワットマン(Whatman)フィルターペーパーを用いて積み重ねた。マクロキャリアーを含むマクロキャリアホルダーをフィルターペーパーの上に水平に置き、ぺトリ皿の蓋を置き換えた。
Biolistic Particle Delivary Systemを照射した。チャンバー内を通気し、MABAプレートを28℃、5乃至7日間のインキュベートのために取り出した。
パートI dH2O 500ml中
1000×塩 1 ml
ノベルアガー 20 g
pHを6.0に調製してオートクレーブ
パートII dH2O500ml中
アセトアミド 0.6 g
CaCl 1.68 g
グルコース 20 g
KH2PO 15 g
MgSO4・7H2O 0.6 g
CaCl2・2H2O 0.6 g
pHを4.5に調製し、0.2ミクロンのフィルター滅菌をし、50℃のオーブン内で加熱し、パートI混合物と混合し、プレートに注いだ。
FeSO4・7H2O 5 g
MnSO4・H2O 1.6 g
ZnSO4・7H2O 1.4 g
CaCl2・6H2O 1 g
0.2ミクロンのフィルター滅菌
rGSHEの発現(トリコデルマレーシ(T. reesei)において発現したアスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHE)は実施例1のフミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoides)の発現について説明したのと同様に決定された。発現のレベルは1g/L以上であった(データは示していない)。図10は、トリコデルマレーシ(T. reesei)宿主内におけるアスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHEの発現を示すSDS-PAGEの結果である。
典型的な試験において、150グラムの顆粒デンプンを350グラムの脱イオン水に懸濁した。混合の後、6 NのNaOHを用いてpHを5.5に調整した。アルファアミラーゼ(GZYME G997を1.0
kg/MT ds)をデンプンスラリーに添加し、60℃に維持されているウォーターバス内で攪拌しながらインキュベートした。このサンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックスを測定した。インキュベートから24時間の時点で回収されたサンプルをHPLCを用いた糖組成の決定に用いた(表6)。
通常の実験において、350 gの水を150 gの顆粒トウモロコシデンプン、顆粒コムギデンプン及び顆粒タピオカデンプンに添加し、6NのNaOHを用いてpHを5.5に調整した。このスラリーを、混合物を均一に保つために攪拌しながら、60℃維持した水槽内に静置した。温度が安定した後、アルファアミラーゼ(GZYME G997を1.0 kg/MT ds)及びrH-GSHE(1.0 GSHE単位/グラムデンプン da)を各デンプンスラリーに添加し、インキュベーションを続けた。サンプルを異なる時間間隔において回収し、遠心し、ブリックスを測定した。24時間のサンプルは糖組成を解析した。顆粒デンプンの相対的な可溶化はジェットクッキングプロセス処理されたブリックスの比較により計算した。
アスペルギウスニガー(Aspergillus niger)(OPTIDEX L-400及びG Zyme G 990 4X ジェネンコーインターナショナルインク)及びリゾプスニベウス(Rhizopus niveus)(CU.
CONC.新日本製薬 日本)由来の顆粒デンプン加水分解活性を有する市販グルコアミラーゼを、実施例1のrH-GSHEと比較した。これらの酵素の顆粒デンプン基質加水分解活活性は上で説明した方法で測定した。
Kg/MTデンプンdsに添加し、デンプンスラリーを60℃に維持したウォーターバス内に静置した。G Zyme G 997を含む各デンプンスラリーにグルコアミラーゼを同じ投与量、すなわち、1.5 GSHE単位/gデンプンds添加し、60℃でインキュベートした。アリコートを異なる時間で回収し、遠心分離した。透明な上清をブリックス測定に用いた。2、6、22.5、及び49時間インキュベーションしたサンプルをHPLCによる糖組成の解析に用いた。結果を表9に示す。
372 gの水を178gのトウモロコシデンプンに添加した。このスラリーの混合を均一にするためにスターラーでよく攪拌し、6 NのNaOHを用いてpHを4.0、5.0、5.5、6.0、及び7.0に調整した。このサンプルを60℃に維持したウォーターバスの中に静置した。温度が平衡になったあと、G Zyme G 997(0.1 kg/MT デンプン)及びrH-GSHEをスラリーに添加した。このスラリーをインキュベーションの間攪拌し、1時間インキュベーションした後のサンプルをブリックスの測定に用いた(表10)。
372gの水を178gのトウモロコシデンプンに添加した。このスラリーを均一にするためによく混合し、pHを6NのNaOHを用いて5.5に調整した。このサンプルを55℃、60℃、及び65℃に維持したウォーターバス内に静置した。温度を平衡化した後、G Zyme G 997、0.1 kg/MTデンプン及び実施例1のrH-GSHE(1.0 GSHE単位/gデンプン)を添加した。このスラリーをインキュベーションの間、連続的に攪拌し1時間後にブリックスを測定した(表11)。
別々のフラスコ内で372 gの水に178 gの顆粒トウモロコシデンプンを含むスラリーを均一にするためによく混合した。このスラリーのpHを5.5に調整した。異なるレベルのG Zyme G 997 0.1 kg/MTデンプン及び0.5 kg/MTデンプンを、0.25、0.5、及び0.1 GSHE単位/g dsデンプンと共にインキュベートした。サンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックス及び総糖組成の測定に用いた(表12A及び表12B)。
32% dsのトウモロコシデンプンをpH5.6において、低温ジェットクッキング工程(105℃、8分の後に、95℃、90分間加水分解することにより液化した。SPEZYME FERD(ジェネンコーインターナショナル)を0.4 kgs/MTデンプンdsで添加した。液化工程において、SPEZYME FERD液化デンプン基質のpHを4.2に調整し、グルコアミラーゼ(OPTIDEX L-400)を0.22 GSHE/g ds添加した。加水分解を60℃で行った。サンプルを異なる時間間隔で回収し、最大グルコース生産にいたるまでの時間を決定するためにHPLCで解析した。
蒸留水中に異なる顆粒トウモロコシデンプンの濃度のスラリー(すなわち、32%、35%、38%、40%、及び42%)を調整した。このスラリーのpHをpH5.5に調整した。このサンプルを60℃に維持したウォーターバス内に置き、スラリーを均一にするために攪拌を続けた。G Zyme G997(0.1 kgs/MT ds)及び実施例1のrH-GSHE(1.0 GSHE単位/ds)をスラリーに添加した。ブリックス及び糖組成のために、サンプルの一部をインキュベーションの間の異なる時間間隔で回収した(表14)。
G 997(0.4 kgs/MTデンプン)を用いて製造される。更に残余アルファアミラーゼを失活させるために液化デンプンの一部を加熱する。残余アルファアミラーゼ活性を有する又は有さない、液化デンプンの糖化物を、実施例1のrH-GSHE、0.5 GSHE単位/gを用いて60℃、pH5.5の条件で、更に糖化(32%
ds)させる。サンプルを異なる時間間隔で回収し、グルコース生産をHPLCを用いて解析した(表15)。
反応管中に、水1200 gに顆粒トウモロコシデンプン(800 g)を懸濁したスラリーを得るため均一に混合した。4NのNaOHを用いてこのスラリーのpHを5.5に調整した。60℃において、G Zyme G 997(0.1 kgs/MTデンプン)及びトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)の中で発現したフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. theromidea)(rH-GSHE)1.0 GSHE U/gデンプンを添加した。サンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックス及び総糖含量の測定に用いた(表16)。
Claims (10)
- トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei) 細胞においてグルコアミラーゼ活性を有する顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)を生産する方法であって、pHが3.0から4.0での前記酵素の活性は、天然の糸状菌宿主細胞(フミコーラグリセアvar セルモイデア細胞)から産生された対応するGSHEよりも高く、
a) フミコーラグリセアvar セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)株由来の、前記GSHEをコードしている異種ポリヌクレオチドに作動可能に結合した、前記トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei) 細胞における転写活性を有するプロモーターを含むDNA構築体を用いてトリコデルマレーシ細胞を形質転換する工程と、
b) 前記GSHEを発現させるのに許容する培地において前記形質転換されたトリコデルマレーシ細胞を培養する工程と、
c) 前記GSHEを生産する工程、とを含むことを特徴とする方法。 - 前記生産されたGSHEを回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記GSHEが配列番号3の配列と少なくとも90%の配列同一性を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換されたトリコデルマレーシ宿主細胞を連続発酵条件下で培養することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換されたトリコデルマレーシ宿主細胞をバッチ発酵条件下で培養することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- フミコーラグリセアvar セルモイデア由来の、グルコアミラーゼ活性を有する顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、組み換えトリコデルマレーシ細胞。
- トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)の培養により生産されるグルコアミラーゼ活性を有する、請求項1に記載の顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)を含む発酵培地であって、該トリコデルマレーシが配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有するGSHEをコードしている異種ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発酵培地。
- 顆粒デンプンスラリーからグルコースシロップを生産する方法であって、前記顆粒デンプンのゼラチン化温度以下の温度において、請求項7に記載の発酵培地とバチルス(Bacillus) 株由来のアルファアミラーゼとを顆粒デンプン基質に同時に接触させる工程と、グルコースシロップを得るために2乃至100時間の間アルファアミラーゼとGSHEとを作用させて顆粒デンプンを加水分解する工程とを含むことを特徴とする方法。
- アルファアミラーゼ及び、請求項1の方法により生産される顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼ(GSHE)を含む顆粒デンプン加水分解活性を有する酵素組成物であって、前記GSHEに対する前記アルファアミラーゼの比が15:1乃至1:15であることを特徴とする酵素組成物。
- 前記GSHEに対する前記アルファアミラーゼの比が、10:1乃至1:10であることを特徴とする請求項9に記載の酵素組成物。
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