CN102712915B - 具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体 - Google Patents

Abstract

本发明提供显示出改变特性，例如改良的热稳定性和/或比活，的变体葡糖淀粉酶。还公开编码该变体的DNA序列、整合了该DNA序列的载体和宿主细胞、酶组合物、以及在各种应用中使用变体的方法。

Description

具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体

优先权

本申请要求2009年8月19日递交的美国临时申请系列号61/235,140的优先权，就其全部内容通过参考引用并入本文。

序列表

本文附有序列表，包括SEQ ID NOs：1-1097，就其全部内容通过参考引用并入此处。

发明领域

本发明公开了亲本葡糖淀粉酶的组合变体，其具有改变的特性，适用于淀粉水解组合物和清洁组合物。本发明也公开了编码该变体的DNA构建体和用于在宿主细胞内生产葡糖淀粉酶变体的方法。

发明背景

葡糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是淀粉水解外切糖酶，其催化从淀粉或相关的寡糖或多糖分子的非还原末端移去相继的葡萄糖单元。葡糖淀粉酶能够水解淀粉(例如，直链淀粉和支链淀粉)的直链和支链葡糖苷键。

多种细菌菌株、真菌、酵母和植物都产生葡糖淀粉酶。特别令人感兴趣和在商业上重要的是，葡糖淀粉酶是在细胞外产生的真菌酶，例如来自以下属的菌株：曲霉属(Aspergillus)(Svensson等，Carlsberg Res.Commun.48：529-544(1983)；Boel等，EMBO J.3：1097-1102(1984)；Hayashida等，Agric.Biol.Chem.53：923-929(1989)；美国专利号5,024,941；美国专利号4,794,175和WO 88/09795)；篮状菌属(Talaromyces)(美国专利号4,247,637；美国专利号6,255,084；和美国专利号6,620,924)；根霉属(Rhizopus)(Ashikari等，Agric.Biol.Chem.50：957-964(1986)；Ashikari等，App.Microbio.Biotech.32：129-133(1989)和美国专利号4,863,864)；腐质霉属(Humicola)(WO 05/052148和美国专利号4,618,579)；以及毛霉属(Mucor)(Houghton-Larsen等，Appl.Microbiol.Biotechnol.62：210-217(2003))。许多编码这些酶的基因已经被克隆，并在酵母、真菌和/或细菌细胞中表达。

在商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，已在许多需要淀粉水解的用途中使用(例如，用于从淀粉生产葡萄糖或其它单糖)。葡糖淀粉酶可以用于生产高果糖的玉米甜味剂，高果糖玉米甜味剂占据超过50％的美国甜味剂市场。通常，在淀粉水解过程中，葡糖淀粉酶可以且通常与α-淀粉酶一起使用，以将淀粉水解为糊精，再水解为葡萄糖。然后，葡萄糖可以被其它酶(例如，葡萄糖异构酶)转化为果糖；结晶；或用于发酵以生产许多终产物(例如，乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、抗坏血酸中间体、谷氨酸、甘油和1，3-丙二醇)。使用葡糖淀粉酶在含淀粉和/或纤维素的物质的发酵中生产的乙醇可以用作燃料的来源或用于醇消费。

尽管葡糖淀粉酶已经被成功用于商业应用许多年了，但仍然需要具有改变的特性(例如改良的比活和增加的热稳定性)的新型葡糖淀粉酶。

发明概述

本文涉及的葡糖淀粉酶变体在催化结构域和/或淀粉结合结构域内包含氨基酸取代。变体显示出改变的特性，例如改良的热稳定性和/或增加的比活。

在一方面，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中的如下位置上或在亲本葡糖淀粉酶中的等价位置上包含一个或多个取代：

10，14，15，23，42，43，44，59，60，61，65，67，68，72，73，97，98，99，102，110，113，114，133，140，144，145，147，152，153，164，182，204，205，214，216，219，228，229，230，231，236，239，241，242，263，264，265，268，269，276，284，291，294，300，301，303，311，338，342，344，346，349，359，361，364，375，379，382，390，391，393，394，410，417，418，430，431，433，436，442，444，448，451，493，494，495，502，503，508，511，518，519，520，527，531，535，536，537，539，563，或577。

该一个或多个氨基酸取代可以是：

T10，L14，N15，P23，T42，I43，D44，P45，D46，F59，K60，N61，T67，E68，A72，G73，S97，L98，A99，S102，K108，E110，L113，K114，R122，Q124，R125，I133，K140，N144，N145，Y147，S152，N153，N164，F175，N182，A204，T205，S214，V216，Q219，W228，V229，S230，S231，D236，1239，N240，T241，N242，G244，N263，L264，G265，A268，G269，D276，V284，S291，G294，P300，A301，A303，Y310，A311，D313，Y316，V338，T342，S344，T346，A349，V359，G361，A364，T375，N379，S382，S390，E391，A393，K394，R408，S410，S415，L417，H418，T430，A431，R433，I436，A442，N443，S444，T448，S451，T493，P494，T495，H502，E503，Q508，Q511，N518，A519，A520，T527，V531，A535，V536，N537，A539，N563，和N577。

在再一方面，该一个或多个氨基酸取代可以是：

T10S，T42V，I43Q/R，D44R/C，N61I，T67M，E68C/M，A72Y，G73F/W，S97N，S102A/M/R，K114M/Q，I133T/V，N145I，N153A/D/E/M/S/V，T205Q，Q219S，W228A/F/H/M/V，V229I/L，S230C/F/G/L/N/Q/R，S231L/V，D236R，I239V/Y，N263P，L264D/K，A268C/D/G/K，S291A/F/H/M/T，G294C，A301P/R，V338I/N/Q，T342V，S344M/P/Q/R/V，G361D/E/F/I/L/M/P/S/W/Y，A364D/E/F/G/K/L/M/R/S/T/V/W，T375N，K394S，L417K/R/V，T430A/K，A431I/L/Q，R433C/E/G/L/N/S/V/Y，I436H，T451K，T495K/M/S，E503A/C/V，Q508R，Q511H，A519I/K/R/Y，A520C/L/P，V531L，A535K/N/P/R，V536M，A539E/R/S，N563C/E/I/K/K/Q/T/V，或N577K/P/R.

在另一方面，葡糖淀粉酶变体包含两个或更多个氨基酸取代，对应于SEQ ID NO：2的位置：43，44，61，73，294，417，430，431，503，511，535，539或563位，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。该两个或更多个氨基酸取代可以是：I43Q/R，D44R/C，N61I，G73F，G294C，L417R/V，T430A/M，A431L/Q，E503A/V，Q511H，A535R，A539R，和/或N563I/K。在另一方面，葡糖淀粉酶变体可以还包含对应于如下位置的一个或多个氨基酸取代，所述位置为：SEQ ID NO：2的位置

10，14，15，23，42，59，60，65，67，68，72，97，98，99，102，110，113，114，133，140，144，145，147，152，153，164，182，204，205，214，216，219，228，229，230，231，236，239，241，242，263，264，265，268，269，276，284，291，300，301，303，311，338，342，344，346，349，359，361，364，375，379，382，390，391，393，394，410，418，433，436，442，444，448，451，493，494，495，502，508，518，519，520，527，531，536，537，或577，

或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。该一个或多个额外的氨基酸取代可以是：

T10S，T42V，T67M，E68C/M，A72Y，S97N，S102A/M/R，K114M/Q，I133T/V，N145I，N153A/D/E/M/S/V，T205Q，Q219S，W228A/F/H/M/V，V229I/L，S230C/F/G/L/N/Q/R，S231L/V，D236R，I239V/Y，N263P，L264D/K，A268C/D/G/K，S291A/F/H/M/T，A301P/R，V338I/N/Q，T342V，S344M/P/Q/R/V，G361D/E/F/I/L/M/P/S/W/Y，A364D/E/F/G/K/L/M/R/S/T/V/W，T375N，K394S，R433C/E/G/L/N/S/V/Y，I436H，T451K，T495K/M/S，Q508R，A519I/K/R/Y，A520C/L/P，V531L，V536M，或N577K/P/R.

在其他方面，葡糖淀粉酶变体包含对应于如下位置的氨基酸取代：SEQ ID NO：2的(a)61，417，431和539位，(b)43，417，431，535和539位；或(c)73，503和563位，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。氨基酸取代可以是：(a)N61I，L417G/R/V，A431L/Q和A539R；(2)I43Q/R，L417G/R/V，A431L/Q，A535R和A539R；或(3)G73F，E503V和N563K。

葡糖淀粉酶变体可以于SEQ ID NO：2的相关位置、或于亲本葡糖淀粉酶中的等价位置包含以下取代组之一：

N61I/L417V/A431L/A539R；

I43Q/N61I/L417V/A431L/A539R；

N61I/L417V/A431L/A535R/A539R

I43Q/L417V/A431L/A535R/A539R；

I43Q/N61I/L417V/A431L/A535R/A539R；

I43Q/N61I/L417V/T430A/A431L/A535R/A539R；

I43Q/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；

N61I/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；

I43Q/N61I/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；

I43R/N61I/L417V/A431L/A539R；

I43R/N61I/L417V/T430A/A431L/A535R/A539R；

G73F/L417R/E503V/A539R/N563K；

I43R/G73F/L417R/E503V/A539R/N563K；和

I43R/G73F/E503V/Q511H/N563K.

葡糖淀粉酶变体可以包含一个或多个额外的氨基酸取代，所述取代对应于SEQ ID NO：2的第43，44，61，73，294，430，503，511，535或563位，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。该一个或多个额外的氨基酸取代可以是：I43Q/R，D44C/R，N61I，G73F，G294C，T430A/M，E503A/V，Q511H，A535R或N563I/K。葡糖淀粉酶变体可以包含一个或多个额外的氨基酸取代，所述取代对应于SEQ ID NO：2的位置10，14，15，23，42，59，60，65，67，68，72，97，98，99，102，110，113，114，133，140，144，145，147，152，153，164，182，204，205，214，216，219，228，229，230，231，236，239，241，242，263，264，265，268，269，276，284，291，300，301，303，311，338，342，344，346，349，359，361，364，375，379，382，390，391，393，394，410，418，433，436，442，444，448，451，493，494，495，502，508，518，519，520，527，531，536，537或577，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。该一个或多个额外的氨基酸取代可以是：T10S，T42V，T67M，E68C/M，A72Y，S97N，S102A/M/R，K114M/Q，I133T/V，N145I，N153A/D/E/M/S/V，T205Q，Q219S，W228A/F/H/M/V，V229I/L，S230C/F/G/L/N/Q/R，S231L/V，D236R，I239V/Y，N263P，L264D/K，A268C/D/G/K，S291A/F/H/M/T，A301P/R，V338I/N/Q，T342V，S344M/P/Q/R/V，G361D/E/F/I/L/M/P/S/W/Y，A364D/E/F/G/K/L/M/R/S/T/V/W，T375N，K394S，R433C/E/G/L/N/S/V/Y，I436H，T451K，T495K/M/S，Q508R，A519I/K/R/Y，A520C/L/P，V531L，V536M，或N577K/P/R.

葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1或2或亲本葡糖淀粉酶具有至少80％，85％，90％，95％，99.5％的序列同一性。亲本葡糖淀粉酶或葡糖淀粉酶变体可以包含与SEQ ID NO：1，2，3，5，6，7，8或9具有至少80％，85％，90％，95％或99.5％的序列同一性的催化结构域。亲本葡糖淀粉酶或葡糖淀粉酶变体可以包含与SEQ ID NO：1，2，11，385，386，387，388，389或390具有至少95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的序列同一性的淀粉结合结构域。亲本葡糖淀粉酶可以包含SEQ ID：1或2。任选地，亲本葡糖淀粉酶可以由SEQ ID NO：1或2组成。亲本葡糖淀粉酶可以是来自木霉属的种(Trichoderma spp.)，曲霉属的种(Aspergillus spp.)，腐质霉属的种(Humicola spp.)，青霉属的种(Penicillium spp.)，篮状菌属的种(Talaromycese spp.)，或裂殖酵母属的种(Schizosaccharmyces spp.)之任一的酶。在一些方面，亲本葡糖淀粉酶可来自木霉属的种(Trichoderma spp.)或曲霉属的种(Aspergillus spp.)。

本发明还提供了葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体包含以下取代组之一，于SEQ ID NO：2的相关位置，或于亲本葡糖淀粉酶中的等价位置：

L417V/A431L/A539R；

I43Q/L417V/A431L/A539R；

L417V/A431L/A535R/A539R

I43R/L417V/A431L/A539R；

L417R/A431L/A539R；或

L417G/A431L/A539R；

其中与亲本葡糖淀粉酶相比较，葡糖淀粉酶变体不具有任何其它取代，并且其中亲本葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO：1，2，3，5，6，7，8或9有至少80％序列同一性的催化结构域。

亲本葡糖淀粉酶可以包含与SEQ ID NO：1，2，11，385，386，387，388，389或390具有至少95％的序列同一性的淀粉结合结构域。亲本葡糖淀粉酶可以与SEQ ID NO：1或2具有至少80％的序列同一性；例如，其可以包含SEQ ID NO：1或2。任选地，亲本葡糖淀粉酶可以由SEQ ID NO：1或2组成。

在一方面，与亲本葡糖淀粉酶相比较，变体葡糖淀粉酶显示出改变的热稳定性。改变的热稳定性可以是增加的热稳定性。可选地或此外，与亲本葡糖淀粉酶相比较，变体表现出改变的比活。改变的比活可以是增加的比活。

本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸。一方面是包含该多核苷酸的载体。另一方面是包含该载体的宿主细胞。另一方面是通过在适于葡糖淀粉酶变体表达和产生的条件下培养包含该多核苷酸的宿主细胞以及生产该变体来生产变体葡糖淀粉酶的方法。方法还可以包括从培养物回收葡糖淀粉酶变体的步骤。

本发明的另一方面是包含葡糖淀粉酶变体的酶组合物。在一方面，酶组合物用于淀粉转化工艺，例如醇发酵工艺或高果糖糖浆生产工艺。

附图简述

附图被整合进本说明书并组成本说明书的一部分，其对实施方案进行举例说明。在图中：

图1A描述了具有632个氨基酸(SEQ ID NO：1)的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)。信号肽以加下划线表示；催化区域(SEQ ID NO：3)以粗体表示，其开始于氨基酸残基SVDDFI(SEQ IDNO：12)，具有453个氨基酸残基；接头区域以斜体表示；淀粉结合结构域(SBD)以斜体和加下划线表示。TrGA的成熟蛋白质(SEQ ID NO：2)包括催化结构域(SEQ ID NO：3)、接头区域(SEQ ID NO：10)和淀粉结合结构域(SEQ ID NO：11)。对于TrGA葡糖淀粉酶分子的SBD编号，在本发明中参考：a)成熟TrGA的SEQ ID NO：2中的491至599位，和/或b)SEQ ID NO：11中的1至109位(其代表成熟TrGA的分离的SBD序列)。对于TrGA分子的催化结构域编号，参考SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3。图1B描述了编码TrGA的cDNA(SEQ ID NO：4)。图1C描述了前体和成熟蛋白质TrGA结构域。

图2描述了包含TrGA的cDNA(SEQ ID NO：4)的目的质粒(destination plasmid)pDONR-TrGA。

图3描述了质粒pTTT-Dest。

图4描述了最终表达载体pTTT-TrGA。

图5A和5B描述了亲本葡糖淀粉酶的催化结构域的比对比较，所述亲本葡糖淀粉酶来自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(AaGA)(SEQ ID NO：5)；黑曲霉(Aspergillus niger)(AnGA)(SEQ ID NO：6)；米曲霉(Aspergillusoryzae)(AoGA)(SEQ ID NO：7)；里氏木霉(Trichoderma reesei)(TrGA)(SEQ ID NO：3)；灰腐质霉(Humicola grisea)(HgGA)(SEQ ID NO：8)；和酒色肉座菌(Hypocrea vinosa)(HvGA)(SEQ ID NO：9)。相同的氨基酸以星号(^＊)表示。图5C描述了篮状菌属(Talaromycese)的葡糖淀粉酶(TeGA)成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：384)。图5D和5E描述了亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域(SBD)的比对比较，所述亲本葡糖淀粉酶来自里氏木霉(Trichoderma reesei)(SEQ ID NO：11)；灰腐质霉(Humicola grisea)(HgGA)(SEQ ID NO：385)；疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)(ThGA)(SEQ ID NO：386)；埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(TeGA)(SEQID NO：387)；黑曲霉(Aspergillus niger)(AnGA)(SEQ ID NO：388)；泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(AaGA)(SEQ ID NO：389)；和太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)(TtGA)(SEQ ID NO：390)。

图6描述了从侧面观察的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO：2)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(灰色)(SEQ ID NO：5)的三维结构的比较。所述侧面是参考活性位点来量度的，活性位点入口在分子的“顶部”。

图7描述了从顶部观察的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO：2)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(灰色)(SEQ ID NO：5)的三维结构的比较。

图8描述了从侧面观察的TrGA(SEQ ID NO：2)和AnGA(SEQ IDNO：6)的三维结构的比对，显示结合位点1和2。

图9描述了阿卡波糖与TrGA晶体结构结合的模型。

发明详述

葡糖淀粉酶是需要淀粉水解的多种应用中的商业上重要的酶。本文描述的葡糖淀粉酶变体在其催化结构域或淀粉结合结构域内包含氨基酸取代。变体可以显示出改变的特性，所述特性例如改良的热稳定性和/或比活。具有改良的热稳定性和/或比活的变体可以例如显著地提高从玉米淀粉生产葡萄糖和燃料乙醇的效率。

1.定义和缩写

1.1.定义

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的意思。Singleton等，D_ICTIONARY O_FM_ICROBIOLOGY A_ND M_OLECULAR B_IOLOGY，第2版，John Wiley和Sons，New York(1994)，以及Hale和Markham，THE H_ARPER C_OLLINSD_ICTIONARY O_F B_IOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)为技术人员提供了本文中使用的许多术语的一般含义。出于清楚和便于参考的原因，将一些术语定义如下。

如本文中使用的，术语“葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)”指催化从淀粉和相关的寡糖和多糖的非还原末端释放D-葡萄糖的酶。

术语“亲本”或“亲本序列”指在宿主细胞内原来存在的或天然存在的序列。亲本葡糖淀粉酶包括但不限于SEQ ID NOs：1，2，3，5，6，7，8和9中所示的葡糖淀粉酶序列，以及与SEQ ID NO：2具有80％的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。

如本文中使用的，“等价位置”意指，基于所讨论的亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列以及所讨论的亲本葡糖淀粉酶的三维结构分别与TrGA参照葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和三维结构的比对，两个亲本序列中共同的位置。因此，序列比对或结构比对可以用来确定等价性。

术语“TrGA”指具有SEQ ID NO：2中所示成熟蛋白质序列的亲本里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶序列，其包括具有SEQ ID NO：3中所示序列的催化结构域。TrGA的分离、克隆和表达描述于WO2006/060062和美国专利号7,413,887中，两者均通过引用整合到本文中。

在一些实施方案中，亲本序列指作为蛋白质工程起点的葡糖淀粉酶序列。本文中，葡糖淀粉酶氨基酸的编号基于葡糖淀粉酶与TrGA(SEQ ID NO：2和/或3)的序列比对。

词组“蛋白质或多肽的成熟形式”指蛋白质或多肽的最终功能形式。例如，葡糖淀粉酶的成熟形式可以缺乏信号肽。作为示例，TrGA的成熟形式包括催化结构域、接头区域和淀粉结合结构域，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

如本文中使用的，术语“葡糖淀粉酶变体”和“变体”用来指与亲本葡糖淀粉酶序列具有一定程度的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。变体与亲本序列相似，但在其氨基酸序列中具有至少一个取代、缺失或插入，从而使其在序列上与亲本葡糖淀粉酶不同。在某些情况下，变体已经被操作和/或改造以在其氨基酸序列中包括至少一个取代、缺失或插入，从而使其在序列上与亲本不同。此外，葡糖淀粉酶变体可以保留亲本葡糖淀粉酶的功能特征，例如，维持亲本葡糖淀粉酶的至少约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的葡糖淀粉酶活性。

当进行最佳比对来比较时，“变体”可以与亲本多肽序列具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体可以与亲本葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体可以与亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。序列同一性可以基于亲本或变体序列的总长来测定。

可以利用本领域已知的标准技术来确定序列同一性(见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)；例如Wisconsin Genetics Software Package(GeneticsComputer Group，Madison，WI)中的程序GAP、BESTHT、FASTA和TFASTA等；以及Devereux等，Nucleic Acid Res.，12：387-395(1984))。

“百分比(％)核酸序列同一性”或“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为，在候选序列中与起始序列(例如，PS4)的核苷酸残基或氨基酸残基相同的核苷酸残基或氨基酸残基的百分比。序列同一性可以基于起始序列的总长来测定。

在本文中，“序列同一性”通过序列比对方法来确定。为了本发明的目的，比对方法可以是Altschul等描述的BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(见Altschul等，Meth.Enzymol.266：460-480(1996))。WU-BLAST-2利用了几个搜索参数，其中大部分都可以设定为默认值。可调节的参数可以设定为如下值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，其由程序本身根据具有序列的组成和搜索目的序列所用的特定数据库的组成来确定。然而，可以对该值进行调节以增加灵敏度。百分比(％)氨基酸序列同一性值是由匹配的相同残基的数除以比对区域内“较长的”序列的残基总数来确定的。“较长的”序列是在比对区域内具有最多实际残基的序列(忽略为了使比对分数最大化而由WU-Blast-2引入的空位)。

术语“最佳比对”指产生最高百分比同一性分数的比对。

如本文中使用的，术语“催化结构域”指多肽的结构区域，其包含用于底物水解的活性位点。

术语“接头”指通常具有3至40个氨基酸残基的短氨基酸序列，其使包含淀粉结合结构域的氨基酸序列与包含催化结构域的氨基酸序列共价连接。

术语“淀粉结合结构域”指优先地与淀粉底物结合的氨基酸序列。

如本文中使用的，术语“突变序列”和“突变基因”可互换使用，其指宿主细胞的亲本序列中的至少一个密码子发生了改变的多核苷酸序列。突变序列的表达产物是变体蛋白质，所述变体蛋白质与亲本相比较具有改变的氨基酸序列。表达产物可以具有改变的功能能力(例如，增加的酶活性)。

如本文中使用的，涉及多肽时，术语“特性”或其语法等同物指多肽的可以进行选择或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于，氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、K_M、K_CAT、K_CAT/K_M比值、蛋白质折叠、结合底物的能力和被分泌的能力。

如本文中使用的，涉及核酸时，术语“特性”或其语法等同物指核酸的可以进行选择或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于，影响基因转录的特性(例如，启动子强度或启动子识别)，影响RNA加工的特性(例如，RNA剪切和RNA稳定性)，影响翻译的特性(例如，调控，mRNA与核糖体蛋白质的结合)。

术语“热稳定”和“热稳定的”指，本发明的葡糖淀粉酶变体在淀粉底物水解期间惯常的条件下、于一定的温度下暴露给定的时间后(例如，暴露于改变的温度)，维持规定量的酶活性。

在涉及例如热稳定性等特性时，术语“增加的稳定性”指经过一段时间后，与其它参照(即，亲本)葡糖淀粉酶相比较，保留了较高的淀粉水解活性。

在涉及例如热稳定性等特性时，术语“降低的稳定性”指经过一段时间后，与其它参照葡糖淀粉酶相比较，保留了较低的淀粉水解活性。

术语“比活”定义为每毫克葡糖淀粉酶蛋白质的活性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶的活性通过本文中描述的乙醇分析试验来测定，表示为从淀粉底物产生的葡萄糖的量。在一些实施方案中，可以使用本文中描述的Caliper分析试验来测定蛋白质的浓度。

术语“活性”和“生物学活性”指与特定蛋白质相关的生物学活性。由此，给定蛋白质的生物学活性指由本领域技术人员典型地归属于所述蛋白质的任何生物学活性。例如，与葡糖淀粉酶相关的酶活性是水解，因此，活性葡糖淀粉酶具有水解活性。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，指任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)聚合形式。这些术语包括但不限于单链、双链或三链DNA，基因组DNA，cDNA，RNA，DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学、生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

如本文中使用的，术语“DNA构建体”、“转化DNA”和“表达载体”可互换使用，指用于将序列引入宿主细胞或生物体内的DNA。该DNA可以通过PCR或任何其它本领域技术人员已知的合适技术在体外产生。DNA构建体、转化DNA或重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒休DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子以及其它序列。在一些实施方案中，表达载体具有在宿主细胞内整合和表达异源DNA片段的能力。

如本文中使用的，术语“载体”指设计用于将核酸引入到一种或多种细胞类型中的多核苷酸构建休。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。

如本文中使用的，涉及将核酸序列引入细胞时，术语“引入”指适于将核酸序列转移到该细胞内的任何方法。此类用于引入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导。

如本文中使用的，术语“转化的”和“稳定转化的”指具有整合到其基因组内或作为附加体质粒维持至少两代的非天然(异源的)多核苷酸序列的细胞。

如本文中使用的，术语“选择性标记”和“选择标记”指能够在宿主细胞内表达的核酸(例如，基因)，其允许容易地选择那些含有载体的宿主。通常，选择性标记是赋予宿主细胞抵抗抗微生物剂的抗性或代谢优势的基因，从而使含有外来DNA的细胞可以区别于在转化过程中未接受任何外来序列的细胞。

如本文中使用的，术语“启动子”指具有指导下游基因转录的作用的核酸序列。启动子，与其它转录和翻译调控核酸序列(也被称为“控制序列”)一起，是表达给定基因所必需的。通常，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，以及增强子或激活物序列。

当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系中时，它是“有效连接的”。例如，编码分泌前导区(即，信号肽)的DNA，当表达为参与多肽分泌的前蛋白时，是与编码多肽的DNA有效连接的。通常，“有效连接的”意指所连接的DNA序列是连续的，并且就分泌前导区来说，是连续的且在阅读框中。

如本文中使用的术语“基因”指编码多肽的多核苷酸(例如，DNA片段)，其包括位于编码区前和后的区域、以及位于编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如本文中使用的，“直系同源物”和“直系同源基因”指不同物种中的、从共同祖先基因(即，同源基因)通过物种形成而进化成的基因。通常，直系同源物在进化过程中保留了相同的功能。直系同源物的鉴别可用于可靠预测新测序基因组中的基因功能。

如本文中使用的，“旁系同源物”和“旁系同源基因”指通过基因组内复制而相关的基因。直系同源物在进化过程中保留了相同的功能，而旁系同源物则进化出新的功能，即使一些功能常与原来的功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，它们都是丝氨酸蛋白酶，并一起存在于相同的物种内。

如本文中使用的，术语“杂交”，如本领域已知的，指一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程。

如果在中等至高严紧杂交和洗涤条件下，核酸序列与参照核酸序列特异地相互杂交，则认为核酸序列可以与参照核酸序列“选择性杂交”。杂交条件基于核酸结合复合体或探针的解链温度(T_m)。例如“最大严紧”通常是约T_m-5℃(比探针的T_m低5℃)；“高严紧”是比T_m低约5-10℃；“中等严紧”是比探针的T_m低约10-20℃；“低严紧”是比T_m低约20-25℃。从功能上讲，最大严紧条件可用于鉴别与杂交探针严格相同或接近严格相同的序列；而中等或低严紧杂交可用于鉴别或检测多核苷酸序列同源物。

中等和高严紧杂交条件在本领域公知。高严紧条件的实例包括在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中，于约42℃杂交，然后在2×SSC和0.5％SDS中于室温洗涤两次，在0.1×SSC和0.5％SDS中于42℃再洗涤两次。中等严紧条件的实例包括在包含20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切蛙精DNA的溶液中，于37℃孵育过夜，然后在1×SSC中于约37-50℃洗涤滤膜。本领域技术人员知道如何酌情调节温度、离子强度等，以适应例如探针长度等因素。

如本文中使用的，“重组”包括细胞或载体，所述细胞或载体通过引入异源或同源的核酸序列而已经被修饰，或者所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，作为有意的人为干预的结果，重组细胞可以表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在相同形式的基因，或者使原本异常表达、低表达或完全不表达的天然基因表达。

在本发明的一个实施方案中，在至少一个密码子上，用位点饱和诱变，产生突变的DNA序列。在另一个实施方案中，对两个或更多个密码子进行位点饱和诱变。在其它实施方案中，突变的DNA序列与亲本序列具有高于约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约98％的同一性。在可选的实施方案中，利用任何已知的诱变方法(例如，辐射、亚硝基胍等)在体内产生突变的DNA。然后分离所需的DNA序列并用于本文中提供的方法。

如本文中使用的，“异源蛋白质”指在宿主细胞内非天然存在的蛋白质或多肽。

如果酶在宿主细胞内表达的水平比在相应的野生型细胞内表达的水平更高，则酶在宿主细胞内是“过量表达”的。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本发明说明书和权利要求中，使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。所定义的该氨基酸3-字母代码按照IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会(Joint Commissionon Biochemical Nomenclature)(JCBN)进行定义。还应理解的是，由于遗传密码的简并性，多肽可以由一条以上核苷酸序列编码。

对本发明的变体按以下命名法进行描述：[原始氨基酸残基/位置/取代的氨基酸残基]。例如，以亮氨酸取代76位的精氨酸表示为R76L。当一个给定位置可以被多个氨基酸取代时，取代表示为1)Q172C，Q172D或Q172R；2)Q172C，D或R；或3)Q172C/D/R。当在本文中适于取代的位置被指出但是没有提出特定的氨基酸时，应理解的是，任何氨基酸残基都可以取代存在于该位置上的该氨基酸残基。当变体葡糖淀粉酶与其它葡糖淀粉酶相比包含缺失时，以“^＊”表示缺失。例如，将R76位的缺失表示为R76^＊。两个或更多个连续氨基酸的缺失表示为例如(76-78)^＊。

“原序列(prosequence)”是位于信号序列和成熟蛋白质之间的氨基酸序列，其对蛋白质的分泌是必需的。将原序列切除后，将获得成熟的活性蛋白。

术语“信号序列”或“信号肽”指可以参与成熟或前体形式蛋白质的分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信号序列的该定义是功能性的，意指包括由蛋白质基因的N-端部分编码的所有那些参与实现蛋白质分泌的氨基酸序列。它们常常，但并非绝对，结合在蛋白质的N-端部分，或结合在前体蛋白质的N-端部分。信号序列可以是内源的或外源的。信号序列可以是正常与蛋白质(例如，葡糖淀粉酶)连接的信号序列，或者可以来自编码其它分泌蛋白的基因。

术语蛋白质或肽的“前体”形式指，具有与蛋白质的氨基端或羧基端有效连接的原序列的成熟形式蛋白质。前体还可以具有与原序列的氨基端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的其它多核苷酸(例如，从蛋白质或肽上被切除以留下成熟形式蛋白质或肽的多核苷酸)。

“宿主株”或“宿主细胞”指合适含有本发明DNA的表达载体的宿主。

术语“来自”和“获自”不仅指由所讨论的生物体的株系生产或可生产的葡糖淀粉酶，而且还指由从该株系中分离的DNA序列编码的、并在含有该DNA序列的宿主生物体中产生的葡糖淀粉酶。此外，该术语还指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的、具有所讨论的葡糖淀粉酶的标识特征的葡糖淀粉酶。

“衍生物”在该定义范围内一般保留在野生型、天然或亲本形式中观察到的特征性水解活性，所保留的程度使衍生物可用于与野生型、天然或亲本形式类似的目的。葡糖淀粉酶的功能衍生物包括天然存在的、合成或重组产生的肽或肽片段，其具有本发明的葡糖淀粉酶的一般特征。

术语“分离的”指，当物质是天然存在的时，物质从天然环境中移出。“纯化的”蛋白质指至少部分纯化至同质的蛋白质。在一些实施方案中，纯化的蛋白质的纯度(以SDS-PAGE测得)大于约10％、约20％、或约30％。本发明的其它方面包括高度纯化形式(以SDS-PAGE测得)的蛋白质(即，纯度大于约40％、约60％、约80％、约90％、约95％、约97％、或约99％)。

如本文中使用的，术语“组合诱变”指产生起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体包含选自一组预定的突变的一个或几个突变。此外，该方法可以提供引入随机突变的手段，所述随机突变不是该组预定突变的成员。在一些实施方案中，该方法包括在美国专利号6,582,914中提出的方法，其通过引用整合至本文中。在可选的实施方案中，组合诱变方法包括可商业获取的试剂盒(例如，Multisite，Stratagene，San Diego，CA)。

如本文中使用的，术语“突变体文库”指一群细胞，其基因组大部分相同，但包括一个或多个基因的不同同源物。此类文库可用于，例如，鉴别具有改良性状的基因或操纵子。

如本文中使用的术语“干固形物含量(DS或ds)”指基于干重的、浆中的％总固形物。

如本文中使用的，术语“初始命中物”指通过筛选组合共有诱变文库(combinatorial consensus mutagenesis library)而鉴别出的变体。在一些实施方案中，与起始基因相比，初始命中物具有改良的性能特征。

如本文中使用的，术语“改良的命中物”指通过筛选增强的组合共有诱变文库而鉴别出的变体。

如本文中使用的，术语“目标特性”指起始基因的待改变的特性。其不意味着本发明限于任何特定的目标特性。然而，在一些实施方案中，目标特性是基因产物的稳定性(例如，对变性、蛋白水解或其它降解因素的抗性)，而在其它实施方案中，在生产宿主中的生产水平被改变。事实上，可以考虑起始基因的任何特性都可用于本发明中。其它术语定义可以在整个说明书中是明显的。

当提供数值范围时，应理解的是，位于该范围的上下限之间的每个中间值(到下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指出)也都被具体公开。本公开还涵盖了在该所述范围中的任何述及值或中间值与在该所述范围内的任何其它述及值或中间值之间的每个更小的范围。这些更小范围的上下限可以独立地被包含在范围内或排除在范围之外，而且每个范围(其中两个端点之一或两者包含在或两个端点都不包含在该更小范围内)也都涵盖在本公开中，在不与在所述范围中任何具体排除的限定相抵触的情况下。当述及的范围包括一个或两个端点时，排除那些所包括的端点之一个或两者的范围也包括在本发明中。

在更详细地描述示例性实施方案之前，应理解的是，本发明不限于所描述的特定的实施方案，其当然是可以变化的。尽管现在对示例性方法和材料进行描述，但是在实施或测试本发明时可以使用与本文中描述的相似或等同的任何方法和材料。

除非上下文另外清楚地指出，在本文中和所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一种”和“这”都包括了对复数的指示。因此，例如，提到“一种基因”时，包括了复数个此类候选物，提到“该细胞”时，包括提到一个或多个细胞及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

提供本文中讨论的出版物仅由于其公开早于本申请的申请日。本文的任何内容都不应被解释为承认本发明无权依据在先发明而先于此类出版物。

1.2.缩写

2.亲本葡糖淀粉酶

在一些实施方案中，本发明提供了葡糖淀粉酶变休。葡糖淀粉酶变体是亲本葡糖淀粉酶的变休，亲本葡糖淀粉酶可以包含催化结构域和淀粉结合结构域。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含催化结构域，所述催化结构域具有SEQ ID NO：1，2，3，5，6，7，8或9中所示氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：1，2，3，5，6，7，8或9中所示氨基酸序列的一个或多个显示出至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或约99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含由DNA序列编码的催化结构域，其中所述DNA序列在中等、高或严紧条件下与具有SEQ ID NO：1，2或3的氨基酸序列之一的葡糖淀粉酶的催化结构域的编码DNA杂交。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含淀粉结合结构域，所述淀粉结合结构域具有SEQ ID NO 1，2，11，385，386，387，388，389或390中所示氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO 1，2，11，385，386，387，388，389或390中所示氨基酸序列的一或多个显示出至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或约99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含由DNA序列编码的淀粉结合结构域，其中所述DNA序列在中等、高或严紧条件下与具有SEQ ID NO：1，2或11的氨基酸序列之一的葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域的编码DNA杂交。

葡糖淀粉酶的预测结构和已知序列在真菌物种中是保守的(Coutinho等，1994，Protein Eng.，7：393-400和Coutinho等，1994，Protein Eng.，7：749-760)。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是丝状真菌的葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶获自木霉属(Trichoderma)菌株(例如，里氏木霉(T.reesei)，长枝木霉(T.longibrachiatum)，T.strictipilis，棘孢木霉(T.asperellum)，T.konilangbra和哈茨木霉(T.hazianum))；曲霉属(Aspergillus)菌株(例如，黑曲霉(A.niger)，构巢曲霉(A.nidulans)，A.kawachi，泡盛曲霉(A.awamori)和米曲霉(A.orzyae))；篮状菌属(Talaromyces)菌株(例如，T.emersonii，T.thermophilus和T.duponti)；肉座菌属(Hypocrea)菌株(例如，胶质肉座菌(H.gelatinosa)，H.orientalis，酒色肉座菌(H.vinosa)和淡黄肉座菌(H.citrina))；镰孢属(Fusarium)菌株(例如，尖镰孢(F.oxysporum)，粉红镰孢(F.roseum)和F.venenatum)；脉孢霉属(Neurospora)菌株(例如，粗糙脉孢霉(N.crassa))；腐质霉属(Humicola)菌株(例如，灰腐质霉(H.grisea)，特异腐质霉(H.insolens)和疏绵状腐质霉(H.lanuginose))；青霉属(Penicillium)菌株(例如，特异青霉(P.notatum)或产黄青霉(P.chrysogenum))；或复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)菌株(例如，扣囊复膜孢酵母(S.fibuligera))。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶可以是细菌葡糖淀粉酶，例如，多肽可以获自革兰氏阳性菌菌株，例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株(例如，嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，迟缓芽孢杆菌(B.lentus)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis))；或链霉菌属(Streptomyces)菌株(例如，变铅青链霉菌(S.lividans))。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含催化结构域，所述催化结构域与SEQ ID NO：3的TrGA氨基酸序列的催化结构域具有至少约80％、约85％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含催化结构域，所述催化结构域与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的曲霉属亲本葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。

在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含催化结构域，所述催化结构域与SEQ ID NO：8的灰腐质霉(HgGA)亲本葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％的序列同一性。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含淀粉结合结构域，所述淀粉结合结构域与SEQ ID NO：1，2或11的TrGA氨基酸序列的淀粉结合结构域具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约98％的序列同一性。

在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含淀粉结合结构域，所述淀粉结合结构域与SEQ ID NO：385的灰腐质霉(HgGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％、或约99％的序列同一性。

在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含淀粉结合结构域，所述淀粉结合结构域与SEQ ID NO：390的太瑞斯梭孢壳(TtGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％、或约99％的序列同一性。

在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含淀粉结合结构域，所述淀粉结合结构域与SEQ ID NO：386的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)(ThGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％、或约99％的序列同一性。

在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含淀粉结合结构域，所述淀粉结合结构域与SEQ ID NO：387的埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(TeGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％、或约99％的序列同一性。

在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含淀粉结合结构域，所述淀粉结合结构域与SEQ ID NO：388或389的曲霉属亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域具有至少约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：1或2的TrGA氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。

在其它实施方案中，木霉属(Trichoderma)葡糖淀粉酶同源物获自木霉属(Trichoderma)或肉座菌属(Hypocrea)菌株。一些典型的木霉属(Trichoderma)葡糖淀粉酶同源物描述于美国专利号No.7,413,887中，特别参考所述参考文献中的SEQ ID NOs：17-22和43-47所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的TrGA，或是与TrGA序列(SEQ ID NO：2)具有至少约80％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的木霉属葡糖淀粉酶同源物。

可以使用标准的重组DNA技术来分离和/或鉴别亲本葡糖淀粉酶。可以使用技术人员已知的任何标准技术。例如，可以使用对葡糖淀粉酶的保守区域特异的探针和/或引物来鉴别细菌或真菌细胞中的同源物(催化结构域、活性位点等)。可选地，可以使用简并PCR来鉴别细菌或真菌细胞中的同源物。在某些情况下，可以分析已知序列(例如数据库中的序列)与已知的葡糖淀粉酶之一(包括SEQ ID NO：2)或已知的淀粉结合结构域(包括SEQ ID NO：11)的序列和/或结构同一性。也可以利用功能分析试验来鉴别细菌或真菌细胞中的葡糖淀粉酶活性。可以分离具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质并对其进行反向测序，以分离其对应的DNA序列。此类方法为技术人员已知。

3.葡糖淀粉酶结构同源性

分子生物学的中心法则是编码特定酶的基因的DNA序列决定该蛋白质的氨基酸序列，该氨基酸序列又决定该酶的三维折叠。该折叠将分开的残基带到一起形成催化中心和底物结合表面，从而导致所讨论的酶的高特异性和活性。

葡糖淀粉酶由多达三个不同的结构域组成，于所有葡糖淀粉酶中结构保守的约450个残基的催化结构域，通常跟着由30至80个残基组成的接头区域，接头区域连接至约100个残基的淀粉结合结构域。具有所有三个完整区域的里氏木霉葡糖淀粉酶的结构在本文中进行了测定，至1.8埃分辨率(见表9和实施例9)。利用该坐标(见表9)，将该结构与以前测定的泡盛曲霉菌林X100的葡糖淀粉酶的催化结构域的坐标(Aleshin，A.E.，Hoffman，C.，Firsov，L.M.和Honzatko，R.B.Refined crystal structures ofglucoamylase from Aspergillus awamori var.X100.J.Mol.Biol.238：575-591(1994))进行了比对。该泡盛曲霉晶体结构仅包括催化结构域。如图6-7中所见，这些催化结构域的结构非常紧密地重叠，基于该结构叠合，可以鉴定等价残基。所有的葡糖淀粉酶被认为都具有图6-7中描述的基本结构。

图6是从侧面观察的、SEQ ID NO：2的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)的三维结构的比较。在此视图中，可见催化结构域、接头区域和淀粉结合结构域之间的关系。

图7是从顶部观察的、SEQ ID NO：2的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)的三维结构的比较。图中所示的葡糖淀粉酶和实际上目前已知的所有葡糖淀粉酶都具有该结构同源性。该结构的保守性与所有葡糖淀粉酶的保守的活性以及保守的作用机制相关。考虑到该高同源性，由木霉葡糖淀粉酶的位点特异性变异导致的、引起功能改变的变化，在其它葡糖淀粉酶中也将具有相似的结构以及由此功能后果。因此，可以将有关何种变体导致期望有益结果的教导适用于其它的葡糖淀粉酶。

利用表9中的坐标，还产生了淀粉结合结构域(SBD)的晶体结构。将TrGA的SBD与黑曲霉(A.niger)的SBD进行比对。如图8中所示，黑曲霉和TrGA SBD的结构非常紧密地重叠。据信，尽管所有的淀粉结合结构域都具有至少部分图8中描述的基本结构，但一些SBD在结构上比其它SBD更相似。例如，在CAZY数据库(cazy.org)中，TrGA SBD可以被分类在碳水化合物结合模块20家族中。CAZY数据库描述了降解、修饰或产生糖苷键的酶的结构相关催化模块和碳水化合物结合模块(或功能结构域)的家族。考虑到高度的结构同源性，导致功能改变的TrGA SBD的位点特异性变异也将在具有与TrGA SBD类似结构的SBD的其它葡糖淀粉酶，特别是那些分类在碳水化合物结合模块20家族中的葡糖淀粉酶中，具有相似的结构和由此功能的后果。因此，可以将有关何种变异会导致所需要的有益结果的教导适用于具有结构相似性的其它SBD。

因此，本文中讨论的氨基酸位置号指分配给图1中显示的成熟里氏木霉葡糖淀粉酶序列(SEQ ID NO：2)的位置号。然而，本发明不限于木霉属葡糖淀粉酶的变体，而是扩展至在等价于里氏木霉葡糖淀粉酶(SEQ IDNO：2)中的具体鉴定残基的位置包含氨基酸残基的葡糖淀粉酶。在本发明一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是篮状菌属GA，在篮状菌属葡糖淀粉酶(见例如，SEQ ID NO：12)中等价的氨基酸残基位置上进行取代，如本文所述的取代。在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包括SEQ ID NOs：5-9(见图5A和5B)。在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是青霉属葡糖淀粉酶，例如产黄青霉(见例如，SEQ ID NO：13)。

“结构同一性”决定氨基酸残基是否是等价的。结构同一性是当比对两个结构(三维和氨基酸结构)时一对一的拓扑学等价性。如果一个葡糖淀粉酶的一个残基(氨基酸)位置与里氏木霉葡糖淀粉酶的残基是等价的，则其与里氏木霉葡糖淀粉酶中的特定残基或该残基的部分是同源的(即，在一级或三级结构中在位置上相应)或类似的(具有相同或相似的化学结合、反应或相互作用的功能能力)。

为了建立一级结构的同一性，可以将葡糖淀粉酶的氨基酸序列与里氏木霉葡糖淀粉酶的一级序列，特别是与序列已知的葡糖淀粉酶中已知不变的残基集合，进行直接比较。例如，本文中的图5A和5B显示了葡糖淀粉酶之间的保守残基。图5D和5E显示了来自各种葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域的比对。在比对保守残基、允许进行必要的插入和缺失以维持比对(即，通过主观的缺失和插入而避免去除保守残基)后，定义与里氏木霉葡糖淀粉酶的一级序列中特定氨基酸等价的残基。典型地，保守残基的比对应该保存100％的此类残基。然而大于约75％或少至约50％的保守残基的比对也足以定义等价残基。此外，可以将结构同一性与序列同一性结合起来用于鉴定等价残基。

例如，在图5A和5B中，对来自6个生物体的葡糖淀粉酶的催化结构域进行了比对，以提供氨基酸序列之间的最大同源性。这些序列的比较显示，有多个包含在每条序列中的保守残基(用星号指示)。因此，这些保守残基可用于定义其它葡糖淀粉酶(例如来自黑曲霉的葡糖淀粉酶)中、与里氏木霉葡糖淀粉酶对应的等价氨基酸残基。类似地，图5D和5E显示了来自7个生物体的葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域的比对，以鉴定等价残基。

结构同一性涉及两个结构之间等价残基的鉴别。对于三级结构已经通过X射线晶体学进行了确定的酶，可以通过确定三级结构水平上的同源性(结构同一性)来定义“等价残基”。等价残基定义为，在比对后，相对于里氏木霉葡糖淀粉酶的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子坐标(N对N，CA对CA，C对C和O对O)，在0.13nm以内，可选地在0.1nm以内的残基。当将最佳模型进行定向和定位，以使所讨论的葡糖淀粉酶与里氏木霉葡糖淀粉酶的非氢蛋白质原子的原子坐标获得最大重叠之后，实现比对。最佳模型是，对可获得的最高分辨率下的实验衍射数据产生最低R因子的晶体学模型。

R因子

将在功能上与里氏木霉葡糖淀粉酶的特定残基类似的等价残基定义为可以采取如下构象的酶的氨基酸残基，所述构象使得这些氨基酸残基可以以确定的且归属于里氏木霉葡糖淀粉酶的特定残基的方式，改变、修饰或贡献于蛋白质结构、底物结合或催化。此外，它们是占据了类似位置的酶(已经通过X射线晶体学获得了三级结构的酶)的残基，所述类似的程度使得虽然给定残基的主链原子可能未满足以占据同源位置为基础的等价标准，但是该残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于里氏木霉葡糖淀粉酶的对应侧链原子的0.13nm内。表9中列出了里氏木霉葡糖淀粉酶的三维结构的坐标，其可如上所述用于确定三级结构水平上的等价残基。

一些鉴定用于取代的残基是保守残基，而另一些则不是。在残基不保守的情况下，一个或多个氨基酸的取代被限于产生具有与天然发现的序列不一致的氨基酸序列的变体的取代。在保守残基的情况下，取代不应导致天然存在的序列。

4.葡糖淀粉酶变体

根据本发明的变体包括在亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列中的至少一个取代、缺失或插入，其使变体在序列上与亲本葡糖淀粉酶不同。在一些实施方案中，本发明的变体具有TrGA(SEQ ID NO：2)，亲本葡糖淀粉酶(与TrGA(SEQ ID NO：2)具有至少80％序列同一性)，的至少约20％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约100％的葡糖淀粉酶活性。在一些实施方案中，根据本发明的变体在亲本TrGA(SEQ ID NO：2)的至少一个氨基酸位置上，或者在另一亲本葡糖淀粉酶序列中的等价位置上包含取代、缺失或插入，所述另一亲本葡糖淀粉酶与TrGA序列(SEQ ID NO：2)具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。

在其它实施方案中，根据本发明的变体在亲本TrGA的片段的至少一个氨基酸位置上包含取代、缺失或插入，其中所述片段包含TrGA序列的催化结构域(SEQ ID NO：3)，或在亲本葡糖淀粉酶的含催化结构域的片段中的等价位置上包含取代、缺失或插入，其中所述亲本葡糖淀粉酶的含催化结构域片段与SEQ ID NO：3，5，6，7，8或9的含催化结构域片段具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。在一些实施方案中，片段包含TrGA催化结构域(SEQ ID NO：3)的至少约400、约425、约450或约500个氨基酸残基。

在其它实施方案中，根据本发明的变体在亲本TrGA的片段的至少一个氨基酸位置上包含取代、缺失或插入，其中所述片段包含TrGA序列的淀粉结合结构域(SEQ ID NO：11)，或在亲本葡糖淀粉酶的含淀粉结合结构域的片段中的等价位置上包含取代、缺失或插入，其中所述亲本葡糖淀粉酶的含淀粉结合结构域的片段与SEQ ID NO：11，385，386，387，388，389和390的含淀粉结合结构域的片段具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。在一些实施方案中，片段包含TrGA淀粉结合结构域(SEQ ID NO：11)的至少约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100或约109个氨基酸残基。

在一些实施方案中，当亲本葡糖淀粉酶包括催化结构域、接头区域和淀粉结合结构域时，变体在包含部分接头区域的片段的至少一个氨基酸位置上包含取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体在TrGA序列(SEQ ID NO：2)的片段的氨基酸序列中包含取代、缺失或插入。

就氨基酸取代而言，结构同一性意指，取代发生在同源葡糖淀粉酶或亲本葡糖淀粉酶中的等价氨基酸位置上。术语等价位置意指两个亲本序列共有的位置，这是基于所讨论的亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列以及所讨论的亲本葡糖淀粉酶的三维结构与TrGA参照萄糖淀粉酶的氨基酸序列和三维序列的比对得到的。例如，参考图5A，TrGA(SEQ ID NO：2或3)中的第24位是D24，黑曲霉(SEQ ID NO：6)的等价位置是位置D25，米曲霉(SEQ ID NO：7)的等价位置是位置D26。三维序列的示例性比对见图6和7。

在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体将包括在亲本的氨基酸序列中的至少一个取代。在其它实施方案中，变体可以具有一个以上的取代。例如，与对应的亲本葡糖淀粉酶相比较，变体可以具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20或25个氨基酸取代、缺失或插入。

在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体包括取代、缺失或插入，典型地是在对应于图5A，5B，5D和5E所示非保守氨基酸区域的位置(例如，对应于图5A，5B，5D和5E中没有用“^＊”标示的那些位置的氨基酸位置)中的至少一个氨基酸位置上的取代。

尽管变体可以在成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：2)的任何位置中具有取代，但在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的下列位置、或在亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中包含一个或多个取代：

10，14，15，23，42，43，44，59，60，61，65，67，68，72，73，97，98，99，102，110，113，114，133，140，144，145，147，152，153，164，182，204，205，214，216，219，228，229，230，231，236，239，241，242，263，264，265，268，269，276，284，291，294，300，301，303，311，338，342，344，346，349，359，361，364，375，379，382，390，391，393，394，410，417，418，430，431，433，436，442，444，448，451，493，494，495，502，503，508，511，518，519，520，527，531，535，536，537，539，563，或577。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是木霉属葡糖淀粉酶同源物。在一些实施方案中，变体具有改变的特性。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2的葡糖淀粉酶具有结构同一性。

在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的下列位置、或在亲本葡糖淀粉酶(例如，木霉属葡糖淀粉酶同源物)中的等价位置，包含一个或多个取代：T10，L14，N15，P23，T42，I43，D44，P45，D46，F59，K60，N61，T67，E68，A72，G73，S97，L98，A99，S102，K108，E110，L113，K114，R122，Q124，R125，I133，K140，N144，N145，Y147，S152，N153，N164，F175，N182，A204，T205，S214，V216，Q219，W228，V229，S230，S231，D236，I239，N240，T241，N242，G244，N263，L264，G265，A268，G269，D276，V284，S291，G294，P300，A301，A303，Y310，A311，D313，Y316，V338，T342，S344，T346，A349，V359，G361，A364，T375，N379，S382，S390，E391，A393，K394，R408，S410，S415，L417，H418，T430，A431，R433，I436，A442，N443，S444，T448，S451，T493，P494，T495，H502，E503，Q508，Q511，N518，A519，A520，T527，V531，A535，V536，N537，A539，N563，和N577。

在一些实施方案中，与亲本葡糖淀粉酶相比较，变体具有改变的特性。在其它实施方案中，葡糖淀粉酶亲本的变体在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中的下列位置包含至少一个下列取代：T10S，T42V，I43Q/R，D44R/C，N61I，T67M，E68C/M，A72Y，G73F/W，S97N，S102A/M/R，K114M/Q，I133T/V，N145I，N153A/D/E/M/S/V，T205Q，Q219S，W228A/F/H/M/V，V229I/L，S230C/F/G/L/N/Q/R，S231L/V，D236R，I239V/Y，N263P，L264D/K，A268C/D/G/K，S291A/F/H/M/T，G294C，A301P/R，V338I/N/Q，T342V，S344M/P/Q/R/V，G361D/E/F/I/L/M/P/S/W/Y，A364D/E/F/G/K/L/M/R/S/T/V/W，T375N，K394S，L417K/R/V，T430A/K，A431I/L/Q，R433C/E/G/L/N/S/V/Y，I436H，T451K，T495K/M/S，E503A/C/V，Q508R，Q511H，A519I/K/R/Y，A520C/L/P，V531L，A535K/N/P/R，V536M，A539E/R/S，N563C/E/I/K/K/Q/T/V或N577K/P/R，或在亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中包含替代。

本发明的葡糖淀粉酶变体也可以包括嵌合的或杂合的葡糖淀粉酶，具有，例如来自一种葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域(SBD)和来自另一种葡糖淀粉酶的催化结构域和接头。例如，杂合葡糖淀粉酶可以通过将来自AnGA(SEQ ID NO：6)的SBD与来自TrGA(SEQ ID NO：2)的SBD进行交换，以获得具有AnGA的SBD和TrGA的催化结构域和接头的杂合体。可选地，可以将来自AnGA的SBD和接头，与TrGA的SBD和接头进行交换。

在一些方面，与亲本葡糖淀粉酶相比较，变体葡糖淀粉酶显示出改变的热稳定性。在一些方面，改变的热稳定性可以是与亲本葡糖淀粉酶相比，增加的热稳定性。在一些实施方案中，改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比，改变的比活。在一些实施方案中，改变的比活可以是与亲本葡糖淀粉酶相比，增加的比活。在一些实施方案中，改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比，在较低的温度下增加的热稳定性。在一些实施方案中，改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比，增加的比活和增加的热稳定性。

一些具有多重取代的变体，即组合变体，可以包括在SEQ ID NO：2的位置或亲本葡糖淀粉酶，特别是木霉属葡糖淀粉酶同源物，的等价位置上的取代：

I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R；

I43Q/L417V/E503A/Q511H/A539R；

I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；

I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；

I43R/L417V/E503A/Q511H/A539R；

I43R/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；

I43R/L417R/E503A/A539R；

I43R/N61I/L417R/E503A/Q511H/A539R；

G73F/T430A/Q511H；

I43R/G73F/T430A；

G73F/T430A/E503V/Q511H；

D44C/G73F/N563K；

D44C/G73F/E503V/Q511H；

D44C/G73F/N563K；

D44C/G73F/L417R/N563K；

D44C/G73F/N563K；

I43R/T430A；

I43Q/T430A；

I43Q/T430A/Q511H；

D44C/L417R/N563K；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；

L417V/T430A/A431Q/Q511H/A535R/A539R/N563I；

L417V/T430A/Q511H/A535R/N563I；

L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I；

G294C/L417R/A431L；

G294C/L417V/A431Q；

G294C/L417V/A431L/Q511H；

G294C/L417R/A431Q/Q511H；

L417R/A431L/Q511H；

L417V/A431Q/Q511H；

I43Q/T430A/Q511H/N61I；

I43Q/T430A/Q511H/L417V；

I43Q/T430A/Q511H/A431L；

I43Q/T430A/Q511H/E503A；

I43Q/T430A/Q511H/A539R；

I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R；

I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R；

I43Q/T430A/Q511H/A431L/A539R；

I43Q/T430A/Q511H/A431L/E503A；

I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R/A431L；

I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R/A431L；

I43Q/Q511H/N61I；

I43Q/Q511H/L417V；

I43Q/Q511H/A431L；

I43Q/Q511H/A539R；

I43Q/Q511H/A539R/N61I；

I43Q/Q511H/A539R/E503A；

I43Q/Q511H/A539R/T430M；

I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I；

I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I/L417V；

I43R/T430A/E503V/A535R/N563K；

D44R/E503A/Q511H/N563I；

E503A/N563I；

I43R/T430A/E503A/Q511H/N563K；

D44R/T430A/Q511H/A535R；

L417V/A431L/A539R；

L417V/A431L/A539R/I43Q；

L417V/A431L/A539R/N61I；

L417V/A431L/A539R/A535R；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I；

L417V/A431L/A539R/N61I/A535R；

L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/N61I；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I；

L417V/A431L/A539R/I43R；

L417V/A431L/A539R/I43R/N61I；

L417V/A431L/A539R/I43R/N61I/A535R/T430A；

L417R/A431L/A539R；

L417G/A431L/A539R；

G73F/E503V/N563K/L417R/A539R；

G73F/E503V/N563K/I43R/L417R/A539R；和

G73F/E503V/N563K/I43R/Q511H。

已经将多个亲本葡糖淀粉酶与TrGA的氨基酸序列进行了比对。图5包括下列亲本葡糖淀粉酶的催化结构域：泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(AaGA)(SEQ ID NO：5)；黑曲霉(Aspergillus niger)(AnGA)(SEQ ID NO：6)；米曲霉(Aspergillus oryzae)(AoGA)(SEQ ID NO：7)；灰腐质霉(Humicola grisea)(HgGA)(SEQ ID NO：8)；和酒色肉座菌(Hypocreavinosa)(HvGA)(SEQ ID NO：9)。下表1中显示了催化结构域的百分比(％)同一性。

表1、各种真菌葡糖淀粉酶之间的序列同源性

	AaGA	AnGA	AoGA	HgGA	HvGA	TrGA
							AaGA	100	95	58	53	57	56
AnGA		100	59	53	57	56
							AoGA			100	55	56	56
HgGA				100	61	63
							HvGA					100	91
TrGA						100

在一些实施方案中，例如，变体葡糖淀粉酶来自亲本葡糖淀粉酶——曲霉属葡糖淀粉酶、腐质霉属葡糖淀粉酶、或肉座菌属葡糖淀粉酶，并且变体包括在与SEQ ID NO：2中所示的位置等价的位置中，特别是对应于如下位置的位置中，的至少一个取代：

T10，L14，N15，P23，T42，I43，D44，P45，D46，F59，K60，N61，T67，E68，A72，G73，S97，L98，A99，S102，K108，E110，L113，K114，R122，Q124，R125，I133，K140，N144，N145，Y147，S152，N153，N164，F175，N182，A204，T205，S214，V216，Q219，W228，V229，S230，S231，D236，I239，N240，T241，N242，G244，N263，L264，G265，A268，G269，D276，V284，S291，G294，P300，A301，A303，Y310，A311，D313，Y316，V338，T342，S344，T346，A349，V359，G361，A364，T375，N379，S382，S390，E391，A393，K394，R408，S410，S415，L417，H418，T430，A431，R433，I436，A442，N443，S444，T448，S451，T493，P494，T495，H502，E503，Q508，Q511，N518，A519，A520，T527，V531，A535，V536，N537，A539，N563，或N577.

在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体可以仅在规定的位置上与亲本葡糖淀粉酶不同。

例如，本发明提供了葡糖淀粉酶变体，所述变体包含在SEQ ID NO：2的位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置上的下组取代之一：

L417V/A431L/A539R；

I43Q/L417V/A431L/A539R；

L417V/A431L/A535R/A539R

I43R/L417V/A431L/A539R；

L417R/A431L/A539R；或

L417G/A431L/A539R；

其中与亲本葡糖淀粉酶相比较，葡糖淀粉酶变体不具有任何其它取代，并且其中亲本葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO：1，2，3，5，6，7，8或9有至少80％的序列同一性的催化结构域。因此，亲本葡糖淀粉酶可以是以上所描述的任何亲本葡糖淀粉酶。

亲本葡糖淀粉酶可以包含与SEQ ID NO：1，2，11，385，386，387，388，389或390具有至少95％的序列同一性的淀粉结合结构域。亲本葡糖淀粉酶可以与SEQ ID NO：1或2具有至少80％的序列同一性；例如其可以包含SEQ ID NO：1或2。可选地，亲本葡糖淀粉酶可以由SEQ ID NO：1或2组成。

显而易见的是，本发明还延及制备本文中描述的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括提供所描述的亲本葡糖淀粉酶，和修饰所述亲本葡糖淀粉酶以提供所述葡糖淀粉酶变体。方法可以包括提供编码所述亲本葡糖淀粉酶的亲本多核苷酸的步骤，和修饰所述亲本多核苷酸以提供编码所述葡糖淀粉酶变体的变体多核苷酸的步骤。此类多核苷酸在下文中得到了更详细的描述。本发明的方法可以，例如，用于产生包含编码葡糖淀粉酶变体的多核苷酸的DNA构建体或载体，其也在下文中得到了更详细的描述。

5.变体葡糖淀粉酶的表征

本发明还提供与亲本葡糖淀粉酶，特别是与TrGA相比，具有至少一个改变的特性(例如，改良的特性)的葡糖淀粉酶变体。在一些实施方案中，至少一个改变的特性(例如，改良的特性)选自酸稳定性、热稳定性和比活。典型地，改变的特性是增加的酸稳定性、增加的热稳定性和/或增加的比活。典型地，增加的热稳定性是在较高温下。在一个实施方案中，增加的pH稳定性是在高pH下。在另一个实施方案中，增加的pH稳定性是在低pH下。

与亲本葡糖淀粉酶相比，本发明的葡糖淀粉酶变体还可以提供在低底物浓度下更高的淀粉水解速率。当在相同条件下测试时，变体可具有比亲本葡糖淀粉酶更高的V_max或更低的K_m。例如，变体葡糖淀粉酶可在约25℃至70℃(例如，约25℃至约35℃；约30℃至约35℃；约40℃至约50℃；约50℃至约55℃，或约55℃至约62℃)的温度范围下，具有更高的V_max。米-曼氏常数(Michaelis-Menten constant)、K_m和V_max值，可以使用已知的标准方法很容易地测定。

5.1具有改变的热稳定性的变体葡糖淀粉酶

在一些方面，本发明涉及与亲本(野生型)相比，具有改变的热稳定性的变体葡糖淀粉酶。改变的热稳定性可以是在增加的温度下或在降低的温度下。热稳定性按在pH为4.5的NaAc缓冲液中64℃孵育1小时后的百分比(％)残留活性来度量。在这些条件下，与孵育前的初始活性相比较，由于每日变化，TrGA具有约15％至44％的残留活性。因此，在一些实施方案中，与孵育前的初始活性相比，具有增加的热稳定性的变体具有比亲本的残留活性高至少约1％到至少约50％的残留活性(在pH为4.5的NaAc缓冲液中于64℃孵育1小时后)，包括约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％和约50％。例如，当亲本的残留活性为15％时，具有增加的热稳定性的变体可以具有约16％到约75％之间的残留活性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体具有改良的热稳定性，例如在暴露于改变的温度给定的时间(例如，至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟或约300分钟)后，保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的酶活性。在一些实施方案中，在约40℃至约80℃范围内，以及在约50℃至约75℃范围内，和在约60℃至约70℃范围内的选定温度下，并在约4.0至约6.0的pH，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体具有增加的热稳定性。在一些实施方案中，按分析和方法(Assays andMethods)中的描述，测量热稳定性。该方法可以按需进行适应性调整以测量在其它温度下的热稳定性。可选地，可以按照所述，在64℃测量热稳定性。在一些实施方案中，在约20℃至约50℃(包括约35℃至约45℃和约30℃至约40℃)范围内的选定温度下，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体具有在较低的温度下增加的热稳定性。

在一些实施方案中，具有改良热稳定性的变体在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的如下位置、或在亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中，包括一个或多个缺失、取代或插入，尤其是取代：10，42，43，44，59，61，68，72，73，97，98，99，102，114，133，140，144，152，153，182，204，205，214，216，228，229，230，231，236，241，242，263，264，265，268，269，276，284，291，294 300，301，303，311，338，342，344，346，349，359，361，364，375，379，382，390，391，393，394，410，417，430，431，433，436，442，444，448，451，493，495，503，508，511，518，519，520，527，531，535，536，537，539，563，或577，

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是木霉属(Trichoderma)葡糖淀粉酶同源物，在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2也具有结构同一性。在一些实施方案中，具有增加的热稳定性的变体在SEQ IDNO：2的至少一个以下位置具有取代：T10S，T42V，I43Q，I43R，D44C，D44R，E68C，E68M，G73F，G73W，K114M，K114Q，I133V，N153A，N153E，N153M，N153S，N153V，W228V，V229I，V229L，S230Q，S231V，D236R，L264D，L264K，A268D，S291A，S291F，S291H，S291M，S291T，G294C，A301P，A301R，V338I，V338N，V338Q，S344M，S344P，S344Q，S344R，S344V，G361D，G361E，G361F，G361I，G361L，G361M，G361P，G361S，G361W，G361Y，A364D，A364E，A364F，A364G，A364K，A364L，A364M，A364R，A364S，A364T，A364V，A364W，T375N，L417K，L417R，R433C，R433E，R433G，R433L，R433N，R433S，R433V，I436H，T495K，T495S，E503A，E503C，E503V，Q508R，Q511H，A519K，A519R，A519Y，V531L，A535K，A535N，A535P，A535R，A539E，A539R，A539S，N563C，N563E，N563I，N563K，N563L，N563Q，N563T，N563V，N577K，N577P，或N577R。

5.2.具有改变的比活的变体葡糖淀粉酶

如本文中使用的，比活是每毫克蛋白质的葡糖淀粉酶活性。使用乙醇检测试验，测定了活性。该筛选鉴别出了与亲本TrGA的性能指数PI相比，具有性能指数(PI)＞1.0的变体。PI是从野生型(WT)和变体酶的比活(每毫克酶的活性)来计算的。它是“变体比活/WT比活”的商，并可作为变体比活增加的度量。PI约为2应是比WT好约2倍。在一些方面，本发明涉及与亲本或野生型葡糖淀粉酶相比，具有改变的比活的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，改变的比活是增加的比活。增加的比活可以定义为大于或等于约1的增加的性能指数，包括大于或等于约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9和约2。在一些实施方案中，增加的比活是约1.0至约5.0，包括约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2.、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8和约4.9。在一些实施方案中，变体具有比亲本葡糖淀粉酶高至少约1.0倍的比活，包括至少约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2.0倍、约2.2倍、约2.5倍、约2.7倍、约2.9倍、约3.0倍、约4.0倍和约5.0倍。

在一些实施方案中，具有改良比活的变体在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的以下位置、或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中包括一个或多个缺失、取代或插入：10，14，15，23，59，60，61，65，67，68，72，73，97，98，99，102，110，113，133，140，144，145，147，152，153，164，182，204，205，214，216，219，228，229，230，231，236，239，241，242，263，264，265，268，269，276，284，291，300，301，303，311，338，342，344，346，349，359，361，364，375，379，382，390，391，393，394，410，417，418，430，431，433，442，444，448，451，493，494，495，502，503，508，511，518，519，520，531，535，536，539，或563。

在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO：2序列具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶也与SEQ ID NO：2具有结构同一性。在一些实施方案中，具有改良比活的本发明变体在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的以下位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置包括取代：I43Q，I43R，D44C，D44R，N061I，T067M，A072Y，S097N，S102A，S102M，S102R，I133T，N145I，N153D，T205Q，Q219S，W228A，W228F，W228H，W228M，S230C，S230F，S230G，S230L，S230N，S230Q，S230R，S231L，I239V，I239Y，N263P，A268C，A268G，A268K，S291A，G294C，T342V，K394S，L417R，L417V，T430K，A431I，A431L，A431Q，R433Y，T451K，T495M，A519I，A520C，A520L，A520P，A535R，V536M，A539R，N563K，或N563I。

在一些实施方案中，与变体相比，亲本的比活按分析和方法(Assays andMethods)中的描述进行测量。

5.3.具有改变的热稳定性和改变的比活的变体葡糖淀粉酶

在一些方面，本发明涉及与亲本(例如，野生型)相比，具有改变的热稳定性和改变的比活的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，改变的比活是增加的比活。在一些实施方案中，改变的热稳定性是与亲本葡糖淀粉酶相比，在高温下(例如，在80℃以上的温度下)增加的热稳定性。

在一些实施方案中，具有增加的热稳定性和增加的比活的变体在SEQID NO：2所示氨基酸序列的以下位置或在亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中包括一个或多个缺失、取代或插入，尤其取代：10，15，43，44，59，61，68，72，73，97，99，102，140，153，182，204，205，214，228，229，230，231，236，241，242，264，265，268，276，284，291，294，300，301，303，311，338，344，346，349，359，361，364，375，379，382，391，393，394，410，430，433，444，448，451，495，503，511，520，531，535，536，539，或563，在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是木霉属(Trichoderma)葡糖淀粉酶同源物，在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶也与SEQ ID NO：2具有结构同一性。在一些实施方案中，具有增加的热稳定性和比活的变体具有在SEQ ID NO：2的以下至少一个位置上的取代：I43Q/R，D44C/R，W228F/H/M，S230C/F/G/N/Q/R，S231L，A268C/D/G/K，S291A，G294C，R433Y，S451K，E503C，Q511H，A520C/L/P或A535N/P/R。

6.编码葡糖淀粉酶的多核苷酸

本发明还涉及编码变体葡糖淀粉酶的分离的多核苷酸。多核苷酸可以通过本领域已知的常规技术来制备。多核苷酸可以通过合成来制备，例如通过自动化DNA合成仪。DNA序列可以是混合的基因组(或cDNA)和合成来源的，通过将片段连接在一起而制备。多核苷酸还可以使用特异引物、通过聚合酶链式反应(PCR)来制备。通常，参考Minshull J.等，Methods 32(4)：416-427(2004)。DNA也可以由许多商业公司(例如GeneartAG，Regensburg，德国)来合成。

本发明还提供了包含以下核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列(i)与SEQ ID NO：4具有至少约50％，包括至少约60％、约70％、约80％、约90％、约95％和约99％，的同一性，或(ii)在中等至高严紧条件下，能够与来自SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的探针杂交，或(iii)互补于与SEQ ID NO：4所示序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。根据本发明的有用探针可以包括SEQ ID NO：4的至少约50、约100、约150、约200、约250、约300或更多个连续的核苷酸。在一些实施方案中，所编码的多肽与SEQ ID NO：2也具有结构同一性。

本发明还提供了编码变体葡糖淀粉酶的分离的多核苷酸，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO：2具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。此外，本发明还提供了包含以上所提供的任何多核苷酸的表达载体。本发明还提供了编码本文所提供的变体葡糖淀粉酶的DNA的片段(即，部分)。这些片段可用于获得部分长度DNA片段，其能够用于从丝状真菌细胞(例如，木霉、曲霉、镰孢霉、青霉和腐质霉)中分离或鉴定编码本文中所描述的成熟葡糖淀粉酶或其具有葡糖淀粉酶活性的片段的多核苷酸。在一些实施方案中，DNA片段可以包含至少约50个、约100个、约150个、约200个、约250个、约300个或更多个连续的核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4中提供的DNA的部分可用于从其它物种，例如编码葡糖淀粉酶的丝状真菌中，获得亲本葡糖淀粉酶，特别是木霉属(Trichoderma)葡糖淀粉酶同源物。

7.葡糖淀粉酶的生产

7.1.DNA构建体和载体

根据本发明的一个实施方案，组装包含有效连接至启动子序列的、上述编码本发明变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的DNA构建体，以转移至宿主细胞中。

可以利用载体将DNA构建体引入到宿主细胞中。载体可以是稳定地引入到宿主细胞中的任何载体。在一些实施方案中，载体整合到宿主细胞基因组中并被复制。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、盒等。在一些实施方案中，载体是表达载体，其包含与葡糖淀粉酶编码序列有效连接的调控序列。

Sambrook等(1989)同上引文，和Ausubel(1987)同上引文，和vanden Hondel等(1991)于Bennett和Lasure(编辑)M_ORE G_ENEM_ANIPULATIONS I_N F_UNGI，Academic Press第396-428页中以及美国专利号5,874,276中提供了合适的表达和/或整合载体的实例。还可参考FungalGenetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，http://www.fgsc.net)的载体名录。特别有用的载体包括获得自例如Invitrogen和Promega的载体。

在细菌细胞中使用的合适的质粒包括能在大肠杆菌(E.coli)中进行复制的pBR322和pUC19，以及例如允许在芽孢杆菌(Bacillus)中复制的pE194。其它适合在大肠杆菌宿主细胞中使用的特定载体包括载体例如pFB6，pBR322，pUC18，pUC100，pDONR^TM201，10pDONR^TM221，pENTR^TM，3Z和4Z。

适合在真菌宿主细胞中使用的特定载体包括用于曲霉的通用表达载体pRAX，带glaA启动子的pRAX，以及在肉座菌(Hypocrea)/木霉(Trichoderma)中包括带cbh1启动子的pTrex3g。

在一些实施方案中，在细菌或真菌宿主细胞内表现出转录活性的启动子可以来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。启动子可以是突变的、截短的和/或杂合的启动子。上述启动子在本领域是已知的。用于真菌细胞，特别是丝状真菌细胞，例如木霉属(Trichoderma)或曲霉属(Aspergillus)细胞的合适的启动子的实例包括例如里氏木霉(T.reesei)启动子cbh1，cbh2，egl1，egl2，eg5，xln1和xln2等示例性启动子。其它有用的启动子的实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因(glaA)的启动子(见Nunberg等，Mol.Cell Biol.4：2306-2315(1984)和Boel等，EMBO J.3：1581-1585(1984))、米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶启动子、来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子、来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶基因和米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶基因的启动子。用于细菌细胞的合适启动子的实例包括获自大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)淀粉酶基因(amyS)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因、β-内酰胺酶基因的启动子，和tac启动子。在一些实施方案中，启动子是宿主细胞天然的启动子。例如，当里氏木霉(T.reesei)是宿主时，启动子是天然的里氏木霉(T.reesei)启动子。在其它实施方案中，启动子是和真菌宿主细胞异源的启动子。在一些实施方案中，启动子是亲本葡糖淀粉酶的启动子(例如，TrGA启动子)。

在一些实施方案中，DNA构建体包括编码信号序列的核酸，所述信号序列是连接在多肽氨基端的氨基酸序列，其指导该编码的多肽进入到细胞的分泌途径。核酸序列的编码序列的5′端可以天然包括信号肽编码区，其在翻译阅读框中天然连接至编码分泌的葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶编码序列的区段上，或者核酸序列的编码序列的5′端可以包括对该编码序列来说是外源的信号肽。在一些实施方案中，DNA构建体包括与变体葡糖淀粉酶所获自的亲本葡糖淀粉酶基因天然连接的信号序列。在一些实施方案中，信号序列是SEQ ID NO：l中所描述的序列，或与其具有至少约90％、约94％或约98％的序列同一性的序列。有效的信号序列可以包括获自其它丝状真菌酶的信号序列，所述酶例如来自木霉属(Trichoderma)(里氏木霉(T.reesei)葡糖淀粉酶，纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，内切葡聚糖酶III，或分泌蛋白酶，例如天冬氨酸蛋白酶)、腐质霉属(Humicola)(特异腐质霉(H.insolens)纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶，或灰腐质霉(H.grisea)葡糖淀粉酶)、或曲霉属(Aspergillus)(黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶和米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶)。

在其它实施方案中，包含信号序列的DNA构建体或载体与待引入到宿主细胞中的启动子序列来自相同来源。在一些实施方案中，可以使用木霉属(Trichoderma)葡糖淀粉酶同源物的天然葡糖淀粉酶信号序列，例如来自肉座菌属(Hypocrea)菌株的信号序列。

在一些实施方案中，表达载体还包括终止序列。任何在宿主细胞中有功能的终止序列都可以用于本发明。在一些实施方案中，终止序列和启动子序列来自相同的来源。在另一个实施方案中，终止序列是与宿主细胞同源的。有用的终止序列包括获自以下基因的终止序列：里氏木霉cbl1；黑曲霉(A.niger)或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(Nunberg等(1984)同上，和Boel等(1984)同上)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)邻氨基苯甲酸合酶，米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶，或构巢曲霉(A.nidulans)trpC(Punt等，Gene 56：117-124(1987))。

在一些实施方案中，表达载体包括选择性标记。选择性标记的实例包括赋予对于抗微生物剂(例如，潮霉素和腐草霉素)的抗性的标记。营养选择性标记也可用于本发明，其包括本领域已知的标记，例如amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)和pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)。在用于木霉属(Trichoderma)转化的载体系统中有用的标记是本领域已知的(见例如，Finkelstein，B_IOTECHNOLOGY O_F F_ILAMENTOUS F_UNGI中第6章，Finkelstein等(1992)编辑，Butterworth-Heinemann，Boston，MA；Kinghorn等(1992)A_PPLIED M_OLECULAR G_ENETICS O_F F_ILAMENTOUSF_UNGI，Blackie Academic and Professional，Chapman and Hall，London；Berges和Barreau，Curr.Genet.19：359-365(1991)；和van Hartingsveldt等，Mol.Gen.Genet.206：71-75(1987))。在一些实施方案中，选择性标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，允许被转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上进行生长。以构巢曲霉(A.nidulans)amdS基因作为选择性标记的应用描述于Kelley等，EMBO J.4：475-479(1985)和Penttila等，Gene 61：155-164(1987)中。

用于连接包含编码变体葡糖淀粉酶的核酸序列的DNA构建体、启动子、终止子和其它序列以及将它们插入到合适的载体中的方法，在本领域公知。通常通过在方便的限制性位点处进行连接。如果不存在此类位点，则可以依照常规实践使用合成的寡核苷酸接头(见Sambrook等(1989)同上，以及Bennett和Lasure，M_ORE G_ENE M_ANIPULATIONS I_N F_UNGI，AcademicPress，San Diego(1991)第70-76页)。此外，可以使用已知的重组技术(例如，Invitrogen Life Technologies，Gateway技术)构建载体。

7.2.宿主细胞与宿主细胞的转化

本发明还涉及包含编码本发明的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自细菌、真菌、植物和酵母细胞。术语宿主细胞包括细胞、细胞的后代以及从细胞产生的原生质体，其可以用于生产根据本发明的变体葡糖淀粉酶。

在一些实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，可选地是丝状真菌宿主细胞。术语“丝状真菌”指真菌亚门(subdivision Eumycotina)的所有丝状形式(见Alexopoulos，C.J.(1962)，I_NTRODUCTORY M_YCOLOGY，Wiley，NewYork)。这类真菌的特征是具有由几丁质、纤维素和其它复杂多糖组成的细胞壁的营养性菌丝体。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上与酵母截然不同。丝状真菌的营养生长通过菌丝伸长进行，其碳分解代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲本细胞可以是如下物种但不限于以下物种的细胞：木霉属(Trichoderma)(例如，里氏木霉、原分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)的Hypocrea jecorina无性型、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum))(Sheir-Neirs等，Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53(1984)；ATCC号56765和ATCC号26921)，青霉属(Penicilliurn)的种，腐质霉属(Humicola)的种(例如，特异腐质霉(H.insolens)、疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)和灰腐质霉(H.grisea))，Chrysosporium属的种(例如，C.lucknowense)，粘帚霉属(Gliocladium)的种，曲霉属(Aspergillus)的种(例如，米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)和泡盛曲霉(A.awamori))(Ward等，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743(1993)和Goedegebuur等，Curr.Genet.41：89-98(2002))，镰孢霉属(Fusarium)的种(例如，粉红镰孢(F.roseum)、禾赤镰孢(F.graminum)、E cerealis、尖镰孢(F.oxysporum)和F.venenatum)，脉孢霉属(Neurospora)的种(粗糙脉孢霉(N.crassa))，肉座菌属(Hypocrea)的种，毛霉属(Mucor)的种(米黑毛霉(M.miehei))，根霉属(Rhizopus)的种，以及裸孢壳属(Emericella)的种(也见Innis等，Science 228：21-26(1985))。术语“木霉属(Trichoderma)”或“木霉属物种(Trichoderma sp.)”或“木霉属种(Trichoderma spp.)”指原来或现在分类为木霉属(Trichoderma)的任何真菌属。

在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性菌细胞。非限制性实例包括链霉菌属(Streptomyces)(例如，变铅青链霉菌(S.lividans，)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌属的菌株。如本文中使用的，“芽孢杆菌属”包括“芽孢杆菌”属中的所有种，如本领域技术人员已知的，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilu)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到芽孢杆菌属在不断经历分类学重组。因此，该属旨在包括已被重分类的种，包括但不限于生物例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilu)——其现在被命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus tearothermophilus)”。

在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性菌株，例如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)的种。在其它实施方案中，宿主细胞可以是酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)的种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的种、毕赤酵母属(Pichia)的种或假丝酵母属(Candida)的种。在其它实施方案中，宿主细胞是其中的天然基因已经被失活的遗传改造的宿主细胞，例如在细菌或真菌细胞内通过缺失来实现。当希望获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞时，可使用已知的方法(例如，美国专利号5,246,853、美国专利号5,475,101和WO 92/06209中描述的方法)。可以通过完全或部分缺失、插入失活或任何其它导致基因就其预期目的而言丧失功能(例如使基因不能表达功能性蛋白质)的方法来实现基因失活。在一些实施方案中，当宿主细胞是木霉属(Trichoderma)细胞、特别是里氏木霉(T.reesei)宿主细胞时，cbh1，cbh2，egl1和egl2基因被失活和/或缺失。具有四重缺失蛋白质的示例性里氏木霉宿主细胞被提出并描述于美国专利号5,847,276和WO 05/001036中。在其它实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺陷的或蛋白酶缺失的菌株。

将DNA构建体或载体引入到宿主细胞内包括例如以下技术：转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染(例如，脂转染介导的和DEAE-葡聚糖介导的转染)、与磷酸钙-DNA沉淀进行孵育、以DNA-包被的微粒进行高速轰击、以及原生质体融合。常规的转化技术是本领域已知的(见例如，Ausubel等(1987)同上，第9章；Sambrook等(1989)同上；和Campbell等，Curr.Genet.16：53-56(1989))。

许多文献公开了用于芽孢杆菌的转化方法，这些文献包括Anagnostopoulos C.和J.Spizizen，J.Bacteriol.81：741-746(1961)以及WO02/14490。

用于曲霉属(Aspergillus)的转化方法描述于Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474(1984)；Berka等，(1991)于A_PPLICATIONS O_FE_NZYME B_IOTECHNOLOGY，Kelly和Baldwin编辑，Plenum Press(NY)；Cao等，Protein Sci.9：991-1001(2000)；Campbell等，Curr.Genet.16：53-56(1989)，以及EP 238 023中。在木霉属(Trichoderma)中表达异源蛋白质描述于美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；Harkki等，EnzymeMicrob.Technol.13：227-233(1991)；Harkki等，BioTechnol.7：596-603(1989)；EP 244,234；EP 215,594；和Nevalainen等，“The Molecular Biologyof Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologousand Heterologous Genes”(于M_OLECULAR I_NDUSTRIAL M_YCOLOGY，Leong和Berka编辑，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)第129-148页)中。还可参考W096/00787和Bajar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8202-8212(1991)用于镰孢霉属(Fusarium)菌株的转化。

在一个特定的实施方案中，制备木霉属物种用于转化涉及从真菌菌丝体制备原生质体(见Campbell等，Curr.Genet.16：53-56(1989)；Pentilla等，Gene 61：155-164(1987))。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的丝状真菌的转化是已知的(见de Groot等，Nat.Biotechnol.16：839-842(1998))。还可参考美国专利号6,022,725和美国专利号6,268,328中用于丝状真菌宿主的转化方法。

在一些实施方案中，使用可以将编码变体葡糖淀粉酶的核酸稳定整合到宿主菌株染色体中的载体系统，构建遗传稳定的转化体。然后利用已知技术来纯化转化体。

在其它一些实施方案中，宿主细胞是植物细胞，例如来自单子叶植物的细胞(例如，玉米、小麦和高粱)，或来自双子叶植物的细胞(例如，大豆)。制备用于植物转化的DNA构建体的方法和用于植物转化的方法是已知的。一些这类方法包括根癌农杆菌介导的基因转移，微粒轰击，PEG介导的原生质体转化，电穿孔等。参考美国专利号6,803,499，美国专利号6,777,589；Fromm等，BioTechnol.8：833-839(1990)；Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)。

7.3.葡糖淀粉酶的生产

本发明还涉及生产变体葡糖淀粉酶的方法，其包括用含有编码根据本发明的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，在适合表达和生产变体葡糖淀粉酶的条件下培养宿主细胞，和可选地，回收变体葡糖淀粉酶。

在本发明的表达和生产方法中，可以采用摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续的、分批和补料分批发酵)，以含有生理盐和营养物的合适培养基，在合适的条件下，培养宿主细胞(见例如，Pourquie，J.等，B_IOCHEMISTRY A_ND G_ENETICS O_F C_ELLULOSED_EGRADATION，Aubert，J.P.等编辑，Academic Press，第71-86页，1988；和Ilmen，M.等，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306(1997))。本发明可使用常规的商业制备的培养基(例如，酵母麦芽提取物(YM)培养基、Luria Bertani(LB)培养基和沙氏葡萄糖(SD)培养基)。用于细菌和丝状真菌细胞的培养条件是本领域已知的，其可以从科学文献和/或真菌来源处(例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)和真菌遗传种源中心(Fungal Genetics Stock Center))获得。当葡糖淀粉酶的编码序列处于可诱导的启动子控制下时，将诱导剂(例如，糖、金属盐或抗微生物剂)以有效诱导葡糖淀粉酶表达的浓度添加到培养基中。

在一些实施方案中，本发明涉及在植物宿主中生产变体葡糖淀粉酶的方法，其包括以包含编码根据本发明的葡糖淀粉酶变体的多核苷酸的载体转化植物细胞，并使植物细胞在适合表达和生产变体的条件下生长。

在一些实施方案中，进行分析试验以评价转化了编码本发明变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的细胞系对变体葡糖淀粉酶的表达。该试验可以在蛋白质水平、RNA水平进行，和/或使用特定针对葡糖淀粉酶活性和/或生产的功能性生物测定法进行。一些这类测定试验包括Northern印迹、点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)、利用合适的标记探针(基于核酸编码序列)进行的原位杂交，以及常规的Southern印迹与放射自显影。

此外，可以直接测量样品中的变体葡糖淀粉酶的生产和/或表达，例如，通过直接测定培养基中的还原糖(例如葡萄糖)的分析测定试验，以及通过测量葡糖淀粉酶活性、表达和/或生产的分析测定试验。特别地，可以通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法(见Goto等，Biosci.Biotechnol.Biochem.58：49-54(1994))，测定葡糖淀粉酶活性。在其它实施方案中，通过免疫学方法来评估蛋白质的表达，所述免疫学方法例如细胞、组织切片的免疫组织化学染色、或组织培养基的免疫测定(例如，通过Western印迹或ELISA)。此类免疫测定试验可用于定性和定量评估葡糖淀粉酶的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的，用于实践此类方法的许多试剂是可商业获取的。

可以通过本领域已知的多种方法，从培养基中回收或纯化本发明的葡糖淀粉酶，所述方法包括离心、过滤、提取、沉淀等。

8.组合物及其使用

本发明的变体葡糖淀粉酶可以用于酶组合物中，所述酶组合物包括但不限于淀粉水解和糖化组合物、清洁和洗涤剂组合物(例如，衣物洗涤剂、餐具洗涤剂和硬表面清洁组合物)、醇发酵组合物和动物饲料组合物。此外，变体葡糖淀粉酶可用于例如酿造、卫生保健、纺织、环境废弃物转化工艺、生物浆加工和生物质转化应用。

在一些实施方案中，包含本发明变体葡糖淀粉酶的酶组合物可以任选地与以下酶的任一种或其组合来结合使用：α-淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精葡糖转移酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、木聚糖酶、粒状淀粉水解酶和其它葡糖淀粉酶。

在一些组合物中，酶组合物包括α-淀粉酶，例如真菌(例如，曲霉属(Aspergillus)的种)α-淀粉酶或细菌(例如，芽孢杆菌属(Bacillus)的种，例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))α-淀粉酶及其变体和杂合体。在一些实施方案中，α-淀粉酶是酸稳定的α-淀粉酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶是Aspergillus kawachiα-淀粉酶(AkAA)，见美国专利号7,037,704。可用于本发明组合物的可商业获取的α-淀粉酶是已知的，其包括GZYME G997，FRED，XTRA(美国Danisco公司，Genencor分部)，120-L和(Novozymes，A/S)。

在一些实施方案中，酶组合物包括酸性真菌蛋白酶。在其它实施方案中，酸性真菌蛋白酶来自木霉属(Trichoderma)的种，其可以是美国专利号7,563,607(于2006年7月13日以US 2006/0154353公布)中公开的任何一种蛋白酶，所述专利通过参考引用整合于本文中。在其它实施方案中，酶组合物包括来自Buttiauxiella物种的肌醇六磷酸酶(例如BP-17，也见PCT专利公布WO 2006/043178中公开的变体)。

在其它实施方案中，本发明的变体葡糖淀粉酶可以与其它葡糖淀粉酶组合。在一些实施方案中，本发明的葡糖淀粉酶与一种或多种其它葡糖淀粉酶组合，所述其它葡糖淀粉酶为来自曲霉属(Aspergillus)菌株(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、A.kawachi和泡盛曲霉(A.awamori))的葡糖淀粉酶或其变体；来自腐质霉属(Humicola)菌株(特别是灰腐质霉(H.grisea))的葡糖淀粉酶或其变体，例如与WO 05/052148中公开的SEQID NO：3具有至少约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的葡糖淀粉酶；来自篮状菌属(Talaromyces)菌株(特别是埃默森篮状菌(T.emersonii))的葡糖淀粉酶或其变体；来自Athelia菌株(特别是A.rolfsii)的葡糖淀粉酶；来自青霉属(Penicillium)菌株(特别是产黄青霉(P.chrysogenum))的葡糖淀粉酶。

特别地，变体葡糖淀粉酶可用于淀粉转化工艺，特别是生产葡萄糖用于果糖糖浆、特种糖(specialty sugars)、以及从包含淀粉的底物发酵来生产醇和其它终产品(例如，有机酸、抗坏血酸和氨基酸)(G.M.A.vanBeynum等编辑(1985)S_TARCH C_ONVERSION T_ECHNOLOGY，MarcelDekker Inc.NY)。利用本发明的变体葡糖淀粉酶组合物产生的糊精可以导致至少80％、至少85％、至少90％和至少95％的葡萄糖产量。利用本发明葡糖淀粉酶从淀粉底物发酵生产醇可以包括燃料醇或可饮用醇的生产。在一些实施方案中，在与亲本葡糖淀粉酶相同的条件下使用变体葡糖淀粉酶时醇产量更高。在一些实施方案中，比亲本葡糖淀粉酶相比，醇产量高约0.5％至2.5％之间，包括但不限于多约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％和约2.4％的醇。

在一些实施方案中，本发明的变体葡糖淀粉酶用于从各种基于植物的底物水解淀粉，可以用于醇生产。在一些实施方案中，基于植物的底物包括玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、稻、甘燕、马铃薯及其组合。在一些实施方案中，基于植物的底物可以是经分级分离的植物材料例如谷粒(例如玉米)，其分级分离为例如纤维、胚芽、蛋白质和淀粉(胚乳)等成分(美国专利号6,254,914和美国专利号6,899,910)。醇发酵的方法描述于T_HE A_LCOHOL T_EXTBOOK，K.A.Jacques等编辑，2003，NottinghamUniversity Press，UK中。

在一些实施方案中，醇是乙醇。特别地，醇发酵生产工艺的特征是湿磨或干磨工艺。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶可用于湿磨发酵工艺，在其它实施方案中，变体葡糖淀粉酶可用于干磨工艺。

籽粒干磨涉及多个基本步骤，其通常包括：研磨、蒸煮、液化、糖化、发酵和固液分离来生产醇和其它副产品。将植物材料，特别是全谷粒，例如玉米、小麦或黑麦碾碎。在一些情况下，籽粒可以先被分级分离成数个组成成分。可以将碾碎的植物材料碾磨以获得粗粒或细粒。将碾碎的植物材料与液体(例如，水和/或稀釜馏物)在浆料罐中混合。浆料在喷射式蒸煮器中与液化酶(例如，α-淀粉酶)一起经历高温(例如，约90℃至约105℃或更高)，使籽粒中的淀粉溶解和水解成糊精。使混合物冷却并进一步用糖化酶(例如本发明葡糖淀粉酶)进行处理来生产葡萄糖。然后，可以在存在发酵微生物，例如产乙醇微生物，特别是酵母(酵母属(Saccharomyces)的种)的条件下，使含有葡萄糖的醪液发酵约24至120小时。将醪中的固形物与液相分离，获得醇(例如乙醇)和有用的副产品(例如酒糟)。

在一些实施方案中，将糖化步骤和发酵步骤组合，该方法称为同时糖化和发酵，或者同时糖化、酵母增殖和发酵。

在其它实施方案中，在淀粉水解的工艺中使用变体葡糖淀粉酶，其中所述工艺的温度是30℃至75℃之间，在一些实施方案中，是约40℃至约65℃之间。在一些实施方案中，在淀粉水解工艺中使用变体葡糖淀粉酶，其中pH在约3.0至约6.5之间。一些实施方案中，发酵过程包括研磨谷粒或分级分离谷粒，并将碾碎的谷粒与液体结合形成浆料，然后在单个容器内将浆料与根据本发明的变体葡糖淀粉酶、以及任选地其它酶(例如，但不限于α-淀粉酶、其它葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶或其它具有颗粒淀粉水解活性的酶)以及酵母混合，以生产乙醇和其它副产品(见例如，美国专利号4,514,496，WO 04/081193和WO 04/080923)。

在一些实施方案中，本发明涉及糖化液体淀粉溶液的方法，其包括利用本发明的变体葡糖淀粉酶进行的酶促糖化步骤。

在其它实施方案中，于啤酒酿造工艺中使用变体葡糖淀粉酶。酿造工艺在本领域公知，其通常涉及制麦芽、制醪液和发酵步骤。制醪液是将来自研磨过的大麦芽和固体附属物的淀粉转化成可发酵的和不可发酵的糖以生产麦芽汁的过程。传统的醪液制备涉及将研磨过的大麦芽及附属物与水以设定的温度和体积混合，以使在制麦芽过程中就开始的生物化学变化继续。醪液制备过程可以在多个温度下进行一段时间，以激活负责蛋白质和碳水化合物降解的内源酶。在醪液制备后，将麦芽汁与固形物(废籽粒)分离。在分离麦芽汁后，以酿酒酵母对麦芽汁进行发酵以生产啤酒。通过添加外源酶例如葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶、β-淀粉酶以及支链淀粉酶等，可以进一步水解在制醪期间形成的短支链的葡萄糖低聚物。可以就此使用麦芽汁，或可以将其浓缩和/或干燥。经浓缩和/或干燥后的麦芽汁可以用作酿酒提取物，用作麦芽提取物调味品，用于非醇类麦芽饮料、麦芽醋、早餐麦片，用于糖食等。可以将麦芽汁发酵，生产醇类饮料，典型地是啤酒，例如爱尔啤酒(Ale)、烈性爱尔啤酒、苦味啤酒、司陶特啤酒(Stout)、波特啤酒(Porter)、拉格啤酒(Lager)、Export啤酒、麦芽酒(malt liquor)、大麦酒、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或淡味啤酒(light beer)。在另一个典型实施方案中，将麦芽汁发酵来生产饮用乙醇。

本发明还提供了包含至少一种本发明变体萄糖淀粉酶的动物饲料组合物或制剂。WO 03/049550(通过参考引用就其全文整合进本文)中提供了在生产包含淀粉的饲料过程中利用葡糖淀粉酶的方法。简而言之，可以将葡糖淀粉酶变体与包含淀粉的饲料混合。葡糖淀粉酶能够降解抗性淀粉以供动物使用。根据本说明书，本发明的其它目标和优势是显而易见的。

实施例

测定试验和方法

以下测定试验和方法用于下文提供的实施例中。下文描述了用于提供变体的方法。然而，应注意的是，可以使用不同的方法提供亲本酶的变体，本发明不限于实施例中使用的方法。意思是可以采用任何适合产生变体和选择变体的方法。

96孔微量滴定板pNPG葡糖淀粉酶活性测定试验

试剂溶液是：NaAc缓冲液：200mM乙酸钠缓冲液，pH 4.5；底物：50mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma N-1377)于NaAc缓冲液中(0.3g/20ml)，和终止溶液：800mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH 10。将30μl过滤的上清液置于新的96孔平底MTP中。在每个孔加入50μlNaAc缓冲液和120μl底物，于50℃孵育30分钟(Thermolab系统iEMS培养箱/摇床HT)。通过加入100μl终止溶液，终止反应。在MTP读板器(Molecular Devices Spectramax 384 plus)中测量405nm处吸光度，利用0.011μM/cm的摩尔消光系数计算活性。

热稳定性测定试验

利用150ppm纯化酶的储备物稀释液(在50mM NaAc pH 4.0中)，通过加入6μl至294μl的50mM NaAc缓冲液(pH 4.5)中，配制3ppm的稀释液。将稀释后的样品等分至2个MTP上。一个MTP(初始板)于4℃孵育1小时，另一个MTP(剩余板)于64℃孵育(Thermolab系统iEMS培养箱/摇床HT)1小时。将剩余板在冰上冷却10分钟。将初始板和剩余板中的60μl稀释液加入到120μl 4％的可溶性玉米淀粉(pH 3.7)中，在2个分开的MTP中于32℃、900rpm(Thermolab系统iEMS培养箱/摇床HT)孵育2小时。利用下文描述的乙醇应用测定试验，在己糖激酶活性测定试验中测量两个平板的活性。

按如下的百分比(％)剩余活性来计算热稳定性：

×100％

己糖激酶活性测定试验

己糖激酶混合物：在使用前10-15分钟，向BoatIL容器葡萄糖HKRl(IL检测葡萄糖(HK)试剂盒，Instrument Laboratory # 182507-40)中加入90ml水，轻轻混合。将100μl己糖激酶混合物加入到85μl的dH₂O中。将15μl样品加入到混合物中，在黑暗中于室温孵育10分钟。10分钟后，在MTP读板器中读取340nm处的吸光度。根据葡萄糖(0-1.6mg/ml)标准曲线，计算葡萄糖浓度。

乙醇应用一从玉米淀粉释放葡萄糖

8％储备液：将8g可溶性玉米淀粉(Sigma #S4180)在室温下悬浮于40ml的dH₂O中。将浆液一部分一部分地加入到250ml烧瓶中的50ml煮沸的dH₂O中，煮5分钟。将淀粉溶液搅拌冷却至25℃，用剩余的10ml dH₂O调节体积。

终止溶液：800mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH 10。

4％(m/v)可溶性淀粉工作溶液∶用100mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.0)稀释储备液(1∶1)。

在平底96孔MTP中，以294μl 50mM NaAc缓冲液(pH 4.0)稀释6μl 150ppm的纯化酶。将60μl该稀释液加入到120μl 4％的可溶性玉米淀粉(pH 4.0)中，于32℃、900rpm(Thermolab系统iEMS培养箱/摇床HT)孵育2小时。通过加入90μl的4℃冷却的终止溶液来终止反应。将样品于冰上放置20分钟。于10℃以1118×g离心沉降淀粉5分钟(SIGMA 6K15)，将15μl上清液用于上述己糖激酶活性测定试验中，以测定葡萄糖含量。

乙醇筛选试验的数据分析和性能指数计算

使用微流控电泳仪(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，美国)测量蛋白质水平。根据生产商的操作指南(HT Protein Express，P/N760301)，准备微流控芯片和蛋白质样品。制备培养物上清液，在96孔微量滴定板中于-20℃保存直到使用，使用时通过在37℃恒温箱中保温30分钟将其融化。在短暂摇动后，将2μl的每个培养样品转移到装有7μl样品缓冲液(Caliper)的96孔PCR板(Bio-Rad，Hercules，CA，美国)中，接着在恒温控制的平板加热器上将平板加热至90℃ 5分钟。使平板冷却后，向每个样品中加入40μl水。将平板与生产商提供和校准过的蛋白质标准样一起置于仪器中。当蛋白质移动通过芯片中的焦点(focus point)时，荧光信号被记录下来，与由校准过的蛋白质标准样集产生的信号相比较来定量信号，由此确定蛋白质浓度。

在进行Caliper蛋白质测定之后，按以下方式处理数据。

检查校准梯度的峰模式的正确性。如果与该轮相关的校准梯度不足，则以邻近轮的校准梯度替换。对于峰的检测，使用Caliper软件的全峰查找选项的默认设置进行。以75kDA+/-10％，选择目的峰。将结果输出到电子数据表程序中，峰面积与乙醇筛选测定试验中的对应活性(ABS340-空白测量)相关。

以12个野生型样品的面积和活性数值，使用Grafit程序第5版(Erithacus软件，Horley，UK)的“酶动力学”方程式，结合非线性拟合功能来制作校准线。使用默认设置计算Km和Vmax参数。基于这两个参数，制作米-曼氏参照线，计算每个变体的比活。

基于比活计算性能指数(PI)。变体的PI是“变体比活/WT比活”的商。WT的PI是1.0，PI＞1.0的变体具有比WT高的比活。

TrGA变体的纯化

采用AKTA explorer 100 FPLC系统(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，通过亲和层析，一步纯化表达的TrGA变体的浓缩摇瓶培养物上清。将β-环糊精(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，TheNetherlands；85.608-8)偶联到环氧活化的琼脂糖珠(GE Healthcare，Diegem，Belgium；17-0480-01)上，用来进行纯化。以25mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.3)平衡柱子，随后施以浓缩的酶样品。使用含有10mMα-环糊精(Sigma，28705)的25mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)从柱子上洗脱结合的变体。采用硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化的样品。

纯化的TrGA变体的蛋白质定量

采用AKTA explorer 100 FPLC系统，通过阴离子交换层析，测定纯化的TrGA变体的蛋白质浓度。将纯化的样品注入到ResourceQ_1ml柱(GE Healthcare)中，用溶于25mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)的0至500mM线性梯度NaCl洗脱结合的蛋白质。测定峰面积，与具有已知浓度的TrGA标准进行比较，计算蛋白质浓度。

液化物(Liquefact)测定试验

在6孔板中，以来自当地乙醇生产商的玉米醪液化物测定变体释放的葡萄糖。在平板的每个孔中注入6g 26％DS的液化物(pH 4.3)。随后，加入300ppm的酶和400ppm的尿素，在于32℃孵育2，4和6小时后收集250μl样品。样品于14.000×g下离心5分钟，将50μl上清液转移到装有50μl终止溶液(1.1N硫酸)的eppendorf管中，静置5分钟。向管中加入250μl水，然后以0.22μm滤板过滤，注入到下文描述的HPX-87H柱中。

TrGA变体在乙醇发酵中的性能评价

从当地乙醇生产商获得玉米醪液化物样品，在一些情况下，利用稀釜馏物稀释至26％DS。利用4N的硫酸将浆料的pH调至pH 4.3。将100g或50g醪液等分试样加入125ml烧瓶中，置于32℃恒温箱中，使其平衡。在加入100μl 400ppm的尿素后，将1ml纯化的变体以预期浓度或将纯化的TrGA以两种不同浓度加入到烧瓶中。最后，向每个样品中加入333μl Red Star Red酵母溶液(15g在45ml DI水中经过30分钟水合，Lesaffre酵母公司，Milwaukee，WI)。在5，21，28，48和52小时取样，使用Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)进行HPLC(Agilent 1200系列)分析。

乙醇和碳水化合物测定

在2ml Eppendorf离心管中加入发酵啤酒(fermentor beer)，于冰上冷却10分钟。样品于14.000×g离心3分钟，将500μl上清液转移到装有50μl终止溶液(1.1N硫酸)的试管中，静置5分钟。向试管中加入5.0ml水，然后0.22μm的滤板(多屏，Millipore，Amsterdam，theNetherlands)过滤，运行HPLC。柱温：60℃；移动相：0.01N硫酸；流速：0.6ml/分钟；检测器：RI；注射体积：20μl。柱基于电荷和分子量分离分子；DP1(单糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)；DP＞3(具有聚合度大于3的寡糖)；琥珀酸；乳酸；甘油；甲醇；乙醇。

实施例1：用于在里氏木霉中表达的pTTT载体中的TrGA位点评价文库(SELs)的构建

通过BP重组反应(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)，将里氏木霉的cDNA序列(SEQ ID NO：4)克隆到pDONR^TM201中，获得进入载体pDONR-TrGA(图2)。该cDNA序列(SEQ ID NO：4)编码TrGA信号肽、原(pro-)序列、和成熟蛋白质，所述成熟蛋白质包括催化结构域、接头区域和淀粉结合结构域(SEQ ID NO：1)。SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：1示于图1B和1B中。图1C图示了前体和成熟蛋白质TrGA的结构域。

为了在里氏木霉中表达TrGA蛋白质，通过LR重组反应，将TrGA编码序列(SEQ ID NO：4)克隆到Gateway兼容的目的载体pTTT-Dest(图3)中。表达载体包含里氏木霉(T.reesei)cbhI-来源的启动子和终止子区域，其允许目的基因的强诱导型表达。载体也包含构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS选择性标记，其允许转化体以乙酰胺作为唯一氮源进行生长。表达载体也包含里氏木霉的端粒区域，其允许在真菌细胞中非染色体质粒维持。在pTTT-Dest目的质粒上，cbhI启动子和终止子区域被氯霉素抗性基因Cm^R和致死性大肠杆菌基因ccdB(两侧具有基于λ噬菌体的特异性重组位点attR1，attR2)分开。此构型允许通过LR重组反应，直接选择包含以正确方向在cbhI调控元件控制下的TrGA基因的重组体。最终的表达载体pTTT-TrGA示于图4中。

使用pDONR-TrGA进入载体(图2)作为模板和表2中所列的引物，构建SEL。所有用于诱变实验中的引物都在与设计突变的TrGA序列(SEQ ID NO：1)密码子对齐的位置上包含三联体NNS(N＝A，C，T，G，和S＝C或G)，以允许在该预先选择的位置上随机整合核苷酸。每个SEL文库的构建开始于对pDONR-TrGA进入载体的两个独立的PCR扩增：一个使用Gateway F(pDONR201-FW)和特定诱变引物R(表2)，另一个使用Gateway引物R(pDONR201-RV)和特定诱变引物F(表2)。在包括0.2μM引物的PCR扩增反应中使用高保真PHUSION DNA聚合酶(Finnzymes OY，Espoo，芬兰)。根据Finnzymes提供的操作程序，进行25个循环的反应。以所获得的PCR片段的1μl等分样作为模板，与Gateway FW和Gateway RV引物(Invitrogen)一起进行随后的融合PCR反应。在22个循环后，该PCR扩增产生在该特定的密码子位置上随机突变了的全长线性TrGA DNA片段的群体。这些片段在两侧具有Gateway特异性attL1，attL2重组位点。以PCR纯化试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，美国)纯化DNA片段，然后使用LR CLONASETMII酶混合物，根据Invitrogen提供的操作程序，将片段与100ng的pTTT-目的载体(图3)重组。将所产生的重组产物按供应商(Invitrogen)的描述，转化到大肠杆菌Max Efficiency DH5α中。通过将细菌铺于含100μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂平板(16g/L Bacto胰蛋白胨(Difco)，10g/L Bacto酵母提取物(Difco)，5g/L NaCl，16g/L Bacto琼脂(Difco))上，选择在所需位置上具有突变的最终表达载体pTTT-TrGA。

将来自每个文库的96个单菌落在包含200μL 2×YT培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的MTP中，于37℃生长24小时。直接使用培养物扩增包含引入了特定突变的区域的PCR片段。使用ABI3100序列分析仪(Applied Biosystems)对所获得的特异性PCR产物进行测序。每个文库包含在最终表达载体中的15至19个不同的TrGA变体。将这些变体分别转化到里氏木霉(T.reesei)中，如上文所述。将文库编号为1至182，指示随机突变了的TrGA序列中的特定氨基酸残基。

表2、用于产生TrGA SEL的引物

实施例2：将TrGA SEL转化到里氏木霉中

使用PEG原生质体方法将SEL转化到里氏木霉(T.reesei)中。将通过序列分析确认的SEL的大肠杆菌(E.coli)克隆置于包含1200μl的2×YT培养基(含100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素)的深孔微量滴定板(Greiner Art.No.780271)中，在37℃生长过夜。使用质粒小型试剂盒(Chemagen-Biopolymer Technologie AG，Baesweiler，德国)，从培养物中提取质粒DNA，采用经以下修改的PEG-原生质体方法(等(1987)Gene 61：155-164)，将质粒DNA分别转化到来自RL-P37的里氏木霉宿主菌株中，其中RL-P37具有4个基因的缺失(Δcbh1，Δcbh2，Δegl1，Δegl2，即“四重缺失”，见美国专利号5,847,276、WO 92/06184和WO 05/001036)。

将孢子置于木霉基本培养基(MM)(20g/L葡萄糖，15g/L KH₂PO₄，pH4.5，5g/L(NH₄)₂SO₄，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，0.6g/L CaCl₂·2H₂O，1ml 1000×里氏木霉微量元素溶液{5g/L FeSO₄·7H₂O，1.4g/L ZnSO₄·7H₂O，1.6g/LMnSO₄·H₂O，3.7g/L CoCl₂·6H₂O})中，在150rpm摇动下，于24℃生长16-24小时，用于原生质体制备。通过离心收获萌发的孢子，以15mg/ml的β-D-葡聚糖酶-G(Interspex-Art.No.0439-1)溶液处理孢子，以裂解真菌细胞壁。按等(1987，同上)描述的，以标准方法进一步制备原生质体。

将转化方法按比例缩小10倍。通常，以200ml 25％的PEG溶液处理25μl总体积中包含多达600ng的DNA和1-5×10⁵的原生质体的转化混合物，以2体积的1.2M山梨醇溶液稀释，与含乙酰胺的3％选择性Top琼脂糖MM(除了以20mM乙酰胺取代(NH₄)₂SO₄以外，其它与上述基本培养相同)混合，倾到在24孔微量滴定板或分割为48孔的20×20cmQ-盘中含乙酰胺的2％选择性琼脂糖上。将平板于28℃孵育5至8天。使用0.85％ NaCl，0.015％吐温80溶液，从平板上自每个孔收获再生的整个转化体群体的孢子。使用孢子悬浮液在96孔MTP中接种发酵。在24孔MTP的情况下，引入在具有选择性乙酰胺MM的新鲜24孔MTP上额外铺板的步骤，以富集孢子数量。

实施例3：表达TrGA变体的里氏木霉转化体在MTP格式中的发酵

将转化体发酵，测试包含表达的变体TrGA蛋白质的上清液的各种特性。简言之，在每个孔中包含200μl LD-GSM培养基(5.0g/L(NH₄)₂SO₄，33g/L 1，4-哌嗪二(丙磺酸)(pH 5.5)，9.0g/L酪蛋白氨基酸，1.0g/L KH₂PO₄，1.0g/L CaCl₂·2H₂O，1.0g/L MgSO₄·7H₂O，2.5ml/L 1000×里氏木霉痕量元素，20g/L葡萄糖，10g/L槐糖))的96孔滤板(Corning Art.No.3505)上，按照一式四份，接种表达TrGA变体的里氏木霉转化体的孢子悬浮液(每个孔中的孢子多于10⁴个)。将平板在230rpm摇动和80％的湿度下，于28℃培养6天。通过真空过滤收集培养物上清液。将上清液用于筛选具有改良特性的变体的各种测定试验中。

实施例4：从产GA的转化体制备全培养液样品

先使产TrGA的转化体在包含30ml ProFlo培养基的250ml摇瓶中预生长。Proflo培养基含有：30g/L α-乳糖，6.5g/L(NH₄)₂SO₄，2g/LKH₂PO₄，0.3g/L MgSO₄·7H₂O，0.2g/L CaCl₂·2H₂O，1ml/L 1000×痕量元素盐溶液(如上文所述)，2ml/L 10％吐温80，22.5g/L ProFlo棉籽粉(Traders Protein，Memphis，TN)，0.72g/L CaCO₃。在28℃和140rpm下生长2天后，将10％的Proflo培养物转移到包含30ml乳糖成分确定培养基的250ml摇瓶中。乳糖成分确定培养基的组分如下：5g/L(NH₄)₂SO₄，33g/L 1，4-哌嗪二(丙磺酸)缓冲液(pH 5.5)，9g/L酪蛋白氨基酸，4.5g/L KH₂PO₄，1.0g/L MgSO₄·7H₂O，5ml/L Mazu DF60-P防沫剂(Mazur Chemicals，IL)，1ml/L 1000×痕量元素溶液。将40ml/L 40％(w/v)的乳糖溶液灭菌后加入到培养基中。将装有乳糖成分确定培养基的摇瓶在28℃、140rpm下培养4-5天。

通过离心从培养物中移出菌丝体，按以上在测定试验和方法部分中的描述，分析上清液中总蛋白质含量(BCA蛋白质测定试剂盒，Pierce Cat.No.23225)和GA活性。

通过SDS-PAGE电泳确定全培养液样品的蛋白质谱。将培养物上清液样品与等体积的2×样品上样缓冲液(含还原剂)混合，以MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)在Novex 10％Bis-Tris凝胶上进行分离。以SIMPLYBLUE SafeStain(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)，显现SDS凝胶中的多肽条带。

实施例5：具有改良热稳定性的变体

在所述条件下，亲本TrGA分子具有在15和44％之间的残留活性(每日变异)。基于同一批次的WT TrGA热稳定性，计算了性能指数。性能指数是商值PI＝(变体残留活性)/(WT TrGA残留活性)。利用该商值，性能指数＞1表示改良的稳定性。具有大于1.0的热稳定性能指数的变体示于以下表3中。

表3、热稳定性筛选

表3包括那些在测试时显示出比亲本葡糖淀粉酶增加的性能指数的变体。这些包括以下位点：10，42，59，61，68，72，73，97，98，99，102，114，133，140，144，152，153，182，204，205，214，216，228，229，230，231，236，241，242，263，264，265，268，269，276，284，291，300，301，303，311，338，342，344，346，349，359，361，364，375，379，382，390，391，393，394，410，417，430，431，433，436，442，444，448，451，493，495，503，508，511，518，519，520，527，531，535，536，537，539，563，和577。

显示出最高增加(PI≥1.20)的取代的位点包括：T10S，T42V，E68C，E68M，G73F，G73W，K114M，K114Q，I133V，N153A，N153E，N153M，N153S，N153V，W228V，V229I，V229L，S230Q，S231V，D236R，L264D，L264K，A268D，S291A，S291F，S291H，S291M，S291T，A301P，A301R，V338I，V338N，V338Q，S344M，S344P，S344Q，S344R，S344V，G361D，G361E，G361F，G361I，G361L，G361M，G361P，G361S，G361W，G361Y，A364D，A364E，A364F，A364G，A364K，A364L，A364M，A364R，A364S，A364T，A364V，A364W，T375N，L417K，L417R，R433C，R433E，R433G，R433L，R433N，R433S，R433V，I436H，T495K，T495S，E503A，E503C，E503V，Q508R，Q511H，A519K，A519R，A519Y，V531L，A535K，A535N，A535P，A535R，A539E，A539R，A539S，N563C，N563E，N563I，N563K，N563L，N563Q，N563T，N563V，N577K，N577P，和N577R。

实施例6：在乙醇筛选测定试验中具有改良比活(SA)的变体

使用上述测定试验，在乙醇筛选测定中测试了变体。表4显示了与亲本TrGA PI相比具有性能指数(PI)＞1.0的变体的筛选测定结果。PI是从WT和变体酶的比活(活性/mg酶)计算的。其是商值“变体比活/WT比活”。野生型TrGA比活的PI是1.0，具有PI＞1.0的变体具有高于亲本TrGA的比活。比活是：乙醇筛选测定试验中测量的活性除以上述Caliper测定试验中获得的结果。

表4、乙醇筛选

表4提供了具有性能指数至少为1.0的变体。这些包括以下位点：

10，14，15，23，59，60，61，65，67，68，72，73，97，98，99，102，110，113，133，140，144，145，147，152，153，164，182，204，205，214，216，219，228，229，230，231，236，239，241，242，263，264，265，268，269，276，284，291，300，301，303，311，338，342，344，346，349，359，361，364，375，379，382，390，391，393，394，410，417，418，430，431，433，442，444，448，451，493，494，495，502，503，508，511，518，519，520，531，535，536，和539。

显示出最高比活(PI≥1.20)的位点包括：N061I，T067M，A072Y，S097N，S102A，S102M，S102R，I133T，N145I，N153D，T205Q，Q219S，W228A，W228F，W228H，W228M，S230C，S230F，S230G，S230L，S230N，S230Q，S230R，S231L，I239V，I239Y，N263P，A268C，A268G，A268K，S291A，T342V，K394S，L417R，L417V，T430K，A431I，A431L，A431Q，R433Y，T451K，T495M，A519I，A520C，A520L，A520P，A535R，V536M，和A539R。

实施例7：组合的比活和热稳定性变体

对实施例6-7中的变体分析了组合的增加的比活和增加的热稳定性。表5显示了与亲本TrGA PI相比，在两种特性上都具有PI＞1.0的变体。这些包括以下位点：10，15，59，61，68，72，73，97，99，102，140，153，182，204，205，214，228，229，230，231，236，241，242，264，265，268，276，284，291，300，301，303，311，338，344，346，349，359，361，364，375，379，382，391，393，394，410，417，430，431，433，444，448，451，495，503，511，520，531，535，536，和539。

表5、组合变体

实施例8：组合变体的构建和表征

基于实施例5-7中显示的数据，对具有单取代的一组选定变体进行了进一步表征。这些变体在位置：43，44，61，73，294，417，430，431，503，511，535，539和563上具有单取代。在这些位点中，43，44和294于以前在筛选实验中在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中被鉴定。见WO08/045489，其通过参考引用整合到本文中。从大规模发酵中纯化变体，测定热稳定性和比活的PI。具体地，使用各种底物，包括DP7、玉米淀粉和液化物(liquefact)来测定比活。结果显示于表6中。

表6、一组选定的单位点变体的PI，每个变体均获自500ml发酵

此外，使用PCR方法构建在43，44，61，73，294，417，430，431，503，511，535，539和563中具有取代的组合的变体。简言之，使用质粒pDONR-TrGA(图2)作为骨架，构建组合的变体。构建组合的变体的方法基于Gateway技术(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用于产生组合的变体的引物显示于表2和7中。选择以下合成构建体方法来构建所有组合变体。CTCTCT[XbaI位点][MF]GAGAGGGG[attB1][GAP组合变体][attB2位点]CCCCAGAG[MR][HindIII]AGAGAG

以限制性酶Xba-I和HindIII处理该构建体。将消化过的片段连接到经Xba-I/HindIII处理的pBC(pUC19衍生载体)中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，铺于添加了100μg/ml的氨苄青霉素的选择性琼脂上。将平板于37℃培养16小时。自选择性平板分离菌落并接种到选择性液体培养基中。在37℃和250rpm培养16小时后，使用标准的质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒与pDONR 2.21(Invitrogen，Carlsbad，CA)组合，以产生含特定GAP组合变体的Gateway进入载体。将反应混合物转化到大肠杆菌Max高效DH5α(Invitrogen，Carlsbad，CA)中并铺于选择性琼脂(添加有50μg/ml卡那霉素的2xTY)上。在37℃过夜培养后，挑取单菌落进行序列分析(BaseClear B.V.，Leiden，荷兰)。将组合变体亚克隆到pTrexTrTel中，按WO 06/060062中的描述在里氏木霉宿主菌株中进行表达。

表7、用于构建组合变体的引物

从大规模发酵(即，100ml或500ml发酵)中纯化变体，测定热稳定性(Ts)和比活的PI。具体地，使用不同的底物，包括DP2，DP3，DP4，DP5，DP6，DP7，玉米淀粉(CS)，和液化物(Liq)，测定了比活。PI显示于表8中。表8中的“N/D”表示“没有进行”。

实施例9：TrGA的晶体结构

测定了分辨率下的里氏木霉(Hypocrea jecorina)葡糖淀粉酶(TrGA)的完整三维结构。表9显示了该木霉葡糖淀粉酶晶体结构的坐标。TrGA以含有599个残基以及在天然宿主中将正常发生的所有翻译后修饰的完整形式结晶。按如下产生和分析晶体结构：

对于蛋白质表达和纯化，将编码H.jecorina GA的基因，根据美国专利号7,413,887中描述的操作程序，进行了克隆和表达。

所有结晶实验使用的TrGA蛋白质材料都初步地通过阴离子交换层析进行一步纯化：通过在25mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中按1∶10稀释样品，制备由180mg/ml总蛋白组成的、表达TrGA的浓缩培养物上清液。使用HiPrep 16/10 Q琼脂糖FF柱(GE Helthcare)进行阴离子交换纯化。用4倍柱体积(CV)的起始缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 8.0)平衡HiPrep柱，然后施用10ml稀释的蛋白质样品。使用8CV的在运行缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 8.0)中0至140mM线性梯度的NaCl洗脱结合的蛋白质。在约80mM NaCl盐浓度下，从HiPrep Q琼脂糖柱上洗脱结合的TrGA。合并含有纯TrGA蛋白质的级分，并使用具有10kD分子量截留(MWCO)的25ml Vivaspin离心浓缩管(Viva Science)将其浓缩至50mg/ml。使用以50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)平衡的DG-10脱盐柱(Bio-Rad)，将纯化和浓缩的TrGA材料进行缓冲液交换。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。然后将初步纯化和浓缩的TrGA蛋白质储备液于-20℃储存。

引入了两个额外的纯化步骤，即另一次阴离子交换纯化和大小排阻纯化，来增加TrGA蛋白质材料的结晶能力。按如下进行这两个额外的纯化步骤。在第一个阴离子交换纯化步骤中，使用10ml MonoQ柱(GEHelthcare)。将1ml初步纯化和冷冻的TrGA材料(50mg蛋白质)样品解冻，通过将样品在新鲜缓冲液中重复稀释至6ml，再利用6ml 5kDMWCO浓缩管将样品再次浓缩至0.5ml，将缓冲液转变为20mM Tris-HCl，pH 8.0。在最后一次浓缩步骤后，在蒸馏水中稀释TrGA样品，直到蛋白质样品的电导率达到与阴离子纯化的起始缓冲液(即，25mM Tris-HCl，pH 8.0)的电导率一致。首先用4倍柱体积(CV)的起始缓冲液平衡MonoQ柱，然后在柱上施用稀释的蛋白质样品。通过两个不同的梯度从MonoQ柱上洗脱结合的蛋白质。首先，使用4CV线性pH梯度，其中起始缓冲液的pH从8.0降至6.0。在第二个梯度中，使用8CV长盐梯度，其中运行缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 6.0)中的盐浓度从0增加至350mMNaCl。在第二个盐梯度过程中，在约150mM的NaCl浓度处，发现结合的TrGA被从柱上洗脱下来。合并含有TrGA的级分，并使用6ml 5kDMWCO Vivaspin浓缩管将其浓缩至2ml。然后，将浓缩的TrGA样品加至Superdex 200 16/60大小排阻柱(GE Helthcare)上，所述排阻柱已经用4CV的20mM Tris-Cl(pH 8.0)和50mM NaCl平衡，所述平衡液也用作运行缓冲液。在大小排阻纯化后，合并来自主洗脱峰的级分，并利用6ml 5kD MWCO Vivaspin浓缩管将其浓缩至蛋白质浓度约为7.5mg/ml。

对于蛋白质结晶，用来发现初步的TrGA结晶条件的蛋白质样品，是通过阴离子交换纯化过一次，然后于-20℃储存的TrGA材料的样品。在开始结晶实验前，将该TrGA蛋白质样品解冻，并用50mM乙酸纳缓冲液(pH 4.3)稀释至约12mg/ml。使用正交X-射线数据集，通过分子置换(MR)，解析TrGA的结构，该高分辨率的正交数据集用于最终的正交空间群TrGA结构模型。发现，使用悬滴式蒸气扩散方法(McPherson1982)，正交TrGA晶体在由25％PEG 3350、0.20M乙酸铵、0.10MBis-Tris pH 5.5(RESERVOIR溶液)组成的溶液中于20℃生长。通过将等量的蛋白质溶液(12mg/ml)和Reservoir溶液混合至终体积为10μl来制备结晶滴。发现TrGA晶体属于正交晶系空间群P212121，晶胞大小约为： 具有2.3的计算的V_m(Matthews，B.W.(1968)J.Mol.Biol.33：491-497)，且一个分子在不对称单元中。

对于X-射线数据收集，在室温，从安放在密封毛细管内的单晶体收集了两套正交TrGA数据集。在home X-射线源上(MSC/Rigaku(Molecular Structures公司，The Woodlands，Texas)，Raxis IV++ IMAGEPLATE检测器，带聚焦镜，利用来自Rigaku RU200旋转阳极发生器的Cu Kα辐射)，收集了初步的lo分辨率正交TrGA X-射线数据集，用于通过分子置换方法(MR)来解析结构。使用由MSC/Rigaku提供的d＊trek软件，对该数据集进行处理、调整(Scale)和平均。在100K，从单个冷冻的TrGA晶体收集了C心单斜数据集，其中所述晶体在由25％ PEG 3350，15％甘油，50mM CaCl₂和0.1M Bis-Tris(pH 5.5)组成的冷冻保护剂(作为冷冻保护剂)中平衡，安放于人造丝纤维环内，在转移到同步加速器前投入液氮中冷冻。在位于瑞典Lund的MAX LAB，以同步加速器源，光束911：5，收集了高分辨率正交数据集和C心单斜数据集用MOSFLM处理在同步加速器源收集的两套数据集，并用包含在CCP4程序包(Collaborative Computational Project Number 4 1994)中的程序SCALA调整。除非另外提及，使用CCP4程序包(CollaborativeComputational Project Number 4 1994)进行所有后续数据处理。从每套数据集留出5％的一组反射，用于监测R-free(Brünger，A(1992)Nature，355：472-475)。

通过MR和自动置换程序MOLREP(Collaborative ComputationalProject Number 4 1994)(包括在CCP4程序包中)，利用初步的lo分辨率正交数据集，以及利用泡盛曲霉GA(AaGA)变体X 100(pdb条目1GLM(Aleshin等(1994)J.Mol.Boil.238：575-591)的坐标作为搜索模型，初步解析了TrGA结构。编辑泡盛曲霉GA搜索模型，以在进行MR实验前，去除附着在蛋白质分子上的所有糖基化(例如N-和O-糖基化)部分和所有溶剂分子。将来自初步lo分辨TrGA数据集的分辨率在36.8和之间的所有反射都用于MR解析。MR程序发现了单旋函数解(single rotation function solution)，最大为背景之上11.1σ，次最大为背景之上3.8σ。平动(translation)函数解产生了48.7％的R-因子，并具有17.4的对照因子(contrast factor)。利用程序Refmac 5.0(Murshudov等(1997)Acta Crystallogr.D53：240-255)，对MR解析进行了10轮约束最小二乘方精修。这将结晶学R-因子降低至31.1％，而R-free值从42.2％降至41.1％。

将精修的MR解析模型用于从lo-分辨率正交TrGA数据集计算初始密度图。在该电子密度图中，可以很容易鉴别出在TrGA的19和26位残基之间的二硫桥的电子密度，所述二硫桥不存在于泡盛曲霉(A.awamori)变体X 100结构模型中。这被认为是一个指标，指示该电子密度图的质量足够用于从氨基酸序列构建TrGA的结构模型。将基于lo-分辨率数据集的该初始TrGA结构模型，通过利用Coot(Emsley和Cowtan，(2004)Acta Crystallogr.D boil Crystallogr.60：2126-2132)的模型构建和利用Refmac 5.0的最大似然性精修的交替循环，进行了精修。

通过如下方式，将该初始TrGA结构模型的解析延伸到该高分辨率正交数据集的解析：利用程序Refmac 5.0，将初始TrGA结构模型相对于该高分辨率数据集，进行10轮约束精修来进行精修。利用精修程序中的水挑取方案，自动定位结构模型中的大部分水分子，然后通过肉眼检查人工选取或剔除。所有结构比较都使用Coot(Emsley和Cowtan(2004)同上)或O(Jones等(1991)Acta Crystallogr.A47：110-119)，并采用PyMOL(Delano W.L.(2002)The PyMOL Molecular Graphics System.Palo Alto，CA，USA；Delano Scientific)制图。

根据这些结果，可见TrGA催化核心区段遵循Aleshin等(1992)对AaGA描述的相同(α/α)6-桶拓扑学，由α螺旋双桶组成，其中外部螺旋的C-末端引导入内部螺旋的N末端。可以鉴别电子密度中的关键差异，例如在残基19和26之间的二硫桥，和相对于AaGA的插入(残基257-260)。包含80-100的片段也经历了广泛的模型重建。在Asn 171鉴别出一个主要的糖基化位点，其上附着了多达四个糖苷部分。在AaGA中也鉴别出了相似的糖基化位点。此外，于残基22-23、44-45和122-123之间包含三个顺式肽的催化核心在TrGA和AaGA之间是保守的。总的，当比较TrGA和AaGA的催化核心的坐标时，在453个Cα原子中的409个之间有的rms变化。

表9：TrGA的X-射线坐标

实施例10：TrGA和AaGA之间的同源性

将实施例9中鉴定的TrGA晶体结构，与以前已鉴定的泡盛曲霉GA(AaGA)晶体结构叠置。AaGA晶体结构来自蛋白质数据库(PDB)，且结晶的该AaGA形式是仅含有催化结构域(PDB条目编号：1GLM)的形式。将所有三个区域完整的TrGA的结构确定至1.8埃分辨率(见表9和实施例9)。利用坐标(见表9)，将结构与以前测定的泡盛曲霉菌株X 100的催化结构域的坐标进行比对(Aleshin等，J.Mol.Biol.238：575-591(1994))。如图6-7中可见，催化结构域的结构紧密重叠，使得可以基于结构的叠置来鉴别等价残基。

基于该分析，鉴别了能够在TrGA中突变并且导致增加的热稳定性和/或比活的位点。这些位点包括位于活性位点的108，124，175和316位。还鉴别了特定的成对变体Y47W/Y315F和Y47F/Y315W。鉴别的其它位点是I43，D44，P45，D46，R122，R125，V181，E242，Y310，D313，V314，N317，R408和N409。由于高结构同源性，预期在TrGA中的位点上发现的有益变体，在泡盛曲霉和其它同源的葡糖淀粉酶中也将具有相似的效果。

TrGA接头(残基454-490)定义为跨两个二硫桥之间的区域的区段，其中一个二硫桥位于残基222和453之间，一个位于残基491和587之间。接头中的9个残基是脯氨酸。从晶体结构上，接头从分子的后面以宽弧线形式延伸，然后于靠近底物结合面的表面上在第477位赖氨酸残基后急转。接头以无规则卷曲延伸，通过Tyr 452，Pro 465，Phe 470，Gln 474，Pro 475，Lys 477，Val 480和Tyr 486的侧链的相互作用被锚定到催化结构域表面上的区域。

淀粉结合结构域由两个缠绕的β折叠的β-夹层组成，一端栓系Cys491和Cys 587之间的二硫桥，另一端具有通过长环连接的一系列环(包含淀粉结合位点)。TrGA SBD的结构与由NMR(Sorimachi等，Structure 5：647-661(1997))测定的AnGA SBD和来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的β淀粉酶的SBD(Mikami，B.等，Biochemistry 38：7050-61(1999))的平均结构十分相似。图9显示了包括SBD的AnGA和TrGA晶体结构的比对。当与这些SBD之一或两者比对时，一个环由于高度可变而突出，所述环对应于残基537-543(在黑曲霉(A.niger)中，该环是554-560，在蜡样芽孢杆菌(B.cereus)中，该环是462-465)。在β-环糊精的NMR结构中，淀粉类似物与AnGA的SBD形成复合物(Sorimachi等(1997)同上)，环在结合环糊精后显著移位。因此，该环被称为“柔性环”。该柔性环组成“结合位点2”的一部分(TrGA中该结合位点见图9)。在AnGA中还鉴定了第二结合位点(结合位点1)，与其它碳水化合物结合蛋白质具有相似性的主要位点。总的来说，这些SBD的结合位点1中的残基和甚至是侧链构象的保守性是非常高的。这些图显示了在SBD和催化结构域之间用来结合淀粉的这些结合位点中的相互作用。

总之，接头及SBD与催化结构域之间的相互作用似乎具有普遍的模式。该相互作用的形式是与邻近结构域的表面区域相互作用的锚定侧链。通常，锚定残基存在于接头片段上。在CD和SBD之间相互作用的情况下，锚定残基可以由两个结构域中的任一个来贡献，例如来自CD的Ile43和Phe 29残基或来自SBD的第592位残基。

实施例11：阿卡波糖与TrGA结合的模型

测定了与抑制剂阿卡波糖形成复合物的TrGA的晶体结构。通过在阿卡波糖中浸泡预生长的天然TrGA晶体来获得复合物的晶体。在浸泡3天后，将晶体安放到密封玻璃毛细管中，以Rigaku Raxis IV++影像平板检测器收集x-射线衍射至分辨率为使坐标与差异电子密度图相适应。针对总计41276个反射(代表在27和分辨力之间收集的所有数据)，将模型精修至R-因子为0.154且R-free为0.201。所得到的精修过的结构的模型示于图9中。

基于SBD的存在影响不溶性淀粉水解的认知，得出SBD应该与较大的淀粉分子存在相互作用。因此，将TrGA的结构与以下已知结构进行了比较：(1)结合了阿卡波糖的AaGA的CD和(2)与β-环糊精形成了复合物的黑曲霉SBD。这显示，在结合位点2结合的β-环糊精接近底物位置，如与泡盛曲霉CD结合的阿卡波糖的位置所指示的。因此，将来自AaGA结构模型(pdb条目1GAI，Aleshin等，1994，同上)的阿卡波糖的坐标比对到TrGA活性位点中。进一步，对结合环糊精的AnGA SBD结构(pdb条目1AC0：Sorimachi等，1997，同上)进行比对。由此，构建了阿卡波糖与TrGA结合的模型(见图9)。该模型显示，SBD使TrGA CD位于分解的淀粉的附近，也阻止底物扩散离开酶，同时在水解后从活性位点释放产物。TrGA的SBD将沿着位点1与淀粉结合，并利于如下的定位，在该定位中分解的片段可以结合到位于松散末端中的位点2(指向催化位点(催化结构域的活性侧))。该模型显示了SBD和接头的结构是怎样对提议的酶功能作出贡献的。涉及CD、接头和SBD之间特定相互作用的氨基酸侧链对里氏木霉GA是特定的，然而，在其它葡糖淀粉酶中，互补序列变化将使得类似的整体相互作用和结构域并置成为可能。

基于该模型，鉴定了在TrGA SBD中可以进行取代以获得增加的稳定性和/或比活的位点。因此，构成结合位点1的部分的两个环可能是用于改变以增加或降低与较大淀粉分子结合的候选者。它们是环1(aa 560-570)和环2(aa 523-527)。因为在第525和527位氨基酸的两个Trp(色氨酸)残基可能直接参与淀粉结合，改变它们将不是有利的。然而，下面的残基，包括516-518位，将是有益的，下面的558-562位残基也是。来自第570-578位残基的环也是用于改变的良好候选者。第534-541位残基是结合位点2的部分，与CD上的催化位点相互作用。因此，它们可能是用于改变以增加或降低比活的良好候选者。

因为TrGA SBD的高度结构同源性，可预期的是，在里氏木霉GA中的位点上找到的有利变异，将在泡盛曲霉以及其它同源葡糖淀粉酶中具有类似效果。因此，TrGA SBD的结构提供了对该类及相关酶进行工程改造以使其与亲本葡糖淀粉酶相比而具有改变的特性的基础。这些改变的特性可能有利于基于淀粉原料的燃料产生工艺。

在不脱离本发明范围和精神的前提下，本发明所述方法和系统的各种修改和改变对本领域技术人员是显而易见的。虽然已经结合特定的代表性实施方案对本发明进行了描述，应该理解的是，要求保护的发明主题不应过分被限于此类特定的实施方案。实际上，对本领域技术人员显而易见的、为实施本发明对所述模式的各种修改也意在下列权利要求的范围内。

Claims (13)

1.葡糖淀粉酶变体，其为SEQ ID NO:1或2的亲本葡糖淀粉酶的变体，其中所述变体与其亲本的差异为，当亲本为SEQ ID NO:2时在SEQ IDNO:2的相关位置上的、或当亲本为SEQ ID NO:1时在所述亲本葡糖淀粉酶中的等价位置上的、以下取代集合之一：

L417V/A431L/A539R；

L417V/A431L/A539R/I43Q；

L417V/A431L/A539R/N61I；

L417V/A431L/A539R/A535R；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I；

L417V/A431L/A539R/N61I/A535R；

L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/N61I；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I；

L417V/A431L/A539R/I43R；

L417V/A431L/A539R/I43R/N61I；

L417V/A431L/A539R/I43R/N61I/A535R/T430A；

L417R/A431L/A539R；和

L417G/A431L/A539R。

2.权利要求1的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比较，葡糖淀粉酶变体显示出增加的热稳定性，其中所述变体与其亲本的差异为以下取代集合之一：

L417V/A431L/A539R/I43Q；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I；

L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I。

3.权利要求1的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比较，葡糖淀粉酶变体显示出增加的比活，其中所述变体与其亲本的差异为以下取代集合之一：

L417V/A431L/A539R/I43Q；

L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I；

L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q；

L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I。

4.权利要求1的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比较，葡糖淀粉酶变体显示出增加的热稳定性和增加的比活，其中所述变体与其亲本的差异为以下取代集合：L417V/A431L/A539R/I43Q。

5.编码上述权利要求之任一的变体的多核苷酸。

6.包含权利要求5的多核苷酸的载体。

7.包含权利要求6的载体的宿主细胞。

8.在宿主细胞中生产葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括在合适葡糖淀粉酶变体表达和生产的条件下培养权利要求7的宿主细胞，以及产生葡糖淀粉酶变体。

9.根据权利要求8的方法，其还包括从培养物回收葡糖淀粉酶变体。

10.包含权利要求1至4之任一的葡糖淀粉酶变体的酶组合物。

11.转化淀粉的方法，所述方法包括使用权利要求10的酶组合物水解淀粉。

12.发酵醇的方法，所述方法包括使用权利要求10的酶组合物发酵醇。

13.生产高葡萄糖糖浆的方法，所述方法包括使用权利要求10的酶组合物生产高葡萄糖糖浆。