MX2015002099A - Variantes que tienen actividad glucoamilasa. - Google Patents

Variantes que tienen actividad glucoamilasa.

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Abstract

La presente invención se relaciona con variantes que tienen actividad glucoamilasa con propiedades mejoradas y con composiciones que comprenden estas variantes adecuadas para usarse, por ejemplo, en la producción de un alimento, bebida (p. ej., cerveza), alimentos para animales, sustancias bioquímicas o biocombustibles. Se describen, además, constructos de ADN que codifican las variantes y métodos para producir las variantes de glucoamilasa en células huésped. Además, se describen diferentes métodos y usos relacionados con las glucoamilasas de conformidad con la invención, tales como en un proceso de fabricación de cerveza.

Description

VARIANTES QUE TIENEN ACTIVIDAD GLUCOAMILASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con variantes que tienen actividad glucoamilasa con propiedades mejoradas y con composiciones que comprenden estas variantes adecuadas para usarse, por ejemplo, en la producción de un alimento, bebida (p. ej., cerveza), forraje, sustancias bioquímicas o biocombustibles. Se describen, además, constructos de ADN que codifican las variantes, y métodos para producir las variantes de glucoamilasa en células huésped. Además, se describen diferentes métodos y usos relacionados con las glucoamilasas de conformidad con la invención, tales como en un proceso de fabricación de cerveza.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las glucoamilasas (1,4-a-glucano glucohidrolasas, EC 3.2.1.3) son carbohidrasas que actúan exógenamente en la hidrólisis del almidón, las cuales catalizan la eliminación de unidades sucesivas de glucosa a partir de los extremos no reductores del almidón o moléculas de oligo y polisacáridos relacionados. Las glucoamilasas pueden hidrolizar los enlaces glucosídicos lineales y ramificados del almidón (por ejemplo, amilosa y amilopectina).
Las glucoamilasas son producidas por numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Particularmente Ref . 253395 interesantes y comercialmente importantes, las glucoamilasas son enzimas fúngicas que se producen extracelularmente, por ejemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al., Carlsberg Res. Commun. 48: 529-544 (1983); Boel et al., EMBO J. 3: 1097-1102 (1984); Hayashida et al., Agrie. Biol . Chem. 53: 923-929 (1989); patente de los EE. UU. núm.5,024,941; patente de los EE. UU. núm. 4,794,175 y patente n|úm. WO 88/09795); Talaromyces (patente de los EE . UU. núm. 4,247,637; patente de los EE. UU. núm. 6,255,084; y la patente de los EE. UU. núm.6,620,924); Rhizopus (Ashikari et al., Agrie. Biol . Chem. 50: 957-964 (1986); Ashikari et al., App. Microbio. Biotech. 32: 129-133 (1989) y la patente de los EE. UU. núm. 4,863,864); Humicola (la patente núm. WO 05/052148 y la patente de los EE. UU. núm. 4,618,579); y Mucor (Houghton-Larsen et al., Appl . Microbiol . Biotechnol . 62: 210-217 (2003)). Muchos de los genes que codifican para estas enzimas se han clonado y expresado en células de levadura, hongos y/o bacterias. Comercialmente, las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han usado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis del almidón (p. ej . , para producir glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón). Las glucoamilasas se usan para producir edulcorantes de maíz con alto contenido de fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en los Estados Unidos.
Generalmente, las glucoamilasas pueden usarse, y se usan comúnmente, con alfa amilasas en procesos hidrolizantes de almidón para hidrolizar el almidón en dextrinas y, después, glucosa. Después, la glucosa puede convertirse en fructosa por medio de otras enzimas (p. ej ., isomerasas de glucosa); cristalizadas; o usadas en fermentaciones para producir varios productos finales (p. ej . , etanol, ácido cítrico, ácido láctico, succinato, ácido ascórbico como productos intermedios, ácido glutámico, glicerol y 1, 3-propanodiol). El etanol producido mediante el uso de glucoamilasas en la fermentación de materiales que contienen almidón y/o celulosa puede usarse como fuente de combustible o para consumo alcohólico.
A las concentraciones altas de sólidos usadas comercialmente para la producción de jarabe de maíz alto en glucosa (HGCS, por sus siglas en inglés) y jarabe de maíz alto en fructosa (HFCS, por sus siglas en inglés), la glucoamilasa sintetiza di, tri y tetrasacáridos de la glucosa por reacciones de condensación. Esto se produce debido a la hidrólisis lenta de enlaces glucosídicos alfa-(1-6)-D en el almidón y la formación de varios productos de condensación acumulativos, principalmente isomaltosa, a partir de D-glucosa. Por consiguiente, el rendimiento de glucosa en muchos procesos convencionales no excede el 95 % del rendimiento teórico. La cantidad de jarabes producida en todo el mundo por este proceso es muy grande, e incluso los incrementos muy pequeños en el rendimiento de la glucosa por tonelada de almidón son comercialmente importantes.
Se describen varias glucoamilasas en, por ejemplo, las patentes núm. WO/2008/045489, WO/2009/048488, WO/2009/048487, US8058033, WO/2011/022465, W02011/020852 y WO 2012/001139.
El uso de glucoamilasas en la hidrólisis de almidón derivado de carbohidratos tiene una importancia cada vez mayor en la industria de la fabricación de cerveza, particularmente, para la producción de cervezas altamente atenuadas (denominadas, algunas veces, de bajas calorías). La glucosa se convierte, fácilmente, en alcohol por medio de levaduras, lo que hace posible que las cervecerías obtengan una producción muy alta de alcohol a partir de la fermentación y, al mismo tiempo, obtengan una cerveza que tiene un contenido muy bajo de carbohidratos residuales. El fermento se diluye hasta el porcentaje de alcohol deseado con agua, y la cerveza final se comercializa como "baja en carbohidratos". Por motivos que se relacionan con la estabilidad del producto y la legislación, es importante que la actividad enzimática agregada se elimine/inactive en la cerveza final. Desafortunadamente, este requerimiento es difícil de cumplir debido a la termoestabilidad de las enzimas, cuando la glucoamilasa se deriva de la fuente usual Aspergillus spp . , tal como A. niger y A. awamori ; Humicola spp. ; Talaromyces spp. , tal como T. emersonii ; Athelia spp. , tal como A. rolfsii ; Penicillium spp. , tal como P. chrysogenum, por ejemplo, y la enzima se agrega al recipiente de fermentación (FV, por sus siglas en inglés) en el proceso de fabricación de cerveza.
Aunque la adición de glucoamilasa al recipiente de macerado, o en cualquier etapa antes de hervir el mosto, puede evitar este problema, esto introduce otras dificultades prácticas. La patente de los EE. UU. núm.4,666,718 describe un proceso de fabricación de cerveza que emplea un reactor que comprende la enzima usada en la elaboración de cerveza, glucoamilasa, inmovilizada en un soporte sólido, mediante el cual la enzima puede recuperarse del producto. La patente de los EE. UU. núm. 5,422,267A describe un proceso de fabricación de cerveza que emplea levadura genéticamente diseñada que expresa una glucoamilasa recombinante, pero en donde la enzima es secretada por la levadura.
Por lo tanto, persiste la necesidad de glucoamilasas, por ejemplo, en la forma de una composición que tiene actividad glucoamilasa, que puedan agregarse en cualquier etapa de un proceso convencional para preparar bebidas fermentadas, tales como cerveza, mediante el uso de equipos convencionales y cuya actividad pueda eliminarse de manera segura del producto final.
Sería especialmente eficiente agregar variantes de glucoamilasa que tengan actividad hidrolítica, por ejemplo, en la forma de una composición, en el recipiente de fermentación (FV) usado para preparar una bebida fermentada. Los beneficios son, por ejemplo, dosis más bajas de enzimas, conversión incrementada de almidón en carbohidratos fermentables y reducción del estrés de la levadura. El motivo por el cual este método no se usa comúnmente es que pueden quedar enzimas activas en el producto final, lo cual no es deseable, como se describió anteriormente. Las glucoamilasas comercialmente disponibles son, generalmente, termoestables, y la energía aplicada durante la pasteurización de una bebida fermentada no es suficiente para inactivar las enzimas. Por lo tanto, existe la necesidad adicional de una glucoamilasa termolábil que pueda inactivarse por pasteurización después de la fermentación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una variante de glucoamilasa que comprende una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
La presente invención se relaciona, además, con un ácido nucleico capaz de codificar una variante de glucoamilasa de la presente invención.
La presente invención se relaciona, además, con un ácido nucleico capaz de expresar una variante de glucoamilasa de la presente invención. La presente invención se relaciona, además, con un plásmido o un vector de expresión, tal como un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico o es capaz de expresar una variante de glucoamilasa de la presente invención. La presente invención se relaciona, además, con una célula hospedera que tiene expresión heteróloga de una variante de glucoamilasa de la presente invención y una célula hospedera que comprende un plásmido o un vector de expresión como se definió anteriormente. La presente invención se relaciona, además, con métodos para aislar, producir y/o expresar una variante de glucoamilasa de la presente invención.
La presente invención se relaciona, además, con una composición que comprende una o más variantes de glucoamilasa de la presente invención.
La presente invención se relaciona, además, con el uso de una variante de glucoamilasa o una composición de la presente invención en una fermentación, en donde la variante de glucoamilasa o la composición se agrega antes de o durante una etapa de fermentación.
La presente invención se relaciona, además, con el uso de una variante de glucoamilasa termolábil de la presente invención para aumentar la producción de azúcares fermentables en la etapa de fermentación de un proceso cervecero .
La presente invención se relaciona, además, con un metodo que comprende agregar una variante de glucoamilasa o una composición de la invención antes de o durante una etapa de fermentación.
La presente invención se relaciona, además, con una bebida fermentada, en donde la bebida fermentada se produce por un método de la presente invención.
La presente invención se relaciona, además, con un método para la producción de un producto alimenticio, forraje o bebida, tal como una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de cereales o malta, como cerveza o whisky, tal como vino, sidra, vinagre, vino de arroz, salsa de soja, o jugo; el método comprende la etapa de tratar un material vegetal que contiene almidón y/o azúcar con una variante de glucoamilasa o una composición de la presente invención.
La presente invención se relaciona, además, con un método para la producción de un biocombustible de primera o segunda generación, tal como bioetanol; el método comprende la etapa de tratar un material que comprende almidón con una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción, y productos obtenidos por el método. La presente invención se relaciona, además, con un método para la producción de una sustancia bioquímica, tal como isopreno de base biológica; el método comprende la etapa de tratar un material que comprende almidón con una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción, y productos obtenidos por el método. La presente invención se relaciona, además, con el uso de una variante de glucoamilasa o una composición, como se describe en la presente descripción, en la producción de un biocombustible de primera o segunda generación, tal como bioetanol, o en la producción de una sustancia bioquímica, tal como isopreno de base biológica.
La presente invención se relaciona, además, con un kit que comprende una variante de glucoamilasa o una composición de la presente invención; e instrucciones para usar la variante de glucoamilasa o la composición.
Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención no abarcar dentro de esta ningún producto previamente conocido, proceso para fabricar el producto o método para usar el producto, de tal manera que los solicitantes se reservan el derecho y por este medio presentan su descargo de responsabilidad con respecto a cualquier producto, proceso o método previamente conocidos. Cabe mencionar, además, que la invención no pretende abarcar dentro de su alcance ningún producto, proceso o fabricación del producto o método para usar el producto, los cuales no cumplan con la descripción escrita y requisitos de habilitación de la USPTO (35 U.S.C. §112, primer párrafo) o la EPO (Artículo 83 de la EPC), de tal manera que los solicitantes se reservan el derecho y por este medio presentan su descargo de responsabilidad con respecto a cualquier producto, proceso para fabricar el producto o método para usar el producto previamente descritos.
Cabe mencionar que en esta descripción y, particularmente, en las reivindicaciones y/o modalidades, los términos tales como "comprende", "comprendido(a) ", "que comprende" y similares pueden tener el significado atribuido a estos en la lcy de patentes de los EE. UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido(a) " , "que incluye", y similares; y los términos tales como "que consisten esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado asignado a ellos en la ley de patentes de los EE. UU., por ejemplo, permiten elementos no mencionados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la materia anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.
Estas y otras modalidades se describen o resultan obvias a partir de, y están abarcadas por, la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La siguiente descripción detallada, dada a manera de ejemplo, pero no prevista para limitar la invención únicamente a las modalidades específicas descritas, podrá comprenderse mejor en conjunto con las figuras que se acompañan, en las que: Las Figuras 1A y IB son una representación esquemática de los vectores de entrada: fig.1A pEntry-GA CS4 y fig. IB pEntry-GA wt.
Las Figuras 2A y 2B son una representación esquemática de los vectores de expresión: fig 2A pTTT-pyrG13-GACS4 y fig. 2B pTTTpyr2-GACS4.
La Figura 3 ilustra un análisis SDS-PAGE de variantes de TrGA. En la parte superior, las variantes de glucoamilasa de Trichoderma reesei : R_C_1, R_C_2, R_C_5, R_C_12, R_C_7 R_D_2, R_D_3 y R_D_5; en la parte inferior, las variantes R_C_13, R_c_22, R_A_1, R_A_2, R_A_6, R_A_7 y TrGA (WT). Para cada variante, se muestra la actividad glucoamilasa (GAU/ml) entre paréntesis.
La Figura 4 ilustra un análisis SDS-PAGE de variantes de TrGA. En la parte superior, las variantes de glucoamilasa de Trichoderma reesei CPS3-B01 - CPS2-E08 como se indica, el producto de fermentación del vector vacío y la TrGA-CS4. Para cada variante, se muestra la actividad glucoamilasa (GAU/ml) entre paréntesis.
La Figura 5 ilustra un análisis SDS-PAGE de variantes de TrGA purificadas. Desde la izquierda: marcador de peso molecular y las variantes purificadas de glucoamilasa de Trichoderma reesei R_C_1 y R_C_2 como se indica.
La Figura 6A ilustra una comparación de la estructura tridimensional de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (en negro) (sec. con núm. de ident.: 2) y la glucoamilasa de Aspergillus awamori (en gris) (sec. con núm. de ident.: 5) vista desde el lateral. El lateral se mide con referencia al sitio activo, y la entrada del sitio activo está en la "parte superior" de la molécula.
La Figura 6B ilustra la estructura tridimensional de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (en negro) (sec. con núm. de ident.: 2) vista desde el lateral. El lateral se mide con referencia al sitio activo, y la entrada del sitio activo está en la "parte superior" de la molécula. Los residuos que forman la región de la interfase entre el dominio catalítico y el dominio de unión a almidón se muestran como esferas transparentes (los residuos del dominio catalítico tienen un color gris oscuro y los residuos del dominio de unión a almidón tienen un color gris claro).
La Figura 7 ilustra una comparación de las estructuras tridimensionales de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (en negro) (sec. con núm. de ident.: 2) y la glucoamilasa de Aspergillus awamori (en gris) (sec. con núm. de ident.: 5) vista desde arriba.
La Figura 8 ilustra un alineamiento de las estructuras tridimensionales de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2) y AnGA (sec. con núm. de ident.: 6) visto desde el lateral que muestra los sitios de unión 1 y 2.
La Figura 9 ilustra un modelo de la unión de acarbosa en la estructura de la TrGA.
Las Figuras 10A y 10B ilustran una comparación del alineamiento de los dominios catalíticos de las glucoamilasas parentales de Aspergillus awamori (AaGA) (sec. con núm. de ident.: 5); Aspergillus niger (AnGA) (sec. con núm. de ident.: 6); Aspergillus oryzae (AoGA) (sec. con núm. de ident.: 7); Trichoderma reesei (TrGA) (sec. con núm. de ident.: 3); Humicola grisea (HgGA) (sec. con núm. de ident.: 8); y Hypocrea vinosa (HvGA) (sec. con núm. de ident.: 9).
Los aminoácidos idénticos se indican con un asterisco (*).
La Figura 10C ilustra una secuencia de proteína madura de la glucoamilasa de Talaromyces (TeGA) (sec. con núm. de ident.: 23).
Las Figuras 10D y 10E ilustran un alineamiento que compara el dominio de unión a almidón (SBD, por sus siglas en inglés) de glucoamilasas parentales de Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident.: 11); Humicola grisea (HgGA) (sec. con núm. de ident.: 24); Thermomyces lanuginosus (ThGA) (sec. con núm. de ident.: 25); Talaromyces emersonii (TeGA) (sec. con núm. de ident.: 26); Aspergillus niger (AnGA) (sec. con núm. de ident.: 27); Aspergillus awamori (AaGA) (sec. con núm. de ident.: 28); y Thielavia terrestris (TtGA) (sec. con núm. de ident.: 29).
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS A continuación de la sección de ejemplos están las secuencias, que se incorporan en su totalidad en la presente descripción como referencia.
Sec. con núm. de ident.: 1: glucoamilasa de Trichoderma reesei, longitud completa; con péptido señal Sec. con núm. de ident.: 2: glucoamilasa de Trichoderma reesei, proteína madura; sin péptido señal Sec. con núm. de ident.: 3: dominio catalítico de la glucoamilasa de Trichoderma reesei, 1-453 de la TrGA madura, CD Sec. con núm. de ident.: 4: ADNc de la glucoamilasa de Trichoderma reesei Sec. con núm. de ident.: 5: GA de Aspergillus awamori (AaGA); CD Sec. con núm. de ident.: 6: Aspergillus niger (AnGA), CD Sec. con núm. de ident.: 7: Aspergillus oryzae (AoGA), CD Sec. con núm. de ident.: 8: glucoamilasa de Humicola grísea (HgGA); CD Sec. con núm. de ident.: 9: glucoamilasa de Hypocrea vinosa (HvGA); CD Sec. con núm. de ident.: 10: TrGA, región del conector Sec. con núm. de ident.: 11: TrGA, SBD Sec. con núm. de ident.: 12: SVDDFI: inicio de la proteína madura de la TrGA Sec. con núm. de ident.: 13: variante CS4 de glucoamilasa de Trichoderma reesei , proteína madura; sin péptido señal Sec. con núm. de ident.: 14: variante R_A_1 de glucoamilasa de Trichoderma reesei , proteína madura; sin péptido señal Sec. con núm. de ident.: 15: variante R_C_1 de glucoamilasa de Trichoderma reesei , proteína madura; sin péptido señal Sec. con núm. de ident.: 16: variante R_A_6 de glucoamilasa de Trichoderma reesei , proteína madura; sin péptido señal Sec. con núm. de ident.: 17: variante R_C_13 de glucoamilasa de Trichoderma reesei , proteína madura; sin péptido señal Sec. con núm. de ident.: 18: glucoamilasa de Aspergillus awamori (AaGA), longitud completa, con péptido señal Sec. con núm. de ident.: 19: glucoamilasa de Aspergillus niger (AnGA), longitud completa, con péptido señal Sec. con núm. de ident.: 20: glucoamilasa de Aspergillus oryzae (AoGA), longitud completa, con péptido señal Sec. con núm. de ident.: 21: glucoamilasa de Humicola grísea (HgGA), longitud completa, con péptido señal Sec. con núm. de ident.: 22: glucoamilasa de Hypocrea vinosa (HvGA), longitud completa, con péptido señal Sec. con núm. de ident.: 23: GA de Talaromyces, proteína madura Sec. con núm. de ident.: 24: GA de Humicola grísea, SBD Sec. con núm. de ident.: 25: GA de Thermomyces lanuginosus, SBD Sec. con núm. de ident.: 26: GA de Talaromyces emersonii, SBD Sec. con núm. de ident.: 27: GA de Aspergillus niger, SBD Sec. con núm. de ident.: 28: GA de Aspergillus awamori , SBD Sec. con núm. de ident.: 29: GA de Thielavia terrestris, SBD Sec. con núm. de ident.: 30: ADNc optimizado de glucoamilasa de tipo silvestre (WT)de Trichoderma reesei (pEntry-GA WT) Sec. con núm. de ident.: 31: ADNc optimizado de glucoamilasa variante CS4 de Trichoderma reesei (pEntry-GA CS4) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las glucoamilasas son enzimas comercialmente importantes en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis del almidón. Los solicitantes han descubierto que al introducir ciertas alteraciones en posiciones dentro de regiones específicas de la secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa parental, la variante de glucoamilasa exhibe termoestabilidad disminuida y, en algunas modalidades, sin perder el rendimiento de sacarificación en comparación con la glucoamilasa parental.
Las glucoamilasas son enzimas comercialmente importantes en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis del almidón. En la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa con termoestabilidad reducida para hidrólisis de almidón. Estas variantes de glucoamilasa contienen sustituciones de aminoácidos dentro de los dominios catalíticos y/o el dominio de unión a almidón. Las variantes exhiben propiedades alteradas, tales como una termoestabilidad alterada y/o actividad específica alterada.
Además, en la presente descripción se describe que un cierto subconjunto de variantes de glucoamilasa son muy útiles para agregarse en un recipiente de fermentación, por ejemplo, durante la fermentación de cerveza debido a la termolabilidad adecuada de la enzima que hace que sea posible la inactivación por pasteurización.
Se han llevado a cabo experimentos de pasteurización en cerveza a escala de laboratorio, piloto y a escala real para evaluar la capacidad de inactivar las variantes descritas en la presente descripción en el proceso cervecero. Las pasteurizaciones a escala de laboratorio se validaron en cerveza embotellada con glucoamilasas en un pasteurizador de túnel a escala real (no se muestran los datos). Los inventores de la presente invención han proporcionado varias variantes de una glucoamilasa parental, cuyas variantes, en algunas modalidades, han demostrado ser activos funcionales en el recipiente de fermentación (rendimiento alto de sacarificación) y significativamente más termolábiles que la glucoamilasa parental y/o varias otras glucoamilasas evaluadas. Estas variantes de glucoamilasa pueden inactivarse completamente con menos de 16.8 unidades de pasteurización (PU, por sus siglas en inglés), lo cual se prefiere para la pasteurización de cerveza.
En algunas modalidades, usar una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción en un proceso de sacarificación produce un jarabe con porcentaje alto de glucosa. En algunas modalidades, usar una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción da como resultado una producción aumentada de azúcares fermentables en una etapa de maceración y/o fermentación de una etapa de fabricación de cerveza. En algunas modalidades, usar una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción produce un grado real de fermentación mejorado. Estas propiedades alteradas se obtienen por mutación, por ejemplo, al sustituir residuos de aminoácidos en posiciones seleccionadas en una glucoamilasa parental. Esto se describirá detalladamente más adelante.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que comprenden a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental y, opcionalmente, una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos de la interfase que consiste en los residuos 29, 43, 48, y 116 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental y, opcionalmente, una o dos sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos de la interfase o del grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que comprenden a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 48 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental, o una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 147 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que comprenden a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 147 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 48 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que comprenden la sustitución de aminoácidos H502S de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; la sustitución de aminoácidos L98E de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; y la sustitución de aminoácidos Y48V de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13 o la sustitución de aminoácidos Y147R de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa con un dominio de unión a almidón y un dominio catalítico, la variante comprende una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de los aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que comprenden, además, una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 24, 26, 27, 30, 40, 42, 44, 46, 49, 110, 111, 112, 114, 117, 118, 119, 500, 504, 534, 536, 537, 539, 541, 542, 543, 544, 546, 547, 548, 580, 583, 585, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594 y 596 de la sec. con núm. de ident.:2 o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
En otro aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que comprenden, además, una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos en las posiciones 1 a 484 con excepción de la posición 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 97, 98, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 500, 502, 504, 534, 536, 537, 539, 541, 542, 543, 544, 546, 547, 548, 580, 583, 585, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594 y 596 de la sec. con núm. de ident.:2 o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
En otro aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasas que comprenden una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos en las posiciones 1 a 484 con excepción de la posición 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118 y 119 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
En un aspecto, en la presente descripción se describen variantes de glucoamilasa que tienen un RDF de al menos 74.5 %, tal como, por ejemplo, al menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % 86 %, 87 %, 88 %, 89 % o 90 % cuando se dosifican a 0.058 mg de GA/ml de mosto, como se describe en el análisis 'Elaboración de cerveza' de la Sección de ensayos y métodos.
En un aspecto, la presente invención describe el enlace estructural-funcional usado para derivar un conjunto de variantes de TrGA que es suficien emente termolábil en cerveza para inactivarse completamente por pasteurización y, al mismo tiempo, mantener un alto rendimiento en toda la fermentación de la cerveza evaluado por el grado real de fermentación. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos F29, 143, Y48, F116 y H502 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en 143 es I43Q, y la sustitución en Y48 es Y48V, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos S97, L98, Y147, F175, G483 y T484 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en S97 es S97M, la sustitución en G483 es G483S y la sustitución en T484 es T484W, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
En un aspecto, la glucoamilasa parental, como se describe en la presente descripción, es la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción tiene al menos 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos 85 %, 90 %, 95 % o 99.5 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: : 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21, o 22. En un aspecto, la glucoamilasa parental descrita en la presente descripción tiene un dominio catalítico que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99.5 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, y/o 13, y/o un dominio de unión a almidón que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99.5 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 11, 24, 25, 26, 27, 28 y/o 29.
En otro aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción consiste en la secuencia parental de los aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22, cuya secuencia de aminoácidos tiene una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos F29, 143, Y48, F116 y H502 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en 143 es I43Q, y la sustitución en Y48 es Y48V, o una posición equivalente en la glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos S97, L98, Y147, F175, G483 y T484 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en S97 es S97M, la sustitución en G483 es G483S y la sustitución en T484 es T484W, o una posición equivalente en la glucoamilasa parental.
En otro aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 2, cuya secuencia de aminoácidos tiene una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos F29, 143, Y48, F116 y H502 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en 143 es I43Q, y la sustitución en Y48 es Y48V; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos S97, L98, Y147, F175, G483 y T484 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en S97 es S97M, la sustitución en G483 es G483S y la sustitución en T484 es T484W.
En otro aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 13, cuya secuencia de aminoácidos tiene una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos F29, 143, Y48, F116 y H502 de la sec. con núm. de ident.: 13, en donde la sustitución en 143 es I43Q, y la sustitución en Y48 es Y48V; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos S97, L98, Y147, F175, G483 y T484 de la sec. con núm. de ident.: 13, en donde la sustitución en S97 es S97M, la sustitución en G483 es G483S y la sustitución en T484 es T484W de la sec. con núm. de ident.: 13.
En un aspecto, la variante de glucoamilasa exhibe termoestabilidad alterada cuando se compara con la glucoamilasa parental . En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción exhibe termoestabilidad disminuida cuando se compara con la glucoamilasa parental, tal como la glucoamilasa parental con la cual tiene la identidad de secuencia más alta. En un aspecto, la variante de glucoamilasa exhibe actividad específica alterada cuando se compara con la glucoamilasa parental, tal como la glucoamilasa parental con la cual tiene la identidad de secuencia más alta. En un aspecto, la variante de glucoamilasa exhibe actividad específica similar o incrementada cuando se compara con la glucoamilasa parental, tal como la glucoamilasa parental con la cual tiene la identidad de secuencia más alta. En un aspecto, la variante de glucoamilasa exhibe termoestabilidad reducida y actividad específica similar o incrementada cuando se compara con la glucoamilasa parental, tal como la glucoamilasa parental con la cual tiene la identidad de secuencia más alta.
En un aspecto, la variante de glucoamilasa exhibe rendimiento de sacarificación alterado en el FV determinado por el grado real de fermentación (RDF, por sus siglas en inglés) en comparación con la glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción produce un valor de RDF similar o disminuido en la elaboración de cerveza en comparación con la glucoamilasa parental, tal como la glucoamilasa parental con la cual tiene la identidad de secuencia más alta.
En otro aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción se inactiva por pasteurización, tal como al usar menos de 16.8, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 unidades de pasteurización (PU) en cerveza. En aún otro aspecto, la variante de glucoamilasa tiene una actividad glucoamilasa (GAU) de 0.05-10 GAU/mg, tal como 0.1-5 GAU/mg, tal como 0.5-4 GAU/mg, tal como 0.7-4 GAU/mg, o tal como 2-4 GAU/mg.
En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción, cuando está en su forma cristalina, tiene una estructura de cristales para la cual las coordenadas atómicas de los átomos de la cadena principal tienen una desviación cuadrática media con respecto a las coordenadas atómicas de los átomos equivalentes de la cadena principal de la TrGA (como se define en la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218) menor que 0.13 nm después del alineamiento de los átomos equivalentes de la cadena principal, y que tiene una región de conector, un dominio de unión a almidón y un dominio catalítico.
En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo correspondiente a la posición F29 de la sec. con núm. de ident.:2 o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos F29A/R/N/D/C/E/F/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos F29V de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 143 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos I43Q de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo correspondiente a la posición Y48 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos Y48V de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición F116 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos F116M de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición H502 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos H502A/N/D/C/E/F/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V/W/Y de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos H502S/E de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo correspondiente a la posición S97 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos S97M de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición L98 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos L98A/R/N/E/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V/Y de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos L98E de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo correspondiente a la posición Y147 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos Y147R de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo correspondiente a la posición F175 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos F175V/I/L de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo correspondiente a la posición G483 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos G483S de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo correspondiente a la posición T484 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la siguiente sustitución de aminoácidos T484W de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
En un aspecto, la cantidad total de sustituciones de aminoácidos (1) en el grupo de residuos de aminoácidos de la interfase que consiste en los residuos 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 500, 502, 504, 534, 536, 537, 539, 541, 542, 543, 544, 546, 547, 548, 580, 583, 585, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594 y 596 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y (2) en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consiste en residuos que no están en contacto directo con el dominio de unión a almidón en las posiciones 1 a 484 con excepción de la posición 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118 y 119 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; es dos, tres o cuatro.
En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos F29V-G483S, Y48V-L98E-H502S, F116M-F175V, F175V-H502E, I43Q-F175I, I43Q-F175V-H502S, F29V- S97M-G483S-T484W o L98E-Y147R-H502S de la sec. con núm. de ident.: 22 oo 1133,, oo uunnaa posición equivalente en una glucoamilasa parental. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende, además, las siguientes sustituciones de aminoácidos L417V, T430A, Q511H, A539R y N563I. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción es la sec. con núm. de ident.: 14, 15 o 16. En un aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción es la sec. con núm. de ident.: 14, 15 o 17. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la sec. con núm. de ident.: 14, 15 o 16. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa descrita en la presente descripción comprende la sec. con núm. de ident.: 14, 15 o 17.
En un aspecto, la glucoamilasa parental se selecciona de una glucoamilasa obtenida a partir de Trichoderma spp., Aspergillus spp., Humicola spp., Penicillium spp., Talaromycese spp. o Schizosaccharmyces spp. (Figura 10C, D y E). En otro aspecto, la glucoamilasa parental se obtiene a partir de Trichoderma spp. o Aspergillus spp.
En un aspecto, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos con, o con respecto a, otra secuencia de aminoácidos se determina mediante el uso de la búsqueda de proteína-proteína de BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) con los parámetros predeterminados: matriz de puntajes: blosum62, base de datos no redundante de secuencias de proteínas y el algoritmo Blast Parámetros Umbral esperado 10 Máximo de coincidencias en un intervalo de consulta 0 Penalidad por apertura de la interrupción 11 Penalidad por extensión de la interrupción 1 Ajuste composicional: Ajuste composicional condicional de la matriz de puntajes Máscara y filtros No En un aspecto, la variante de glucoamilasa se obtiene por expresión recombinante en una célula hospedera.
En un aspecto, la invención se relaciona con un ácido nucleico capaz de codificar una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción. En otro aspecto, se describe un plásmido o vector de expresión que comprende el ácido nucleico, o capaz de expresar una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción. En un aspecto, el plásmido o vector de expresión comprende un promotor derivado de Trichoderma, tal como un promotor derivado de cbhl de T. reesei . En otro aspecto, el plásmido o vector de expresión comprende un terminador derivado de Trichoderma, tal como un terminador derivado de cbhl de T. reesei . En aún otro aspecto, el plásmido o vector de expresión comprende uno o más marcadores de selección, tales como amdS y pyrG de Aspergillus nidulans . En otro aspecto, el plásmido o vector de expresión comprende una o más regiones de telómeros que permiten el mantenimiento de plásmidos no cromosómicos en una célula hospedera.
En un aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedera que tiene expresión heteróloga de una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción. En otro aspecto, la célula hospedera es una célula fúngica. En aún otro aspecto, la célula fúngica es del género Trichoderma. En aún otro aspecto, la célula fúngica es de la especie Trichoderma reesei o de la especie Hypocrea jecorina . En otro aspecto, la célula hospedera comprende, preferentemente se transforma con, un plásmido o vector de expresión como se describe en la presente descripción.
En un aspecto, la invención se relaciona con un método para aislar una variante de glucoamilasa como se define en la presente descripción; el método comprende las etapas de inducir la síntesis de la variante de glucoamilasa en una célula hospedera, como se define en la presente descripción, que tiene expresión heteróloga de la variante de glucoamilasa y recuperar la proteína extracelular secretada por la célula hospedera y, opcionalmente, purificar la variante de glucoamilasa. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir una variante de glucoamilasa como se define en la presente descripción, el método comprende las etapas de inducir la síntesis de la variante de glucoamilasa en una célula hospedera, como se define en la presente descripción, que tiene expresión heteróloga de la variante de glucoamilasa y, opcionalmente, purificar la variante de glucoamilasa. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para expresar una variante de glucoamilasa como se define en la presente descripción; el método comprende obtener una célula hospedera, como se define en la presente descripción, y expresar la variante de glucoamilasa a partir de la célula hospedera y, opcionalmente, purificar la variante de glucoamilasa. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa, como se define en la presente descripción, es la proteína dominante secretada.
En un aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende una o más variantes de glucoamilasa como se describe en la presente descripción. En un aspecto, la composición se selecciona entre una composición hidrolizante de almidón, una composición sacarificante, una composición detergente, una composición enzimática para fermentación de alcohol, y una composición alimenticia para animales. En otro aspecto, la composición comprende una o más enzimas adicionales. En aún otro aspecto, una o más de las enzimas adicionales se seleccionan entre alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej ., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluida cualquier combinación de estas. En otro aspecto, una o más de estas variantes de glucoamilasa y/o una o más enzimas adicionales se inactivan por pasteurización. En aún otro aspecto, la variante de glucoamilasa y/o una o más de las enzimas adicionales se inactivan por pasteurización, tal como al usar menos de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16 o 15 de unidades de pasteurización (PU) en cerveza.
En un aspecto, la invención se relaciona con el uso de una variante de glucoamilasa, como se describe en la presente descripción, o una composición, como se describe en la presente descripción, en una fermentación, en donde la variante de glucoamilasa o la composición se agrega antes de o durante una etapa de fermentación. En otro aspecto, a la etapa de fermentación, y etapa de filtración de cerveza opcional, le sigue una etapa de pasteurización. En un aspecto, la fermentación está comprendida en un proceso para fabricar una bebida fermentada. En un aspecto, la bebida fermentada se selecciona del grupo que consiste en cerveza, tal como cerveza de bajo contenido alcohólico o cerveza de bajas calorías. En un aspecto, la variante de glucoamilasa o la composición descritas en la presente descripción se agrega en una combinación con una o más enzimas adicionales, tales como alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej. arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasas, incluida cualquier combinación de estas. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa y/o una o más de las enzimas adicionales se inactivan en la etapa de pasteurización. En un aspecto, la variante de glucoamilasa se agrega en una cantidad, por ejemplo, de 0.01-50 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.05 -25 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.1-15 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.2 -10 mg por mi de mosto fermentado, tal como 1-5 mg por mi de mosto fermentado. En un aspecto, en la presente descripción se describe el uso de una variante de glucoamilasa termolábil para aumentar la producción de azúcares fermentables en la etapa de fermentación de un proceso cervecero, en donde la variante de glucoamilasa es como se describe en la presente descripción.
En un aspecto la invención se relaciona con un método que comprende agregar una variante de glucoamilasa, como se describe en la presente descripción, o una composición, como se describe en la presente descripción, antes de o durante una etapa de fermentación, tal como una etapa de fermentación con levadura. En otro aspecto, el método comprende una etapa de pasteurización después de la etapa de fermentación o etapa opcional de filtración de la cerveza. En otro aspecto, la fermentación está comprendida en un proceso para fabricar una bebida fermentada. En aún otro aspecto, la bebida fermentada se selecciona del grupo que consiste en cerveza, tal como cerveza de bajo contenido alcohólico o cerveza baja en calorías. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa o la composición se agrega en combinación con una o más enzimas adicionales, tales como las seleccionadas entre alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluida cualquier combinación de estas. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa y/o una o más de las enzimas adicionales se inactivan en la etapa de pasteurización. En un aspecto, la variante de glucoamilasa se agrega en una cantidad, por ejemplo, de 0.01-50 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.05 -25 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.1-15 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.2 -10 mg por mi de mosto fermentado, tal como 1-5 mg por mi de mosto fermentado. En aún otro aspecto, el método para producir una bebida fermentada comprende las siguientes etapas: a) preparar un macerado, b) filtrar el macerado para obtener un mosto, y c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, en donde una variante de glucoamilasa, como se describe en la presente descripción, o una composición, como se describe en la presente descripción, se agrega al: macerado de la etapa (a) y/o el mosto de la etapa (b) y/o el mosto de la etapa (c).
En otro aspecto, la bebida fermentada se somete a una etapa de pasteurización (d). En aún otro aspecto, el macerado de la etapa (a) se obtiene a partir de una molienda, tal como en donde la molienda comprende uno o más granos malteados y/o no malteados, o un material con base de almidón de otro cultivo. En otro aspecto, el método comprende, además, poner en contacto el macerado de la etapa (a) con una o más enzimas adicionales, tal como en donde la enzima se selecciona entre una enzima desramificante de almidón, enzima R, dextrinasa límite, alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluida cualquier combinación de estas. En otro aspecto, el método comprende, además, poner en contacto el mosto de la etapa (b) o (c) con una o más enzimas adicionales, en donde la enzima se selecciona entre una enzima desramificante de almidón, isoamilasa y dextrinasa límite, incluida cualquier combinación de estas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una bebida fermentada, en donde la bebida fermentada se produce por un método como se describe en la presente descripción. En otro aspecto, la bebida fermentada es cerveza, tal como cerveza de bajo contenido alcohólico o cerveza de bajas calorías.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de un producto alimenticio, forraje o bebida, tal como una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de malta o cereales, como cerveza o whisky, tal como vino, sidra, vinagre, vino de arroz, salsa de soja o jugo; el método comprende la etapa de tratar un material vegetal que contiene almidón y/o azúcar con una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción, o una composición como se describe en la presente descripción.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción o una composición como se describe en la presente descripción; e instrucciones para usar la variante de glucoamilasa o la composición.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una variante de glucoamilasa, como se describe en la presente descripción, o una composición, como se describe en la presente descripción, en la producción de un biocombustible de primera o segunda generación, tal como bioetanol y/o biobutanol.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una variante de glucoamilasa, como se describe en la presente descripción, o una composición, como se describe en la presente descripción, en la producción de una sustancia bioquímica, tal como isopreno de base biológica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de un biocombustible de primera o segunda generación, tal como bioetanol y/o biobutanol; el método comprende la etapa de tratar un material que comprende almidón con una variante de glucoamilasa, como se describe en la presente descripción, o una composición, como se describe en la presente descripción.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de una sustancia bioquímica, tal como isopreno de base biológica; el método comprende la etapa de tratar un material que comprende almidón con una variante de glucoamilasa, como se describe en la presente descripción, o una composición, como se describe en la presente descripción.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un producto obtenido por un método de conformidad con la invención.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición que comprende el producto obtenido por un método de conformidad con la invención, tal como en donde el producto está en un intervalo de 0.1 %-99.9 %. 1. Definiciones A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado comúnmente entendido por el experimentado en la materia a la cual pertenece esta descripción. Singleton et al., Dictionary of Microbiology And Molecular Biology, 2.° ed., John Wilcy and Sons, New York (1994), y Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary Of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan a un experimentado en la materia el sentido general de muchos de los términos usados en la presente descripción. No obstante, a continuación se definen ciertos términos por motivos de claridad y para facilitar la consulta.
Como se usa en la presente descripción, el término "glucoamilasa" (EC 3.2.1.3) se refiere a una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa desde los extremos no reductores del almidón y oligo y polisacáridos relacionados.
El término "parental" o "secuencia parental" se refiere a una secuencia que es nativa o de origen natural en una célula hospedera. Las glucoamilasas parentales incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de glucoamilasas expuestas en cualquiera de las secs. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 y 22, y glucoamilasas con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la sec. con núm. de ident.: 2.
Como se usa en la presente descripción, el término "parental" o "secuencia parental" puede referirse, además, a la variante CS4 de la TrGA madura (sec. con núm. de ident.: 13), que incluye L417V-T430A-Q511H-A539R-N563I en comparación con la TrGA (sec. con núm. de ident.2) . La forma madura de la TrGA CS4 incluye el dominio catalítico, región de conector y dominio de unión a almidón que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 13. La numeración de los aminoácidos de la glucoamilasa en la TrGA CS4 es similar a la TrGA y se basa en el alineamiento de secuencias de una glucoamilasa con la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2 y/o 3). Se espera que la estructura tridimensional de la TrGA CS4 sea idéntica a la estructura tridimensional de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (ver la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218 (Danisco US Inc., Genencor División), págs. 94-216, incorporada en la presente descripción como referencia, y el Ejemplo 11 de la patente núm. W02009/067218 (Danisco US Inc., Genencor División), págs. 89-93, incorporada en la presente descripción como referencia).
Como se usa en la presente descripción, una "posición equivalente" significa una posición que es común a dos secuencias parentales según un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa parental en cuestión así como el alineamiento de la estructura tridimensional de la glucosa parental en cuestión con la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa TrGA de referencia (sec. con núm. de ident.: 2 o 13) y estructura tridimensional. Así, puede usarse cualquier alineamiento de secuencias o alineamiento estructural para determinar la equivalencia.
El término "TrGA" se refiere a una secuencia de glucoamilasa parental de Trichoderma reesei que tiene la secuencia de proteína madura ilustrada en la sec. con núm. de ident.: 2 que incluye el dominio catalítico que tiene la secuencia ilustrada en la sec. con núm. de ident.: 3. El aislamiento, la clonación y la expresión de la TrGA se describen en la patente núm. WO 2006/060062 y en la patente de los EE. UU. núm. 7,413,887, ambas incorporadas en la presente descripción como referencia. En algunas modalidades, la secuencia parental se refiere a una secuencia de glucoamilasa que es el punto inicial para el diseño de proteínas. En la presente descripción, la numeración de los aminoácidos de la glucoamilasa se basa en el alineamiento de secuencias de una glucoamilasa con la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2 y/o 3).
El término "TrGA CS4" o "CS4" se refiere a la secuencia CS4 de la variante de la glucoamilasa parental de Trichoderma reesei que tiene la secuencia de proteína madura ilustrada en la sec. con núm. de ident.: 13 que incluye L417V-T430A-Q511H-A539R-N563I en comparación con la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2).
La frase "forma madura de una variante, proteína o polipéptido" se refiere a la forma funcional final de la variante, proteína o polipéptido. Una forma madura de una glucoamilasa puede carecer de un péptido señal, por ejemplo. Como ejemplo, una forma madura de la TrGA/-CS4 incluye el dominio catalítico, región de conector y dominio de unión a almidón que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 2/13.
Como se usa en la presente descripción, los términos "variante de glucoamilasa" y "variante" se usan con referencia a glucoamilasas que tienen algún grado de identidad de secuencias de aminoácidos con una secuencia de glucoamilasa parental . Una variante es similar a una secuencia parental, pero tiene al menos una sustitución, supresión o inserción en su secuencia de aminoácidos que hace que la secuencia sea diferente a la de una glucoamilasa parental. En algunos casos, las variantes se han manipulado y/o diseñado para incluir al menos una sustitución, supresión o inserción en su secuencia de aminoácidos que hace que la secuencia sea diferente a una parental. Adicionalmente, una variante de glucoamilasa puede retener las características funcionales de la glucoamilasa parental, por ejemplo, mantener una actividad glucoamilasa que es al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 % o aproximadamente 90 % de la actividad de la glucoamilasa parental. Además, puede tener actividad más alta que 100 % si eso es lo que se ha seleccionado.
Las "variantes" pueden tener al menos aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 99.5 % de identidad de secuencia con una secuencia de polipéptidos parental cuando se alinean óptimamente para comparación. En algunas modalidades, la variante de glucoamilasa puede tener al menos aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 99.5 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de una glucoamilasa parental. En algunas modalidades, la variante de glucoamilasa puede tener al menos aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 ¾, aproximadamente 85 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 99.5 % de identidad de secuencia con el dominio de unión a almidón de una glucoamilasa parental. La identidad de secuencia puede determinarse en toda la longitud de la secuencia parental o de la variante.
Como se usa en la presente descripción, una "secuencia homologa" e "identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos significa que tiene aproximadamente al menos 100 %, al menos 99 %, al menos 98 %, al menos 97 %, al menos 96 %, al menos 95 %, al menos 94 %, al menos 93 %, al menos 92 %, al menos 91 ¾, al menos 90 %, al menos 88 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 65 %, al menos 60 %, al menos 55 %, al menos 50 %, o al menos 45 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácidos nucleicos o una secuencia de polipéptidos cuando se alinean óptimamente para comparación, en donde la función de la secuencia de polipéptidos o secuencia de ácidos nucleicos candidato es esencialmente la misma que la secuencia de polipéptidos o secuencia de ácidos nucleicos con la que se compara la secuencia candidato homologa. En algunas modalidades, las secuencias homologas tienen entre al menos aproximadamente 85 % y 100 % de identidad de secuencia, mientras que, en otras modalidades, entre aproximadamente 90 % y 100 % de identidad de secuencia y, en otras modalidades, al menos aproximadamente 95 % y 100 %de identidad de secuencia.
Grado de identidad El grado de relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe con el parámetro "identidad".
En una modalidad, el grado de identidad de secuencias entre una secuencia de consulta y una secuencia de referencia se determina al 1) alinear las dos secuencias con cualquier programa de alineamiento adecuado mediante el uso de la matriz de puntajes predeterminada y la penalización por interrupción predeterminada, 2) identificar la cantidad de coincidencias exactas, en donde una coincidencia exacta es cuando el programa de alineamiento ha identificado un nucleótido o aminoácido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en el alineamiento y 3) dividir el número de coincidencias exactas por la longitud de la secuencia de referencia.
En una modalidad, el grado de identidad de secuencias entre una secuencia de consulta y una secuencia de referencia se determina al 1) alinear las dos secuencias con cualquier programa de alineamiento adecuado mediante el uso de la matriz de puntajes predeterminada y la penalización por interrupciones predeterminada, 2) identificar la cantidad de coincidencias exactas, en donde una coincidencia exacta es cuando el programa de alineamiento ha identificado un nucleótido o aminoácido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en el alineamiento y 3) dividir el número de coincidencias exactas por la longitud de la más larga de las dos secuencias.
En una modalidad, el grado de identidad de secuencias entre la secuencia de consulta y la secuencia de referencia se determina al 1) alinear las dos secuencias con cualquier programa de alineamiento adecuado mediante el uso de la matriz de puntajes predeterminada y la penalización por interrupciones predeterminada, 2) identificar la cantidad de coincidencias exactas, en donde una coincidencia exacta es cuando el programa de alineamiento ha identificado un nucleótido o aminoácido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en el alineamiento y 3) dividir el número de coincidencias exactas por la "longitud del alineamiento", en donde la longitud del alineamiento es la longitud de todo el alineamiento que incluye las interrupciones y partes salientes de las secuencias.
Las comparaciones de identidad de secuencias se pueden realizar a ojo o, más usualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos comercialmente disponibles usan algoritmos de comparación complejos para alinear las dos o más secuencias que reflejan mejor los eventos evolutivos que pudieran haber producido la(s) diferencia(s) entre las dos o más secuencias. Por lo tanto, estos algoritmos funcionan con un sistema de puntajes que recompensa el alineamiento de aminoácidos similares o idénticos y penaliza la inserción de interrupciones, las extensiones por interrupciones y el alineamiento de aminoácidos no similares. El sistema de puntajes de los algoritmos de comparación incluye: i) asignar un puntaje de penalización cada vez que se inserta una interrupción (puntaje de penalización por interrupciones), ii) asignar un puntaje de penalización cada vez que una interrupción existente se extiende con una posición adicional (puntaje de penalización por extensión), iii) asignar puntajes altos por alineamiento de aminoácidos idénticos, y iv) asignar puntajes variables por alineamiento de aminoácidos no idénticos.
La mayoría de programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por interrupciones. Sin embargo, se prefiere usar los valores predeterminados cuando se usa un programa para comparaciones de secuencias.
Los puntajes dados para alineamiento de aminoácidos no idénticos se asignan de conformidad con una matriz de puntajes, conocida, además, como matriz de sustitución. Los puntajes proporcionados en cada una de las matrices de sustitución reflejan el hecho de que la probabilidad de que un aminoácido se sustituya con otro durante la evolución varía y depende de la naturaleza física/química del aminoácido que se sustituye. Por ejemplo, la probabilidad de que un aminoácido polar se sustituya con otro aminoácido polar es mayor en comparación con que se sustituya con un aminoácido hidrófobo. Por lo tanto, la matriz de puntajes asignará el puntaje más alto para aminoácidos idénticos, un puntaje más bajo para aminoácidos no idénticos, pero similares, y un puntaje aún más bajo para aminoácidos que no son ni similares ni idénticos. Las matrices de puntajes más frecuentemente empleadas son las matrices PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), las matrices BLOSUM (Henikoff y Henikoff (1992)) y la matriz de Gonnet (Gonnet et al. (1992)).
Los programas informáticos adecuados para llevar a cabo este alineamiento incluyen, pero no se limitan a, los programas Vector NTI (Invitrogen Corp.) y ClustalV, ClustalW y ClustalW2 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). Se encuentra disponible una selección de diferentes herramientas de alineamiento en el servidor ExPASy Proteomics en www.expasy.org. Otro ejemplo de un programa informático que puede realizar el alineamiento de secuencias es BLAST (Herramienta básica de búsqueda de alineamiento local, por sus siglas en inglés), que está disponible en la página web del National Center for Biotechnology Information, que puede encontrarse actualmente en http:// (1990) www.ncbi.nlm.nih.gov/ y que se describió por primera vez en Altschul et al. J. Mol. Biol.215; 403-410.
En una modalidad de la presente invención, el programa de alineamiento es un programa que realiza un alineamiento global, el cual optimiza el alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias. En otra modalidad, el programa de alineamiento global se basa en el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman, Saúl B.; y Wunsch, Christian D. (1970). hA general method applicable to the search for similarities in the amino acid_ sequence of two proteins". Journal of Molecular Biology 48 (3): 443-53). Los ejemplos de programas actuales para realizar alineamientos globales que usan el algoritmo de Needleman-Wunsch son los programas EMBOSS Needle y EMBOSS Stretcher, ambos disponibles en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/.
EMBOSS Needle realiza un alineamiento global óptimo de secuencias que usa el algoritmo de alineamiento de Needleman-Wunsch para hallar el alineamiento óptimo (que incluye interrupciones) de dos secuencias a lo largo de su longitud completa.
EMBOSS Stretcher usa una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch que permite alinear globalmente secuencias más grandes.
En una modalidad, las secuencias se alinean con un programa de alineamiento global y la identidad de secuencia se calcula al identificar el número de coincidencias exactas identificadas por el programa dividido por la "longitud de alineamiento", en donde la longitud de alineamiento es la longitud de todo el alineamiento que incluye las interrupciones y las partes salientes de las secuencias. En otra modalidad, el programa de alineamiento global usa el algoritmo de Needleman-Wunsch y la identidad de secuencia se calcula al identificar el número de coincidencias exactas identificadas por el programa dividido por la "longitud de alineamiento", donde la longitud de alineamiento es la longitud de todo el alineamiento que incluye las interrupciones y las partes salientes de las secuencias.
En aún otra modalidad, el programa de alineamiento global se selecciona del grupo que consiste en EMBOSS Needle y EMBOSS stretcher, y la identidad de secuencia se calcula al identificar el número de coincidencias exactas identificadas por el programa dividido por la "longitud de alineamiento", donde la longitud de alineamiento es la longitud de todo el alineamiento que incluye las interrupciones y las partes salientes de las secuencias.
Una vez que el programa ha producido un alineamiento, es posible calcular el % de similitud y el % de identidad de secuencias. El programa hace esto, típicamente, como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
En una modalidad, se prefiere usar el programa ClustalW para realizar el alineamiento de secuencias. Preferentemente, el alineamiento con ClustalW se realiza con los siguientes parámetros para el alineamiento de secuencias por pares: ClustalW2 está disponible, por ejemplo, en la Internet, en la página web del European Bioinformatics Institute, EMBL-EBI, www.ebi.ac.uk, en el apartado herramientas - análisis de secuencias - ClustalW2. Actualmente, la dirección exacta de la herramienta ClustalW2 es www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.
En otra modalidad, se prefiere usar el programa Align X de Vector NTI (Invitrogen) para realizar los alineamientos de secuencias. En una modalidad, puede usarse ExplO con los parámetros predeterminados: Penalización por apertura de la interrupción: 10 Penalización por extensión de la interrupción: 0.05 Intervalo de penalización por separación de las interrupciones: 8 En otra modalidad, el alineamiento de una secuencia de aminoácidos con, o con respecto a, otra secuencia de aminoácidos se determina mediante el uso de la matriz de puntajes: blosum62mt2 y los parámetros de alineación por pares de VectorNTI En una modalidad preferida, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos con, o con respecto a, otra secuencia de aminoácidos se determina mediante el uso de la búsqueda proteína-proteína de BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) con los parámetros predeterminados: matriz de puntajes: tamaño de palabra de 3, matriz de sustitución blosum6, base de datos no redundante de secuencias de proteínas y el algoritmo de BLAST El término "alineamiento óptimo" se refiere al alineamiento que da el puntaje de identidad de porcentaje más alto.
La homología se determina mediante el uso de téenicas estándar conocidas en la materia (ver, p. ej., Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. 2 : 482 (1981); Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); Pearson y Lipman, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 85: 2444 (1988); programas tales como GAP, BESTHT, FASTA y TFASTA del paquete de programas informáticos Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI); y Devereux et al., Nucleic Acid Res. , 12: 387-395 (1984)).
Las secuencias homologas se determinan por métodos de alineamiento de secuencias conocidos. En la presente descripción, la "identidad de secuencia" se determina por el método de alineamiento de secuencias. Un método de alineamiento comúnmente usado es BLAST, descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol . Blol . 215: 403-410 (1990); y Karlin et al, Proc . Nati . Acad. Sel . USA 90: 5873-5787 (1993)). Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 (ver Altschul et al, Meth. Enzymol . 266: 460-480 (1996)). El WU-BLAST-2 usa diversos parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se configuran con los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se definen con los siguientes valores: intervalo de superposición =1, fracción de superposición = 0.125, umbral de palabra (T) 11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos, y el programa los configura por sí solo en función de la composición de la secuencia particular y de la composición de la base de datos particular contra la cual se busca la secuencia de interés. Sin embargo, los valores se pueden ajustar para incrementar la sensibilidad.
Pueden usarse otros métodos para alinear secuencias. Un ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo PILEUP. El algoritmo PILEUP crea un alineamiento múltiple de secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas mediante el uso de alineamientos progresivos por pares. Puede trazar, además, un árbol que muestra las relaciones de agrupamientos usadas para crear el alineamiento. El algoritmo PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (Feng y Doolittle, J. Mol . Evol . 35: 351-360 (1987)). El método es similar al descrito por Higgins y Sharp (Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989)). Los parámetros del algoritmo PILEUP útiles incluyen un peso de la interrupción predeterminado de 3.00, un peso de la longitud de la interrupción predeterminado de 0.10 e interrupciones finales pesadas.
Como se usa en la presente descripción, los términos "variante de glucoamilasa" o "variante" se usan con referencia a glucoamilasas que son similares a una secuencia de la glucoamilasa parental, pero tienen al menos una sustitución, supresión o inserción en su secuencia de aminoácidos que hace que sean de secuencia diferente con respecto a la secuencia parental. En algunos casos, se han manipulado y/o diseñado para incluir al menos una sustitución, supresión o inserción en su secuencia de aminoácidos que hace que sean de secuencia diferente con respecto a la glucoamilasa parental.
Como se usa en la presente descripción, el término "dominio catalítico" se refiere a una región estructural de un polipéptido, que contiene el sitio activo para la catálisis de la hidrólisis del sustrato, ver, por ejemplo, la región especificada de la TrGA más adelante.
La región de la interfase entre el dominio de núcleo catalítico y el dominio de unión a almidón en la glucoamilasa de Trichoderma reesei se determinó mediante el uso de la herramienta interactiva PDBePISA para la exploración de interfases de proteínas macromoleculares (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html) al usar la búsqueda de base de datos y el parámetro de entrada PDB: 2V 4 (R. Bott et al., (2008) Biochemistry 47: 5746-5754), identidad de cadena modificada para análisis de la interfase intramolecular por: cadena A, residuo 1-453; dominio de núcleo catalítico y cadena B, residuo 491-599. La búsqueda de la interfase se realizó con los parámetros predeterminados para el análisis de la interfase: Parámetros: Modo de procesamiento, Automático Procesamiento de ligandos,Sí La búsqueda dio como resultado los siguientes residuos de aminoácidos en el área de superficie de conexión entre los dos dominios, que corresponden a las posiciones 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 500, 502, 504, 534, 536, 537, 539, 541, 542, 543, 544, 546, 547, 548, 580, 583, 585, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594 y 596 de la sec. con núm. de ident.: 2, que se validaron por inspección manual mediante el uso de Pymol (Sistema gráfico molecular PyMOL, Versión 1.2r3pre, Schródinger, LLC.).
En el presente contexto, el término "residuos que no están en contacto directo con el dominio de unión a almidón en las posiciones 1 a 484" significa residuos de aminoácidos en las posiciones 1 a 484 de la sec. con núm. de ident.: 2 que no tienen interacción electrostática, polar o hidrófoba directa con los residuos de aminoácidos en el dominio de unión a almidón. La mayoría de los residuos en las posiciones 1 a 484 no están en contacto directo, como se ve a partir de la estructura de la TrGA (PDB ID: 2VN4). La identidad de la interacción y los residuos involucrados pueden definirse mediante el uso del servidor PISA ePDB y consisten en: interacción hidrófoba (Van der Waals), enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo u otras interacciones electrostáticas directas entre los átomos de la cadena lateral o de la cadena principal. Así, en un aspecto, todos los residuos desde 1 a 484 de la sec. con núm. de ident.: 2 que excluye los residuos: 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118 y 119 de la sec. con núm. de ident.: 2 no están en contacto directo con el dominio de unión a almidón.
El término "conector" se refiere a una secuencia corta de aminoácidos que tiene, generalmente, entre 3 y 40 residuos de aminoácidos que unen covalentemente una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de unión a almidón con una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio catalítico.
El término "dominio de unión a almidón" (SBD, por sus siglas en inglés) se refiere a una secuencia de aminoácidos que se une, preferentemente, a un sustrato de almidón. Es muy conocido para un experimentado en la materia cómo identificar un SBD - el SBD es un ejemplo de un módulo de unión a carbohidratos (CBM, por sus siglas en inglés), y los CBM se han clasificado en familias de CBM mediante el uso de un sistema de clasificación basado en secuencias (http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html). Adicionalmente, es muy conocido para una persona experimentada en la materia aislar materiales que contienen, por ejemplo, un SBD mediante el uso de cromatografía de afinidad con beta ciclodextrina o almidón crudo (Hamilton et al. (2000) Enzyme and Microbial Technology 26, págs. 561-567). En un aspecto, la definición de dominio de SBD se adopta de la base de datos Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/ o www.sanger.ac.uk/resources/databases/pfam.html), cuya base de datos de familias de dominios de proteínas se genera a partir de la similitud de secuencias. Así, en un aspecto, el SBD es como se define en la familia 20 de módulos de unión a carbohidratos de la base de datos Pfam.
Como se usa en la presente descripción, el término "fragmento" se define como una variante que tiene una o más (varias) supresiones de aminoácidos en el extremo amino y/o carboxilo, por ejemplo, del polipéptido de la sec. con núm. de ident.:2; en donde el fragmento tiene actividad glucoamilasa. En un aspecto, el fragmento tiene una o más (varias) supresiones de aminoácidos en el extremo amino y/o carboxilo de la sec. con núm. de ident.:2 o 13.
Como se usa en la presente descripción, el término "truncado" se refiere a un polipéptido que, comparado con la glucoamilasa parental (u otra variante), no logra su longitud completa traducida y, por lo tanto, al que le faltan algunos de los aminoácidos presentes en la glucoamilasa parental. El truncamiento es producido, normalmente, por una mutación de terminación prematura, pero podría ser causado por otro mecanismo, tal como una modificación posterior a la traducción o escisión de la proteasa.
Como se usa en la presente descripción, los términos "secuencia mutante" y "gen mutante" se usan intercambiablemente y se refieren a una secuencia de polinucleótidos que tiene una alteración en al menos un codón que tiene lugar en una secuencia parental de la célula hospedera. El producto de expresión de la secuencia mutante es una proteína variante con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la glucoamilasa parental. El producto de expresión puede tener una capacidad funcional alterada (p. eu., actividad enzimática aumentada o termoestabilidad reducida).
El término "propiedad" o sus equivalentes gramaticales en el contexto de un polipéptido, como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier característica o atributo de un polipéptido que puede seleccionarse o detectarse. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, estabilidad oxidativa, especificidad del sustrato, actividad catalítica, estabilidad térmica, perfil de actividad del pH, resistencia a la degradación proteolítica, KM, KCAT, relación KCAT/KM, plegado de proteínas, capacidad de unirse a un sustrato y capacidad de secretarse.
El término "propiedad" o sus equivalentes gramaticales en el contexto de un ácido nucleico, como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier característica o atributo de un ácido nucleico que puede seleccionarse o detectarse. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, una propiedad que afecta la transcripción de genes (p. ej., resistencia del promotor o reconocimiento del promotor), una propiedad que afecta el procesamiento del ARN (p. ej., corte y empalme del ARN y estabilidad del ARN), una propiedad que afecta la traducción (p. ej., regulación, unión del ARNm a proteínas ribosómicas).
Los términos "térmicamente estable" y "termoestable" se refieren a variantes de glucoamilasa de la presente descripción que retienen una cantidad especificada de actividad enzimática después de exponerse a una temperatura durante un período de tiempo dado en condiciones imperantes durante la hidrólisis de los sustratos de almidón, por ejemplo, mientras se exponen a temperaturas alteradas.
El término "estabilidad aumentada" en el contexto de una propiedad, tal como termoestabilidad, se refiere a una actividad catalítica retenida más alta, o actividad hidrolítica de almidón medida de cualquier manera, en el tiempo en comparación con la glucoamilasa parental.
El término "glucoamilasa termolábil" se refiere a una glucoamilasa de la presente descripción que pierde actividad enzimática hidrolítica detectable después de exponerse a una temperatura durante un período de tiempo dado. En un aspecto, el término "glucoamilasa termolábil" se refiere a una glucoamilasa de la presente descripción que pierde actividad enzimática hidrolítica detectable después de exponerse a una temperatura durante un período dado en las condiciones imperantes durante la pasteurización del producto de un proceso cervecero. Las condiciones precisas de pasteurización (p. ej., unidades de pasteurización) dependerán del tipo de cerveza producida por el proceso cervecero. La pérdida de actividad hidrolítica detectable de la glucoamilasa termolábil en una cerveza pasteurizada puede detectarse mediante el uso de un ensayo enzimático de glucoamilasa, como se describe en la presente descripción, y se define por la pérdida de actividad medida por el ensayo. En un aspecto, "termoestabilidad disminuida" se usa intercambiablemente con "más termolábil" cuando se compara con una glucoamilasa parental.
El término "actividad específica" se define como la actividad por mg de proteína glucoamilasa. En algunas modalidades, la actividad para glucoamilasa se determina por un ensayo específico cromogénico de glucoamilasa con un sustrato de pNP-b-maltósido y se expresa como la cantidad de p-nitrofenol que se produce a partir del sustrato por min en condiciones de ensayo definidas. En algunas modalidades, la concentración de proteínas puede determinarse con un ensayo de Bradford.
Los términos "activo" y "biológicamente activo" se refieren a una actividad biológica asociada con una proteína particular. Se deduce que la actividad biológica de una proteína dada se refiere a cualquier actividad biológica típicamente atribuida a esa proteína por los experimentados en la materia. Por ejemplo, una actividad enzimática asociada con una glucoamilasa es hidrolítica y, por lo tanto, una glucoamilasa activa tiene actividad hidrolítica.
Como se usa en la presente descripción, el término "actividad glucoamilasa" se refiere a la actividad de una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa desde los extremos no reductores del almidón y oligo y polisacáridos relacionados. Particularmente, la actividad glucoamilasa puede evaluarse por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (ver Goto et al., Biosci . Biotechnol . Biochem. 58:49-54 (1994)).
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", usados intercambiablemente en la presente descripción, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estos términos incluyen, pero no se limitan a, un ADN de hebra simple, doble o triple, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de pirimidina y purina, u otras bases nucleotídicas naturales, química o bioquímicamente modificadas, no naturales o derivadas.
Como se usa en la presente descripción, los términos "constructo de ADN" , "ADN transformante" y "vector de expresión" se usan intercambiablemente para referirse al ADN usado para introducir secuencias en un organismo o célula hospedera. El ADN puede generarse in vitro por PCR o cualquier otra téenica adecuada conocida para los experimentados en la materia. El constructo de ADN, ADN transformante, o casete de expresión recombinante pueden incorporarse en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plasmídico, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del casete de expresión recombinante de un vector de expresión, constructo de ADN o ADN transformante incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácidos nucleicos que se transcribirá, y un promotor. En algunas modalidades, los vectores de expresión tienen la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogo en una célula hospedera.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a un constructo de polinucleótidos diseñado para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, casetes, y similares.
Como se usa en la presente descripción en el contexto de introducir una secuencia de ácidos nucleicos en una célula, el término "introducido" se refiere a cualquier método adecuado para transferir la secuencia de ácidos nucleicos a la célula. Estos métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, fusión de protoplastos, transíección, transformación, conjugación, y transducción.
Como se usa en la presente descripción, los términos "transformado" y "establemente transformado" se refieren a una célula que tiene una secuencia de polinucleótidos no nativa (heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episómico que se mantiene por al menos dos generaciones.
Como se usa en la presente descripción, los términos "marcador de selección" y "marcador selectivo" se refieren a un ácido nucleico (p. ej., un gen) capaz de expresarse en células huésped que facilita la selección de estos huéspedes que contienen el vector. Típicamente, los marcadores de selección son genes que confieren resistencia antimicrobiana o una ventaja metabólica en la célula hospedera que permite que las células que contienen el ADN exógeno se distingan de las células que no han recibido ninguna secuencia exógena durante la transformación.
Como se usa en la presente descripción, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que funciona para dirigir la transcripción de un gen dirección 3'. El promotor, junto con otras secuencias de ácidos nucleicos reguladoras de la transcripción y la traducción (denominadas, además, "secuencias de control"), es necesario para expresar un gen dado. Generalmente, las secuencias reguladoras de transcripción y de traducción incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, sitios de unión a ribosomas, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción, y secuencias potenciadoras o activadoras.
Un ácido nucleico se "une operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN que codifica un líder secretor (es decir, un péptido señal), puede unirse operativamente al ADN para un polipéptido si este se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido. Generalmente, "unirse operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura.
Como se usa en la presente descripción, el término "gen" se refiere a un polinucleótido (p. ej., un segmento de ADN), que codifica un polipéptido e incluye regiones que están antes y después de las regiones codificantes, así como secuencias intervinientes (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
Como se usa en la presente descripción, el término "hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria por apareamiento de bases, como se conoce en la materia.
Se considera que una secuencia de ácidos nucleicos es "selectivamente hibridable" a una secuencia de ácidos nucleicos de referencia si las dos secuencias se hibridan específicamente entre sí en condiciones de hibridación de rigurosidad moderada a alta y condiciones de lavado. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) de la sonda o complejo de unión del ácido nucleico. Por ejemplo, la "rigurosidad máxima" tiene lugar, típicamente, a aproximadamente una Tm - 5 °C (5 °C menor que la Tm de la sonda),- "rigurosidad alta" a aproximadamente 5- 10 °C menor que la Tm; "rigurosidad intermedia" a aproximadamente 10-20 °C menor que la Tm de la sonda; y "rigurosidad baja" a aproximadamente 20-25 °C menor que la Tm. Funcionalmente, pueden usarse condiciones máximas de rigurosidad para identificar secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación; mientras que puede usarse una hibridación de rigurosidad intermedia o baja para identificar o dectectar homólogos de secuencias de polinucleótidos.
Las condiciones de hibridación de rigurosidad moderada y alta son conocidas en la materia. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad alta incluye hibridación a aproximadamente 42 °C en formamida al 50 I, 5 SSC, 5 de solución de Denhardt, 0.5 % de SDS y 100 mg/ml de ADN portador desnaturalizado seguido por el lavado dos veces en 2 SSC y 0.5 % de SDS a temperatura ambiente y dos veces más en 0.1 SSC y 0.5 % de SDS a 42 °C. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderada incluye una incubación de toda una noche a 37 °C en una solución que comprende formamida al 20 %, 5 SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH de 7.6), 5 de solución de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado por cizallamiento, seguido por el lavado de los filtros en 1 SSC a aproximadamente 37-50 °C. Aquellos con experiencia en la materia sabrán cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario, para adaptarse a factores tales como la longitud de la sonda y similares.
Como se usa en la presente descripción, "recombinante" incluye la referencia a un vector o una célula, que se ha modificado por la introducción de una secuencia de ácidos nucleicos homologa o heteróloga o que la célula se deriva de una célula modificada de esta manera. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que en su defecto se expresan anormalmente, se subexpresan o no se expresan de ningún modo como resultado de intervención humana deliberada.
En una modalidad, las secuencias mutadas de ADN se generan con mutagénesis saturada de sitios en al menos un codón y/o nucleótido. En otra modalidad, la mutagénesis saturada de sitios se lleva a cabo para dos o más codones. En otra modalidad, las secuencias de ADN mutantes tienen más de aproximadamente 50 %, más de 55 %, más de 60 %, más de 65 %, más de 70 %, más de 75 %, más de 80 %, más de 85 %, más de 90 %, más de 95 % o más de 98 % de identidad con la secuencia de ADN de la glucoamilasa. En modalidades alternativas, el ADN mutante puede generarse in vivo al usar cualquier procedimiento mutagénico conocido, tal como, por ejemplo, radiación, nitrosoguanidina, y similares. Después, la secuencia de ADN deseada puede aislarse y usarse en los métodos proporcionados en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, "proteína heteróloga" se refiere a una proteína o un polipéptido que no se produce naturalmente en la célula hospedera.
Una enzima se "sobreexpresa" en una célula hospedera si la enzima se expresa en la célula en una concentración más alta que la concentración a la que se expresa en una célula de tipo silvestre correspondiente.
Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan intercambiablemente en la presente descripción. En la presente descripción y en las reivindicaciones se usan los códigos de una letra y de tres letras convencionales para los residuos de aminoácidos. El código de 3 letras para los aminoácidos es como se define de conformidad con la nomenclatura IUPAC-IUB de la Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) (Comisión conjunta sobre nomenclatura bioquímica). Se entiende, además, que un polipéptido se puede codificar por medio de más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.
Las variantes de la descripción se describen con la siguiente nomenclatura: [residuo de amino ácidos original/posición/residuo de aminoácidos sustituido]. En la presente descripción, cuando se identifica una posición adecuada para sustitución sin un aminoácido específico sugerido, se comprenderá que puede sustituirse cualquier residuo de aminoácidos para el residuo de aminoácidos presente en la posición.
Una "prosecuencia" es una secuencia de aminoácidos entre la secuencia señal y la proteína madura que es necesaria para la secreción de la proteína. La escisión de la prosecuencia producirá una proteína activa madura.
El término "secuencia señal" o "péptido señal" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que pueda participar en la secreción de las formas maduras o precursoras de la proteína. Esta definición de secuencia señal es una definición funcional, es decir, incluye todas aquellas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N-terminal del gen de la proteína que participa en la secreción de proteína. Frecuentemente, pero no siempre, están unidas a la porción N-terminal de una proteína o a la porción N-terminal de una proteína precursora. La secuencia señal puede ser endógena o exógena. La secuencia señal puede ser aquella normalmente asociada con la proteína (p. ej . , glucoamilasa), o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada.
El término forma "precursora" de una proteína o un péptido se refiere a una forma madura de la proteína que tiene una prosecuencia operativamente unida al extremo amino o carbonilo de la proteína. El precursor puede tener, además, una secuencia "señal" operativamente unida al extremo amino de la prosecuencia. El precursor puede tener, además, polinucleótidos adicionales que están involucrados en la actividad posterior a la traducción (p. ej., polinucleótidos escindidos de ahí para dejar la forma madura de una proteína o péptido).
"Cepa hospedera" o "célula hospedera" se refiere a un huésped adecuado para un vector de expresión que comprende ADN de conformidad con la presente descripción.
Los términos "derivado de" y "obtenido de" no solo se refieren a una glucoamilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión sino, además, a una glucoamilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de esa cepa y producida en un organismo hospedero que contiene la secuencia de ADN. Adicionalmente, el término se refiere a una glucoamilasa que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o ADNc y que tiene las características identificadoras de la glucoamilasa en cuestión.
Un "derivado" dentro del alcance de esta definición retiene, generalmente, la actividad hidrolizante característica observada en la glucoamilasa en la medida que el derivado es útil para propósitos similares como la forma silvestre, nativa o parental. Los derivados funcionales de glucoamilasas abarcan los péptidos o fragmentos de péptidos de origen natural o producidos de manera sintética o recombinante que tengan las características generales de las glucoamilasas de la presente descripción.
El término "aislado" se refiere a un material que se retira del ambiente natural si es de origen natural. Una proteína "purificada" se refiere a una proteína que está al menos parcialmente purificada para homogeneidad. En algunas modalidades, una proteína purificada puede tener una pureza mayor que aproximadamente 10 %, opcionalmente, mayor que aproximadamente 20 % y, opcionalmente, mayor que aproximadamente 30 %, según lo determinado por un análisis SDS-PAGE. Otros aspectos de la descripción abarcan la proteína en una forma altamente purificada (es decir, una pureza mayor que aproximadamente 40 %, mayor que aproximadamente 60 %, mayor que aproximadamente 80 %, mayor que aproximadamente 90 %, mayor que aproximadamente 95 %, mayor que aproximadamente 97 % y aún mayor que aproximadamente 99 %), según lo determinado por un análisis SDS-PAGE.
Como se usa en la presente descripción, el término, "mutagénesis combinatoria" se refiere a métodos en los que se generan bibliotecas de variantes de una secuencia inicial. En estas bibliotecas, las variantes contienen una o varias mutaciones seleccionadas de un conjunto predefinido de mutaciones. Adicionalmente, los métodos proporcionan medios para introducir mutaciones aleatorias que no fueron miembros del conjunto predefinido de mutaciones. En algunas modalidades, los métodos incluyen los expuestos en la patente de los EE. UU. núm. 6,582,914, incorporada por este medio como referencia. En modalidades alternativas, los métodos de mutagénesis combinatoria abarcan kits comercialmente disponibles (p. ej., QuikChange® Multisite, Stratagene, San Diego, CA).
Como se usa en la presente descripción, el término "biblioteca de mutantes" se refiere a una población de células que son idénticas en la mayor parte de su genoma, pero incluyen homólogos diferentes de uno o más genes. Estas bibliotecas pueden usarse, por ejemplo, para identificar genes u operones con rasgos mejorados.
Como se usa en la presente descripción, el término "contenido seco de sólidos (DS o ds, por sus siglas en inglés)" se refiere al total de sólidos de una suspensión acuosa en % con base en el peso seco.
Como se usa en la presente descripción, el término "acierto inicial" se refiere a una variante que se identificó por análisis de una biblioteca de mutagénesis combinatoria de consenso. En algunas modalidades, los aciertos iniciales tienen características de rendimiento mejoradas en comparación con el gen inicial.
Como se usa en la presente descripción, el término "acierto mejorado" se refiere a una variante que se identificó por análisis de una biblioteca de mutagénesis combinatoria de consenso mejorada.
Como se usa en la presente descripción, el término "propiedad deseada" se refiere a la propiedad del gen inicial que se alterará. No se pretende que la presente descripción se limite a cualquier propiedad deseada particular. Sin embargo, en algunas modalidades, la propiedad deseada es la estabilidad de un producto génico (p. ej . , resistencia a la desnaturalización, proteólisis u otros factores degradantes) mientras que, en otras modalidades, se altera el nivel de producción en un huésped de producción. Claramente, se contempla que cualquier propiedad de un gen inicial será útil en la presente descripción. A lo largo de la descripción pueden encontrarse otras definiciones de términos.
Como se usa en la presente descripción, el término "composición" se relaciona con una preparación en la forma de, por ejemplo, un ingrediente de una bebida, alimento o forraje, preparado de conformidad con la presente invención, y puede estar en la forma de una solución o como sólido, dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración. La forma sólida puede estar como un polvo enzimático seco o como una enzima granulada. La composición puede comprender una variante de conformidad con la invención, un portador de enzimas y, opcionalmente, un estabilizante y/o un conservador. El portador de enzimas puede seleccionarse del grupo que consiste en glicerol o agua. La preparación puede comprender un estabilizante. En un aspecto, el estabilizante puede seleccionarse del grupo que consiste en sales inorgánicas, polioles, azúcares, y combinaciones de estos. Además, el estabilizante puede ser una sal inorgánica, tal como cloruro de potasio. En otro aspecto, el poliol es glicerol, propilenglicol, o sorbitol. El azúcar es un carbohidrato de molécula pequeña, particularmente, cualquiera de los varios de sabor dulce, tal como la glucosa, fructosa y sacarosa. En aún otro aspecto, la preparación puede comprender un conservador. En un aspecto, el conservador es metilparabeno, propilparabeno, benzoato, sorbato u otro conservador aprobado para alimentos, o una mezcla de estos.
En el presente contexto, el término "fermentación" se refiere a proporcionar una composición, tal como una bebida y/o sustancia fermentada, mediante el crecimiento de microorganismos en un cultivo. En el contexto de producción de una enzima (p. ej., glucoamilasa) , el término "fermentación" se refiere a un proceso que involucra la producción de la enzima en un proceso de cultivo microbiano. En el contexto de elaboración de cerveza, el término "fermentación" se refiere a la transformación de azúcares en un mosto, por medio de enzimas en la levadura de cerveza, en etanol y dióxido de carbono con la formación de otros subproductos de fermentación.
Como se usa en la presente descripción, el "proceso para la producción de una bebida fermentada" tal como cerveza comprende, generalmente, una etapa para preparar un macerado, tal como con base en una molienda, filtrar el macerado para obtener un mosto y grano agotado, y fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada.
Como se usa en la presente descripción, el término "material vegetal que contiene almidón y/o azúcar" se refiere a un material vegetal que contiene almidón y/o azúcar que puede derivarse de cualquier planta y partes de plantas, que incluyen tubérculos, raíces, tallos, hojas y semillas. "Material vegetal que comprende almidón y/o azúcar" puede ser, por ejemplo, uno o más cereales, tales como cebada, trigo, maíz, centeno, sorgo, mijo o arroz, y cualquier combinación de estos. El material vegetal que comprende almidón y/o azúcar puede procesarse, por ejemplo, molerse, maltearse, maltearse parcialmente o no maltearse. El cereal no malteado se denomina, además, "grano crudo". Los ejemplos de material vegetal que no son cereales y contienen almidón comprenden, por ejemplo, tubérculos.
Como se usa en la presente descripción, el término "molienda" se refiere a cualquier material vegetal procesado que contiene azúcar y/o almidón adecuado para maceración. La molienda, como se contempla en la presente descripción, puede comprender cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar derivable de cualquier planta y partes de plantas, que incluyen tubérculos, raíces, tallos, hojas y semillas. Los ejemplos de procesos comprenden molienda y/o triturado, que proporcionan, usualmente, un material que es más grueso que la harina. En el presente contexto, la molienda puede comprender material procesado a partir de granos, tales como granos de cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, milo, mijo y sorgo y, con mayor preferencia, al menos 10 % o, con mayor preferencia, al menos 15 %, aún con mayor preferencia, al menos 25 % o, con la máxima preferencia, al menos 35 %, tal como al menos 50 %, al menos 75 %, al menos 90 % o aún 100 % (p/p) de la molienda del mosto deriva de granos. En algunas modalidades, la molienda puede comprender el material vegetal que contiene almidón y/o azúcar obtenido a partir de raíces de yuca [ Manihot esculenta]. La molienda puede comprender grano malteado, tal como malta de cebada. Preferentemente, por lo menos 10 % o, con mayor preferencia, por lo menos 15 %, todavía con mayor preferencia, por lo menos 25 % o, con la máxima preferencia, por lo menos 35 %, tal como por lo menos 50 %, por lo menos 75 %, por lo menos 90 %, o aún 100 % (p/p) de la molienda del mosto deriva de granos malteados.
Como se usa en la presente descripción, se entiende que el término "malta" se refiere a cualquier grano de cereal malteado, tal como trigo o cebada malteados.
En un aspecto, ccuuaannddoo ssee usa malta producida principalmente a partir de variedades seleccionadas de cebada en conexión con la producción de cerveza, la malta ejerce el mayor efecto en el carácter y la calidad global de la cerveza. Primero, la malta es el agente saborizante principal en la cerveza. Segundo, la malta proporciona la mayor parte del azúcar fermentable. Tercero, la malta proporciona las proteínas que contribuirán al cuerpo y el carácter de la espuma de la cerveza. Cuarto, la malta proporciona actividad enzimática durante el macerado, opcionalmente complementado por la adición de enzimas exógenas. Quinto, los granos de malta agotados proporcionan un medio de filtración para la separación del mosto después del macerado, típicamente, por separación de los granos agotados o por filtración del macerado.
Como se usa en la presente descripción, el término "adjunto" se refiere a cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar que no es malta de cebada. Como ejemplos de adjuntos, pueden mencionarse materiales tales como granos de maíz común, granos de maíz refinado, levadura de cerveza molida, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarada, trigo, almidón de trigo, cereal tostado, copos de cereales, centeno, avena, papa, tapioca, y jarabes, tales como el jarabe de maíz, jarabe de caña de azúcar, jarabe de azúcar invertida, jarabes de cebada y/o trigo, y similares, que pueden usarse como fuente de almidón. El almidón se convertirá, finalmente, en dextrinas y azúcares fermentables . En un aspecto, "adjunto" incluye el material vegetal que contiene almidón y/o azúcar obtenido de raíces de yuca [Manihot esculenta].
Como se usa en la presente descripción, el término "macerado" se refiere a una suspensión acuosa de cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar, tal como una molienda, por ejemplo, que comprende malta de cebada aplastada, cebada aplastada y/u otro adjunto o una combinación de estos, mezclada con agua que más tarde se separará en mosto y granos agotados.
Como se usa en la presente descripción, el término "mosto" se refiere al licor no fermentado que queda después de extraer la molienda durante el macerado.
Como se usa en la presente descripción, el término "granos agotados" se refiere a los sólidos drenados que quedan cuando se ha extraído la molienda y el mosto se separa del macerado. Los "granos agotados" pueden usarse, por ejemplo, como forraje.
Como se usa en la presente descripción, el término "recuperación del extracto" en el mosto se refiere a la suma de sustancias solubles extraídas de la molienda (malta y/u otros adjuntos) que se expresa en porcentaje con base en la materia seca.
Como se usa en la presente descripción, el término "lúpulo" se refiere a su uso para contribuir significativamente a la calidad de la cerveza, que incluye aportar sabor. Particularmente, el lúpulo (o los constituyentes del lúpulo) agrega a la cerveza sustancias de sabor amargo convenientes. Además, el lúpulo puede actuar como precipitante de proteínas, determina los agentes conservadores y contribuye a la formación y estabilización de la espuma.
Como se usa en la presente descripción, los términos "bebida(s)" y "producto de bebida(s)" incluye cervezas, tales como cerveza malteada completa, cerveza fermentada con los requisitos de la "Reinheitsgebot" (lcy alemana de pureza de la cerveza) , cerveza inglesa ale, IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, bebida de cereal (casi cerveza), cerveza ligera, cerveza de bajo contenido alcohólico, cerveza de bajas calorías, cerveza porter, cerveza bock, cerveza negra, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol, y similares. El término "bebida(s)" o "producto de bebidas" incluye, además, las bebidas de malta y cereal alternativas, tales como las bebidas de malta saborizadas con frutas, por ejemplo, con sabor a cítricos, tales como las bebidas de malta con sabor a limón, naranja, lima, o bayas, las bebidas de malta con sabor a licor, por ejemplo, el licor de malta con sabor a vodka, ron, o tequila, o las bebidas de malta con sabor a café, tal como el licor de malta saborizado con cafeína, y similares. En otro aspecto, la bebida o producto de bebida es una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de malta o cereales, como la cerveza o el whisky, tal como vino, sidra, vinagre, vino de arroz, salsa de soja o jugo.
Como se usa en la presente descripción, el término "bebida de malta" incluye bebidas de malta, tales como cerveza malteada completa, cerveza inglesa ale, IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, bebida de cereal (casi cerveza), cerveza ligera, cerveza de bajo contenido alcohólico, cerveza de bajas calorías, cerveza porter, cerveza bock, cerveza negra, licor de malta, licor de malta sin alcohol, y similares. El término "bebidas de malta" incluye, además, bebidas de malta alternativas, tales como bebidas de malta saborizadas con frutas, por ejemplo, de sabores cítricos, tales como bebidas de malta con sabor a limón, naranja, lima o bayas, bebidas de malta saborizadas con licores, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron o tequila, o bebidas de malta con sabor a café, tales como licor de malta saborizado con cafeína, y similares.
En el contexto de la presente invención, se entiende que el término "cerveza" comprende cualquier mosto fermentado, producido por la fermentación/uso en la fabricación de cerveza de un material vegetal que contiene almidón; por lo tanto, particularmente, además, la cerveza producida exclusivamente a partir de malta o adjuntos, o cualquier combinación de malta y adjuntos.
La cerveza puede fabricarse a partir de una variedad de materiales vegetales que contienen almidón y/o azúcar, frecuentemente, granos y/o malta de cereal, por, esencialmente, el mismo proceso. Se cree que los almidones granulares son homopolímeros de la glucosa en los que los residuos de glucosa tienen enlaces o bien alfa-1,4- o alfa-1,6-, siendo predominante el primero de estos.
Como se usa en la presente descripción, el término "cerveza Pilsner" se refiere a una cerveza Lager pálida de baja fermentación (fabricada con malta Pilsner), usualmente, con un carácter lupular más pronunciado que el de las cervezas lager pálidas normales (p. ej., cervezas claras).
Como se usa en la presente descripción, el término "cervezas ligeras, cervezas reducidas en calorías o cervezas de bajas calorías", se refiere a la reciente popularización generalizada de bebidas fermentadas, particularmente, en el mercado de los Estados Unidos. Tal como se define en los Estados Unidos, estas cervezas altamente atenuadas tienen aproximadamente 30 % menos de calorías que una cerveza "normal" de un fabricante.
Como se usa en la presente descripción, el término "cerveza sin alcohol" o "cerveza de bajo contenido alcohólico" se refiere a una cerveza que contiene un máximo de 0.1 %, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 % de alcohol en volumen. La cerveza sin alcohol puede fabricarse por métodos especiales (fermentación detenida), con "levaduras" especiales que no producen alcohol o por métodos tradicionales, pero durante las etapas de terminación del proceso de fabricación de cerveza, el alcohol se elimina, por ejemplo, con evaporación por vacío, al aprovechar la ventaja de los puntos de ebullición diferentes del agua y del alcohol.
Como se usa en la presente descripción, el término "cerveza de bajas calorías" o "cerveza con un contenido bajo de carbohidratos (baja en carbohidratos)" se define como una cerveza con un contenido de carbohidratos de 0.75 g/100 g o menor y con un grado de fermentación de aproximadamente 90-92 %.
Como se usa en la presente descripción, el término "pasteurización" significa destruir los microorganismos de una solución acuosa por calentamiento. La implementación de pasteurización en el proceso de fabricación de cerveza es, típicamente, a través del uso de un pasteurizador instantáneo o un pasteurizador de túnel. Como se usa en la presente descripción, el término "unidades de pasteurización o PU" se refiere a una medida cuantitativa de pasteurización. Una unidad de pasteurización (1 PU) para cerveza se define como una retención de calor de un minuto a 60 grados Celsius. Se calcula que: PU = t x 1.393A(T - 60), en donde: t = tiempo, en minutos, a la temperatura de pasteurización en el pasteurizador T = temperatura, en grados Celsius, en el pasteurizador [A(T -60) representa el exponente de (T-60)] Puede usarse una PU mínima diferente en función del tipo de cerveza, las materias primas y la contaminación microbiana, el fabricante, y el efecto percibido en el sabor de la cerveza. Típicamente, para la pasteurización de la cerveza se requieren 14 - 15 PU. Dependiendo del equipo de pasteurización, las temperaturas de pasteurización están, típicamente, en el intervalo de 64 - 72 grados Celsius con un tiempo de pasteurización calculado consecuentemente. Puede encontrarse información adicional en "Technology Brewing and Malting" de Wolfgang Kunze del Research and Teaching Institute of Brewing, Berlín (VLB), 3.° edición completamente actualizada, 2004, ISBN 3-921690-49-8.
Además, se entiende que cuando se proporciona un intervalo de valores, se describe específicamente, además, cada valor interviniente, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo. Cada intervalo menor entre cualquier valor mencionado o valor interviniente en un intervalo mencionado y cualquier otro valor mencionado o interviniente en ese intervalo mencionado está comprendido dentro de la presente descripción. Los límites superior e inferior de estos intervalos menores pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada intervalo en el cual alguno, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos menores está comprendido, además, dentro de la presente descripción, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo mencionado. Cuando el intervalo mencionado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen alguno o ambos de estos límites incluidos se incluyen, además, en la presente descripción.
Antes de describir las modalidades ilustrativas con mayor detalle, debe entenderse que la presente descripción no se limita a las modalidades particulares descritas, porque estas, evidentemente, pueden variar. Aunque en la práctica o las pruebas de la presente invención puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción, a continuación se describen métodos y materiales ilustrativos.
Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "uno", y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un gen" incluye una pluralidad de esos agentes candidato, y la referencia a "la célula" incluye la referencia a una o más células y equivalentes de esta conocidos para los experimentados en la materia, etc.
Las publicaciones descritas en la presente descripción se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada aquí debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no esté habilitada a antedatar la publicación en virtud de una invención anterior. 2. Abreviaturas 3. Polipetidos de glucoamilasa Glucoamilasas parentales En algunas modalidades, la presente descripción proporciona una variante de glucoamilasa. La variante de glucoamilasa es una variante de una glucoamilasa parental, que puede comprender tanto un dominio catalítico como un dominio de unión a almidón. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio catalítico que tiene una secuencia de aminoácidos como se ilustra en la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 o 13 o que tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 99.5 % de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos ilustradas en la sec. con núm. de ident.:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 o 13. En aún otras modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio catalítico codificado por una secuencia de ADN que se híbrida en condiciones de rigurosidad media. alta con un ADN que codifica el dominio catalítico de una glucoamilasa que tiene una de las secuencias de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 1, 2 o 3.
En un aspecto, una variante, como se describe en la presente descripción, tiene como máximo 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 495, 500, 505, 507, 515, 525, 535, 545, 555, 565 o 573 residuos de aminoácidos.
En un aspecto, una variante, como se describe en la presente descripción, tiene como máximo 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o l sustituciones de residuos de aminoácidos.
En un aspecto, una variante como se describe en la presente descripción tiene como máximo, una supresión con una longitud de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o l residuos de aminoácidos.
En un aspecto, una variante como se describe en la presente descripción tiene como máximo una inserción con una longitud de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o l residuos de aminoácidos.
En algunas modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio de unión a almidón que tiene una secuencia de aminoácidos como se ilustra en la sec. con núm. de ident.1, 2, 11, 24, 25, 26, 27, 28 o 29, o que tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 99.5 % de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos ilustradas en la sec. con núm. de ident.1, 2, 11, 24, 25, 26, 27, 28 o 29. En aún otras modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio de unión a almidón codificado por una secuencia de ADN que se híbrida en condiciones de rigurosidad media o alta con un ADN que codifica el dominio de unión a almidón de una glucoamilasa que tiene una de las secuencias de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 1, 2 o 11.
La estructura predicha y las secuencias conocidas de glucoamilasas se conservan entre especies fúngicas (Coutinho et al., 1994, Protein Eng. , 7:393-400 y Coutinho et al., 1994, Protein Eng. , 7: 749-760). En algunas modalidades, la glucoamilasa parental es una glucoamilasa de hongos filamentosos. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental se obtiene de una cepa de Trichoderma (por e j . , T. reesei , T. longibrachiatum, T. strictipilis , T. asperellum, T. konilangbra y T. hazianum) , una cepa de Aspergillus (p . ej . A. niger, A. nidulans , A. kawachi, A. awamori y A. orzyae) , una cepa de Talaromyces (p. ej . T. emersonii , T. thermophilus, y T. duponti) , una cepa de Hypocrea {p. ej . H. gelatinosa, H. orientalis , H. vinosa, y H. citrina), una cepa de Fusarium (p. ej . , F. oxysporum, F. roseum y F. venena t um) , una cepa de Neurospora (p. ej . , N. crassa) y una cepa de Humicola ( p . ej . , H. grísea, H. insolens yH. lanuginose) , una cepa de Penicillium ( p . ej . , P. notatum o P. chrysogenum) , o una cepa de S aechar omycops i s (p. ej . , S. fibuligera) .
En algunas modalidades, la glucoamilasa parental puede ser una glucoamilasa bacteriana. Por ejemplo, el polipéptido puede obtenerse a partir de una cepa bacteriana gra positiva, tal como Bacillus (p. ej . , B. alkalophilus , B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis, B. stearothermophilus , B. subtilis y B. thuringiensis) o una cepa de Streptomyces (p. ej . , S. lividans) .
En algunas modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio catalítico que tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la secuencia de aminoácidos de la TrGA de la sec. con núm. de ident.: 3.
En otras modalidades, la glucosa parental comprende un dominio catalítico que tiene al menos aproximadamente 90 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa parental de Aspergillus de la sec. con núm. de ident.: 5 o sec. con núm. de ident.: 6.
En aún otras modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio catalítico que tiene al menos aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa parental de Humicola grisea (HgGA) de la sec. con núm. de ident.: 8.
En algunas modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio de unión a almidón que tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 % o aproximadamente 98 % de identidad de secuencia con el dominio de unión a almidón de la secuencia de aminoácidos de la TrGA de la sec. con núm. de ident.: 1, 2, o 11.
En otras modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio de unión a almidón que tiene al menos aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa de Humicola grisea (HgGA) de la sec. con núm. de ident.: 24.
En otras modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio de unión a almidón que tiene al menos aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa de Thielavia terrestris (TtGA) de la sec. con núm. de ident.: 29, ver, además, el alineamiento de la Figura 10D y 10E.
En otras modalidades, la glucosa parental comprende un dominio de unión a almidón que tiene al menos aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa de Thermomyces lanuginosus (ThGA) de la sec. con núm. de ident.: 25 (Figura 10D y 10E).
En otras modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio de unión a almidón que tiene al menos aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa de Talaromyces emersonii (TeGA) de la sec. con núm. de ident.: 26.
En aún otras modalidades, la glucoamilasa parental comprende un dominio de unión a almidón que tiene al menos aproximadamente 90 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el dominio de unión a almidón de la glucoamilasa parental de Aspergillus de la sec. con núm. de ident.: 27 o 28.
En algunas modalidades, la glucoamilasa parental tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la TrGA de la sec. con núm. de ident.: 1 o 2.
En otras modalidades, un homólogo de glucoamilasa de Trichoderma se obtiene de una cepa de Trichoderma o Hypocrea . Algunos homólogos típicos de la glucoamilasa de Trichoderma se describen en la patente de los EE. UU. núm.7,413,887 y se hace referencia específicamente a las secuencias de aminoácidos expuestas en las secs. con núm. de ident.: 17-22 y 43-47 de la referencia.
En algunas modalidades, la glucoamilasa parental es la TrGA que comprende la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 2, o un homólogo de la glucoamilasa de Trichoderma que tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2).
Una glucoamilasa parental puede aislarse y/o identificarse mediante el uso de téenicas de ADN recombinate estándar. Puede usarse cualquier técnica estándar que sea conocida para el técnico experimentado. Por ejemplo, pueden usarse sondas y/o iniciadores específicos para regiones conservadas de la glucoamilasa para identificar homólogos en células fúngicas o bacterianas (el dominio catalítico, el sitio activo, etc.). Alternativamente, puede usarse una PCR degenerada para identificar homólogos en células bacterianas o fúngicas. En algunos casos, pueden analizarse secuencias conocidas, tales como en una base de datos, para determinar la identidad de secuencia y/o estructural con una de las glucoamilasas conocidas, que incluye la sec. con núm. de ident.: 2, o un dominio de unión a almidón conocido, que incluye la sec. con núm. de ident.: 11. Pueden usarse, además, ensayos funcionales para identificar la actividad glucoamilasa en células bacterianas o fúngicas. Las proteínas que tienen actividad glucoamilasa pueden aislarse y secuenciarse de manera inversa para aislar la secuencia de ADN correspondiente. Estos métodos son conocidos para el experimentado en la materia.
Homología estructural de la glucoamilasa El dogma central de la biología molecular es que la secuencia de ADN que codifica un gen para una enzima particular determina la secuencia de aminoácidos de la proteína, esta secuencia, a su vez, determina el plegamiento tridimensional de la enzima. Este plegamiento aproxima los residuos dispares que crean un centro catalítico y una superficie de unión al sustrato, y esto produce la alta especificidad y actividad de la enzima en cuestión.
Las glucoamilasas consisten en un máximo de tres dominios estructurales distintos, un dominio catalítico de aproximadamente 450 residuos que se conserva estructuralmente en todas las glucoamilasas, generalmente seguido de una región de conector que consiste en entre 30 y 80 residuos que están conectados a un dominio de unión a almidón de aproximadamente 100 residuos. La estructura de la glucoamilasa de Trichoderma reesei con las tres regiones intactas se determinó a una resolución de 1.8 Angstrom en la presente descripción (ver la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218 (Danisco US Inc., Genencor División), págs.94-216, incorporada en la presente descripción como referencia, y el Ejemplo 11 de la patente núm. W02009/067218 (Danisco US Inc., Genencor División), págs. 89-93, incorporada en la presente descripción como referencia). Al usar las coordenadas (ver la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218 (Danisco US Inc., Genencor División), págs. 94-216, incorporada en la presente descripción como referencia), la estructura se alineó con las coordenadas del dominio catalítico de la glucoamilasa de la cepa X100 de Aspergillus awamori que se determinó previamente (Aleshin, A.E., Hoffman, C., Firsov, L.M., y Honzatko, R.B. Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var. X100. J. Mol . Biol . 238: 575-591 (1994)). La estructura cristalina de Aspergillus awamori incluyó solo el dominio catalítico. Como se observa en las Figuras 6A y 7, la estructura de los dominios catalíticos se superponen muy estrechamente, y es posible identificar residuos equivalentes en función de esta superposición estructural. Se cree que todas las glucoamilasas comparten la estructura básica ilustrada en las Figuras 6A y 7.
Por lo tanto, el dominio catalítico de la TrGA tiene aproximadamente 450 residuos, tales como los residuos 1-453 de la TrGA de la sec. con núm. de ident.:2 y es un dominio de barril de doce hélices dobles. Las hélices y los lazos del dominio catalítico pueden definirse en términos de los residuos de la TrGA con sec. con núm. de ident.:2 que los forman: El dominio conector tiene entre 30 y 80 residuos, tales como los residuos 454-490 de la TrGA con sec . con núm . de ident.: 2.
El dominio de unión a almidón de la TrGA tiene aproximadamente 100 residuos, tales como los residuos 496-596 de la TrGA con sec. con núm. de ident.:2 que consiste en un dominio beta-sándwich compuesto de dos láminas de tres hebras trenzadas. Las láminas, hélices y lazos del dominio de unión a almidón pueden definirse en términos de los residuos de la TrGA con sec . con núm. de ident.:2 que los forman: La ubicación del dominio catalítico en la TrGA contra la superficie del dominio de unión a almidón deja una región de interfase entre los dos dominios. Esta área de superficie conectora corresponde a las siguientes posiciones en la TrGA (sec. con núm. de ident.2) : 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 500, 502, 504, 534, 536, 537, 539, 541, 542, 543, 544, 546, 547, 548, 580, 583, 585, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594 y 596. La posición de estos residuos en la estructura tridimensional de la TrGA se muestran en la Figura 6B.
Es posible identificar residuos equivalentes en función de la superposición estructural en otras glucoamilasas, como se describe detalladamente a continuación.
La Figura 6A es una comparación de las estructuras tridimensionales de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (en negro) de la sec. con núm. de ident.: 2 y de la glucoamilasa de Aspergillus awamorii (en gris) vista desde el lateral. En esta vista, puede verse la relación entre el dominio catalítico y la región del conector y el dominio de unión a almidón.
La Figura 6B ilustra la estructura tridimensional de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (en negro) (sec. con núm. de ident.: 2) vista desde el lateral con los residuos que forman la región de la interfase entre el dominio catalítico y el dominio de unión a almidón resaltados (residuos del dominio catalítico en gris oscuro y residuos del dominio de unión a almidón en gris claro).
La Figura 7 es una comparación de las estructuras tridimensionales de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (en negro) de la sec. con núm. de ident.: 2 y de la glucoamilasa de Aspergillus awamorii (en gris) vista desde arriba. Las glucoamilasas mostradas aquí y, de hecho, todas las conocidas hasta la fecha, comparten esta homología estructural. La conservación de la estructura se correlaciona con la conservación de la actividad y un mecanismo conservado de acción para todas las glucoamilasas. Dada esta alta homología, los cambios resultantes de las variantes específicas de sitio de la glucoamilasa de Trichoderma que producen funciones alteradas tendrán, además, consecuencias estructurales y, por lo tanto, funcionales similares en otras glucoamilasas. Por lo tanto, las enseñanzas cuyas variantes producen beneficios deseables pueden aplicarse a otras glucoamilasas.
Se produjo otra estructura cristalina mediante el uso de las coordenadas de la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218 (Danisco US Inc., Genencor División), pág.94-216, incorporada en la presente descripción como referencia, para el dominio de unión a almidón (SBD, por sus siglas en inglés). El SBD de la TrGA se alineó con el SBD de A. niger. Como se muestra en la Figura 8, la estructura de los SBD de A. niger y de la TrGA se superponen muy estrechamente. Se cree que si bien todos los dominios de unión a almidón comparten al menos algo de la estructura básica ilustrada en la Figura 8, algunos SBD son más estructuralmente similares que otros. Por ejemplo, el SBD de la TrGA puede clasificarse dentro de la familia 20 de módulos de unión a carbohidratos en la base de datos CAZY (cazy.org). La base de datos CAZY describe las familias de módulos catalíticos y de unión a carbohidratos estructuralmente relacionados (o dominios funcionales) de enzimas que degradan, modifican o crean enlaces glicosídicos. Dada una homología estructural alta, las variantes específicas de sitio del SBD de la TrGA que producen una función alterada tendrán, además, consecuencias estructurales y, por lo tanto, funcionales similares en otras glucoamilasas que tienen SBD de estructura similar a la del SBD de la TrGA, particularmente, los clasificados dentro de la familia 20 de módulos de unión a carbohidratos. Así, las enseñanzas cuyas variantes producen beneficios deseables pueden aplicarse a otros SBD que tienen estructuras similares.
Por lo tanto, los números de la posición de aminoácidos descritos en la presente descripción se refieren a los asignados a la secuencia de glucoamilasa madura de Trichoderma reesei que tiene la sec. con núm. de ident.: 2. La presente descripción, sin embargo, no se limita a las variantes de glucoamilasa de Trichoderma, sino que se extiende a glucoamilasas que contienen residuos de aminoácidos en posiciones que son "equivalentes" a los residuos particulares identificados en la glucoamilasa de Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident.: 2). En algunas modalidades de la presente descripción, la glucoamilasa parental es una GA de Talaromyces, y las sustituciones se hacen en las posiciones de residuos de aminoácidos equivalentes en la glucoamilasa de Talaromyces {ver, p. ej . , la sec. con núm. de ident.: 23) como las que se describen en la presente descripción. En otras modalidades, la glucoamilasa parental comprende las secs. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 y 22.
La "identidad estructural" determina si los residuos de aminoácidos son equivalentes. La identidad estructural es un equivalente topológico uno a uno cuando las dos estructuras (estructura tridimensional y de aminoácidos) se alinean. Una posición de residuos (de aminoácidos) de una glucoamilasa es "equivalente" a un residuo de la glucoamilasa de T. reesei si este es o bien homólogo (es decir, que se corresponde en posición en una estructura primaria o terciaria) o análogo a un residuo específico o porción de ese residuo en la glucoamilasa de T. reesei (que tiene capacidad funcional igual o similar para combinarse, reaccionar o interactuar químicamente).
Con el fin de establecer identidad con la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa puede compararse directamente con la secuencia primaria de la glucoamilasa de Trichoderma reesei y, particularmente, con un conjunto de residuos conocidos por ser invariantes en glucoamilasas para las cuales se conoce la secuencia. Por ejemplo, las Figuras 10A y 10B de la presente descripción muestran los residuos conservados entre glucoamilasas. Las Figuras 10D y 10E muestran un alineamiento de dominios de unión a almidón de varias glucoamilasas. Después de alinear los residuos conservados, que permite las inserciones y supresiones necesarias para mantener el alineamiento (es decir, evitar la eliminación de residuos conservados a través de supresión e inserción arbitrarias), se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la glucoamilasa de Trichoderma reesei . El alineamiento de residuos conservados debe conservar, típicamente, el 100 % de estos residuos. Sin embargo, el alineamiento de más de aproximadamente 75 % o, como mínimo, aproximadamente 50 % de residuos conservados es adecuado, además, para definir los residuos equivalentes. Además, la identidad estructural puede usarse en combinación con la identidad de secuencia para identificar residuos equivalentes.
Por ejemplo, en las Figuras 10A y 10B, los dominios catalíticos de glucoamilasas de seis organismos se alinean para proporcionar la cantidad máxima de homología entre secuencias de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que hay un número de residuos conservados contenido en cada secuencia según lo designado con un asterisco. Estos residuos conservados pueden usarse, por lo tanto, para definir los residuos de aminoácidos equivalentes correspondientes de la glucoamilasa de Trichoderma reesei en otras glucoamilasas, tales como la glucoamilasa de Aspergillus niger. De manera similar, las Figuras 10D y 10E muestran los dominios de unión a almidón de glucoamilasas de siete organismos alineados para identificar residuos equivalentes .
La identidad estructural involucra la identificación de residuos equivalentes entre las dos estructuras. Los "residuos equivalentes" pueden definirse al determinar la homología al nivel de la estructura terciaria (identidad estructural) de una enzima cuya estructura terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se definen como aquellos para los que las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácidos particular de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (N en N, CA en CA, C en C y 0 en 0) se encuentran dentro de O.13 nm y, opcionalmente, 0.1 nm después del alineamiento. En un aspecto, al menos 2 o 3 de los cuatro átomos posibles de la cadena principal están dentro de 0.1 nm después del alineamiento. El alineamiento se logra después de orientar y ubicar el mejor modelo para producir la máxima superposición de coordenadas atómicas de átomos de proteínas que no son de hidrógeno de la glucoamilasa en cuestión con la glucoamilasa de Trichoderma reesei . El mejor modelo es el modelo cristalográfico que proporciona el factor R más bajo para los datos de difracción experimental a la resolución más alta disponible.
R factor Los residuos equivalentes que son funcionalmente análogos a un residuo específico de la glucoamilasa de Trichoderma reesei se definen como aquellos aminoácidos de la enzima que pueden adoptar una conformación de tal manera que alteren, modifiquen o contribuyan a la estructura de la proteína, unión al sustrato o catálisis de una manera definida y atribuida a un residuo específico de la glucoamilasa de Trichoderma reesei . Además, son aquellos residuos de la enzima (para los cuales se ha obtenido una estructura terciaria por cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga en la medida en que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo dado pueden no satisfacer los criterios de equivalencia en función de ocupar una posición homologa, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo se encuentran con 0.13 nm de los átomos de la cadena lateral correspondiente de la glucoamilasa de Trichoderma reesei . Las coordenadas de la estructura tridimensional de la glucoamilasa de Trichoderma reesei se exponen en la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218 (Danisco US Inc., Genencor División), págs. 94-216, incorporada en la presente descripción como referencia, y pueden usarse como se describió anteriormente para determinar residuos equivalentes en el nivel de la estructura terciaria.
Algunos de los residuos identificados para sustitución son residuos conservados, en tanto que otros no lo son. En el caso de los residuos que no son conservados, la sustitución de uno o más aminoácidos se limita a sustituciones que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a una encontrada en la naturaleza. En el caso de los residuos conservados, estas sustituciones no deben dar como resultado una secuencia de origen natural. Variantes de glucoamilasas Las variantes de conformidad con la descripción incluyen al menos una sustitución, supresión o inserción en la secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa parental que hace que la variante tenga una secuencia diferente con respecto a una glucoamilasa parental. En algunas modalidades, las variantes de la descripción tendrán al menos aproximadamente 20 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 ¾, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 % o aproximadamente 100 % de actividad glucoamilasa como la de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2), una glucoamilasa parental que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2). En algunas modalidades, las variantes de conformidad con la descripción comprenden una sustitución, supresión o inserción en al menos una posición de aminoácidos de la TrGA parental (sec. con núm. de ident.: 2), o en una posición equivalente en la secuencia de otra glucoamilasa parental que tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2).
En otras modalidades, las variantes de conformidad con la descripción comprenden una sustitución, supresión o inserción en al menos una posición de aminoácidos de un fragmento de la TrGA parental, en donde el fragmento comprende el dominio catalítico de la secuencia de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 3) o en una posición equivalente en un fragmento que comprende el dominio catalítico de una glucoamilasa parental que tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el fragmento que contiene el domino catalítico de la sec. con núm. de ident.: 3, 5, 6, 7, 8 o 9. En algunas modalidades, el fragmento comprende al menos aproximadamente 400, aproximadamente 425, aproximadamente 450 o aproximadamente 500 residuos de aminoácidos del dominio catalítico de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 3).
En otras modalidades, las variantes de conformidad con la descripción comprenden una sustitución, supresión o inserción en al menos una posición de aminoácidos de un fragmento de la TrGA parental, en donde el fragmento comprende el dominio de unión a almidón de la secuencia de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 11) o en una posición equivalente en un fragmento que comprende el dominio de unión a almidón de una glucoamilasa parental que tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el fragmento que contiene el dominio de unión a almidón de la sec. con núm. de ident: 11, 24, 25, 26, 27, 28 y/o 29. En algunas modalidades, el fragmento comprende al menos aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100 o aproximadamente 109 residuos de aminoácidos del dominio de unión a almidón de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 11).
En algunas modalidades, cuando la glucoamilasa parental incluye un dominio catalítico, una región de conector y un dominio de unión a almidón, la variante comprenderá una sustitución, supresión o inserción en al menos una posición de aminoácidos de un fragmento que comprende parte de la región de conector. En algunas modalidades, la variante comprenderá una sustitución, supresión o inserción en la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la secuencia de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2).
La identidad estructural con referencia a una sustitución de aminoácidos significa que la sustitución se produce en la posición de aminoácidos equivalente en la glucoamilasa homologa o glucoamilasa parental. El término "posición equivalente" significa una posición que es común a dos secuencias parentales que se basa en un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa parental en cuestión así como el alineamiento de la estructura tridimensional de la glucoamilasa parental en cuestión con la secuencia de aminoácidos y secuencia tridimensional de la glucoamilasa de referencia de la TrGA. Por ejemplo, con referencia a la Figura 10A, la posición 24 en la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2 o 3) es D24 y la posición equivalente para Aspergillus niger (sec. con núm. de ident.: 6) es la posición D25, y la posición equivalente para Aspergillus oryzea (sec. con núm. de ident.: 7) es la posición D26. Ver las Figuras 6A y 7 para un alineamiento ilustrativo de la secuencia tridimensional.
Por consiguiente, en un aspecto, se describe una variante de glucoamilasa, donde la variante de glucoamilasa, cuando está en su forma cristalina, tiene una estructura de cristal para la cual las coordenadas atómicas de los átomos de la cadena principal tienen una desviación cuadrática media con respecto a las coordenadas atómicas de los átomos equivalentes de la cadena principal de la TrGA (como se define en la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218) menor que 0.13 nm después del alineamiento de los átomos equivalentes de la cadena principal, y que tienen una región de conector, un dominio de unión a almidón y un dominio catalítico; la variante comprende dos o más sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa parental en el lazo interconector 2 ' del dominio de unión a almidón, y/o en el lazo 1, y/o en la hélice 2, y/o en el lazo 11, y/o en la hélice 12 del dominio catalítico. En otro aspecto, la desviación cuadrática media de las coordenadas atómicas de los átomos equivalentes de la cadena principal de la TrGA (como se define en la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218) es menor que 0.12 nm, tal como menor que 0.11 o tal como menor que 0.10.
En otro aspecto, la variante de glucoamilasa tiene un dominio de unión a almidón que tiene al menos 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99.5 % de identidad de secuencia con el dominio de unión a almidón de la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 11, 13, 24, 25, 26, 27, 28 o 29. En otro aspecto, la variante de glucoamilasa tiene un dominio catalítico que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99.5 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 o 13.
En otro aspecto, la glucoamilasa parental es una glucoamilasa fúngica.
En otro aspecto, la glucoamilasa parental se selecciona de una glucoamilasa obtenida de Trichoderma spp. , Aspergillus spp. , Humicola spp. , Penicillium spp. , Talaromycese spp. o Schizosaccharmyces spp.
En otro aspecto, la glucoamilasa parental se obtiene de Trichoderma spp. o Aspergillus spp.
En otro aspecto, la glucoamilasa se ha purificado. Las glucoamilasas de la presente descripción pueden recuperarse o purificarse a partir de los medios de cultivo mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia, que incluyen centrifugación, filtración, extracción, precipitación y similares.
En algunas modalidades, la variante de glucoamilasa incluirá al menos dos sustituciones en la secuencia de aminoácidos de una parental. En algunas modalidades, la variante de glucoamilasa incluirá al menos dos, tres o cuatro sustituciones en la secuencia de aminoácidos de una parental, tal como la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la variante de glucoamilasa incluirá como máximo dos, tres o cuatro sustituciones en la secuencia de aminoácidos de una parental, tal como la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En otras modalidades, la variante puede tener más de dos sustituciones. Por ejemplo, la variante puede tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o 25 sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos cuando se compara con una glucoamilasa parental correspondiente.
En algunas modalidades, una variante de glucoamilasa comprende una sustitución, supresión o inserción y, típicamente, una sustitución en al menos una posición de aminoácidos en una posición que corresponde a las regiones de aminoácidos no conservados como se ilustra en las Figuras 10A, 10B, 10D y 10E (p. e j ., las posiciones de aminoácidos que corresponden a aquellas posiciones que no están designadas con un en las Figuras 10A, 10B, 10D y 10E).
En algunas modalidades, la glucoamilasa parental tendrá al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 ¾, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 13. En otras modalidades, la glucoamilasa parental será un homólogo de la glucoamilasa de Trichoderma . En algunas modalidades, la variante tendrá propiedades alteradas. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental tendrá identidad estructural con la glucoamilasa de la sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 13.
En algunas modalidades, la variante de glucoamilasa puede diferir de la glucoamilasa parental solo en las posiciones especificadas.
La glucoamilasa parental puede comprender un dominio de unión a almidón que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 11, 13, 24, 25, 26, 27, 28 o 29. La glucoamilasa parental puede tener al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1 o 2; por ejemplo, puede comprender la sec. con núm. de ident.: 1 o 2. Opcionalmente, la glucoamilasa parental puede consistir en la sec. con núm. de ident.: 1, 2 o 13.
Las variantes de glucoamilasa de la descripción pueden incluir, además, glucoamilasas quiméricas o híbridas con, por ejemplo, un dominio de unión a almidón (SBD) de una glucoamilasa y un dominio catalítico y conector de otra. Por ejemplo, una glucoamilasa híbrida puede prepararse al intercambiar el SBD de una AnGA (sec. con núm. de ident.: 6) con el SBD de la TrGA (sec. con núm. de ident.: 2), para preparar un híbrido con el SBD de la AnGA y el conector y el dominio catalítico de la TrGA. Alternativamente, el SBD y el conector de la AnGA puede intercambiarse por el SBD y el conector de la TrGA.
En algunos aspectos, la glucoamilasa variante exhibe termoestabilidad alterada en comparación con la glucoamilasa parental. En algunos aspectos, la termoestabilidad alterada puede ser termoestabilidad disminuida en comparación con la glucoamilasa parental. En algunas modalidades, la propiedad alterada es una actividad específica alterada en comparación con la glucoamilasa parental. En algunas modalidades, la actividad específica puede ser similar o estar incrementada en comparación con la glucoamilasa parental. En algunas modalidades, la propiedad alterada es termoestabilidad disminuida a temperaturas más bajas en comparación con la glucoamilasa parental. En algunas modalidades, la propiedad alterada es actividad específica similar o incrementada y termoestabilidad disminuida en comparación con la glucoamilasa parental.
Varias glucoamilasas parentales se han alineado con la secuencia de aminoácidos de la TrGA. La Figura 10A y 10B incluyen el dominio catalítico de las siguientes glucoamilasas parentales de Aspergillus awamori (AaGA) (sec. con núm. de ident.: 5); Aspergillus niger (AnGA) (sec. con núm. de ident.: 6); Aspergillus orzyae (AoGA) (sec. con núm. de ident.: 7); Humicola grísea (HgGA) (sec. con núm. de ident.: 8); y Hypocrea vinosa (HvGA) (sec. con núm. de ident.: 9). El % de identidad de los dominios catalíticos se representa en la Tabla A a continuación.
Tabla A. Homología de secuencias entre varias glucoamilasas fúngicas En algunas modalidades, por ejemplo, la glucoamilasa variante se deriva de una glucoamilasa parental que es una glucoamilasa de Aspergillus, una glucoamilasa de Humicola o una glucoamilasa de Hypocrea .
En un aspecto, la variante como se contempla en la presente descripción se obtiene por expresión recombinante en una célula hospedera.
En un aspecto, la variante descrita en la presente descripción tiene una actividad glucoamilasa (GAU) de al menos 0.05 GAU/mg, 0.1 GAU/mg, 0.2 GAU/mg, 0.3 GAU/mg, 0.4 GAU/mg, 0.5 GAU/mg, 0.6 GAU/mg, 0.7 GAU/mg, 0.8 GAU/mg, 0.9 GAU/mg, 1 GAU/mg, 2 GAU/mg, 3 GAU/mg, 5 GAU/mg o 10 GAU/mg.
En otro aspecto, la variante descrita en la presente descripción tiene una actividad glucoamilasa (GAU) de 0.05- 10 GAU/mg, tal como 0.1-5 GAU/mg, tal como 0.5-4 GAU/mg, tal como 0.7-4 GAU/mg, tal como 2-4 GAU/mg.
En aún otro aspecto, las variantes de glucoamilasa descritas en la presente descripción comprenden o consisten en la variante de la sec. con núm. de ident.:14, 15 o 16. Caracterización de glucoamilasas variantes La presente descripción proporciona, además, variantes de glucoamilasa que tienen al menos una propiedad alterada (p. ej . , propiedad mejorada) en comparación con una glucoamilasa parental y, particularmente, con la TrGA. En algunas modalidades, al menos una propiedad alterada (p. ej., propiedad mejorada) se selecciona del grupo que consiste en actividad GAU, grado real de fermentación, nivel de expresión, estabilidad térmica y actividad específica. Típicamente, la propiedad alterada es estabilidad térmica reducida, grado real de fermentación mejorado y/o actividad específica incrementada. La estabilidad térmica reducida es, típicamente, a temperaturas más altas.
Las variantes de glucoamilasa de la descripción pueden proporcionar, además, índices más altos de hidrólisis de almidón en concentraciones de sustrato bajas en comparación con la glucoamilasa parental. La variante puede tener un valor Vmax más alto o un valor Km más bajo que una glucoamilasa parental cuando se prueba en las mismas condiciones. Por ejemplo, la glucoamilasa variante puede tener un valor Vmax más alto a un intervalo de temperaturas de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C (p. ej ., de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 35 °C; de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 35 °C). Los valores de la constante de Michaelis-Menten, Km y Vmax, pueden determinarse fácilmente mediante el uso de procedimientos conocidos estándar. En otro aspecto, la glucoamilasa puede exhibir, además, una actividad de hidrólisis de almidón reducida, la cual no es mayor que 5 %, no mayor que 10 % o no mayor que 15 % reducida en comparación con la glucoamilasa parental, tal como la TrGA o TrGA CS4.
Glucoamilasas variantes con termoestabilidad alterada En algunos aspectos, la descripción se relaciona con una glucoamilasa variante que tiene estabilidad térmica alterada en comparación con una parental (tipo silvestre). La termoestabilidad alterada puede ser a temperaturas incrementadas o a temperaturas disminuidas. La termoestabilidad se mide como el % de actividad residual después de la incubación por hasta 100 s a 72 °C en un amortiguador de NaAc con un pH de 4.5 o cerveza Pilsner común, la TrGA tiene una actividad residual de 24 % en comparación con la actividad inicial antes de la incubación en estas condiciones. La actividad residual de la TrGA en estas condiciones es comparable con la incubación de la enzima durante 1 hora a 64 °C en un amortiguador de NaAc con un ph de 4.5 que deja aproximadamente 15 % de actividad residual en comparación con la actividad inicial antes de la incubación. Así, en algunas modalidades, las variantes con termoestabilidad disminuida (es decir, más termolábiles) tienen una actividad residual que es entre al menos aproximadamente 50 % y al menos aproximadamente 100 % menor que la de la parental (después de la incubación por 100 s a 72 °C en cerveza Pilsner común, pH de 4.5), que incluye aproximadamente 51 %, aproximadamente 52 % aproximadamente 53 %, aproximadamente 54 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 56 %, aproximadamente 57 %, aproximadamente 58 %, aproximadamente 59 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 61 %, aproximadamente 62 %, aproximadamente 63 %, aproximadamente 64 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 66 %, aproximadamente 67 %, aproximadamente 68 %, aproximadamente 69 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 71 %, aproximadamente 72 ¾, aproximadamente 73 %, aproximadamente 74 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 76 %, aproximadamente 77 %, aproximadamente 78 %, aproximadamente 79 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 81 %, aproximadamente 82 %, aproximadamente 83 %, aproximadamente 84 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 86 %, aproximadamente 87 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 89 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % y aproximadamente 100 % cuando se compara con la actividad inicial antes de la incubación. Por ejemplo, cuando la actividad residual de la parental es 24 %, una variante con estabilidad térmica disminuida puede tener una actividad residual entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 3 %. En algunas modalidades, la variante de glucoamilasa tendrá termoestabilidad disminuida, tal como al retener al menos aproximadamente 0 %, aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 6 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 9 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, o aproximadamente 20 % de actividad enzimática después de la exposición a temperaturas alteradas durante un período dado, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 s, aproximadamente 60 s, aproximadamente 70 s, aproximadamente 100 s o aproximadamente 150 a 72 °C. En algunas modalidades, la variante tiene termoestabilidad disminuida en comparación con la glucoamilasa parental a temperaturas seleccionadas en el intervalo de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C, además, en el intervalo de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 75 °C y en el intervalo de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 70 °C y en un intervalo de pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.0. En algunas modalidades, la termoestabilidad se determina como se describe en los ensayos y métodos. Ese método puede adaptarse según se apropiado para medir la termoestabilidad a otras temperaturas. Alternativamente, la termoestabilidad puede determinarse a 64 °C como se describe ahí. En algunas modalidades, la variante tiene estabilidad térmica disminuida a temperatura más baja en comparación con la glucoamilasa parental a temperaturas seleccionadas en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 50 °C, que incluye de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 45 °C y de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C.
En algunas modalidades, las variantes que tienen una termoestabilidad disminuida incluyen una o más supresiones, sustituciones o inserciones y, particularmente, sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 2: una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En algunas modalidades, las variantes que tienen una termoestabilidad disminuida incluyen una o más supresiones, sustituciones o inserciones y, particularmente, sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec . con núm. de ident.: 2 o 13: una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental es un homólogo de la glucoamilasa de Trichoderma y, en otras modalidades, la glucoamilasa parental tiene al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 98 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental tiene, además, identidad estructural con la sec. con núm. de ident.: 2. En algunas modalidades, la variante que tiene termoestabilidad disminuida tiene una o dos de las siguientes sustituciones: F29V, F29Q, I43Q, Y48V, F116M, H502S, H502E o H502W y tienen una, dos o tres de las siguientes sustituciones S97M, L98E Y147R, F175V, F175L, F175I, G483S o T484W de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la variante que tiene termoestabilidad disminuida tiene una o dos de las siguientes sustituciones: F29V, I43Q, Y48V, F116M, H502S o H502E y tiene una, dos o tres de las siguientes sustituciones S97M, L98E Y147R, F175V, F175L, F175I, G483S o T484W de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
Glucoamilasas variantes con actividad específica alterada Como se usa en la presente descripción, actividad específica es la actividad de la glucoamilasa por mg de proteína. La actividad se determinó con el ensayo de glucoamilasa mediante el uso de un sustrato cromogénico pNP-b-maltosida. El análisis identificó variantes que tienen un índice de rendimiento (PI, por sus siglas en inglés) >1.0 o (PI) = 1.0 en comparación con el PI de la TrGA parental. El PI se calcula a partir de las actividades específicas (actividad/mg de enzima) de las enzimas variantes y de tipo silvestre (WT, por sus siglas en inglés). Es el cociente "actividad específica de la variante/actividad específica de WT" y puede ser una medida del aumento en la actividad específica de la variante. Un PI de aproximadamente 2 sería aproximadamente 2 veces mejor que el WT. En algunos aspectos, la descripción se relaciona con una variante de glucoamilasa que tiene actividad específica alterada en comparación con una glucoamilasa parental o de tipo silvestre. En algunas modalidades, la actividad específica alterada es actividad específica incrementada. La actividad específica incrementada puede definirse como un índice de rendimiento incrementado mayor que 1, que incluye mayor o igual que aproximadamente 1.1, aproximadamente 1.2, aproximadamente 1.3, aproximadamente 1.4, aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.6, aproximadamente 1.7, aproximadamente 1.8, aproximadamente 1.9, y aproximadamente 2. En algunas modalidades, la actividad específica incrementada es de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 5.0, que incluye aproximadamente 1.1, aproximadamente 1.2, aproximadamente 1.3, aproximadamente 1.4, aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.6, aproximadamente 1.7, aproximadamente 1.8, aproximadamente 1.9, aproximadamente 2.0, aproximadamente 2.1, aproximadamente 2.2, aproximadamente 2.3, aproximadamente 2.4, aproximadamente 2.5, aproximadamente 2.6, aproximadamente 2.7, aproximadamente 2.8, aproximadamente 2.9, aproximadamente 3.0, aproximadamente 3.1, aproximadamente 3.2, aproximadamente 3.3, aproximadamente 3.4, aproximadamente 3.5, aproximadamente 3.6, aproximadamente 3.7, aproximadamente 3.8, aproximadamente 3.9, aproximadamente 4.0, aproximadamente 4.1, aproximadamente 4.2, aproximadamente 4.3, aproximadamente 4.4, aproximadamente 4.5, aproximadamente 4.6, aproximadamente 4.7, aproximadamente 4.8, y aproximadamente 4.9. En algunas modalidades, la variante tiene una actividad específica de al menos aproximadamente 1.0 veces más alta que la glucoamilasa parental, que incluye al menos aproximadamente 1.1 veces, aproximadamente 1.2 veces, aproximadamente 1.3 veces, aproximadamente 1.4 veces, aproximadamente 1.5 veces, aproximadamente 1.6 veces, aproximadamente 1.7 veces, aproximadamente 1.8 veces, aproximadamente 1.9 veces, aproximadamente 2.0 veces, aproximadamente 2.2 veces, aproximadamente 2.5 veces, aproximadamente 2.7 veces, aproximadamente 2.9 veces, aproximadamente 3 .0 veces, aproximadamente 4.0 veces y aproximadamente 5.0 veces. En algunas modalidades, la actividad específica es similar o igual a la parental. Por lo tanto, la actividad específica similar puede definirse como un índice de rendimiento que es 0.1 mayor, igual o 0.1 menor que con respecto a 1.0 de la parental, que incluye aproximadamente 0.02 mayor o menor que con respecto a 1.0, que incluye aproximadamente 0.04 mayor o menor que con respecto a 1.0, que incluye aproximadamente 0.06 mayor o menor que con respecto a 1.0, que incluye aproximadamente 0.08 mayor o menor que con respecto a 1.0 y que incluye aproximadamente 0.1 mayor o menor que con respecto a 1.0.
En algunas modalidades, las variantes que tienen una mejora en la actividad específica incluyen una o más supresiones, sustituciones o inserciones y, particularmente, sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 2: una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En algunas modalidades, las variantes que tienen una mejora en la actividad específica incluyen una o más supresiones, sustituciones o inserciones y, particularmente, sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 2 o 13: una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental es un homólogo de la glucoamilasa de Trichoderma y, en otras modalidades, la glucoamilasa parental tiene al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 98 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental tiene, además, identidad estructural con la sec. con núm. de ident.: 2. En algunas modalidades, la variante que tiene una mejora en la actividad específica tiene una o dos de las siguientes sustituciones: F29V, F29Q, I43Q, Y48V, F116M, H502S, H502E o H502W, y tiene una, dos o tres de las siguientes sustituciones S97M, L98E Y147R, F175V, F175L, F175I, G483S o T484W de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
En algunas modalidades, la actividad específica de la parental en comparación con la variante se determina como se describe en la sección Ensayos y métodos.
Glucoamilasas variantes con rendimiento de sacarificación alterado Como se usa en la presente descripción, el rendimiento de la glucoamilasa para facilitar la sacarificación del almidón en el recipiente de fermentación (FV) se determinó indirectamente por el grado real de fermentación. El grado real de fermentación se determinó en experimentos de fabricación de cerveza con malta y adjuntos con las variantes de glucoamilasa dosificadas en la actividad GAU o en la proteína en un conjunto definido de condiciones. El grado real de fermentación (RDF, por sus siglas en inglés, que es la atenuación real expresada en forma de porcentaje) se calculó para el mosto fermentado final (cerveza), ya que la gravedad específica del mosto antes, durante y después de la fermentación se midió con un hidrómetro para gravedad específica o un densitómetro Anton-Paar (p. ej. DMA 4100 M). La atenuación real se calculó y expresó en forma de porcentaje como RDF de conformidad con las fórmulas presentadas por Ensminger (ver http://hbd.org/ensmingr/ "Beer data: Alcohol, Calorie, and Attenuation Levels of Beer").
En algunos aspectos, la descripción se relaciona con una glucoamilasa variante que tiene rendimiento de RDF alterado en comparación con una glucoamilasa parental o de tipo silvestre. En algunas modalidades, el rendimiento de RDF alterado es similar o igual a la parental. La TrGA tiene un rendimiento de RDF de 75.04 % cuando se dosifica con 0.058 mg de GA/ml de mosto. Por lo tanto, un rendimiento de RDF similar puede definirse como un valor de RDF obtenido en el conjunto descrito de condiciones y con una dosificación de 0.058 mg GA/ml de mosto, que es 0.5 % mayor, igual o 0.5 % menor que con respecto a 75.04 %, que incluye aproximadamente 0.1 % mayor o menor que con respecto a 75.04 %, aproximadamente 0.2 % mayor o menor que con respecto a 75.04 %, aproximadamente 0.3 % mayor o menor que con respecto a 75.04 %, aproximadamente 0.4 % mayor o menor que con respecto a 75.04 % o aproximadamente 0.5 % mayor o menor que con respecto a 75.04 %.
En algunas modalidades, las variantes que tienen un grado real de fermentación similar en comparación con la glucoamilasa parental, tal como la TrGA, incluyen una o más supresiones, sustituciones o inserciones y, particularmente, sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 2: una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En algunas modalidades, las variantes de la descripción que tienen un rendimiento de RDF mejorado incluyen una o más supresiones, sustituciones o inserciones y, particularmente, sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 2 o 13: una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental es un homólogo de la glucoamilasa de Trichoderma y, en otras modalidades, la glucoamilasa parental tiene al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 98 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental tiene, además, identidad estructural con la sec. con núm. de ident.: 2. En algunas modalidades, las variantes de la descripción que tienen un rendimiento de RDF mejorado tienen una o dos de las siguientes sustituciones: F29V, F29Q, I43Q, Y48V, F116M, H502S, H502E o H502W y tienen una, dos o tres de las siguientes sustituciones S97M, L98E Y147R, F175V, F175L, F175I, G483S o T484W de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
En algunas modalidades, el rendimiento del RDF de la parental en comparación con la variante se determina como se describe en la sección Ensayos y métodos.
Glucoamilasas variantes con termoestabilidad disminuida y rendimiento de sacarificación similar en comparación con la glucoamilasa parental En algunos aspectos, la descripción se relaciona con una glucoamilasa variante que tiene termoestabilidad alterada y rendimiento de sacarificación (RDF) similar en comparación con una parental (p. ej . , de tipo silvestre). En algunas modalidades, la termoestabilidad alterada es una termoestabilidad disminuida, por ejemplo, una variante más termolábil. En algunas modalidades, el rendimiento del RDF es un rendimiento de RDF similar en comparación con la glucoamilasa parental.
En algunas modalidades, las variantes con una termoestabilidad disminuida y rendimiento de RDF similar incluyen una o más supresiones, sustituciones o inserciones y, particularmente, sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 2: una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental. En algunas modalidades, las variantes con una termoestabilidad disminuida y rendimiento de RDF similar incluyen una o más supresiones, sustituciones o inserciones y, particularmente, sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 2 o 13: una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental es un homólogo de la glucoamilasa de Trichoderma y, en otras modalidades, la glucoamilasa parental tiene al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 ¾ o aproximadamente 98 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. En algunas modalidades, la glucoamilasa parental tiene, además, identidad estructural con la sec. con núm. de ident.: 2. En algunas modalidades, la variante con una termoestabilidad disminuida y rendimiento de RDF similar tiene una o dos de las siguientes sustituciones: F29V, F29Q, I43Q, Y48V, F116M, H502S, H502E o H502W, y tiene una, dos o tres de las siguientes sustituciones S97M, L98E Y147R, F175V, F175L, F175I, G483S o T484 de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13. Glucoamilasas variantes con producción de azúcar(es) fermentable(s) En otro aspecto, la glucoamilasa exhibe una producción mejorada de azúcar(es) fermentable(s) en comparación con la glucoamilasa parental, tal como la TrGA. En otro aspecto, la glucoamilasa exhibe una producción mejorada de azúcares fermentables en la etapa de maceración del proceso cervecero en comparación con la glucoamilasa parental, tal como la TrGA. En otro aspecto, la glucoamilasa exhibe una producción mejorada de azúcares fermentables en la etapa de fermentación del proceso cervecero en comparación con la glucoamilasa parental, tal como la TrGA. En otro aspecto, el azúcar fermentable es glucosa. Una persona experimentada en el campo puede determinar la producción de azúcar(es) fermentadle(s) mediante, por ejemplo, téenicas de HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento, por sus siglas en inglés). 4. Polinucleótidos que codifican glucoamilasas La presente descripción se relaciona, además, con polinucleótidos aislados que codifican la glucoamilasa variante. Los polinucleótidos pueden prepararse por técnicas establecidas conocidas en la materia. Los polinucleótidos pueden prepararse sintéticamente, tal como con un sintetizador automático de ADN. La secuencia de ADN puede ser de origen mixto genómico (o ADNc) y sintético preparada al ligar fragmentos entre sí. Los polinucleótidos pueden prepararse, además, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante el uso de iniciadores específicos. Generalmente, se hace referencia a Minshull J. et al., Methods 32(4):416-427 (2004). El ADN puede sintetizarse, además, por medio de varias compañías comerciales, tales como Geneart AG, Regensburg, Alemania.
La presente descripción proporciona, además, polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos aproximadamente 50 % de identidad con la sec. con núm. de ident.: 4, que incluye al menos aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % y aproximadamente 99 %, o (ii) que es capaz de hibridarse a una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 4, en condiciones de rigurosidad intermedia a alta, o (iii) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident.: 4. Las sondas útiles de conformidad con la descripción pueden incluir al menos aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300 o más nucleótidos contiguos de la sec. con núm. de ident.: 4. En algunas modalidades, la variante codificada tiene, además, identidad estructural con la sec. con núm. de ident.: 2.
La presente descripción proporciona, además, polinucleótidos aislados que codifican glucoamilasas variantes que comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 13. Adicionalmente, la presente descripción proporciona vectores de expresión que comprenden cualquiera de los polinucleótidos proporcionados anteriormente. La presente descripción proporciona, además, fragmentos (es decir, porciones) del ADN que codifica las glucoamilasas variantes proporcionadas en la presente descripción. Estos fragmentos son útiles para obtener fragmentos de ADN de longitud parcial que pueden emplearse para aislar o identificar polinucleótidos que codifican enzimas glucoamilasa maduras descritas en la presente descripción a partir de células de hongos filamentosos (p. ej . , Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Penicillium y Humicola) , o un segmento de estos que tiene actividad glucoamilasa. En algunas modalidades, los fragmentos de ADN pueden comprender al menos aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300 o más nucleótidos contiguos. En algunas modalidades, las porciones del ADN proporcionado en la sec. con núm. de ident.: 4 pueden usarse ppaarraa obtener glucoamilasas ppaarreennttaalleess y, particularmente, homólogos de la glucoamilasa de Trichoderma de otras especies, tales como hongos filamentosos que codifican una glucoamilasa. 5. Producción de glucoamilasas Constructos de ADN y vectores De conformidad con una modalidad de la descripción, un constructo de ADN que comprende un polinucleótido, como se describió anteriormente, que codifica una glucoamilasa variante abarcada por la descripción y operativamente unida a una secuencia promotora se ensambla para transferirse a una célula hospedera. En un aspecto, se describe un polinucleótido que codifica una glucoamilasa variante como se describe en la presente descripción.
El constructo de ADN puede introducirse en una célula hospedera mediante el uso de un vector. En un aspecto, se describe un vector que comprende el polinucleótido o capaz de expresar una variante de glucoamilasa como se describe en la presente descripción. El vector puede ser cualquier vector que, al introducirse en una célula hospedera, se introduzca de manera estable. En algunas modalidades, el vector se integra en el genoma de la célula hospedera y se replica. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas de fagos, casetes, y similares. En algunas modalidades, el vector es un vector de expresión que comprende secuencias reguladoras operativamente unidas a la secuencia codificante de la glucoamilasa.
Los ejemplos de vectores de expresión y/o integración adecuados se proporcionan en Sambrook et al. (1989) supra, y Ausubel (1987) supra, y van den Hondel et al. (1991) en Bennett y Lasure (Eds.) More Gene Manipulations In Fungí, Academic Press, págs.396-428 y en la patente de los EE. UU. núm. 5,874,276. Además, se hace referencia al catálogo de cepas Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, http://www.fgsc.net) para una lista de vectores. Los vectores particularmente útiles incluyen los vectores obtenidos, por ejemplo, de Invitrogen y Promega.
Los plásmidos adecuados para usarse en las células bacterianas incluyen pBR322 y pUC19, que permiten la replicación en E. coli , y pE194, por ejemplo, que permite la replicación en Bacillus . Otros vectores específicos adecuados para usarse en las células huésped de E. coli incluyen vectores tales como pFB6, pBR322, pUC18, pUClOO, pDONR™201, 10 pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z y pGEM®4Z.
Los vectores específicos adecuados para usarse en células fúngicas incluyen pRAX, un vector de expresión de propósito general útil en Aspergillus, pRAX con un promotor de glaA, y en Hypocrea/Trichoderma incluye pTrex3 g con un promotor de cbhl .
En algunas modalidades, el promotor que exhibe actividad de transcripción en una célula hospedera bacteriana o fúngica puede derivarse de genes que codifican proteínas homologas o heterólogas en la célula hospedera. El promotor puede ser un promotor mutante, trunco y/o híbrido. Los promotores mencionados anteriormente se conocen en la materia. Los ejemplos de promotores adecuados útiles en células fúngicas y, particularmente, células fúngicas filamentosas, tales como células de Trichoderma o Aspergillus, incluyen promotores ilustrativos tales como los promotores de T. reesei cbhl, cbh2 , egll, egl2 , eg5, xlnl y xln2 . Otros ejemplos de promotores útiles incluyen promotores de genes de glucoamilasa de A. awamori y A. niger ( glaA) (ver Nunberg et al., Mol . Cell Biol . 4: 2306-2315 (1984) y Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585 (1984)), promotor TAKA amilasa de A. oryzae, el promotor TPI (triosa fosfato isomerasa) de S. cerevisiae, el promotor de genes de acetamidasa de Aspergillus nidulans y genes lipasa de Rhizomucor miehei . Los ejemplos de promotores adecuados útiles en células bacterianas incluyen los que se obtienen del operón lac de E. coli; gen alfa amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , gen amilasa de B. stearothermophilus ( amyS ) ; genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen beta lactamasa y el promotor tac. En algunas modalidades, el promotor es uno que es nativo en la célula hospedera. Por ejemplo, cuando el hospedero es T. reesei, el promotor es un promotor nativo de T. reesei . En otras modalidades, el promotor es uno que es heterólogo para la célula hospedera fúngica. En algunas modalidades, el promotor es el promotor de una glucoamilasa parental ( p. e j . , el promotor de la TrGA).
En algunas modalidades, el constructo de ADN incluye ácidos nucleicos que codifican para una secuencia señal, esto es, una secuencia de aminoácidos unida al extremo amino del polipéptido que dirige el polipéptido codificado en la ruta secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácidos nucleicos puede incluir naturalmente una región que codifica un péptido señal que está naturalmente unida en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante de glucoamilasa que codifica la glucoamilasa secretada o el extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácidos nucleicos puede incluir un péptido señal que es foráneo para la secuencia codificante. En algunas modalidades, el constructo de ADN incluye una secuencia señal que se asocia naturalmente con un gen glucoamilasa parental a partir del cual se ha obtenido una glucoamilasa variante. En algunas modalidades, la secuencia señal es la secuencia ilustrada en la sec. con núm. de ident.: 1 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90 %, aproximadamente 94 o aproximadamente 98 % de identidad de secuencia con esta. Las secuencias señal eficaces pueden incluir las secuencias señal obtenidas de otras enzimas fúngicas filamentosas, tales como de Trichoderma { T . reesei : glucoamilasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, endoglucanasa I, endoglucanasa II, o una proteinasa secretada, tal como una proteinasa aspártica), Humicola (celobiohidrolasa o endoglucanasa de H. insolens o glucoamilasa de H. grísea) , o Aspergillus (glucoamilasa de A. niger y TAK? amilasa de A. oryzae) .
En modalidades adicionales, un vector o constructo de ADN que comprende una secuencia señal y una secuencia promotora que se introducirán en una célula hospedera se derivan de la misma fuente. En algunas modalidades, puede usarse la secuencia señal nativa de glucoamilasa de un homólogo de glucoamilasa de Trichoderma, tal como una secuencia señal de una cepa de Hypocrea .
En algunas modalidades, el vector de expresión incluye, además, una secuencia terminadora. Cualquier secuencia terminadora funcional en la célula hospedera puede usarse en la presente descripción. En algunas modalidades, la secuencia terminadora y la secuencia promotora se derivan de la misma fuente. En otra modalidad, la secuencia terminadora es homologa para la célula hospedera. Las secuencias terminadoras útiles incluyen las secuencias terminadoras obtenidas de los genes de Trichoderma reesei, cbl1; glucoamilasa de A. niger o A. awamori (Nunberg et al. (1984) supra, y Boel et al., (1984) supra) , antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, TAKA amilasa de Aspergí llus oryzae o trpC de A. nidulans (Punt et al., Gene 56:117-124 (1987)).
En algunas modalidades, un vector de expresión incluye un marcador de selección. Los ejemplos de marcadores de selección incluyen los que confieren resistencia antimicrobiana (p. ej ., higromicina y fleomicina). En la presente descripción son útiles, además, los marcadores de selección nutricionales que incluyen los marcadores conocidos en la materia, tales como amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa) y pyrG (orotidina-5'fosfato descarboxilasa). Los marcadores útiles en sistemas vectoriales para la transformación de Trichoderma se conocen en la materia (ver, p. ej . , Finkelstein, Capítulo 6 de Biotechnology Of Filamentous Fungí, Finkelstein et al. (1992) Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA; Kinghorn et al. (1992) Applied Molecular Genetics Of Filamentous Fungí, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London; Berges y Barreau, Curr. Gene t . 19:359-365 (1991); y van Hartingsveldt et al., Mol . Gen. Gene t . 206:71-75 (1987)). En algunas modalidades, el marcador de selección es el gen amdS, que codifica la enzima acetamidasa, y permite que las células transformadas crezcan en acetamida como una fuente de nitrógeno. El uso del gen amdS de A. nidulans como marcador de selección se describe en Kellcy et al., EMBO J. 4:475-479 (1985) y Penttila et al., Gene 61:155-164 (1987).
Los métodos usados para ligar el constructo de ADN que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una glucoamilasa variante, una secuencia promotora, una secuencia terminadora y otras secuencias y para insertarlos en un vector adecuado son muy conocidos en la materia. La conexión se logra, generalmente, por ligamiento en sitios convenientes de restricción. Si estos sitios no existen, se usan conectores de oligonucleótidos sintéticos de conformidad con la práctica convencional (ver Sambrook et al. (1989) supra, y Bennett y Lasure, More Gene Manipulations In Fungí, Academic Press, San Diego (1991), págs. 70-76.). Adicionalmente, los vectores pueden construirse mediante el uso de téenicas de recombinación conocidas (p. ej ., invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).
Células huésped y transformación de células huésped La presente descripción se relaciona, además, con células huésped que comprenden un polinucleótido que codifica una glucoamilasa variante de la descripción. En algunas modalidades, las células huésped se seleccionan de células bacterianas, fúngicas, vegetales y de levadura. El término "célula hospedera" incluye las células, la progenie de las células y los protoplastos creados a partir de las células que se usan para producir una glucoamilasa variante de conformidad con la descripción. En un aspecto, se describe una célula hospedera que comprende, preferentemente, se transforma con, un vector. En otro aspecto, se proporciona una célula capaz de expresar una variante de glucoamilasa. En otro aspecto, la célula hospedera es una célula hospedera deficiente en proteasas y/o deficiente en xilanasas y/o deficiente en glucanasas. Una célula hospedera deficiente en proteasas y/o deficiente en xilanasas y/o deficiente en glucanasas nativa puede obtenerse mediante la supresión o el silenciamiento de genes que codifican para las enzimas mencionadas. Como consecuencia, la célula hospedera que contiene la variante de GA no expresa las enzimas mencionadas.
En algunas modalidades, las células huésped son células fúngicas y, opcionalmente, células huésped fúngicas filamentosas. El término "fúngicas filamentosas" se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina (ver, Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory ycology, Wilcy, New York). Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos de la presente descripción son morfológica, fisiológica y genéticamente distintos de las levaduras. El crecimiento vegetativo de los hongos filamentosos es por elongación de las hifas, y el catabolismo del carbono es obligadamente aeróbico. En la presente descripción, la célula fúngica filamentosa parental puede ser una célula de una especie de, pero sin limitarse a, Trichoderma (p. ej . , Trichoderma reesei , el morfo asexual de Hypocrea jecorina, clasificado anteriormente como T. longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii , Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl . Microbiol . Biotechnol . 20:46-53 (1984); núm. de la ATCC 56765 y núm. de la ATCC 26921), Penicilliurn sp . , Humicola sp. (p. ej . , H. insolens , H. lanuginosa y H. grísea) , Chrysosporium sp. (p. ej . , C. lucknowen.se) , Gliocladium sp. , Aspergillus sp. {p. ej . , A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus , A. nidulans y A. awamori) (Ward et al., Appl . Microbiol . Biotechnol . 39:738-743 (1993) y Goedegebuur et al., Curr. Gene t . 41:89 -98 (2002)), Fusarium sp. , (p. ej . , F. roseum, F. graminum, F. cerealis , F. oxysporum y F. venenatum) , Neurospora sp. , ( N . crassa) , Hypocrea sp. , Mucor sp. ( M . miehei) , Rhizopus sp. y Emericella sp. {ver, además, Innis et al., Science 228:21 -26 (1985)). El término "Trichoderma" o "Trichodeiwa sp.” o " Trichoderma spp.” se refiere a cualquier gen fúngico anteriormente o actualmente clasificado como Trichoderma .
En algunas modalidades, las células huésped son células bacterianas grampositivas. Los ejemplos no limitantes incluyen cepas de Streptomyces (p. ej . , S. lividans, S. coelicolor, y S. griseus) y Bacillus . Como se usa en la presente descripción, "el género Bacillus" incluye todas las especies dentro del género "Bacillus" , como es conocido para los experimentados en la materia, e incluyen, pero no se limitan a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii , B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus y B. thuringiensis . Se reconoce que el género Bacillus continúa experimentando reorganización taxonómica. Por lo tanto, se pretende que el género incluya las especies que se han reclasificado, que incluyen, pero no se limitan a, organismos tales como B. stearothermophilus, que ahora se denomina " Geobacillus tearothermophilus . " En algunas modalidades, la célula hospedera es una cepa bacteriana gramnegativa, tal como E. coli o Pseudomonas sp. En otras modalidades, las células huésped pueden ser células de levadura, tales como Saccharomyces sp. , Schizosaccharomyces sp. , Pichia sp. o Candida sp. En otras modalidades, la célula hospedera es una célula hospedera genéticamente diseñada, en donde los genes nativos se han inactivado, por ejemplo, mediante supresión en células bacterianas o fúngicas. Cuando se desea obtener una célula hospedera fúngica que tiene uno o más genes inactivados, pueden usarse métodos conocidos (p. ej . , los métodos descritos en la patente de los EE. UU. núm. 5,246,853, la patente de los EE. UU. núm.5,475,101, y la patente núm. O 92/06209). La inactivación de genes puede lograrse por supresión parcial o completa, por inactivación de inserción o por cualquier otro método que haga que un gen no sea funcional para el propósito previsto, (de tal manera que se evite que el gen se exprese de una proteína funcional). En algunas modalidades, cuando la célula hospedera es una célula de Trichoderma y, particularmente, una célula hospedera de T. reesei , los genes cbhl , cbh2, egll y egl2 se inactivan y/o suprimen. Las células huésped ilustrativas de Trichoderma reeseique tienen cuatro supresiones de proteínas se exponen y describen en la patente de los EE. UU. núm. 5,847,276 y la patente núm. WO 05/001036. En otras modalidades, la célula hospedera es una cepa deficiente en proteasas o que no tiene proteasa.
La introducción de un vector o constructo de ADN en una célula hospedera incluye téenicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transíección, (p. ej., transfección mediada por DEAE-dextrina y mediada por lipofección); incubación con precipitado de ADN con fosfato de calcio; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN; y fusión de protoplastos. En la materia se conocen técnicas de transformación generales (ver, p. ej ., Ausubel et al. (1987) supra, capítulo 9; y Sambrook et al. (1989) supra, y Campbell et al., Curr . Genet . 16:53-56 (1989)).
Los métodos de transformación para Bacillus se describen en varias referencias que incluyen Anagnostopoulos C. y J. Spizizen, J. Bacteriol . 81:741-746 (1961) y la patente núm. WO 02/14490.
Los métodos de transformación para Aspergillus se describen en Yelton et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 81:1470-1474 (1984); Berka et al., (1991) en Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly y Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., Protein Sci . 9:991-1001 (2000); Campbell et al., Curr. Gene t . 16:53-56 (1989), y EP 238023. La expresión de proteína heteróloga en Trichoderma se describe en la patente de los EE. UU. núm. 6,022,725; la patente de los EE. UU. núm. 6,268,328; Harkki et al. Enzyme Microb. Technol . 13:227-233 (1991); Harkki et al., BioTechnol . 7:596-603 (1989); EP 244,234; EP 215,594; y Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", en Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong y Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992), págs.129-148). Se hace referencia, además, a la patente núm. W096/00787 y Bajar et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 88:8202-8212 (1991) para la transformación de cepas de Fusarium.
En una modalidad específica, la preparación de Trichoderma sp. para la transformación involucra la preparación de protoplastos a partir de micelios fúngicos [ver, Campbell et al., Curr. Gene t . 16:53-56 (1989); Pentilla et al., Gene 61:155-164 (1987)). Se conoce la transformación de hongos filamentosos mediada por Agrobacterium tumefaciens (ver de Groot et al., Nat . Biotechnol .16:839-842 (1998)). Se hace referencia, además, a la patente de los EE. UU. núm. 6,022,725 y la patente de los EE. UU. núm.6,268,328 para los procedimientos de transformación usados con huéspedes fúngicos filamentosos.
En algunas modalidades, los transformantes genéticamente estables se construyen con sistemas vectoriales mediante los cuales el ácido nucleico que codifica la glucoamilasa variante se integra establemente en un cromosoma de una Cepa hospedera. Después, los transformantes se purifican por medio de téenicas conocidas.
En algunas modalidades adicionales, las células huésped son células vegetales, tales como células de una planta monocotiledónea (p. ej., maíz, trigo y sorgo) o células de una planta dicotiledónea (p. ej ., soja). Se conocen métodos para preparar constructos de ADN útiles en la transformación de plantas y métodos para transformación de plantas. Algunos de estos métodos incluyen transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens ; bombardeo de microproyectiles, transformación de protoplastos mediada por PEG, electroporación y similares. Se hace referencia a la patente de los EE. UU. núm.6,803,499, la patente de los EE. UU. núm. 6,777,589; Fromm et al., BioTechnol . 8:833-839 (1990); Potrykus et al., Mol . Gen. Gene t . 199:169-177 (1985). Producción de glucoamilasas La presente descripción se relaciona, además, con métodos para producir las glucoamilasas variantes; los métodos comprenden transformar una célula hospedera con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una glucoamilasa variante de conformidad con la descripción, cultivar la célula hospedera en condiciones adecuadas para expresión y producción de la glucoamilasa variante y, opcionalmente, recuperar la glucoamilasa variante. En un aspecto, se proporciona un método para expresar una glucoamilasa variante de conformidad con la descripción; el método comprende obtener una célula hospedera o una célula como se describe en la presente descripción y expresar la variante de glucoamilasa a partir de la célula o célula hospedera y, opcionalmente, purificar la variante de glucoamilasa. En un aspecto, se purifica la variante de glucoamilasa.
En los métodos de expresión y de producción de la presente descripción, las células huésped se cultivan en condiciones adecuadas en cultivos de matraz agitado, fermentaciones a pequeña o a gran escala (que incluyen fermentación continua, discontinua y semicontinua) en termentadores de laboratorio o industriales, con el medio adecuado que contiene sales y nutrientes fisiológicos (ver, p. ej . , Pourquie, J. et al., Biochemistry And Genetics Of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, págs. 71-86, 1988 e limen, M. et al., Appl . Environ. Microbiol . 63:1298-1306 (1997)). Los medios comunes preparados comercialmente (p. ej . , caldo de cultivo de extracto de malta y levadura (YM), caldo de cultivo Luria Bertani (LB) y caldo de cultivo de dextrosa Sabouraud (SD) son útiles en la presente descripción. Las condiciones de cultivo para células fúngicas bacteriales y filamentosas se conocen en la materia y pueden encontrarse en la literatura científica y/o fuentes de hongos, tales como la colección de American Type Culture Collection y el centro Fungal Genetics Stock Center. En casos en donde la secuencia codificante de glucoamilasa está bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor (p. ej . , un azúcar, una sal metálica o un antimicrobiano), se agrega al medio en una concentración eficaz para inducir la expresión de la glucoamilasa.
En algunas modalidades, la presente descripción se relaciona con métodos para producir la glucoamilasa variante en un huésped vegetal; el método comprende transformar una célula vegetal con un vector que comprende un polinucleótido que codifica una variante de glucoamilasa de conformidad con la descripción y cultivar la célula vegetal en condiciones adecuadas para la expresión y producción de la variante.
En algunas modalidades, se llevan a cabo ensayos para evaluar la expresión de una glucoamilasa variante a través de una línea celular que se ha transformado con un polinucleó ido que codifica una glucoamilasa variante abarcada por la presente descripción. Los ensayos pueden llevarse a cabo a nivel de la proteína, a nivel del ARN y/o mediante el uso de bioensayos funcionales particulares para actividad y/o producción de la glucoamilasa. Algunos de estos ensayos incluyen Northern blot, dot blot (mancha de puntos) (análisis de ADN o ARN), RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa), hibridación in si tu mediante el uso de una sonda adecuadamente marcada (basada en la secuencia codificadora de ácidos nucleicos) y téenicas convencionales de Southern blot y detección por autorradiografía.
Adicionalmente, la producción y/o expresión de una variante de glucoamilasa puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante ensayos que miden directamente los azúcares reductores, tales como glucosa, en el medio de cultivo, y mediante ensayos para medir la actividad, expresión y/o producción de la glucoamilasa. Particularmente, la actividad glucoamilasa puede evaluarse por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (ver Goto et al., Biosci . Biotechnol . Biochem. 58:49-54 (1994)). En modalidades adicionales, la expresión de proteínas se evalúa con métodos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de células, secciones de tejido o el inmunoensayo de medio de cultivo de tejido, (p. ej ., con Western blot o ELISA). Estos inmunoensayos pueden usarse para evaluar cualitativa y cuantitativamente la expresión de una glucoamilasa. Los detalles de estos métodos son conocidos para los experimentados en la materia, y muchos reactivos para llevar a la práctica estos métodos están comercialmente disponibles.
Las glucoamilasas de la presente descripción pueden recuperarse o purificarse a partir de los medios de cultivo mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia que incluyen centrifugación, filtración, extracción, precipitación y similares.
En algunas modalidades, una variante de glucoamilasa tiene más de una sustitución de aminoácidos. Por ejemplo, la variante puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o 25 sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos en comparación con una glucoamilasa parental . En algunas modalidades, una variante de glucoamilasa comprende una sustitución, supresión o inserción en al menos una posición de aminoácidos que corresponde a las regiones de aminoácidos no conservados. Como se contempla en la presente descripción, las variantes de glucoamilasa pueden tener sustituciones, supresiones o inserciones en cualquier posición en la secuencia de la proteína madura.
Como se contempla en la presente descripción, una secuencia de ADN que codifica una glucoamilasa o una variante de glucoamilasa puede expresarse, enzimáticamente, mediante el uso de un vector de expresión que incluye, típicamente, secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión a ribosomas, señal de iniciación de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores. El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una glucoamilasa como se contempla en la presente descripción puede ser cualquier vector que pueda someterse, convenientemente, a procedimientos de ADN recombinante. El vector puede ser uno que, cuando se introduce en una glucoamilasa parental, se integra en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado. Por ejemplo, la célula fúngica puede transformarse con el constructo de ADN que codifica la glucoamilasa para integrar el constructo de ADN, en una o más copias, en el(los) cromosoma(s) del hospedero. Generalmente, se considera que esta integración es ventajosa, ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga de manera estable. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma del hospedero puede llevarse a cabo de conformidad con métodos convencionales, tales como recombinación homologa o heteróloga.
En una modalidad que incorpora el uso de un vector, la secuencia de ADN debe conectarse operativamente a una secuencia promotora adecuada. La secuencia promotora puede ser cualquier secuencia de ADN que exhiba actividad de transcripción en una glucoamilasa parental y puede derivarse de genes que codifican proteínas homologas o heterólogas para una glucoamilasa parental. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de glucoamilasa son, solo como ejemplos no limitantes, los derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae, la celobiohidrolasa I de T. reesei, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la a-amilasa neutra de A. niger, la a -amilasa estable a ácidos de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei , la proteasa alcalina de A. oryzae o la gliceraldehído-3-fostato deshidrogenasa de A. nidulans. Cualquier vector de expresión contemplado puede comprender, además, secuencias de poliadenilación y terminadoras de transcripción adecuadas operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la glucoamilasa o la variante. Las secuencias terminadoras y de poliadenilación pueden derivarse adecuadamente de las mismas fuentes que el promotor. El vector puede comprender, además, cualquier secuencia de ADN que permita o haga que el vector se replique en la célula hospedera. El vector puede comprender, además, genes adicionales, cuyo producto puede complementar un defecto en el hospedero fúngico. Por ejemplo, pueden incorporarse marcadores de selección para proporcionar resistencia a fármacos. Como se contempla en la presente descripción, todos los procedimientos usados para ligar constructos de ADN que codifican una glucoamilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación son los que pueden ser conocidos por aquellos con experiencia en la materia.
En un aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedera que tiene expresión heteróloga de un polipéptido, como se describe en la presente descripción, tal como una célula fúngica, por ejemplo, del género Trichoderma, tal como Trichoderma reesei . En otro aspecto, la célula fúngica es de la especie Hypocrea j ecorina.
En un aspecto, la célula hospedera comprende o, preferentemente, se transforma con un plásmido o un vector de expresión y es capaz, por lo tanto, de expresar un polipéptido como se contempla en la presente descripción. En un aspecto, el vector de expresión comprende un ácido nucleico, y el plásmido o vector de expresión como se contempla en la presente descripción puede comprender un promotor derivado de Trichoderma, tal como un promotor derivado de cbhl de T. reesei y/o un terminador derivado de Trichoderma, tal como un terminador derivado de cbhl de T. reesei y/o uno o más marcadores de selección, tales como amdS y pyrG de Aspergillus nidulans y/o una o más regiones de telómeros que permiten el mantenimiento de un plásmido no cromosómico en una célula hospedera. 6. Composiciones y usos Las glucoamilasas, como se contempla en la presente descripción, pueden usarse en composiciones que incluyen, pero no se limitan a, composiciones sacarificantes e hidrolizantes de almidón, composiciones limpiadoras y detergentes (p. ej., detergentes para lavandería, detergentes para el lavado de vajilla y composiciones para la limpieza de superficies duras), composiciones de fermentación alcohólica, y composiciones de alimentos para animales, por ejemplo. Además, estas glucoamilasas pueden usarse en aplicaciones de panadería, tal como la producción de panes y pasteles, aplicaciones de fabricación de cerveza, cuidado de la salud, textiles, procesos de conversión de residuos ambientales, procesamiento de biopulpas y de conversión de biomasa.
En algunas modalidades, una composición que comprende una glucoamilasa, como se contempla en la presente descripción, se usa, opcionalmente, en combinación con cualquiera de o en cualquier combinación con las siguientes enzimas: alfa amilasas, beta amilasas, peptidasas (proteasas, proteinasas, endopeptidasas, exopeptidasas), pululanasas, isoamilasas, cceelluullaassaass,, hemicelulasas, endoglucanasas y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasas y enzimas xilanasas auxiliares, acetolactato descarboxilasas, ciclodextrina glicotransferasas, lipasas, fitasas, laccasas, oxidasas, esterasas, cutinasas, enzimas hidrolizantes de almidón granular y otras glucoamilasas.
En algunas modalidades, la composición incluye una o más de las siguientes enzimas. En algunas modalidades, la composición incluye una o más de las enzimas seleccionadas entre alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (tal como proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasas, incluida cualquier combinación de estas.
En otra modalidad, la(s) variante(s) contemplada(s) en la presente descripción y/o una o más enzimas adicionales se inactivan por pasteurización, tal como al usar menos de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16 o 15 unidades de pasteurización (PU) en cerveza, tal como la cerveza Pilsner.
En algunas modalidades, la composición incluye una alfa amilasa, tal como alfa amilasas fúngicas (p. ej . , Aspergillus sp. ) o alfa amilasas bacterianas (p. ej . , Bacillus sp. , tales como B. stearothermophilus, (Geobacillus stearothermophilus) , B. amyloliquefaciens y B. licheniformis) y variantes e híbridos de estas. En algunas modalidades, la alfa amilasa es una alfa amilasa estable a los ácidos. En algunas modalidades, la alfa amilasa es la alfa amilasa (AkAA) de Aspergillus kawachi, ver la patente de los EE. UU. nú . 7,037,704. Las alfa amilasas comercialmente disponibles contempladas para usarse en las composiciones de la presente descripción son conocidas e incluyen GZYME® G-997, SPEZYME® FRED, SPEZYME® XTRA (Danisco US, Inc, Genencor División), TERMAMYL 120-L y SUPRA (Novozymes, Biotech.).
En algunas modalidades, la composición incluye una proteasa fúngica ácida. En otra modalidad, la composición incluye la endoproteasa (EC 3.4.21.26) proveniente de una variante del microorganismo Aspergillus niger que hidroliza péptidos en el sitio carboxilo de los residuos de prolina descrita en la patente núm. WO 2007/101888 publicada el 13 de setiembre de 2007. En otra modalidad, la proteasa fúngica ácida se deriva de una Trichoderma sp y puede ser cualquiera de las proteasas descritas en la patente de los EE. UU. 2006/0154353, publicada el 13 de julio de 2006, incorporada en la presente descripción como referencia. En otra modalidad, la composición incluye una fitasa de Buttiauxiella spp . (p. ej . , BP-17, ver, además, las variantes descritas en la publicación de patente del PCT WO 2006/043178). En una modalidad adicional, la composición incluye una acetolactato descarboxilasa (ALDC), EC 4.1.1.5, por ejemplo, de Bacillus licheniformis o del gen de ALDC de Bacillus brevis expresado en una cepa modificada de Bacillus subtilis, como se describe en la patente de los EE. UU. núm.4,617,273, publicada el 14 de octubre de 1986.
En otras modalidades, las glucoamilasas , como se contempla en la presente descripción, pueden combinarse con otras de estas glucoamilasas. En algunas modalidades, las glucoamilasas se combinan con una o más glucoamilasas derivadas de varias otras cepas o variantes de Monascus kaoliang, o de Aspergillus o variantes de estas, tales como A. oryzae, A. niger, A. kawachi y A. awamori ; glucoamilasas derivadas de cepas de Humicola o variantes de estas; glucoamilasas derivadas de cepas de Talaromyces o variantes de estas, tales como T. emersonii; glucoamilasas derivadas de cepas de Athelia, tales como A. rolfsii; o glucoamilasas derivadas de cepas de Penicillium, tales como P. chrysogenum, por ejemplo.
Particularmente, las glucoamilasas, como se contempla en la presente invención, pueden usarse para procesos de conversión del almidón y, particularmente, en la producción de dextrosa para jarabes de fructosa, azúcares de especialidad y en la producción de alcohol y otros productos finales (p. ej ., áácciiddoo oorrggáánniiccoo,, ácido ascórbico y aminoácidos) a partir de la fermentación de sustratos que contienen almidón (G.M.A. van Bcynum et al., Eds. (1985) STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Marcel Dekker Inc. NY). Las dextrinas producidas mediante el uso de composiciones de glucoamilasas variantes de conformidad con la descripción pueden dar como resultado rendimientos de glucosa de al menos 80 %, al menos 85 ¾, al menos 90 % y al menos 95 %. La producción de alcohol a partir de la fermentación de sustratos de almidón mediante el uso de glucoamilasas, como se contempla en la presente descripción, puede incluir la producción de alcohol para combustible o alcohol potable. En algunas modalidades, la producción de alcohol es mayor cuando las glucoamilasas variantes se usan en las mismas condiciones que la glucoamilasa parental o de tipo silvestre. En algunas modalidades, la producción de alcohol es entre aproximadamente 0.5 % y 2.5 % mejor, que incluye, pero no se limita a, 0.6 %, 0.7 %, 0.8 %, 0.9 %, 1.0 %, 1.1 %, 1.2 %, 1.3 %, 1.4 %, 1.5 %, 1.6 %, 1.7 %, 1.8 %, 1.9 %, 2.0 %, 2.1 %, 2.2 %, 2.3 % y 2.4 % más de alcohol que la glucoamilasa parental o de tipo silvestre.
En algunas modalidades, las glucoamilasas, como se contempla en la presente descripción, son útiles en la hidrólisis de almidón de varios sustratos con base vegetal, usualmente, material vegetal que contiene almidón y/o azúcar, que se usan para la producción de alcohol. En algunas modalidades, los sustratos con base vegetal incluyen maíz, trigo, cebada, centeno, milo, arroz, caña de azúcar, papa, mandioca y combinaciones de estos. En algunas modalidades, el sustrato con base vegetal es material vegetal fraccionado, por ejemplo, un grano cerealero, tal como maíz, que se fracciona en componentes, tales como fibra, germen, proteína y almidón (endospermo) (la patente de los EE. UU. núm. 6,254,914 y la patente de los EE. UU. núm.6,899,910). Los métodos de fermentaciones alcohólicas se describen en THE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES, 3.° Ed., Eds K.A. Jacques et al., 1999, Nottingham University Press, Reino Unido. En ciertas modalidades, el alcohol es etanol. Particularmente, los procesos de producción de fermentación de alcohol se caracterizan como procesos de molienda en húmedo o molienda en seco. En algunas modalidades, la glucoamilasa se usa en un proceso de fermentación de molienda en húmedo y, en otras modalidades, la glucoamilasa se usará en un proceso de molienda en seco.
La molienda en seco de granos involucra varias etapas básicas, que incluyen, generalmente: triturado, cocción, licuefacción, sacarificación, fermentación y separación de líquidos y sólidos para producir alcohol y otros coproductos. Se muele el material vegetal y, particularmente, los granos de cereal enteros, tales como maíz, trigo o centeno. En algunos casos, el grano puede fraccionarse primero en partes componentes. El material vegetal triturado puede molerse para obtener una partícula gruesa o fina. El material vegetal triturado puede mezclarse con un líquido (p. ej . , agua y/o residuos de destilación) en un tanque de suspensión acuosa. La suspensión acuosa se somete a altas temperaturas (p. ej . , de 90 °C a 105 °C o más altas) en una olla de presión junto con las enzimas de licuefacción (p. ej . , alfa amilasas) para solubilizar e hidrolizar el almidón del grano para formar dextrinas. La mezcla puede enfriarse y tratarse, adicionalmente, con enzimas sacarificantes, tales como las glucoamilasas abarcadas por la presente descripción, para producir glucosa. Después, el macerado que contiene glucosa puede fermentarse por aproximadamente 24 a 120 horas en presencia de microorganismos para fermentación, tales como microorganismos productores de etanol y, particularmente, levadura ( Saccharomyces spp ) . Los sólidos del macerado se separan de la fase líquida y se obtiene alcohol, tal como etanol y coproductos útiles, tales como residuos de los granos destilados.
En algunas modalidades, la etapa de sacarificación y la etapa de fermentación se combinan, y el proceso se conoce como sacarificación y fermentación simultáneas o como sacarificación y fermentación simultánea con propagación de levadura. En un aspecto, las variantes de glucoamilasa descritas en la presente descripción se usan en un proceso de una sola etapa que convierte la biomasa celulósica en alcohol que combina enzimas celulíticas y microbios para fermentación. En el proceso, los azúcares liberados por la acción enzimática pueden convertirse simultáneamente en alcohol por fermentación microbiana.
En otras modalidades, estas glucoamilasas pueden usarse en un proceso para hidrólisis de almidón, en donde la temperatura del proceso es entre 25 °C y 50 °C, en algunas modalidades, entre 30 °C y 40 °C. En algunas modalidades, la glucoamilasa puede usarse en un proceso para hidrólisis de almidón a un pH entre un pH de 3.0 y un pH de 6.5. Los procesos de fermentación, en algunas modalidades, incluyen moler un grano cerealero o grano fraccionado y combinar el grano de cereal triturado con líquido para formar una suspensión acuosa que puede mezclarse, después, en un solo recipiente con una glucoamilasa de conformidad con la presente descripción y, opcionalmente, otras enzimas, tales como, pero sin limitarse a, alfa amilasas, otras glucoamilasas, fitasas, proteasas, pululanasas, isoamilasas u otras enzimas que tienen actividad hidrolizante de almidón granular y levadura para producir etanol y otros coproductos (ver p. e j ., la patente de los EE. UU. núm. 4,514,496, la patente núm. WO 04/081193 y la patente núm. WO 04/080923).
En algunas modalidades, la descripción se refiere a un método para sacarificar una solución de almidón líquido; el método comprende una etapa de sacarificación enzimática mediante el uso de una o más glucoamilasas como se contempla en la presente descripción.
En algunas modalidades, la descripción se refiere a un método para hidrolizar y sacarificar almidón granular gelatinizado y licuado (típicamente) para usarse en la fabricación de cerveza, en virtud de lo cual una composición que comprende una o más glucoamilasas, como se contempla en la presente descripción, se usa para aumentar la cantidad de azúcares fermentables para levadura de cerveza obtenidos a partir de almidón. Se usa un proceso de fabricación de cerveza para producir el producto potable, cerveza, en donde los azúcares fermentables se convierten a etanol y CO2 por fermentación con la levadura de cerveza. Los azúcares fermentables se derivan, tradicionalmente, de almidón de granos de cereal, opcionalmente complementados con fuentes de azúcar fermentable, tales como jarabes de glucosa y maltosa, y caña de azúcar. Brevemente, la producción de cerveza, muy conocida en la materia, incluye, típicamente, las etapas de malteado, macerado y fermentación.
Históricamente, la primera etapa en la producción de cerveza es el malteado: remojo, germinación y secado del grano de cereal (p. ej., cebada). Durante el malteado, se producen enzimas en el grano de cereal que germina (p. ej., cebada) y hay ciertos cambios en sus constituyentes químicos (lo que se conoce como modificación) que incluyen la degradación del almidón, proteínas y betaglucanos.
El cereal malteado se muele para dar una molienda que puede mezclarse con un adjunto molido (p. ej., grano de cereal no germinado) para dar una molienda mixta. Además, la molienda puede consistir predominantemente o únicamente en adjuntos. La molienda se mezcla con agua y se somete a macerado; puede agregarse un adjunto previamente cocinado (gelatinizado y licuado) (el resultado de la "cocción de un adjunto") al macerado. El proceso de macerado se realiza por un período de tiempo a varias temperaturas con el fin de hidrolizar las proteínas del cereal, degradar los betaglucanos y solubilizar e hidrolizar el almidón. Se cree que la hidrólisis del almidón de la molienda en la malta y adjuntos en el macerado tradicional es catalizada por dos enzimas endógenas principales en cebada malteada. La alfa amilasa escinde aleatoriamente los enlaces alfa-1,4 en el interior de la molécula del almidón y los fragmenta en dextrinas más pequeñas. La beta amilasa escinde secuencialmente los enlaces alfa-1,4 desde el extremo no reductor de estas dextrinas y produce, principalmente, maltosa. Tanto la alfa como la beta amilasa son incapaces de hidrolizar los enlaces alfa-1,6 que forman los puntos de ramificación de las cadenas de almidón en la molécula de almidón, lo cual resulta en la acumulación de dextrinas límite en el macerado. La malta sí contiene una enzima, la dextrinasa límite, que cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa-1,6, pero solo muestra una actividad débil a las temperaturas de macerado debido a su termolabilidad. Después del macerado, el extracto líquido (mosto) se separa de los sólidos de los granos agotados (es decir, el grano insoluble y el material de cáscara que forman parte de la molienda). Los objetivos de la separación del mosto incluyen: · obtener una recuperación adecuada del extracto, · obtener una filtrabilidad adecuada, y · producir un mosto claro. La recuperación y la filtrabilidad del extracto del mosto son importantes en la economía del proceso cervecero.
La composición del mosto depende de las materias primas, el proceso de macerado y perfiles y otras variables. Un mosto típico comprende 65-80 % de azúcares fermentables (glucosa, maltosa y maltotriosa, y 20-35 % de dextrinas límite no fermentables (azúcares con un grado de polimerización más alto que la maltotriosa). Puede originarse una insuficiencia de enzimas hidrolíticas de almidón durante el macerado cuando la elaboración de cerveza tiene niveles altos de adjuntos de granos de cereal no malteados. Por lo tanto, se necesita una fuente de enzimas exógenas capaz de producir azúcares fermentables durante el proceso de macerado. Además, estas enzimas exógenas son necesarias para reducir el nivel de azúcares no fermentables en el mosto, con un incremento correspondiente en azúcares fermentables, con el fin de producir cervezas altamente atenuadas con un contenido bajo de carbohidratos. En la presente descripción se describe una composición de enzimas para hidrólisis del almidón; la composición comprende al menos una glucoamilasa, como se contempla en la presente descripción, que puede agregarse al macerado o usarse en la etapa de macerado de un proceso cervecero, con el fin de escindir los enlaces alfa-1,4 y/o alfa-1,6 de una molienda de almidón e incrementar, de esta manera, el contenido de azúcar fermentable del mosto y reducir el residuo de azúcares no fermentables en la cerveza final. Adicionalmente, el mosto, producido de esta manera, puede secarse (p. ej ., por secado por aspersión) o concentrarse (p. ej. por hervido y evaporación) para proporcionar un jarabe o un polvo.
La molienda, como se contempla en la presente descripción, puede comprender cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar derivable de cualquier planta y partes de plantas, que incluyen, por ejemplo, tuberculos, raíces, tallos, hojas y semillas, como se describió anteriormente. Preferentemente, la molienda comprende granos, tales como granos de cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, milo, mijo y sorgo y, con mayor preferencia, al menos 10 % o, con mayor preferencia, al menos 15 %, aún con mayor preferencia, al menos 25 % o, con la máxima preferencia, al menos 35 %, tal como al menos 50 %, al menos 75 %, al menos 90 %, o aún 100 % (p/p) de la molienda del mosto deriva de granos. Con la máxima preferencia, la molienda comprende grano malteado, tal como malta de cebada. Preferentemente, por lo menos 10 % o, con mayor preferencia, por lo menos 15 %, todavía con mayor preferencia, por lo menos 25 % o, con la máxima preferencia, por lo menos 35 %, tal como por lo menos 50 %, por lo menos 75 %, por lo menos 90 %, o aún 100 % (p/p) de la molienda del mosto deriva de granos malteados. Preferentemente, la molienda comprende adjuntos, tales como granos no malteados de cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, milo, mijo y sorgo y, con mayor preferencia, al menos 10 % o, con mayor preferencia, al menos 15 %, aún con mayor preferencia, al menos 25 % o, con la máxima preferencia, al menos 35 %, tal como al menos 50 %, al menos 75 %, al menos 90 %, o aún 100 % (p/p) de la molienda del mosto deriva de granos u otros adjuntos no malteados. Los materiales adicionales que comprenden carbohidratos fácilmente fermentables, tales como azúcares o jarabes, pueden agregarse al macerado de malta antes, durante o después del proceso de macerado de la invención, pero se agregan, preferentemente, después del proceso de macerado. Una parte de los adjuntos pueden tratarse con una alfa amilasa y/o endopeptidasa (proteasa) y/o una endoglucanasa, y/o tratarse térmicamente antes de agregarse al macerado. La composición de enzimas para hidrólisis del almidón, como se contempla en la presente descripción, puede incluir enzimas adicionales, preferentemente, la enzima se selecciona entre una alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluida cualquier combinación de estas. Durante el proceso de macerado, el almidón extraído de la molienda se hidroliza gradualmente en azúcares fermentables y dextrinas más pequeñas. Preferentemente, el macerado tiene resultado negativo para almidón con la prueba de yodo antes de la separación del mosto.
Después del macerado, el mosto (mosto como extracto líquido) se separa de los sólidos de los granos agotados mediante el proceso de separación de granos agotados o filtración del macerado. Los objetivos de la separación del mosto incluyen: recuperación adecuada del extracto; filtrabilidad adecuada, y un mosto claro (puede encontrarse información adicional en "Technology Brewing and Malting" de Wolfgang Kunze del Research and Teaching Institute of Brewing, Berlín (VLB), 3.° edición completamente actualizada, 2004, ISBN 3-921690-49-8).
Antes de la tercera etapa del proceso de fabricación de cerveza, la fermentación, el mosto se transfiere, típicamente, a una marmita de fermentación y se hierve vigorosamente por 50 - 60 minutos. Se producen varios procesos importantes durante el hervido del mosto (puede encontrarse información adicional en "Technology Brewing and Malting" de Wolfgang Kunze del Research and Teaching Institute of Brewing, Berlín (VLB), 3.° edición completamente actualizada, 2004, ISBN 3-921690-49-8) que incluyen la inactivación de las enzimas endógenas de la malta y cualquier enzima exógena agregada al macerado o adjunto. Después, el mosto hervido se enfría, se añade levadura de cerveza y se fermenta a temperaturas en el intervalo de 8-16 °C para convertir los azúcares fermentables en etanol. Puede producirse una cerveza de bajo contenido alcohólico a partir de la cerveza final mediante un proceso de evaporación por vacío que sirve para eliminar, selectivamente, el alcohol. Además, puede agregarse lúpulo al mosto.
En un aspecto, la invención se relaciona con el uso de una variante o una composición, como se contempla en la presente descripción, en una fermentación, en donde la variante o la composición se agrega antes de o durante la etapa de fermentación. En otro aspecto, a la etapa de fermentación le sigue una etapa de pasteurización. En un aspecto, la bebida fermentada se selecciona del grupo que consiste en cerveza, tal como cerveza de bajo contenido alcohólico o cerveza de bajas calorías. En otro aspecto, la variante o la composición se agrega en combinación con una o más enzimas adicionales, tales como las que se seleccionan entre alfa amilasa, proteasa, pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa y glucoamilasa, que incluye cualquier combinación de estas. En aún otro aspecto, la variante y/o una o más enzimas adicionales se inactivan en la etapa de pasteurización.
En un aspecto, la(s) variante(s) contemplada(s) en la presente descripción se agrega(n) en una cantidad de, por ejemplo, 0.01-50 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.05 -25 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.1-15 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.2 -10 mg por mi de mosto fermentado, tal como 1-5 mg por mi de mosto fermentado.
En un aspecto, la(s) variante(s) contemplada(s) en la presente descripción se agrega(n) en una cantidad de, por ejemplo, al menos 0.001, 0.01, 0.05, 0.10, 0.200, 0.300, 0.500, 0.800, 0.100, 0.500 o 1.000 mg por mi de mosto fermentado.
En un aspecto, la(s) variante(s) contemplada(s) en la presente descripción se agrega(n) en una cantidad de, por ejemplo, 0.01-20 GAU por mi. de mosto fermentado, tal como 0.02 -10 GAU por mi de mosto fermentado, tal como 0.05-5 GAU por mi de mosto fermentado, tal como 0.08-2 GAU por mi de mosto fermentado, tal como 0.1-1 GAU por mi de mosto fermentado.
En un aspecto, la(s) variante(s) contemplada(s) en la presente descripción se agrega(n) en una cantidad de, por ejemplo, al menos 0.010, 0.050, 0.100, 0.150, 0.300, 0.500, 0.800, 1.00, 5.00 o 10.0 GAU por mi de mosto fermentado.
En una modalidad alternativa, la invención se relaciona con un método, tal como un método en donde una fermentación está comprendida en un proceso para fabricar una bebida fermentada, y el método comprende agregar una variante o una composición como se describe en la presente descripción antes de o durante una etapa de fermentación, tal como en un método que comprende una etapa de pasteurización después de la etapa de fermentación o una etapa opcional de filtración de cerveza.
En un aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de una bebida fermentada que comprende las siguientes etapas: a) preparar un macerado, tal como el obtenido de una molienda, en donde la molienda, por ejemplo, comprende uno o más granos malteados y/o no malteados, o un material a base de almidón de otro cultivo, y en donde, además, esta etapa comprende, opcionalmente, poner en contacto el macerado con una o más enzimas adicionales, b) filtrar el macerado para obtener un mosto, y c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, y, opcionalmente, una etapa de pasteurización (d) en donde una variante o una composición como se describe en la presente descripción se agrega al: i. macerado de la etapa (a) y/o ii. el mosto de la etapa (b) y/o iii. el mosto de la etapa (c).
En un aspecto, una o más enzimas opcionalmente agregadas en la etapa a pueden seleccionarse entre una enzima desramificante de almidón, enzima R, dextrinasa límite, alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasas, incluida cualquier combinación de estas. En otro aspecto, una o más enzimas pueden agregarse, además, al poner el contacto el mosto de la etapa (b) o (c) con una o más enzimas adicionales, en donde la enzima se selecciona entre una enzima desramificante de almidón, isoamilasa y dextrinasa límite, que incluye cualquier combinación de estas.
En una modalidad alternativa, la descripción se refiere a un método para aumentar la cantidad de azúcares fermentables en el mosto, mediante el uso de una composición que comprende una o más glucoamilasas como se contempla en la presente descripción (p. ej., glucoamilasa termolábil), en virtud de lo cual la composición se agrega al mosto después de que este se ha hervido, de tal manera que una o más glucoamilasas estén activas durante la etapa de fermentación. La composición puede agregarse al mosto hervido ya sea antes, simultáneamente o después de añadir levadura de cerveza al mosto. Al final de la etapa de fermentación y maduración, la cerveza, que puede someterse, opcionalmente, a evaporación por vacío para producir una cerveza de bajo contenido alcohólico, se filtra, opcionalmente, y/o pasteuriza. Una ventaja inherente de este método reside en la duración del proceso de fermentación, la cual es aproximadamente 6-15 días (dependiendo de la temperatura, fermentación, velocidad, etc. al añadir la levadura) que permite más tiempo para la escisión enzimática de azúcares no fermentables, en comparación con la etapa de maceración corta (2-4 horas de duración). Otra ventaja de este método reside en la cantidad de la composición que se necesita para lograr la disminución deseada de azúcares no fermentables (un incremento en azúcares fermentables), que corresponde a una cantidad significativamente menor de unidades de actividad enzimática (p. ej., unidades de actividad glucoamilasa) que la que se necesitaría agregar al macerado para lograr una disminución similar en azúcares no fermentables. Adicionalmente, esto elimina las dificultades frecuentemente observadas durante la separación del mosto, especialmente, en la separación de granos agotados por el proceso, cuando se agregan concentraciones de dosis altas de glucoamilasa en el macerado. En contraposición con fuentes alternativas de enzimas glucoamilasa, se ha descubierto, sorprendentemente, que las glucoamilasas, como se contempla en la presente descripción, son adecuadamente sensibles a la temperatura, y la etapa de tratamiento térmico final de la cerveza terminada (condiciones estándar de pasteurización) es suficiente para inactivar su actividad catalítica. Por lo tanto, una ventaja importante de la composición que comprende una o más glucoamilasas, como se contempla en la presente descripción, es que la composición puede usarse para reducir la cantidad de azúcares no fermentables en el mosto durante la etapa de fermentación del proceso cervecero con el fin de producir cervezas altamente atenuadas con un contenido bajo de carbohidratos y en donde la actividad catalítica de la composición es susceptible de inactivarse por el tratamiento térmico durante la pasteurización de la cerveza y evitar, de esta manera, el gasto de reactores de enzimas inmovilizadas o el uso de levadura de cerveza genéticamente diseñada.
La presente descripción proporciona, además, un método para la producción de un producto alimenticio, forraje o bebida, tal como una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de cereales o malta, como cerveza o whisky, tal como vino, sidra, vinagre, vino de arroz, salsa de soja, o jugo; el método comprende la etapa de tratar un material vegetal que contiene almidón y/o azúcar con una variante o una composición como se describe en la presente descripción. En otro aspecto, la invención se relaciona, además, con un kit que comprende una variante o una composición, como se contempla en la presente descripción; e instrucciones para usar la variante o la composición. La invención se relaciona, además, con una bebida fermentada producida por un método como se describe en la presente descripción.
La presente descripción proporciona, además, una composición o formulación alimenticia para animales que comprende al menos una glucoamilasa como se contempla en la presente descripción. Los métodos para usar una enzima glucoamilasa en la producción de forrajes que comprenden almidón se proporcionan, por ejemplo, en la patente núm. WO 03/049550 (incorporada en su totalidad en la presente descripción como referencia). Brevemente, la glucoamilasa se mezcla con un forraje que comprende almidón. La glucoamilasa es capaz de degradar el almidón resistente para ser usado por el animal.
Otros objetos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la presente descripción. 6. Modalidades adicionales numeradas de conformidad con la invención: Modalidad 1. Una variante de glucoamilasa que comprende una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 29, 43, 48, 116 y 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 98, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 2. Una variante de glucoamilasa; la variante comprende: a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental y, opcionalmente, una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos de la interfase que consiste en los residuos 29, 43, 48, y 116 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental y, opcionalmente, una o dos sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos de la interfase o del grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 3. Una variante de glucoamilasa; la variante comprende: a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 48 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental, o una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 147 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 4. Una variante de glucoamilasa; la variante comprende: a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 147 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 ¾ de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 5. Una variante de glucoamilasa; la variante comprende: a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 48 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 6. Una variante de glucoamilasa; la variante comprende la sustitución de aminoácidos H502S de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; la sustitución de aminoácidos L98E de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; y la sustitución de aminoácidos Y48V de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13, o la sustitución de aminoácidos Y147R de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
Modalidad 7. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde la glucoamilasa parental es la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 8. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-7, en donde la glucoamilasa parental es la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
Modalidad 9. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-8, que comprende una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de los aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 500, 502, 504, 534, 536, 537, 539, 541, 542, 543, 544, 546, 547, 548, 580, 583, 585, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594 y 596 de la sec. con núm. de ident.:2 o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 10. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-9, que comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos que no están en contacto directo con el domino de unión a almidón en las posiciones 1 a 484 con excepción de la posición 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118 y 119 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 11. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-10, que tiene un valor de RDF de al menos 74.5 %.
Modalidad 12 . La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-11, en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 13. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-12, en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 14. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-13, en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 15. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-14, en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 16. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-15, en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 99.5 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
Modalidad 17. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-16, en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos 85 %, 90 %, 95 % o 99.5 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
Modalidad 18. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-17, que consiste en la secuencia parental de los aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22, cuya secuencia de aminoácidos tiene una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos F29, 143, Y48, F116 y H502 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en 143 es I43Q, y la sustitución en Y48 es Y48V, o una posición equivalente en la glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos S97, L98, Y147, F175, G483 y T484 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en S97 es S97M, la sustitución en G483 es G483S y la sustitución en T484 es T484W, o una posición equivalente en la glucoamilasa parental.
Modalidad 19. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-18, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 2, cuya secuencia de aminoácidos tiene una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos F29, 143, Y48, F116 y H502 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en 143 es I43Q, y la sustitución en Y48 es Y48V; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos S97, L98, Y147, F175, G483 y T484 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en S97 es S97M, la sustitución en G483 es G483S y la sustitución en T484 es T484W.
Modalidad 20. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-19, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 13, cuya secuencia de aminoácidos tiene una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos F29, 143, Y48, F116 y H502 de la sec. con núm. de ident.: 13, en donde la sustitución en 143 es I43Q, y la sustitución en Y48 es Y48V; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos S97, L98, Y147, F175, G483 y T484 de la sec. con núm. de ident.: 13, en donde la sustitución en S97 es S97M, la sustitución en G483 es G483S y la sustitución en T484 es T484W de la sec. con núm. de ident.: 13.
Modalidad 21. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-20, en donde la variante de glucoamilasa exhibe termoestabilidad disminuida en comparación con la glucoamilasa parental.
Modalidad 22. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-21, en donde la variante de glucoamilasa se inactiva por pasteurización, tal como al usar menos de 16.8, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 unidades de pasteurización (PU) en cerveza.
Modalidad 23. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-22, en donde la variante de glucoamilasa, cuando está en su forma cristalina, tiene una estructura de cristales para la cual las coordenadas atómicas de los átomos de la cadena principal tienen una desviación cuadrática media con respecto a las coordenadas atómicas de los átomos equivalentes de la cadena principal de la TrGA (como se define en la Tabla 20 de la patente núm. W02009/067218) menor que 0.13 nm después del alineamiento de los átomos equivalentes de la cadena principal, y que tiene una región de conector, un dominio de unión a almidón y un dominio catalítico.
Modalidad 24. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-23, que comprende una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos F29, 143, Y48, F116 y H502 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en 143 es I43Q, y la sustitución en Y48 es Y48V, o una posición equivalente en la glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos S97, L98, Y147, F175, G483 y T484 de la sec. con núm. de ident.: 2, en donde la sustitución en S97 es S97M, la sustitución en G483 es G483S y la sustitución en T484 es T484 , o una posición equivalente en la glucoamilasa parental.
Modalidad 25. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-24, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición F29 de la sec. con núm. de ident.:2 o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 26. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-25, que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos F29A/R/N/D/C/E/F/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 27. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-26, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos F29V de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 28. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-27, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 143 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 29. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-28, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos I43Q de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 30. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-29, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición Y48 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 31. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-30, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos Y48V de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 32. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-31, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición F116 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 33. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-32, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos F116M de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 34. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-33, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición H502 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 35. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-34, que comprende las siguiente sustitución de aminoácidos H502A/N/D/C/E/F/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V/W/Y de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 36. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-35, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos H502S/E de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 37. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-36, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición S97 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 38. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-37, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos S97M de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 39. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-38, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición L98 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa.
Modalidad 40. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-39, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos L98A/R/N/E/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V/Y de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 41. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-40, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos L98E de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 42. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-41, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición Y147 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 43. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-42, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos Y147R de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 44. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-43, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición F175 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 45. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-44, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos F175V/I/L de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 46. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-45, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición G483 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 47. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-46, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos G483S de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 48. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-47, que comprende una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición T484 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 49. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-48, que comprende la siguiente sustitución de aminoácidos T484W de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 50. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-49, en donde el número total de sustituciones de aminoácidos (1)en el grupo de los residuos de aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 500, 502, 504, 534, 536, 537, 539, 541, 542, 543, 544, 546, 547, 548, 580, 583, 585, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594 y 596 de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y (2)en el grupo de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos que no están en contacto directo con el dominio de unión a almidón en las posiciones 1 a 484 con la excepción de la posición 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118 y 119 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; es dos, tres o cuatro.
Modalidad 51. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-50 que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos F29V-G483S, Y48V-L98E-H502S, F116M-F175V, F175V-H502E, I43Q-F175I-H502S, I43Q-F175I, F29V-S97M-G483S-T484W, o L98E-Y147R-H502S de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
Modalidad 52. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-51, que comprende, además, las siguientes sustituciones de aminoácidos L417V, T430A, Q511H, A539R y N563I.
Modalidad 53. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-52, que consiste en la sec. con núm. de ident.: 14.
Modalidad 54. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-52, que consiste en la sec. con núm. de ident.: 15.
Modalidad 55. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-52, que consiste en la sec. con núm. de ident.: 16.
Modalidad 56. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-52, que consiste en la sec. con núm. de ident.: 17.
Modalidad 57. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-56, en donde la glucoamilasa parental tiene un dominio catalítico que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 y/o 22.
Modalidad 58. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-57, en donde la glucoamilasa parental tiene un dominio de unión a almidón que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 11, 24, 25, 26, 27, 28 y/o 29.
Modalidad 59. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-58, en donde la glucoamilasa parental se selecciona de una glucoamilasa obtenida a partir de Trichoderma spp., Aspergillus spp., Humicola spp., Penicillium spp., Talaromyces spp., o Schizosaccharmyces spp.
Modalidad 60. La variante de glucoamilasa de conformidad con la modalidad 59, en donde la glucoamilasa parental se obtiene a partir de Trichoderma spp. o Aspergillus spp.
Modalidad 61. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-60, en donde la variante de glucoamilasa exhibe termoestabilidad alterada en comparación con la glucoamilasa parental.
Modalidad 62 . La variante de glucoamilasa de conformidad con la modalidad 61, en donde la termoestabilidad alterada es una termoestabilidad disminuida.
Modalidad 63. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-62, en donde la variante de glucoamilasa exhibe actividad específica alterada en comparación con la glucoamilasa parental.
Modalidad 64. La variante de glucoamilasa de conformidad con la modalidad 63, en donde la actividad específica alterada es una actividad específica similar o incrementada.
Modalidad 65. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-64, en donde la variante exhibe termoestabilidad disminuida y actividad específica similar o incrementada en comparación con la glucoamilasa parental.
Modalidad 66. La variante de glucoamilasa conformidad con cualquiera de las modalidades 1-65, en donde el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos con, o con respecto a, otra secuencia de aminoácidos se determina mediante el uso de la búsqueda proteína a proteína de BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) con los parámetros predeterminados: matriz de puntajes: blosum62, base de datos no redundante de secuencias de proteínas y el algoritmo Blast Parámetros Umbral esperado 10 Máximo de coincidencias en un intervalo de consulta 0 Penalidad por apertura de la interrupción 11 Penalidad por extensión de la interrupción 1 Ajuste composicional: Ajuste composicional condicional de la matriz de puntajes Máscara y filtros No Modalidad 67. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-66, en donde la variante de glucoamilasa se inactiva por pasteurización, tal como al usar menos de 16.8, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, o 4 unidades de pasteurización (PU) en cerveza.
Modalidad 68. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1- 67, en donde la variante de glucoamilasa tiene una actividad glucoamilasa (GAU) de 0.05-10 GAU/mg, tal como 0.1-5 GAU/mg, tal como 0.5-4 GAU/mg, tal como 0.7-4 GAU/mg o tal como 2-4 GAU/mg.
Modalidad 69. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-68, que se obtiene por expresión recombinante en una célula hospedera.
Modalidad 70. Un ácido nucleico capaz de codificar una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-69.
Modalidad 71. Un plásmido o vector de expresión que comprende un ácido nucleico de conformidad con la modalidad 70, o capaz de expresar una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-69.
Modalidad 72. El plásmido o vector de expresión de conformidad con la modalidad 71, que comprende un promotor derivado de Trichoderma, tal como un promotor derivado de cbhl de T. reesei.
Modalidad 73. El plásmido o vector de expresión de conformidad con cualquiera de las modalidades 71-72, que comprende un terminador derivado de Trichoderma, tal como un terminador derivado de cbhl de T. reesei.
Modalidad 74. El plásmido o vector de expresión de conformidad con cualquiera de las modalidades 71-73, que comprende uno o más marcadores de selección, tal como amdS y pyrG de Aspergillus nidulans.
Modalidad 75. El plásmido o vector de expresión de conformidad con cualquiera de las modalidades 71-74, que comprende una o más regiones de telómeros que permiten el mantenimiento de un plásmido no cromosómico en una célula hospedera.
Modalidad 76. Una célula hospedera que tiene expresión heteróloga de una variante de glucoamilasa como se define en cualquiera de las modalidades 1-69.
Modalidad 77. La célula hospedera de conformidad con la modalidad 76, en donde la célula hospedera es una célula fúngica.
Modalidad 78. La célula hospedera de conformidad con la modalidad 77, en donde la célula fúngica es del género Trichoderma.
Modalidad 79. La célula hospedera de conformidad con la modalidad 78, en donde la célula fúngica es de la especie Trichoderma reesei.
Modalidad 80. La célula hospedera de conformidad con la modalidad 77, en donde la célula fúngica es de la especie Hypocrea jecorina.
Modalidad 81. Una célula hospedera que comprende, y preferentemente transformada con, un plásmido o un vector de expresión como se define en cualquiera de las modalidades 71-75.
Modalidad 82. Un método para aislar una variante de glucoamilasa como se define en cualquiera de las modalidades 1-69; el método comprende las etapas de inducir la síntesis de la variante de glucoamilasa en una célula hospedera, como se define en cualquiera de las modalidades 76-81, que tiene expresión heteróloga de la variante de glucoamilasa, y recuperar la proteína extracelular secretada por la célula hospedera y, opcionalmente, purificar la variante de glucoamilasa.
Modalidad 83. Un método para producir una variante de glucoamilasa como se define en cualquiera de las modalidades 1-69; el método comprende las etapas de inducir la síntesis de la variante de glucoamilasa en una célula hospedera, como se define en cualquiera de las modalidades 76-81, que tiene expresión heteróloga de la variante de glucoamilasa y, opcionalmente, purificar la variante de glucoamilasa.
Modalidad 84. Un método para expresar una variante de glucoamilasa como se define en cualquiera de las modalidades 1-69; el método comprende obtener una célula hospedera como se define en cualquiera de las modalidades 76-81 y expresar la variante de glucoamilasa a partir de la célula hospedera y, opcionalmente, purificar la variante de glucoamilasa.
Modalidad 85. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 82-84, en donde la variante de glucoamilasa, como se define en cualquiera de las modalidades 1-69, es la proteína secretada dominante.
Modalidad 86. Una composición que comprende una o más variantes de glucoamilasa como se define en cualquiera de las modalidades 1-69.
Modalidad 87. La composición de conformidad con la modalidad 86, en donde la composición se selecciona entre una composición hidrolizante de almidón, una composición sacarificante, una composición detergente, una composición enzimática para fermentación de alcohol y una composición alimenticia para animales.
Modalidad 88. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 86-87, que comprende una o más enzimas adicionales.
Modalidad 89. La composición de conformidad con la modalidad 88, en donde una o más de las enzimas se seleccionan entre alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa) , pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluida cualquier combinación de estas.
Modalidad 90. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 86-89, en donde la(s) variante(s) de glucoamilasa y/o una o más enzimas adicionales se inactivan por pasteurización.
Modalidad 91. La composición de conformidad con la modalidad 90, en donde la variante de glucoamilasa y/o una o más enzimas se inactivan por pasteurización, tal como al usar menos de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16 o 15 unidades de pasteurización (PU) en cerveza.
Modalidad 92. El uso de una variante de glucoamilasa como se define en cualquiera de las modalidades 1-69 o una composición como se define en cualquiera de las modalidades 86-91 en una fermentación, en donde la variante de glucoamilasa o la composición se agrega antes de o durante una etapa de fermentación.
Modalidad 93. El uso de conformidad con la modalidad 92, en donde a la etapa de fermentación, y la etapa opcional de filtración de cerveza, le sigue una etapa de pasteurización.
Modalidad 94. El uso de conformidad con cualquiera de las modalidades 92-93, en donde la fermentación está comprendida en un proceso para fabricar una bebida fermentada.
Modalidad 95. El uso de conformidad con cualquiera de las modalidades 92-94, en donde la bebida fermentada se selecciona del grupo que consiste en cerveza, tal como cerveza de bajo contenido alcohólico o cerveza de bajas calorías.
Modalidad 96. El uso de conformidad con cualquiera de las modalidades 92-95, en donde la variante de glucoamilasa o la composición se agrega en una combinación con una o más enzimas adicionales.
Modalidad 97. El uso de conformidad con la modalidad 96, en donde una o más de las enzimas adicionales se selecciona entre alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluida cualquier combinación de estas.
Modalidad 98. El uso de conformidad con cualquiera de las modalidades 92-97, en donde la variante de glucoamilasa y/o una o más de las enzimas adicionales se inactivan en la etapa de pasteurización.
Modalidad 99. El uso de conformidad con cualquiera de las modalidades 92-98, en donde la variante de glucoamilasa se agrega en una cantidad, por ejemplo, de 0.01-50 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.05 -25 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.1-15 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.2 -10 mg por mi de mosto fermentado, tal como 1-5 mg por mi de mosto fermentado.
Modalidad 100. El uso de una variante de glucoamilasa termolábil para aumentar la producción de azúcares fermentables en la etapa de fermentación de un proceso cervecero, en donde la variante de glucoamilasa es como se define en cualquiera de las modalidades 1-69.
Modalidad 101. Un método que comprende agregar una variante de glucoamilasa como se define en cualquiera de las modalidades 1-69 o una composición como se define en cualquiera de las modalidades 86-91 antes de o durante una etapa de fermentación, tal como una etapa de fermentación con levadura.
Modalidad 102. El método de conformidad con la modalidad 101, que comprende una etapa de pasteurización después de la etapa de fermentación o la etapa opcional de filtración de cerveza.
Modalidad 103. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 101-102, en donde la fermentación está comprendida en un proceso para fabricar una bebida fermentada.
Modalidad 104. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 101-103, en donde la bebida fermentada se selecciona del grupo que consiste en cerveza, tal como cerveza de bajo contenido alcohólico o cerveza de bajas calorías.
Modalidad 105. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 101-104, en donde la variante de glucoamilasa o la composición se agrega en combinación con una o más enzimas adicionales.
Modalidad 106. El método de conformidad con la modalidad 105, en donde una o más de las enzimas adicionales se selecciona entre alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluida cualquier combinación de estas.
Modalidad 107. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 101-106, en donde la variante de glucoamilasa y/o una o más de las enzimas adicionales se inactivan en la etapa de pasteurización.
Modalidad 108. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 101-107, en donde la variante de glucoamilasa se agrega en una cantidad, por ejemplo, de 0.01-50 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.05 -25 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.1-15 mg por mi de mosto fermentado, tal como 0.2 -10 mg por mi de mosto fermentado, tal como 1-5 mg por mi de mosto fermentado.
Modalidad 109. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 101-108 para la producción de una bebida fermentada; el método comprende las siguientes etapas: a) preparar un macerado, b) filtrar el macerado para obtener un mosto, y c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, Modalidad 110. El método de conformidad con la modalidad 109, en donde una variante de glucoamilasa como se define en cualquiera de las modalidades 1-69 o una composición como se define en cualquiera de las modalidades 86-91 se agrega al: macerado de la etapa (a) y/o el mosto de la etapa (b) y/o el mosto de la etapa (c).
Modalidad 111. El método de conformidad con la modalidad 109 o 110, en donde la bebida fermentada se somete a una etapa de pasteurización (d).
Modalidad 112. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 109-111, en donde el macerado de la etapa (a) se obtiene a partir de una molienda.
Modalidad 113. El método de conformidad con la modalidad 112, en donde la molienda comprende uno o más granos malteados y/o no malteados, o un material a base de almidón de otro cultivo.
Modalidad 114. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 109-113, que comprende, además, poner en contacto el macerado de la etapa (a) con una o más enzimas adicionales.
Modalidad 115. El método de conformidad con la modalidad 114, en donde la enzima se selecciona entre una enzima desramificante de almidón, enzima R, dextrinasa límite, alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas xilanasa auxiliares (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasas, incluida cualquier combinación de estas.
Modalidad 116. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 109-115, que comprende, además, poner en contacto el mosto de la etapa (b) o (c) con una o más enzimas adicionales, en donde la enzima se selecciona entre una enzima desramificante de almidón, isoamilasa y dextrinasa límite, que incluye cualquier combinación de estas.
Modalidad 117. Una bebida fermentada, en donde la bebida fermentada se produce con un método como se define en cualquiera de las modalidades 109-116.
Modalidad 118. La bebida fermentada de conformidad con la modalidad 117, que es cerveza, tal como una cerveza de bajo contenido alcohólico o una cerveza de bajas calorías.
Modalidad 119. Un método para la producción de un producto alimenticio, forraje o bebida, tal como una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de malta o cereales, como cerveza o whisky, tal como vino, sidra, vinagre, vino de arroz, salsa de soja o jugo; el método comprende la etapa de tratar un material vegetal que contiene almidón y/o azúcar con una variante de glucoamilasa de conformidad con las modalidades 1-69, o una composición como se define en cualquier modalidad 86-91.
Modalidad 120. Un kit que comprende una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-69, o una composición como se define en cualquiera de las modalidades 86-91; e instrucciones para usar la variante de glucoamilasa o la composición.
Modalidad 121. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-69, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 86-91 y 117-118, en la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol y/o biobutanol.
Modalidad 122. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-69, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 86-91 y 117-118, en la producción de una sustancia bioquímica, tal como isopreno de base biológica.
Modalidad 123. Un método para la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol y/o biobutanol; el método comprende la etapa de tratar un material que comprende almidón con una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-69 o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 86-91 y 117-118.
Modalidad 124. Un método para la producción de una sustancia bioquímica, tal como isopreno de base biológica; el método comprende la etapa de tratar un material que comprende almidón con una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-69 o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 86-91 y 117- 118.
Modalidad 125. Una variante de glucoamilasa obtenida por el método de conformidad con cualquiera de las modalidades 82-85.
Modalidad 126. Una composición que comprende el producto de conformidad con la modalidad 125, tal como en donde el producto está en un intervalo de 0.1 %-99.9 %.
Se proporcionan los siguientes ejemplos, y se comprenderá que pueden hacerse varias modificaciones sin apartarse del espíritu de las modalidades descritas.
EJEMPLOS Ensayos y métodos Los siguientes ensayos y métodos se usan en los ejemplos proporcionados más adelante. Los métodos usados para proporcionar variantes se describen a continuación. Sin embargo, cabe mencionar que pueden usarse métodos diferentes para proporcionar variantes de una enzima parental, y la invención no se limita a los métodos usados en los ejemplos. Se pretende que pueda usarse cualquier método adecuado para preparar variantes y seleccionar variantes.
Producción de GA por fermentación Solución de elementos traza 400x ·. Se diluyen en 1000 mi de agua desmineralizada: Ácido cítrico anhidro (175 g), FeSO4*7 H2O (200 g), ZnS04*7 H20 (16 g), CuS04*5 H20 (3.2 g), MnS04*H20 (1.4 g), H3B03 (0.8 g). Puede ser útil acidificar esto para para que todos los componentes entren en la solución. Se filtra y se esteriliza la solución.
Medio LD: Se agrega a ~ 800 mi de agua desmineralizada: Ácidos casamino (9 g), MgSO4*7H2O (1 g), (NH4)2SC>4 (5 g), KH2PO4 (4.5 g), CaCl2*2H20 (1 g), ácido piperazina-1,4-bis-propanosulfónico (PIPPS), amortiguador (33 g), elementos traza de T. reesei, 400x, (2.5 mi); el pH se ajusta a 5.5 con NaOH 4N. El volumen final se ajusta a 920 mi.
Agar base Amd S 2x (1 litro) : Se mezcla KH2PO4 (30 g), 1 M acetamida (20 mi) 1 M, CsCl (20 mi) 1 M, 20 % MgS04.7H20 (6 mi), 20 % CaCl2.2H20 (6 mi), elementos de esporas 400x de T. reesei (2 mi), 50 % glucosa. H20 (80 mi). Se ajusta el pH a 4.5 con NaOH 4 N, se lleva a 1 litro y se esteriliza por filtración. Se almacena a 4 °C.
Cultivo inicial : se cultivaron cepas de Trichoderma reesei en placas con agar y base de AmdS. Para producir placas con agar, se hirvió agar con medios mínimos y, después, se dejó enfriar hasta aproximadamente 50 °C, se diluyó con base de AmdS 2x 1:1 y se vertió en placas Petri. Después de la esporulación (aprox.6-7 días), las placas se rasparon con 2 mi de solución salina al 0.015 % Tween 80. Se agregó aproximadamente 1 mi a tubos con glicerol que contienen 500-600 ml de glicerol al 35 % y se almacenó a -80 °C. Las fermentaciones del precultivo se iniciaron directamente a partir de esta suspensión de esporas.
Precultivo: El medio se prepara al agregar 2.5 % de glucosa al medio LD, que se lleva, posteriormente, a 1 litro. Para producir la biomasa, se agrega 50 ml de suspensión de esporas a 100 mi de medio (esterilizado en un matraz de agitación de 500 mi). Los matraces se incuban en un agitador rotativo a 30 °C, 180 rpm, durante 2 días, después, se usa 10 mi de la suspensión para inocular un nuevo matraz de agitación con desviadores, que se incuba en condiciones similares por un (1) día. El contenido de este matraz se usa para inocular un termentador. La fermentación alternativa del precultivo se inició con una pieza (~1 cm2) de una placa con PDA fresco y T. reesei.
Cultivo principal : Para preparar 1 litro de medio, se agregó 40 mi de mezcla de glucosa/soforosa (Danisco, Jamsa, Finlandia) al medio LD y se completó a 1 litro. Fermentadores de 6 litros que contienen 4 litros de medio se inocularon con el precultivo y se cultivaron a un pH de 3.5 durante aproximadamente 16 horas a 34 °C, hasta que la relación CER/OUR (velocidad de excreción de dióxido de carbono/velocidad de captación de oxígeno) comenzó a caer. Después, la temperatura se redujo a 28 °C, el pH se elevó a 5.5, y se continuó con la fermentación durante aproximadamente 80 horas. Se recolectó el cultivo de células, y los medios se depuraron por centrifugación (4000 rpm a 25 min) y filtración (VacuCap 90, 0.2 pm). Después, el fermento se concentró y almacenó a -20 °C.
Purificación de las variantes de TrGA Los sobrenadantes de cultivos de las variantes de TrGA expresadas se purificaron en una sola etapa por cromatografía de afinidad mediante el uso de un sistema DUO-Flow de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC, por sus siglas en inglés) BioRAD (BioRAD, EE. UU.). La cromatografía se llevó a cabo manualmente en un sistema FPLC de BioRAD. Se preparó una columna de 15 mi de b-ciclodextrina por inmovilización de b-ciclodextrina (Sigma-Aldrich Zwijndrecht, Países Bajos; núm. CAS 68168-23-0) en Epoxy-activated Sepharose (sefarosa activada por epoxi)™ 6B (GE Healthcare, Diegem, Bélgica; lote: 10021987). Esta columna con b-CD se equilibró con el Amortiguador A a un régimen de flujo de 2 ml/min. Este régimen de flujo se mantuvo durante toda la purificación. La muestra que contiene 500 unidades GAU se cargó en la columna a través de la tubería de entrada y se recolectaron fracciones de 10 mi durante toda la purificación Se descartó la fracción no retenida, y el amortiguador se cambió por 100 % del Amortiguador B (10 mM de a-ciclodextrina en 25 mM de acetato de sodio, pH de 4.3 (Sigma, 28705)) después de la estabilización de los valores iniciales por varios lavados con el Amortiguador A. Las variantes de TrGA ligadas se eluyeron de la columna y, finalmente, el amortiguador se cambió nuevamente por el amortiguador A después de que se eluyeron todas las proteínas. Las proteínas eluidas se desalaron para eliminar la a-ciclodextrina y se analizaron para determinar la actividad glucoamilasa por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés).
Cuantificación de proteínas de variantes de TrGA purificadas Se usó el ensayo de Bradford para la cuantificación total de proteínas. La solución de reactivos fue la solución de trabajo Bradford Quikstart (BioRad, núm. de catálogo 500-0205). Se colocó 100 ml de sobrenadante en una placa nueva de fondo plano de 96 pocilios. En cada pocilio, se agregó 200 Ul de reactivo, y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia a 595 nm en un lector de placas de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés) (Molecular Devices Spectramax 190). Las concentraciones de proteínas se calcularon de acuerdo con una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA) (0-50 Ug/ml).
Análisis de electroforesis en gel Toda la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) se realizó con los productos Invitrogen NuPAGE® Novex, 4-12 % de gel Bis-Tris 1.0 mm, 12 pocilios (núm. de catálogo NP0321box), estándar preteñido Novex See-Blue® Plus2 (núm. de catálogo LC5925), Invitrogen Simply Blue Safestain (núm. de catálogo LC6060) y el amortiguador NuPAGE® MES SDS Running Buffer (núm. de catálogo NP0002) de conformidad con el protocolo del fabricante.
Ensayo de actividad de glucoamilasa pNPG para placas de raicrotitulación de 96 pocilios Las soluciones de reactivos fueron: amortiguador NaAc: 200 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH de 4.5; Sustrato: 50 mM de p-nitrofenil-a-D-glucopiranósido (Sigma N-1377) en amortiguador de NaAc (0.3 g/20 mi) y solución de terminación: 800 mM de amortiguador de glicina-NaOH, pH de 10. Se colocó 30 ml de sobrenadante filtrado en una placa de microtitulación (MTP) nueva de fondo plano de 96 pocilios. En cada pocilio se agregó 50 ml de amortiguador de NaAc y 120 m? de sustrato, y se incubó durante 30 minutos a 50 °C (Thermolab systems iEMS Incubador/agitador HT). La reacción se terminó con el agregado de 100 m? de solución de terminación. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de placas de microtitulación (Molecular Devices Spectramax 384 plus), y se calculó la actividad al usar un coeficiente de extinción molar de 0.011 mM/cm.
Determinación de la actividad GAU en placas de microtitulación de 96 pocilios Ensayo cromogénico específico para glucoamilasa con sustrato de pNP-b-maltósido y expresado como la cantidad de p-nitrofenol que se produce a partir del sustrato en condiciones definidas para el ensayo. El sustrato específico de p-nitrofenil-p-maltósido no se hidroliza por oí-amilasa, a- glucosidasa y transglucosidasa, que pueden aparecer como contaminantes en preparaciones comerciales de glucoamilasa Sustrato: Se preparó en el momento un sustrato de p-nitrofenilo-b-maltósido (4 mM), más b-glucosidasa termoestable (5 U/ml) (del ensayo R-AMGR3 05/04; Megazyme International Wicklow, Irlanda).
Amortiguador: 200 mM de amortiguador de acetato de sodio (pH de 4.5).
Las muestras de enzimas se diluyeron en al menos un factor 10 en el amortiguador de acetato de sodio en una placa de 96 pocilios: Se mezcló 20 mi de sustrato con 20 mi de solución de enzimas y se incubó a 40 °C con agitación durante 10 minutos. Se agregó 300 ml de base Trizma al 2 % para terminar la reacción y desarrollar el color. Se midió la absorbancia a 400 nm contra un blanco de reactivos.
Los blancos se preparan al agregar 300 mi de solución de base Trizma (2 %) a 20 ml de sustrato con agitación vigorosa, seguido por la solución de enzimas (20 m?). La actividad se calcula de la siguiente manera: Actividad GAU/mL)= - 1- 1— D±iución 18.10.88 en donde: GAU = Unidades internacionales de actividad enzimática. Una unidad es la cantidad de enzima que libera un mmo? de p-nitrofenol del sustrato por minuto a la temperatura y pH definidos. DAioo absorbencia (reacción) absorbancia (blanco). 10 = tiempo de incubación (min). 340 = volumen final de la reacción (ml).20 = volumen de enzima del ensayo (ml) 18.1 = E mM p-nitrofenol en la base Trizma al 2 % (pH ~ 8.5) a 400 nm (unidad: pM1*cm·1).0.88 = Paso de luz (cm). Ensayo de estabilidad térmica La pérdida relativa de actividad glucoamilasa se determinó en cerveza desgasificada o amortiguador de acetato de sodio, pH de 4.5, en un ensayo de pasteurización a escala de laboratorio. La muestra se diluyó 1:10 en cerveza o el amortiguador y se transfirió a una cubeta de vidrio fina y se colocó en un baño de agua a 72 °C, en donde se midieron el tiempo y la temperatura. Con el transcurso del tiempo (de 0 a 100 s), se retiraron las muestras y se mantuvieron sobre hielo para determinar la actividad residual GAU. La dilución y el mezclado se realizaron en placas para ensayos ELISA de 96 pocilios en un equipo Biomek 3000 (Beckman Coulter). Para determinar la termoestabilidad de las enzimas en las condiciones usadas en los presentes experimentos, se determinó la actividad GAU antes y después de la incubación de las enzimas. Como blanco, se usó cerveza o amortiguador sin glucoamilasa. La entrada de energía acumulada se convirtió a unidades de pasteurización (PU), un índice equivalente de energía, por la ecuación que se indica a continuación.
Unidades de pasteurización o PU se refiere a una medida cuantitativa de la pasteurización. Una unidad de pasteurización (1 PU) para cerveza se define como una retención de calor de un minuto a 60 grados Celsius Se calcula que: PU = t x 1.393 (T - 60), en donde: t = tiempo, en minutos, a la temperatura de pasteurización en el pasteurizador T = temperatura, en grados Celsius, en el pasteurizador [ (T -60) representa el exponente de (T-60)] La termoestabilidad se determinó en cerveza Pilsner común desgasificada (Royal Export Pilsner), pH de 4.5, para las variantes TrGA. Los datos se calculan como % de actividad relativa de la siguiente manera: GAU residual - blanco - — - x100% GAU_inicial - blanco Análisis de la elaboración de cerveza con determinación del grado real de fermentación (RDF) Análisis de cerveza de malta pura Se disolvió 340 g de extracto de malta de Munton en 1500 mi de agua caliente. A esta suspensión acuosa se agregó 5 pelotillas de lúpulo amargo de Hopfenveredlung, St. Johann: Contenido alfa de 16.0 % (análisis específico de HPLC, método EBC 7.7 0), el pH se ajustó a 5.2 con H2SO4 y se hirvió durante 1 hora antes de introducirse en un autoclave a 121 °C durante 15 minutos con el fin de destruir la actividad residual de glucoamilasa y la contaminación microbiana. Al final de la maceración, el macerado se enfrió, se completó a 350 g y se filtró. Se midieron los volúmenes del filtrado después de 30 minutos, y se tomaron muestras del mosto filtrado para determinar la gravedad específica. El mosto final tuvo una gravedad específica de 1058.6 (es decir 14.41 °Plato). Se agregó 60 mi del mosto a cada matraz de 100 i (recipiente de fermentación; FV), y se enfrió a 18 °C. Las enzimas se dosificaron en una cantidad similar de proteína (0.058 mg GA/ml de mosto) o actividad b-D-maltósido similar (0.16 GAU/ml de mosto).
Se hicieron las siguientes adiciones en los matraces: Los matraces de control negativo recibieron 2 mi de agua estéril; los matraces de control positivo recibieron 2 mi de DIAZYME® X4 diluida (glucoamilasa concentrada derivada de una cepa de Aspergillus niger) suministrada por Genencor International; 2 mi de caldo de fermentación filtrado diluido de la glucoamilasa de tipo silvestre de Trichorderma reesei (TrGA de WT); y 2 mi de caldo de fermentación filtrado diluido de la variante CS4 de glucoamilasa de Trichorderma reesei (TrGA CS4).
Matrices de prueba recibidos: 2 mi de 3.5 mg ® de una dilución de 2 mi de las variantes de glucoamilasa termolábil, equivalente a la misma concentración de adición, en términos de cantidad (mg) de glucoamilasa agregada por hl de mosto con añadido de levadura, como la usada para la DIAZYME® X4 en el control positivo.
Cada matraz cónico se dosificó con levadura W34/70 (Weihenstephan) producida en el momento a una concentración de dosis de 0.6 g por 100 mi de mosto; se dejó que la fermentación continuara en condiciones de prueba estandarizadas de laboratorio (una temperatura elevada de 18.5 °C, con agitación moderada de 150 rpm, en un incubador orbital por un tiempo de hasta 88 horas). Se analizó cada matraz a intervalos programados con respecto a la pérdida de peso y la gravedad específica, y se calculó el grado real de fermentación (RDF, que es la atenuación real expresada en forma de porcentaje) para el mosto fermentado final (cerveza). La gravedad específica del mosto antes, durante y después de la fermentación se determinó mediante el uso de un hidrómetro para gravedad específica o un densitómetro Anton-Paar (p. ej., DMA 4100 M) y se calculó la atenuación real y se expresó en forma de porcentaje como RDF de conformidad con las fórmulas presentadas por Ensminger (ver http://hbd.org/ensmingr/ "Beer data: Alcohol, Calorie, and Attenuation Levels of Beer"). Controlar la pérdida de peso durante la fermentación proporciona una medida indirecta de la evolución del C02 y, por lo tanto, de la formación de etanol.
La actividad residual se midió antes y después de la fermentación. La producción de etanol se determinó indirectamente por la pérdida de peso de los fermentos. El alcohol se midió en un Anton-Paar Análisis de elaboración de cerveza con adjuntos y malta Se empleó una maceración por decocción modificada mediante el uso de molienda de maíz como adjunto. El protocolo de fabricación de cerveza se modificó a partir de la patente de los EE. UU. núm. 2009014247. Cuarenta por ciento (40 %) de la malta se sustituyó con molienda de maíz con un contenido de humedad de 12.6 % (Benntag Nordic; Nordgetreide GmBH Lübec, Alemania). Toda la molienda de maíz se calentó a 100 °C a 2 °C /min, junto con 54 % del agua y 5 % de la malta (malta Pilsner muy modificada; Fuglsang, Dinamarca). Se hicieron descansos de 5 in a 72 °C y 80 °C y se hizo un descanso de 10 min a 100 °C. Después, el adjunto se enfrió a 64 °C y se combinó con el macerado principal, también a 64 °C. Las enzimas se agregaron en esta etapa, y el descanso a 64 °C se extendió a 250 min. Después de la fermentación, se determinaron los valores de RDF.
El valor del grado real de fermentación (RDF) puede calcularse de acuerdo con la siguiente ecuación: en donde: RE = extracto real = (0.1808 x °Piniciai) + (0.8192 x °Pfinai), °Piniciai es la gravedad específica de los mostos estandarizados antes de la fermentación y °Pfinai es la gravedad específica de los mostos fermentados expresada en grados Plato.
En el presente contexto, el grado real de fermentación (RDF) se determinó a partir de la gravedad específica y la concentración de alcohol.
Se determinó la gravedad específica y la concentración de alcohol en los fermentos con un medidor Beer Alcolyzer Plus y un densitómetro DMA 5000 (ambos de Antón Paar, Gratz, Austria). Tomando como base estas mediciones, el valor del grado real de fermentación (RDF) se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: OE — E { r) RDF (%) = xlOO OE en donde: E(r) es el extracto real en grados Plato (°P), y OE es el extracto original en °P.
Ejemplo 1. Construcción de variantes TrGA en el vector pTTT para expresión en Trichoderma reesei Secuencias de ADNc optimizadas de Hypocrea j ecorina (anamorfo Trichoderma reesei) (sec. con núm. de ident.: 30 y sec. con núm. de ident.:31) que codifican la TrGA de tipo silvestre y la variante CS4 de TrGA, (sec. con núm. de ident.:2 y sec. con núm. de ident.:13) se clonaron en pDONR™201 por vía de la reacción de recombinación BP de Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para producir el vector de entrada pEntry-CS4 y pEntry-GA (Figura 1) como se describe en la solicitud de patente de los EE. UU. núm.
US20110020899, la solicitud de patente de los EE. UU. núm. US 20110014681. Para permitir la expresión de la proteína en H. jecorina, la secuencia codificante de la TrGA CS4/GA WT se clonó en los vectores de destino compatibles de Gateway pTTT-pyrG13 o pTTT-pyr2 por medio de la reacción de recombinación LR de Gateway®.
El vector pTTT-pyrG13 se describe en la patente W02010141779A1. Este vector contiene las regiones del terminador y promotor derivadas de cbhl de T. reesei que permiten una fuerte expresión inducible de un gen de interés, el marcador de selección de amdS y pyrG de Aspergillus nidulans que confiere crecimiento de transformantes en acetamida como única fuente de nitrógeno en ausencia de uridina, y las regiones de telómeros de T. reesei que permiten el mantenimiento de un plásmido no cromosómico en una célula fúngica. Las regiones del terminador y promotor de cbhl están separadas por el gen de resistencia a cloranfenicol, CmR, y el gen letal de E. coli , ccdB, flanqueados por los sitios de recombinación específicos del bacteriófago lambda attRl, attR2. Esta configuración permite la selección directa de recombinantes que contienen el gen de TrGA bajo el control de los elementos reguladores de cbhl en la orientación correcta por vía de la reacción de recombinación LR de Gateway®. El vector de destino pTTT-pyr2 es un derivado de pTTT-pyrG13, en donde pyrG se reemplazó con el gen pyr2 de H. jecorina que confiere una capacidad auxótrofa para uridina a H. jecorina para crecer en ausencia de uridina. Los vectores finales de expresión pTTT-pyrG13-GACS4 y pTTTpyr2-GACS4 se muestran en la Figura 2.
Los plásmidos pEntry-CS4 y pEntry-GA WT se usaron como plantilla para mutagénesis combinatoria construidos por BASEClear (Leiden, Países Bajos). Se solicitó al proveedor la generación de variantes únicas y combinatorias específicas en la TrGA WT madura (sec. con núm. de ident.2) y la variante TrGA CS4 madura (sec. con núm. de ident.13) como se muestra en la Tabla 1. La variante TrGA -CS4 incluye las siguientes mutaciones L417V-T430A-Q511H-A539R-N563I en comparación con la TrGA (WT).
Tabla 1. Mutaciones en TrGA (WT) y variantes TrGA - CS4 iemplo 2. Transformación de variantes TrGA en Trichoderma reesei Las variantes de TrGA se transformaron en T. reesei mediante el uso de un metodo de protoplastos con PEG. Los ADN plasmídicos confirmados por análisis de secuencias fueron proporcionados por BASEClear (Leiden, Países Bajos) y se transformaron individualmente en una Cepa hospedera de T. reesei derivada de RL-P37 que contiene cuatro supresiones de genes ( Acbhl , Acbh2 , Aegll , Aegl2, es decir, "de cuatro supresiones"; ver la patente de los EE. UU. núm.5,847,276, la patente núm. WO 92/06184 y la patente núm. WO 05/001036) mediante el uso del método de protoplastos con PEG (Penttilá et al. (1987) Gene 61:155-164) con las siguientes modificaciones.
Para la preparación de protoplastos, se cultivaron esporas durante 16-24 horas a 24 °C en medio mínimo (MM) de Trichoderma (20 g/1 de glucosa, 15 g/1 de KH2P04, pH de 4.5, 5 g/1 de (NH4)2SO4, 0.6 g/1 de MgS04x7H2O, 0.6 g/1 de CaCl2x2H20, 1 mi de 1000 de solución de elementos traza de T. reesei {5 g/1 de FeS04x7H20, 1.4 g/1 de ZnS04x7H20, 1.6 g/1 de MnS04xH0, 3.7 g/1 de CoCl2x6H20 }) con agitación a 150 rpm. Las esporas en germinación se recolectaron por centrifugación y se trataron con solución de 15 mg/ml de b-D-glucanasa-G (Interspex - Art. núm. 0439-1) para lisar las paredes de las células fúngicas. Se realizó otra preparación de protoplastos por un método estándar, como se describe en Penttilá et al. (1987 supra) .
El método de transformación se redujo 10 veces. Generalmente, las mezclas de transformación que contienen hasta 600 ng de ADN y 1-5 105 de protoplastos en un volumen total de 25 ml se trataron con 200 mi de solución de PEG al 25 %, se diluyeron con 2 volúmenes de solución de sorbitol 1.2 M, se mezclaron con 3 % de MM selectivo top-agarosa con acetamida (el mismo medio mínimo como se mencionó anteriormente, pero el (NH4)2SO4 se sustituyó con 20 mM de acetamida) y se vertió sobre medios selectivos de agarosa al 2 % con acetamida ya sea en placas de microtitulación de 24 pocilios o en una bandeja Q de 20 '20 cm dividida en 48 pocilios. Las placas se incubaron a 28 °C por 5-8 días. Las esporas de la población total de transformantes regeneradas en cada pocilio individual se recolectaron de las placas mediante el uso de una solución de 0.85 % de NaCl, Tween 80 al 0.015 %. Las suspensiones de esporas se usaron para inocular fermentaciones en las MTP de 96 pocilios. En el caso de las MTP de 24 pocilios, se introdujo una etapa adicional de siembra en placas en una MTP nueva de 24 pocilios con MM selectivo de acetamida con el fin de enriquecer la cantidad de esporas.
Ejemplo 3. Análisis de actividad enzimática en el caldo de fermentación de variantes de glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA).
Los transformantes se fermentaron, como se describió anteriormente en la Sección de ensayos y métodos, y los sobrenadantes que contenían las proteínas TrGA variantes expresadas se sometieron a prueba para determinar varias propiedades.
Brevemente, se eliminó el micelio de las muestras de cultivo por centrifugación, y se analizó el sobrenadante para determinar el contenido total de proteínas (kit de ensayos de proteínas BCA, núm. de catálogo Pierce 23225) y actividad GA, como se describió anteriormente en la sección Ensayos y métodos.
El perfil de proteínas de las muestras de caldos de cultivo enteras se determinó por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (electroforesis SDS-PAGE). Las muestras del sobrenadante del cultivo se mezclaron con un volumen igual de 5 de amortiguador de carga de muestras con agente reductor, se hirvieron durante 10 minutos y se separaron sobre 4-12 % de gel Bis-Tris NUPAGE® Novex con el amortiguador MES SDS Running (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las bandas de polipéptidos se visualizaron en el gel de SDS con SIMPLYBLUE SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de conformidad con el protocolo del fabricante. Como se ilustra en la Figura 3, 4 y 5, se analizó el caldo de fermentación de las variantes de Trichoderma reesei de la cadena principal de la TrGA (WT) y la TrGA -CS4 (CS4 que incluye L417V-T430A-Q511H-A539R-N563I en comparación con la TrGA (WT)). Se determinó la actividad glucoamilasa del caldo de fermentación de las variantes de Trichorderma reesei y se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Actividad glucoamilasa del caldo de fermentación de las variantes de glucoamilasa de Trichorderma reesei - La actividad (GAU/ml) se determinó con un ensayo de pNP-b-maltósido y los resultados son un promedio de las tres mediciones. 10 OJ un El caldo de fermentación de la mayoría de las variantes de Trichoderma reesei mostró una banda intensa de proteínas en el tamaño de la glucoamilasa TrGA (WT) (64 kDa). Sin embargo, se observó una gran variación en los niveles de expresión de las diferentes variantes y, además, en la actividad GAU determinada entre caldos fermentados. Al comparar la actividad GAU total del caldo de fermentación con el contenido total de proteínas, se observó que la actividad específica aparente varió 52 veces de las variantes con la actividad específica más alta con respecto a una con la más baja. Por lo tanto, varias combinaciones de mutaciones que involucraban ciertos sitios fueron destructivas en términos de capacidad de expresión o actividad GAU y se dejaron fuera del análisis de la elaboración de cerveza.
El análisis de SDS-PAGE de las variantes R_C_1 y R_C_2 purificadas de la etapa de cromatografía con b-ciclodextrina se muestra en la Figura 5. Todas las variantes purificadas se desalaron en una columna PD-10 (GE Healthcare, núm. de catálogo 17-0851-01) equilibrada en 25 mM de acetato de sodio, pH de 4.3 (Sigma, 28705) para evitar cualquier inhibición de la a-ciclodextrina restante.
Ejemplo 4. Ensayo de termoestabilidad de variantes de glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA).
La estabilidad térmica se determinó de conformidad con el "ensayo de estabilidad térmica" descrito anteriormente.
Los resultados del ensayo de estabilidad térmica se muestran en la Tabla 3 con la actividad residual para las variantes, que se seleccionaron de un análisis inicial para expresión y fermentación a gran escala: CPS3-B01, CPS2-F07, CPS2-A12, CPS2-F05, CPS2-D11, CPS2-F09, CPS2-E08, R_A_1, R_A_2, R_A_6, R_A_7, R_C_1, R_C_2, R_C_5, R_C_7, R_C_12, R_C_13, R_C_22, R_D_2, R_D_3 y R_D_5. La molécula parental (TrGA -WT y TrGA - CS4) en las condiciones descritas mostró una actividad residual de 24 y 38 %, respectivamente, después de la pasteurización durante 100 segundos. Una glucoamilasa de Aspergillus niger, DIAZYME® X4, se incluyó como referencia y mostró una actividad residual de 45 % después de 100 segundos de incubación. El material usado fue proteína purificada y desalada (25 mM de acetato de sodio, pH de 4.3). La actividad residual se calculó con base en la actividad GAU (sustrato de pNP-b-maltósido) antes y después de incrementar (hasta 100 segundos) la incubación en cerveza Pilsner común desgasificada (Royal Export Pilsner), pH de 4.5 a 72 °C. La actividad residual se muestra como una función del tiempo de incubación: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 70 y 100 s y unidades de pasteurización correspondientes: 0.0, 0.0, 0.0, 0.2, 1.6, 4.0, 16.8 y 42.6 PU. La selección de variantes pertinentes para la aplicación del FV se definió como el conjunto de variantes completamente inactivadas por 16.8 PU. Esto dejó las siguientes 14 variantes de interés: CPS3-B01, CPS2-F07, CPS2-A12, CPS2-F05, CPS2-D11, R_A_1, R_A_6, R_C_1, R_C_2, R_C_5, R_C_7, R_C_13, y R_C_22.
Puede usarse una PU mínima diferente en función del tipo de cerveza, las materias primas y la contaminación microbiana, el fabricante, y el efecto percibido en el sabor de la cerveza. Típicamente, para la pasteurización de la cerveza se requieren 14 - 16 PU. Dependiendo del equipo de pasteurización, las temperaturas de pasteurización están, típicamente, en el intervalo de 64 - 72 grados Celsius con un tiempo de pasteurización calculado consecuentemente. Puede encontrarse información adicional en "Technology Brewing and Malting" de Wolfgang Kunze del Research and Teaching Institute of Brewing, Berlín (VLB), 3.° edición completamente actualizada, 2004, ISBN 3-921690-49-8.
En comparación, se determinó la termoestabilidad para MkGA I, MkGA II, DIAZYME® X4 (AnGA), TrGA (WT) y TrGA-CS4 en cerveza Pilsner común desgasificada (Royal Export Pilsner), pH de 4.5, como se describió anteriormente. MkGA I, una glucoamilasa truncada que carece del SBD, se inactivó completamente con menos de 26 unidades de pasteurización (PU) al usar una temperatura de pasteurización de 72 °C (previamente descrito en la patente núm. EP 12151285.9), MkGA II requirió 100 PU, y AnGA y TrGA necesitaron más de 200 PU para inactivarse.
Tabla 3. Actividad residual de glucoamilasa determinada después de la pasteurización a 72 °C en cerveza Pilsner común con varios tiempos/PU. Los resultados son un promedio de tres mediciones. o co 15 Ejemplo 5. Uso de variantes de glucoamilasa de Trichoderma reesei del caldo de fermentación en la etapa de fermentación de la fabricación de cerveza Análisis de elaboración de la cerveza: El uso de la glucoamilasa de M. kaoliang para sacarificar los carbohidratos del mosto y apoyar la fermentación de etanol se comparó con la DIAZYME® X4 que comprende una glucoamilasa de Aspergillus niger (AnGA), la glucoamilasa de tipo silvestre de Trichorderma reesei (TrGA WT), la variante CS4 de glucoamilasa de Trichorderma reesei (TrGA CS4) y dos glucoamilasas de Monascus kaoling (MkGAI y MkGAII) previamente investigadas para aplicación en la fabricación de cerveza (patente EP 12151285.9). Las pruebas de fermentación se realizaron con un mosto preparado a partir de extracto de malta de Munton como se describe en la sección Ensayos y métodos.
La gravedad específica del mosto antes, durante y después de la fermentación se determinó mediante el uso de un hidrómetro para gravedad específica o un densitómetro Anton-Paar (p. ej., DMA 4100 M) y se calculó la atenuación real y se expresó en forma de porcentaje como RDF de conformidad con las fórmulas presentadas por Ensminger (ver http://hbd.org/ensmingr/ "Beer data: Alcohol, Calorie, and Attenuation Levels of Beer"). Los valores de RDF obtenidos cuando la enzima se dosifica en mg de proteínas (0.058 mg de GA/ml de mosto) se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Valores de RDF determinados para las GA listadas (proteínas purificadas) aplicados al FV a una concentración similar (0.058 mg de GA/ml de mosto). Los resultados son un promedio de dos mediciones ± error estándar. 5 10 15 15 Varias variantes mostraron rendimiento similar a las referencias (TrGA (WT), TrGA (CS4) y Diaxyme®X4) dentro del error estándar; sin embargo, se observaron, además, diferencias significativas para algunas de las variantes combinatorias. Notablemente, varias variantes combinatorias muestran un rendimiento marcadamente disminuido (% disminuido de RDF), el cual puede atribuirse a un cambio en la especificidad del sustrato ya que su rendimiento disminuyó, además, en la dosificación de actividad GAU (CPS3 B01, CPS2 E08, CPS2 F09, R_A_2, R_A_7, R_C_2, R_C_5, R_C_7 y R_C_12). Las 9 GA restantes (CPS2-A12, CPS2-F05, CPS2-D11, CPS2-F07, R_A_1, R_A_6, R_C_1, R_C_13 y R_C_22) produjeron valores de RDF comparables/similares a los obtenidos en las referencias (TrGA WT, TrGA CS4 y Diaxyme®X4). Ninguna de las variantes combinatorias analizadas incrementó significativamente el valor de RDF en comparación con el RDF obtenido por las referencias (TrGA (WT), TrGA -CS4 y Diaxyme®X4) y, además, las glucoamilasas de Monascus kaoliang (MkGAI y MkGAll). La selección de variantes pertinentes para la aplicación del FV se definió como el conjunto de variantes que produce un valor de RDF mínimo de 74.5, cuando se dosifican a 0.058 mg de GA/ml de mosto. Esto deja las siguientes 9 variantes de interés: CPS2-A12, CPS2-F05, CPS2-D11, CPS2-F07, R_A_1, R_A_6, R_C_1, R_C_13 y R_C_22.
Este conjunto de 9 variantes que fueron funcionales en el FV fueron todas interesantes en términos de termolabilidad de conformidad con el "ensayo de estabilidad térmica", como se describió anteriormente. Cada variante puede inactivarse completamente con 16.8 PU y produce un valor de RDF mínimo de 74.5, cuando se dosifica a 0.058 mg de GA/ml de mosto en el FV en el conjunto dado de condiciones.
Estas 9 variantes fueron las que se denominaron aciertos ganadores en el análisis por rendimiento de sacarificación y termolabilidad.
Las solicitudes mencionadas anteriormente, y todos los documentos citados en ellas o durante su procesamiento ("documentos citados en la solicitud") y todos los documentos citados o referenciados en los documentos citados en la solicitud, y todos los documentos citados o referenciados en la presente descripción ("documentos citados en la presente descripción"), y todos los documentos citados o referenciados en los documentos citados en la presente descripción, junto con las instrucciones, descripciones, especificaciones de producto y hojas de producto del fabricante para cualquier producto mencionado en la presente descripción o en cualquier documento incorporado en la presente descripción como referencia, se incorporan por este medio en la presente descripción como referencia, y pueden emplearse en la práctica de la invención.
Varias modificaciones y variaciones de las modalidades descritas resultarán evidentes para aquellos con experiencia en la materia sin apartarse del alcance y espíritu de las modalidades. Se comprenderá que el tema de la invención como se reivindica no debe limitarse indebidamente a las modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo las modalidades que son obvias para los experimentados en la materia pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una variante de glucoamilasa caracterizada porque comprende una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de la interfase, que consisten en los residuos 502, 29, 43, 48 y 116 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 98, 97, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental, caracterizada porque la variante de la glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
2. La variante de glucoamilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental y, opcionalmente, una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos de la interfase que consiste en los residuos 29, 43, 48, y 116 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental y, opcionalmente, una o dos sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos 97, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; cuya variante de glucoamilasa tiene una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos de la interfase o del grupo de residuos de aminoácidos de núcleo catalítico; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
3. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque comprende: a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental, b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 48 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental, o una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 147 de la sec. con núm. de ident.: 2 o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
4. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque comprende: a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 147 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
5. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque comprende: a) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 502 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; b) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 98 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; y c) una sustitución de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 48 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental; en donde la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
6. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque comprende la siguiente sustitución de aminoácidos H502S de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
7. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque comprende la siguiente sustitución de aminoácidos L98E de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
8. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque comprende la siguiente sustitución de aminoácidos Y48V de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
9. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque comprende la siguiente sustitución de aminoácidos Y147R de la sec. con núm. de ident.:2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
10. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque comprende la sustitución de aminoácidos H502S de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; la sustitución de aminoácidos L98E de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; y la sustitución de aminoácidos Y48V de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13, o la sustitución de aminoácidos Y147R de la sec. con núm. de ident.: 2 o 13; caracterizada porque la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
11. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque la glucoamilasa parental es la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
12. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque la glucoamilasa parental es la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
13. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque comprende además, una o dos sustituciones de aminoácidos en el grupo de los aminoácidos de la interfase que consisten en los residuos 24, 26, 27, 30, 40, 42, 44, 46, 49, 110, 111, 112, 114, 117, 118, 119, 500, 504, 534, 536, 537, 539, 541, 542, 543, 544, 546, 547, 548, 580, 583, 585, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594 y 596 de la sec. con núm. de ident.:2 o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
14. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada porque comprende además, una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en el grupo de aminoácidos de núcleo catalítico que consisten en los residuos en las posiciones 1 a 484 con excepción de la posición 24, 26, 27, 29, 30, 40, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 97, 98, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 147, 175, 483 y 484 de la sec. con núm. de ident.: 2, o una posición equivalente en una glucoamilasa parental.
15. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque la variante de glucoamilasa exhibe un valor de RDF de al menos 74.5 %.
16. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque la variante de glucoamilasa tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 1, 2, 13, 18, 19, 20, 21 o 22.
17. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque la variante de glucoamilasa tiene al menos 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos 85 %, 90 %, 95 % o 99.5 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 2 o 13.
18. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque la variante de glucoamilasa exhibe termoestabilidad disminuida en comparación con la glucoamilasa parental.
19. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada porque la variante de glucoamilasa se inactiva por pasteurización, tal como al usar menos de 16.8, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 unidades de pasteurización (PU) en cerveza.
20. La variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque consiste en la sec. con núm. de ident.: 14, 15 o 17.
21. Un método para producir una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque comprende las etapas de inducir la síntesis de la variante de glucoamilasa en una célula hospedera que tiene expresión heteróloga de esa variante de glucoamilasa y, opcionalmente, purificar la variante de glucoamilasa.
22. Una composición caracterizada porque comprende una o más variantes de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, tal como una composición enzimática para fermentación de alcohol, cuya composición comprende, opcionalmente, una o más enzimas adicionales seléccionadas entre alfa amilasa, beta amilasa, peptidasa (p. ej., proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endoglucanasa y enzimas hidrolíticas auxiliares relacionadas con betaglucanos, xilanasa y enzimas auxiliares xilanasa (p. ej., arabinofuranosidasa, esterasa del ácido ferúlico, acetil xilano esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluida cualquier combinación de estas.
23. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, o una composición de conformidad con la reivindicación 22, en una fermentación, en donde la variante de glucoamilasa o la composición se agrega antes de o durante una etapa de fermentación, donde a la etapa de fermentación le sigue, opcionalmente, una etapa de pasteurización, tal como la fermentación está comprendida en un proceso para fabricar una bebida fermentada.
24. Un método caracterizado porque comprende agregar una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, o una composición de conformidad con la reivindicación 22, antes de o durante la etapa de fermentación seguida, opcionalmente, por una etapa de pasteurización.
25. Un método para la producción de una bebida fermentada, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) preparar un macerado, b) filtrar el macerado para obtener un mosto, y c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, en donde una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, o una composición de conformidad con la reivindicación 22, se agrega al: i. macerado de la etapa (a) y/o ii.el mosto de la etapa (b) y/o iii.el mosto de la etapa (c).
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