JP5827227B2 - グルコアミラーゼの変異体 - Google Patents

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Description

配列表
それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる配列番号１〜１０９９を含む配列表もまた、添付される。
改変された特性を有し、かつ醸造およびグルコースシロップ生産における使用などに適した、親グルコアミラーゼのコンビナトリアル変異体が開示される。変異体をコードするＤＮＡコンストラクトおよび宿主細胞においてグルコアミラーゼ変異体を生産するための方法もまた、開示される。
グルコアミラーゼ酵素（グルカン１，４−α−グルコヒドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．３）は、デンプン加水分解エキソ型カルボヒドラーゼであり、デンプンまたは関連するオリゴ分子および多糖分子の非還元末端からの、連続するグルコース単位の除去を触媒する。グルコアミラーゼは、デンプンの直鎖状および分岐グルコシド結合（たとえばアミロースおよびアミロペクチン）の両方を加水分解することができる。
グルコアミラーゼは、細菌、菌類、酵母、および植物のたくさんの株によって生産される。特に興味深く、商業的に重要なグルコアミラーゼは、たとえば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）［Svensson et al., Carlsberg Res.Commun.48:529-544 (1983)；Boel et al., EMBO J.3:1097-1102 (1984)；Hayashida et al., Agric.Biol.Chem.53:923-929 (1989)；米国特許第５，０２４，９４１号；米国特許第４，７９４，１７５号、およびＷＯ８８／０９７９５］；タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）（米国特許第４，２４７，６３７号；米国特許第６，２５５，０８４号；および米国特許第６，６２０，９２４号）；Ｒｈｉｚｏｐｕｓ［Ashikari et al., Agric.Biol.Chem.50:957-964 (1986)；Ashikari et al., App.Microbio.Biotech.32:129-133 (1989)、および米国特許第４，８６３，８６４号］；フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（ＷＯ０５／０５２１４８および米国特許第４，６１８，５７９号）；ならびにＭｕｃｏｒ［Houghton-Larsen et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.62:210-217 (2003)］の株から細胞外に生産される菌類の酵素である。これらの酵素をコードする遺伝子の多くは、酵母、菌類、および／または細菌の細胞においてクローニングされ、かつ発現されてきた。
商業的に、グルコアミラーゼは、非常に重要な酵素であり、デンプンの加水分解を必要とする種々様々の用途において使用されてきた（たとえば、デンプンからグルコースおよび他の単糖を生産するために）。グルコアミラーゼは、高フルクトースコーン甘味料を生産するために使用され、これらは、アメリカ合衆国において甘味料市場の５０％以上を構成する。
一般に、グルコアミラーゼは、デンプンをデキストリンに、次いでグルコースに加水分解するために、デンプン加水分解プロセスにおいてアルファ−アミラーゼと共に使用されてもよい、また、一般に使用されている。次いで、グルコースは、他の酵素（たとえばグルコースイソメラーゼ）によってフルクトースに変換されてもよい；結晶化されてもよい；またはたくさんの最終産物を生産するために発酵において使用されてもよい（たとえばエタノール、クエン酸、乳酸、コハク酸、アスコルビン酸中間体、グルタミン酸、グリセロール、および１，３−プロパンジオール）。デンプンおよび／またはセルロース含有材料の発酵においてグルコアミラーゼを使用することによって生産されるエタノールは、燃料の供給源としてまたはアルコールの消費に使用されてもよい。
高グルコースコーンシロップ（ＨＧＣＳ）および高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の生産に商業的に使用される高固形分濃度で、グルコアミラーゼは、縮合反応によってグルコースからジ、トリ、およびテトラサッカリドを合成する。これは、デンプンにおけるアルファ−（１−６）−Ｄ−グルコシド結合のゆっくりとした加水分解およびＤ−グルコース由来の様々な蓄積する縮合産物、主にイソマルトースの形成のために起こる。したがって、多くの従来のプロセスにおけるグルコース収率は、理論収率の９５％を超えない。このプロセスによって世界的に生産されるシロップの量は、非常に多く、デンプン１トン当たりのグルコース収率における非常にわずかな増加でさえ、商業的に重要となる。
グルコアミラーゼは、主に低炭水化物ビールの生産のために醸造において使用される。他のアミラーゼ（麦芽由来など）と組み合わせて、グルコアミラーゼは、デンプンがグルコース単位に至るまでの非常に広範囲な加水分解を行う。グルコースは、酵母によってアルコールに即時変換され、醸造所が、発酵から非常に高いアルコール収率を得、かつ同時に、残留する炭水化物が非常に少ないビールを得るのを可能にする。発酵体は、水を用いて所望のアルコール％まで希釈され、最終的なビールは、「低炭水化物」として販売される。
グルコアミラーゼは、長年、商業的な用途における使用に成功してきたが、改善された比活性、イソマルトースなどのような縮合産物の形成の低下、および熱安定性の増加などのような改変された特性を有する新しいグルコアミラーゼについての必要性は、なお存在する。
デンプンの加水分解の間の縮合産物の合成を低下させるための、グルコアミラーゼ変異体の使用が、本発明において企図されている。これらのグルコアミラーゼ変異体は、触媒ドメインおよび／またはデンプン結合ドメイン内にアミノ酸置換を含有する。変異体は、改変された比活性、イソマルトースなどのような縮合産物の形成の低下、および／または改変された熱安定性などのような改変された特性を示す。
一態様では、相互連結ループ２’中におよび／またはループ１中におよび／またはヘリックス２中におよび／またはループ１１中におよび／またはヘリックス１２中に、配列番号２または等価な親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むデンプン結合ドメインおよび触媒ドメインを有するグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用が、本明細書において記載される。
さらなる態様では、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス１２に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用が、記載される。
さらなる態様では、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用が、記載される。
さらなる態様では、上述の２つ以上のアミノ酸置換が、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列を有するヘリックス１２に対するものである、グルコアミラーゼ変異体の使用が、記載される。
さらなる態様では、その結晶形をしている場合に、主鎖原子の原子座標が、等価な主鎖原子のアライメント後に、ＴｒＧＡの等価な主鎖原子の原子座標（ＷＯ２００９／０６７２１８における表２０において定義される）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有する結晶構造を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメイン、および触媒ドメインを有し、デンプン結合ドメインの相互連結ループ２’中にならびに／または触媒ドメインのループ１中におよび／もしくはヘリックス２中におよび／もしくはループ１１中におよび／もしくはヘリックス１２中に、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含む、グルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用が、記載される。
一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、２つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、５３９位にあり、かつアミノ酸置換は、４４位にあり、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応し、この配列は、親グルコアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、４４位におけるアミノ酸置換は、４４Ｃではない。
本開示は、本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドにさらに関する。一態様は、核酸を含むプラスミドである。他の態様は、記載されるポリヌクレオチドを含むまたは記載されるグルコアミラーゼ変異体を発現することができるベクターである。他の態様は、記載されるプラスミドまたはベクターを含む、たとえばそれを用いて形質転換された宿主細胞である。他の態様は、変異グルコアミラーゼをコードする核酸配列を染色体の中に安定して統合している宿主細胞である。他の態様は、記載されるグルコアミラーゼ変異体を発現することができる細胞である。他の態様は、グルコアミラーゼ変異体を発現させるための方法であって、宿主細胞または細胞を得ることと、細胞または宿主細胞からグルコアミラーゼ変異体を発現させることと、所望により、グルコアミラーゼ変異体を精製することとを含む方法である。
本開示のさらなる態様は、本明細書において記載される少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体を含む酵素組成物およびその使用である。
本開示のさらなる態様は、デンプンまたは部分的に加水分解されたデンプンを、グルコースを含有するシロップに変換するための方法であり、このプロセスは、本明細書において記載される少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体または酵素組成物の存在下において液体デンプン溶液を糖化することを含む。
本開示のさらなる態様は、一連のデンプン変換プロセスにおけるなどのようにデンプン変換プロセスにおける、オリゴ糖、マルトデキストリン、またはグルコースシロップを生産するプロセスにおける、および高フルクトースコーンシロップを生産するためのプロセスにおける、本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用である。
さらなる態様では、アルコール（ａｌｃｈｏｈｏｌ）発酵プロセスにおける本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用が、提供される。
本開示のさらなる態様は、醸造用の麦芽汁を生産するための方法であって、グリストからマッシュを形成することと、記載されるグルコアミラーゼ変異体または記載される酵素組成物とマッシュを接触させることとを含む方法である。
本開示のさらなる態様は、ビールの生産のための方法であって、ａ）マッシュを調製することと、ｂ）マッシュをろ過して、麦芽汁を得ることと、ｃ）麦芽汁を発酵させて、ビールを得ることとを含み、記載されるグルコアミラーゼ変異体は、工程（ａ）および／または工程（ｂ）および／または工程（ｃ）に添加される方法である。
本開示のさらなる態様は、醸造プロセスのマッシング工程または発酵工程のどちらかにおいて発酵性の糖の生産を増強するための、記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用である。
本開示のさらなる態様は、ビールであり、ビールは、ａ）マッシュを調製する工程と、ｂ）マッシュをろ過して、麦芽汁を得る工程と、ｃ）麦芽汁を発酵させて、ビールを得る工程と、ｄ）ビールを低温殺菌する工程とによって生産され、記載されるグルコアミラーゼ変異体は、工程（ａ）および／または工程（ｂ）および／または工程（ｃ）に添加される。
添付の図面は、本明細書中に組み込まれ、その一部を構成し、実施形態を例証する。
図１Ａは、６３２のアミノ酸を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）（配列番号１）を示す。シグナルペプチドには下線を引き、アミノ酸残基ＳＶＤＤＦＩ（配列番号１２）で始まり、４５３のアミノ酸残基を有する触媒領域（配列番号３）は太字とし、リンカー領域はイタリック体とし、デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）は、イタリック体とし、かつ下線を引く。ＴｒＧＡの成熟タンパク質（配列番号２）は、触媒ドメイン（配列番号３）、リンカー領域（配列番号１０）、およびデンプン結合ドメイン（配列番号１１）を含む。ＴｒＧＡグルコアミラーゼ分子のＳＢＤナンバリングに関しては、本開示において、ａ）成熟ＴｒＧＡの配列番号２における４９１〜５９９位および／またはｂ）配列番号１１における１〜１０９位が参照され、これは、成熟ＴｒＧＡの単離ＳＢＤ配列に相当する。ＴｒＧＡ分子の触媒ドメインナンバリングに関しては、配列番号２および／または配列番号３が参照される。図１Ｂは、ＴｒＧＡをコードするｃＤＮＡ（配列番号４）を示す。図１Ｃは、前駆体および成熟タンパク質ＴｒＧＡドメインを示す。 図２は、ＴｒＧＡのｃＤＮＡ（配列番号４）を含む目的プラスミドｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡを示す。 図３は、プラスミドｐＴＴＴ−Ｄｅｓｔを示す。 図４は、最終的な発現ベクターｐＴＴＴ−ＴｒＧＡを示す。 図５Ａおよび５Ｂは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ（ＡａＧＡ）（配列番号５）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＡｏＧＡ）（配列番号７）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（ＴｒＧＡ）（配列番号３）；Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ（ＨｇＧＡ）（配列番号８）；およびＨｙｐｏｃｒｅａ ｖｉｎｏｓａ（ＨｖＧＡ）（配列番号９）由来の親グルコアミラーゼの触媒ドメインのアライメント比較を示す。同一のアミノ酸はアスタリスク（＊）によって示す。図５Ｃは、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ（ＴｅＧＡ）成熟タンパク質配列（配列番号３８４）を示す。図５Ｄおよび５Ｅは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１１）；Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ（ＨｇＧＡ）（配列番号３８５）；Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ（ＴｈＧＡ）（配列番号３８６）；Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＴｅＧＡ）（配列番号３８７）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号３８８）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ（ＡａＧＡ）（配列番号３８９）；およびＴｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（ＴｔＧＡ）（配列番号３９０）由来の親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）を比較するアライメントを示す。 図６は、側面から見たトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）（配列番号２）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（灰色）（配列番号５）の三次元構造の比較を示す。側面は活性部位を基準として判断し、活性部位の入口は分子の「上部」にある。 図７は、上部から見たトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）（配列番号２）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（灰色）（配列番号５）の三次元構造の比較を示す。 図８は、結合部位１および２を示す側面から見たＴｒＧＡ（配列番号２）およびＡｎＧＡ（配列番号６）の三次元構造のアライメントを示す。 図９は、ＴｒＧＡ結晶構造へのアカルボースの結合のモデルを示す。 図１０は、異なる濃度のグルコース、マルトース、およびイソマルトースを含有する標準物質ならびにＴｒＧＡおよびＡｎＧＡと共にインキュベートしたグルコース由来の反応産物を含有する試料を有するＴＬＣプレートを示す。
グルコアミラーゼは、デンプンの加水分解を必要とする種々様々の用途において商業的に重要な酵素である。出願人らは、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列の特異的な領域内の位置にある種の改変を導入することによって、アルファ−（１−６）結合を形成する割合が低下することおよび／またはイソマルトースなどのような縮合産物の形成が低下することを発見した。グルコアミラーゼがアルファ−（１−４）結合を切断する割合と比較した、それがアルファ−（１−６）結合を形成する割合の低下は、実用的な意味合いを有する。
本発明者らは、いくつかの実施形態において、親グルコアミラーゼと比較して、縮合の低下ならびに／またはイソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の比（ＩＳ／ＳＨ比）の低下を示す、親グルコアミラーゼの多くの変異体を提供した。いくつかの実施形態では、糖化プロセスにおいて本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体を使用すると、高グルコース百分率を有するシロップが生産される。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体を使用すると、醸造工程のマッシングおよび／または発酵工程において発酵性の糖の生産の増強がもたらされる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体を使用すると、発酵の実質的な程度の増強がもたらされる。これらの改変された特性は、親グルコアミラーゼにおいて選択された位置を突然変異させる、たとえば置換することによって得られる。これは、下記により詳細に記載することとする。
したがって、さらなる態様では、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス１２に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用が、記載される。
さらなる態様では、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用が、記載される。
したがって、さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体の使用が、記載され、グルコアミラーゼ変異体は、その結晶形をしている場合に、主鎖原子の原子座標が、等価な主鎖原子のアライメント後に、ＴｒＧＡの等価な主鎖原子の原子座標（ＷＯ２００９／０６７２１８における表２０において定義される）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有する結晶構造を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメイン、および触媒ドメインを有し、上述の変異体は、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるために、デンプン結合ドメインの相互連結ループ２’中にならびに／または触媒ドメインのループ１中におよび／もしくはヘリックス２中におよび／もしくはループ１１中におよび／もしくはヘリックス１２中に、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含む。さらなる態様では、ＴｒＧＡの等価な主鎖原子の原子座標（ＷＯ２００９／０６７２１８における表２０において定義される）からの平均二乗偏差は、０．１１未満などのようにまたは０．１０未満などのように、０．１２ｎｍ未満である。
一態様では、相互連結ループ２’中におよび／またはループ１中におよび／またはヘリックス２中におよび／またはループ１１中におよび／またはヘリックス１２中に、配列番号２または等価な親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むデンプン結合ドメインおよび触媒ドメインを有するグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用が、本明細書において記載される。
さらなる態様では、使用は、グルコアミラーゼ変異体について記載され、上述の２つ以上のアミノ酸置換は、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス１２に対するものである。
さらなる態様では、使用は、グルコアミラーゼ変異体について記載され、上述の２つ以上のアミノ酸置換は、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列を有するヘリックス１２に対するものである。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の１つ、２つ、または３つなどのように、少なくとも１つのアミノ酸置ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つなどのように、少なくとも１つのアミノ酸置換である。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換である。さらなる態様では、相互連結ループ’２中に１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換である。さらなる態様では、ループ１中に１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換がある。さらなる態様では、ヘリックス２中に１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換がある。さらなる態様では、ループ１１中に１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換がある。さらなる態様では、ヘリックス１２中に１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換がある。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、相互連結ループ２’の５２０〜５４３位、５３０〜５４３位、または５３４〜５４３位内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、ループ１の３０〜５０位、３５〜４８位、または４０〜４６位内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス２の５０〜６６位、５５〜６４位、または５８〜６３位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、ループ１１の４０５〜４２０位、４１０〜４２０位、または４１５〜４２０位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス１２の４２１〜４３４位、４２５〜４３４位、または４２８〜４３４のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性などのように、親グルコアミラーゼに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する。一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する。
さらなる態様では、親グルコアミラーゼまたはグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、または３９０のデンプン結合ドメインと、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する。さらなる態様では、親グルコアミラーゼまたはグルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９の触媒ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する。
一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４４、６１、４１７、および４３１位から選択される位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつａ）４４位にアミノ酸置換を有し、ならびに／またはｂ）４１７および４３１位の両方にアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４４位にアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４１７および４３１位にアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４４位および６１位にアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、４３位にアミノ酸置換を有し、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、６１位にアミノ酸置換を有し、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、５３９位のアミノ酸置換は、５３９Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、４４位のアミノ酸置換は、４４Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、４１７位のアミノ酸置換は、４１７Ｒ／Ｖであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、４１７位のアミノ酸置換は、４１７Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、４１７位のアミノ酸置換は、４１７Ｖであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、４３１位のアミノ酸置換は、４３１Ｌであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、４３位のアミノ酸置換は、４３Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。一態様では、６１位のアミノ酸置換は、６１Ｉであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
一態様では、縮合産物は、イソマルトースである。一態様では、デンプンの加水分解は、醸造プロセスにおけるものである。たとえば醸造において、イソマルトースの形成は、発酵の間にそれをアルコールに変換することができないので、望ましくない。
ビールは、従来より、オオムギに由来する麦芽などのような麦芽および所望により穀物粒などのような副原料に由来し、ホップで風味をつけたアルコール飲料と呼ばれる。
ビールは、本質的に同じプロセスによって様々な穀物から作製することができる。穀物デンプンはすべて、グルコース残基がアルファ−１，４−またはアルファ−１，６−結合によって連結されたグルコースホモポリマーであるが、前者が優勢である。
発酵麦芽飲料を作製するためのプロセスは、一般に、醸造と呼ばれる。これらの飲料を作製するのに使用される主要な原材料は、水、ホップ、および麦芽である。さらに、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造業者が粉砕した酵母、コメ、ソルガム、精製コーンスターチ、オオムギ、オオムギデンプン、脱穀（ｄｅｈｕｓｋｅｄ）オオムギ、コムギ、コムギデンプン、加熱乾燥穀類、穀類フレーク、ライムギ、カラスムギ、ジャガイモ、タピオカ、ならびにコーンシロップ、サトウキビシロップ、転化糖シロップ、オオムギ、および／またはコムギシロップなどのようなシロップ、ならびにその他同種のものなどのような副原料は、デンプンの供給源として使用されてもよい。デンプンは、最終的には、デキストリンおよび発酵性の糖に変換されるであろう。
多くの理由で、選択された品種のオオムギから主として生産される麦芽は、ビールの全体的な特徴および品質に対して最も大きな効果が有すると考えられる。第１に、麦芽は、ビールにおける主要な香味料である。第２に、麦芽は、発酵性の糖の大部分を提供する。第３に、麦芽は、タンパク質を提供し、これは、ビールのボディおよび泡の特徴に寄与するであろう。第４に、麦芽は、マッシングの間に必要な酵素活性を提供する。
ホップもまた、風味づけを含めて、ビールの品質に著しく寄与する。特に、ホップ（またはホップ成分）は、望ましい苦味物質をビールに添加する。さらに、ホップは、タンパク質沈殿剤として作用し、保存剤となり、かつ発泡および安定化を助ける。
ビールを作製するためのプロセスは、当技術分野においてよく知られているが、手短かに言えば、それは、５つの工程を含む。（ａ）マッシングおよび／または副原料煮沸、（ｂ）麦芽汁分離および抽出、（ｃ）麦芽汁の煮沸およびホッピング、（ｄ）冷却、発酵、および保存、ならびに（ｅ）熟成、加工、および包装。
典型的に、第１の工程では、粉砕されたまたは破砕された麦芽は、水と混合され、制御温度下で一定の期間保持され、麦芽中に存在する酵素が、麦芽中に存在するデンプンを発酵性の糖に変換するのを可能にする。
第２の工程では、マッシュは、「ロータータン」またはマッシュフィルターに移され、液体は、穀物残渣から分離される。この甘い液体は「麦芽汁」と呼ばれ、残りの穀物残渣は「使用済み穀物」と呼ばれる。マッシュは、典型的に、抽出にかけられ、これは、使用済み穀物から残留する可溶性抽出物を回収するためにマッシュに水を添加することを伴う。
第３の工程では、麦芽汁は、激しく煮沸される。これにより、麦芽汁を殺菌し、かつ色、風味、および香りを生じさせるのを助け、かつ酵素活性を不活性化する。ホップは、煮沸の間のある時点で添加される。
第４の工程では、麦芽汁は、冷却され、発酵槽に移され、発酵槽は酵母を含有するまたは発酵槽に酵母が添加される。酵母は、発酵によって糖をアルコールおよび炭酸ガスに変換し、発酵の終了時に、発酵槽は冷まされるまたは発酵槽は発酵を停止させるために冷まされてもよい。酵母は、凝集され、除去される。
最後の工程では、ビールは、一定の期間冷却され、保存され、この間に、ビールは浄化され、その風味が生じ、ビールの外観、風味、および貯蔵寿命を損なういかなる材料も沈降する。包装前に、ビールは、炭酸ガスで飽和され、所望によりろ過され、低温殺菌される。
発酵後に、約２重量％〜約１０重量％のアルコールを通常含有する飲料が得られる。非発酵性の炭水化物は、発酵の間に変換されず、最終的なビールにおいて大多数の溶解固形物を形成する。
この残渣は、麦芽アミラーゼがデンプンのアルファ−１，６−結合を加水分解することができないために残る。非発酵性の炭水化物は、１２オンスのビール当たり約５０カロリーを提供する。
従来の醸造プロセスについてのさらなる情報および本発明に適用されることとなる醸造工学の分野において使用される用語の定義は、"Technology Brewing and Malting" by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 2nd revised Edition 1999, ISBN 3-921690-39-0 or 3rd edition (2004):ISBN 3-921690-49-8において見つけられてもよい。
最近、特にアメリカ合衆国市場では、ライトビール、低カロリービール、またはローカロリービールと称される醸造飲料が広く普及してきた。アメリカ合衆国において定義されるように、これらのビールは、メーカーの「通常の」ビールよりも約３０％少ないカロリーを有する。
本明細書において使用されるように、用語「ライトビール、低カロリービール、またはローカロリービール」は、特にアメリカ合衆国市場における、醸造飲料の最近の広い普及に関連がある。アメリカ合衆国において定義されるように、これらの非常に薄いビールは、メーカーの「通常の」ビールよりも約３０％少ないカロリーを有する。従来の醸造プロセスについてのさらなる情報は、"Technology Brewing and Malting" by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3rd completely updated edition, 2004, ISBN 3-921690-49-8"において見つけられてもよい。
本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用が、本明細書において開示され、発酵性の糖（複数可）の生産は、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して増強する。本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用が、本明細書においてさらに開示され、発酵性の糖の生産は、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスのマッシング工程において増強する。本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用が、本明細書において開示され、発酵性の糖の生産は、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスの発酵工程において増強する。本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用が、本明細書において開示され、発酵性の糖は、グルコースである。
副産物の量を著しく低下させながらグルコースを生産することができるグルコアミラーゼは、たとえばグルコースシロップの生産または醸造において多大な商業的利益となるであろう。本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用が、本明細書においてさらに開示され、デンプンの加水分解は、グルコースシロップを生産するためのプロセスにおけるものである。一態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成（ＩＳ）およびデンプン加水分解活性（ＳＨ）の間の比の低下を示す。一態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、デンプン加水分解活性の低下を示す。一態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵の実質的な程度の増強を示す。一態様では、グルコアミラーゼは、同等の条件下で、グルコアミラーゼＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）によって形成される縮合産物の量よりも少ない量の縮合産物を形成する。一態様では、グルコアミラーゼは、同等の条件下で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）によって形成される縮合産物の量と本質的に同じ、それよりも５％以下で高い、８％以下で高い、または１０％以下で高い量の縮合産物を形成する。一態様では、グルコアミラーゼの投入量は、タンパク質濃度に基づいて同じである。一態様では、グルコアミラーゼの投入量は、活性アッセイにおける活性の測定に基づいて同じである。
本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体は、触媒ドメインおよび／またはデンプン結合ドメイン内にアミノ酸置換を含有する。変異体は、改善された熱安定性、イソマルトースなどのような縮合産物の改変された形成ならびに／または発酵の実質的な程度の増強ならびに／またはイソマルトース合成（ＩＳ）およびデンプン加水分解活性（ＳＨ）の間の比の低下ならびに／または比活性などのような改変された特性を示してもよい。たとえば、イソマルトースなどのような縮合産物の形成が低下した変異体は、醸造工業（ｂｒｅｗｉｎｇ ｉｎｄｕｓｔｒｉ）において所望の産物を作製する性能を著しく改善してもよい。
１．定義および略語
１．１．定義
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語はすべて、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary Of Microbiology And Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994)およびHale & Markham, The Harper Collins Dictionary Of Biology, Harper Perennial, N.Y.(1991)は、本明細書において使用される用語のうちの多くの一般的な意味を当業者に提供する。ある種の用語は、鮮明性および参照の容易さのために下記に定義される。
本明細書において使用されるように、用語「グルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）」は、デンプンならびに関連するオリゴ糖および多糖の非還元末端からのＤ−グルコースの放出を触媒する酵素を指す。
用語、「親」または「親配列」は、宿主細胞において自然のまたは自然に存在する配列を指す。親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、３、５、６、７、８、および９において記載されるグルコアミラーゼ配列ならびに配列番号２に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するグルコアミラーゼを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるように、「等価な位置」は、ＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼアミノ酸配列（配列番号２）および三次元構造との、論議されている親グルコアミラーゼのアミノ酸配列のアライメントおよび論議されている親グルコアミラーゼの三次元構造のアライメントに基づいて２つの親配列に共通である位置を意味する。したがって、配列アライメントまたは構造アライメントは、等価性を決定するために使用されてもよい。
用語「ＴｒＧＡ」は、配列番号３において示される配列を有する触媒ドメインを含む、配列番号２において示される成熟タンパク質配列を有する親トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ配列を指す。ＴｒＧＡの単離、クローニング、および発現は、両方が参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００６／０６００６２および米国特許第７，４１３，８８７号において記載される。いくつかの実施形態では、親配列は、タンパク質工学の出発点となるグルコアミラーゼ配列を指す。本明細書におけるグルコアミラーゼアミノ酸のナンバリングは、ＴｒＧＡ（配列番号２および／または３）を有するグルコアミラーゼの配列アライメントに基づく。
語句「タンパク質またはポリペプチドの成熟形態」は、タンパク質またはポリペプチドの最終的な機能的な形態を指す。たとえば、グルコアミラーゼの成熟形態は、シグナルペプチドを欠いていてもよい。例示するために、ＴｒＧＡの成熟形態は、触媒ドメイン、リンカー領域、およびデンプン結合ドメインを含み、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
本明細書において使用されるように、「グルコアミラーゼ変異体」および「変異体」という用語は、親グルコアミラーゼ配列に対してある程度のアミノ酸配列同一性を有するグルコアミラーゼを基準として使用される。変異体は、親配列に類似しているが、それらのアミノ酸配列中に、配列においてそれらを親グルコアミラーゼと異なるものにする少なくとも１つの置換、欠失、または挿入を有する。ある場合には、変異体は、アミノ酸配列中に、配列においてそれらを親と異なるものにする少なくとも１つの置換、欠失または、挿入を含むように操作されているおよび／または遺伝子操作されている。さらに、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの機能的な特質を保持していてもよく、たとえば、親グルコアミラーゼの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％であるグルコアミラーゼ活性を維持する。それが選択されたものである場合、１００％よりも高い活性もまた、有することができる。
「変異体」は、比較のために最適にアライメントされた場合に、親ポリペプチド配列に対して、少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９．５％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの触媒ドメインに対して、少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９．５％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインに対して、少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９．５％の配列同一性を有していてもよい。配列同一性は、親配列または変異体配列の全長にわたって測定することができる。
配列同一性は、当技術分野において知られている標準の技術を使用して決定される［たとえばSmith and Waterman, Adv.Appl.Math.2:482 (1981)；Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)；Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444 (1988)；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＨＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのようなプログラム；ならびにDevereux el al., Nucleic Acid Res., 12:387-395 (1984)を参照されたい］。
「核酸配列同一性パーセント（％）」または「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、出発配列（たとえば配列番号２）のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基と同一である、候補配列中のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基の百分率として定義される。配列同一性は、出発配列の全長にわたって測定することができる。
「配列同一性」は、配列アライメントの方法によって本明細書において決定される。本開示のために、アライメント方法は、Altschul et al.［Altschul et al., J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)；およびKarlin et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787 (1993)］によって記載されるＢＬＡＳＴである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである［Altschul et al, Meth.Enzymol.266:460-480 (1996)を参照されたい］。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメーターを使用するが、これらの大部分はデフォルト値に設定される。調整可能なパラメーターは、以下の値を用いて設定される。オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の組成および興味のある配列を検索する特定のデータベースの組成に依存してプログラム自体によって設定される。しかしながら、値は、感度を増加させるために調整されてもよい。アミノ酸配列同一性値％は、アライメント領域における「より長い」配列の残基の総数によって割られた、マッチする同一の残基の数によって決定される。「より長い」配列は、アライメント領域における大部分の実際の残基を有する配列である（アライメントスコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されたギャップは無視される）。
用語「最適なアライメント」は、最も高い同一性パーセントスコアを与えるアライメントを指す。
本明細書において使用されるように、用語「触媒ドメイン」は、ポリペプチドの構造領域を指し、これは、基質加水分解のための活性部位を含有する。
用語「リンカー」は、デンプン結合ドメインを含むアミノ酸配列を、触媒ドメインを含むアミノ酸配列と共有結合する、３〜４０のアミノ酸残基を一般に有する短いアミノ酸配列を指す。
用語「デンプン結合ドメイン」は、デンプン基質に優先的に結合するアミノ酸配列を指す。
本明細書において使用されるように、「突然変異配列」および「突然変異遺伝子」という用語は、区別なく使用され、宿主細胞の親配列中に生じる、少なくとも１つのコドンにおける改変を有するポリヌクレオチド配列を指す。突然変異配列の発現産物は、親と比較して改変されたアミノ酸配列を有する変異タンパク質である。発現産物は、改変された機能的な能力を有していてもよい（たとえば酵素活性の増強）。
本明細書において使用される、ポリペプチドの文脈における用語「特性」またはその文法上の等価物は、選択するまたは検出することができるポリペプチドの任意の特質または属性を指す。これらの特性は、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク分解性の分解に対する抵抗性、ＫＭ、ＫＣＡＴ、ＫＣＡＴ／ＫＭ比、タンパク質フォールディング、基質に結合する性能および分泌される性能を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される、核酸の文脈における、用語「特性」またはその文法上の等価物は、選択するまたは検出することができる核酸の任意の特質または属性を指す。これらの特性は、遺伝子転写に影響を与える特性（たとえばプロモーターの強度またはプロモーター認識）、ＲＮＡプロセシングに影響を与える特性（たとえばＲＮＡスプライシングおよびＲＮＡ安定性）、翻訳に影響を与える特性（たとえば調節、リボソームタンパク質へのｍＲＮＡの結合）を含むが、これらに限定されない。
用語「熱安定性」および「耐熱性」は、デンプン基質の加水分解中の支配的な条件下での所与の期間にわたるある温度に対する曝露の後に、たとえば、温度の変化に曝露されながらも、指定される量の酵素活性を保持する本開示のグルコアミラーゼ変異体を指す。
熱安定性などのような特性の文脈における用語「安定性の増強」は、他の参照（つまり親）グルコアミラーゼと比較して、ある期間にわたって、より高く保持されるデンプン加水分解活性を指す。
熱安定性などのような特性の文脈における用語「安定性の減少」は、他の参照グルコアミラーゼと比較して、ある期間にわたってより低く保持されるデンプン加水分解活性を指す。
用語「比活性」は、１ｍｇのグルコアミラーゼタンパク質当たりの活性として定義される。いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼについての活性は、本明細書において記載されるエタノールアッセイによって決定され、デンプン基質から生産されるグルコースの量として表現される。いくつかの実施形態では、タンパク質濃度は、本明細書において記載されるＣａｌｉｐｅｒアッセイを使用して決定することができる。
用語「活性」および「生物学的活性」は、特定のタンパク質と関連する生物学的活性を指す。所与のタンパク質の生物学的活性は、当業者によってそのタンパク質に典型的に帰する任意の生物学的活性を指すことになる。たとえば、グルコアミラーゼと関連する酵素活性は加水分解である、したがって、活性グルコアミラーゼは、加水分解活性を有する。
本明細書において区別なく使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのどちらかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、一、二、もしくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学的に、生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるように、用語「ＤＮＡコンストラクト」、「形質転換用ＤＮＡ」、および「発現ベクター」は、宿主細胞または生物の中に配列を導入するために使用されるＤＮＡを指すために区別なく使用される。ＤＮＡは、当業者らに知られているＰＣＲまたは任意の他の適した技術（複数可）によってインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で生成されてもよい。ＤＮＡコンストラクト、形質転換用ＤＮＡ、または組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、または核酸断片の中に組み込むことができる。典型的に、発現ベクター、ＤＮＡコンストラクト、または形質転換用ＤＮＡの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写されることとなる核酸配列およびプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、異種ＤＮＡ断片を組み込み、かつ宿主細胞において発現する性能を有する。
本明細書において使用されるように、用語「ベクター」は、１つまたは複数の細胞型の中に核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチドコンストラクトを指す。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット、およびその他同種のものを含む。
本明細書において使用されるように、細胞の中に核酸配列を導入するための文脈において、用語「導入された」は、細胞の中に核酸配列を移すのに適した任意の方法を指す。導入のためのそのような方法は、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、コンジュゲーション、および形質導入を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるように、用語「形質転換された」または「安定して形質転換された」は、そのゲノムの中に統合されたまたは少なくとも２世代の間、維持されるエピソームプラスミドとして自然でない（異種）ポリヌクレオチド配列を有する細胞を指す。
本明細書において使用されるように、「選択可能マーカー」および「選択マーカー」という用語は、ベクターを含有する宿主の選択を容易にする、宿主細胞において発現させることができる核酸（たとえば遺伝子）を指す。典型的に、選択可能マーカーは、外因性のＤＮＡを含有する細胞が、形質転換の間にいかなる外因性の配列も得ていない細胞と区別されるのを可能にするために、宿主細胞に対して抗菌性の抵抗性または代謝の有利性を与える遺伝子である。
本明細書において使用されるように、用語「プロモーター」は、下流の遺伝子の転写を指示するために機能する核酸配列を指す。プロモーターは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも名づけられる）と一緒に、所与の遺伝子を発現させるのに必要である。一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含むが、これらに限定されない。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。たとえば、分泌リーダー（つまりシグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しており、かつ読取り相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）中にあることを意味する。
本明細書において使用されるように、用語「遺伝子」は、ポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡセグメント）を指す。ポリペプチドをコードし、コード領域に先行する領域および後続する領域ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
本明細書において使用されるように、「オルソログ」および「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通祖先の遺伝子（つまり相同遺伝子）から進化した、異なる種における遺伝子を指す。典型的に、オルソログは、進化の過程の間に同じ機能を保持する。オルソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測において使用を見出す。
本明細書において使用されるように、「パラログ」および「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内の複製によって関連する遺伝子を指す。オルソログは、進化の過程を通して同じ機能を保持しているが、たとえいくつかの機能が本来のものと関連していることが多くても、パラログは新しい機能を進化させる。パラロガス遺伝子の例は、すべてセリンプロテイナーゼであり、同じ種内で同時に生じるトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびトロンビンをコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、当技術分野において知られているように核酸の鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合するプロセスを指す。
核酸配列は、２つの配列が、中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズすることができる」と考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。たとえば、「最高のストリンジェンシー」は、典型的に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じ、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約５〜１０℃下で生じ、「中程度のストリンジェンシー」は、プローブのＴｍの約１０〜２０℃下で生じ、「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約２０〜２５℃下で生じる。実用的には、最高のストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使用されてもよいが、中程度のまたは低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列相同体を同定するまたは検出するために使用することができる。
中および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、当技術分野においてよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性キャリヤーＤＮＡ中約４２℃でのハイブリダイゼーション、その後に続く、室温での２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中での２回の洗浄ならびに４２℃での０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中でのさらなる２回の洗浄を含む。中ストリンジェント条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性煎断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃での一晩のインキュベーション、その後に続く、約３７〜５０℃での１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄を含む。当業者らは、プローブ長およびその他同種のものなどのような因子を適応させるために、必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を知っている。
本明細書において使用されるように、「組換え」は、異種もしくは同種核酸配列の導入によって修飾されたまたは細胞がそのように修飾された細胞に由来する細胞またはベクターに対する言及を含む。したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞の自然の（非組換え）形態内で同一の形態で見つけられない遺伝子を発現するまたは計画的なヒトの介入の結果として、他の場合には異常発現される、低発現される、もしくは全く発現されない自然の遺伝子を発現する。
本開示の実施形態では、突然変異ＤＮＡ配列は、少なくとも１つのコドンにおける部位飽和突然変異誘発（ｓｉｔｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて生成される。他の実施形態では、部位飽和突然変異誘発は、２つ以上のコドンについて実行される。さらなる実施形態では、突然変異ＤＮＡ配列は、親配列と約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％超の同一性を有する。代替の実施形態では、突然変異ＤＮＡは、たとえば放射、ニトロソグアニジン、およびその他同種のものなどのような任意の知られている突然変異誘発性の手順を使用してインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で生成される。次いで、所望のＤＮＡ配列は、単離され、本明細書において提供される方法において使用される。
本明細書において使用されるように、「異種タンパク質」は、宿主細胞において自然に存在しないタンパク質またはポリペプチドを指す。
酵素が、対応する野生型細胞において発現されるレベルよりも高いレベルで細胞において発現される場合、酵素は、宿主細胞において「過剰発現される」。
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において区別なく（ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）使用される。本開示および請求項では、アミノ酸残基についての従来の１文字および３文字コードが、使用される。３文字は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従って定義されるアミノ酸をコードする。ポリペプチドが遺伝子コードの縮重により１つを超えるヌクレオチド配列によってコードされてもよいこともまた理解される。
本開示の変異体は、以下の命名法によって記載される。［本来のアミノ酸残基／位置／置換アミノ酸残基］。たとえば、７６位でのアルギニンに対するロイシンの置換は、Ｒ７６Ｌとして表される。１つを超えるアミノ酸が所与の位置で置換される場合、置換は、１）Ｑ１７２Ｃ、Ｑ１７２Ｄ、もしくはＱ１７２Ｒ、２）Ｑ１７２Ｃ、Ｄ、もしくはＲ、または３）Ｑ１７２Ｃ／Ｄ／Ｒとして表される。置換に適した位置が、特定のアミノ酸が示唆されずに本明細書において同定される場合、任意のアミノ酸残基が、その位置に存在するアミノ酸残基に対して置換されてもよいことが理解されたい。変異グルコアミラーゼが他のグルコアミラーゼと比較して欠失を含有する場合、欠失は、「＊」を用いて示される。たとえば、位置Ｒ７６での欠失は、Ｒ７６＊として表される。２つ以上の連続的なアミノ酸の欠失は、たとえば（７６〜７８）＊として示される。
「プロ配列」は、タンパク質の分泌に必要なシグナル配列および成熟タンパク質の間のアミノ酸配列である。プロ配列の切断により、成熟活性タンパク質がもたらされるであろう。
用語「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、タンパク質の成熟形態または前駆体形態の分泌に参加してもよいヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の任意の配列を指す。シグナル配列のこの定義は、機能的な定義であり、タンパク質の分泌の達成に参加する、タンパク質遺伝子のＮ末端部分によってコードされるアミノ酸配列をすべて含むことを意味する。それらは、普遍的ではないが、タンパク質のＮ末端部分にまたは前駆体タンパク質のＮ末端部分に結合していることが多い。シグナル配列は、内因性または外因性であってもよい。シグナル配列は、タンパク質（たとえばグルコアミラーゼ）と通常関連しているものまたは他の分泌タンパク質をコードする遺伝子由来のものであってもよい。
タンパク質またはペプチドの「前駆体」形態という用語は、タンパク質のアミノまたはカルボニル末端に作動可能に連結されたプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を指す。前駆体はまた、プロ配列のアミノ末端に作動可能に連結された「シグナル」配列を有していてもよい。前駆体はまた、翻訳後活性に関与するさらなるポリヌクレオチド（たとえば、それから切断されて、タンパク質またはペプチドの成熟形態を残すポリヌクレオチド）を有していてもよい。
「宿主株」または「宿主細胞」は、本開示によれば、ＤＮＡを含む発現ベクターに適した宿主を指す。
用語「に由来する」および「から得られる」は、論議されている生物の株によって生産されるまたは生産可能なグルコアミラーゼだけではなく、そのような株から単離されるＤＮＡ配列によってコードされ、そのようなＤＮＡ配列を含有する宿主生物において生産されるグルコアミラーゼを指す。さらに、用語は、合成のおよび／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされるならびに論議されているグルコアミラーゼの同定用の特質を有するグルコアミラーゼを指す。
この定義の範囲内の「誘導体」は、一般に、誘導体が、野生型、自然、または親形態としての類似する目的に有用である程度まで、野生型、自然、または親形態において観察される特徴的な加水分解活性を保持する。グルコアミラーゼの機能的誘導体は、本開示のグルコアミラーゼの一般的な特質を有する、自然に存在する、合成的に生産された、または組換えで生産されたペプチドまたはペプチド断片を包含する。
用語「単離された」は、それが自然に存在する場合、自然環境から取り出される材料を指す。「精製」タンパク質は、少なくとも部分的に均一に精製されたタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、精製タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、約１０％超純粋、約２０％超純粋、または約３０％超純粋である。本開示のさらなる態様は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、高度に精製された形態（つまり、約４０％超純粋、約６０％超純粋、約８０％超純粋、約９０％超純粋、約９５％超純粋か、約９７％超純粋、または約９９％超純粋）のタンパク質を包含する。
本明細書において使用されたように、用語、「コンビナトリアル突然変異誘発」は、出発配列の変異体のライブラリーが生成される方法を指す。これらのライブラリーでは、変異体は、突然変異のあらかじめ定められたセットから選ばれる１つまたはいくつかの突然変異を含有する。さらに、方法は、突然変異のあらかじめ定められたセットのメンバーでなかったランダムな突然変異を導入するための手段を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、参照によってこれによって組み込まれる米国特許第６，５８２，９１４号において記載されるそれらのセットを含む。代替の実施形態では、コンビナトリアル突然変異誘発方法は、市販で入手可能なキットを包含する［たとえばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ］。
本明細書において使用されるように、用語「突然変異体のライブラリー」は、ほとんどのそれらのゲノムにおいて同一であるが、１つまたは複数の遺伝子の異なる相同体を含む細胞の集団を指す。そのようなライブラリーは、たとえば、改善された形質を有する遺伝子またはオペロンを同定するために使用することができる。
本明細書において使用されるように、用語「乾燥固形分含有量（ＤＳまたはｄｓ）」は、乾燥重量ベースの％でのスラリーの全固形分を指す。
本明細書において使用されるように、用語「イニシャルヒット（ｉｎｉｔｉａｌ ｈｉｔ）」は、コンビナトリアルコンセンサス突然変異誘発ライブラリーをスクリーニングすることによって同定された変異体を指す。いくつかの実施形態では、イニシャルヒットは、出発遺伝子と比較して、改善された性能特質を有する。
本明細書において使用されるように、用語「改善されたヒット（ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｉｔ）」は、増強されたコンビナトリアルコンセンサス突然変異誘発ライブラリー（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｌｉｂｒａｒｙ）をスクリーニングすることによって同定された変異体を指す。
本明細書において使用されるように、用語「標的特性」は、改変されることになっている出発遺伝子の特性を指す。本開示が任意の特定の標的特性に限定されるようには意図されない。しかしながら、いくつかの実施形態では、標的特性は、遺伝子産物の安定性（たとえば変性、タンパク質分解、または他の分解性因子に対する抵抗性）であるが、他の実施形態では、生産宿主における生産のレベルが改変される。実際に、出発遺伝子のあらゆる特性が本開示における使用を見出すであろうということが企図される。用語の他の定義は、本明細書の全体にわたって記載されてもよい。
本明細書において使用されるように、「ビールを作製するためのプロセス」は、さらに、あらゆるグリストのマッシングにおいて適用されてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「グリスト」は、塊茎（たとえばジャガイモ）、根（たとえばキャッサバ［Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ］の根）、茎、葉、および種子を含む任意の植物および植物の一部から誘導できる任意のデンプンおよび／または糖含有植物材料を指す。グリストは、オオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、コーン／トウモロコシ、コメ、ミロ、キビ、およびソルガム由来の穀物などのような穀物を含んでいてもよく、たとえば、麦芽汁のグリストの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、またはさらに１００％（ｗ／ｗ）などのように、少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２５％または少なくとも３５％は、穀物に由来する。いくつかの実施形態では、グリストは、キャッサバ［Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ］の根から得られるデンプンおよび／または糖含有植物材料を含んでいてもよい。グリストは、オオムギの麦芽などのような麦芽にした穀物を含んでいてもよい。多くの場合、麦芽汁のグリストの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、またはさらに１００％（ｗ／ｗ）などのように、少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２５％または少なくとも３５％は、麦芽にした穀物に由来する。グリストは、１０％までなどのように、副原料を含んでいてもよいまたは麦芽汁のグリストの少なくとも１０％もしくは少なくとも１５％もしくは少なくとも２５％もしくは少なくとも３５％もしくは少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、もしくはさらに１００％（ｗ／ｗ）は、副原料である。
用語「副原料」は、オオムギの麦芽でないグリストの一部として理解される。副原料は、任意の炭水化物が豊富な材料であってもよい。用語において、「副原料」は、たとえば「グリスト」の下で上記に定義されるように、デンプンおよび／または糖含有植物材料を含む。
用語「発酵」は、醸造の文脈において、他の発酵副産物の形成を伴う、エタノールおよび二酸化炭素への、醸造酵母中の酵素による、麦芽汁中の糖の転換を意味する。
本明細書において使用されるように、用語「麦芽」は、オオムギなどのような任意の麦芽にした穀物粒として理解される。
本明細書において使用されるように、用語「麦芽飲料」は、フルモルトビール（ｆｕｌｌ ｍａｌｔｅｄ ｂｅｅｒ）、エール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、ローカロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽液、非アルコール麦芽液、およびその他同種のもののような発酵麦芽飲料を形成する発泡体を含む。用語「麦芽飲料」はまた、フルーツ風味の麦芽飲料、たとえば、レモン、オレンジ、ライムなどのような柑橘類の風味もしくはベリー風味の麦芽飲料、リカー風味の麦芽飲料、たとえばウォッカ、ラム、もしくはテキーラ風味の麦芽液、またはカフェイン風味の麦芽液などのようなコーヒー風味の麦芽飲料、およびその他同種のものなどのような非発砲ビールおよび代替の麦芽飲料を含む。
用語「マッシュ」は、たとえば、後に、麦芽汁＋使用済み穀物に分離されることとなる、水と混合された、破砕されたオオムギの麦芽、破砕されたオオムギ、および／もしくは他の副原料またはこの組み合わせを含む水性デンプンスラリーとして理解される。
本明細書において使用されるように、用語「麦芽汁」は、マッシングの間にグリストを抽出した後の非発酵汁の流出液体を指す。
本明細書において使用されるように、用語「使用済み穀物」は、グリストが抽出され、麦芽汁がマッシュから分離された場合に残っている、排出される固形物を指す。
麦芽にしたオオムギなどのような穀物粒に主に由来するデンプン含有材料の醸造および発酵によって生産されるあらゆる発酵麦芽汁が、用語「ビール」内に含まれる。コムギ、トウモロコシ、およびコメもまた、使用されてもよい。
本明細書において使用されるように、麦芽汁における「抽出物回収率」という用語は、乾燥物質に基づいて百分率で表現される、グリスト（麦芽および副原料）から抽出される可溶性物質の合計として定義される。
本明細書において使用されるように、用語「低温殺菌」は、加熱による水溶液中の微生物の死滅を意味する。醸造プロセスにおける低温殺菌の実施は、典型的に、フラッシュ低温殺菌器（ｆｌａｓｈ ｐａｓｔｅｕｒｉｓｅｒ）またはトンネル低温殺菌器（ｔｕｎｎｅｌ ｐａｓｔｅｕｒｉｓｅｒ）の使用を通してのものである。本明細書において使用されるように、用語「低温殺菌ユニット（ｐａｓｔｅｕｒｉｓａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）またはＰＵ」は、低温殺菌の量的基準を指す。ビールについての１低温殺菌ユニット（１ＰＵ）は、摂氏６０度での１分間の熱保持として定義される。以下のように計算する。
ＰＵ＝ｔ×１．３９３＾（Ｔ−６０）
ｔ＝低温殺菌器における低温殺菌温度での分での時間
Ｔ＝低温殺菌器における摂氏度における温度
［＾（Ｔ−６０）は、（Ｔ−６０）のべき指数を表す］
様々な最小のＰＵが、ビールの種類、原材料、および微生物汚染、醸造業者、ならびにビールの風味に対して認められる影響に依存して使用されてもよい。典型的に、ビールの低温殺菌については、１４〜１５ＰＵが必要とされる。低温殺菌設備に依存して、低温殺菌温度は、適宜計算される低温殺菌時間と共に、典型的に、６４〜７２摂氏度の範囲にある。さらなる情報は、"Technology Brewing and Malting" by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3rd completely updated edition, 2004, ISBN 3-921690-49-8において見つけられてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「非アルコールビール」または「低アルコールビール」は、容量で、０．１％〜０．５％などのように、最大０．１％〜３．５％または０．１％〜２．５％のアルコールを含有するビールを指す。非アルコールビールは、従来の方法によって醸造されるが、醸造プロセスの最後の段階の間に、アルコールは、水およびアルコールの異なる沸点を利用することによって、真空蒸発によって除去される。
本明細書において使用されるように、用語「ローカロリービール」または「低炭水化物含有量を有するビール」は、１．５ｇ／１００ｇ以下の炭水化物含有量を有し、少なくとも８０％の実質的な程度の発酵を有するビールとして定義される。
値の範囲が提供される場合、文脈によって明確に指示されない限り、その範囲の上限値および下限値の間の、下限値の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値もまた明確に開示されることが理解される。任意の指定される値または指定される範囲における介在値および任意の他の指定される値またはその指定される範囲における介在値の間のそれぞれのより小さな範囲が、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、範囲において独立して含まれてもよくまたは除外されてもよく、指定される範囲における任意の明確に除外された限界次第で、より小さな範囲においてどちらかの限界が含まれる、どちらも含まれない、両方とも含まれるそれぞれの範囲もまた本開示内に包含される。指定される範囲が一方または両方の限界を含む場合、それらの含まれる限界のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた、本開示において含まれる。
例示的な実施形態がより詳細に記載される前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、もちろん変化してもよいことが理解されたい。本明細書において記載されるものに類似するまたは等価な任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料をここで記載する。
本明細書においておよび添付の請求項において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示物を含む。したがって、たとえば、「遺伝子」への言及は、複数のそのような候補作用物質を含み、「細胞」への言及は、当業者らに知られている１つまたは複数の細胞およびその等価物への言及を含む、などである。
本明細書において議論される刊行物は、単に、本出願の出願日前のそれらの開示について提供される。この中のいずれも、本開示が、先の発明によりそのような刊行物に先行する権利がないという許可として解釈されないこととする。
１．２．略語
ＧＡ グルコアミラーゼ
ＧＡＵ グルコアミラーゼ単位
ｗｔ％ 重量パーセント
℃ 摂氏度
ｒｐｍ 毎分回転数
Ｈ２Ｏ 水
ｄＨ２Ｏ 脱イオン水
ｄＩＨ２Ｏ 脱イオン水、Ｍｉｌｌｉ−Ｑろ過
ａａまたはＡＡ アミノ酸
ｂｐ 塩基対
ｋｂ キロ塩基対
ｋＤ キロダルトン
ｇまたはｇｍ グラム
μｇ マイクログラム
ｍｇ ミリグラム
μｌおよびμＬ マイクロリットル
ｍｌおよびｍＬ ミリリットル
ｍｍ ミリメートル
μｍ マイクロメートル
Ｍ モル
ｍＭ ミリモル
μＭ マイクロモル
Ｕ 単位
Ｖ ボルト
ＭＷ 分子量
ＭＷＣＯ 分子量カットオフ
ｓｅｃ（ｓ）またはｓ（ｓ） 秒／秒
ｍｉｎ（ｓ）またはｍ（ｓ） 分／分
ｈｒ（ｓ）またはｈ（ｓ） 時間／時間
ＤＯ 溶存酸素
ＡＢＳ 吸光度
ＥｔＯＨ エタノール
ＰＳＳ 生理的食塩水
ｍ／ｖ 質量／容量
ＭＴＰ マイクロタイタープレート
Ｎ ノーマル
ＤＰ１ 単糖
ＤＰ２ 二糖
ＤＰ＞３ オリゴ糖、３を超える重合度を有する糖
ｐｐｍ 百万分率
ＳＢＤ デンプン結合ドメイン
ＣＤ 触媒ドメイン
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＷＴ 野生型
２．親グルコアミラーゼ
いくつかの実施形態では、本開示は、グルコアミラーゼ変異体を提供する。グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの変異体であり、これは、触媒ドメインおよびデンプン結合ドメインの両方を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、３、５、６、７、８、もしくは９において示されるアミノ酸配列を有するまたは配列番号１、２、３、５、６、７、８、もしくは９において示される１つもしくは複数のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、もしくは約９９．５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する触媒ドメインを含む。他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、または３のアミノ酸配列のうちの１つを有するグルコアミラーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡと中位の、高度な、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる触媒ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、もしくは３９０において示されるアミノ酸配列を有するまたは配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、もしくは３９０において示される１つもしくは複数のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、もしくは約９９．５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するデンプン結合ドメインを含む。他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、または１１のアミノ酸配列のうちの１つを有するグルコアミラーゼのデンプン結合ドメインをコードするＤＮＡと中位の、高度な、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされるデンプン結合ドメインを含む。
グルコアミラーゼの予測される構造および知られている配列は、菌類の種の中で保存されている（Coutinho et al., 1994, Protein Eng., 7:393-400およびCoutinho et al., 1994, Protein Eng., 7:749-760）。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、糸状菌類のグルコアミラーゼである。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株（たとえばＴ．ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔ．ｓｔｒｉｃｔｉｐｉｌｉｓ、Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ、およびＴ．ｈａｚｉａｎｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株（たとえばＡ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｋａｗａｃｈｉ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、およびＡ．ｏｒｚｙａｅ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）株（たとえばＴ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＴ．ｄｕｐｏｎｔｉ）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ株（たとえばＨ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ、Ｈ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｈ．ｖｉｎｏｓａ、およびＨ．ｃｉｔｒｉｎａ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ株（たとえばＦ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ、およびＦ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ株（たとえばＮ．ｃｒａｓｓａ）、ならびにフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）株（たとえばＨ．ｇｒｉｓｅａ、Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ、およびＨ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）株（たとえばＰ．ｎｏｔａｔｕｍもしくはＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ株（たとえばＳ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）から得られる。
いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは細菌のグルコアミラーゼであってもよい。たとえば、ポリペプチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株（たとえばＢ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株（たとえばＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）などのようなグラム陽性細菌株から得られてもよい。
いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号３のＴｒＧＡアミノ酸配列の触媒ドメインと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する触媒ドメインを含むであろう。
他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号５または配列番号６のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）親グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する触媒ドメインを含むであろう。
他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号８のＨｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ（ＨｇＧＡ）親グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％の配列同一性を有する触媒ドメインを含むであろう。
いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２または１１のＴｒＧＡアミノ酸配列のデンプン結合ドメインと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または約９８％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含むであろう。
他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号３８５のＨｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ（ＨｇＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含むであろう。
他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号３９０のＴｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（ＴｔＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含むであろう。
他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号３８６のＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ（ＴｈＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含むであろう。
他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号３８７のＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉｔ（ＴｅＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含むであろう。
他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号３８８または配列番号３８９のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインと少なくとも約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含むであろう。
いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号１または２のＴｒＧＡアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するであろう。
さらなる実施形態では、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株またはＨｙｐｏｃｒｅａ株から得られるであろう。いくつかの典型的なトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体は、米国特許第７，４１３，８８７号において記載され、特に参考文献の配列番号１７〜２２および４３〜４７において記載されるアミノ酸配列が言及される。
いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＴｒＧＡまたはＴｒＧＡ配列（配列番号２）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体である。
親グルコアミラーゼは、標準の組換えＤＮＡ技術を使用して単離するおよび／または同定することができる。当業者に知られている任意の標準の技術を使用することができる。たとえば、グルコアミラーゼの保存領域に特異的なプローブおよび／またはプライマーは、細菌または菌類の細胞において、相同体（触媒ドメイン、活性部位など）を同定するために使用することができる。あるいは、縮重ＰＣＲは、細菌または菌類の細胞における相同体を同定するために使用することができる。いくつかの場合では、データベースにおいてなどのように知られている配列は、配列番号２を含む知られているグルコアミラーゼまたは配列番号１１を含む知られているデンプン結合ドメインのうちの１つに対する配列および／または構造的な同一性について分析することができる。機能的なアッセイもまた、細菌または菌類の細胞におけるグルコアミラーゼ活性を同定するために使用することができる。グルコアミラーゼ活性を有するタンパク質は、単離されてもよく、対応するＤＮＡ配列を単離するために逆配列決定されてもよい（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。そのような方法は、当業者に知られている。
３．グルコアミラーゼの構造的な相同性
分子生物学のセントラルドグマは、ある特定の酵素についての遺伝子をコードするＤＮＡの配列が、タンパク質のアミノ酸配列を決定し、この配列は、次に、酵素の三次元フォールディングを決定する、というものである。このフォールディングにより、触媒中心および基質結合表面を作り出す異種の残基が集められ、これにより、論議されている高度な特異性および酵素活性がもたらされる。
グルコアミラーゼは、３つもの別個の構造ドメイン、すべてのグルコアミラーゼにおいて構造上保存される約４５０残基の触媒ドメイン、一般に、その後に続く、約１００残基のデンプン結合ドメインにつながれる３０〜８０残基から成るリンカー領域から成る。完全な３つの領域すべてを有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの構造は、本明細書において、１．８オングストロームの解像度まで決定された［参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページ中の表２０および参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）８９〜９３中の実施例１１を参照されたい］。座標を使用して［参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページ中の表２０を参照されたい］、構造は、以前に決定されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ株Ｘ１００由来のグルコアミラーゼの触媒ドメインの座標とアライメントされた［Aleshin, A.E., Hoffman, C., Firsov, L.M., and Honzatko, R.B.Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var.X100.J.Mol.Biol.238:575-591 (1994)］。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ結晶構造は、触媒ドメインのみを含んだ。図６〜７において見られるように、触媒ドメインの構造は、非常に密接にオーバーラップしており、この構造的な重ね合わせに基づいて等価な残基を同定することが可能である。グルコアミラーゼはすべて、図６〜７において示される基本構造を共有すると考えられる。
ＴｒＧＡの触媒ドメインは、したがって、ＴｒＧＡ配列番号２の残基１〜４５３などのような約４５０の残基を有し、１２ヘリックス二連ドメインである。触媒ドメインのヘリックスおよびループは、それらを形成する配列番号２を有するＴｒＧＡの残基の点から定義することができる。
ヘリックス１ 残基２〜２０、
ループ１ 残基２１〜５１、
ヘリックス２ 残基５２〜６８、
ループ２ 残基６９〜７１、
ヘリックス３ 残基７２〜９０、
ループ３ 残基９１〜１２５、
ヘリックス４ 残基１２６〜１４５、
ループ４ 残基１４６、
ヘリックス５ 残基１４７〜１６９、
ヘリックス６ 残基１８６〜２０６、
ループ６ 残基２０７〜２１０、
ヘリックス７ 残基２１１〜２２７、
ループ７ 残基２１１〜２２７、
ヘリックス８ 残基２５０〜２７５、
ループ８ 残基２６０〜２７５、
ヘリックス９ 残基２７６〜２９２、
ループ９ 残基２９３〜３２１、
ヘリックス１０ 残基３２２〜３４２、
ループ１０ 残基３４３〜３７１、
ヘリックス１１ 残基３７２〜３９５、
ループ１１ 残基３９６〜４２０、
ヘリックス１２ 残基４２１〜４３４、
ループ１２ 残基４３５〜４４３、
ヘリックス１３ 残基４４４〜４４７、
ループ１３ 残基４４８〜４５３
リンカードメインは、配列番号２を有するＴｒＧＡの残基４５４〜４９０などのように、３０〜８０の残基を有する。
ＴｒＧＡのデンプン結合ドメインは、２つのねじれ三本鎖シートから構成されるベータサンドイッチから成る、配列番号２を有するＴｒＧＡの残基４９６〜５９６などのように、約１００の残基を有する。デンプン結合ドメインのシート、ヘリックス、およびループは、それらを形成する配列番号２を有するＴｒＧＡの残基の点から定義することができる。
シート１’ 残基４９６〜５０４、
ループ１’ 残基５０５〜５１１、
シート２’ 残基５１２〜５１７、
相互連結ループ２’ 残基５１８〜５４３、
シート３’ 残基５４４〜５５２、
ループ３’ 残基５５３、
シート４’ 残基５５４〜５６５、
ループ４’ 残基５６６〜５６７、
シート５’ 残基５６８〜５７２、
シート間セグメント 残基５７３〜５７７、
シート５ａ’ 残基５７８〜５８２、
ループ５’ 残基５８３〜５８９、
シート６’ 残基５９０〜５９６
さらに詳細に下記に記載されるように、他のグルコアミラーゼにおける構造的な重ね合わせに基づいて等価な残基を同定することが可能である。
図６は、側面から見た配列番号２のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉｉ）グルコアミラーゼ（灰色）の三次元構造の比較である。この見方において、触媒ドメインおよびリンカー領域およびデンプン結合ドメインの関係を見ることができる。
図７は、上部から見た配列番号２のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（黒色）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（灰色）の三次元構造の比較である。ここに示されるグルコアミラーゼおよび実際、現在までに知られているすべてのグルコアミラーゼは、この構造的な相同性を共有する。構造の保存は、すべてのグルコアミラーゼについての活性の保存および作用のメカニズムの保存と相関する。この高度な相同性を考慮すれば、機能の改変をもたらす、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼの部位特異的変異体に起因する変化はまた、他のグルコアミラーゼにおいても、類似する構造的な、そのため機能的な効果を有するであろう。そのため、変異体が望ましい有益性をもたらす教示は、他のグルコアミラーゼに適用することができる。
さらなる結晶構造は、デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）について、参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページ中の表２０中の座標を使用して生産された。ＴｒＧＡについてのＳＢＤは、Ａ．ｎｉｇｅｒについてのＳＢＤとアライメントされた。図８において示されるように、Ａ．ｎｉｇｅｒおよびＴｒＧＡのＳＢＤの構造は、非常に密接にオーバーラップする。デンプン結合ドメインはすべて、図８において示される基本構造のうちの少なくともいくつかを共有しているが、いくつかのＳＢＤは、他のものよりも構造上類似していると考えられる。たとえば、ＴｒＧＡ ＳＢＤは、ＣＡＺＹデータベース（cazy.org）内の炭水化物結合モジュール２０ファミリー内として分類することができる。ＣＡＺＹデータベースは、グリコシド結合を分解する、修飾する、または生成する酵素の構造上関連する触媒モジュール、炭水化物結合モジュール（または機能的ドメイン）のファミリーを記載する。高度な構造的な相同性を考慮すれば、機能の改変をもたらすＴｒＧＡ ＳＢＤの部位特異的変異体はまた、ＴｒＧＡ ＳＢＤ、特に炭水化物結合モジュール２０ファミリー内に分類されるものに類似する構造を有するＳＢＤを有する他のグルコアミラーゼにおいても、類似する構造的な、そのため機能的な効果を有するであろう。したがって、変異体が望ましい有益性をもたらす教示は、構造的類似性を有する他のＳＢＤに適用することができる。
したがって、本明細書において議論されるアミノ酸位置番号は、図１において示される成熟トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ配列（配列番号２）に割り当てられるものを指す。しかしながら、本開示は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼの変異体に限定されない、しかし、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（配列番号２）における特定の同定された残基と「等価な」位置にアミノ酸残基を含有するグルコアミラーゼまで及ぶ。本開示のいくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＡであり、置換は、本明細書において記載されるもののように、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ（たとえば配列番号１２を参照されたい）における等価なアミノ酸残基位置に成される。他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号５〜９を含む（図５Ａおよび５Ｂを参照されたい）。さらなる実施形態では、親グルコアミラーゼは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどのようなペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）グルコアミラーゼである（たとえば配列番号１３を参照されたい）。
「構造的な同一性」は、アミノ酸残基が等価かどうかを決定する。２つの構造（三次元構造およびアミノ酸構造）がアライメントされる場合、構造的な同一性は、１対１の形態的な等価性である。グルコアミラーゼの残基（アミノ酸）位置は、それが同種である（つまり、一次もしくは三次構造における位置において対応する）またはＴ．ｒｅｅｓｅｉグルコアミラーゼにおけるその残基の特異的な残基もしくは部分と相似性である（化学的に組み合わせる、反応する、相互作用するのに同じもしくは類似する機能的能力を有する）場合、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉグルコアミラーゼの残基と「等価である」。
一次構造に対する同一性を確立するために、グルコアミラーゼのアミノ酸配列は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ一次配列と、特に、配列が知られているグルコアミラーゼにおいて不変であることが知られている残基のセットと、直接比較することができる。たとえば、本明細書における図５Ａおよび５Ｂは、グルコアミラーゼ間の保存残基を示す。図５Ｄおよび５Ｅは、様々なグルコアミラーゼ由来のデンプン結合ドメインのアライメントを示す。保存残基をアライメントし、アライメントを維持するために必要な挿入および欠失を考慮に入れた（つまり、任意の欠失および挿入を通して保存残基の排除を回避した）後、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの一次配列における特定のアミノ酸と等価な残基が決定される。保存残基のアライメントは、典型的に、そのような残基の１００％を保存するはずである。しかしながら、約７５％を超えるまたは約５０％ほどの保存残基のアライメントもまた、等価な残基を決定するのに適切である。さらに、構造的な同一性は、等価な残基を同定するために配列同一性と組み合わせて使用することができる。
たとえば、図５Ａおよび５Ｂにおいて、６つの生物由来のグルコアミラーゼの触媒ドメインが、アミノ酸配列間の相同性の最高値をもたらすためにアライメントされる。これらの配列の比較は、アスタリスクによって示されるように、それぞれの配列において含有される多くの保存残基があることを示す。これらの保存残基は、したがって、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のグルコアミラーゼなどのような他のグルコアミラーゼにおいてトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの対応する等価なアミノ酸残基を決定するために使用されてもよい。同様に、図５Ｄおよび５Ｅは、等価な残基を同定するためにアライメントされた７つの生物由来のグルコアミラーゼのデンプン結合ドメインを示す。
構造的な同一性は、２つの構造間の等価な残基の同定を伴う。「等価な残基」は、三次構造をＸ線結晶解析によって決定した酵素について、三次構造のレベルでの相同性（構造的な同一性）を決定することによって決定することができる。等価な残基は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特定のアミノ酸残基の主鎖原子の２つ以上の原子座標（Ｎに対してＮ、ＣＡに対してＣＡ、Ｃに対してＣ、およびＯに対してＯ）が、アライメント後に０．１３ｎｍ、所望により０．１ｎｍ以内にあるものとして決定される。一態様では、少なくとも４つの可能性のある主鎖原子のうちの２つまたは３つが、アライメント後に０．１ｎｍ以内にある。アライメントは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼに対して、論議されているグルコアミラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大のオーバーラップを与えるように、最良のモデルが方向づけられ、位置づけられた後に達成される。最良のモデルは、利用可能な最も高度な解像度での実験的回折データについて最低のＲ因子を与える結晶学的モデルである。
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トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特定の残基に対して機能的に相似性の等価な残基は、それらが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特定の残基に対して決定され、かつそれに帰するように、タンパク質構造、基質結合、または触媒作用を改変する、修飾する、またはそれに寄与するように立体配座をとるかもしれない、酵素のアミノ酸として決定される。さらに、それらは、所与の残基の主鎖原子が、相同の位置を占めることを基礎とする等価性の基準を満たさなくてもよいが、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子座標が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの対応する側鎖原子から０．１３ｎｍにある程度まで、相似性の位置を占める酵素の残基である（三次構造はＸ線結晶解析によって得た）。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの三次元構造の座標は、参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページ中の表２０において記載され、三次構造のレベルで等価な残基を決定するために上記に概説されるように使用することができる。
置換のために同定された残基のうちのいくつかは、保存残基であるが、他のものはそうではない。保存されていない残基の場合には、１つまたは複数のアミノ酸の置換は、自然界で見つけられるものに対応しないアミノ酸配列を有する変異体をもたらす置換に限定される。保存残基の場合には、そのような置換は、自然に存在する配列をもたらさないはずである。
４．グルコアミラーゼ変異体
本開示による変異体は、配列において変異体を親グルコアミラーゼと異なるものにする、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列における少なくとも１つの置換、欠失、または挿入を含む。いくつかの実施形態では、本開示の変異体は、ＴｒＧＡ（配列番号２）の少なくとも約２０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または約１００％のグルコアミラーゼ活性を有し、親グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、本開示による変異体は、親ＴｒＧＡ（配列番号２）の少なくとも１つのアミノ酸位置においてまたはＴｒＧＡ配列（配列番号２）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有する他の親グルコアミラーゼの配列における等価な位置において置換、欠失、または挿入を含むであろう。
他の実施形態では、本開示による変異体は、ＴｒＧＡ配列の触媒ドメイン（配列番号３）を含む、親ＴｒＧＡの断片の少なくとも１つのアミノ酸位置においてまたは配列番号３、５、６、７、８、もしくは９の触媒ドメイン含有断片に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有する、親グルコアミラーゼの触媒ドメインを含む断片における等価な位置において、置換、欠失、または挿入を含むであろう。いくつかの実施形態では、断片は、ＴｒＧＡ触媒ドメイン（配列番号３）の少なくとも約４００、約４２５、約４５０、または約５００アミノ酸残基を含むであろう。
他の実施形態では、本開示による変異体は、ＴｒＧＡ配列のデンプン結合ドメイン（配列番号１１）を含む、親ＴｒＧＡの断片の少なくとも１つのアミノ酸位置においてまたは配列番号１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、および３９０のデンプン結合ドメイン含有断片に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有する、親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインを含む断片における等価な位置において、置換、欠失、または挿入を含むであろう。いくつかの実施形態では、断片は、ＴｒＧＡデンプン結合ドメイン（配列番号１１）の少なくとも約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、または約１０９アミノ酸残基を含むであろう。
いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼが、触媒ドメイン、リンカー領域、およびデンプン結合ドメインを含む場合、変異体は、リンカー領域の一部を含む断片の少なくとも１つのアミノ酸位置において置換、欠失、または挿入を含むであろう。いくつかの実施形態では、変異体は、ＴｒＧＡ配列（配列番号２）の断片のアミノ酸配列において置換、欠失、または挿入を含むであろう。
アミノ酸置換に関しての構造的な同一性は、相同のグルコアミラーゼまたは親グルコアミラーゼにおける等価なアミノ酸位置に置換が存在することを意味する。等価な位置という用語は、ＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼアミノ酸配列および三次元配列との、論議されている親グルコアミラーゼのアミノ酸配列のアライメントおよび論議されている親グルコアミラーゼの三次元構造のアライメントに基づいて２つの親配列に共通である位置を意味する。たとえば、図５Ａに関して、ＴｒＧＡ（配列番号２または３）における２４位は、Ｄ２４であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（配列番号６）についての等価な位置は、位置Ｄ２５であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚｅａ（配列番号７）についての等価な位置は、位置Ｄ２６である。三次元配列の例示的なアライメントについては、図６および７を参照されたい。
したがって、一態様では、グルコアミラーゼ変異体が記載され、グルコアミラーゼ変異体は、その結晶形をしている場合に、主鎖原子の原子座標が、等価な主鎖原子のアライメント後に、ＴｒＧＡの等価な主鎖原子の原子座標（ＷＯ２００９／０６７２１８における表２０において定義される）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有する結晶構造を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメイン、および触媒ドメインを有し、上述の変異体は、デンプン結合ドメインの相互連結ループ２’中にならびに／または触媒ドメインのループ１中におよび／もしくはヘリックス２中におよび／もしくはループ１１中におよび／もしくはヘリックス１２中に、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含む。さらなる態様では、ＴｒＧＡの等価な主鎖原子の原子座標（ＷＯ２００９／０６７２１８における表２０において定義される）からの平均二乗偏差は、０．１１未満などのようにまたは０．１０未満などのように、０．１２ｎｍ未満である。
一態様では、グルコアミラーゼ変異体が記載され、グルコアミラーゼ変異体は、デンプン結合ドメインおよび触媒ドメインを含み、上述の変異体は、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるために、相互連結ループ２’中にならびに／またはループ１中におよび／もしくはヘリックス２中におよび／もしくはループ１１中におよび／もしくはヘリックス１２中に、配列番号２のアミノ酸配列または等価な親グルコアミラーゼに対する２つ以上のアミノ酸置換を含む。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体が、記載され、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス１２に対する２つ以上のアミノ酸置換を含む。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体が、記載され、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含む。
一態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列を有する相互連結ループ２’に対する置換、たとえば、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、および／もしくは５４３位の１つもしくは複数における置換、ならびに／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列を有するループ１に対する置換、たとえば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、および／もしくは５１位の１つもしくは複数における置換、ならびに／または５２位〜６８位のアミノ酸配列を有するヘリックス２に対する置換、たとえば、配列番号２の５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、および／もしくは６８位の１つもしくは複数における置換、ならびに／または３９６位〜４２０位のアミノ酸配列を有するループ１１に対する置換、たとえば、配列番号２の３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、および／もしくは４２０位の１つもしくは複数における置換、ならびに／または４２１位〜４３４位のアミノ酸配列を有するヘリックス１２に対する置換、たとえば、配列番号２の４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、および／もしくは５３４位の１つもしくは複数における置換である。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の１、２、３、または４つのアミノ酸置換、ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の１、２、３、または４つのアミノ酸置換である。
さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。さらなる態様では、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、相互連結ループ２’の５２０〜５４３位、５３０〜５４３位、または５３４〜５４３位内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、ループ１の３０〜５０位、３５〜４８位、または４０〜４６位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス２の５０〜６６位、５５〜６４位、または５８〜６３位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、ループ１１の４０５〜４２０位、４１０〜４２０位、または４１５〜４２０位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス１２の４２１〜４３４位、４２５〜４３４位、または４２８〜４３４位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、２つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、５３９位にあり、かつアミノ酸置換は、４４位にあり、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応し、この配列は、親グルコアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、４４位におけるアミノ酸置換は、４４Ｃではない。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は２つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は５３９位にあり、かつアミノ酸置換は４４Ｒであり、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は６１位においてアミノ酸置換を含み、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。さらなる態様では、５３９位におけるアミノ酸置換は５３９Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。さらなる態様では、４４位におけるアミノ酸置換は４４Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。さらなる態様では、６１位におけるアミノ酸置換は６１Ｉであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、以下のアミノ酸置換：
ａ）Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒまたは
ｂ）Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ
を含み、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２から成り、以下のアミノ酸置換：
ａ）Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒまたは
ｂ）Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ
を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置に対応する。
さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、または３９０のデンプン結合ドメインと、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９の触媒ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する。
さらなる態様では、親グルコアミラーゼは、菌類のグルコアミラーゼである。
さらなる態様では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ．）、ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、タラロミセス属種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ ｓｐｐ．）、またはシゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）から得られるグルコアミラーゼから選択される。
さらなる態様では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から得られる。
さらなる態様では、グルコアミラーゼは、精製されている。本開示のグルコアミラーゼは、遠心分離、ろ過、抽出、沈殿、およびその他同種のものを含む当技術分野において知られている様々な手順によって培養液から回収されてもよいまたは精製されてもよい。
いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、親のアミノ酸配列において少なくとも２つの置換を含むであろう。さらなる実施形態では、変異体は、２つを超える置換を有していてもよい。たとえば、変異体は、対応する親グルコアミラーゼと比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有していてもよい。
いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、図５Ａ、５Ｂ、５Ｄ、および５Ｅにおいて示されるように、非保存アミノ酸の領域に対応する位置において、置換、欠失、または挿入、典型的に、少なくとも１つのアミノ酸位置における置換を含む（たとえば、図５Ａ、５Ｂ、５Ｄ、および５Ｅにおいて「＊」によって示されない位置に対応するアミノ酸位置）。
変異体は、成熟タンパク質配列（配列番号２）の任意の位置において置換を有していてもよいが、いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：２３、４２、４３、４４、５９、６０、６１、６５、６７、６８、４１０、４１７、４１８、４３０、４３１、４３３、５１８、５１９、５２０、５２７、５３１、５３５、５３６、５３７、もしくは５３９においてまたは親グルコアミラーゼにおける等価な位置において、２つ以上の置換を含む。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：１０、１４、１５、７２、７３、９７、９８、９９、１０２、１１０、１１３、１１４、１３３、１４０、１４４、１４５、１４７、１５２、１５３、１６４、１８２、２０４、２０５、２１４、２１６、２１９、２２８、２２９、２３０、２３１、２３６、２３９、２４１、２４２、２６３、２６４、２６５、２６８、２６９、２７６、２８４、２９１、２９４、３００、３０１、３０３、３１１、３３８、３４２、３４４、３４６、３４９、３５９、３６１、３６４、３７５、３７９、３８２、３９０、３９１、３９３、３９４、４３６、４４２、４４４、４４８、４５１、４９３、４９４、４９５、５０２、５０３、５０８、５１１、５６３、または５７７においてまたは親グルコアミラーゼにおける等価な位置において１つまたは複数のさらなる置換を含む。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号２と少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するであろう。他の実施形態では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体となるであろう。いくつかの実施形態では、変異体は、改変された特性を有するであろう。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号２のグルコアミラーゼと構造的な同一性を有するであろう。
いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：Ｐ２３、Ｔ４２、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｆ５９、Ｋ６０、Ｎ６１、Ｔ６７、Ｅ６８、Ｒ４０８、Ｓ４１０、Ｓ４１５、Ｌ４１７、Ｈ４１８、Ｔ４３０、Ａ４３１、Ｒ４３３、Ｎ５１８、Ａ５１９、Ａ５２０、Ｔ５２７、Ｖ５３１、Ａ５３５、Ｖ５３６、Ｎ５３７、およびＡ５３９または親グルコアミラーゼ（たとえばトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体）における等価な位置において２つ以上の置換を含む。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：Ｔ１０、Ｌ１４、Ｎ１５、Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ９７、Ｌ９８、Ａ９９、Ｓ１０２、Ｋ１０８、Ｅ１１０、Ｌ１１３、Ｋ１１４、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｉ１３３、Ｋ１４０、Ｎ１４４、Ｎ１４５、Ｙ１４７、Ｓ１５２、Ｎ１５３、Ｎ１６４、Ｆ１７５、Ｎ１８２、Ａ２０４、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｖ２１６、Ｑ２１９、Ｗ２２８、Ｖ２２９、Ｓ２３０、Ｓ２３１、Ｄ２３６、Ｉ２３９、Ｎ２４０、Ｔ２４１、Ｎ２４２、Ｇ２４４、Ｎ２６３、Ｌ２６４、Ｇ２６５、Ａ２６８、Ｇ２６９、Ｄ２７６、Ｖ２８４、Ｓ２９１、Ｇ２９４、Ｐ３００、Ａ３０１、Ａ３０３、Ｙ３１０、Ａ３１１、Ｄ３１３、Ｙ３１６、Ｖ３３８、Ｔ３４２、Ｓ３４４、Ｔ３４６、Ａ３４９、Ｖ３５９、Ｇ３６１、Ａ３６４、Ｔ３７５、Ｎ３７９、Ｓ３８２、Ｓ３９０、Ｅ３９１、Ａ３９３、Ｋ３９４、Ｉ４３６、Ａ４４２、Ｎ４４３、Ｓ４４４、Ｔ４４８、Ｓ４５１、Ｔ４９３、Ｐ４９４、Ｔ４９５、Ｈ５０２、Ｅ５０３、Ｑ５０８、Ｑ５１１、Ｎ５６３、およびＮ５７７においてまたは親グルコアミラーゼにおける等価な位置において１つまたは複数の置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体は、親グルコアミラーゼと比較して、改変された特性を有するであろう。
いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、指定される位置でのみ親グルコアミラーゼと異なっていてもよい。
さらなる実施形態では、グルコアミラーゼの親の変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置において少なくとも２つの以下の置換：Ｔ４２Ｖ、Ｉ４３Ｑ／Ｒ、Ｄ４４Ｒ／Ｃ、Ｎ６１Ｉ、Ｔ６７Ｍ、Ｅ６８Ｃ／Ｍ、Ｌ４１７Ｋ／Ｒ／Ｖ、Ｔ４３０Ａ／Ｋ、Ａ４３１Ｉ／Ｌ／Ｑ、Ｒ４３３Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ａ５１９Ｉ／Ｋ／Ｒ／Ｙ、Ａ５２０Ｃ／Ｌ／Ｐ、Ｖ５３１Ｌ、Ａ５３５Ｋ／Ｎ／Ｐ／Ｒ、Ｖ５３６Ｍ、もしくはＡ５３９Ｅ／Ｒ／Ｓまたは親グルコアミラーゼにおける等価な位置において置換を含む。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：Ｔ１０Ｓ、Ａ７２Ｙ、Ｇ７３Ｆ／Ｗ、Ｓ９７Ｎ、Ｓ１０２Ａ／Ｍ／Ｒ、Ｋ１１４Ｍ／Ｑ、Ｉ１３３Ｔ／Ｖ、Ｎ１４５Ｉ、Ｎ１５３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｓ／Ｖ、Ｔ２０５Ｑ、Ｑ２１９Ｓ、Ｗ２２８Ａ／Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｖ、Ｖ２２９Ｉ／Ｌ、Ｓ２３０Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｒ、Ｓ２３１Ｌ／Ｖ、Ｄ２３６Ｒ、Ｉ２３９Ｖ／Ｙ、Ｎ２６３Ｐ、Ｌ２６４Ｄ／Ｋ、Ａ２６８Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｋ、Ｓ２９１Ａ／Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｔ、ｇ２９４ｃ、Ａ３０１Ｐ／Ｒ、Ｖ３３８Ｉ／Ｎ／Ｑ、Ｔ３４２Ｖ、Ｓ３４４Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｇ３６１Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ａ３６４Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｔ３７５Ｎ、Ｋ３９４Ｓ、Ｉ４３６Ｈ、Ｔ４５１Ｋ、Ｔ４９５Ｋ／Ｍ／Ｓ、Ｅ５０３Ａ／Ｃ／Ｖ、Ｑ５０８Ｒ、Ｑ５１１Ｈ、Ｎ５６３Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｋ／Ｋ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、またはＮ５７７Ｋ／Ｐ／Ｒにおいてまたは親グルコアミラーゼにおける等価な位置において１つまたは複数の置換を含む。
さらなる実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の適切な位置にまたは親グルコアミラーゼにおける等価な位置に置換の以下のセット：
Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｇ７３Ｆ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ｖ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｉ４３Ｒ／Ｇ７３Ｆ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ｖ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｋ；および
Ｉ４３Ｒ／Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ５６３Ｋ
のうちの１つを含む。
さらなる実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に置換の以下のセット：
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ
Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；または
Ｌ４１７Ｇ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ
のうちの１つを含み、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼと比較していかなるさらなる置換をも有さず、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９と少なくとも８０％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する。したがって、親グルコアミラーゼは、別記されるもののいずれかであってもよい。
親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、または３９０と少なくとも９５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含んでいてもよい。親グルコアミラーゼは、配列番号１または２と少なくとも８０％の配列同一性を有していてもよく、たとえば、それは、配列番号１または２を含んでいてもよい。所望により、親グルコアミラーゼは、配列番号１または２から成ってもよい。
本開示のグルコアミラーゼ変異体はまた、たとえば、あるグルコアミラーゼ由来のデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）ならびに他由来の触媒ドメインおよびリンカーを有するキメラグルコアミラーゼまたはハイブリッドグルコアミラーゼを含んでいてもよい。たとえば、ハイブリッドグルコアミラーゼは、ＴｒＧＡ（配列番号２）由来のＳＢＤとＡｎＧＡ（配列番号６）由来のＳＢＤを取り換えることによって作製し、ＡｎＧＡのＳＢＤならびにＴｒＧＡの触媒ドメインおよびリンカーを有するハイブリッドを作製することができる。あるいは、ＡｎＧＡ由来のＳＢＤおよびリンカーは、ＴｒＧＡのＳＢＤおよびリンカーと取り換えることができる。
いくつかの態様では、変異グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、改変された熱安定性を示す。いくつかの態様では、改変された熱安定性は、親グルコアミラーゼと比較して、増加した熱安定性であってもよい。いくつかの実施形態では、改変された特性は、親グルコアミラーゼと比較して、改変された比活性である。いくつかの実施形態では、改変された比活性は、親グルコアミラーゼと比較して、増加した比活性であってもよい。いくつかの実施形態では、改変された特性は、親グルコアミラーゼと比較して、より低い温度で増加した熱安定性である。いくつかの実施形態では、改変された特性は、親グルコアミラーゼと比較して、増加した比活性および増加した熱安定性の両方である。
一実施形態では、いくつかの変異体は、配列番号２の位置：
Ｄ４４Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ；
Ｄ４４Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｇ７３Ｆ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｒ／Ｇ７３Ｆ／Ｔ４３０Ａ；
Ｇ７３Ｆ／Ｔ４３０Ａ／Ｅ５０３Ｖ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｄ４４Ｃ／Ｇ７３Ｆ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｄ４４Ｃ／Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｄ４４Ｃ／Ｇ７３Ｆ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｄ４４Ｃ／Ｇ７３Ｆ／Ｌ４１７Ｒ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｄ４４Ｃ／Ｇ７３Ｆ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｉ４３Ｒ／Ｔ４３０Ａ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｄ４４Ｃ／Ｌ４１７Ｒ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｇ２９４Ｃ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｌ；
Ｇ２９４Ｃ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｑ；
Ｇ２９４Ｃ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｇ２９４Ｃ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｑ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｑ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ６１Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｌ４１７Ｖ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ４３１Ｌ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｅ５０３Ａ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ４３１Ｌ／Ｅ５０３Ａ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ／Ａ４３１Ｌ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ５３９Ｒ／Ａ４３１Ｌ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ６１Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ｌ４１７Ｖ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ４３１Ｌ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｅ５０３Ａ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ／Ｎ６１Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ；
Ｉ４３Ｒ／Ｔ４３０Ａ／Ｅ５０３Ｖ／Ａ５３５Ｒ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｄ４４Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｅ５０３Ａ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｉ４３Ｒ／Ｔ４３０Ａ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｄ４４Ｒ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ａ５３５Ｒ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ／Ｔ４３０Ａ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ／Ｔ４３０Ａ；
Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｇ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｎ５６３Ｋ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｎ５６３Ｋ／Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ５３９Ｒ；および
Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｎ５６３Ｋ／Ｉ４３Ｒ／Ｑ５１１Ｈ
または親グルコアミラーゼ、特にトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等価な位置に置換を含んでいてもよい。
さらなる実施形態では、いくつかの変異体は、配列番号２の位置：
Ｄ４４Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ；
Ｄ４４Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ／Ａ４３１Ｌ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ５３９Ｒ／Ａ４３１Ｌ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｅ５０３Ａ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ／Ｎ６１Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ａ５３５Ｒ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ／Ｔ４３０Ａ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ／Ｔ４３０Ａ；
Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｇ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｎ５６３Ｋ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ５３９Ｒ；および
Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｎ５６３Ｋ／Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ５３９Ｒ
または親グルコアミラーゼ、特にトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等価な位置に置換を含んでいてもよい。
さらなる実施形態では、いくつかの変異体は、配列番号２の位置：
Ｄ４４Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ；
Ｄ４４Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ／Ａ４３１Ｌ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ５３９Ｒ／Ａ４３１Ｌ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｅ５０３Ａ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ／Ｎ６１Ｉ；
Ｉ４３Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｔ４３０Ｍ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ａ５３５Ｒ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ／Ｔ４３０Ａ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３５Ｒ／Ｔ４３０Ａ；
Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｇ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｎ５６３Ｋ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ５３９Ｒ；および
Ｇ７３Ｆ／Ｅ５０３Ｖ／Ｎ５６３Ｋ／Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ５３９Ｒ
または親グルコアミラーゼ、特にトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等価な位置に置換を含んでいてもよい。
さらなる実施形態では、いくつかの変異体は、配列番号２の位置：
Ｄ４４Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ；
Ｄ４４Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｉ４３Ｑ；
Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｌ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ６１Ｉ；
または親グルコアミラーゼ、特にトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等価な位置に置換を含んでいてもよい。
さらなる実施形態では、いくつかの変異体は、配列番号２の位置：
Ｄ４４Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９Ｒ；
Ｄ４４Ｒ／Ａ５３９Ｒ；
または親グルコアミラーゼ、特にトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等価な位置に置換を含んでいてもよい。
さらなる実施形態では、いくつかの変異体は、配列番号２の以下の置換：Ｄ４４Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ａ５３９ＲまたはＤ４４Ｒ／Ａ５３９Ｒを有する。
さらなる実施形態では、変異体は、配列番号１０９８を含む。さらなる実施形態では、変異体は、配列番号１０９８から成る。さらなる実施形態では、変異体は、配列番号１０９９を含む。さらなる実施形態では、変異体は、配列番号１０９９から成る。
多くの親グルコアミラーゼが、ＴｒＧＡのアミノ酸配列とアライメントされている。図５は、以下の親グルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ（ＡａＧＡ）（配列番号５）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｚｙａｅ（ＡｏＧＡ）（配列番号７）；Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ（ＨｇＧＡ）（配列番号８）；およびＨｙｐｏｃｒｅａ ｖｉｎｏｓａ（ＨｖＧＡ）（配列番号９）の触媒ドメインを含む。触媒ドメインの同一性％は、表１において下記に表される。
Figure 0005827227
いくつかの実施形態では、たとえば、変異体グルコアミラーゼは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）グルコアミラーゼ、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）グルコアミラーゼ、またはＨｙｐｏｃｒｅａグルコアミラーゼである親グルコアミラーゼに由来するであろう。
５．変異体グルコアミラーゼの特徴づけ
本開示はまた、親グルコアミラーゼ、特にＴｒＧＡと比較して、少なくとも１つの改変された特性（たとえば、改善された特性）を有するグルコアミラーゼ変異体を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変された特性（たとえば、改善された特性）は、ＩＳ／ＳＨ比、デンプン加水分解活性、発酵の実質的な程度、縮合産物の形成の低下、酸安定性、熱安定性および比活性から成る群から選択される。典型的に、改変された特性は、ＩＳ／ＳＨ比の低下、発酵の実質的な程度の増強、縮合産物の形成の低下、熱安定性の増加、および／または比活性の増加である。熱安定性の増加は、典型的に、より高い温度でのものである。一実施形態では、ｐＨ安定性の増加は、高ｐＨでのものである。さらなる実施形態では、ｐＨ安定性の増加は、低ｐＨでのものである。
本開示のグルコアミラーゼ変異体はまた、親グルコアミラーゼと比較して、低い基質濃度での、より高度な割合のデンプン加水分解をもたらしてもよい。変異体は、同じ条件下で試験された場合、親グルコアミラーゼよりも高いＶｍａｘまたは低いＫｍを有していてもよい。たとえば、変異グルコアミラーゼは、約２５℃〜約７０℃（たとえば約２５℃〜約３５℃；約３０℃〜約３５℃；約４０℃〜約５０℃；約５０℃〜約５５℃、または約５５℃〜約６２℃）の温度範囲でより高いＶｍａｘを有していてもよい。ミカエリス−メンテン定数、Ｋｍ、およびＶｍａｘの値は、標準の知られている手順を使用して容易に決定することができる。他の態様では、グルコアミラーゼはまた、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、デンプン加水分解活性の低下を示してもよい。
５．１．改変された熱安定性を有する変異グルコアミラーゼ
いくつかの態様では、本開示は、親（野生型）と比較して、改変された熱安定性を有する変異グルコアミラーゼに関する。改変された熱安定性は、上昇した温度または低下した温度でのものとすることができる。熱安定性は、ＮａＡｃバッファーｐＨ４．５中６４℃での１時間のインキュベーション後の残存活性％として測定される。これらの条件下で、ＴｒＧＡは、インキュベーション前の初期活性と比較して、日差変動により約１５％〜４４％の残存活性を有する。したがって、いくつかの実施形態では、増加した熱安定性を有する変異体は、インキュベーション前の初期活性と比較して、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、および約５０％を含めて、親よりも少なくとも約１％〜少なくとも約５０％多くの残存活性を有する（ＮａＡｃバッファーｐＨ４．５中６４℃での１時間のインキュベーション後に）。たとえば、親残存活性が１５％である場合、増加した熱安定性を有する変異体は、約１６％〜約７５％の残存活性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、所与の期間にわたる、たとえば少なくとも約６０分間、約１２０分間、約１８０分間、約２４０分間、または約３００分間の温度の変化への曝露後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の酵素活性を保持するなどのように、改善された熱安定性を有するであろう。いくつかの実施形態では、変異体は、約４０℃〜約８０℃の範囲の選択された温度で、また約５０℃〜約７５℃の範囲において、および約６０℃〜約７０℃の範囲においてならびに約４．０〜約６．０のｐＨ範囲で、親グルコアミラーゼと比較して、増加した熱安定性を有するであろう。いくつかの実施形態では、熱安定性は、アッセイおよび方法において記載されるように決定される。その方法は、他の温度での熱安定性を測定するのに適切となるように、適応させてもよい。あるいは、熱安定性は、そこに記載されるように、６４℃で決定されてもよい。いくつかの実施形態では、変異体は、約３５℃〜約４５℃および約３０℃〜約４０℃を含む約２０℃〜約５０℃の範囲において選択された温度で、親グルコアミラーゼと比較して、より低い温度で、増加した熱安定性を有する。
いくつかの実施形態では、熱安定性において改善を有する変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：１０、４２、４３、４４、５９、６１、６８、７２、７３、９７、９８、９９、１０２、１１４、１３３、１４０、１４４、１５２、１５３、１８２、２０４、２０５、２１４、２１６、２２８、２２９、２３０、２３１、２３６、２４１、２４２、２６３、２６４、２６５、２６８、２６９、２７６、２８４、２９１、２９４ ３００、３０１、３０３、３１１、３３８、３４２、３４４、３４６、３４９、３５９、３６１、３６４、３７５、３７９、３８２、３９０、３９１、３９３、３９４、４１０、４１７、４３０、４３１、４３３、４３６、４４２、４４４、４４８、４５１、４９３、４９５、５０３、５０８、５１１、５１８、５１９、５２０、５２７、５３１、５３５、５３６、５３７、５３９、５６３、または５７７、または親グルコアミラーゼにおける等価な位置において１つまたは複数の欠失、置換、または挿入、特に置換を含む。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体となるであろう、またさらなる実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号２に対して、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼはまた、配列番号２に対して構造的な同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、増加した熱安定性を有する変異体は、配列番号２のＴ１０Ｓ、Ｔ４２Ｖ、Ｉ４３Ｑ、Ｉ４３Ｒ、Ｄ４４Ｃ、Ｄ４４Ｒ、Ｅ６８Ｃ、Ｅ６８Ｍ、Ｇ７３Ｆ、Ｇ７３Ｗ、Ｋ１１４Ｍ、Ｋ１１４Ｑ、Ｉ１３３Ｖ、Ｎ１５３Ａ、Ｎ１５３Ｅ、Ｎ１５３Ｍ、Ｎ１５３Ｓ、Ｎ１５３Ｖ、Ｗ２２８Ｖ、Ｖ２２９Ｉ、Ｖ２２９Ｌ、Ｓ２３０Ｑ、Ｓ２３１Ｖ、Ｄ２３６Ｒ、Ｌ２６４Ｄ、Ｌ２６４Ｋ、Ａ２６８Ｄ、Ｓ２９１Ａ、Ｓ２９１Ｆ、Ｓ２９１Ｈ、Ｓ２９１Ｍ、Ｓ２９１Ｔ、Ｇ２９４Ｃ、Ａ３０１Ｐ、Ａ３０１Ｒ、Ｖ３３８Ｉ、Ｖ３３８Ｎ、Ｖ３３８Ｑ、Ｓ３４４Ｍ、Ｓ３４４Ｐ、Ｓ３４４Ｑ、Ｓ３４４Ｒ、Ｓ３４４Ｖ、Ｇ３６１Ｄ、Ｇ３６１Ｅ、Ｇ３６１Ｆ、Ｇ３６１Ｉ、Ｇ３６１Ｌ、Ｇ３６１Ｍ、Ｇ３６１Ｐ、Ｇ３６１Ｓ、Ｇ３６１Ｗ、Ｇ３６１Ｙ、Ａ３６４Ｄ、Ａ３６４Ｅ、Ａ３６４Ｆ、Ａ３６４Ｇ、Ａ３６４Ｋ、Ａ３６４Ｌ、Ａ３６４Ｍ、Ａ３６４Ｒ、Ａ３６４Ｓ、Ａ３６４Ｔ、Ａ３６４Ｖ、Ａ３６４Ｗ、Ｔ３７５Ｎ、Ｌ４１７Ｋ、Ｌ４１７Ｒ、Ｒ４３３Ｃ、Ｒ４３３Ｅ、Ｒ４３３Ｇ、Ｒ４３３Ｌ、Ｒ４３３Ｎ、Ｒ４３３Ｓ、Ｒ４３３Ｖ、Ｉ４３６Ｈ、Ｔ４９５Ｋ、Ｔ４９５Ｓ、Ｅ５０３Ａ、Ｅ５０３Ｃ、Ｅ５０３Ｖ、Ｑ５０８Ｒ、Ｑ５１１Ｈ、Ａ５１９Ｋ、Ａ５１９Ｒ、Ａ５１９Ｙ、Ｖ５３１Ｌ、Ａ５３５Ｋ、Ａ５３５Ｎ、Ａ５３５Ｐ、Ａ５３５Ｒ、Ａ５３９Ｅ、Ａ５３９Ｒ、Ａ５３９Ｓ、Ｎ５６３Ｃ、Ｎ５６３Ｅ、Ｎ５６３Ｉ、Ｎ５６３Ｋ、Ｎ５６３Ｌ、Ｎ５６３Ｑ、Ｎ５６３Ｔ、Ｎ５６３Ｖ、Ｎ５７７Ｋ、Ｎ５７７Ｐ、またはＮ５７７Ｒ位の少なくとも１つにおいて置換を有する。
５．２．改変された比活性を有する変異グルコアミラーゼ
本明細書において使用されるように、比活性は、タンパク質の１ｍｇ当たりのグルコアミラーゼの活性である。活性は、エタノールアッセイを使用して決定された。スクリーニングは、親ＴｒＧＡ ＰＩと比較して、性能指数（ＰＩ）＞１．０を有する変異体を同定した。ＰＩは、野生型（ＷＴ）および変異酵素の比活性（活性／酵素ｍｇ）から計算される。それは、指数「変異体比活性／ＷＴ比活性」であり、変異体の比活性の増加の基準とすることができる。約２のＰＩは、ＷＴの約２倍良いものとなるはずである。いくつかの態様では、本開示は、親または野生型グルコアミラーゼと比較して、改変された比活性を有する変異グルコアミラーゼに関する。いくつかの実施形態では、改変された比活性は、比活性の増加である。比活性の増加は、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、および約２以上を含む約１以上の性能指数の増加として決定することができる。いくつかの実施形態では、比活性の増加は、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、および約４．９を含む、約１．０〜約５．０である。いくつかの実施形態では、変異体は、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２．０倍、約２．２倍、約２．５倍、約２．７倍、約２．９倍、約３．０倍、約４．０倍、および約５．０倍を含む、親グルコアミラーゼよりも少なくとも約１．０倍高い比活性を有する。
いくつかの実施形態では、比活性において改善を有する変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：１０、１４、１５、２３、５９、６０、６１、６５、６７、６８、７２、７３、９７、９８、９９、１０２、１１０、１１３、１３３、１４０、１４４、１４５、１４７、１５２、１５３、１６４、１８２、２０４、２０５、２１４、２１６、２１９、２２８、２２９、２３０、２３１、２３６、２３９、２４１、２４２、２６３、２６４、２６５、２６８、２６９、２７６、２８４、２９１、３００、３０１、３０３、３１１、３３８、３４２、３４４、３４６、３４９、３５９、３６１、３６４、３７５、３７９、３８２、３９０、３９１、３９３、３９４、４１０、４１７、４１８、４３０、４３１、４３３、４４２、４４４、４４８、４５１、４９３、４９４、４９５、５０２、５０３、５０８、５１１、５１８、５１９、５２０、５３１、５３５、５３６、５３９、または５６３、または親グルコアミラーゼにおける等価な位置において１つまたは複数の欠失、置換、または挿入を含む。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号２の配列に対して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を有する配列を含むであろう。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼはまた、配列番号２に対して構造的な同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、改善された比活性を有する本開示の変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：Ｉ４３Ｑ、Ｉ４３Ｒ、Ｄ４４Ｃ、Ｄ４４Ｒ、Ｎ０６１Ｉ、Ｔ０６７Ｍ、Ａ０７２Ｙ、Ｓ０９７Ｎ、Ｓ１０２Ａ、Ｓ１０２Ｍ、Ｓ１０２Ｒ、Ｉ１３３Ｔ、Ｎ１４５Ｉ、Ｎ１５３Ｄ、Ｔ２０５Ｑ、Ｑ２１９Ｓ、Ｗ２２８Ａ、Ｗ２２８Ｆ、Ｗ２２８Ｈ、Ｗ２２８Ｍ、Ｓ２３０Ｃ、Ｓ２３０Ｆ、Ｓ２３０Ｇ、Ｓ２３０Ｌ、Ｓ２３０Ｎ、Ｓ２３０Ｑ、Ｓ２３０Ｒ、Ｓ２３１Ｌ、Ｉ２３９Ｖ、Ｉ２３９Ｙ、Ｎ２６３Ｐ、Ａ２６８Ｃ、Ａ２６８Ｇ、Ａ２６８Ｋ、Ｓ２９１Ａ、Ｇ２９４Ｃ、Ｔ３４２Ｖ、Ｋ３９４Ｓ、Ｌ４１７Ｒ、Ｌ４１７Ｖ、Ｔ４３０Ｋ、Ａ４３１Ｉ、Ａ４３１Ｌ、Ａ４３１Ｑ、Ｒ４３３Ｙ、Ｔ４５１Ｋ、Ｔ４９５Ｍ、Ａ５１９Ｉ、Ａ５２０Ｃ、Ａ５２０Ｌ、Ａ５２０Ｐ、Ａ５３５Ｒ、Ｖ５３６Ｍ、Ａ５３９Ｒ、Ｎ５６３Ｋ、またはＮ５６３Ｉ、または親グルコアミラーゼにおける等価な位置において置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体と比較した親の比活性は、アッセイおよび方法において記載されるように決定される。
５．３．改変された熱安定性および改変された比活性の両方を有する変異グルコアミラーゼ
いくつかの態様では、本開示は、親（たとえば、野生型）と比較して、改変された熱安定性および改変された比活性の両方を有する変異グルコアミラーゼに関する。いくつかの実施形態では、改変された比活性は、比活性の増加である。いくつかの実施形態では、改変された熱安定性は、親グルコアミラーゼと比較して、高い温度での（たとえば８０℃を超える温度での）熱安定性の増加である。
いくつかの実施形態では、熱安定性の増加および比活性の増加を有する変異体は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列における以下の位置：１０、１５、４３、４４、５９、６１、６８、７２、７３、９７、９９、１０２、１４０、１５３、１８２、２０４、２０５、２１４、２２８、２２９、２３０、２３１、２３６、２４１、２４２、２６４、２６５、２６８、２７６、２８４、２９１、２９４、３００、３０１、３０３、３１１、３３８、３４４、３４６、３４９、３５９、３６１、３６４、３７５、３７９、３８２、３９１、３９３、３９４、４１０、４３０、４３３、４４４、４４８、４５１、４９５、５０３、５１１、５２０、５３１、５３５、５３６、５３９、または５６３、または親グルコアミラーゼにおける等価な位置において１つまたは複数の欠失、置換、または挿入および置換を含む。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体となるであろう、またさらなる実施形態では、親グルコアミラーゼは、配列番号２に対して、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、親グルコアミラーゼはまた、配列番号２に対して構造的な同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、増加した熱安定性および比活性を有する変異体は、配列番号２のＩ４３Ｑ／Ｒ、Ｄ４４Ｃ／Ｒ、Ｗ２２８Ｆ／Ｈ／Ｍ、Ｓ２３０Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｑ／Ｒ、Ｓ２３１Ｌ、Ａ２６８Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｋ、Ｓ２９１Ａ、Ｇ２９４Ｃ、Ｒ４３３Ｙ、Ｓ４５１Ｋ、Ｅ５０３Ｃ、Ｑ５１１Ｈ、Ａ５２０Ｃ／Ｌ／Ｐ、またはＡ５３５Ｎ／Ｐ／Ｒ位の少なくとも１つにおいて置換を有する。
５．４．発酵性の糖（複数可）の生産を有する変異グルコアミラーゼ
さらなる態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵性の糖（複数可）の生産の増強を示す。さらなる態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスのマッシング工程において発酵性の糖の生産の増強を示す。さらなる態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスの発酵工程において発酵性の糖の生産の増強を示す。さらなる態様では、発酵性の糖は、グルコースである。当業者は、たとえばＨＰＬＣ技術によって発酵性の糖（複数可）の生産を決定することができる。
５．５イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の改変された比（ＩＳ／ＳＨ比）を有する変異グルコアミラーゼ
さらなる態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の比（ＩＳ／ＳＨ比）の低下を示す。さらなる態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下したデンプン加水分解活性を示す。
一態様では、デンプンの加水分解中に縮合産物の合成の低下を有するグルコアミラーゼ変異体の同定のためのスクリーニング法および方法によって得られるグルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌｓｅ）変異体が提供され、方法は、グルコアミラーゼ変異体のイソマルトース合成およびデンプン加水分解活性を測定する工程ならびに親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、低下したデンプン加水分解活性を有し、かつ親グルコアミラーゼと比較してイソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を有する変異体を選択する工程を含む。
いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を有することについて選択される。
いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼと比較して、同じまたは増加したデンプン加水分解活性および５％以下で、１０％以下で、または１５％以で下低下した、低下したイソマルトース合成を有し、それによって、親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を有することについて選択される。
さらなる態様では、グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵の実質的な程度の増強を示す。
５．５ 縮合産物の改変された形成を有する変異グルコアミラーゼ
一態様では、グルコアミラーゼは、同じ条件下でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）によって形成される縮合産物の量よりも少ない量の縮合産物を形成する。さらなる態様では、グルコアミラーゼは、同じ条件下で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）によって形成される縮合産物の量と本質的に同じ、それよりも５％以下で、８％以下で、または１０％以下で高い量の縮合産物を形成する。さらなる態様では、グルコアミラーゼの投入量は、タンパク質濃度に基づいて同じである。さらなる態様では、グルコアミラーゼの投入量は、本明細書において記載されるＧＡＵ活性アッセイまたはさらに本明細書において記載されるデンプン加水分解（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｉｏｎ）活性アッセイなどのような活性アッセイにおける活性の測定に基づいて同じである。
６．グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチド
本開示はまた、変異グルコアミラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている確立された技術によって調製されてもよい。ポリヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置によってなどのように、合成的に調製されてもよい。ＤＮＡ配列は、断片をともにライゲーションすることによって調製された混合ゲノム（またはｃＤＮＡ）および合成起源のものであってもよい。ポリヌクレオチドはまた、特異的なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製されてもよい。一般に、Minshull J.et al., Methods 32(4):416-427 (2004)が参照される。ＤＮＡはまた、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙなどのような多くの営利会社によって合成されてもよい。
本開示はまた、（ｉ）少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、および約９９％を含めて、配列番号４に対して少なくとも約５０％の同一性を有するまたは（ｉｉ）中程度の〜高度なストリンジェンシーの条件下で、配列番号４において記載されるヌクレオチド配列に由来するプローブにハイブリダイズすることができるまたは（ｉｉｉ）配列番号４において記載される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドをも提供する。本開示に従って有用なプローブは、少なくとも約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００またはそれ以上の、配列番号４の連続ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチドはまた、配列番号２に対する構造的な同一性をも有する。
本開示は、配列番号２に対して、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％のアミノ酸配列同一性を含むアミノ酸配列を含む変異グルコアミラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドをさらに提供する。さらに、本開示は、上記に提供されるポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供する。本開示はまた、本明細書において提供される変異グルコアミラーゼをコードするＤＮＡの断片（つまり部分）を提供する。これらの断片は、糸状菌類の細胞（たとえばトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、およびフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ））由来の、本明細書において記載される成熟グルコアミラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドまたはグルコアミラーゼ活性を有するそのセグメントを単離するまたは同定するために使用することができる部分的な長さのＤＮＡ断片を得る際に使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの断片は、少なくとも約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、配列番号４において提供されるＤＮＡの部分は、グルコアミラーゼをコードする糸状菌などのような他の種から、親グルコアミラーゼ、特に、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体を得るために使用されてもよい。
７．グルコアミラーゼの生産
７．１．ＤＮＡコンストラクトおよびベクター
本開示の一実施形態によれば、本開示によって包含される変異グルコアミラーゼをコードし、プロモーター配列に作動可能に連結された上記に記載されるポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞の中に移入するために構築される。一態様では、本明細書において開示されるグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドが、提供される。
ＤＮＡコンストラクトは、ベクターを使用して、宿主細胞の中に導入されてもよい。一態様において、請求項７５に記載のポリヌクレオチドを含むまたは本明細書において開示されるグルコアミラーゼ変異体を発現することができるベクターが、提供される。ベクターは、宿主細胞の中に導入される場合に、安定して導入される、任意のベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞ゲノムの中に統合され、複製される。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット、およびその他同種のものを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、グルコアミラーゼコード配列に作動可能に連結された調節配列を含む発現ベクターである。
適した発現および／または組込み型ベクターの例は、Sambrook et al.(1989)前掲およびAusubel (1987)前掲、およびvan den Hondel et al.(1991) in Bennett and Lasure (Eds.) More Gene Manipulations In Fungi, Academic Press pp.396-428ならびに米国特許第５，８７４，２７６号において提供される。ベクターの一覧については、Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains（FGSC、http://www.fgsc.net）もまた参照される。特に有用なベクターは、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＰｒｏｍｅｇａから得られるベクターを含む。
細菌の細胞における使用に適したプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９たとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＥ１９４を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における使用に適した他の特異的なベクターは、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１００、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１、１０ｐＤＯＮＲ（商標）２２１、ｐＥＮＴＲ（商標）、ｐＧＥＭ（登録商標）３Ｚ、およびｐＧＥＭ（登録商標）４Ｚなどのようなベクターを含む。
菌類の細胞における使用に適した特異的なベクターは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）において有用な汎用性発現ベクターであるｐＲＡＸ、ｇｌａＡプロモーターを有するｐＲＡＸを含み、Ｈｙｐｏｃｒｅａ／トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）においては、ｃｂｈ１プロモーターを有するｐＴｒｅｘ３ｇを含む。
いくつかの実施形態において、細菌または菌類の宿主細胞において転写活性を示すプロモーターは、宿主細胞に対して同種または異種であるタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。プロモーターは、突然変異、切断型、および／またはハイブリッドプロモーターであってもよい。前述のプロモーターは、当技術分野において知られている。菌類の細胞、特に、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞などのような糸状菌類の細胞において有用な適したプロモーターの例は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉプロモーターｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇ５、ｘｌｎ１、およびｘｌｎ２のような例示的なプロモーターを含む。有用なプロモーターの他の例は、Ａ．ａｗａｍｏｒｉおよびＡ．ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）由来のプロモーター［Nunberg et al., Mol.Cell Biol.4:2306-2315 (1984)およびBoel et al., EMBO J.3:1581-1585 (1984)を参照されたい］、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）プロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ遺伝子およびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ遺伝子由来のプロモーターを含む。細菌の細胞において有用な適したプロモーターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＳ）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子、ならびにｔａｃプロモーターから得られるものを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、宿主細胞に対して自然のものである。たとえば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉが宿主である場合、プロモーターは、自然のＴ．ｒｅｅｓｅｉプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、菌類の宿主細胞に対して異種のものである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、親グルコアミラーゼのプロモーター（たとえばＴｒＧＡプロモーター）となるであろう。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、シグナル配列、すなわち、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向ける、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードする核酸を含む。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるグルコアミラーゼをコードするグルコアミラーゼコード配列のセグメントを有する翻訳リーディングフレーム中に自然に連結されたシグナルペプチドコード領域を自然に含んでいてもよいまたは核酸配列のコード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、変異グルコアミラーゼが得られた親グルコアミラーゼ遺伝子と自然に関連するシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号１において示される配列またはそれに対して少なくとも約９０％、約９４、もしくは約９８％の配列同一性を有する配列となるであろう。有効なシグナル配列は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉグルコアミラーゼ、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩＩ、もしくはアスパラギン酸プロテイナーゼなどのような分泌プロテイナーゼ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓセロビオヒドロラーゼもしくはエンドグルカナーゼまたはＨ．ｇｒｉｓｅａグルコアミラーゼ）、またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼおよびＡ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ）由来のなどのような他の糸状菌類の酵素から得られるシグナル配列を含んでいてもよい。
さらなる実施形態では、宿主細胞の中に導入されることとなるシグナル配列およびプロモーター配列を含むＤＮＡコンストラクトまたはベクターは、同じ供給源に由来する。いくつかの実施形態では、Ｈｙｐｏｃｒｅａ株由来のシグナル配列などのようなトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体の自然のグルコアミラーゼシグナル配列が、使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、発現ベクターはまた、終止配列をも含む。宿主細胞において機能的な任意の終止配列が、本開示において使用されてもよい。いくつかの実施形態では、終止配列およびプロモーター配列は、同じ供給源に由来する。他の実施形態では、終止配列は、宿主細胞に対して同種である。有用な終止配列は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｌ１；Ａ．ｎｉｇｅｒもしくはＡ．ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ［Nunberg et al.(1984)前掲およびBoel et al., (1984)前掲］、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、またはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ［Punt et al., Gene 56:117-124 (1987)］の遺伝子から得られる終止配列を含む。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーの例は、抗菌性の抵抗性（たとえばハイグロマイシンおよびフレオマイシン）を与えるものを含む。ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、およびｐｙｒＧ（オロチジン−５’リン酸デカルボキシラーゼ）として当技術分野において知られているマーカーを含む栄養性選択マーカーもまた、本開示において使用を見出す。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換のためのベクター系において有用なマーカーが、当技術分野において知られている［たとえばFinkelstein, Chapter 6 in Biotechnology Of Filamentous Fungi, Finkelstein et al.(1992) Eds.Butterworth-Heinemann, Boston, MA；Kinghorn et al.(1992) Applied Molecular Genetics Of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London；Berges and Barreau, Curr.Genet.19:359-365 (1991)；およびvan Hartingsveldt et al., Mol.Gen.Genet.206:71-75 (1987)を参照されたい］。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、酵素アセトアミダーゼをコードし、形質転換細胞が窒素源としてのアセトアミド上で成長することを可能にするａｍｄＳ遺伝子である。選択マーカーとしてのＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ遺伝子の使用は、Kelley et al., EMBO J.4:475-479 (1985)およびPenttila et al., Gene 61:155-164 (1987)において記載されている。
変異グルコアミラーゼ、プロモーター、終止配列、および他の配列をコードする核酸配列を含むＤＮＡコンストラクトをライゲーションし、かつ適したベクターの中にそれらを挿入するために使用される方法は、当技術分野においてよく知られている。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって一般に達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドリンカーが、従来の実施に従って使用される［Sambrook et al.(1989)前掲およびBennett and Lasure, More Gene Manipulations In Fungi, Academic Press, San Diego (1991) pp 70-76を参照されたい］。さらに、ベクターは、知られている組換え技術を使用して構築することができる（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
７．２．宿主細胞および宿主細胞の形質転換
１．本開示はまた、本開示の変異グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌、菌類、植物、および酵母細胞から選ばれる。宿主細胞という用語は、本開示に従って変異グルコアミラーゼを生産するために使用される細胞、細胞の子孫、および細胞から生成されるプロトプラストの両方を含む。一態様では、ベクターを含む、好ましくはそれを用いて形質転換された宿主細胞が、開示される。さらなる態様では、グルコアミラーゼ変異体を発現することができる細胞が、提供される。さらなる態様では、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損および／またはキシラナーゼ欠損および／またはグルカナーゼ欠損宿主細胞である。プロテアーゼ欠損および／またはキシラナーゼ欠損および／または自然グルカナーゼ欠損宿主細胞は、前述の酵素をコードする遺伝子を欠失させるまたは発現停止させることによって、得られてもよい。結果として、ＧＡ変異体を含有する宿主細胞は、前述の酵素を発現しない。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、菌類の細胞であり、所望により糸状菌類の宿主細胞である。用語「糸状菌」は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の糸状性の種類をすべて指す［Alexopoulos, C.J.(1962), Introductory Mycology, Wiley, New Yorkを参照されたい］。これらの菌類は、キチン、セルロース、および他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸によって特徴づけられる。本開示の糸状菌は、酵母とは形態学的に、生理学的に、かつ遺伝学的に異なる。糸状菌による栄養成長は、菌糸の伸長によるものであり、炭素異化は、絶対好気性である。本開示では、糸状菌類の親細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（たとえばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、以前にＴ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍとして分類されたＨｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａの無性生殖モルフ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）（Sheir-Neirs et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46-53 (1984)；ＡＴＣＣ Ｎｏ．５６７６５およびＡＴＣＣ Ｎｏ．２６９２１）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｒｎ種、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ．）（たとえばＨ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ、およびＨ．ｇｒｉｓｅａ）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ種（たとえばＣ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ種、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（たとえばＡ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ ｓｏｊａｅ、Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、およびＡ．ａｗａｍｏｒｉ）［Ward et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738-743 (1993)およびGoedegebuur et al., Curr.Genet.41:89-98 (2002)］、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種（たとえばＦ．ｒｏｓｅｕｍ、Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ、Ｆ．ｃｅｒｅａｌｉｓ、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、およびＦ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ種（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ種、Ｍｕｃｏｒ種（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種、ならびにＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ種［Innis et al., Science 228:21-26 (1985)もまた参照されたい］の種の細胞であってもよいが、これらに限定されない。用語「トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」または「トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）」または「トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）」は、以前にまたは現在トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）として分類されている任意の菌類の属を指す。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌細胞となるであろう。非限定的な例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（たとえばＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、およびＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ）ならびにＢａｃｉｌｌｕｓの株を含む。本明細書において使用されるように、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ属」は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、およびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むが、これらに限定されない、当業者らに知られている、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ」属内のすべての種を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属が分類学的な再編成を受け続けることが認識される。したがって、属は、今「Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ」と命名されているＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのような生物を含むが、これらに限定されない再分類された種を含むことが意図される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種などのようなグラム陰性細菌株である。他の実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｃｈｉａ種、またはＣａｎｄｉｄａ種などのような酵母細胞であってもよい。他の実施形態では、宿主細胞は、自然の遺伝子が、たとえば、細菌または菌類の細胞における欠失によって不活性化された、遺伝子的に操作された宿主細胞となるであろう。１つまたは複数の不活性化遺伝子を有する菌類の宿主細胞を得ることが所望な場合には、知られている方法が、使用されてもよい。（たとえば米国特許第５，２４６，８５３号、米国特許第５，４７５，１０１号、およびＷＯ９２／０６２０９において開示される方法）。遺伝子不活性化は、完全なもしくは部分的な欠失によって、挿入不活化によって、または遺伝子をその意図される目的のために非機能性にする、任意の他の手段によって達成されてもよい（遺伝子が機能的なタンパク質の発現を妨害されるように）。いくつかの実施形態では、宿主細胞がトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、特にＴ．ｒｅｅｓｅｉ宿主細胞である場合、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、およびｅｇｌ２遺伝子は、不活性化されるおよび／または欠失させられるであろう。クワッド欠失タンパク質を有する例示的なトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞は、米国特許第５，８４７，２７６号およびＷＯ０５／００１０３６において説明され、記載されている。他の実施形態では、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損株またはプロテアーゼがない株である。
宿主細胞の中へのＤＮＡコンストラクトまたはベクターの導入は、形質転換；エレクトロポレーション；核マイクロインジェクション；形質導入；トランスフェクション（たとえばリポフェクション媒介性のおよびＤＥＡＥ−デキストリン媒介性のトランスフェクション）；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いるインキュベーション；高速ＤＮＡコート微粒子銃（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＮＡ−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）；ならびにプロトプラスト融合などのような技術を含む。一般的な形質転換技術は、当技術分野において知られている［たとえばAusubel et al.(1987)前掲，chapter 9；およびSambrook et al.(1989)前掲およびCampbell et al., Curr.Genet.16:53-56 (1989)を参照されたい］。
Ｂａｃｉｌｌｕｓについての形質転換方法は、Anagnostopoulos C.and J.Spizizen, J.Bacteriol.81:741-746 (1961)およびＷＯ０２／１４４９０を含むたくさんの参考文献において開示されている。
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）についての形質転換方法は、Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474 (1984)；Berka et al., (1991) in Applications of Enzyme Biotechnology, Eds.Kelly and Baldwin, Plenum Press (NY)；Cao et al., Protein Sci.9:991-1001 (2000);Campbell et al., Curr.Genet.16:53-56 (1989)、およびＥＰ２３８ ０２３において記載されている。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）における異種タンパク質の発現は、米国特許第６，０２２，７２５号；米国特許第６，２６８，３２８号；Harkki et al.Enzyme Microb.Technol.13:227-233 (1991)；Harkki et al., BioTechnol.7:596-603 (1989)；ＥＰ２４４，２３４；ＥＰ２１５，５９４；およびNevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", in Molecular Industrial Mycology, Eds.Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp.129-148)において記載されている。Ｆｕｓａｒｉｕｍ株の形質転換については、ＷＯ９６／００７８７およびBajar et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8202-8212 (1991)もまた参照される。
特定の一実施形態では、形質転換のためのトリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）の調製は、菌類の菌糸からのプロトプラストの調製を伴う［Campbell et al., Curr. Genet.16:53-56 (1989)；Pentilla et al., Gene 61:155-164 (1987)を参照されたい］。糸状菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性の形質転換が知られている［de Groot et al., Nat.Biotechnol.16:839-842 (1998)を参照されたい］。糸状菌類の宿主と共に使用される形質転換手順については、米国特許第６，０２２，７２５号および米国特許第６，２６８，３２８号もまた参照される。
いくつかの実施形態では、遺伝学的に安定した形質転換体は、ベクター系を用いて構築され、それによって、変異グルコアミラーゼをコードする核酸は、宿主株染色体の中に安定して統合される。次いで、形質転換体は、知られている技術によって精製される。
いくつかのさらなる実施形態では、宿主細胞は、単子葉植物（たとえばコーン、コムギ、およびソルガム）由来の細胞または双子葉植物（たとえばダイズ）由来の細胞などのような植物細胞である。植物の形質転換において有用なＤＮＡコンストラクトを作製するための方法および植物形質転換のための方法は、知られている。これらの方法のうちのいくつかは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性の遺伝子移入；微粒子銃、プロトプラストのＰＥＧ媒介性の形質転換、エレクトロポレーション、およびその他同種のものを含む。米国特許第６，８０３，４９９号、米国特許第６，７７７，５８９号；Fromm et al., BioTechnol.8:833-839 (1990)；Potrykus et al., Mol.Gen.Genet.199:169-177 (1985)が参照される。
７．３．グルコアミラーゼの生産
本開示は、さらに、変異グルコアミラーゼを生産するための方法であって、本開示に従って、変異グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することと、変異グルコアミラーゼの発現および生産に適した条件下で宿主細胞を培養することと、所望により、変異グルコアミラーゼを回収することとを含む方法に関する。一態様では、本開示に従って変異グルコアミラーゼを発現させるための方法であって、宿主細胞または本明細書において開示される細胞を得ることと、細胞または宿主細胞からグルコアミラーゼ変異体を発現させることと、所望により、グルコアミラーゼ変異体を精製することとを含む方法が提供される。一態様では、グルコアミラーゼ変異体は、精製される。
本開示の発現および生産の方法において、宿主細胞は、生理的な塩類および栄養素を含有する適した培地を有する実験用のまたは工業用の発酵槽において、振盪フラスコ培養、小規模発酵、または大規模発酵（連続、バッチ、および流加発酵を含む）において、適した条件下で培養される［たとえばPourquie, J.et al., Biochemistry And Genetics Of Cellulose Degradation, eds.Aubert, J.P.et al., Academic Press, pp.71-86, 1988およびIlmen, M.et al., Appl.Environ.Microbiol.63:1298-1306 (1997)を参照されたい］。一般的な商業的に調製された培地（たとえばＹｅａｓｔ Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＹＭ）ブロス、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、およびＳａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス）は、本開示において使用を見出す。細菌および糸状菌類の細胞についての培養条件は、当技術分野において知られており、科学文献においておよび／またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎおよびＦｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒなどのような菌類の供給源から見つけられてもよい。グルコアミラーゼコード配列が、誘発性プロモーターの制御下にある場合、誘発剤（たとえば糖、金属塩、または抗菌薬）は、グルコアミラーゼ発現を誘発するのに有効な濃度で培地に添加される。
いくつかの実施形態では、本開示は、植物宿主において変異グルコアミラーゼを生産するための方法であって、本開示に従ってグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて植物細胞を形質転換することと、変異体の発現および生産に適した条件下で植物細胞を成長させることとを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、アッセイは、本開示によって包含される変異グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換された細胞株による変異グルコアミラーゼの発現を評価するために実行される。アッセイは、タンパク質レベルで、ＲＮＡレベルで、ならびに／または特にグルコアミラーゼ活性および／もしくは生産に対する機能的バイオアッセイの使用によって実行することができる。これらのアッセイのいくつかは、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、適切に標識されたプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーション（核酸コード配列に基づく）、および従来のサザンブロッティング、ならびにオートラジオグラフィーを含む。
さらに、変異グルコアミラーゼの生産および／または発現は、たとえば、培養液中のグルコースなどのような還元糖を直接測定するアッセイによってならびにグルコアミラーゼ活性、発現、および／または生産を測定するためのアッセイによって、直接、試料において測定されてもよい。特に、グルコアミラーゼ活性は、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法によってアッセイされてもよい［Goto et al., Biosci.Biotechnol.Biochem.58:49-54 (1994)を参照されたい］。さらなる実施形態では、タンパク質発現は、細胞、組織切片の免疫組織化学染色または組織培養液のイムノアッセイ（たとえばウェスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡによる）などのような免疫学的方法によって評価される。そのようなイムノアッセイは、グルコアミラーゼの発現を質的にかつ量的に評価するために使用することができる。そのような方法の詳細は、当業者らに知られており、そのような方法を実施するための多くの試薬が、市販で入手可能である。
本開示のグルコアミラーゼは、遠心分離、ろ過、抽出、沈殿、およびその他同種のものを含む当技術分野において知られている様々な手順によって培養液から回収されてもよいまたは精製されてもよい。
８．組成物および使用
一態様では、酵素組成物の調製のための、本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用が提供される。
本開示の変異グルコアミラーゼは、デンプン加水分解組成物およびデンプン糖化組成物、洗浄組成物および界面活性剤組成物（たとえば洗濯用界面活性剤、食器洗浄用界面活性剤、および硬表面洗浄組成物）、アルコール発酵組成物を含むが、これらに限定されない酵素組成物においてならびに飼料組成物において使用されてもよい。さらに、変異グルコアミラーゼは、たとえば醸造、ヘルスケア、織物、環境廃棄物変換プロセス、バイオパルプ加工、およびバイオマス変換の用途において使用されてもよい。本開示の変異グルコアミラーゼは、デンプン加水分解組成物、糖化組成物、界面活性剤、アルコール発酵酵素組成物、および飼料を含む酵素組成物において使用されてもよい。一態様では、組成物は、デンプン加水分解組成物である。
いくつかの実施形態では、本開示によって包含される変異グルコアミラーゼを含む酵素組成物は、所望により、以下の酵素−アルファ−アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、シクロデキストリングリコトランスフェラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、キシラナーゼ、粒状デンプン加水分解酵素、および他のグルコアミラーゼのいずれか１つまたはそれらの組み合わせと組み合わせて、使用されるであろう。
いくつかの実施形態では、本開示によって包含される変異グルコアミラーゼを含む酵素組成物は、所望により、以下の酵素−アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、およびさらなるグルコアミラーゼのいずれか１つまたはそれらの組み合わせと組み合わせて、使用されるであろう。いくつかの実施形態では、本開示によって包含される変異グルコアミラーゼを含む酵素組成物は、所望により、以下の酵素−アミラーゼ、プルラナーゼ、およびさらなるグルコアミラーゼのいずれか１つまたはそれらの組み合わせと組み合わせて、使用されるであろう。いくつかの実施形態では、本開示によって包含される変異グルコアミラーゼを含む酵素組成物は、所望により、以下の酵素−アミラーゼおよびプルラナーゼのいずれか１つまたはそれらの組み合わせと組み合わせて、使用されるであろう。さらなる態様では、アミラーゼは、アルファ−アミラーゼおよび／またはイソアミラーゼである。さらなる態様では、グルカナーゼは、エキソグルカナーゼおよび／またはエンドグルカナーゼである。
いくつかの実施形態では、酵素組成物は、菌類のアルファ−アミラーゼ（たとえばアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．））または細菌のアルファ−アミラーゼ（たとえばＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、およびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのようなＢａｃｉｌｌｕｓ種）などのようなアルファ−アミラーゼならびにその変異体およびハイブリッドを含むであろう。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼは、酸安定アルファ−アミラーゼである。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉアルファ−アミラーゼ（ＡｋＡＡ）であり、米国特許第７，０３７，７０４号を参照されたい。本開示の組成物において使用するために企図される市販で入手可能なアルファ−アミラーゼが知られており、ＧＺＹＭＥ Ｇ９９７、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ，Ｉｎｃ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）１２０−Ｌ、およびＳＵＰＲＡ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ａ／Ｓ）を含む。
いくつかの実施形態では、酵素組成物は、酸性菌類プロテアーゼを含むであろう。さらなる実施形態では、酸性菌類プロテアーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）に由来し、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第７，５６３，６０７号（２００６年７月１３日にＵＳ２００６／０１５４３５３として公開）において開示されるプロテアーゼのいずれか１つであってもよい。さらなる実施形態では、酵素組成物は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ種由来のフィターゼを含むであろう。（たとえばＢＰ−１７、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２００６／０４３１７８において開示される変異体もまた参照されたい）。
他の実施形態では、本開示の変異グルコアミラーゼは、他のグルコアミラーゼと組み合わせられてもよい。いくつかの実施形態では、本開示のグルコアミラーゼは、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｋａｗａｃｈｉ、およびＡ．ａｗａｍｏｒｉなどのようなアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはその変異体の株に由来する１つまたは複数のグルコアミラーゼ；ＷＯ０５／０５２１４８において開示される配列番号３に対して少なくとも約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するグルコアミラーゼなどのような、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）またはその変異体、特にＨ．ｇｒｉｓｅａの株に由来するグルコアミラーゼ；タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）またはその変異体、特にＴ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉの株に由来するグルコアミラーゼ；Ａｔｈｅｌｉａ、特にＡ．ｒｏｌｆｓｉｉの株に由来するグルコアミラーゼ；ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、特にＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの株に由来するグルコアミラーゼと組み合わせられるであろう。
特に、変異グルコアミラーゼは、デンプン変換プロセスのために、特にフルクトースシロップ、高級糖用のデキストロースの生産において、ならびにデンプン含有基質の発酵からのアルコールおよび他の最終産物（たとえば有機酸、アスコルビン酸、およびアミノ酸）の生産において使用されてもよい［G.M.A.van Beynum et al., Eds.(1985) Starch Conversion Technology, Marcel Dekker Inc.NY］。本開示の変異グルコアミラーゼ組成物を使用して生産されるデキストリンは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％のグルコース収率をもたらしてもよい。本開示によって包含されるグルコアミラーゼを使用するデンプン基質の発酵からのアルコールの生産は、アルコール燃料または飲用アルコールの生産を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、変異グルコアミラーゼが親グルコアミラーゼと同じ条件下で使用される場合、アルコールの生産は、より高くなる。いくつかの実施形態では、アルコールの生産は、親グルコアミラーゼよりも、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、および約２．４％多いアルコールを含むが、これらに限定されず、約０．５％〜２．５％、より良好となるであろう。
いくつかの実施形態では、本開示の変異グルコアミラーゼは、アルコール生産に使用される、様々な植物ベースの基質由来のデンプンの加水分解における使用を見出すであろう。いくつかの実施形態では、植物ベースの基質は、コーン、コムギ、オオムギ、ライムギ、ミロ、コメ、サトウキビ、ジャガイモ、およびその組み合わせを含むであろう。いくつかの実施形態では、植物ベースの基質は、分別された植物材料、たとえば、繊維、胚、タンパク質、およびデンプン（胚乳）などのような構成成分に分別されるコーンなどのような穀物粒となるであろう（米国特許第６，２５４，９１４号および米国特許第６，８９９，９１０号）。アルコール発酵の方法は、The Alcohol Textbook, K.A.Jacques et al., Eds.2003, Nottingham University Press, UKにおいて記載されている。
ある実施形態では、アルコールは、エタノールとなるであろう。特に、アルコール発酵生産プロセスは、湿式粉砕プロセスまたは乾式粉砕プロセスとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、変異グルコアミラーゼは、湿式粉砕発酵プロセスにおいて使用されるであろう、また、他の実施形態では、変異グルコアミラーゼは、乾式粉砕プロセスにおいて使用を見出すであろう。
乾式穀物粉砕は、多くの基本的な工程を伴い、これらは、一般に、アルコールおよび他の副産物を生産するために、摩砕、煮沸、液化、糖化、発酵、ならびに液体および固形物の分離を含む。コーン、コムギ、またはライムギなどのような、植物材料、特に穀物粒全体が摩砕される。いくつかの場合には、穀物は、最初に構成部分に分別されてもよい。摩砕された植物材料は、粗いまたは細かい粒子を得るために粉砕されてもよい。摩砕された植物材料は、スラリータンク中の液体（たとえば水および／または薄い蒸留廃液）と混合される。スラリーは、穀物中のデンプンを可溶性にし、デキストリンに加水分解するために、液化酵素（たとえばアルファ−アミラーゼ）と共に、ジェットクッカー中で高温（たとえば約９０℃〜約１０５℃以上）にかけられる。混合物は、冷却され、グルコースを生産するために本開示によって包含されるグルコアミラーゼなどのような糖化酵素を用いてさらに処理される。次いで、グルコースを含有するマッシュは、エタノール生産微生物、特に酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種）などのような発酵微生物の存在下において約２４〜１２０時間発酵させてもよい。マッシュ中の固形物は、液相から分離され、エタノールなどのようなアルコールおよびジスチラーズグレインなどのような有用な副産物が得られる。
いくつかの実施形態では、糖化工程および発酵工程は、組み合わせられ、そのプロセスは、同時の糖化および発酵または同時の糖化、酵母増殖、および発酵と呼ばれる。
他の実施形態では、変異グルコアミラーゼは、デンプン加水分解のためのプロセスにおいて使用され、プロセスの温度は、約３０℃〜約７５℃であり、いくつかの実施形態では、約４０℃〜約６５℃である。いくつかの実施形態では、変異グルコアミラーゼは、約３．０〜約６．５のｐＨでデンプン加水分解のためのプロセスにおいて使用される。いくつかの実施形態における発酵プロセスは、穀物粒または分別された穀物を粉砕することと液体と摩砕された穀物粒を組み合わせて、本開示に記載の変異グルコアミラーゼならびに所望により、これらに限定されないが、アルファ−アミラーゼ、他のグルコアミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、または粒状デンプン加水分解活性を有する他の酵素などのような他の酵素ならびにエタノールおよび他の副産物を生産するための酵母と単一の容器において次いで混合されるスラリーを形成することとを含む（たとえば米国特許第４，５１４，４９６号、ＷＯ０４／０８１１９３、およびＷＯ０４／０８０９２３を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の変異グルコアミラーゼを使用する酵素糖化工程を含む、液体デンプン溶液を糖化するための方法に関する。液体デンプン溶液は、水または水性バッファー中でデンプンを可溶性にし、所望により、加熱して、デンプンをゼラチン化することによって生産されてもよい。アミラーゼによるデンプンのさらなる部分的な分解が、適用されてもよい。
本発明は、デンプンからグルコースおよびその他同種のものを生産するために、本発明のグルコアミラーゼ変異体を使用するための方法を提供する。一般に、この方法は、アルファ−アミラーゼの存在下において前駆体デンプンを部分的に加水分解する工程ならびに、次いで、アルファ−（１−４）およびアルファ−（１−６）グルコシド結合を切断することによって、グルコアミラーゼの存在において、デンプンまたは関連するオリゴ分子および多糖分子の非還元末端からのＤ−グルコースの放出をさらに加水分解する工程を含む。アルファ−アミラーゼを利用する前駆体デンプンの部分加水分解は、内部のアルファ−（１−４）−結合の加水分解によるデンプン分子の初期の分解をもたらす。商業的な用途では、アルファ−アミラーゼを使用する初期の加水分解は、約１０５℃の温度で実行される。非常に高度なデンプン濃度、通常３０％〜４０％の固形物が、処理される。初期の加水分解は、通常、この高い温度で５分間実行される。次いで、部分的に加水分解されたデンプンは、第２のタンクに移すことができ、８５〜９０℃の温度で約１時間インキュベートされて、１０〜１５のデキストロース当量（Ｄ．Ｅ．）を誘導する。グルコアミラーゼの存在下においてデンプンまたは関連するオリゴ分子および多糖分子の非還元末端からのＤ−グルコースの放出をさらに加水分解する工程は、３０〜６０℃の低い温度で個別のタンクにおいて通常実行される。多くの場合、基質液体の温度は、５５℃〜６０℃に下がる。溶液のｐＨは、６〜６．５から３〜５．５の範囲まで下がる。多くの場合、溶液のｐＨは、４〜４．５である。グルコアミラーゼは、溶液に添加され、反応は、３６〜４８時間などのように、２４〜７２時間行われる。
本発明のグルコアミラーゼ変異体が使用されてもよい糖化プロセスの例は、ＪＰ３−２２４４９３；ＪＰ１−１９１６９３；ＪＰ６２−２７２９８７；およびＥＰ４５２，２３８において記載されているプロセスを含む。本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体（複数可）は、少なくとも４つのグルコシル残基を有する分子におけるアルファ−（１−６）−グルコシド結合のみを加水分解する酵素と組み合わせて使用されてもよい。優先的に、グルコアミラーゼ変異体は、プルラナーゼまたはアルファ−アミラーゼと組み合わせて使用することができる。脱分枝のためのアルファ−アミラーゼおよびプルラナーゼの使用、酵素の分子特性、ならびにグルコアミラーゼとの酵素の可能性として考えられる使用は、G.M.A.van Beynum et aI., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142において記載されている。
一実施形態では、本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体の使用は、連続糖化工程においてなどのように、デンプン変換プロセスにおいて提供される。本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体はまた、固定された形態で使用されてもよい。これは、マルトデキストリンまたはグルコースシロップまたはマルトースシロップなどのような高級なシロップを生産するのにおよびさらに、フルクトースシロップの生産に関するオリゴ糖の抽残液の流動に適しており、多くの場合、使用される。
所望の最終的な糖製品がたとえば高フルクトースシロップである場合、デキストロースシロップは、フルクトースに変換されてもよい。糖化プロセス後に、ｐＨは、ｐＨ７．５などのように６〜８の範囲の値まで増加し、カルシウムは、イオン交換によって除去される。次いで、デキストロースシロップは、たとえば、固定されたグルコースイソメラーゼ（Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）ＩＴなど）を使用して、高フルクトースシロップに変換される。
他の実施形態では、変異グルコアミラーゼは、ビール醸造用のプロセスにおいて使用される。醸造プロセスは、当技術分野においてよく知られており、麦芽製造、マッシング、および発酵の工程を一般に伴う。マッシングは、粉砕されたオオムギの麦芽および固形副原料由来のデンプンを発酵性のおよび発酵性でない糖に変換し、麦芽汁を生産するプロセスである。従来のマッシングは、設定された温度および容量で、水と粉砕されたオオムギの麦芽および副原料を混合して、麦芽製造プロセスの間に開始される生化学的変化を継続することを伴う。マッシングプロセスは、タンパク質および炭水化物の分解を担う内因性の酵素を活性化するために、様々な温度で一定の期間にわたって行われる。マッシング後に、麦芽汁は、固形物（使用済み穀物）から分離される。麦芽汁分離後に、麦芽汁は、醸造酵母を用いて発酵させて、ビールを生産してもよい。マッシングの間の形成される短い分岐グルコースオリゴマーは、とりわけグルコアミラーゼならびに／またはアルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、およびプルラナーゼのような外因性酵素の追加によって、さらに加水分解されてもよい。麦芽汁は、そのまま使用されても、または濃縮および／もしくは乾燥されてもよい。濃縮されたおよび／または乾燥された麦芽汁は、醸造抽出物として、非アルコール麦芽飲料、麦芽酢、朝食用シリアル用の、菓子用の麦芽抽出物調味料としてなどで使用されてもよい。麦芽汁は、アルコール飲料、典型的にビール、たとえばエール、ストロングエール、ビター、スタウト、ポーター、ラガー、エクスポートビール、麦芽酒、バーレーワイン、発泡酒（ｈａｐｐｏｕｓｈｕ）、高アルコールビール、低アルコールビール、ローカロリービール、またはライトビールを生産するために発酵させる。他の典型的な実施形態では、麦芽汁は、飲用エタノールを生産するために発酵させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、醸造において使用されることとなる、ゼラチン化され、液化された（典型的に）グリストデンプンを加水分解し、糖化するための方法に関し、それによって、本明細書において企図される１つまたは複数のグルコアミラーゼを含む酵素組成物は、デンプンから得られる醸造酵母発酵性の糖の量を増強するために使用される。醸造プロセスは、飲用製品およびビールを生産するために使用され、発酵性の糖は、醸造酵母を用いる発酵によってエタノールおよびＣＯ２に変換される。発酵性の糖は、従来より、穀物粒中のデンプンに由来し、所望により、グルコースおよびマルトースのシロップおよびショ糖などのような発酵性の糖供給源が補足される。手短かに言えば、当技術分野においてよく知られているビール生産は、典型的に、麦芽製造、マッシング、および発酵の工程を含む。
歴史的に、ビール生産における第１の工程は、穀物粒（たとえばオオムギ）の麦芽製造−浸漬、発芽、および乾燥である。麦芽製造の間に、酵素は、発芽穀類（たとえばオオムギ）の穀粒において生産され、デンプン、タンパク質、およびベータ−グルカンのいくらかの分解を含む、その化学的成分におけるある種の変化（修飾として知られている）がある。
麦芽にした穀類は、粉砕されて、粉砕された副原料（たとえば非発芽穀物粒）と混合されて、混合グリストを生じさせてもよいグリストを生じさせる。グリストは、水と混合され、マッシングにかけられ、先に煮沸された（ゼラチン化され、液化した）副原料が、マッシュに添加されてもよい。マッシングプロセスは、穀類タンパク質を加水分解（ｈｙｄｒｏｌｙｓｅ）し、ベータ−グルカンを分解し、デンプンを可溶性にし、加水分解するために、様々な温度で一定の期間にわたって行われる。従来のマッシングにおける、麦芽および副原料中のグリストデンプンの加水分解は、麦芽にしたオオムギに対して内因性の２つの主な酵素によって触媒される。アルファ−アミラーゼは、デンプン分子の内部におけるアルファ−１，４結合をランダムに切断し、それらをより小さなデキストリンに断片化する。ベータ−アミラーゼは、これらのデキストリンの非還元末端からアルファ−１，４結合を連続して切断し、主にマルトースを生産する。アルファ−およびベータ−アミラーゼの両方は、デンプン分子中のデンプン鎖の分岐点を形成するアルファ−１，６結合を加水分解することができず、これは、マッシュにおける限界デキストリンの蓄積をもたらす。麦芽は、酵素、限界デキストリナーゼを含有し、これは、アルファ−１，６結合の加水分解を触媒するが、その熱不安定性によりマッシング温度では弱い活性しか示さない。マッシング後に、液体抽出物（麦芽汁）は、使用済み穀物固形物（つまりグリストの一部を形成する不溶性穀物および殻材料）から分離される。麦芽汁分離の目的は、・好適な抽出物回収率を得ること、・好適なろ過性を得ること、および・澄んだ麦芽汁を生産することである。麦芽汁の抽出物回収率およびろ過性は、醸造プロセスの経済性において重要である。
麦芽汁の組成は、原材料、マッシングプロセスおよびプロファイル、ならびに他の変動要因に依存する。典型的な麦芽汁は、６５〜８０％の発酵性の糖（グルコース、マルトース、およびマルトトリオース）ならびに２０〜３５％の非発酵性の限界デキストリン（マルトトリオースよりも高度な重合度を有する糖）を含む。高レベルの副原料非麦芽穀類グリストと共に醸造する場合、マッシングの間のデンプン加水分解酵素が不十分となり得る。したがって、マッシングプロセスの間に発酵性の糖を生産することができる外因性酵素の供給源が必要である。さらに、そのような外因性酵素はまた、低炭水化物含有量を有する非常に薄いビールを醸造するために、発酵性の糖の対応する増加と共に、麦芽汁における非発酵性の糖のレベルを低下させるのに必要である。本明細書において企図される少なくとも１つのグルコアミラーゼを含むデンプンの加水分解のための酵素組成物が本明細書において開示され、これは、デンプングリストにおけるアルファ−１，４結合および／またはアルファ−１，６結合を切断するために、マッシュに添加するまたは醸造プロセスのマッシング工程において使用することができ、それによって麦芽汁の発酵性の糖の含有量を増加させ、完成したビールにおける非発酵性の糖の残渣を低下させることができる。さらに、そのように生産された麦芽汁は、シロップまたは粉末を提供するために、乾燥させてもよい（たとえば噴霧乾燥によって）または濃縮させてもよい（たとえば、煮沸および蒸発）。
本明細書において企図されるグリストは、任意の植物ならびに塊茎、根、茎、葉、および種子を含む植物の一部から誘導できる植物材料を含有する任意のデンプンおよび／または糖を含んでいてもよい。多くの場合、グリストは、オオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、コーン、コメ、ミロ、キビ、およびソルガム由来の穀物などのような穀物を含み、麦芽汁のグリストの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、またはさらに１００％（ｗ／ｗ）などのように、より好ましくは少なくとも１０％もしくはより好ましくは少なくとも１５％、さらに好ましくは少なくとも２５％、または最も好ましくは少なくとも３５％は、穀物に由来する。最も好ましくは、グリストは、オオムギの麦芽などのような麦芽にした穀物を含む。麦芽汁のグリストの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、またはさらに１００％（ｗ／ｗ）などのように、好ましくは少なくとも１０％もしくはより好ましくは少なくとも１５％、さらに好ましくは少なくとも２５％、または最も好ましくは少なくとも３５％は、麦芽にした穀物に由来する。好ましくは、グリストは、オオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、コーン、コメ、ミロ、キビ、およびソルガム由来の麦芽にしていない穀物などのような副原料を含み、麦芽汁のグリストの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、またはさらに１００％（ｗ／ｗ）などのように、より好ましくは少なくとも１０％もしくはより好ましくは少なくとも１５％、さらに好ましくは少なくとも２５％、または最も好ましくは少なくとも３５％は、麦芽にしていない穀物または他の副原料に由来する。糖またはシロップなどのような即時発酵性の炭水化物を含む副原料は、本発明のマッシングプロセスの前に、その間に、またはその後に麦芽マッシュに添加されてもよいが、好ましくは、マッシングプロセス後に添加される。副原料の一部は、マッシュに添加される前にアルファ−アミラーゼおよび／もしくはエンドペプチダーゼ（プロテアーゼ）および／もしくはエンドグルカナーゼを用いて処理されてもよいならびに／または熱処理されてもよい。本明細書において企図される酵素組成物は、さらなる酵素（複数可）、好ましくは、アルファ−アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、エキソグルカナーゼまたはエンドグルカナーゼなどのようなグルカナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、フェルロイルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、およびグルコアミラーゼの中から選択される酵素を含んでいてもよい。マッシングプロセスの間に、グリストから抽出されるデンプンは、発酵性の糖およびより小さなデキストリンに徐々に加水分解される。好ましくは、マッシュは、麦芽汁分離前の、ヨウ素試験に対して陰性のデンプンである。
醸造プロセスの第３の工程である発酵前に、麦芽汁は、典型的に、醸造釜に移され、５０〜６０分間、激しく煮沸させる。内因性の麦芽酵素およびマッシュまたは副原料に対して添加される任意の外因性酵素の不活性化を含む、多くの重要なプロセスが、麦芽汁煮沸の間に存在する［さらなる情報は、"Technology Brewing and Malting" by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3rd completely updated edition, 2004, ISBN 3-921690-49-8において見つけられてもよい］。次いで、煮沸された麦芽汁は、冷却され、醸造酵母を投入し、典型的に８〜１６℃の範囲の温度で発酵させ、発酵性の糖をエタノールに変換する。低アルコールビールは、アルコールを選択的に除去する役目をする真空蒸発のプロセスによって最終的なビールから生産することができる。
代替の実施形態では、本開示は、本明細書において企図される１つまたは複数のグルコアミラーゼ（たとえば熱不安定性のグルコアミラーゼ）を含む酵素組成物を使用して、麦芽汁における発酵性の糖の量を増強するための方法であって、それによって、酵素組成物は、麦芽汁が煮沸された後に麦芽汁に添加され、１つまたは複数のグルコアミラーゼが発酵工程の間に活性となる方法に関する。酵素組成物はまた、麦芽汁に醸造酵母を投入する前に、それと同時に、またはその後に、煮沸された麦芽汁に添加することができる。発酵および熟成工程の終了時に、ビールは、所望により真空蒸発にかけられ、低アルコールビールを生産してもよいが、次いで、低温殺菌される。この方法の固有の有利性は、約６〜１５日間ある（投入する割合、発酵、温度などに依存）発酵プロセスの期間にあり、これにより、短いマッシング工程（２〜４時間の期間）と比較して、非発酵性の糖の酵素による切断に、より多くの時間が与えられる。この方法のさらなる有利性は、非発酵性の糖における所望の減少（および発酵性の糖における増加）を達成するために必要な酵素組成物の量にあり、これは、非発酵性の糖における類似する減少を達成するためにマッシュに添加される必要があるであろうよりも、酵素活性の単位（たとえばグルコアミラーゼ活性の単位）の著しくより少ない数に対応する。さらに、それは、グルコアミラーゼの高度な分量の割合がマッシュに添加される場合に、特に麦汁ろ過による麦芽汁分離の間に多くの場合見られる問題を除去する。
本開示はまた、本開示によって包含される少なくとも１つの変異グルコアミラーゼを含む飼料組成物または配合物を提供する。デンプンを含む供給原料の生産においてグルコアミラーゼ酵素を使用するための方法は、ＷＯ０３／０４９５５０（その全体が参照によって本明細書において組み込まれる）において提供される。手短かに言えば、グルコアミラーゼ変異体は、デンプンを含む供給原料と混ぜられる。グルコアミラーゼは、動物による使用のために抵抗性のデンプンを分解することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるグルコアミラーゼ変異体は、デンプン供給材料をベースとする燃料の生成におけるプロセスにおいて使用される。本開示の他の目的および有利性は、本明細書から明らかである。
本発明によるさらなる実施形態
１．配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス１２に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用。
２．その結晶形をしている場合に、主鎖原子の原子座標が、等価な主鎖原子のアライメント後に、ＴｒＧＡの等価な主鎖原子の原子座標（ＷＯ２００９／０６７２１８における表２０において定義される）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有する結晶構造を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメイン、および触媒ドメインを有し、デンプン結合ドメインの相互連結ループ２’中にならびに／または触媒ドメインのループ１中におよび／もしくはヘリックス２中におよび／もしくはループ１１中におよび／もしくはヘリックス１２中に親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用。
３．上述の２つ以上のアミノ酸置換は、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列を有するヘリックス１２に対するものである、実施形態１〜２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４．２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
５．２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の１、２、３、または４つのアミノ酸置換ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の１、２、３、または４つのアミノ酸置換である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
６．２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
７．２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
８．２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
９．２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１０．２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１１．グルコアミラーゼ変異体は、相互連結ループ２’の５２０〜５４３位、５３０〜５４３位、または５３４〜５４３位内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１２．グルコアミラーゼ変異体は、ループ１の３０〜５０位、３５〜４８位、または４０〜４６位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１３．グルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス２の５０〜６６位、５５〜６４位、または５８〜６３位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１４．グルコアミラーゼ変異体は、ループ１１の４０５〜４２０位、４１０〜４２０位、または４１５〜４２０位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１５．グルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス１２の４２１〜４３４位、４２５〜４３４位、または４２８〜４３４位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１６．グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１７．グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１８．グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、または３９０のデンプン結合ドメインと、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１９．グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９の触媒ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２０．グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２１．縮合産物は、イソマルトースである、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２２．デンプンの加水分解は、醸造プロセスにおけるものである、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２３．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵性の糖（複数可）の生産の増強を示す、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２４．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスのマッシング工程において発酵性の糖の生産の増強を示す、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２５．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスの発酵工程において発酵性の糖の生産の増強を示す、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２６．発酵性の糖は、グルコースである、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２７．デンプンの加水分解は、グルコースシロップを生産するためのプロセスにおけるものである、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２８．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成（ＩＳ）およびデンプン加水分解活性（ＳＨ）の間の比の低下を示す、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
２９．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、デンプン加水分解活性の低下を示す、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３０．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵の実質的な程度の増強を示す、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３１．グルコアミラーゼは、同等の条件下で、グルコアミラーゼＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）によって形成される縮合産物の量よりも少ない量の縮合産物を形成する、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３２．グルコアミラーゼは、同等の条件下で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）によって形成される縮合産物の量と本質的に同じ、それよりも５％以下で高い、８％以下で高い、または１０％以下で高い量の縮合産物を形成する、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３３．グルコアミラーゼの投入量は、タンパク質濃度に基づいて同じである、実施形態３１〜３２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３４．グルコアミラーゼの投入量は、活性アッセイにおける活性の測定に基づいて同じである、実施形態３１〜３３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３５．グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４４、６１、４１７、および４３１位から選択される位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３６．グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつａ）４４位にアミノ酸置換を有しならびに／またはｂ）４１７および４３１位の両方にアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３７．グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４４位にアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３８．グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４１７位および４３１位にアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
３９．グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４４位および６１位にアミノ酸置換を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４０．グルコアミラーゼ変異体は、４３位にアミノ酸置換を有し、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４１．グルコアミラーゼ変異体は、６１位にアミノ酸置換を有し、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４２．５３９位のアミノ酸置換は、５３９Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４３．４４位のアミノ酸置換は、４４Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４４．４１７位のアミノ酸置換は、４１７Ｒ／Ｖであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４５．４１７位のアミノ酸置換は、４１７Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４６．４１７位のアミノ酸置換は、４１７Ｖであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４７．４３１位のアミノ酸置換は、４３１Ｌであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４８．４３位のアミノ酸置換は、４３Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
４９．６１位のアミノ酸置換は、６１Ｉであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
５０．実施例１〜４９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
５１．アミノ酸置換は、５３９位にあり、かつアミノ酸置換は、４４位にあり、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応し、この配列は、親グルコアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、４４位におけるアミノ酸置換は、４４Ｃではない、２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体。
５２．アミノ酸置換は、５３９位にあり、かつアミノ酸置換は、４４Ｒであり、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、２つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態５１に記載のグルコアミラーゼ変異体。
５３．６１位においてアミノ酸置換を含み、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態５１〜５２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
５４．グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼに対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、実施形態５１〜５３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
５５．グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、実施形態５１〜５４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
５６．グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、実施形態５１〜５５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
５７．５３９位におけるアミノ酸置換は、５３９Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態５１〜５６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
５８．４４位におけるアミノ酸置換は、４４Ｒであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態５１〜５７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
５９．６１位におけるアミノ酸置換は、６１Ｉであり、この位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態５１〜５８のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６０．以下のアミノ酸置換：
ａ．Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒまたは
ｂ．Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ
を含み、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、実施形態５１〜５９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６１．配列番号２から成り、以下のアミノ酸置換：
ａ．Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒまたは
ｂ．Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ
を有し、これらの位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置に対応する、実施形態５１〜６０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６２．グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、または３９０のデンプン結合ドメインと、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する、実施形態５１〜６１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６３．グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９の触媒ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する、実施形態５１〜６２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６４．親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ．）、ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、タラロミセス属種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ ｓｐｐ．）、またはシゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）から得られるグルコアミラーゼから選択される、実施形態５０〜６３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６５．親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）から得られる、実施形態５０〜６４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６６．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵性の糖（複数可）の生産の増強を示す、実施形態５０〜６５のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６７．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスのマッシング工程において発酵性の糖の生産の増強を示す、実施形態５０〜６６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６８．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスの発酵工程において発酵性の糖の生産の増強を示す、実施形態５０〜６７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
６９．発酵性の糖は、グルコースである、実施形態６８に記載のグルコアミラーゼ変異体。
７０．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の比（ＩＳ／ＳＨ比）の低下を示す、実施形態５０〜６９のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
７１．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、デンプン加水分解活性の低下を示す、実施形態５０〜７０のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
７２．グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵の実質的な程度の増強を示す、実施形態５０〜７１のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
７３．グルコアミラーゼは、同じ条件下でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）によって形成される縮合産物の量よりも少ない量の縮合産物を形成する、実施形態５０〜７２のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
７４．グルコアミラーゼは、同じ条件下で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）によって形成される縮合産物の量と本質的に同じ、それよりも５％以下で、８％以下で、または１０％以下で高い量の縮合産物を形成する、実施形態５０〜７３のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
７５．グルコアミラーゼの投入量は、タンパク質濃度に基づいて同じである、実施形態７３〜７４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
７６．グルコアミラーゼの投入量は、活性アッセイにおける活性の測定に基づいて同じである、実施形態７３〜７４のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
７７．グルコアミラーゼは精製されている、実施形態５０〜７６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体。
７８．実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
７９．実施形態７８に記載のポリヌクレオチドを含むまたは実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体を発現することができるベクター。
８０．実施形態７９に記載のベクターを含む宿主細胞。
８１．実施形態５０〜８０のいずれか１つに記載の変異グルコアミラーゼをコードする核酸を染色体の中に安定して統合している宿主細胞。
８２．実施形態５０〜７６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体を発現することができる細胞。
８３．実施形態７８〜８１のいずれか１つに記載の宿主細胞または細菌細胞、菌類細胞、もしくは酵母細胞である、実施形態８１に記載の細胞。
８４．トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｉｉ）などのようなトリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）である、実施形態８３に記載の宿主細胞。
８５．プロテアーゼ欠損および／またはキシラナーゼ欠損および／または自然グルカナーゼ欠損宿主細胞である、実施形態８３〜８４のいずれか１つに記載の宿主細胞。
８６．実施形態８０〜８５のいずれか１つに記載の宿主細胞または細胞を得ることと、細胞または宿主細胞からグルコアミラーゼ変異体を発現させることとを含み、グルコアミラーゼ変異体を精製することを含んでもよい、グルコアミラーゼ変異体を発現させるための方法。
８７．グルコアミラーゼ変異体を精製することを含む、実施形態８６に記載の方法。
８８．酵素組成物の調製のための、実施形態５０〜７６のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
８９．実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載の少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体を含む酵素組成物。
９０．組成物は、デンプン加水分解組成物、糖化組成物、界面活性剤、アルコール発酵酵素組成物、および飼料の中から選択される、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載の少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体を含む、実施形態８９に記載の酵素組成物。
９１．デンプン加水分解組成物である、実施形態９０に記載の酵素組成物。
９２．アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、およびさらなるグルコアミラーゼの中から選択される、少なくとも１つのさらなる酵素を含む、実施形態８９〜９１のいずれか１つに記載の酵素組成物。
９３．少なくとも１つのさらなる酵素は、アミラーゼ、プルラナーゼ、およびさらなるグルコアミラーゼの中から選択される、実施形態８９〜９２に記載の酵素組成物。
９４．少なくとも１つのさらなるものは、アミラーゼおよびプルラナーゼの中から選択される、実施形態８９〜９３に記載の酵素組成物。
９５．アミラーゼは、アルファ−アミラーゼおよびイソアミラーゼの中から選択される、実施形態８９〜９４のいずれか１つに記載の酵素組成物。
９６．デンプンまたは部分的に加水分解されたデンプンを、グルコースを含有するシロップに変換するための方法であって、上述のプロセスは、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載の少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体または実施形態８９〜９５のいずれか１つに記載の酵素組成物の存在下において、液体デンプン溶液を糖化することを含む、方法。
９７．実施形態５０〜７７に記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８９〜９５のいずれか１つに記載の酵素組成物を使用する、酵素糖化工程を含む、液体デンプン溶液を糖化するための、実施形態９６に記載の方法。
９８．少なくとも１つのさらなる酵素と液体デンプン溶液を接触させることをさらに含む、実施形態９６〜９７のいずれか１つに記載の方法。
９９．さらなる酵素は、アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、およびグルコアミラーゼの中から選択される、実施形態９８に記載の方法。
１００．さらなる酵素は、アミラーゼおよびプルラナーゼである、実施形態９６〜９９に記載の方法。
１０１．アミラーゼは、アルファ−アミラーゼおよびイソアミラーゼの中から選択される、実施形態９６〜１００のいずれか１つの実施形態に記載の方法。
１０２．連続デンプン変換プロセスにおけるなどのような、デンプン変換プロセスにおける、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１０３．オリゴ糖、マルトデキストリン、またはグルコースシロップを生産するためのプロセスにおける、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１０４．高フルクトースコーンシロップを生産するためのプロセスにおける、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１０５．グリストからマッシュを形成することと、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体または実施形態８９〜９５のいずれか１つに記載の酵素組成物とマッシュを接触させることとを含む、醸造用の麦芽汁を生産するための方法。
１０６．１つまたは複数のさらなる酵素とマッシュを接触させることをさらに含む、実施形態１０５に記載の方法。
１０７．１つまたは複数の酵素は、アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、およびグルコアミラーゼの中から選択される、実施形態１０６に記載の方法。
１０８．１つまたは複数の酵素は、アミラーゼおよび／またはプルラナーゼである、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．アミラーゼは、アルファ−アミラーゼおよび／またはイソアミラーゼである、実施形態１０７〜１０８のいずれか１つの実施形態に記載の方法。
１１０．グリストは、麦芽にした穀物、非麦芽穀物、副原料、およびその任意の組み合わせの１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒｅ ｍｏｒｅ）を含む、実施形態１０５〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１１．発酵飲料を得るために麦芽汁を発酵させることをさらに含む、実施形態１０５〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
１１２．ビールを得るために麦芽汁を発酵させることをさらに含む、実施形態１０５〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
１１３．ａ．マッシュを調製することと、
ｂ．マッシュをろ過して、麦芽汁を得ることと、
ｃ．麦芽汁を発酵させて、ビールを得ることと
を含み、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体は、工程（ａ）および／または工程（ｂ）および／または工程（ｃ）に添加される、ビールの生産のための方法。
１１４．ビールは、低温殺菌工程にかけられる、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．醸造プロセスのマッシング工程または発酵工程のいずれかにおいて発酵性の糖の生産を増強するための、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１１６．ａ．マッシュを調製する工程と、
ｂ．マッシュをろ過して、麦芽汁を得る工程と、
ｃ．麦芽汁を発酵させて、ビールを得る工程と、
ｄ．ビールを低温殺菌する工程と
によって生産され、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体は、工程（ａ）および／または工程（ｂ）および／または工程（ｃ）に添加される、ビール。
１１７．低温殺菌されたビールは、
ａ．グルコアミラーゼ活性を本質的に有していないならびに／または
ｂ．ローカロリービールおよび／もしくは低アルコールビール
としてさらに特徴づけられる、実施形態１１６に記載のビール。
１１８．アルコール発酵プロセスにおける、実施形態５０〜７７のいずれか１つに記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
１１９．親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を有するグルコアミラーゼ変異体の同定のためのスクリーニング法。
１２０．親グルコアミラーゼと比較して、同じまたは増加したデンプン加水分解活性および５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、低下したイソマルトース合成を有し、親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を有するグルコアミラーゼ変異体の同定のためのスクリーニング法。
１２１．デンプンの加水分解中に縮合産物の合成の低下を有するグルコアミラーゼ変異体の同定のためのスクリーニング法であって、グルコアミラーゼ変異体のイソマルトース合成およびデンプン加水分解活性を測定する工程ならびに親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、低下したデンプン加水分解活性を有し、かつ親グルコアミラーゼと比較してイソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を有する変異体を選択する工程を含む、スクリーニング法。
１２２．実施形態１１９〜１２１のいずれか１つに記載の方法によって得られるグルコアミラーゼ変異体。
アッセイおよび方法
以下のアッセイおよび方法は、下記に提供される実施例において使用される。変異体を提供するために使用される方法は、下記に記載される。しかしながら、様々な方法が、親酵素の変異体を提供するために使用されてもよく、本発明は、実施例において使用される方法に限定されないことに注意されたい。変異体の作製および変異体の選択のための任意の適した手段が使用されてもよいことが意図される。
９６ウェルマイクロタイタープレートについてのｐＮＰＧグルコアミラーゼ活性アッセイ
試薬溶液は、ＮａＡｃバッファー：２００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５；基質：ＮａＡｃバッファー中の５０ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｎ−１３７７）（０．３ｇ／２０ｍｌ）、および停止溶液：８００ｍＭグリシン−ＮａＯＨバッファーｐＨ１０とした。３０μｌのろ過した上清を、新しい９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中に置いた。それぞれのウェルに、５０μｌ ＮａＡｃバッファーおよび１２０μｌ 基質を添加し、５０℃で３０分間、インキュベートした（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉＥＭＳ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ／ｓｈａｋｅｒ ＨＴ）。反応は、１００μｌ停止溶液を添加することによって終結させた。吸光度は、ＭＴＰリーダーにおいて４０５ｎｍで測定し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ３８４ ｐｌｕｓ）、活性は、０．０１１μＭ／ｃｍのモル吸光係数を使用して計算した。
熱安定性アッセイ１
１５０ｐｐｍの精製酵素のストック希釈液を用いて（５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ４．０中）、２９４μｌ ５０ｍＭ ＮａＡｃバッファーｐＨ４．５に６μｌを添加することによって、３ｐｐｍ希釈液を作製した。希釈した試料を、等しく、２つのＭＴＰに分けた。一方のＭＴＰ（最初のプレート）は、４℃で１時間インキュベートし、他方のＭＴＰ（残りのプレート）は、１時間、６４℃でインキュベートした（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉＥＭＳ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ／Ｓｈａｋｅｒ ＨＴ）。残りのプレートは、氷上で１０分間冷ました。最初のプレートおよび残りのプレートの両方の６０μｌを、１２０μｌの４％可溶性コーンスターチｐＨ３．７に添加し、２つの別個のＭＴＰ中で３２℃、９００ｒｐｍで２時間インキュベートした（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ ｉＥＭＳ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ／Ｓｈａｋｅｒ ＨＴ）。両方のプレートの活性は、下記に記載されるエタノール適用アッセイを使用して、ヘキソキナーゼ活性アッセイにおいて測定した。
熱安定性は、残存活性％として以下のように計算した。
Figure 0005827227
ヘキソキナーゼ活性アッセイ
ヘキソキナーゼカクテル：使用の１０〜１５分前に、９０ｍｌの水を、ＢｏａｔＩＬ容器グルコースＨＫ Ｒ１に添加し［ＩＬ試験グルコース（ＨＫ）キット、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＃１８２５０７−４０］、穏やかに混合した。１００μｌのヘキソキナーゼカクテルを、８５μｌのｄＨ２Ｏに添加した。１５μｌの試料を混合物に添加し、室温で暗中で１０分間インキュベートした。吸光度は、１０分後にＭＴＰリーダーにおいて３４０ｎｍで読み取った。グルコース濃度は、グルコース（０〜１．６ｍｇ／ｍｌ）標準曲線に従って計算した。
エタノール適用−コーンスターチからのグルコース放出
８％のストック溶液：８ｇの可溶性コーンスターチ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｓ４１８０）を室温で４０ｍｌ ｄＨ２Ｏ中で懸濁した。スラリーの一部は、２５０ｍｌフラスコ中の５０ｍｌの煮沸ｄＨ２Ｏに添加し、５分間煮沸した。デンプン溶液は、撹拌しながら２５℃まで冷却し、容量は、残りの１０ｍｌのｄＨ２Ｏを用いて調整した。
停止溶液：８００ｍＭグリシン−ＮａＯＨバッファー、ｐＨ１０。
４％（ｍ／ｖ）可溶性デンプン検量線用溶液：ストック溶液は、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．０を用いて希釈した（１：１）。
６μｌの１５０ｐｐｍ精製酵素を、平底９６ウェルＭＴＰ中で２９４μｌ ５０ｍＭ ＮａＡｃバッファーｐＨ４．０を用いて希釈した。６０μｌの希釈液を、１２０μｌの４％可溶性コーンスターチｐＨ４．０に添加し、３２℃、９００ｒｐｍで２時間インキュベートした（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ ｉＥＭＳ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ／Ｓｈａｋｅｒ ＨＴ）。反応は、９０μｌの４℃の冷たい停止溶液を添加することによって停止させた。試料は、２０分間、氷上に置いた。デンプンは、５分間１０℃で１１１８×ｇで回転させ（ＳＩＧＭＡ ６Ｋ１５）、１５μｌ上清は、グルコース含有量を決定するために上記に記載されるヘキソキナーゼ活性アッセイにおいて使用した。
エタノールスクリーニングアッセイの性能指数のデータ分析および計算
タンパク質レベルは、マイクロ流体電気泳動機器を使用して測定した（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）。マイクロ流体チップおよびタンパク質試料は、メーカーの指示に従って調製した［ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｐ／Ｎ ７６０３０１］。培養上清を調製し、３０分間、３７℃のインキュベーター中で温めることによって解凍する場合に、使用まで−２０℃で９６ウェルマイクロタイタープレート中で保存した。短い間振盪させた後に、それぞれの培養試料の２μｌを、７μｌ試料バッファー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を含有する９６ウェルＰＣＲプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移し、その後、サーモスタット制御プレートヒーター上で５分間、９０℃までプレートを加熱した。それぞれの試料に４０μｌ水を添加する前にプレートを冷却した。次いで、プレートを、メーカーによって供給され、検量されたタンパク質標準物質と共に機器中に置いた。タンパク質がチップの中心を通過する時に、蛍光シグナルを、記録し、タンパク質濃度は、タンパク質標準物質の検量されたセットによって生成されるシグナルと比較したシグナルを定量することによって決定する。
Ｃａｌｉｐｅｒタンパク質測定の後に、データは、以下の方法において処理する。
検量ラダーを、ピークパターンの正確さについてチェックする。実行と関連する検量ラダーが十分でない場合、それを、隣接する実行の検量ラダーと交換する。ピーク検出については、ｃａｌｉｐｅｒソフトウェアのグローバルピークファインドオプション（ｇｌｏｂａｌ ｐｅａｋ ｆｉｎｄ ｏｐｔｉｏｎ）のデフォルト設定を使用する。興味のあるピークは、７５ｋＤＡ＋／−１０％で選択する。結果は、表計算プログラムにエクスポートし、ピーク面積は、エタノールスクリーニングアッセイにおいて対応する活性（ＡＢＳ３４０−ブランク測定値）と関連する。
１２の野生型試料の面積および活性数値を用いて、検量線は、非線形フィット関数と組み合わせて、プログラムＧｒａｆｉｔバージョン５（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｈｏｒｌｅｙ、ＵＫ）の「酵素反応速度論」式を使用して作製する。ＫｍおよびＶｍａｘのパラメーターを計算するためにデフォルト設定を使用する。これらの２つのパラメーターに基づいて、ミカエリス−メンテン基準線を作製し、それぞれの変異体の比活性を計算する。
比活性に基づいて、性能指数（ＰＩ）を計算する。変異体のＰＩは、指数「変異体比活性／ＷＴ比活性」とする。ＷＴのＰＩは、１．０とし、ＰＩ＞１．０を有する変異体は、ＷＴよりも高い比活性を有する。
ＴｒＧＡ変異体の精製
発現されたＴｒＧＡ変異体の培養上清は、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、親和性クロマトグラフィーによって一工程で精製した。β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；８５．６０８−８）をエポキシ活性化セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｉｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ；１７−０４８０−０１）に連結し、精製に使用した。カラムは、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．３を用いて平衡化し、その後、濃縮酵素試料を適用した。結合した変異体は、１０ｍＭ α−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ、２８７０５）を含有する２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．３を用いてカラムから溶出した。精製した試料は、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して分析した。
精製ＴｒＧＡ変異体のタンパク質定量化
精製ＴｒＧＡ変異体のタンパク質濃度は、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍを使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーによって決定した。精製試料は、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ＿１ｍｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、結合タンパク質を溶出するために、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．３中０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの線形勾配を適用した。ピーク面積を決定し、タンパク質濃度は、既知濃度を有するＴｒＧＡ標準物質と比較して計算した。
液化液（ｌｉｑｕｅｆａｃｔ）アッセイ
変異体のグルコース放出は、６ウェルプレートにおける、地方のエタノール製造業者からのコーンマッシュ液化液に基づいて決定した。プレートのそれぞれのウェルに、６ｇの２６％ＤＳ液化液ｐＨ４．３を充填した。続いて、３００ｐｐｍ酵素および４００ｐｐｍ尿素を添加し、２５０μｌ試料を、３２℃でのインキュベーションの２、４、および６時間後に収集した。試料は、１４，０００×ｇで５分間、遠心分離し、５０μｌの上清を、５０μｌの死滅溶液（１．１Ｎ硫酸）を含有するｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、５分間放置した。２５０μｌの水をチューブに添加し、次いで、０．２２μｍろ板を用いてろ過し、下記に記載されるようにＨＰＸ−８７Ｈカラムに注入した。
エタノール発酵におけるＴｒＧＡ変異体の性能の評価
地方のエタノール製造業者からコーンマッシュ液化液の試料を得、いくつかの場合において、薄い蒸留廃液を使用して、２６％ＤＳまで希釈した。スラリーのｐＨは、４Ｎ硫酸を使用して、ｐＨ４．３に調整した。マッシュの１００ｇまたは５０ｇの一定分量を１２５ｍｌ振盪フラスコの中に入れ、３２℃インキュベーターの中に置き、平衡化させた。１００μｌ ４００ｐｐｍ尿素の追加後に、所望の濃度の１ｍｌ精製変異体または２つの異なる濃度の精製ＴｒＧＡを、振盪フラスコに添加した。最後に、３３３μｌのＲｅｄ Ｓｔａｒ Ｒｅｄ酵母の溶液（１５ｇを４５ｍｌ ＤＩ水中で３０分間水和；Ｌｅｓａｆｆｒｅ ｙｅａｓｔ Ｃｏｒｐ．Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を、それぞれの試料に添加した。試料は、５、２１、２８、４８、および５２時間に収集し、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ｓｅｒｉｅｓ）によって分析した。
エタノールおよび炭水化物の測定
２ｍｌ ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心管に、発酵槽ビールを充填し、１０分間氷上で冷却した。試料は、１４，０００×ｇで３分間、遠心分離し、５００μｌの上清を、５０μｌの死滅溶液（１．１Ｎ硫酸）を含有する試験管に移し、５分間放置した。５．０ｍｌの水を試験管に添加し、次いで、０．２２μｍろ板（ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でろ過し、ＨＰＬＣ上で実行した。カラム温度：６０℃；移動相：０．０１Ｎ硫酸；流速０．６ｍｌ／分；検出器：ＲＩ；注入容量：２０μｌ。カラムは、電荷および分子量に基づいて分子を分離する；ＤＰ１（単糖）；ＤＰ２（二糖）；ＤＰ３（三糖類）；ＤＰ＞３（オリゴ糖、３を超える重合度を有する糖）；コハク酸；乳酸；グリセロール；メタノール；エタノール。
ＧＡＵ活性の測定
基質：ｐ−ニトロフェニル−β−マルトシド（４ｍＭ）および耐熱性β−グルコシダーゼ（５Ｕ／ｍｌ）（アッセイＲ−ＡＭＧＲ３ ０５／０４から；Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を新たに調製した。
バッファー：２００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）。
酵素試料は、酢酸ナトリウムバッファー中の少なくとも第１０因子によって希釈した。９６ウェルプレート中で、２０μＬ基質を、２０μＬ酵素溶液と混合し、１０分間、撹拌しながら４０℃でインキュベートした。３００μＬ ２％Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅを、反応を終結させるために添加し、色を生じさせた。４００ｎｍでの吸光度を、試薬ブランクに対して測定した。
ブランクは、激しく撹拌しながら、２０μＬの基質に３００μＬのＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅ溶液（２％）を添加し、その後に酵素溶液（２０μＬ）を添加することによって調製した。活性は、以下のように計算した。
Figure 0005827227
 Ｕ＝酵素活性国際単位。１単位は、決定されたｐＨおよび温度で毎分、基質から１μモルのｐ−ニトロフェノールを放出する酵素の量である。ΔＡ４００＝吸光度（反応）−吸光度（ブランク）。１０＝インキュベーション時間（分）。３４０＝最終的な反応容量（μＬ）。２０＝アッセイした酵素の容量（μＬ）。１８．１＝４００ｎｍでの２％ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ（ｐＨ 約８．５）中のｐ−ニトロフェノール ＥｍＭ（単位：μＭ−１＊ｃｍ−１）。０．８８＝光路（ｃｍ）
デンプン加水分解活性（ＳＨ活性）：
バッファー：０．１Ｍクエン酸バッファーｐＨ５．４（０．１Ｍクエン酸および０．１Ｍトリクエン酸ナトリウムから作製）
基質：バッファー中３０％可溶性デンプン（Ｍｅｒｃｋ、ｖ．ｎｒ １．０１２５７．１０００）（デンプンがすべて溶解するまでわずかに加熱する）
酵素：上記のアッセイに基づいて３ＧＡＵ／ｍｌに標準化したグルコアミラーゼ。
６０μＬ ３０％デンプンを９６ウェルＰＣＲプレートに移した。６０μＬ酵素試料または標準物質をピペットを用いて数回ポンピングすることによって添加し混合した。以下の工程をインキュベーションまでにできるだけ速く実行した（ｗｅｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｕｏｔ）。
ＰＣＲプレートは、密閉テープを用いてカバーし、以下のＰＣＲプログラムを実行した。６３℃で６分、９９℃で６分、および４℃で１０分。ふたは加熱しなかった。温度サイクル後に、ＰＣＲプレートは、ウェルの底の液体をすべて収集するために遠心分離した（３００ｒｐｍで約１分）。プレートは、さらなる分析まで４℃で保存した。グルコース濃度は、下記の方法に従って測定し、加水分解活性は、以下のように計算した。
Figure 0005827227
イソマルトース加水分解活性
基質を２％イソマルトース（Ｓｉｇｍａ Ｉ７２５３）とし、ＰＣＲプログラムにおける第１の工程を６分の代わりに６３℃で１０分とするという点を除いてはデンプン加水分解活性と同じとする。
グルコース濃度の測定
Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｃ）Ｄ−グルコースアッセイ（ＫＧＬＵＣ ０４／０６）から修飾し、デンプンおよびイソマルトースの加水分解反応から放出されるグルコースの量を決定するために使用する。
ボトル１の内容物［試薬バッファー：リン酸カリウムバッファー（１．０Ｍ、ｐＨ７．４）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（０．２２Ｍ）、およびアジ化ナトリウム（０．４％ｗ／ｖ）］を蒸留水を用いて１Ｌまで希釈した。ボトル２の内容物［試薬酵素：グルコースオキシダーゼ（＞１２，０００Ｕ）およびペルオキシダーゼ（＞６５０Ｕ）ならびに４−アミノアンチピリン（８０ｍｇ）、凍結乾燥粉末］を約２０ｍＬの溶液１中で希釈し、溶液１の残りを含有するボトルに定量的に移した（ｔｒａｎｓｆｅｒｅｄ）。これをグルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ試薬）とする。それを新鮮なまま使用したまたは暗中で冷凍で保存した。使用前に、蒸留水に対して読み取った場合に、この溶液の吸光度（Ａ５１０）が０．０５未満であったことをチェック（ｃｈｅｋｅｄ）した。
９６ウェルプレートにおいて、２５０μＬのＧＯＰＯＤ試薬を１０μＬの試料溶液に添加する。密閉テープを用いてプレートをカバーし、２０分間、４０℃、７００ｒｐｍで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中でインキュベートする。５１０ｎｍで吸光度を読み取る。グルコース標準曲線は、ｍｉｌｌｉ−ｑ水中１．４；１．２；０．８；０．４；０．２、および０ｍｇ／グルコースｍｌの溶液から作製し、試料グルコース濃度の計算に使用する。
ＴＬＣによるマルトースおよびイソマルトース合成の測定
基質：０．１Ｍクエン酸バッファー、ｐＨ５．４中３０％グルコース（グルコースをすべて溶解するためにわずかに加熱する）。
酵素：３ＧＡＵ／ｍｌに標準化したグルコアミラーゼＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ産物（ＡｎＧＡ；Ｄｉａｚｙｍｅ（登録商標）×４、Ｄａｎｉｓｃｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ産物（ＴｒＧＡ Ｄｉａｚｙｍｅ ＴＲ８ Ｄａｎｉｓｃｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を常に参照として実行した。
参照：熱不活化酵素試料および／またはバッファー溶液（すべての場合で使用したわけではない）。
標準物質：１）脱塩水中０．３％マルトースおよび０．１％イソマルトース。２）脱塩水中０．２％マルトースおよび０．０５％イソマルトース。３）脱塩水中０．３％マルトースおよび０．１％イソマルトース。
反応条件：６０μｌ基質を、ＰＣＲプレートのウェルにおいて６０μＬ酵素溶液と混合した。プレートを密閉テープを用いてカバーし、以下の温度を実行した。６３℃で１２０分、９９℃で６分、４℃で１０分。ふたは７０℃まで加熱した。インキュベーション後に、プレートを適度に遠心分離し（３００ｒｐｍで１分）、それらは、さらなる分析まで４℃で保存した。試料はすべて二通り実行した。
マルトースおよびイソマルトースの定量化：試料適用前に１０分間、１６７℃でＴＬＣプレートを予熱する。脱塩水中で試料および標準物質をすべて２０倍に希釈する。４μＬ試料をＴＬＣプレートに正確に移すために、自動ＴＬＣサンプラー（ＡＴＳ４、ＣＡＭＡＧ、Ｍｕｔｔｅｎｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。プレートはそれぞれ、４ｍｍ幅のバンドに置いた２０試料を含有することができた。プレートは、バンドを乾燥させるために４０℃で１０分加熱した。ＴＬＣプレートは、ＡｃＮ、ＥｔＡｃ、１−プロパノール、Ｈ２Ｏ（８５：２０：５０：４０）中で溶出し、その後、プレートは、過剰溶媒を除去するために１６７℃で５分加熱した。プレートは、ひっくり返して（つまり、試料を適用した場所の近くの縁でプレートを保持することによって）、５％Ｈ２ＳＯ４：ＥｔＯＨ（９５：５）中に浸漬した。ディッピング溶液は毎日作製した。プレートは、スポットを視覚化するために１６７℃で３分加熱した。スポット強度の測定は、ＴＬＣスキャナー（ＣＡＭＡＧ ｓｃａｎｎｅｒ ３、Ｍｕｔｔｅｎｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）においてスキャンすることによって行い、定量化は、すべてのマルトースおよびイソマルトース濃度対スポット強度に基づいて標準曲線を引くことによって行った。マルトースおよびイソマルトース濃度の両方は、スポット強度対濃度が２つの化合物について等しいという事実を使用して、この曲線から計算した。
図１０は、異なる濃度のグルコース、マルトース、およびイソマルトースを含有する標準物質ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ産物（ＡｎＧＡ；Ｄｉａｚｙｍｅ（登録商標）×４、Ｄａｎｉｓｃｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ産物（ＴｒＧＡ Ｄｉａｚｙｍｅ ＴＲ８ Ｄａｎｉｓｃｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と共にインキュベートしたグルコース由来の反応産物を含有する試料を有するＴＬＣプレートの例を示す。ブラインドは、酵素を伴わないでインキュベートしたグルコースとする。
イソマルトース合成活性（ＩＳ活性）は、以下の式に従ってＴＬＣによって決定したイソマルトース濃度に基づいて計算する。
Figure 0005827227
熱安定性アッセイ２
本実験において使用される条件下での酵素の熱安定性の基準として、ＧＡＵ活性は、１２０分間、６３℃で、１５％グルコース、０．１Ｍクエン酸バッファー、ｐＨ５．４中で酵素のインキュベーションの前およびその後に上記のアッセイに従って決定した。データは、失われた活性％として示す。
発酵によるＧＡの生産
４００×微量元素溶液：１０００ｍｌの脱塩水：無水（Ａｎｈｕｄｒｏｕｓ）クエン酸（１７５ｇ）、ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（２００ｇ）、ＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１６ｇ）、ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ（３．２ｇ）、ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（１．４ｇ）、Ｈ３ＢＯ３（０．８ｇ）中で希釈する。構成成分をすべて溶解するのにこれを酸性化することは有用であるかもしれない。溶液は、ろ過し、殺菌した。
ＬＤ培地：約８００ｍｌの脱塩水：カザミノ酸（９ｇ）、ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（４．５ｇ）、ＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ピペラジン−１，４−ビス（プロパンスルホン酸（ＰＩＰＰＳ）バッファー（３３ｇ）、４００×Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ微量元素（２．５ｍｌ）を添加し、ＮａＯＨ ４Ｎを用いてｐＨを５．５に調整する。最終的な容量を９２０ｍｌに調整する。
２×Ａｍｄ Ｓベース寒天（ａｇｅｒ）（１リットル）：ＫＨ２ＰＯ４（３０ｇ）、１Ｍアセトアミド（２０ｍｌ）、１Ｍ ＣｓＣｌ（２０ｍｌ）、２０％ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（６ｍｌ）、２０％ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（６ｍｌ）、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ胞子元素４００×（２ｍｌ）、５０％グルコース．Ｈ２Ｏ（８０ｍｌ）を混合する。４Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを４．５に調整する。１Ｌまで作製し、ろ過殺菌する。４℃で保存する。
初期培養：株は、ＡｍｄＳ−ベース寒天プレート上で成長させた。寒天プレートを生産するために、最少培地寒天を煮沸し、約５０℃まで冷却した後、それを２×ＡｍｄＳベースを用いて１：１に希釈し、ペトリ皿上に注いだ。胞子形成（約６〜７日）後に、プレートは、２ｍｌ食塩水０．０１５％Ｔｗｅｅｎ ８０を用いて掻き取った。約１ｍｌを、５００〜６００μｌ ３５％グリセロールを含有するグリセロールチューブに添加し、−８０℃で保存した。前培養発酵は、この胞子懸濁液から直接始めた。
前培養：培地は、ＬＤ培地に２．５％グルコースを添加することによって作製し、これを続いて１Ｌまで作製する。バイオマスを生産するために、５０μｌ胞子懸濁液を１００ｍｌ培地に添加する（５００ｍｌ振盪フラスコ中で殺菌）。フラスコは、２日間、１８０ｒｐｍで、３０℃で回転振盪機上でインキュベートし、次いで、１０ｍｌ懸濁液を、新しい振盪フラスコに接種するために使用し、これを、１日間、同様の条件下でインキュベートする。このフラスコの内容物は、発酵槽に接種するために使用する。
本培養：１Ｌの培地を作製するために、４０ｍｌグルコース／ソホロースミックス（Ｄａｎｉｓｃｏ、Ｊａｍｓａ、Ｆｉｎｌａｎｄ）をＬＤ培地に添加し、１Ｌまで作製した。４Ｌの培地を含有する６Ｌ発酵槽に前培養物を接種し、ＣＥＲ／ＯＵＲ（炭酸ガス排出率速度／酸素摂取速度）が下降し始めるまで、３４℃で約１６時間、ｐＨ３．５で成長させた。次いで、温度を２８℃まで低下させ、ｐＨを４．０まで上げ、発酵を約８０時間継続した。
発酵の実質的な程度（ＲＤＦ）の測定を用いる醸造分析
分析は、下記手順を使用して実行した。７０ｇ粉砕ピルスナー麦芽（Ｗｅｙｅｒｍａｎｎ、Ｂａｍｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を２６６ｍｌ水を用いてマッシュにした。（麦芽および水を混合する）際のマッシング後の温度サイクルは、６３．９℃で１４０分間、１０分間にわたって７３．９℃まで増加、７３．９℃で５分間とした。マッシングの終了時に、マッシュは冷却し、３５０ｇまで作製し、ろ過した。ろ液容量を３０分間後に測定した。ろ過された麦芽汁は、比重測定のためにサンプリングし、次いで、あらゆる残りのグルコアミラーゼ活性を破壊するために水槽中で１０分間、９９℃まで加熱した。熱処理は、２００ｍｌの麦芽汁当たり１．５ｇの損失をもたらす。麦芽汁は、少なくとも８８時間、多くとも１２０時間、酵母添加後に、５００ｍｌ三角フラスコ中で１８℃および１００ｒｐｍで発酵させた。比重は、発酵体に基づいて決定した。発酵の実質的な程度（ＲＤＦ）の値は、下記の式に従って計算した。
Figure 0005827227
 ＲＥ＝実質的な抽出物＝（０．１８０８×°Ｐｉｎｉｔｉａｌ）＋（０．８１９２×°Ｐｆｉｎａｌ）、°Ｐｉｎｉｔｉａｌは、発酵前の標準化麦芽汁の比重であり、°Ｐｆｉｎａｌは、発酵麦芽汁の比重であり、ｄｅｇｒｅｅ ｐｌａｔｏで表現される。
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）における発現のための、ｐＴＴＴベクターにおけるＴｒＧＡ部位評価ライブラリー（ＳＥＬ）のコンストラクション
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｃＤＮＡ配列（配列番号４）は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ組換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を介してｐＤＯＮＲ（商標）２０１の中にクローニングし、エントリーベクターｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡがもたらされた（図２）。ｃＤＮＡ配列（配列番号４）は、ＴｒＧＡシグナルペプチド、プロ配列、ならびに触媒ドメイン、リンカー領域、およびデンプン結合ドメインを含む成熟タンパク質をコードする（配列番号１）。配列番号４および配列番号１を図１Ｂおよび１Ｂ中に示す。図１Ｃは、前駆体および成熟タンパク質ＴｒＧＡドメインを示す。
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）においてＴｒＧＡタンパク質を発現させるために、ＴｒＧＡコード配列（配列番号４）は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え反応を介してＧａｔｅｗａｙ適合性目的ベクターｐＴＴＴ−Ｄｅｓｔ（図３）の中にクローニングした。発現ベクターは、興味のある遺伝子の強力な誘発性の発現を可能にするＴ．ｒｅｅｓｅｉ ｃｂｈＩ由来のプロモーター領域およびターミネーター領域を含有した。ベクターはまた、唯一の窒素源としてのアセトアミド上での形質転換体の成長を可能にするＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ選択マーカーをも含有した。発現ベクターはまた、菌類の細胞における非染色体性のプラスミドの維持を可能にするＴ．ｒｅｅｓｅｉテロメア領域をも含有した。目的ｐＴＴＴ−Ｄｅｓｔプラスミド上で、ｃｂｈＩのプロモーター領域およびターミネーター領域は、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子、ＣｍＲおよび致死Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子、ｃｃｄＢによって分離され、バクテリオファージラムダベースの特異的組換え部位ａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２が側面に位置した。この配置は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え反応を介して右向きのｃｂｈＩ調節エレメントの制御下でＴｒＧＡ遺伝子を含有する組換え体の直接的な選択を可能にした。最終的な発現ベクターｐＴＴＴ−ＴｒＧＡを図４中に示す。
ＳＥＬは、鋳型としてｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡエントリーベクター（図２）および表２中に列挙するプライマーを使用して構築した。突然変異誘発実験において使用するプライマーはすべて、突然変異されるように設計したＴｒＧＡ配列（配列番号１）のコドンとアライメントする位置にトリプレットＮＮＳ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧおよびＳ＝ＣまたはＧ）を含有し、あらかじめ選択した位置でのヌクレオチドのランダムな組み込みを可能にした。それぞれのＳＥＬライブラリーのコンストラクションは、ｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡエントリーベクターに対して２つの独立したＰＣＲ増幅を用いて始めた。一方はＧａｔｅｗａｙ Ｆ（ｐＤＯＮＲ２０１−ＦＷ）および特異的突然変異誘発プライマーＲ（表２）を使用ならびに他方−ＧａｔｅｗａｙプライマーＲ（ｐＤＯＮＲ２０１−ＲＶ）および特異的突然変異誘発プライマーＦ（表２）。高忠実度ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ ＯＹ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）は、０．２μＭプライマーを含むＰＣＲ増幅反応において使用した。反応は、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓによって提供されるプロトコールに従って２５サイクル実行した。得られたＰＣＲ断片の１μｌ一定分量を、Ｇａｔｅｗａｙ ＦＷプライマーおよびＧａｔｅｗａｙ ＲＶプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に、続く融合ＰＣＲ反応のために鋳型として使用した。このＰＣＲ増幅は、２２サイクル後に、特異的なコドン位置でランダムに突然変異した完全長線形ＴｒＧＡ ＤＮＡ断片の集団を生産した。断片は、両端に、Ｇａｔｅｗａｙ特異的ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２組換え部位が側面に位置した。ＤＮＡ断片は、ＣＨＡＲＧＥＳＷＩＴＣＨ（登録商標）ＰＣＲクリーンアップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を用いて精製し、次いで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給されるプロトコールに従って、ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（商標）ＩＩ酵素ミックスを使用して、１００ｎｇのｐＴＴＴ−目的ベクター（図３）と組換えた。生成された組換え産物は、供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５αの中に形質転換した。所望の位置に突然変異を有する最終的な発現コンストラクトｐＴＴＴ−ＴｒＧＡは、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有する２×ＹＴ寒天プレート（１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ））上に細菌を平板培養することによって選択した。
それぞれのライブラリー由来の９６の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有する２００μＬ ２×ＹＴ培地を含有するＭＴＰにおいて３７℃で２４時間成長させた。培養物は、特異的な突然変異が導入された領域を包含するＰＣＲ断片を増幅するために直接使用した。得られた特異的なＰＣＲ産物は、ＡＢＩ３１００配列分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配列決定した。それぞれのライブラリーは、最終的な発現ベクター中に１５〜１９の異なるＴｒＧＡ変異体を含有した。これらの変異体は、下記に記載されるように、個々にＴ．ｒｅｅｓｅｉの中に形質転換した。ライブラリーは、１から１８２まで番号をつけ、ランダムに突然変異したＴｒＧＡ配列における特異的なアミノ酸残基に参照符をつける。
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トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の中へのＴｒＧＡ ＳＥＬの形質転換
ＳＥＬは、ＰＥＧプロトプラスト法を使用して、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉの中に形質転換した。配列分析によって確認したＳＥＬのＥ．ｃｏｌｉクローンは、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有する１２００μｌの２×ＹＴ培地を含有する深いウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ａｒｔ．Ｎｏ．７８０２７１）中で３７℃で一晩成長させた。プラスミドＤＮＡは、ＣＨＥＭＡＧＩＣ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍａｇｅｎ−Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＡＧ、Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、培養物から単離し、以下の修飾を有するＰＥＧプロトプラスト法［Penttilae et al. (1987) Gene 61:155-164］を使用して、４つの遺伝子欠失（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２、つまり「クワッド欠失」；米国特許第５，８４７，２７６号、ＷＯ９２／０６１８４、およびＷＯ０５／００１０３６を参照されたい）を有するＲＬ−Ｐ３７に由来するＴ．ｒｅｅｓｅｉ宿主株に個々に形質転換した。
プロトプラスト調製については、胞子は、１５０ｒｐｍで振盪させながら、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ最少培地（ＭＭ）（２０ｇ／Ｌグルコース、１５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．５、５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｌの１０００×Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ微量元素溶液｛５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、３．７ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ｝中で２４℃で１６〜２４時間成長させた。発芽胞子は、遠心分離によって採取し、菌類の細胞壁を溶解するために１５ｍｇ／ｍｌのβ−Ｄ−グルカナーゼ−Ｇ（Ｉｎｔｅｒｓｐｅｘ−Ａｒｔ．Ｎｏ．０４３９−１）溶液を用いて処理した。プロトプラストのさらなる調製は、Penttilae et al. （1987 前掲）によって記載されるように、標準の方法によって実行した。
形質転換方法は、１０分の１にスケールダウンした。一般に、２５μｌの総容量で６００ｎｇまでのＤＮＡおよび１〜５×１０５プロトプラストを含有する形質転換混合物は、２００ｍｌの２５％ＰＥＧ溶液を用いて処理し、２容量の１．２Ｍソルビトール溶液を用いて希釈し、アセトアミドを有する３％選択的上層アガロースＭＭと混合し（上記に述べられるものと同じ最少培地であるが、（ＮＨ４）２ＳＯ４を２０ｍＭアセトアミドと置換した）、２４ウェルマイクロタイタープレートまたは４８ウェルに分割された２０×２０ｃｍ Ｑ−ｔｒａｙ中のアセトアミドを有する２％選択的アガロース上に注いだ。プレートは、５〜８日間２８℃でインキュベートした。それぞれのウェル上で再生成された形質転換体の全集団由来の胞子は、０．８５％ＮａＣｌ、０．０１５％Ｔｗｅｅｎ ８０の溶液を使用して、プレートから採取した。胞子懸濁液は、９６ウェルＭＴＰにおいて発酵に接種するために使用した。２４ウェルＭＴＰの場合には、選択的アセトアミドＭＭを有する新しい２４ウェルＭＴＰ上でのさらなる平板培養工程を、胞子数を豊富にするために導入した。
ＭＴＰ方式における、ＴｒＧＡ変異体を発現するＴ．ｒｅｅｓｅｉ形質転換体の発酵
形質転換体（ｔｒａｎｆｏｒｍａｎｔｓ）を発酵させ、発現された変異体ＴｒＧＡタンパク質を含有する上清を、様々な特性について試験した。手短かに言えば、それぞれのウェル中に２００μｌのＬＤ−ＧＳＭ培地［５．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／Ｌ １，４−ピペラジンビス（プロパンスルホン酸）、ｐＨ５．５、９．０ｇ／Ｌ カザミノ酸、１．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｍｌ／Ｌの１０００×Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ微量元素、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌソホロース］を含有する９６ウェルろ板（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ａｒｔ．Ｎｏ．３５０５）に、ＴｒＧＡ変異体を発現するＴ．ｒｅｅｓｅｉ形質転換体の胞子懸濁液を４通り接種した（ウェル当たり１０４を超える胞子）。プレートは、６日間、２３０ｒｐｍで振盪させながら、８０％の湿度で２８℃でインキュベートした。培養上清は、真空ろ過によって採取した。上清は、改善された特性を有する変異体をスクリーニングするために様々なアッセイにおいて使用した。
ＧＡ生産形質転換体由来の全ブロス試料の調製
ＴｒＧＡ生産形質転換体は、３０ｍｌのＰｒｏＦｌｏ培地を含有する２５０ｍｌ振盪フラスコにおいて最初にあらかじめ成長させた。Ｐｒｏｆｌｏ培地は、３０ｇ／Ｌ α−ラクトース、６．５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、上記に述べられるような１ｍｌ／Ｌ １０００×微量元素食塩水、２ｍｌ／Ｌ １０％Ｔｗｅｅｎ ８０、２２．５ｇ／Ｌ ＰｒｏＦｌｏ綿実粉（Ｔｒａｄｅｒｓ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）、０．７２ｇ／Ｌ ＣａＣＯ３を含有した。２８℃および１４０ｒｐｍでの２日間の成長後に、１０％のＰｒｏｆｌｏ培養物を、３０ｍｌのラクトース限定培地を含有する２５０ｍｌ振盪フラスコの中に移した。ラクトース限定培地の組成は、以下のとおりとした。５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／Ｌ １，４−ピペラジンビス（プロパンスルホン酸）バッファー、ｐＨ５．５、９ｇ／Ｌ カザミノ酸、４．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍｌ／Ｌ Ｍａｚｕ ＤＦ６０−Ｐ消泡剤（Ｍａｚｕｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＩＬ）、１ｍｌ／Ｌの１０００×微量元素溶液。４０ｍｌ／Ｌの４０％（ｗ／ｖ）ラクトース溶液を、殺菌後に培地に添加した。ラクトース限定培地を有する振盪フラスコは、４〜５日間、２８℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。
菌糸は、遠心分離によって培養試料から除去し、上清は、アッセイおよび方法の部において上記に記載されるように、総タンパク質含有量（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２５）およびＧＡ活性について分析した。
全ブロス試料のタンパク質プロファイルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定した。培養上清の試料は、還元剤を有する等容量の２×試料ローディングバッファーと混合し、ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ上で分離した。ポリペプチドバンドは、ＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＳＤＳゲル中で視覚化した。
変異体の熱安定性
熱安定性は、上記のアッセイ（「熱安定性アッセイ２」）に従って測定した。
記載される条件下の親分子は、８７．２％の残存活性を有し、表３は、変異体についての残存活性を示し、これらは、大規模での発酵およびさらなる分析のために最初のスクリーニングから選択した。使用する材料は、振盪フラスコ由来の粗製発酵ブロスとした。残存活性は、１５％グルコースを含有する０．１Ｍクエン酸バッファーｐＨ５．４における６３℃での１２０分のインキュベーションの前およびその後のＧＡＵ活性に基づいて計算した。
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イソマルトース合成およびデンプン加水分解およびその比の測定
変異体は、上記のアッセイ：「デンプン加水分解活性」ならびに「ＴＬＣによるマルトースおよびイソマルトース合成の測定」に従って試験した。ＩＳ／ＳＨ比は、記載されるこれらの分析の結果から計算した。表４は、大規模での発酵およびさらなる分析のために選択した変異体についてのデータを要約する。使用する材料は、振盪フラスコ由来の粗製発酵ブロスとした。
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発酵の実質的な程度（ＲＤＦ）の測定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｉｔｏｎ）を用いる醸造分析
表３および４中に示す変異体はすべて、発酵槽において成長させ、ＧＡ酵素は、収集し、精製した（「ＴｒＧＡ変異体の精製」の下で上記に記載される）。精製酵素は、実施例６において上記に記載されるように、ＩＳ／ＳＨ比について再分析し、熱安定性は、実施例５において記載されるように測定した。ＲＤＦ値の測定を伴う醸造分析は、「発酵の実質的な程度（ＲＤＦ）の測定を用いる醸造分析」の下で上記に記載されるように、ＩＳ／ＳＨ比および熱安定性の最良の組み合わせを示した４つの変異体（Ｂｒｅｗ１１、Ｂｒｅｗ１、Ｖａｒ１６、およびＶａｒ１３）に対して実行した。ＲＤＦ値を表５中に列挙する。
Figure 0005827227
コンビナトリアル変異体のコンストラクションおよび特徴づけ
データに基づいて、単一の置換を有する変異体の選択したセットをさらに特徴づけた。これらの変異体は、位置：４３、４４、６１、７３、２９４、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９、および５６３に単一の置換を有する。これらの部位の中で、４３、４４、および２９４は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおける前のスクリーニング実験において同定された。参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ０８／０４５４８９を参照されたい。変異体を、大規模発酵から精製し、熱安定性および比活性のＰＩを決定した。特に、比活性は、ＤＰ７、コーンスターチ、および液化液を含む様々な基質を使用して決定した。結果を表６中に示す。
Figure 0005827227
さらに、コンビナトリアル変異体は、４３、４４、６１、７３、２９４、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９、および５６３の中の置換を用いてＰＣＲ法を使用して構築した。手短かに言えば、コンビナトリアル変異体は、バックボーンとしてプラスミドｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡ（図２）を使用することによって構築した。コンビナトリアル変異体を構築するための方法論は、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に基づく。コンビナトリアル変異体を生成するために使用されるプライマーを、表２および７中に示す。以下の合成コンストラクトアプローチは、すべてのコンビナトリアル変異体のコンストラクションのために選んだ。
ＣＴＣＴＣＴ［ＸｂａＩ部位］［ＭＦ］ＧＡＧＡＧＧＧＧ［ａｔｔＢ１］［ＧＡＰコンビナトリアル変異体］［ａｔｔＢ２部位］ＣＣＣＣＡＧＡＧ［ＭＲ］［ＨｉｎｄＩＩＩ］ＡＧＡＧＡＧ
このコンストラクトは、制限酵素Ｘｂａ−ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて処理した。消化断片は、Ｘｂａ−Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＣ（ｐＵＣ１９由来のベクター）の中にライゲーションした。ライゲーション混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足した選択的な寒天上に平板培養した。プレートは、３７℃で１６時間インキュベートした。選択的プレートからコロニーを単離し、選択的液体培地の中に接種した。３７℃および２５０ｒｐｍでのインキュベーションの１６時間後に、プラスミドは、標準のプラスミド単離キットを使用して単離し、ｐＤＯＮＲ ２．２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と組み合わせ、特異的なコンビナトリアル変異体を有するＧａｔｅｗａｙエントリーベクターを生成した。反応混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍａｘ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の中に形質転換し、選択的寒天（５０μｇカナマイシン／ｍｌを補足した２×ＴＹ）上で平板培養した。３７℃での一晩のインキュベーション後に、単一コロニーを配列分析のために選び取った（ＢａｓｅＣｌｅａｒ Ｂ．Ｖ．、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。コンビナトリアル変異体は、ｐＴｒｅｘＴｒＴｅｌ中にサブクローニングし、ＷＯ０６／０６００６２中に記載されるようにＴ．ｒｅｅｓｅｉ宿主株において発現させた。
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変異体を、大規模発酵、つまり１００ｍｌまたは５００ｍｌの発酵から精製し、熱安定性（Ｔｓ）および比活性のＰＩを決定した。特に、比活性は、ＤＰ２、ＤＰ３、ＤＰ４、ＤＰ５、ＤＰ６、ＤＰ７、コーンスターチ（ＣＳ）、および液化液（Ｌｉｑ）を含む様々な基質を使用して決定した。ＰＩを表８中に示す。表８中の「Ｎ／Ｄ」は、「行われず」ということを表す。
Figure 0005827227
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ＴｒＧＡおよびＡａＧＡの間の相同性
参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）８９〜９３ページにおける実施例１１において同定されたＴｒＧＡの結晶構造を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ ＧＡ（ＡａＧＡ）の先に同定された結晶構造上に重ね合わせた。ＡａＧＡ結晶構造は、タンパク質データベース（ＰＤＢ）から得、結晶化されたＡａＧＡの形態は、触媒ドメインのみを含有する形態であった（ＰＤＢエントリーナンバー：１ＧＬＭ）。完全な３つの領域すべてを有するＴｒＧＡの構造は、１．８オングストロームの解像度まで本明細書において決定した［参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページにおける表２０および参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）８９〜９３ページにおける実施例１１を参照されたい］。座標を使用して［参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ２００９／０６７２１８（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）９４〜２１６ページ中の表２０を参照されたい］、構造を、以前に決定されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ株Ｘ１００由来の触媒ドメインの座標とアライメントした［Aleshin et al., J.Mol.Biol.238: 575-591 (1994)］。図６〜７において見られるように、触媒ドメインの構造は、非常に密接にオーバーラップし、構造的な重ね合わせに基づく等価な残基の同定を可能にした。
この分析に基づいて、ＴｒＧＡにおいて突然変異させることができ、熱安定性および／または比活性の増加をもたらすことができる部位を同定した。その点で、部位は、活性部位の１０８、１２４、１７５、および３１６を含む。特異的なペアの変異体Ｙ４７Ｗ／Ｙ３１５ＦおよびＹ４７Ｆ／Ｙ３１５Ｗもまた同定した。同定された他の部位は、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｒ１２２、Ｒ１２５、Ｖ１８１、Ｅ２４２、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｎ３１７、Ｒ４０８、およびＮ４０９であった。高度な構造的な相同性のために、ＴｒＧＡにおける部位に見つけられる有益な変異体が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉおよび他の相同のグルコアミラーゼにおいて同様の結果を有するであろうということが期待される。
ＴｒＧＡリンカー、残基４５４〜４９０は、２つのジスルフィド架橋、残基２２２および４５３の間のものならびに残基４９１および５８７の間のものの間の領域をわたるセグメントとして定義される。リンカー中の９つの残基は、プロリンである。結晶構造から、リンカーは、基質結合表面の近くの表面上のリシン４７７残基の後に急転回が後続する幅広い弓形の分子の後部から伸びる。リンカーは、Ｔｙｒ４５２、Ｐｒｏ４６５、Ｐｈｅ４７０、Ｇｌｎ４７４、Ｐｒｏ４７５、Ｌｙｓ４７７、Ｖａｌ４８０、およびＴｙｒ４８６の側鎖の、触媒ドメインの表面上の領域に対する相互作用によって固定されるランダムコイルとして伸びる。
デンプン結合ドメインは、２つのねじれたベータシートのベータ−サンドイッチから構成され、一端でＣｙｓ４９１およびＣｙｓ５８７の間のジスルフィド架橋によってつながれ、他方の端に、長いループによってつながれた、デンプンに対する結合部位を含む一連のループを有する。ＴｒＧＡ ＳＢＤの構造は、ＮＭＲによって決定されたＡｎＧＡ ＳＢＤの平均された構造［Sorimachi et al., Structure 5: 647-661(1997)］およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のベータアミラーゼのＳＢＤ［Mikami, B.et al., Biochemistry 38: 7050-61(1999)］にかなり類似している。図９は、ＳＢＤを含むＡｎＧＡおよびＴｒＧＡの結晶構造のアライメントを示す。これらのＳＢＤの一方または両方とアライメントした場合、１つのループは、高度に可変的であるかのように突き出ており、残基５３７〜５４３（Ａ．ｎｉｇｅｒでは、ループは５５４〜５６０であり、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓでは、ループは４６２〜４６５である）に対応する。ベータ−シクロデキストリンのＮＭＲ構造において、デンプンアナログは、ＡｎＧＡのＳＢＤと複合体を形成し［Sorimachi et al. (1997) 前掲］、ループは、シクロデキストリンへの結合に際して実質的に変化する。したがって、このループは、「可動性ループ」と呼ばれる。この可動性ループは、「結合部位２」の一部を形成する（ＴｒＧＡにおけるこの結合部位については図９を参照されたい）。他の炭水化物結合タンパク質と類似性を共有する主要な部位である第２の結合部位もまた、ＡｎＧＡにおいて同定した（結合部位１）。全体として、これらのＳＢＤの結合部位１における残基およびさらに側面の立体配座の保存は、非常に高度である。図は、デンプンに結合する役目をするＳＢＤおよび触媒ドメインの間のこれらの結合部位における相互作用を実証する。
まとめると、触媒ドメインとのリンカーおよびＳＢＤの間の相互作用について共通のパターンがあるように見える。相互作用は、隣りのドメインの表面エリアと相互作用する、アンカー側鎖の形態をしている。一般に、アンカー残基は、リンカーセグメント上に見つけられる。ＣＤおよびＳＢＤの間の相互作用の場合には、アンカー残基は、ＣＤに由来する残基Ｉｌｅ４３およびＰｈｅ２９またはＳＢＤに由来する残基５９２の場合におけるように、どちらかのドメインから提供され得る。
ＴｒＧＡへのアカルボース結合のモデル
阻害剤アカルボースと複合体を形成したＴｒＧＡの結晶構造を決定した。複合体の結晶は、あらかじめ成長させた自然のＴｒＧＡ結晶をアカルボース中に浸すことによって得た。３日間浸した後に、結晶は、シールガラス毛細管中にマウントし、Ｘ線回折を、２．０Åの解像度まで、Ｒｉｇａｋｕ Ｒａｘｉｓ ＩＶ＋＋イメージプレート検出器を用いて収集した。座標を、差電子密度マップにフィットさせた。モデルは、合計４１２７６の反射について、０．２０１のＲフリーと共に０．１５４のＲ因子まで精密化し、２７〜２．０Åの解像度で収集されたデータをすべて表した。結果として生じる精密化した構造のモデルを図９中に示す。
ＳＢＤの存在が、不溶性デンプンの加水分解に影響を及ぼすという知識に基づいて、より大きなデンプン分子とのＳＢＤの相互作用があるはずであるということになった。したがって、ＴｒＧＡの構造を、（１）ＡａＧＡのアカルボース結合ＣＤおよび（２）ベータ−シクロデキストリンと複合体を形成したＡ．ｎｉｇｅｒ由来のＳＢＤの知られている構造と比較した。これは、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ ＣＤに結合したアカルボースの位置によって示されるように、結合部位２で結合したベータ−シクロデキストリンが基質位置に近かったことを示した。したがって、ＡａＧＡの構造モデル由来のアカルボースの座標（ｐｄｂ ｅｎｔｙ１ＧＡＩ、Aleshin, et al.1994 前掲）を、ＴｒＧＡ活性部位の中にアライメントした。さらに、シクロデキストリンに結合したＡｎＧＡ ＳＢＤ構造（ｐｄｂ ｅｎｔｒｙ １ＡＣ０：Sorimachi, et al 1997 前掲）を、アライメントした。これから、モデルを、ＴｒＧＡへのアカルボース結合について作製した（図９を参照されたい）。モデルは、ＳＢＤが、破壊されたデンプンの近くにＴｒＧＡ ＣＤを配置し、また、加水分解後に活性部位から産物を放出しながら、酵素が基質から拡散するのを予防するであろうということを示した。ＴｒＧＡのＳＢＤは、部位１に沿ってデンプンに結合し、局在化に好都合であり、破壊された断片が、触媒部位（触媒ドメインについての活性側面）に向いている自由な末端内の部位２に結合することができるであろう。このモデルは、酵素の提唱される機能がＳＢＤおよびリンカーの構造によってどのように提供されるかを示す。ＣＤ、リンカー、およびＳＢＤの間の特異的な相互作用に関連するアミノ酸側鎖は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＧＡについて特異的であるが、他のグルコアミラーゼでは、相補的な配列の変化は、類似する全体的な相互作用およびドメインの並置を可能にするであろう。
このモデルに基づいて、安定性および／または比活性の増加をもたらすために、ＴｒＧＡ ＳＢＤにおいて置換を成すことができる部位を同定した。したがって、結合部位１の一部である２つのループは、より大きなデンプン分子への結合を増加させるまたは減少させるための改変のための有望な候補である。これらは、ループ１（ａａ５６０〜５７０）およびループ２（ａａ５２３〜５２７）である。アミノ酸５２５および５７２の２つのＴｒｐ（トリプトファン）残基が、おそらく直接デンプン結合に関与するので、それらは、変化にそれほど有効ではなかった。しかしながら、５１６〜５１８を含む基本的な残基は、基本的な残基５５８〜５６２のように、有効となるであろう。残基５７０〜５７８由来のループもまた、改変に好適な候補である。残基５３４〜５４１は、ＣＤ上の触媒部位と相互作用する結合部位２の一部である。したがって、これらは、比活性を増加させるまたは減少させるかもしれない改変に好適な候補であるかもしれない。
ＴｒＧＡ ＳＢＤの高度な構造的な相同性のために、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＧＡにおける部位に見つけられる有益な変異体が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉおよび他の相同のグルコアミラーゼにおいて同様の結果を有するであろうということが期待される。したがって、ＴｒＧＡ ＳＢＤの構造は、親グルコアミラーゼと比較して改変された特性について、この酵素および関連する酵素を遺伝子操作する根拠を提供する。改変された特性は、デンプン供給材料をベースとする燃料の生成におけるプロセスに有利であるかもしれない。
配列
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本開示の記載される方法およびシステムの様々な変更および変形は、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者らに明らかになるであろう。本開示は、特定の代表的な実施形態に関して記載されたが、主張される主題は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されたい。実際に、当業者らに明白な、本開示を実行するために記載されるモードの様々な変更は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。

Claims (14)

  1. 以下のアミノ酸置換を含み：
    ａ． Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒ；または
    ｂ． Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ、
    該位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置に対応し、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）と比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を示す、グルコアミラーゼ変異体。
  2. 配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、または３９０のデンプン結合ドメインに対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する、および／または、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９の触媒ドメインに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する、請求項１に記載のグルコアミラーゼ変異体。
  3. 配列番号２に対して少なくとも９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、請求項１〜２のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
  4. 配列番号１０９８を含むか、または配列番号１０９８から成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
  5. 配列番号１０９９を含むか、または配列番号１０９９から成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
  6. 配列番号２を有するＴｒＧＡと比較して、増強した実質的な程度の発酵を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
  8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、または請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体を発現することができる、ベクター。
  9. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体を発現することができる細胞、たとえば、請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞、または請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体をコードする核酸を染色体の中に安定して統合している宿主細胞。
  10. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体を発現させる方法であって、請求項９に記載の細胞または宿主細胞を得ることと、該細胞または宿主細胞からグルコアミラーゼ変異体を発現させることとを含み、グルコアミラーゼ変異体を精製することを含んでもよい、方法。
  11. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体の少なくとも１つを含み、アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフコシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、およびさらなるグルコアミラーゼの中から選択される少なくとも１つのさらなる酵素を含んでもよい、酵素組成物。
  12. グルコアミラーゼ変異体の、配列番号２を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）と比較して、デンプンの加水分解中のイソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の比（ＩＳ／ＳＨ比）を低下させるための使用であって、グルコアミラーゼ変異体が請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体である、使用。
  13. 醸造用の麦芽汁を生産するための方法であって、グリストからマッシュを形成することと、請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体または請求項１１に記載の酵素組成物とマッシュを接触させることとを含む、方法。
  14. ａ．マッシュを調製することと、
    ｂ．マッシュをろ過して、麦芽汁を得ることと、
    ｃ．麦芽汁を発酵させて、ビールを得ることと
    を含み、請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼ変異体または請求項１１に記載の酵素組成物は、工程（ａ）および／または工程（ｂ）および／または工程（ｃ）に添加され、所望により、ビールは、低温殺菌工程にかけられる、ビールの生産のための方法。
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