ES2294846T5 - Variantes de glucoamilasa. - Google Patents

Abstract

Variante de una glucoamilasa progenitora que tiene mejor termoestabilidad con respecto a la glucoamilasa progenitora comprendiendo una o más mutaciones en la(s) siguiente(s) posición(es) en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2 E408R+A425T+S465P+T494A, E408R+S386N, T2Q+Al 1 P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+0406N+L410R. A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+Y402F+N427S+ S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, T2R+S386R+A393R, Y402F, V59A+A393R+T490A, y una extensión del N-terminal que consiste en PLASD Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H, y/o en una posición correspondiente en una glucoamilasa homóloga que exhibe un grado de identidad de al menos un 60% con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NO: 2.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a variantes de glucoamilasa nuevas (mutantes) de AMG progenitor, en particular con termoestabilidad mejorada adecuada para, p. ej., la conversión de almidón, p. ej., para producir glucosa de almidón. Más específicamente, la presente invención se refiere a variantes de enzima de glucoamilasa y el uso de tales variantes de enzimas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La glucoamilasa (1,4--D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores de almidón o moléculas de oligo y polisacáridos relacionadas. Las glucoamilasas son producidas por diferentes hongos filamentosos y levaduras, siendo aquellos de Aspergillus los más importantes comercialmente.

[0003] Comercialmente, la enzima glucoamilasa se utiliza para convertir almidón de maíz que ya está parcialmente hidrolizado por una -amilasa a glucosa. La glucosa es posteriormente convertida por glucosa isomerasa a una mezcla compuesta casi igualmente de glucosa y fructosa. Esta mezcla, o la mezcla adicional enriquecida con fructosa, es el jarabe de maíz rico en fructosa comúnmente usado comercializado en todas partes del mundo. Este jarabe es el producto que se produce con mayor tonelaje por un proceso enzimático. Las tres enzimas implicadas en la conversión del almidón en fructosa se encuentran entre las enzimas industriales producidas más importantes.

[0004] Uno de los principales problemas que existen con el uso comercial de la glucoamilasa en la producción de jarabe de maíz rico en fructosa es la termoestabilidad relativamente baja de la glucoamilasa. La glucoamilasa no es térmicamente tan estable como la -amilasa o glucosa isomerasa y es más activa y estable a un pH inferior que la amilasa o la glucosa isomerasa. Por consiguiente, debe ser usada en un recipiente separado a una temperatura y pH inferiores.

[0005] La glucoamilasa de Aspergillus niger tiene un dominio catalítico (aa 1-440) y de enlace de almidón (aa 509-616) separado por un enlazador largo y altamente O-glicosilado (Svensson et al. (1983), Carlsberg Res. Commun. 48, 529544, 1983 y (1986), Eur. J. Biochem. 154, 497-502). El dominio catalítico (aa 1-471) de glucoamilasa de A. awamori var. X100 adopta un pliegue ()6 donde seis segmentos del bucle  conservados conectan los cilindros externo e interno (Aleshin et al. (1992), J. Biol.Chem. 267, 19291-19298). Las estructuras cristalinas de la glucoamilasa en un complejo con 1-deoxinojirimicina (Harris et al. (1993), Biochemistry; 32, 1618-1626) y los inhibidores de pseudotetrasacáridos acarbosa y D-gluco-dihidroacarbosa (Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8319-8328) son además compatibles con los ácidos glutámicos 179 y 400 que actúan generalmente como ácido y base, respectivamente. El papel crucial de estos residuos durante la catálisis también ha sido estudiado usando ingeniería de proteínas (Sierks et al. (1990), Protein Engng. 3, 193-198 ; Frandsen et al. (1994), Biochemistry, 33, 13808-13816 ). Las interacciones glucoamilasa-carbohidratos en cuatro subsitios de enlace de residuos glicosílicos, -1, +1, +2 y +3 son destacadas en las estructuras de los complejos de glucoamilasa (Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8319-8328) y los residuos importantes para el enlace y la catálisis han sido extensamente investigados usando mutantes dirigidos acoplados con análisis cinético (Sierks et al. (1989), Protein Engng. 2, 621-625; Sierks et al. (1990), Protein Engng. 3, 193-198 ; Berland et al. (1995), Biochemistry, 34, 10153-10161 ; Frandsen et al. (1995), Biochemistry, 34, 10162-10169.

[0006] Se han descrito diferentes sustituciones en la glucoamilasa de A. niger para mejorar la termoestabilidad: i) sustitución de glicinas -helicoidales : G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499-505 ); ii) eliminación de los enlaces peptídicos Asp-X frágiles, D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582 ); prevención de desamidación en N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281 ); iv) ingeniería de enlace de bisulfuro adicional, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry; 35, 8698-8704; y v) introducción de residuos Pro en la posición A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204. Además Clark Ford presentó un ensayo el 17 de octubre de 1997, ENZYME ENGINEERING 14, Beijing/China Oct 12-17, 97 Número de resumen: Libro de resumen p. 0-61. El resumen sugiere mutaciones en las posiciones G137A, N20C/A27C, y S30P en una (no descrita) glucoamilasa de Aspergillus awamori para mejorar la termoestabilidad.

[0007] Se puede encotrar más información sobre la glucoamilasa en una página de internet (http: /www.public.iastate.edu/~pedro/glase/glase.html).

[0008] La página "Glucoamylase WWW page" (actualizada el 08/10/97) de Pedro M. Coutinho expone informaciones referente a las glucoamilasas, incluyendo glucoamilasas derivables de cepas de Aspergillus. Se relacionan las modificaciones químicas y dirigidas al sitio en la glucoamilasa de Aspergillus niger.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN

[0009] El objetivo de la presente invención es proveer variantes de glucoamilasa mejoradas con mejor termoestabilidad adecuada para el uso en, p.j., la fase de sacarificación en los procesos de conversión de almidón.

[0010] El término "una variante de glucoamilasa con mejor termoestabilidad" en el contexto de la presente invención significa una variante de glucoamilasa que tiene un T1/2 superior (duración media) que la glucoamilasa progenitora correspondiente. La determinación de T1/2 (Método I y Método II) es descrita abajo en el apartado de "Materiales y Métodos". La actividad específica es determinada como Kcat o AGU/mg (medido como se describe abajo en el apartado "Materiales y Métodos").

[0011] Los inventores de la presente invención han provisto un número de variantes mejoradas de una glucoamilasa progenitora con mejor termoestabilidad en comparación con la enzima progenitora correspondiente. La termoestabilidad mejorada es obtenida substituyendo posiciones seleccionadas en una glucoamilasa progenitora. Esto se describirá con detalle abajo.

Nomenclatura

[0012] En la presente descripción y reivindicaciones, se usan los códigos convencionales de una y tres letras para residuos aminoácidos. Para facilitar la referencia, las variantes de glucoamilasa de la invención son descritas usando la nomenclatura siguiente: Aminoácido(s) original(es):posición(es):aminoácido(s) sustituido(s)

[0013] Según esta nomenclatura, por ejemplo la sustitución de alanina por asparraguina en la posición 30 es mostrada como:

Ala30Asn o A30N una deleción de alanina en la misma posición es mostrada como:

Ala30* o A30* y la inserción de un residuo aminoácido adicional, tal como lisina, es mostrada como:

Ala30AlaLys o A30AK

[0014] Una deleción de una extensión consecutiva de residuos aminoácidos, tales como residuos aminoácidos 30-33, es indicada como (33)* 30 o (A30-N33).

[0015] Cuando una glucoamilasa específica contiene una "deleción" en comparación con otras glucoamilasas y se hace una inserción en esa posición esto es indicado como:

*36Asp o *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36 Las mutaciones múltiples son separadas por signos de más, es decir:

Ala30Asp + Glu34Ser ó A30N+E34S representando mutaciones en las posiciones 30 y 34 sustituyendo alanina y ácido glutámico por asparraguina y serina, respectivamente. Una mutación múltiple también puede ser separada como sigue, es decir, significando lo mismo que el signo de más:

Ala30Asp/Glu34Ser o A30N/E34S

[0016] Cuando uno o más residuos aminoácidos alternativos pueden ser insertados en una posición esto es indicado como

A30N,E o A30N/E, o A30N o A30E

[0017] Además, cuando se identifica una posición adecuada para la modificación sin sugerir una modificación específica, debe entenderse que cualquier residuo aminoácido puede ser sustituido por el residuo aminoácido presente en la posición.

[0018] Así, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una alanina en la posición 30, pero no se especifica, debe entenderse que la alanina puede ser eliminada o sustituida por cualquier otro aminoácido, es decir, cualquiera de:

R,N,D,A,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

[0019] La Figura 1 muestra el plásmido pCAMG91 conteniendo el gen de glucoamilasa de Aspergillus niger G1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0020] Un objetivo del trabajo base de la presente invención fue mejorar la termoestabilidad de glucoamilasas particulares que son obtenibles de organismos fúngicos, en particular cepas del género de Aspergillus y que ellas mismas han sido seleccionadas en base a sus propiedades adecuadas para la conversión de almidón o fermentación de alcohol.

Posiciones y/o regiones de identificación que deben ser mutadas para obtener mejor termoestabilidad

[0021] Las simulaciones de Dinámica Molecular (DM) indican la movilidad de los aminoácidos en la estructura de la proteína (ver McCammon, JA y Harvey SC., (1987), "Dynamics of proteins and nucleic acids". Cambridge University Press.). Tales dinámicas de la proteína son frecuentemente comparadas con los B-factores cristalográficos (ver Stout, GH and Jensen, LH, (1989), "X-ray structure determination", Wiley). Al ejecutar la simulación DM en diferentes estados de protonación de los residuos titulables, se simula la movilidad relacionada con el pH de residuos. Las regiones que tienen la máxima movilidad o flexibilidad (aquí fluctuaciones isotrópicas) son seleccionadas para la mutagénesis aleatoria. Aquí se entiende que la alta movilidad encontrada en áreas determinadas de la proteína, puede ser térmicamente mejorada substituyendo residuos en estos residuos. Las sustituciones son dirigidas contra residuos que cambiarán el comportamiento dinámico de los residuos a p. ej. cadenas laterales mayores y/o residuos que tienen capacidad de formar mejores contactos para residuos en el entorno cercano. Se usó el AMG de Aspergillus niger para la simulación DM. (En el apartado de Materiales y Métodos abajo se describe cómo llevar a cabo la simulación DM.)

[0022] Las regiones encontradas por simulaciones de dinámica molecular (DM) adecuadas para la mutación cuando se quiere obtener mejor termoestabilidad son las siguientes:

Región: 1-18, Región: 19-35, Región: 73-80, Región: 200-212, Región: 234-246, Región: 334-341, Región: 353-374, Región: 407-411, Región: 445-470,

[0023] Las regiones encontradas de interés para aumentar la termoestabilidad son las regiones cercanas al centro activo. Las regiones situadas entre las -hélices, y que pueden incluir posiciones en cada lado del N-y C-terminal de las -hélices, en el sitio de enlace del sustrato son importantes para la actividad de la enzima. Estas regiones constituyen las regiones siguientes:

Región: 40-62, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 234-246, Región: 287-319, Región: 388-414.

[0024] Rhizopus, Talaromyces, tales como Talaromyces emersonii (descrito en WO 99/28448), y Thielavia tienen alta actividad específica hacia las maltodextrinas, incluyendo maltosa y maltohepatosa. En consecuencia, las regiones que son de interés especial respecto a (transferir) mayor actividad específica son:

Región: 200-212, Región: 287-300, Región: 305-319.

[0025] Los presentes inventores han encontrado que de hecho es posible mejorar la termoestabilidad de una glucoamilasa progenitora modificando uno o más residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa progenitora. La presente invención se basa en este hallazgo.

[0026] Por consiguiente, en un primer aspecto la presente invención se refiere a una variante mejorada de una glucoamilasa progenitora comprendiendo una o más mutaciones en las regiones y posiciones descritas con más detalle abajo.

Glucoamilasas progenitoras

[0027] La glucoamilasa progenitora contemplada según la presente invención incluye glucoamilasas fúngicas, en particular glucoamilasas fúngicas obtenibles de una cepa de Aspergillus, tal como un Aspergillus niger o glucoamilasas de Aspergillus awamori y variantes o mutantes de los mismos, glucoamilasas homólogas y otras glucoamilasas que son estructuralmente y/o funcionalmente similares a la SEC ID NO: 2. Se contemplan específicamente las glucoamilasas de Aspergillus niger G1 y G2 descritas en Boel et al. (1984), "Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs", EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102. La glucoamilasa G2 está descrita en la SEC ID NO: 2. La glucoamilasa G1 está descrita en la SEC ID NO: 13. Otra base principal de AMG contemplada es Talaromyces emersonii, especialmente Talaromyces emersonii DSM descrito en WO 99/28448 (Novo Nordisk).

Glucoamilasas progenitoras comercialmente disponibles

[0028] Las glucoamilasas progenitoras comercialmente disponibles incluyen AMG de Novo Nordisk, y también glucoamilasa de las compañías Genencor, Inc. EEUU, y Gist-Brocades, Delft, Holanda.

Variantes de glucoamilasa.

[0029] La invención se refiere a una variante de una glucoamilasa progenitora como se define en las reivindicaciones 1 a 3 anexas.

[0030] La invención provee también un método para mejorar la termoestabilidad de una glucoamilasa progenitora, como de define en la reivindicación 25 anexa.

Homología (identidad)

[0031] La homología a la que se hace referencia arriba de la glucoamilasa progenitora es determinada como el grado de identidad entre dos secuencias proteínicas que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede ser determinada apropiadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete informático GCG (Manual del Programa para el paquete Wisconsin, versión 8; Agosto 1994; Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p. 443- 453 ). Usando GAP con los ajustes siguientes para comparar las secuencia polipeptídicas: penalización de creación Gap de 3,0 y penalización de extensión Gap de 0,1, la parte madura de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN análoga de la invención exhibe un grado de identidad preferiblemente de al menos un 60%, tal como un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, más preferiblemente al menos un 97%, y más preferiblemente al menos un 99% con la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2.

[0032] Preferiblemente, la glucoamilasa progenitora comprende las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO: 2; o variantes alélicas de las mismas; o fragmentos de las mismas con actividad glucoamilasa.

[0033] Un fragmento de la SEC ID NO: 2 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos cancelados del terminal amino y/o carboxilo de esa secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el AMG G2 (SEC ID NO: 2) es un fragmento de la glucoamilasa de Aspergillus niger G1 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102) que tiene actividad glucoamilasa. Una variante alélica denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo lugar cromosómico. La variación alélica surge naturalmente por mutación, y puede producir polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0034] Las secuencias de aminoácidos de glucoamilasas progenitoras homólogas pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 por una inserción o deleción de uno o más residuos aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos aminoácidos por residuos aminoácidos diferentes. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, es decir las sustituciones de aminoácido conservadoras que no afectan significativamente el pliegue y/o actividad de la proteína; pequeñas deleciones, normalmente de una a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones de terminales amino o carboxílicos, tales como un residuo de metionina de terminal amino; un pequeño enlace péptido de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilite la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de enlace.

[0035] En otra forma de realización, la glucoamilasa progenitora aislada es codificada por una secuencia de ácidos nucléicos que hibrida bajo condiciones de astringencia muy bajas, preferiblemente condiciones de astringencia bajas, más preferiblemente condiciones de astringencia media, más preferiblemente condiciones de astringencia medio-altas, incluso más preferiblemente condiciones de astringencia altas, y más preferiblemente condiciones de astringencia muy altas con una sonda de ácido nucleico que hibrida según las mismas condiciones con (i) la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la SEC ID NO:1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una cadena complementaria de (i), (ii), o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatus; 1989; Clonación Molecular, Manual de Laboratorio, 2ª Edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). La subsecuencia de la SEC ID NO: 1 puede ser de al menos 100 nucleótidos o preferiblemente al menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido con actividad glucoamilasa. Los polipéptidos progenitores también pueden ser variantes o fragmentos alélicos de los polipéptidos que tienen actividad glucoamilasa.

[0036] Se puede usar la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, al igual que la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, o un fragmento de la misma, para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar polipéptidos de codificación de ADN con actividad glucoamilasa, de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, las sondas de este tipo pueden ser usadas para la hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o especie de interés, según los procedimientos estándares de transferencia de Southern, para identificar y aislar su gen correspondiente. Las sondas de este tipo pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente al menos 35 nucleótidos de longitud. También se pueden usar sondas más largas. Se pueden usar sondas de ADN y ARN. Las sondas son normalmente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P; 3H; 35S, biotina, o avidina). Tales sondas están contempladas por la presente invención.

[0037] Así, una biblioteca de ADN genómico o ADNc obtenida a partir de tales otros organismos puede ser seleccionada para el ADN que hibridiza con las sondas anteriormente descritas y que codifica un polipéptido que tiene glucoamilasa. Un ADN genómico u otro de tales otros organismos puede ser separado por electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede ser transferido a e inmovilizado en nitrocelulosa u otro material de soporte adecuado. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo a la SEC ID NO: 1, o sus subsecuencias, el material de soporte es usado en una transferencia Southern. Para los objetivos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácidos nucléicos hibrida a una sonda de ácido nucleico correspondiente a la secuencia de ácidos nucléicos mostrada en la SEC ID NO: 1, su cadena complementaria,

o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de astringencia desde muy bajas a muy altas. Las moléculas a las que la sonda de ácido nucleico hibrida bajo estas condiciones son detectadas usando película de rayos X.

[0038] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material de soporte es finalmente lavado tres veces, cada una durante 15 minutos, usando 2 x SSC, 0,2% SDS preferiblemente al menos a 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50°C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55°C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60°C (astringencia medio-alta), incluso más preferiblemente al menos a 65°C (astringencia alta), y más preferiblemente al menos a 70°C (astringencia muy alta).

[0039] Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia son definidas como prehibridación, hibridación, y post-hibridación con lavado a de 5°C a 10°C por debajo del Tm calculado usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0,9 M de NaCl; 0,09 M de tris-HCl pH 7,6, 6 M de EDTA, 0,5% NP-40, solución 1X Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP, y 0,2 mg de ARN de levadura por ml según los procedimientos de transferencia de Southern estándares.

[0040] Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos hasta aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material de soporte es lavado una vez en 6x SCC más 0,1% SDS durante 15 minutos y dos veces cada una durante 15 minutos usando 6x SSC a de 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada.

[0041] La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas producidas por a) hibridación de ADN bajo condiciones de astringencia muy bajas, bajas, medias, medio-altas, altas o muy altas con la secuencia de la SEC ID NO:1, o su cadena complementaria, o una subsecuencia de la misma; y (b) aislamiento de la secuencia de ácidos nucléicos. La subsecuencia es preferiblemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos tal como una secuencia que codifica un fragmento de polipéptido con actividad glucoamilasa.

[0042] Las glucoamilasas progenitoras contempladas tienen al menos un 20%, preferiblemente al menos un 40%, más preferiblemente al menos un 60%, incluso más preferiblemente al menos un 80%, incluso más preferiblemente al menos un 90%, y más preferiblemente al menos el 100% de la actividad glucoamilasa del polipéptido maduro de la SEC ID NO:

2.

[0043] En una forma de realización preferida la variante de la invención tiene mejor termoestabilidad, preferiblemente dentro del intervalo de temperatura de aproximadamente 60-80°C, preferiblemente 63-75°C, preferiblemente a un pH de 4-5, en particular 4,2-4,7, usando maltodextrina como sustrato.

[0044] En otra forma de realización preferida se usa una variante de la invención para, p. ej., la fermentación de alcohol.

[0045] En una forma de realización preferida, la glucoamilasa progenitora es la glucoamilasa de Aspergillus niger G1 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102. La glucoamilasa progenitora puede ser una glucoamilasa truncada, p. ej., la glucoamilasa AMG G2.

Clonación de una secuencia de ADN que codifica una glucoamilasa progenitora

[0046] La secuencia de ADN que codifica una glucoamilasa progenitora puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produzca la glucoamilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar se debería construir un ADN genómico y/o biblioteca de ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la glucoamilasa que debe ser estudiada. Luego, si se conoce la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa, se puede sintetizar sondas de oligonucleótidos marcadas y usarlas para identificar clones de codificación de glucoamilasa de una genoteca obtenida a partir del organismo en cuestión. Alternativamente se podría utilizar una sonda de oligonucleótidos marcada conteniendo homólogos de secuencias para otro gen de glucoamilasa conocido como una sonda para identificar clones de codificación de glucoamilasa, usando condiciones de hibridación y lavado de astringencia desde muy bajas a muy altas. Esto está descrito arriba.

[0047] Aún otro método para identificar clones de codificación de glucoamilasa implicaría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar las bacterias glucoamilasa-negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante, y luego depositar en placas las bacterias transformadas sobre agar conteniendo un sustrato para glucoamilasa (es decir, maltosa), permitiendo de ese modo identificar los clones que expresan la glucoamilasa.

[0048] Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos estándares establecidos, p. ej. el método de la fosforamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p. 801-805. En el método de la fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej., en un sintetizador de ADN automático, purificados, anelados, ligados y clonados en vectores apropiados.

[0049] Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mixto genómico y sintético, mixto de origen sintético y ADNc o mixto de origen genómico y ADNc, preparado ligando fragmentos de origen sintético, genómico o ADNc (como sea apropiado, los fragmentos correspondiendo a varias partes de toda la secuencia de ADN), según técnicas estándares. La secuencia de ADN también puede ser preparada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491 .

Mutagénesis sitio dirigida

[0050] Una vez que una secuencia de ADN de codificación de glucoamilasa ha sido aislada, y los sitios deseables para la mutación identificados, se pueden introducir mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos flanqueando los sitios de mutación deseada. En un método específico, un espacio vacío monocatenario de ADN, la secuencia de codificación de glucoamilasa, es creada en un vector llevando el gen de glucoamilasa. Luego el nucleótido sintético, llevando la mutación deseada, es anelado a una porción homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante es luego llenado con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y el constructo es ligado usando ligasa T4. Un ejemplo específico de este método está descrito en Morinaga et al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639. US 4,760,025 expone la introducción de oligonucleótidos de codificación de mutaciones múltiples realizando alteraciones menores del casete. No obstante, se puede introducir una variedad incluso superior de mutaciones en cualquier momento por el Método de Morinaga, ya que se puede introducir una multitud de oligonucleótidos de varias longitudes.

[0051] Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN de codificación de glucoamilasa está descrito en Nelson y Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. Este implica la generación en 3 fases de un fragmento de PCR conteniendo la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores en las reacciones PCR. Del fragmento generado por reacción en cadena de polimerasa, un fragmento de ADN llevando la mutación puede ser aislado por seccionamiento con endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de expresión.

[0052] Además, Sierks. et Al., (1989), Protein Eng., 2, 621-625 ; Sierks et al., (1990), Protein Eng. vol. 3, 193-198; también describe la mutagénesis dirigida en una glucoamilasa de Aspergillus.

Mutagénesis aleatoria

[0053] La mutagénesis aleatoria es realizada de manera adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o específica de la región en al menos tres partes del gen que traduce a la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o en todo el gen.

[0054] La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una glucoamilasa progenitora puede ser convenientemente realizada usando cualquier método conocido en la técnica.

[0055] En relación con lo anterior, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una glucoamilasa progenitora donde la variante exhibe una mayor termoestabilidad con respecto a la progenitora, el método comprendiendo:

(a)

someter una secuencia de ADN que codifica la glucoamilasa progenitora a mutagénesis aleatoria,

(b)

expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la fase (a) en una célula huésped, y

(c)

seleccionar las células huéspedes de expresión de una variante de glucoamilasa con una propiedad alterada (es decir termoestabilidad) con respecto a la glucoamilasa progenitora.

[0056] La fase (a) del método indicado arriba de la invención es preferiblemente realizado usando cebadores dopados, como se describe en los ejemplos de trabajo (véase abajo).

[0057] Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser uno que induzca transiciones, transversiones, inversiones, aleatorizaciones, deleciones, y/o inserciones.

[0058] Los ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente objetivo incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, etilmetano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos. Cuando se usan tales agentes, la mutagénesis es normalmente realizada incubando la secuencia de ADN que codifica la enzima progenitora que debe ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante seleccionado bajo condiciones adecuadas para que ocurra la mutagénesis, y seleccionar el ADN mutado teniendo las propiedades deseadas.

[0059] Cuando la mutagénesis es realizada usando un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que deben ser cambiadas. Se puede hacer el dopaje o adición de modo que se eviten los codones para aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado puede ser incorporado en el ADN de codificación de la enzima glucoamilasa por cualquier técnica publicada, usando, p. ej., PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa que se considere apropiado.

[0060] Preferiblemente, el dopaje se realiza usando "dopaje aleatorio constante", donde el porcentaje de tipo salvaje y mutación en cada posición es predefinida. Además, el dopaje puede dirigirse a una preferencia para la introducción de ciertos nucleótidos, y de ese modo una preferencia para la introducción de uno o más residuos aminoácidos específicos. Se puede hacer el dopaje, p. ej., de tal manera que permita la introducción del 90% de tipo salvaje y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopaje se basa en las limitaciones genéticas así como estructurales de la proteína. Se puede hacer el esquema de dopaje usando el programa DOPE que, entre otras cosas, asegura que se evite la introducción de codones de parada.

[0061] Cuando se usa la mutagénesis generada por reacción en cadena de polimerasa un gen de codificación de una glucoamilasa progenitora tratado o no tratado químicamente es sometido a PCR bajo condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et Al., Technique, Vol.1, 1989; págs. 11-15).

[0062] Se puede usar una cepa mutágena de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet.; 133, 1974; págs. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano para la mutagénesis aleatoria del ADN de codificación de la glucoamilasa, p. ej., transformando un plásmido conteniendo la glicosilasa progenitora en la cepa mutágena, haciendo crecer la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede ser posteriormente transformado en el organismo de expresión.

[0063] La secuencia de ADN que debe ser mutagenizada puede estar convenientemente presente en una biblioteca de ADNc o genómica obtenida a partir de un organismo que exprese la glucoamilasa progenitora. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que como tal puede ser incubado con o expuesto de otro modo al agente mutagenizante. El ADN que debe ser mutagenizado puede estar también presente en una célula huésped bien estando integrado en el genoma de dicha célula o estando presente en un vector hospedado en la célula. Finalmente, el ADN que debe ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se sobreentiende que la secuencia de ADN que debe ser sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.

[0064] En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la fase de expresión b) o la fase de selección c). Tal amplificación puede ser realizada según métodos conocidos en la técnica, el método actualmente preferido es la amplificación generada por reacción en cadena de polimerasa usando cebadores oligonucleótidos preparados en base a la secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima progenitora.

[0065] Después de la incubación con o exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado es expresado cultivando una célula huésped adecuada llevando la secuencia de ADN bajo condiciones que permitan que ocurra la expresión. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que haya sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que lleve la secuencia de ADN que codifica la enzima progenitora durante el tratamiento de mutagénesis. Los ejemplos de células huéspedes adecuadas son las siguientes: bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram-negativas tales como E. coli.

[0066] La secuencia de ADN mutada puede comprender además una secuencia de ADN que codifique las funciones que permitan la expresión de la secuencia de ADN mutada.

Mutagénesis aleatoria localizada

[0067] La mutagénesis aleatoria puede ser ventajosamente localizada para una parte de la glucoamilasa progenitora en cuestión. Esta puede, p. ej., ser ventajosa cuando ciertas regiones de la enzima han sido identificadas de particular importancia para una propiedad dada de la enzima, y cuando son modificadas se espera que produzcan una variante con propiedades mejoradas. Las regiones de este tipo pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima progenitora ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.

[0068] La mutagénesis aleatoria localizada o específica de la región es convenientemente realizada usando técnicas de mutagénesis generadas por PCR del modo descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que debe ser modificada puede ser aislada, p. ej., por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.

[0069] Métodos alternativo para proveer variantes de la invención incluyen transposición de genes p. ej. como se describe en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) o en WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S).

Expresión de Variantes de Glucoamilasa

[0070] Según la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por los métodos anteriormente descritos, o por cualquier método alternativo conocido en la técnica, puede ser expresada, en forma de enzima, usando un vector de expresión que normalmente incluye secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de enlace de ribosoma, señal de iniciación de traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

Vector de expresión

[0071] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de glucoamilasa de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que debe ser introducido. El vector puede ser uno que, cuando es introducido en una célula huésped, se integrue en el genoma de la célula huésped y se replique con el (los) cromosoma(s) en el (los) que ha sido integrado. Ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen pMT838.

Promotor

[0072] En el vector, la secuencia de ADN debería ser operativamente conectada a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede derivar de genes de codificación de proteínas bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

[0073] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de glucoamilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E.coli, los promotores del gen de agarasa de Streptomyces coelicolor dagA, los promotores del gen de la -amilasa de Bacillus licheniformis (amiL), los promotores del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), los promotores de -amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xy1A y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, el promotor de TPI (triosa fosfato isomerasa) de S. cerevisiae (Alber et al. (1982), J.Mol. Appl. Genet 1, p. 419-434, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, -amilasa neutra de A. niger, amilasa estable al ácido de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o acetamidasa de A. nidulans.

Vector de expresión

[0074] El vector de expresión de la invención puede también comprender un terminador de transcripción adecuada y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de -amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden derivar apropiadamente de las mismas fuentes que el promotor.

[0075] El vector puede además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.

[0076] El vector también puede comprender un marcador seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complemente una falta en la célula huésped, tales como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera resistencia antibiótica tal como ampicilina, canamicina, cloranfenicol o resistencia a la tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que de lugar a resistencia a la higromicina, o la selección puede ser realizada por cotransformación, p. ej. como se describe en WO 91/17243.

[0077] Los procedimientos usados para enlazar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de glucoamilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados conteniendo la información necesaria para la replicación, son conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et Al., Clonación Molecular: Manual de Laboratorio; 2nd Ed., Cold Spring Harbor; 1989).

Células Huéspedes

[0078] La célula de la invención, comprendiendo bien un constructo de ADN o un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, es ventajosamente usada como una célula huésped en la producción recombinante de una variante de glucoamilasa de la invención. La célula puede ser transformada con el constructo de ADN de la invención codificando la variante, convenientemente integrando el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración es generalmente considerada una ventaja pues es muy probable que la secuencia de ADN sea mantenida de forma estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada según métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga. Alternativamente, la célula puede ser transformada con un vector de expresión del modo descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huéspedes.

[0079] La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, p. ej., una célula bacteriana o fúngica (incluyendo levadura).

[0080] Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E.coli. La transformación de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplasto o usando células competentes conocidas per se.

[0081] El organismo de levadura puede favorablemente ser seleccionado de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, p. ej. Saccharomyces cerevisiae.

[0082] La célula huésped puede ser también un hongo filamentoso p. ej. una cepa de una especie de Aspergillus, más preferiblemente Aspergillus oryzae o Aspergillus niger, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (en el estado perfecto denominado Gribberella zeae, previamente Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y Gibberella roseum f. esp. cerealis), o Fusarium sulphureum (en el estado perfecto denominado Gibberella puricaris, sinónimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, y Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinónimo de Fusarium crokkwellnse), o Fusarium venenatum.

[0083] En una forma de realización preferida de la invención la célula huésped es una cepa deficitaria de proteasa o cepa negativa de proteasa.

[0084] Esta puede por ejemplo ser la cepa deficitaria de Aspergillus oryzae JaL 125 teniendo el gen de proteasa alcalina llamado "alp" cancelado. Esta cepa está descrita en WO 97/35956 (Novo Nordisk).

[0085] Las células de hongos filamentosos pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. El uso de Aspergillus como microorganismo huésped está descrito en EP 238 023 (Novo Nordisk A/S),

Método para Producir una Variante de Glucoamilasa

[0086] En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de glucoamilasa de la invención, cuyo método comprende cultivar una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la variante y recuperación de la variante de las células y/o medio de cultivo.

[0087] El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula huésped en cuestión y obtener expresión de la variante de glucoamilasa de la invención. Los medios adecuados se encuentran disponibles en los proveedores comerciales o pueden ser preparados según recetas publicadas (p. ej. como se describe en los catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo).

[0088] La variante de glucoamilasa segregada de las células huéspedes puede convenientemente ser recuperada del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, incluyendo la separación de las células del medio por centrifugado

o filtración, y la precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, seguido del uso de procedimientos cromatográficos tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.

Conversión de almidón

[0089] La presente invención provee un método para usar variantes de glucoamilasa de la invención para producir glucosa y similares de almidón. Generalmente, el método incluye las fases de hidrolizar parcialmente almidón precursor en presencia de -amilasa e hidrolizar luego adicionalmente la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores del almidón o moléculas oligo- o polisacáridas relacionadas en presencia de glucoamilasa dividiendo los enlaces glucosídicos -(1  4) y -(1  6).

[0090] La hidrólisis parcial del almidón precursor utilizando -amilasa provee una descomposición inicial de las moléculas de almidón al hidrolizar los enlaces internos -(1  4). En aplicaciones comerciales, la hidrólisis inicial usando -amilasa se realiza a una temperatura de aproximadamente 105°C. Se procesa una concentración de almidón muy alta, normalmente sólidos al 30% a 40%. La hidrólisis inicial es normalmente realizada durante cinco minutos a esta temperatura elevada. El almidón parcialmente hidrolizado puede después ser transferido a un segundo tanque e incubado durante aproximadamente 1-2 horas a una temperatura de 85° a 98°C para obtener un equivalente de dextrosa (D.E.) de 10 a 15.

[0091] La fase de hidrolizar adicionalmente la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores del almidón o moléculas de oligo- y polisacáridos relacionadas en presencia de glucoamilasa se realiza normalmente en un tanque separado a una temperatura reducida entre 30° y 62°C. Preferiblemente la temperatura del líquido de sustrato es bajada a entre 55° y 60°C. El pH de la solución es bajada de aproximadamente 5,5 a 6,5 a un rango entre 3 y 5,5. Preferiblemente, el pH de la solución es 4 a 4,5. La glucoamilasa se añade a la solución y la reacción se realiza durante 24-72 horas, preferiblemente 36-48 horas.

[0092] Al usar una variante de glucoamilasa termoestable de la invención se pueden realizar procesos de sacarificación a una temperatura más alta que los procesos de sacarificación por lotes tradicionales. Según la invención la sacarificación puede ser realizada a temperaturas en el rango sobre 60-80°C, preferiblemente 63-75°C. Esto se aplica tanto a los procesos por lotes tradicionales (anteriormente descritos) como a los procesos de sacarificación continuos.

[0093] En realidad, los procesos de sacarificación continuos incluyendo una o más fases de separación por membrana, es decir fases de filtración, deben ser realizados a temperaturas por encima de 60°C para poder mantener un flujo razonablemente alto sobre la membrana o para minimizar la contaminación microbiana. En consecuencia, las variantes termoestables de la invención proporcionan la posibilidad de realizar procesos de sacarificación continuos a gran escala a un precio justo y/o con una dosificación de proteína enzimática inferior dentro de un periodo de tiempo aceptable para los procesos de sacarificación industriales. Según la invención el tiempo de sacarificación puede incluso ser acortado.

[0094] La actividad de la variante de glucoamilasa (p. ej. variante AMG) de la invención es generalmente sustancialmente superior a temperaturas entre 60°C-80°C que a la temperatura generalmente usada entre 30-60°C. En consecuencia, al aumentar la temperatura en la que opera la glucoamilasa el proceso de sacarificación puede ser realizado dentro de un periodo de tiempo más corto.

[0095] Además, al mejorar la termoestabilidad se mejora el T1/2 (duración media, tal y como se define en el apartado de "Materiales y Métodos"). Como la termoestabilidad de las variantes de glucoamilasa de la invención es mejorada se necesita añadir una cantidad menor de glucoamilasa para reemplazar la glucoamilasa que es inactivada durante el proceso de sacarificación. Durante el proceso de sacarificación según la presente invención se mantiene más glucoamilasa activa. Además, se reduce también el riesgo de contaminación microbiana cuando se lleva el proceso de sacarificación a una temperatura por encima de 63°C.

[0096] El rendimiento de glucosa de una prueba de sacarificación típica con glucoamilasa, amilasa ácida y pululanasa es 95,5-96,5%. Los carbohidratos restantes normalmente consisten en 1% de maltosa; 1,5-2% de isomaltosa y 1-1,5% de oligosacáridos superiores. Se producen disacáridos puesto que la glucoamilasa a concentraciones altas de glucosa y altos niveles de materia seca tiende a formar productos de reversión.

[0097] Una glucoamilasa con una actividad específica aumentada hacia los sacáridos presentes en la solución después de licuefacción y los sacáridos formados durante la sacarificación serían una ventaja pues se podría utilizar una menor dosificación de proteína enzimática o un tiempo de proceso más corto. En general, la glucoamilasa tiene preferencia por los sustratos que consisten en sacáridos más largos en comparación con los sacáridos de cadena corta y la actividad específica hacia p. ej. maltoheptaosa es en consecuencia aproximadamente 6 veces superior que hacia maltosa. Una mayor actividad específica hacia los sacáridos de cadena corta tales como maltosa (sin reducir la actividad hacia los oligosacáridos) en consecuencia también permitiría usar una dosificación de enzima inferior y/o tiempo de proceso más corto.

[0098] Además, se puede obtener un rendimiento de glucosa superior con una variante de glucoamilasa con una actividad hidrolítica alfa-1,4 (si la actividad alfa-1,6 es invariada o incluso disminuida), puesto que una cantidad reducida de proteína enzimática está siendo usada, y en consecuencia se disminuye la formación de producto de reversión alfa1,6 (menos isomaltosa).

[0099] La actividad específica puede ser medida usando el método descrito en el apartado "Materiales y Métodos" a 37°C o 60°C.

[0100] Los ejemplos de proceso de sacarificación donde las variantes de glucoamilasa de la invención pueden ser usadas incluyen los procesos descritos en JP 3-224493; JP 1-191693; JP 62-272987; EP 452,238, y WO 99/27124.

[0101] En otro aspecto la invención se refiere a un método de sacarificación de una solución de almidón licuado, incluyendo las siguientes fases

(i) una fase de sacarificación durante la cual se desarrollan uno o más estadios de sacarificación enzimática, y la fase posterior de

(ii) una o más fases de separación por membrana a alta temperatura donde la sacarificación enzimática se realiza usando una variante de glucoamilasa termoestable de la invención.

[0102] La(s) variante(s) de glucoamilasa de la invención pueden ser usadas en el presente proceso inventivo en combinación con una enzima que hidroliza sólo enlaces -(16). glucosídicos en moléculas con al menos cuatro residuos glucosilicos. Preferentemente, la variante de glucoamilasa de la invención puede ser usada en combinación con pululanasa o isoamilasa. El uso de isoamilasa y pululanasa para desramificar las propiedades moleculares de las enzimas, y el uso potencial de las enzimas con glucoamilasa está indicado en G.M.A. van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, Nueva York, 1985, 101-142 .

[0103] En otro aspecto la invención se refiere al uso de una variante de glucoamilasa de la invención en un proceso de conversión de almidón.

[0104] Además, la variante de glucoamilasa de la invención puede ser usada en un proceso de conversión de almidón continuo incluyendo una fase de sacarificación continua.

[0105] Las variantes de glucoamilasa de la invención pueden también ser usadas en forma inmovilizada. Esto es conveniente y frecuentemente usado para producir jarabes especiales, tales como jarabes de maltosa, y otros para la corriente refinada de oligosacáridos en relación con la producción de jarabes de fructosa.

[0106] La glucoamilasa de la invención también puede ser usada en un proceso para producir etanol para combustible o bebidas o puede ser usado en un proceso de fermentación para producir compuestos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido glutámico.

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES: Enzimas: [0107] AMG G1: glucoamilasa de Aspergillus niger G1 descrita en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), 1097-1102, y la SEC ID NO: 13; disponible en Novo Nordisk. AMG G2: glucoamilasa de Aspergillus niger G1 truncada mostrada en la SEC ID NO: 2, disponible en Novo Nordisk)

Soluciones:

[0108] Tampón: 0,05M de acetato sódico (6,8g en 1 l de agua purificada en un sistema milli-Q), pH 4,5 Solución de detención: 0,4M de NaOH GOD-perid, 124036, Boehringer Mannheim

Sustrato: [0109] Maltosa: 29mM (1g maltosa en 100ml 50mM de acetato sódico, pH 4,5) (Sigma) Maltoheptaosa: 10 mM, 115 mg/10 ml (Sigma)

Célula huésped: [0110] A. oryzae JaL 125: Aspergillus oryzae IFO 4177 disponible en Institute for Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku, Osaka, Japón, que tiene el gen de proteasa alcalina denominado "alp" (descrito por Murakami K et al., (1991), Agric. Biol. Chem. 55, p. 2807-2811) cancelado por un método de sustitución de gen de una fase (descrito por G. May en "Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi" (1992), p. 1-25. Eds. J. R. Kinghorn y G. Turner; Blackie Academic and Professional), usando el gen de A. oryzae pyrG como marcador. La cepa JaL 125 está descrita con más detalle en WO 97/35956 (Novo Nordisk).

Microorganismos: [0111] Cepa: Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATleu2-∆2 ura3-52 his4-539 pep4-∆1[cir+]

Plásmidos: [0112] pCAMG91: ver Figura 1. Plásmido comprendiendo la glucoamilasa de Aspergillus niger G1 (AMG G1). La construcción de pCAMG91 está descrita en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (7) p.1581-1585.

[0113] pMT838: plásmido que codifica la glucoamilasa de Aspergillus niger truncada G2 (SEC ID NO: 2).

[0114] pJS0026 (plásmido de expresión de S. cerevisiae) (J.S.Okkels, (1996)"A URA3-promoter deletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology

III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 de los Anales de la Academia de Ciencias de Nueva York). Más específicamente, el plásmido de expresión pJSO37, es derivado de pYES 2,0 reemplazando el promotor inducible GAL1 de pYES 2,0 con el promotor constitutivamente expresado de TPI (triosa fosfato isomerasa) de Saccharomyces cerevisiae (Albert y Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1, 419-434 ), y cancelando una parte del promotor URA3.

MÉTODOS: Transformación de Saccharomyces cerevisiae YNG318

[0115] Los fragmentos de ADN y los vectores abiertos son mezclados y transformados en la levadura de Saccharomyces cerevisiae YNG318 por métodos estándares.

Determinación de la Actividad Específica As Kcat (sec.-1).

[0116] Se incuban 750 microL de sustrato (1% maltosa; 50 mM de acetato sódico, pH 4,3) 5 minutos a temperatura seleccionada, tal como 37°C ó 60°C.

[0117] Se añade 50 microL de enzima diluida en acetato sódico. Se retiran partes alícuotas de 100 microL después de 0, 3, 6, 9 y 12 minutos y se transfieren a 100 microL 0,4 M de hidróxido de sodio para parar la reacción. Se incluye un blanco. Se transfiere 20 microL a placas de Microtitulación y se añaden 200 microL de solución GOLD-Perid. La absorbencia es medida a 650 nm después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Se usa glucosa como estándar y la actividad específica es calculada como Kcat (sec.-1).

Determinación de la actividad AGU y As AGU/mg

[0118] Una unidad de amiloglucosidasa Novo (AGU) es definida como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto a 37°C y pH 4,3. Una descripción detallada del método analítico (AEL-SM-0131) está disponible a petición en Novo Nordisk.

[0119] La actividad es determinada como AGU/ml por un método modificado después de (AEL-SM-0131) usando el kit de glucosa GOD-Perid de Boehringer Mannheim; 124036. Estándar: lote estándar de AMG, lote 7-1195, 195 AGU/ml.

[0120] Se incuban 375 microL de sustrato (1% maltosa en 50 mM de acetato sódico, pH 4,3) 5 minutos a 37°C. Se añaden 25 microL de enzima diluida en acetato sódico. La reacción es detenida después de 10 minutos añadiendo 100 microL 0,25 M de NaOH. Se transfieren 20 microL a una placa de microtitulación de 96 pocillos y se añaden 200 microL de solución GOD-Perid. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la absorbencia es medida a 650 nm y la actividad calculada en AGU/ml del AMG estándar.

[0121] La actividad específica en AGU/mg es luego calculada de la actividad (AGU/ml) dividida por la concentración de proteína (mg/ml).

Transformación de Aspergillus oryzae (procedimiento general)

[0122] Se inoculan100 ml de YPD (Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory ) con esporas de A. oryzae y se incuban con agitación durante aproximadamente 24 horas. El micelio es cosechado por filtración a través de miracloth y lavado con 200 ml de 0.6 M de MgSO4. El micelio es suspendido en 15 ml de 1,2 M de MgSO4, 10 mM de NaH2PO4, pH 5,8. La suspensión es enfriada en hielo y se añade 1 ml de tampón conteniendo 120 mg de Novozym™ 234. Después de 5 min. se añade 1 ml de 12 mg/ml BSA (Sigma tipo H25) y se continúa la incubación con agitación suave durante 1,5-2,5 horas a 37ºC hasta que un gran número de protoplastos es visible en una muestra inspeccionada bajo el microscopio.

[0123] La suspensión es filtrada por miracloth, el filtrado transferido a un tubo estéril y cubierto con 5 ml de 0,6 M de sorbitol, 100 mM de tris-HCl, pH 7,0. Se realiza el centrifugado durante 15 min. a 1000 g y los protoplastos son recogidos de la parte superior del lecho de MgSO4. 2 volúmenes de STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM de tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de CaCl2) son agregados a la suspensión de protoplastos y la mezcla es centrifugada durante 5 min. a 1000 g. El granulado de protoplastos es resuspendido en 3 ml de STC y regranulado. Esto se repite. Finalmente, los protoplastos son resuspendidos en 0,2-1 ml de STC.

[0124] Se mezclan 100 µl de suspensión de protoplastos con 5-25 µg de p3SR2 (un plásmido que lleva el gen amdS de

A. nidulans descrito en Hynes et al., Mol. y Cel. Biol., Vol. 3; n°. 8, 1430-1439; Aug. 1983) en 10 µl de STC. La mezcla es dejada a temperatura ambiente durante 25 min. Se añade 0,2 ml de 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM de CaCl2 y 10 mM de tris-HCl, pH 7,5 y se mezcla cuidadosamente (dos veces) y finalmente se añade y mezcla cuidadosamente 0,85 ml de la misma solución. La mezcla es dejada a temperatura ambiente durante 25 min., centrifugada a 2.500 g durante 15 min. y el granulado es resuspendido en 2 ml de 1,2M de sorbitol. Después de una sedimentación más los protoplastos son extendidos en placas mínimas (Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56) conteniendo 1,0 M de sacarosa, pH 7,0, 10 mM de acetamida como fuente de nitrógeno y 20 mM de CsCl para inhibir el crecimiento residual. Tras la incubación durante 4-7 días a 37°C las esporas son recogidas, suspendidas en agua estéril y extendidas en colonias individuales. Este procedimiento es repetido y las esporas de una colonia individual después del segundo reaislamiento son almacenadas como un transformante definido.

Fermentación con Alimentación por Lotes

[0125] La fermentación con alimentación por lotes es realizada en un medio comprendiendo maltodextrina como fuente de carbono, urea como fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La fermentación con alimentación por lotes es realizada inoculando un cultivo en un frasco de agitación de las células huéspedes de A. oryzae en cuestión en un medio comprendiendo 3,5% de la fuente de carbono y 0,5% de la fuente de nitrógeno. Después de 24 horas de cultivo a pH 5,0 y 34°C se inicia la alimentación continua de fuentes de nitrógeno y carbono adicionales. La fuente de carbono es mantenida como el factor de limitación y se asegura que el oxígeno esté presente en exceso. Se continúa el cultivo con alimentación por lotes durante 4 días, después de los cuales las enzimas pueden ser recuperadas por centrifugado, ultrafiltración, filtración clara y filtración de gérmenes.

Purificación

[0126] El caldo de cultivo es filtrado y se le añade amoniosulfato (AMS) en una concentración de 1,7 M AMS y el pH es ajustado a pH 5. El material de precipitado es retirado por centrifugado y la solución que contiene actividad glucoamilasa es aplicada en una columna Toyo Pearl Butyl previamente equilibrada en 1,7 M de AMS, 20 mM de acetato sódico, pH

5. El material no enlazado es lavado con el tampón de equilibrado. Las proteínas enlazadas son eluidas con 10 mM de acetato sódico, pH 4,5 usando un gradiente lineal de 1,7- 0 M AMS sobre 10 volúmenes de columna. Las fracciones conteniendo glucoamilasa son recogidas y dializadas contra 20 mM de acetato sódico, pH 4,5. La solución fue luego aplicada en una columna de sefarosa Q, previamente equilibrada en 10 mM de Piperazina, Sigma, pH 5,5. El material no enlazado es lavado con el tampón de equilibrado. Las proteínas enlazadas son eluidas con un gradiente lineal de 00,3 M de cloruro sódico en 10 mM de Piperazina, pH 5,5 sobre 10 volúmenes de columna. Las fracciones conteniendo glucoamilasa son recogidas y la pureza fue confirmada por SDS-PAGE.

T1/2 (vida media) Método I

[0127] La termoestabilidad de las variantes es determinada como T1/2 usando el método siguiente: Se incuban 950 microlitros de 50 mM de tampón de acetato sódico (pH 4,3) (NaOAc) durante 5 minutos a 68°C ó 70°C. Se añaden 50 microlitros de enzima en tampón (4 AGU/ml). Se toman muestras de 2 x 40 microlitros a 0, 5, 10, 20, 30 y 40 minutos y se enfría en hielo. Se usa la actividad (AGU/ml) medida antes de la incubación (0 minutos) como referencia (100%). El descenso de la estabilidad (en porcentaje) es calculado en función del período de incubación. La actividad de glucoamilasa residual en % es determinada en tiempos diferentes. T1/2 es el periodo de tiempo hasta que el % de actividad relativa ha disminuido un 50%.

T1/2 (vida media) Método II

[0128] El T1/2 es medido incubando la enzima (aprox 0,2 AGU/ml) en cuestión en 30% de glucosa; 50 mM de acetato sódico a pH 4,5 a la temperatura en cuestión (p. ej.: 70°C). Se retiran muestras a intervalos de tiempo establecidos y se enfrían en hielo y se mide la actividad enzimática residual por el método pNPG (como se describe abajo).

[0129] El % de actividad de glucoamilasa residual es determinada en tiempos diferentes. T1/2 es el periodo de tiempo hasta que el % de actividad relativa ha disminuido un 50%.

Actividad Enzimática Residual (Método pNPG) reactivo pNPG: [0130] Se disuelve 0,2 g de pNPG (p-nitrofenilglucopiranosido) en 0,1 M de tampón de acetato (pH 4,3) y se completa a 100 ml.

Solución de borato: [0131] Se disuelven 3,8g de Na2B4O7 10 H2O en agua purificada en un sistema Milli-Q y se completa hasta 100 ml. [0132] Se añaden muestras de 25 microL a 50 microL de sustrato y se incuban 2 hr a 50°C. La reacción es detenida añadiendo 150 micoL ml de solución de borato. Se mide la densidad óptica a 405 nm y se calcula la actividad residual.

Construcción de pAMGY

[0133] El vector pAMGY fue construido como sigue: el gen de lipasa en pJSO026 fue sustituido por el gen AMG, que fue amplificado por PCR con el cebador directo: FG2: 5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3' y el cebador inverso: RG2: 5'-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT-3' usando el plásmido patrón pLAC103 conteniendo el gen AMG. El plásmido pJSO026 fue digerido con XbaI y SmaI a 37°C durante 2 horas y el amplicon PCR fue hecho romo usando el fragmento Klenow y luego digerido con XbaI. El fragmento del vector y el amplicon PCR fueron ligados y transformados en E.coli por electrotransformación. El vector resultante es designado pAMGY.

Construcción de pLaC103

[0134] Se usa el clon de ADNc AMGII de A. Niger (Boel et al., (1984), supra) como fuente para la construcción de pLaC103 dirigido a la expresión de S. cerevisiae de la forma GII de AMG.

[0135] La construcción se desarrolla en diferentes fases indicadas abajo.

[0136] Se divide pT7-212 (EP37856 / Patente estadounidense n°. 5162498) con XbaI, con extremos romos con ADN polimerasa de Klenow y dNTP. Después de dividir con EcoRI, el fragmento del vector resultante es purificado por una electroforesis de gel de agarosa y ligado con el fragmento EcoR1-EcoRV de 2,05 kb de pBoel53, recreando de ese modo el sitio de XbaI en el extremo EcoRV del fragmento de codificación AMG en el plásmido resultante pG2x.

[0137] Para eliminar el ADN corriente arriba de los cds AMG, y proveer el ADN de codificación de AMG con un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción apropiada, se hizo el siguiente constructo: El fragmento EcoRI-PstI de 930 pares de bases de p53 fue aislado y sometido a seccionamiento de AluI, el fragmento resultante Alu-PstI de 771 bp fue ligado en pBR322 con el sitio de EcoRI romo (ver arriba) y dividido con PstI en el plásmido resultante pBR-AMG', el sitio EcoRI fue recreado justo 34 bp del codón iniciador de los cds de AMG.

[0138] De pBR-AMG' se aisló el fragmento EcoRI -PstI de 775 bp y se unió con el fragmento PstI - XbaI de 1151 pb de pG2x en una reacción de ligadura incluyendo el fragmento del vector XbaI - EcoRI de pT7-212.

[0139] El plásmido resultante pT7GII fue sometido a un seccionamiento de BamHI en presencia de fosfatasa alcalina seguido de seccionamiento parcial SphI después de la inactivación de la fosfatasa. De esta reacción el fragmento SphI-BamHI de 2489 bp, abarcando el promotor de TPI de S.c. fue enlazado a los cds de AMGII. El fragmento anterior junto con el fragmento BamHI de 1052 bp de pT7GII fue ligado con el fragmento del vector tratado con fosfatasa alcalina de pMT743 (EP37856 /US 5162498), produciendo la digestión de SphI-BamHI. El plásmido resultante es pLaC103.

Selección de Variantes Termoestables de AMG

[0140] Las bibliotecas son seleccionadas en el ensayo de filtro termoestable descrito abajo.

Ensayo de filtro para la termoestabilidad

[0141] Se colocan ibliotecas de levadura en placas en un sándwich de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) - y filtros de nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) sobre placas de CFura- agar con 100 µg/ml de ampicilina a 30°C durante al menos 72 hrs. Las colonias son colocadas en réplicas en filtros PVDF (Immobilon-P, Millipore, Bedford) activados con metanol durante 1 min o alternativamente un filtro Protran (sin activación) y posteriormente lavado en 0,1 M de NaAc y luego incubadas a temperatura ambiente durante 2 horas. Las colonias son lavadas de los filtros PVDF/Protran con agua corriente. Cada sandwich de filtros y los filtros PVDF/Protran son específicamente marcados con una aguja antes de la incubación con el objetivo de poder localizar variantes positivas en los filtros después de la selección. Los filtros PVDF con variantes enlazadas son transferidos a un contenedor con 0,1 M de NaAc, pH 4,5 e incubados a 47°C o alternativamente 67-69°C en caso de filtros Protran durante 15 minutos. El sándwich de acetato de celulosa y los filtros de nitrocelulosa sobre placas de SC ura-agar son almacenados a temperatura ambiente hasta su uso. Tras la incubación, las actividades residuales son detectadas en placas que contienen un 5% de maltosa; 1% de agarosa; 50 mM de NaAc, pH 4,5. Las placas de ensayo con filtros PVDF son marcadas de la misma manera que los sandwich de filtros e incubadas durante 2 hrs. a 50°C. Después de retirar los filtros PVDF, las placas de ensayo son coloreadas con glucosa/GOD-perid (Boehringer Mannheim Gmbh, Alemania). Las variantes con actividad residual son detectadas en las placas de ensayo como manchas verde oscuro sobre fondo blanco. Las variantes mejoradas son localizadas en las placas de almacenamiento. Las variantes mejoradas son refiltradas dos veces según las mismas condiciones que la primera selección.

Método General de Mutagénesis Aleatoria Usando el Programa DOPE

[0142] La mutagénesis aleatoria puede ser realizada por las fases siguientes:

1.

Seleccionar regiones de interés para modificar la enzima progenitora,

2.

Decidir sitios de mutación y sitios no mutados en la región seleccionada,

3.

Decidir qué tipo de mutación debería realizarse, p. ej., con respecto a la estabilidad deseada y/o rendimiento de la variante a construir,

4.

Seleccionar mutaciones estructuralmente razonables,

5.

Ajustar los residuos seleccionados en la fase 3 con respecto a la fase 4.

6.

Analizar, usando un algoritmo DOPE adecuado, la distribución de nucleótidos.

7.

Si es necesario, ajustar los residuos deseados al realismo del código genético, p. ej. teniendo en cuenta las limitaciones que resultan del código genético, p. ej. para evitar la introducción de codones de parada; el experto en la materia sabrá que algunas combinaciones de codón no pueden ser usadas en la práctica y necesitan ser adaptadas

8.

Hacer cebadores

9.

Realizar la mutagénesis aleatoria usando los cebadores

10.

Seleccionar las variantes de glucoamilasa resultantes seleccionando las propiedades deseadas mejoradas.

Algoritmo DOPE

[0143] Los algoritmos DOPE adecuados para el uso en la fase 6 son muy conocidos en la técnica. Tal algoritmo está descrito por Tomandl, D. et al.; 1997; Journal of Computer-Aided Molecular Design 11:29-38. Otro algoritmo es DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26:697-702).

Método de Extracción de Regiones Importantes para la Actividad Según la Temperatura Usando Simulación Molecular.

[0144] La estructura de rayos X y/o la estructura modelo de construcción de la enzima de interés, aquí AMG, es sometida a simulaciones de dinámica molecular. Las simulaciones de dinámica molecular se hicieron usando el programa CHARMM (de simulaciones moleculares (MSI) u otros programas adecuados, p. ej., DISCOVER (de MSI). Las dinámicas son hechas en vacío, o incluyendo aguas de cristalización, o con la enzima en cuestión introducida en aguas adecuadas, p. ej., una esfera o una caja. Las simulaciones son realizadas durante 300 picosegundos (ps) o más,

p. ej.; 300-1200 ps. Las fluctuaciones isotrópicas son extraídas para los carbonos CA de las estructuras y se hace la comparación entre las estructuras. Se pueden encontrar más detalles de cómo obtener las fluctuaciones isotrópicas en el manual CHARMM (disponible en MSI).

[0145] La simulación de dinámica molecular puede llevarse a cabo usando cargas estándares en los aminoácidos cargables. Por ejemplo, Asp y Glu son cargados negativamente y Lys y Arg son cargados positivamente. Esta condición se asemeja al pH del medio de aproximadamente 7,0. Para analizar un pH inferior, se puede hacer la titulación de la molécula para obtener el pKa's alterado de los residuos titulables normales dentro de pH 2-10; Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr y His. También Ser, Thr y Cys son titulables pero no son tenidos en cuenta aquí. Aquí se han descrito las cargas alteradas debido al pH como todos Arg, Lys negativos a pH alto, y todos Asp, Glu sin carga. Esto imita un pH de alrededor de 4 a 5 donde normalmente tiene lugar la titulación de Asp y Glu.

[0146] El modelo de construcción de la enzima de interés puede ser obtenido usando el modelo HOMOLOGY del paquete informático MSI. La estructura cristalina de la variante de Aspergillus awamori x100 puede ser encontrada en,

p. ej.; 3GLY y 1DOG en la base de datos Brookhaven. 5

EJEMPLOS EJEMPLO 1

Construcción de variantes de AMG G2 Mutagénesis sitio-dirigida: 10 [0147] Para la construcción de variantes de AMG G2 (SEC ID NO: 2) se usó el kit comercial de mutagénesis dirigida bicatenaria Chameleon según las instrucciones del fabricante.

[0148] El gen que codifica la enzima AMG G2 en cuestión está localizado en pMT838 preparado cancelando el ADN entre G2 nt. 1362 y G2 nt. 1530 en el plásmido pCAMG91 (ver Figura 1) comprendiendo la forma AMG G1.

15 [0149] Según las instrucciones del fabricante el sitio ScaI del gen de Ampicilina de pMT838 fue cambiado a un sitio Mlul usando el cebador siguiente:

7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3' (SEC ID NO: 3). (Cambiando así el sitio ScaI encontrado en el gen de resistencia a la ampicilina y usado para cortar a un sitio MluI). El 20 vector pMT838 comprendiendo el gen AMG en cuestión fue luego usado como un molde para ADN polimerasa y oligo 7258 (SEC ID NO: 3) y 21401 (SEC ID NO: 4).

[0150] Se usó el cebador n°. 21401 (SEC ID NO: 4) como el cebador de selección. 21401: 5'p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3'

25 (Cambia el sito ScaI encontrado en el gen AMG sin cambiar la secuencia de aminoácidos). La mutación deseada (p. ej., la introducción de un residuo de cisteína) es introducida en el gen AMG en cuestión por adición de oligos apropiados comprendiendo la mutación deseada.

[0151] Se usó el cebador 107581 para introducir T12P 30 107581: 5' pgc aac gaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3'(SEC ID NO: 5)

[0152] Las mutaciones son verificadas secuenciando todo el gen. El plásmido fue transformado en A. oryzae usando el método anteriormente descrito en el apartado "Materiales y Métodos". La variante fue fermentada y purificada del modo descrito anteriormente en el apartado "Materiales y Métodos".

35

EJEMPLO 2

Construcción, por mutagénesis dopada aleatoria localizada, de las variantes de AMG de A. niger con termoestabilidad mejorada en comparación con la enzima progenitora [0153] Para mejorar la termoestabilidad de AMG de A. niger se realizó la mutagénesis aleatoria en una región

40 preseleccionada.

[0154] Residuo: Región: L19-G35 Región: A353-V374

45 [0155] Se usó el software DOPE (ver Materiales y Métodos) para determinar los codones adicionados para cada cambio sugerido en las regiones indicadas arriba minimizando la cantidad de codones de parada (ver tabla 1). La distribución exacta de nucleótidos fue calculada en las tres posiciones del codón para dar la población sugerida de cambios de aminoácidos. Las regiones dopadas fueron dopadas específicamente en las posiciones indicadas para tener una alta

50 probabilidad de conseguir los residuos deseados, pero permitir además otras posibilidades.

[0156] La primera columna es el aminoácido que se debe mutar, la segunda columna es el porcentaje de tipo salvaje y la tercera columna define el (los) nuevo(s) aminoácido(s).

55 Tabla 1 [0157] La cadena de oligonucleótidos dopada resultante es mostrada en la tabla 2 como hebra codificante: con la secuencia de cebador, la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje, la secuencia de aminoácidos progenitores y la distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

Dopaje en L19-G35

L19

90% N

N20

95% T

N21

Constante

I22

Constante

G23

95% A

A24

90% S,T

D25

93% S,T,R

G26

95% A

A27

90% S,T

W28

<80% R,Y

V29

Constante

S30

93% T,N

G31

95% A

A32

95% V

D33

80% R,K,H

S34

90% N

G35

Constante

5 Tabla 2 Posición: 19 20 21 22 23 24 25 26 27 sec. A.a.: L N N I G A D G A cebador: 12T A3T AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT sec. t. CTG AAT AAC ATC GGG GCG GAC GGT GCT salvaje:

Pos. (cont.): 28 29 30 31 32 33 34 35

A.a. (cont): W V S G A D S G cebador 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC sec. t. salvaje: TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCT GGC

[0158] Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1: A10,C90

2: A6;T94

10 3: A95,C5

4: G95, C5

5: G91,A3,T3,C3

6: G95, A3, C2

7: G3;A95, C2

15 8: G92, A4, T4 9:A3,T97 10:G95,T5 11:G3;A97 12:G95,A2,C3

20 13:T5,C95

14: G88, A8, C4 15:G7,A93 16:G4,C96 17:G4,A96

25 18:G95,A2,C3

Cebador directo (SEC ID NO: 6): [0159] FAMGII '5-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC 12T A3T AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC ATT GTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC-3'

30 Cebador inverso (SEC ID NO: 7): [0160] RAMG1: 5'-GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3'

Tabla 3

Dopaje en región A353-V374 :

A353

<80% D, E, Q, N, Y

L354

90% Q, E

Y355

90% N,Q

S356

90% T,D,N

G357

80% P,A,S,T

A358

93% S

A359

90% S,T,N

T360

90% R,K

G361

85% A,S,T

T362

90% S

Y363

Constante

S364

93% D

S365

93% N,Q,K

S366

93% P,D

S367

Constante

S368

93% D,N,T

T369

93% Q, E

Y370

Constante

S371

93% N

S372

93% N,T

I373

Constant

V374

93% N,Y,H

[0161] La cadena de oligonucleótidos dopada resultante es mostrada en la tabla 4 como hebra codificante: con la secuencia de cebador, secuencia de nucleótidos de tipo salvaje, la secuencia de aminoácidos progenitores y la

5 distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

Tabla 4 Posición: 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 sec. A.a.: A L Y S D A A T G T cebador: 123 45A 6AC 78C 310T 11CT 1213T 1415A 1617C 18CC sec. t. GCA CTG TAC AGC GAT GCT GCT ACT GGC ACC salvaje:

Pos. (cont.): 363 364 365 366 367 368 369 370

A.a. (cont): Y S S S S S T Y cebador: TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T sec. t.

TAC TCT TCG TCC AGT TCG ACT TAT

salvaje: Pos. (cont.): 371 372 373 374

A.a. (cont): S S I V cebador (cont.): A16T 2930T ATT 313233 sec. t. salvaje (cont.): AGT AGC ATT GTA

[0162] Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1: G91,A3,T3,C3

10 2: A13,C87 3:A40,T60

4: G3,A3,C94

5: A6,T94

6: G4, A4;T92

15 7: G2,A96,C2

8: G93, A3.5, C3.5

9: G87, A8, C5

5

15

25

35

45

55

10: A84;C16 11:G93,T7 12:G92,A5,T3 13:A3,C97 14:G3,A97 15:G2,A2,T4,C92 16:G93,A7 17:G93,C7 18:A90,T10 19:G4,A96 20:G95,A5

21: G96,A4 22:G3,C97 23:G2,A1,T95,C2 24:A3,C97 25:G95,A3,C2 26:G2,A96,C2 27:A5,C95 28:A95,T5 29:G2,A98 30:G94,A4,C2

31: G94, A3, T1, C2 32:A4,T96 33:A20,C80

Cebador: FAMGIV (SEC ID NO: 8)

imagen1

Cebador RAMGVI (SEC ID NO: 9) [0164] 5'-ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3'

Mutagénesis aleatoria [0165] Los oligonucleótidos adicionados que aparecen en la Tabla 2 y 3 (que por término común es designado FAMG) y los cebadores inversos RAMG para la región L19-G35 y los cebadores específicos de la SEC ID NO: 2 que cubren el terminal N (FG2: 5'- CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3' (SEC ID NO: 10) y el terminal C (RG2: 5'- CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT (SEC ID NO: 11) se utilizan para generar fragmentos de biblioteca de PCR por el método de extensión de superposición (Horton et al., Gene, 77 (1989), págs. 61-68) con una superposición de 21 pares de bases. El plásmido pAMGY es un patrón para la reacción en cadena de la polimerasa. Los fragmentos de la PCR son clonados por recombinación homóloga en el vector transportador pAMGY de E. coli/levadura (ver Materiales y Métodos).

Selección [0166] La biblioteca fue seleccionada en los ensayos de filtro de termoestabilidad usando un filtro Protran e incubando a 67-69°C, como se describe en el apartado de "Materiales y Métodos" arriba

EJEMPLO 3

Construcción, por redistribución de PCR adicionada con óligos de ADN, de variantes de AMG de A. niger con termoestabilidad mejorada en comparación con la enzima progenitora. [0167] El método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue usado para preparar fragmentos de ADN llevando el gen AMG y las regiones flanqueantes. Aproximadamente 10 ug de ADN fue digerido con ADNsa, y realizado sobre un 2 % de gel de agarosa. Se purificaron fragmentos de 50-150 bp del gel. Aproximadamente 1 ug de fragmentos purificados fueron mezclados con un exceso molar de 5-15 veces de óligos llevando las mutaciones deseadas. Los óligos fueron del siguiente tipo (para la construcción de Hklib1, Hklib2, Hklib3 etc., respectivamente):

Hklib1: Hk1-T2X:

[0168] 5'-ATGTGATTTCCAAGCGCGCGVNNTTGGATTCATGGTTGAGCAA Hk1-N9X:

[0169] 5'-CCTTGGATTCATGGTTGAGCVNNGAAGCGACCGTGGCTCGTAC Hk1-A11X: [0170] 5'-ATTCATGGTTGAGCAACGAAVNNACCGTGGCTCGTACTGCCAT Hk1-L66X:

[0171] 5'-TCCTCAAGACCCTCGTCGATVNNTTCCGAAATGGAGATACCAG Hk1-S386X:

[0172] 5'-CTTTCGCCGATGGCTTCGTCVNNATTGTGGAAACTCACGCCGC Hk1-E389X:

[0173] 5'-ATGGCTTCGTCTCTATTGTGVNNACTCACGCCGCAAGCAACGG Hk1-T390X:

[0174] 5'-GCTTCGTCTCTATTGTGGAAVNNCACGCCGCAAGCAACGGCTC Hkl-A393X:

[0175] 5'-CTATTGTGGAAACTCACGCCVNNAGCAACGGCTCCATGTCCGA Hkl-S394X:

[0176] 5'-TTGTGGAAACTCACGCCGCAVNNAACGGCTCCATGTCCGAGCA Hk1-N395X:

[0177] 5'-TGGAAACTCACGCCGCAAGCVNNGGCTCCATGTCCGAGCAATA Hk1-G396X:

[0178] 5'-AAACTCACGCCGCAAGCAACVNNTCCATGTCCGAGCAATACGA Hk1-K404X:

[0179] 5'-CCATGTCCGAGCAATACGACVNNTCTGATGGCGAGCAGCTTTC Hk1-D406X:

[0180] 5'-CCGAGCAATACGACAAGTCTVNNGGCGAGCAGCTTTCCGCTCG Hk1-E408X:

[0181] 5'-AATACGACAAGTCTGATGGCVNNCAGCTTTCCGCTCGCGACCT Hk1-L410X:

[0182] 5'-ACAAGTCTGATGGCGAGCAGVNNTCCGCTCGCGACCTGACCT Hk1-L423X:

[0183] 5'-CCTGGTCTTATGCTGCTCTGVNNACCGCCAACAACCGTCGTAA Hk1-N426X:

[0184] 5'-ATGCTGCTCTGCTGACCGCCVNNAACCGTCGTAACTCCGTCGTG Hk1-N427X:

[0185] 5'-CTGCTCTGCTGACCGCCAACVNNCGTCGTAACTCCGTCGTGCCT Hk1-Y402X:

[0186] 5'-ACGGCTCCATGTCCGAGCAANNCGACAAGTCTGATGGCGAGCAGCT

Hklib2: Hk2-L234X-SENTIDO:

[0187] 5'-CTGGACCGGCAGCTTCATTNNKGCCAACTTCGATAGCAGCC Hk2-A235S-ANTISENTIDO:

[0188] 5 '-GAACGGCTGCTATCGAAGTTAGACAGAATGAAGCTGCCGGTC Hk2-F237X-SENTIDO:

[0189] 5-CAGCTTCATTCTGGCCAACNATGATAGCAGCCGTTCCGGCA Hk2-D238T-ANTISENTIDO:

[0190] 5'-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGTGAAGTTGGCCAGAATGAAGC Hk2-D238S-ANTISENTIDO:

[0191] 5'-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGAGAAGTTGGCCAGAATGAAGC Hk2-S239X-SENTIDO:

[0192] 5'-TCATTCTGGCCAACTTCGATNNCAGCCGTTCCGGCAAGGACG Hk2-S240G-ANTISENTIDO:

[0193] 5'-TTGCGTCCTTGCCGGAACGACCGCTATCGAAGTTGGCCAGAA Hk2-S242X-ANTISENTIDO:

[0194] 5'-GGGTGTTTGCGTCCTTGCCAKNACGGCTGCTATCGAAGTTG Hk2-G243X-ANTISENTIDO:

[0195] 5'-GGAGGGTGTTTGCGTCCTTAKNGGAACGGCTGCTATCGAA Hk2-K244R-SENTIDO:

[0196] 5'-CGATAGCAGCCGTTCCGGCAGAGACGCAAACACCCTCCTGG Hk2-T310V-ANTISENTIDO:

[0197] 5'-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAACGTCCTCAGGGTACCGACCC Hk2-T310S-ANTISENTIDO:

[0198] 5'-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAGAGTCCTCAGGGTACCGACCC Hk2-Y311N-SENTIDO:

[0199] 5'-TCGGTACCCTGAGGACACGAATTACAACGGCAACCCGTGGT Hk2-Y312Q-ANTISENTIDO:

[0200] 5'-GGAACCACGGGTTGCCGTTTTGGTACGTGTCCTCAGGGTAC Hk2-Y312N-ANTISENTIDO:

[0201] 5'-GGAACCACGGGTTGCCGTTATTGTACGTGTCCTCAGGGTAC Hk2-N313T-SENTIDO:

[0202] 5'-CCCTGAGGACACGTACTACACTGGCAACCCGTGGTTCCTGT Hk2-N313S-SENTIDO:

[0203] 5'-CCCTGAGGACACGTACTACTCTGGCAACCCGTGGTTCCTGT Hk2-N313G-SENTIDO:

[0204] 5'-CCCTGAGGACACGTACTACGGTGGCAACCCGTGGTTCCTGT Hk2-N315Q-ANTISENTIDO:

[0205] 5'-AGGTGCACAGGAACCACGGTTGGCCGTTGTAGTACGTGTCC Hk2-N315E-ANTISENTIDO:

[0206] 5'-AGGTGCACAGGAACCACGGTTCGCCGTTGTAGTACGTGTCC Hk2-N315R-ANTISENTIDO:

[0207] 5'-AGGTGCACAGGAACCACGGTCTGCCGTTGTAGTACGTGTCC Hk2-F318Y-ANTISENTIDO:

[0208] 5'-CGGCAGCCAAGGTGCACAGATACCACGGGTTGCCGTTGTAG Hk2-Q409P-SENTIDO:

[0209] 5'-CGACAAGTCTGATGGCGAGCCACTTTCCGCTCGCGACCTGA Hklib3: Hk3-D336X-SENTIDO:

[0210] 5'-CGATGCTCTATACCAGTGGNNKAAGCAGGGGTCGTTGGAGG Hk3-K337X-SENTIDO:

[0211] 5'-TGCTCTATACCAGTGGGACNNKCAGGGGTCGTTGGAGGTCA Hk3-Q338X-ANTISENTIDO :

[0212] 5'-CTGTGACCTCCAACGACCCGNNCTTGTCCCACTGGTATAGA

Hk3-G339X-SENTIDO:

[0213] 5'-ATACCAGTGGGACAAGCAGNCUTCGTTGGAGGTCACAGATG Hk3-S340X'-ANTISENTIDO: [0214] 5'-ACACATCTGTGACCTCCAAANTCCCCTGCTTGTCCCACTGG

Hk3-S340X"-ANTISENTIDO:

[0215] 5'-ACACATCTGTGACCTCCAAANCCCCCTGCTTGTCCCACTGG Hk3-L341X-SENTIDO: [0216] 5'-GTGGGACAAGCAGGGGTCGNUUGAGGTCACAGATGTGTCGC

Hk3-K352Q-SENTIDO:

[0217] 5'-TGTGTCGCTGGACTTCTTCCAAGCACTGTACAGCGATGCTG Hk3-K352R-SENTIDO: [0218] 5'-TGTGTCGCTGGACTTCTTCAGAGCACTGTACAGCGATGCTG

Hk3-A353D-ANTISENTIDO:

[0219] 5'-TAGCAGCATCGCTGTACAGATCCTTGAAGAAGTCCAGCGAC Hk3-A353S-ANTISENTIDO: [0220] 5'-TAGCAGCATCGCTGTACAGAGACTTGAAGAAGTCCAGCGAC

Hk3-S356P-SENTIDO:

[0221] 5'-ACTTCTTCAAGGCACTGTACCCAGATGCTGCTACTGGCACCT Hk3-S356N-SENTIDO: [0222] 5'-ACTTCTTCAAGGCACTGTACAAUGATGCTGCTACTGGCACCTA

Hk3-S356D-SENTIDO:

[0223] 5'-ACTTCTTCAAGGCACTGTACGAUGATGCTGCTACTGGCACCTA Hk3-D357S-ANTISENTIDO: [0224] 5'-GAGTAGGTGCCAGTAGCAGCAGAGCTGTACAGTGCCTTGAAGA

Hk3-A359S-SENTIDO:

[0225] 5'-GGCACTGTACAGCGATGCTTCTACTGGCACCTACTCTTCGT Hk3-T360V-ANTISENTIDO: [0226] 5'-TGGACGAAGAGTAGGTGCCAACAGCAGCATCGCTGTACAGT

Hk3-G361X-SENTIDO:

[0227] 5'-TGTACAGCGATGCTGCTACTNCTACCTACTCTTCGTCCAGTTC Hk3-T362R-ANTISENTIDO: [0228] 5'-GTCGAACTGGACGAAGAGTATCTGCCAGTAGCAGCATCGCTG

Hk3-S364X-SENTIDO:

[0229] 5'-TGCTGCTACTGGCACCTACNNKTCGTCCAGTTCGACTTATAG Hk3-S65X-SENTIDO: [0230] 5'-TGCTACTGGCACCTACTCTNNKTCCAGTTCGACTTATAGTAG

Hk3-S366T-ANTISENTIDO:

[0231] 5'-ATGCTACTATAAGTCGAACTAGTCGAAGAGTAGGTGCCAGTA Hk3-S368X-ANTISENTIDO: [0232] 5'-TCTACAATGCTACTATAAGTAGNACTGGACGAAGAGTAGGTG

Hk3-T369X-SENTIDO:

[0233] 5 '-CTACTCTTCGTCCAGTTCGNNKTATAGTAGCATTGTAGATGCC Hk3-S371X-ANTISENTIDO: [0234] 5'-TTCACGGCATCTACAATGCTATNATAAGTCGAACTGGACGAAG

Hk3-S372X-SENTIDO:

[0235] 5'-CGTCCAGTTCGACTTATAGTNNTATTGTAGATGCCGTGAAGAC

5 [0236] A la mezcla de ADN tratado con ADNsa y óligos se añadió nucleótidos, tampón PCR y polimerasa Taq/Pwo. Se realizó una reacción de ensamblaje PCR usando primero 94ºC durante 2 min., luego 35-40 ciclos con los siguientes tiempos de incubación: 94°C; 30 seg.; 45°C; 30 seg.; 72°C; 60 seg; luego finalmente 72°C durante 5 min. Se realizó una reacción de amplificación PCR con 1 uL de la reacción de ensamblaje como patrón y añadiendo cebadores que anelan para las regiones flanqueantes del gen AMG. Parámetros: primero 94°C durante 2 min., luego 35-40 ciclos con los

10 siguientes tiempos de incubación: 94°C; 30 seg.; 55°C; 30 seg.; 72 °C; 90 seg; luego finalmente 72°C durante 10 min.

[0237] El producto resultante de la PCR fue purificado de un 1% de gel de agarosa, mezclado con vector linealizado y transformado en células de levadura competentes del modo descrito anteriormente.

15 EJEMPLO 4 (Referencial) Actividad específica [0238] Se construyeron variantes de AMG G2 del modo descrito anteriormente en el ejemplo 1. Se midió la actividad específica como Kcat sobre muestras purificadas a pH 4,3, 37°C, usando maltosa y maltohepatosa como sustrato como se describe en el apartado de "Materiales y Métodos" arriba. También se midió la actividad específica como AGU/mg a

20 pH 4,3, 37°C, usando maltosa como sustrato como se describe en el apartado de "Materiales y Métodos" arriba.

Kcat (sec.-1)

Variante

Maltosa Maltoheptaosa

AMG G2 (tipo salvaje)

6,0 38

N110T

9,7 27,8

V111P

12,0 43,2

S119P

6,2 44,0

G127A

21,0 40,0

G207N

30,5 36,3

Variante

AGU/mg

AMG G2 (tipo salvaje)

1,8

N110T

3,5

V111P

3,1

S119P

2,1

G127A

5,8

G207N

5,7

L3N

2,3

S56A

2,6

A102*

2,5

D403S

2,2

I18V+T51S+S56A+V59T+L60A

3,3

S119P+Y402F

2,7

S119P+I189T+Y223F+F227Y+Y402F

3,0

EJEMPLO 5 (Referencial)

25 Termoestabilidad a 70°C [0239] Se construyó una variante de AMG G2 S119P usando el procedimiento descrito en el ejemplo 1.

[0240] La termoestabilidad fue determinada como T1/2 usando el Método I, y como % de actividad residual tras la incubación durante 30 minutos en 50 mM de NaOAc, pH 4,5, 70°C; 0,2 AGU/ml, como se describe en el apartado de 30 "Materiales y Métodos" arriba. El resultado de las pruebas está relacionado en la tabla abajo y en comparación con AMG G2 de A. niger de tipo salvaje.

A. niger AMG (Enzima)

Actividad Residual (%) T1/2 (min.)

variante S119P

22 17

tipo salvaje (SEQ ID NO: 2)

13 8

EJEMPLO 6

Termoestabilidad a 68°C

5 [0241] Se construyeron variantes de AMG G2 usando el procedimiento descrito en el ejemplo 3, salvo las variantes nos. 1 y 2 en la tabla abajo, que fueron preparadas por redistribución como se describe en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.). La termoestabilidad fue determinada como T1/2 usando el método I a 68°C como se describe en el apartado de "Materiales y Métodos" y en comparación con AMG G2 de A. niger de tipo salvaje según las mismas condiciones. Se realizó la evaluación de las variantes en el caldo de cultivo después de filtrar los sobrenadantes.

10

Variante

T1/2 (min) T1/2 A. niger AMG G2 (tipo salvaje) (min)

1*

A246T+T72I 11,3 8,5

2*

G447S+S119P 11,4 7,9

3*

E408R+A425T+S465P+T494A 8,6 8,1

4

E408R+S386N 12,6 8,9

5*

T2P 9,3 8,5

6

T2Q+A11P+S394R 10,7 8,5

7*

T2H 9,5 8,9

8

A11E+E408R 12,7 9,3

9

T2M+N9A+T390R+D406N+L410R 10,7 8,5

10

A393R 17,7 8,4

11

T2R+S386R+A393R 14,1 8,4

12

A393R+L410R 14,7 7,9

13

A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G 11,7 8,5

14*

T2K+S30P+N427M+S444G+V470M 11,4 8,4

* no una variante de la invención

Termoestabilidad a 70°C en muestras purificadas.

Enzima

T1/2 (min)

15

AMG G2 (wild type) 7,4

16

T2E+T379A+S386K+A393R 11,6

17

E408R+S386N 10,2

18

T2Q+A11P+S394R 9,8

19

A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G 14,1

20

A393R 14,6

21

T2R+S386R+A393R 14,1

22

A393R+L410R 12,9

23

Y402F 10,1

EJEMPLO 7

15 Termoestabilidad a 68°C [0242] Se construyeron variantes de AMG G2 por redistribución usando el procedimiento descrito en el ejemplo 3 seguido de redistribución de variantes positivas.

[0243] La termoestabilidad fue determinada como T1/2 usando el Método I a 68°C como se describe en el apartado de "Materiales y Métodos" y en comparación con el AMG G2 de A. niger de tipo salvaje bajo las mismas condiciones. Se realizó la evaluación de las variantes en el caldo de cultivo después de filtrar los sobrenadantes.

Variante

T1/2 (min) T1/2 A. niger AMG G2 (tipo salvaje) (min)

24

PLASDi+V59A+A393R+T490A 27,2 6,8

5 i = Extensión del N-terminal

EJEMPLO 8 (Referencial)

Termoestabilidad a 68°C

10 [0244] Se construyeron variantes de AMG G2 usando el procedimiento descrito en el ejemplo 3. La termoestabilidad fue determinada como T1/2 usando el Método I a 68°C como se describe en el apartado de "Materiales y Métodos" y en comparación con el AMG G2 de A. niger de tipo salvaje bajo las mismas condiciones. Se realizó la evaluación de las variantes en el caldo de cultivo después de filtrar los sobrenadantes.

Variante

T1/2 (min) T1/2 A. niger AMG G2 tipo salvaje (min)

25

D357S+T360V+S371H 6,6 5,9

26

N313G+F318Y 8,9 5,9

27

S356P+S366T 7,3 5,8

28

S340G+D357S+T360V+S386P 7,2 5,8

15

EJEMPLO 9

Termoestabilidad a 70°C [0245] Se construyeron las variantes de AMG G2 usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 y se evaluó como muestras semipurificadas (filtración de caldo de cultivo seguido de desalación en un columna G-25).

20 [0246] La termoestabilidad fue determinada como % de actividad residual usando el Método I en 50 mM de NaOAc, pH 4,5, 70°C, como se describe en el apartado de "Materiales y Métodos" arriba. El resultado de la prueba está relacionado en la tabla abajo y en comparación con el AMG G2 de A. niger de tipo salvaje.

Enzima

T1/2 (min)

29

AMG G2 (tipo salvaje) 7

30

Y402F+S411V 60

31

S119P+Y402F+S411V 115

32

S119P+Y312Q+Y402F+T416H 50

25

EJEMPLO 10

Termoestabilidad a 70°C en presencia de 30% glucosa

[0247] Se construyeron variantes de AMG G2 usando el procedimiento descrito en el ejemplo 3.

30 [0248] La termoestabilidad fue determinada como T1/2 usando el Método II a 70°C como se describe en el apartado de "Materiales y Métodos" y en comparación con el AMG G2 de A. niger de tipo salvaje bajo las mismas condiciones.

Enzima

T1/2 (hr)

33

AMG G2 (tipo salvaje) 1,5

34

Y402F 2,5

35

A393R 4,0

36

T2R+S386R+A393R 2,0

37

PLASD(N-terminal)+V59A+A393R+T490A 16,0

EJEMPLO 11

Rendimiento de sacarificación de variantes de AMG S119P+Y402F+S411V y PLASD(Nterminal)+V59A+A393R+T490A, respectivamente. [0249] Se evaluó el rendimiento de sacarificación de las variantes de AMG S119P+Y402F+S411V y PLASD(N

5 terminal)+V59A+A393R+T490A, respectivamente, ambos teniendo termoestabilidad mejorada a 70°C como se describe abajo.

[0250] La enzima de referencia es el AMG G2 de A. niger de tipo salvaje. La sacarificación es realizada bajo las condiciones siguientes:

10 Substrato 10 DE Maltodextrina, aprox. 30% DS (p/p)

Temperatura 70°C

pH inicial

4,3 (a 70°C)

Dosificación de Enzima 0,24 AGU/g DS

Sacarificación [0251] Se hace el sustrato para la sacarificación disolviendo maltodextrina (obtenida de maíz común) en agua purificada con un sistema Milli-Q en ebullición y ajustando la materia seca a aproximadamente 30% (p/p). El pH es ajustado a 4,3.

15 Partes alícuotas del sustrato correspondiente a 15 g de materia seca son transferidas a frascos de vidrio con tapón azul de 50 ml y colocados en un baño de agua con agitación. Se añaden las enzimas y se reajusta el pH si es necesario. El experimento es realizado por duplicado. Se toman muestras periódicamente y se analizan en HPLC para determinar la composición del carbohidrato.

20 LISTADO DE SECUENCIAS [0252]

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i) SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: NOVO NORDISK A/S 25 (B) CALLE: Novo Allé

(C)

CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd

(E)

PAÍS: Dinamarca

(F)

CÓDIGO POSTAL (Identificación de Zona Postal): DK-2880

(G)

TELÉFONO: +45 4444 8888 30 (H) TELEFAX: +45 4449 3256

(ii) TÍTULO DE INVENCIÓN: Variantes de glucoamilasa

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 81

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR: 35 (A) TIPO DE MEDIO: disquete

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

40 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1605 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: única45 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADNc"

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(B)

CEPA: Aspergillus Niger50 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sig_peptide

(B)

UBICACIÓN: 1..72

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide 55 (B) LOCALIZACIÓN:73..1602

(IX)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN:1..1602

(XI)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 534 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: 10

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ix)

CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: misc-feature:

(B)

OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador 7258"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3: gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac ___20

imagen2

imagen2

imagen2

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imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

15 2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 68 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: única20 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature:

(B)

OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador 21401"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de bases 30 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature:

(B)

OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador 107581"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: gcaacgaagc gcccgtggct cgtac 25

imagen3

5 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 109 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: misc-feature:

(B) OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador FAMGII"15 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 30, 33, 42, 44, 47, 48, 51, 53, 56, 57, 58, 62,63,66, 69,71,72,73, 74, 75 (D): OTRAS INFORMACIONES: /Note=

1: A10,C90

2: A6;T94

3: A95,C5 4:G95,C5 5:G91,A3,T3,C3 6:G95,A3,C2

25 7:G3,A95,C2 8:G92,A4,T4

9: A3,T97 10:G95,T5

11: G3,A97

12: G95,A2,C3

13: T5,C95

14: G88,A8,C4 15:G7,A93 16:G4,C96

35 17:G4,A96 18:G95,A2,C3

imagen4

2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 28 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 45 (C) TIPO DE CADENA: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature:

(B)

OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador RAMG1"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7: GATGGCAGTA CGAGCCACGG TCGCTTCG 28

2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:55 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 110 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature:

(B)

OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador FAMGIV"

(ix)

CARACTERÍSTICA:

5 (A) NOMBRE/CLAVE: misc-feature LOCALIZACIÓN: 22, 23, 24, 25, 26, 28, 31, 32, 34, 35; 37, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 55, 56, 59, 60; 61,62,67,68,70,71,74,77,79,80,85,86,87 (D): OTRAS INFORMACIONES: /Note=

1:G91,A3,T3,C3 2:A13,C87 3:A40,T60 4:G3,A3,C94 5:A6,T94

15 6:G4,A4,T92 7:G2,A96,C2 8:G93,A3.5,C3.5 9:G87,A8,C5 10:A84,C16 11:G93,T7 12:G92,A5,T3 13:A3,C97 14:G3,A97 15:G2,A2,T4,C92

25 16:G93,A7 17:G93,C7 18:A90,T10 19:G4,A96 20:G95,A5 21:G96,A4 22:G3,C97 23:G2,A1,T95,C2 24:A3,C97 25:G95,A3,C2

35 26:G2,A96,C2 27:A5,C95 28:A95,T5 29:G2,A98 30:G94,A4,C2 31:G94,A3,T1,C2 32:A4,T96 33:A20,C80

imagen5

2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature:

(B)

OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador RAMGVI"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: CTTGAAGAAG TCCAGCGACA C 21

2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature

(B)

OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador FG2"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10: CATCCCCAGG ATCCTTACTC AGCAATG 27

2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature:

(B)

OTRAS INFORMACIONES: /desc = "Cebador RG2"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11: CTCAAACGAC TCACCAGCCT CTAGAGT

<210> 12

<211> 2602

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<220>

<221> sig_peptide

<222> (270) ... (323)

<221> mat_peptide

<222> (342) ...(2438)

<221> intrón

<222> (484) ...(558)

<221> intrón

<222> (846) ... (900)

<221> intrón

<222> (998) ...(1058)

<221> intrón

<222> (1697) ... (1754)

<400> 12

imagen2

imagen2

<210> SEC ID NO:13

<211> LONGITUD: 640

<212> TIPO: PRT

<213> ORGANISMO: Aspergillus niger

<400> SEC ID NO: 13

imagen2

imagen2

imagen2

<210> SEC ID NO:14

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador HK1-T2X

<400> SEC ID NO:14 atgtgatttc caagcgcgcg vnnttggatt catggttgag caa 43

<210> SEC ID NO:15

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-N9X

<400> SEC ID NO:15 ccttggattc atggttgagc vnngaagcga ccgtggctcg tac 43

<210> SEC ID NO:16

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-A11X

<400> SEC ID NO:16 attcatggtt gagcaacgaa vnnaccgtgg ctcgtactgc cat 43

<210> SEC ID NO:17

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-L66X

<400> SEC ID NO:17 tcctcaagac cctcgtcgat vnnttccgaa atggagatac cag 43

<210> SEC ID NO:18

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-S386X

<400> SEC ID NO:18 ctttcgccga tggcttcgtc vnnattgtgg aaactcacgc cgc 43

<210> SEC ID NO:19

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-E389X

<400> SEC ID NO:19 atggcttcgt ctctattgtg vnnactcacg ccgcaagcaa cgg 43

<210> SEC ID NO:20

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-T390X

<400> SEC ID NO:20 GCTTCGTCTC TATTGTGGAA VNNCACGCCG CAAGCAACGG CTC 43

<210> SEC ID NO:21

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-A393X

<400> SEC ID NO:21 ctattgtgga aactcacgcc vnnagcaacg gctccatgtc cga 43

<210> SEC ID NO:22

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-S394X

<400> SEC ID NO:22 ttgtggaaac tcacgccgca vnnaacggct ccatgtccga gca 43

<210> SEC ID NO:23

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-N395X

<400> SEC ID NO:23 tggaaactca cgccgcaagc vnnggctcca tgtccgagca ata 43

<210> SEC ID NO:24

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-G296X

<400> SEC ID NO:24 aaactcacgc cgcaagcaac vnntccatgt ccgagcaata cga 43

<210> SEC ID NO:25

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-K404X

<400> SEC ID NO:25 ccatgtccga gcaatacgac vnntctgatg gcgagcagct ttc 43

<210> SEC ID NO:26

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-D406X

<400> SEC ID NO:26 ccgagcaata cgacaagtct vnnggcgagc agctttccgc tcg 43

<210> SEC ID NO:27

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-E408X

<400> SEC ID NO:27 aatacgacaa gtctgatggc vnncagcttt ccgctcgcga cct 43

<210> SEC ID NO:28

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-L410X

<400> SEC ID NO:28 acaagtctga tggcgagcag vnntccgctc gcgacctgac ct 42

<210> SEC ID NO:29

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-L423X

<400> SEC ID NO:29 cctggtctta tgctgctctg vnnaccgcca acaaccgtcg taa 43

<210> SEC ID NO: 30

<211> LONGITUD: 44

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-N426X

<400> SEC ID NO:30 atgctgctct gctgaccgcc vnnaaccgtc gtaactccgt cgtg 44

<210> SEC ID NO:31

<211> LONGITUD: 44

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-N427X

<400> SEC ID NO:31 CTGCTCTGCT GACCGCCAAC VNNCGTCGTA ACTCCGTCGT GCCT

<210> SEC ID NO:32

<211> LONGITUD: 46

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk1-Y402X

<400> SEC ID NO:32 ACGGCTCCAT GTCCGAGCAA NNCGACAAGT CTGATGGCGA GCAGCT 46

<210> SEC ID NO:33

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-L234X sentido

<400> SEC ID NO:33 ctggaccggc agcttcattn nkgccaactt cgatagcagc c 41

<210> SEC ID NO:34

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-A235S antisentido

<400> SEC ID NO:34 gaacggctgc tatcgaagtt agacagaatg aagctgccgg tc 42

<210> SEC ID NO:35

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-NF237X sentido

<400> SEC ID NO:35 cagcttcatt ctggccaacn atgatagcag ccgttccggc a 41

<210> SEC ID NO: 36

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-D238T antisentido

<400> SEC ID NO:36 ccttgccgga acggctgcta gtgaagttgg ccagaatgaa gc 42

<210> SEC ID NO:37

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-D238S antisentido

<400> SEC ID NO:37 ccttgccgga acggctgcta gagaagttgg ccagaatgaa gc 42

<210> SEC ID NO:38

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-S239X sentido

<400> SEC ID NO:38 tcattctggc caacttcgat nncagccgtt ccggcaagga cg 42

<210> SEC ID NO:39

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-S240G antisentido

<400> SEC ID NO:39 ttgcgtcctt gccggaacga ccgctatcga agttggccag aa 42

<210> SEC ID NO: 40

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-S242X antisentido

<400> SEC ID NO:40 gggtgtttgc gtccttgcca knacggctgc tatcgaagtt g 41

<210> SEC ID NO:41

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-G243X antisentido

<400> SEC ID NO:41 ggagggtgtt tgcgtcctta knggaacggc tgctatcgaa g 41

<210> SEC ID NO:42

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-K244R sentido

<400> SEC ID NO:42 cgatagcagc cgttccggca gagacgcaaa caccctcctg g 41

<210> SEC ID NO:43

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-T310V antisentido

<400> SEC ID NO:43 acgggttgcc gttgtagtaa acgtcctcag ggtaccgacc c 41

<210> SEC ID NO:44

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-T310S antisentido

<400> SEC ID NO:44 acgggttgcc gttgtagtaa gagtcctcag ggtaccgacc c 41

<210> SEC ID NO:45

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-Y311N sentido

<400> SEC ID NO:45 tcggtaccct gaggacacga attacaacgg caacccgtgg t 41

<210> SEC ID NO:46

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-Y312Q antisentido

<400> SEC ID NO:46 ggaaccacgg gttgccgttt tggtacgtgt cctcagggta c 41

<210> SEC ID NO:47.

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-Y312N antisentido

<400> SEC ID NO:47 ggaaccacgg gttgccgtta ttgtacgtgt cctcagggta c 41

<210> SEC ID NO:48

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-N313T sentido

<400> SEC ID NO:48 ccctgaggac acgtactaca ctggcaaccc gtggttcctg t 41

<210> SEC ID NO:49

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-N313S sentido

<400> SEC ID NO:49 ccctgaggac acgtactact ctggcaaccc gtggttcctg t 41

<210> SEC ID NO:50

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-N313G sentido

<400> SEC ID NO:50 ccctgaggac acgtactacg gtggcaaccc gtggttcctg t

<210> SEC ID NO:51

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-N315Q antisentido

<400> SEC ID NO: 51 aggtgcacag gaaccacggt tggccgttgt agtacgtgtc c 41

<210> SEC ID NO:52

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-N315E antisentido

<400> SEC ID NO: 52 aggtgcacag gaaccacggt tcgccgttgt agtacgtgtc c

<210> SEC ID NO:53

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-N315R antisentido

<400> SEC ID NO:53 aggtgcacag gaaccacggt ctgccgttgt agtacgtgtc c 41

<210> SEC ID NO:54

<211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-F318Y antisentido

<400> SEC ID NO:54 cggcagccaa ggtgcacaga taccacgggt tgccgttgta g 41

<210> SEC ID NO:55

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk2-Q409P sentido

<400> SEC ID NO:55 cgacaagtct gatggcgagc cactttccgc tcgcgacctg a 41

<210> SEC ID NO:56

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-D336X sentido

<400> SEC ID NO:56 cgatgctcta taccagtggn nkaagcaggg gtcgttggag g 41

<210> SEC ID NO:57

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-K337X sentido

<400> SEC ID NO:57 tgctctatac cagtgggacn nkcaggggtc gttggaggtc a 41

<210> SEC ID NO:58

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-Q338X antisentido

<400> SEC ID NO:58 ctgtgacctc caacgacccg nncttgtccc actggtatag a 41

<210> SEC ID NO:59

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA: <223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-G339X sentido

<400> SEC ID NO:59 ataccagtgg gacaagcagn cutcgttgga ggtcacagat g 41

<210> SEC ID NO:60

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S34OX antisentido

<400> SEC ID NO:60 acacatctgt gacctccaaa ntcccctgct tgtcccactg g 41

<210> SEC ID NO:61

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S340C antisentido

<400> SEC ID NO:61 acacatctgt gacctccaaa nccccctgct tgtcccactg g 41

<210> SEC ID NO:62

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-L341X sentido

<400> SEC ID NO:62 gtgggacaag caggggtcgn uugaggtcac agatgtgtcg c 41

<210> SEC ID NO:63

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-K352Q sentido

<400> SEC ID NO:63 tgtgtcgctg gacttcttcc aagcactgta cagcgatgct g 41

<210> SEC ID NO:64

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-K352R sentido

<400> SEC ID NO:64 tgtgtcgctg gacttcttca gagcactgta cagcgatgct g 41

<210> SEC ID NO:65

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA: <223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-A352D antisentido

<400> SEC ID NO:65 tagcagcatc gctgtacaga tccttgaaga agtccagcga c 41

<210> SEC ID NO:66

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-A353S antisentido

<400> SEC ID NO:66 tagcagcatc gctgtacaga gacttgaaga agtccagcga c 41

<210> SEC ID NO:67

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S356P sentido

<400> SEC ID NO:67 acttcttcaag gcactgtacc cagatgctgc tactggcacc t 41

<210> SEC ID NO:68

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S356N sentido

<400> SEC ID NO:68 acttcttcaa ggcactgtac aaugatgctg ctactggcac cta 43

<210> SEC ID NO:69

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S356X sentido

<400> SEC ID NO:69 acttcttcaa ggcactgtac gaugatgctg ctactggcac cta 43

<210> SEC ID NO:70

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-D357S antisentido

<400> SEC ID NO:70 gagtaggtgc cagtagcagc agagctgtac agtgccttga aga 43

<210> SEC ID NO:71

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA: <223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-A359S sentido

<400> SEC ID NO: 71 ggcactgtac agcgatgctt ctactggcac ctactcttcg t

<210> SEC ID NO:72

<211> LONGITUD: 41

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-T360V antisentido

<400> SEC ID NO:72 tggacgaaga gtaggtgcca acagcagcat cgctgtacag t 41

<210> SEC ID NO:73

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-G361X sentido

<400> SEC ID NO:73 tgtacagcga tgctgctact nctacctact cttcgtccag ttc 43

<210> SEC ID NO:74

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-T362R antisentido

<400> SEC ID NO:74 gtcgaactgg acgaagagta tctgccagta gcagcatcgc tg 42

<210> SEC ID NO:75

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S364X sentido

<400> SEC ID NO:75 tgctgctact ggcacctacn nktcgtccag ttcgacttat ag

<210> SEC ID NO:76

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S365X sentido

<400> SEC ID NO:76 tgctactggc acctactctn nktccagttc gacttatagt ag

<210> SEC ID NO:77

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA: <223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S366T antisentido

<400> SEC ID NO: 77 atgctactat aagtcgaact agtcgaagag taggtgccag ta

<210> SEC ID NO:78

<211> LONGITUD: 42

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S368X antisentido

<400> SEC ID NO:78 tctacaatgc tactataagt agnactggac gaagagtagg tg 42

<210> SEC ID NO:79

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-T369X sentido

<400> SEC ID NO:79 ctactcttcg tccagttcgn nktatagtag cattgtagat gcc

<210> SEC ID NO:80

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S371X antisentido

<400> SEC ID NO:80 ttcacggcat ctacaatgct atnataagtc gaactggacg aag 43

<210> SEC ID NO:81

<211> LONGITUD: 43

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<223> OTRAS INFORMACIONES: cebador Hk3-S372X sentido

<400> SEC ID NO:81 cgtccagttc gacttatagt nntattgtag atgccgtgaa gac 43

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1. Variante de una glucoamilasa progenitora que tiene actividad de glucoamilasa y mejor termoestabilidad con respecto a la glucoamilasa progenitora comprendiendo una o más mutaciones en la(s) siguiente(s) posición(es) en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2 E408R+A425T+S465P+T494A, E408R+S386N, T2Q+A11P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+0406N+L410R. A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, T2R+S386R+A393R, Y402F, V59A+A393R+T490A, y una extensión del N-terminal que consiste en PLASD Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H,

   o la variante de una o más mutaciones en una posición correspondiente en una glucoamilasa homóloga que exhibe un grado de identidad de al menos un 60 % con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID NO: 2

2. 2.

   Variante de una glucoamilasa progenitora que tiene actividad de glucoamilasa y mejor termoestabilidad con respecto a la glucoamilasa progenitora, la variante teniendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 y comprendiendo la mutación A393R o la variante teniendo la mutación en una posición correspondiente en una glucoamilasa homóloga que exhibe un grado de identidad de al menos un 70 % con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID NO:2.

3. 3.

   Variante de una glucoamilasa progenitora que tiene actividad de glucoamilasa y mejor termoestabilidad con respecto a la glucoamilasa progenitora, la variante teniendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 y comprendiendo la mutación Y402F o la variante teniendo la mutación en una posición correspondiente en una glucoamilasa homóloga que exhibe un grado de identidad de al menos un 95 % con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID NO:2.

4. 4.

   Variante según cualquiera de la reivindicaciones 1-3, donde la glucoamilasa homóloga progenitora es la glucoamilasa G1 de Aspergillus niger.

5. 5.

   Variante según cualquiera de la reivindicaciones 1-4, donde la glucoamilasa es una glucoamilasa truncada, en particular en el C-terminal.

6. 6.

   Constructo de ADN comprendiendo una secuencia de ADN que codifica una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. 7.

   Vector de expresión recombinante que lleva un constructo de ADN según la reivindicación 6.

8. 8.

   Célula que es transformada con un constructo de ADN según la reivindicación 6 o un vector según la reivindicación 7.

9. 9.

   Célula según la reivindicación 8, que es un microorganismo, tal como una bacteria o un hongo.

10. 10.

    Célula según la reivindicación 9, que es un Aspergillus oryzae o Aspergillus niger deficiente en proteasa.

11. 11.

    Proceso para convertir almidón o almidón parcialmente hidrolizado en un jarabe conteniendo dextrosa, dicho proceso incluyendo la fase de sacarificar el almidón hidrolizado en presencia de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

12. 12.

    Proceso según la reivindicación 11, donde la dosificación de glucoamilasa está presente en el rango de 0,05 a 0,5 AGU por gramo de materia seca.

13. 13.

    Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, comprendiendo la sacarificación de un almidón hidrolizado de al menos 30 por ciento en peso de materia seca.

14. 14.

    Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde la sacarificación es conducida en presencia de una enzima desramificante seleccionada del grupo de pululanasa e isoamilasa, preferiblemente una pululanasa derivada de Bacillus acidopullulyticus o Bacillus deramificans o una isoamilasa derivada de Pseudomonas amyloderamosa.

15. 15.

    Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, donde la sacarificación es conducida a un pH de 3 a 5,5 y a una temperatura de 60-80°C. preferiblemente 63-75°C, durante 24 a 72 horas, preferiblemente durante 36-48 horas a un pH de 4 a 4,5.

16. 16.

    Método de sacarificación de una solución de almidón licuado, cuyo método comprende

    (i)

    una fase de sacarificación durante cuya fase se realiza uno o más estadios de sacarificación enzimática, y la fase posterior de

    (ii)

    una o más fases de separación por membrana a alta temperatura

    donde la sacarificación enzimática se realiza usando una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

17. 17.

    Uso de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un proceso de conversión de almidón.

18. 18.

    Uso de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un proceso de conversión de almidón continuo.

19. 19.

    Uso según la reivindicación 18, donde el proceso de conversión de almidón continuo incluye un proceso de sacarificación continuo según la reivindicación 16.

20. 20.

    Uso de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un proceso para producir oligosacáridos.

21. 21.

    Uso de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un proceso para producir jarabes especializados.

22. 22.

    Uso de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un proceso para producir etanol para combustible.

23. 23.

    Uso de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un proceso para producir una bebida.

24. 24.

    Uso de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un proceso de fermentación para producir compuestos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido glutámico.

25. 25.

    Método para mejorar la termoestabilidad de una glucoamilasa progenitora teniendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 haciendo una mutación en una o más de la(s) siguiente(s) posición(es) en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2: E408R+A425T+S465P+T494A, E408R+S386N, T2Q+A11P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+D408N+L410R, A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, T2R+S386R+A393R, Y402F, V59A+A393R+T490A, y una extensión del N-terminal que consiste en PLASD, Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H.

    o para mejorar la termoestabilidad en una glucoamilasa progenitora que exhibe un grado de identidad de al menos un 60% con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NO: 2 haciendo una o más mutaciones en una posición correspondiente en la glucoamilasa homóloga.