DE69937148T3

DE69937148T3 - Varianten der glukoamylase

Info

Publication number: DE69937148T3
Application number: DE69937148T
Authority: DE
Inventors: Bjarne Nielsen; Allan Svendsen; Henrik Pedersen; Jesper Vind; Hanne HENDRIKSEN; Torben Frandsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2012-05-03
Anticipated expiration: 2019-07-10
Also published as: ATE373703T1; ES2294846T3; DE69937148T2; ES2294846T5; EP1914306A3; EP1914306A2; DE69937148D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Glucoamylasevarianten (Mutanten) der Eltern-AMG, insbesondere mit verbesserter Wärmestabilität, die z. B. zur Stärkekonversion geeignet sind, z. B. zur Herstellung von Glucose aus Stärke. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Glucoamylaseenzym-Varianten und die Verwendung von solchen Variantenenzymen.
Hintergrund der Erfindung
Glucoamylase (1,4-α-D-Glucanglucohydrolase, EC 3.2.1.3) ist ein Enzym, das die Freisetzung von D-Glucose aus dem nicht reduzierenden Enden von Stärke oder verwandten Oligo- und Polysaccharidmolekülen katalysiert. Glucoamylasen werden von mehreren filamentösen Pilzen und Hefen produziert, wobei diejenigen von Aspergillus kommerziell am bedeutendsten sind.
Kommerziell wird das Glucoamylaseenzym zur Konversion von Maisstärke eingesetzt, die bereits teilweise durch eine α-Amylase zu Glucose hydrolysiert ist. Die Glucose wird weiterhin durch Glucoseisomerase zu einem Gemisch umgewandelt, das fast zu gleichen Teilen aus Glucose und Fruktose besteht. Dieses Gemisch, oder das weiter mit Fruktose angereicherte Gemisch, ist der üblicherweise verwendete fruktosereiche Maissirup, der überall in der Welt im Handel ist. Dieser Sirup ist das weltgrößte Tonnageprodukt, das durch ein enzymatisches Verfahren produziert wird. Die drei an der Umwandlung von Stärke zu Fruktose beteiligten Enzyme sind unter den wichtigsten hergestellten industriellen Enzymen.
Eines der Hauptprobleme, das hinsichtlich der kommerziellen Verwendung von Glucoamylase bei der Herstellung von fruktosereichem Maissirup besteht, ist die relativ geringe Wärmestabilität von Glucoamylase. Glucoamylase ist nicht so wärmestabil wie α-Amylase oder Glucoseisomerase, und sie ist im Vergleich zu α-Amylase oder Glucoisomerase bei niedrigen pH-Werten besonders aktiv und stabil. Sie muss demnach in einem getrennten Gefäß bei einer niedrigeren Temperatur und niedrigerem pH eingesetzt werden.
Glucoamylase aus Aspergillus niger besitzt eine katalytische (aa 1–440) und eine Stärke-bindende Domäne (aa 509–616), die durch einen langen und hoch O-glykosilierten Linker getrennt sind (Svensson et al. (1983), Carlsberg Res. Commun., 48, 529–544, 1983 und (1986), Eur. J. Biochem. 154, 497–502). Die katalytische Domäne (aa 1–471) von Glucoamylase aus A. awamori var. X100 nimmt eine (α/α)₆-Faltung an, in der sechs konservierte α→α-Schleifensegmente die äußeren und inneren Röhren verbinden (Aleshin et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 19 291–19 298). Kristallstrukturen von Glucoamylase im Komplex mit 1-Deoxynojirimycin (Harris et al. (1993), Biochemistry, 32, 1 618-1 626) und den Pseudotetrasaccharidinhibitoren Acarbose und D-Gluco-dihydroacarbose (Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8 319–8 328) sind weiterhin mit den Glutaminsäuren 179 und 400, die als allgemeine Säure bzw. Base wirken, kompatibel. Die unverzichtbare Rolle dieser Reste während der Katalyse wurde auch bereits unter Verwendung von Proteinengineering untersucht (Sierks et al. (1990), Protein Engng. 3, 193–198; Frandsen et al. (1994), Biochemistry, 33, 13 808–13 816). Glucoamylase-Kohlehydrat-Wechselwirkungen an vier Glycosylrest-bindenden untergeordneten Stellen –1, +1, +2 und +3 werden in Glucoamylase-Komplexstrukturen hervorgehoben (Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8 319–8 328), und Reste, die zum Binden und zur Katalyse wichtig sind, wurden bereits ausgiebig unter Verwendung von ortsgerichteten Mutanten in Verbindung mit kinetischer Analyse untersucht (Sierks et al. (1989), Protein Engng. 2, 621–625; Sierks et al. (1990), Protein Engng. 3, 193–198; Berland et al. (1995), Biochemistry, 34, 10 153–10 161; Frandsen et al. (1995), Biochemistry, 34, 10 162–10 169).
Verschiedene Substitutionen in A. niger-Glucoamylase, um die Wärmestabilität zu verstärken, wurden bereits beschrieben: i) Substitution von α-helikalen Glycinen: G137A und G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499–505); ii) Eliminierung der fragilen Asp-X-Peptidbindungen, D258E und D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575–582); Prävention von Deamidation in N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275–281); iv) Engineering von einer zusätzlichen Disulfidbindung A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8 698–8 704); und v) Einführung von Pro-Resten in Position A435 und S436 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1 199–1 204)). Außerdem präsentierte Clark Ford am 17. Oktober 1997 eine Druckschrift (ENZYME ENGINEERING 14, Beijing/China, 12.–17. Okt. 97, Abstract number: Abstract book S. 0–61). Die Zusammenfassung legt Mutationen in den Positionen G137A, N20C/A27C und S30P in einer (nicht offenbarten) Aspergillus awamori Glucoamylase nahe, um die Wärmestabilität zu verbessern.
Zusätzliche Information hinsichtlich Glucoamylase kann auf der Internethomepage (http://www.public.iastate.edu/~pedro/glase/glase.html) gefunden werden.
”Die Glucoamylase-Internetseite” (letzte Änderung 08.10.97) von Pedro M. Coutinho offenbart Informationen hinsichtlich Glucoamylasen, einschließlich von Glucoamylasen, die aus Aspergillus-Stämmen ableitbar sind. Chemische und ortsgerichtete Modifikationen in der Aspergillus niger-Glucoamylase sind aufgeführt.
Kurze Offenbarung der Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung verbesserter Glucoamylasevarianten mit verbesserter Wärmestabilität, die zur Verwendung in, bei z. B. dem Saccharifizierungsschritt bei Stärkeumwandlungsverfahren geeignet sind.
Der Begriff ”eine Glucoamylasevariante mit verbesserter Wärmestabilität” bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Glucoamylasevariante, die eine höhere T_1/2 (Halbwertszeit) aufweist als die entsprechende Eltern-Glucoamylase. Die Bestimmung von T_1/2 (Verfahren I und Verfahren II) ist im Abschnitt ”Materialien & Methoden” beschrieben.
Die spezifische Aktivität wird als k_cat oder AGU/mg (gemessen wie nachstehend im Abschnitt ”Materialien & Methoden” beschrieben) bestimmt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine Anzahl von verbesserten Varianten einer Eltern-Glucoamylase mit verbesserter Wärmestabilität im Vergleich zu dem entsprechenden Elternenzym bereitgestellt. Die verbesserte Wärmestabilität wird durch Substitution ausgewählter Positionen in einer Eltern-Glucoamylase erhalten. Dies wird in Einzelheiten nachstehend beschrieben.
Nomenklatur
In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen werden die herkömmlichen Ein-Buchstaben- und Drei-Buchstaben-Codes für die Aminosäurereste verwendet. Zur leichteren Bezugnahme werden die erfindungsgemäßen Glucoamylasevarianten unter Verwendung der folgenden Nomenklatur beschrieben: Ausgangsaminosäure(n): Position(en): substituierte Aminsäure(n)
Nach dieser Nomenklatur wird zum Beispiel die Substitution von Alanin durch Asparagin in Position 30 folgendermaßen angegeben: Ala30Asn oder A30N
Eine Deletion von Alanin in der gleichen Position ist folgendermaßen gezeigt: Ala30* oder A30*
und eine Insertion eines zusätzlichen Aminosäurerestes, wie Lysin, ist folgendermaßen gezeigt: Ala30AlaLys oder A30AK
Eine Deletion eines aufeinander folgenden Abschnitts von Aminosäureresten, wie die Aminosäurereste 30–33 wird als (30–33)* oder Δ(A30–N33) angegeben.
Wenn eine spezielle Glucoamylase eine ”Deletion” im Vergleich zu anderen Glucoamylasen enthält und eine Insertion in einer solchen Position vorgenommen wird, ist dies folgendermaßen angegeben: *36Asp oder *36D
zur Insertion einer Asparaginsäure in Position 36
Mehrere Mutationen werden durch Pluszeichen getrennt, d. h.: Ala30Asp + Glu34Ser oder A30N + E34S, was Mutationen in den Positionen 30 und 34 darstellt, die Alanain bzw. Glutaminsäure durch Asparagin bzw. Serin ersetzen. Mehrere Mutationen können ebenfalls wie folgt getrennt werden, d. h. mit der gleichen Bedeutung wie das Pluszeichen: Ala30Asp/Glu34Ser oder A30N/E34S
Wenn ein oder mehrere alternative Aminosäurereste in eine gegebene Position inseriert werden können, wird es angegeben als A30N, E oder A30N/E oder A30N oder A30E.
Wenn zudem eine zur Modifikation geeignete Position benannt wird, wobei keinerlei spezifische Modifikation nahegelegt wird, ist es so zu verstehen, dass der in der Position vorhandene Aminosäurerest durch einen beliebigen Aminosäurerest substituiert werden kann. Wenn somit beispielsweise eine Modifikation eines Alanins in Position 30 erwähnt wird, jedoch nicht festgelegt ist, ist es zu verstehen, dass das Alanin durch jede andere beliebige Aminosäure deletiert oder substituiert werden kann, d. h. eine von: R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt das Plasmid pCAMG91, das das Aspergillus niger G1-Glucoamylasegen enthält.
Ausführliche Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der Arbeit, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, bestand darin, die Wärmestabilität von bestimmten Glucoamylasen zu verbessern, die aus Pilzorganismen erhältlich sind, insbesondere von Stämmen der Art Aspergillus, und die an sich auf der Grundlage ihrer geeigneten Eigenschaften bei der Stärkeumwandlung oder Alkoholfermentation ausgewählt wurden.
Identifizierung von zu mutierenden Positionen und/oder Regionen, um verbesserte Wärmestabilität zu erhalten
Moleküldynamik(MD)-Simulationen geben Aufschluss über die Mobilität der Aminosäuren in der Proteinstruktur (siehe McCammon, JA und Harvey, SC., (1987), ”Dynamics of proteins and nucleic acids”, Cambridge University Press.). Eine solche Proteindynamik wird oft mit den kristallographischen B-Faktoren verglichen (siehe Stout, GH und Jensen, LH (1989), ”X-ray structure determination”, Wiley). Durch Laufenlassen der MD-Simulation bei verschiedenen Protonierungszuständen der titrierbaren Reste, wird die pH-verwandte Mobilität der Reste stimuliert. Regionen mit der höchsten Mobilität oder Flexibilität (hier isotropische Fluktuationen) werden zur statistischen Mutagenese gewählt. Es ist hier so zu verstehen, dass die in bestimmten Bereichen des Proteins festgestellte hohe Mobilität durch Substituieren von Resten in diesen Resten thermisch verbessert werden kann. Die Substitutionen richten sich gegen Reste, die das dynamische Verhalten der Reste zu z. B. größeren Seitenketten und/oder Resten, die die Fähigkeit besitzen, verbesserte Kontakte zu Resten in ihrer nahen Umgebung zu bilden, ändern. Die AMG aus Aspergillus niger wurde für die MD-Stimulation verwendet. Wie die MD-Simulation durchgeführt wird, ist in dem Abschnitt Materialien & Methoden nachstehend beschrieben.
Regionen, die durch die Moleküldynamik(MD)-Stimulationen als geeignet zur Mutation festgestellt wurden, wenn man verbesserte Wärmestabilität erhalten will, sind die folgenden:
Region: 1–18,
Region: 19–35,
Region: 73–80,
Region 200–212,
Region: 234–246,
Region: 334–341,
Region: 353–374,
Region: 407–411,
Region: 445–470.
Regionen, die zur Erhöhung der Wärmestabilität von Interesse befunden wurden, sind die Regionen in der Nähe der aktiven Stelle. Regionen, die zwischen den α-Helices angeordnet sind, und die an der Substratbindungsstelle Positionen auf jeder Seite des N- und C-Terminus der α-Helices einschließen können, sind für die Aktivität des Enzyms von Bedeutung. Diese Regionen machen die folgenden Regionen aus:
Region: 40–62,
Region: 93–127,
Region: 170–184,
Region: 234–246,
Region: 287–319,
Region: 388–414.
Rhizopus, Talaromcyces, wie Talaromyces emersonii (offenbart in WO 99/28448 ) und Thielavia besitzen hohe spezifische Aktivität gegenüber Maltodextrinen, einschließlich Maltose und Maltohepatose. Darum sind Regionen, die von speziellem Interesse hinsichtlich (übertragend) vergrößerter spezifischer Aktivität, folgende:
Region: 200–212,
Region: 287–300,
Region: 305–319.
Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, dass es in der Tat möglich ist, die Wärmestabilität einer Eltern-Glucoamylase durch Modifikation von einem oder mehreren Aminosäureresten der Aminosäuresequenz der Eltern-Glucoamylase zu verbessern. Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser Feststellung.
Demnach betrifft ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Variante einer Eltern-Glucoamylase, die eine oder mehrere Mutationen in den Regionen und Positionen, die weiter unten beschrieben sind, umfasst.
Eltern-Glucoamylasen
Eltern-Glucoamylase, die erfindungsgemäß betrachtet wird, umfasst Pilzglucoamylasen, insbesondere Pilzglucoamylasen, die aus einem Aspergillus-Stamm erhältlich sind, wie Aspergillus niger- oder Aspergillus awamori-Glucoamylasen und Varianten oder Mutanten davon, homologe Glucoamylasen und weitere Glucoamylasen, die strukturell und/oder funktionell der SEQ ID NO: 2 entsprechen. Speziell betrachtet werden die Aspergillus niger-Glucoamylasen G1 und G2, die bei Boel et al. (1984), ”Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs”, EMBO J. 3 (5), S. 1 097–1 102 offenbart sind. Die G2-Glucoamylase ist in der SEQ ID NO: 2 offenbart. Die G1-Glucoamylase ist in der SEQ ID NO: 13 offenbart. Eine weitere AMG-Hauptkette, die betrachtet wird, ist Talaromyces emersonii, insbesondere Talaromyces emersonii DSM, offenbart in WO 99/28448 (Novo Nordisk).
Im Handel erhältliche Eltern-Glucoamylasen
Im Handel erhältliche Eltern-Glucoamylasen umfassen AMG von Novo Nordisk und auch Glucoamylase von den Firmen Genencor, Inc., USA, und Gist-Brocades, Delft, Niederlande.
Glucoamylasevarianten
Die Erfindung betrifft eine Variante einer Eltern-Glucoamylase wie in den angefügten Ansprüchen 1 bis 3 definiert.
Auch wird durch die Erfindung ein Verfahren zum Verbessern der Wärmestabilität einer Eltern-Glucoamylase wie in dem angefügten Anspruch 25 definiert, bereitgestellt.
Homologie (Identität)
Die oben erwähnte Homologie der Eltern-Glucoamylase wird als Identitätsgrad zwischen zwei Proteinsequenzen bestimmt, der eine Abweichung von der ersten Sequenz von der zweiten angibt. Die Homologie kann zweckmäßigerweise mittels Computerprogrammen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie GAP, bestimmt werden, die in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, S. 443–453) bereitgestellt sind. Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen zum Polypeptidsequenzvergleich: Gap creation penalty of 3,0 und Gap extension penalty of 0,1, zeigt der reife Teil eines Polypeptids, das durch eine analoge erfindungsgemäße DNA-Sequenz codiert wird, einen Identitätsgrad von vorzugsweise mindestens 60%, wie 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, oder stärker bevorzugt von mindestens 95%, stärker bevorzugt von mindestens 97% und am stärksten bevorzugt von mindestens 99% mit dem reifen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz.
Vorzugsweise umfasst die Eltern-Glucoamylase die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2; oder allelische Varianten davon oder Fragmente davon, die Glucoamylaseaktivität aufweisen.
Ein Fragment von SEQ ID NO: 2 ist ein Polypeptid, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren von dem Amino- und/oder Carboxylterminus dieser Aminosäuresequenz deletiert sind. Beispielsweise ist die AMG G2 (SEQ ID NO: 2) ein Fragment der Aspergillus niger G1-Glucoamylase (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), S. 1 097–1 102) mit Glucoamylaseaktivität. Eine allelische Variante bezeichnet alle von zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens, die den gleichen chromosomalen Locus einnehmen. Allelische Variation tritt natürlicherweise durch Mutation auf und kann zu Polymorphismus innerhalb von Populationen führen. Genmutationen können still sein (keine Änderung in dem codierten Polypeptid) oder können Polypeptide mit veränderten Aminosäuresequenzen codieren. Eine allelische Variante eines Polypeptids ist ein Polypeptid, das von einer allelischen Variante eines Gens codiert wird.
Die Aminosäuresequenzen von homologen Eltern-Glucoamylasen können sich von der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 durch eine Insertion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäureresten und/oder durch die Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten durch verschiedene Aminosäurereste unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäureänderungen von geringfügiger Natur, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen, die das Falten und/oder die Aktivität des Proteins nicht nennenswert beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise von eins bis etwa 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie ein Amino-terminaler Methioninrest; ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20–25 Resten; oder eine kleine Extension, die die Reinigung durch Änderung der Nettoladung oder einer weiteren Funktion erleichtert, wie ein Polyhistidintrakt, ein antigenisches Epitop oder eine Bindungsdomäne.
Bei einer anderen Ausführungsform wird die isolierte Eltern-Glucoamylase durch eine Nucleinsäuresequenz codiert, die unter sehr niedrigen Stringenzbedingungen, vorzugsweise niedrigen Stringenzbedingungen, stärker bevorzugt mittleren Stringenzbedingungen, stärker bevorzugt mittel-hohen Stringenzbedingungen, nach stärker bevorzugt hohen Stringenzbedingungen und besonders bevorzugt sehr hohen Stringenzbedingungen mit einer Nucleinsäuresonde hybridisiert, die unter den gleichen Bedingungen, hybridisiert mit (i), der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, (ii) der cDNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1, (iii) einer Subsequenz von (i) oder (ii) oder (iv) einem Komplementärstrang von (i), (ii) oder (iii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York). Die Subsequenz von SEQ ID NO: 1 kann mindestens 100 Nucleotide oder vorzugsweise mindestens 200 Nucleotide betragen. Ferner kann die Subsequenz ein Polypeptidfragment codieren, das Glucoamylaseaktivität aufweist. Die Eltern-Polypeptide können auch allelische Varianten oder Fragmente der Polypeptide sein, die Glucoamylaseaktivität aufweisen.
Die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder eine Subsequenz davon, sowie die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder ein Fragment davon, können zur Konstruktion einer Nucleinsäuresonde eingesetzt werden, um DNA, die Polypeptide mit Glucoamylaseaktivität codiert, aus Stämmen von verschiedenen Gattungen oder Spezies nach auf dem Fachgebiet wohl bekannten Verfahren zu identifizieren und zu klonieren. Insbesondere können solche Sonden zur Hybridisierung mit genomischer oder cDNA der Gattung oder Spezies von Interesse und für die anschließenden Standard-Southernblotverfahren verwendet werden, um das entsprechende Gen darin zu identifizieren und zu isolieren. Solche Sonden können beträchtlich kürzer sein als die gesamte Sequenz, sollten allerdings mindestens 15, vorzugsweise mindestens 25 und stärker bevorzugt mindestens 35 Nucleotide lang sein. Längere Sonden können ebenfalls verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet werden. Die Sonden sind typischerweise zum Nachweis des entsprechenden Gens (beispielsweise mit ³²P, ³H, ³⁵S, Biotin oder Avidin) markiert. Solche Sonden sind durch die vorliegende Erfindung mit umfasst.
Somit kann eine genomische DNA- oder cDNA-Bibliothek, die aus solchen anderen Organismen hergestellt wurde, auf DNA gescreent werden, die mit den Sonden, die vorstehend beschrieben sind, hybridisiert und die ein Polypeptid mit Glucoamylase codiert. Genomische oder eine andere DNA aus solchen anderen Organismen kann durch Agarose oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder andere Trenntechniken aufgetrennt werden. DNA aus den Bibliotheken oder die aufgetrennte DNA kann auf Nitrocellulose oder auf ein anderes geeignetes Trägermaterial übergeführt und immobilisiert werden. Um ein Klon oder eine DNA oder Subsequenzen davon zu identifizieren, die mit der SEQ ID NO: 1 homolog sind, wird das Trägermaterial in einem Southernblot verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gibt die Hybridisierung an, dass die Nucleinsäuresequenz mit einer Nucleinsäuresonde, die der Nucleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, ihrem komplementären Strang oder einer Subsequenz davon entspricht, unter sehr niedrigen bis sehr hohen Stringenzbedingungen hybridisiert. Moleküle, mit denen die Nucleinsäuresonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung von Röntgenfilm nachgewiesen.
Für lange Sonden mit einer Länge von mindestens 100 Nucleotiden wird das Trägermaterial schließlich drei Mal jeweils 15 Minuten lang unter Verwendung von 2 × SSC, 0,2% SDS, vorzugsweise mindestens bei 45°C (sehr niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 50°C (niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 55°C (mittlere Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 60°C (mittel-hohe Stringenz), noch stärker bevorzugt bei mindestens 65°C (hohe Stringenz) und besonders bevorzugt bei mindestens 70°C (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
Für kurze Sonden, die etwa 15 Nucleotide bis etwa 70 Nucleotide lang sind, sind die Stringenzbedingungen als Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen nach Hybridisierung bei 5 bis 10°C unterhalb der berechneten T_m unter Verwendung der Berechnung nach Bolton und McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1 390) in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1x Denhardt-Lösung, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM einbasiges Natriumphosphat, 0,1 mM ATP und 0,2 mg Hefe-RNA pro ml und anschließendes Standard-Southernblot-Verfahren definiert.
Für kurze Sonden, die etwa 15 Nucleotide bis etwa 70 Nucleotide lang sind, wird das Trägermaterial ein Mal in 6 × SSC plus 0,1% SDS 15 Minuten und jeweils zwei Mal 15 Minuten unter Verwendung von 6 × SSC bei 5°C bis 10°C unterhalb der berechneten T_m gewaschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nucleinsäuresequenzen, die die durch (a) Hybridisieren einer DNA unter sehr niedrigen, niedrigen, mittleren, mittel-hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder ihrem Komplementärstrang oder einer Subsequenz davon hergestellt werden. Die Subsequenz ist vorzugsweise eine Sequenz von mindestens 100 Nucleotiden, wie eine Sequenz, die ein Polypeptidfragment codiert, das Glucoamylaseaktivität besitzt.
Die betrachteten Eltern-Glucoamylasen besitzen mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, stärker bevorzugt mindestens 60%, noch stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 100% der Glucoamylaseaktivität des reifen Polypeptids von SEQ ID NO: 2.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die erfindungsgemäße Variante verbesserte Wärmestabilität, vorzugsweise innerhalb des Temperaturintervalls von etwa 60–80°C, vorzugsweise 63–75°C, vorzugsweise bei einem pH von 4–5, insbesondere 4,2–4,7 unter Verwendung von Maltodextrin als das Substrat.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Variante, z. B. zur Alkoholfermentation, verwendet.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Eltern-Glucoamylase die Aspergillus niger G1-Glucoamylase (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), S. 1 097–1 102). Die Eltern-Glucoamylase kann eine verkürzte Glucoamylase sein, z. B. die AMG G2-Glucoamylase.
Klonieren einer DNA-Sequenz, die eine Eltern-Glucoamylase codiert
Die DNA-Sequenz, die eine Eltern-Glucoamylase codiert, kann aus jeder Zelle oder jedem Mikroorganismus isoliert werden, der die in Frage kommende Glucoamylase produziert, unter Verwendung verschiedener auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren. Zuerst sollten eine genomische DNA und/oder eine cDNA-Bibliothek unter Verwendung von chromosomaler DNA oder Messenger-RNA aus dem Organismus konstruiert werden, der die zu untersuchende Glucoamylase produziert. Wenn die Aminosäuresequenz der Glucoamylase bekannt ist, können dann markierte Oligonucleotidsonden synthetisiert und zur Identifizierung von Glucoamylase codierenden Klonen aus einer genomischen Bibliothek verwendet werden, die aus dem in Frage kommenden Organismus hergestellt wurde. Alternativ könnte eine markierte Oligonucleotidsonde, die Sequenzen enthält, die zu einem anderen bekannten Glucoamylasegen homolog sind, als eine Sonde zur Identifizierung von Glucoamylase codierenden Klonen unter Verwendung von Hybridisierung und Waschbedingungen von sehr niedriger bis sehr hoher Stringenz verwendet werden. Dies ist oben beschrieben.
Wieder ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Glucoamylase codierenden Klonen würde die Insertion von Fragmenten genomischer DNA in einen Expressionsvektor, wie ein Plasmid, die Transformation von Glucoamylase-negativen Bakterien mit der resultierenden genomischen DNA-Bibliothek und das anschließende Ausplattieren der transformierten Bakterien auf Agar, die ein Substrat für Glucoamylase (d. h. Maltose) enthalten, umfassen, wodurch sich Klone identifizieren lassen, die die Glucoamylase exprimieren.
Alternativ kann die DNA-Sequenz, die das Enzym codiert, synthetisch durch Entwickeln von Standardverfahren hergestellt werden, z. B. dem Phosphoramiditverfahren, das von S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, S. 1 859–1 869, beschrieben ist oder der beschriebenen Methode von Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, S. 801–805. Bei dem Phosphoramiditverfahren werden Oligonucleotide synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA-Synthesizer, gereinigt, anelliert, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Schließlich kann die DNA-Sequenz gemischten, genomischen und synthetischen Ursprungs, gemischten, synthetischen und cDNA-Ursprungs oder gemischten, genomischen und cDNA-Ursprungs sein, hergestellt nach Standardtechniken durch Ligation von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie angemessen, die Fragmente entsprechen verschiedenen Teilen der gesamten DNA-Sequenz). Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primer, beispielsweise wie in US 4 683 202 oder R. K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, S. 487–491, beschrieben hergestellt werden.
Ortsgerichtete Mutagenese
Nach Isolierung einer Glucoamylase codierenden DNA-Sequenz und nach Identifizierung wünschenswerter Stellen zur Mutation können Mutationen unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide eingebracht werden. Diese Oligonucleotide enthalten Nucleotidsequenzen, die die gewünschten Mutationsstellen flankieren. Bei einem speziellen Verfahren wird eine einzelsträngige DNA-Lücke, die Glucoamylase codierende Sequenz, in einem Vektor erzeugt, der das Glucoamylasegen trägt. Anschließend wird das synthetische Nucleotid, das die gewünschte Mutation trägt, an einen homologen Teil der einzelsträngigen DNA anelliert. Die verbleibende Lücke wird dann mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt, und das Konstrukt wird unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Ein spezielles Beispiel für dieses Verfahren ist bei Morinaga et al., (1984)), Biotechnology 2, S. 646–639, beschrieben. US 4 760 025 beschreibt das Einbringen von Oligonucleotiden, die mehrere Mutationen codieren, durch die Durchführung kleinerer Änderungen der Kassette. Allerdings kann eine noch größere Varietät von Mutationen zu jeder Zeit durch das Morinaga-Verfahren eingebracht werden, da eine Vielzahl von Oligonucleotiden von verschiedenen Längen eingeführt werden kann.
Ein weiteres Verfahren zum Einführen von Mutationen in Glucoamylase codierende DNA-Sequenzen ist bei Nelson und Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, S. 147–151, beschrieben. Es umfasst die 3-Stufen-Generierung zur Erzeugung eines PCR-Fragments, das die gewünschte Mutation enthält, die unter Verwendung eines chemisch synthetisierten DNA-Strangs als einer der Primer bei den PCR-Reaktionen eingebracht wurde. Für das PCR-generierte Fragment kann ein DNA-Fragment, das die Mutation trägt, durch Spaltung mit Restriktionsendonucleasen und Reinsertion in ein Expressionsplasmid isoliert werden.
Weiterhin beschreiben Sierks et al., (1989), Protein Eng., 2, 621–625; Sierks et al., (1990), Protein Eng., Bd. 3, 193–198, auch ortsgerichtete Mutagenese in einer Aspergillus-Glucoamylase.
Statische Mutagenese
Die statistische Mutagenese wird zweckmäßiger entweder als lokalisierte oder regionsspezifische statistische Mutagenese in mindestens drei Teilen des Gens, welches zu der in Frage kommenden Aminosäuresequenz translatiert, oder innerhalb des gesamten Gens durchgeführt.
Die statistische Mutagenese einer DNA-Sequenz, die Eltern-Glucoamylase codiert, kann zweckmäßigerweise durch die Verwendung eines jedem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens durchgeführt werden.
In Relation zu dem obigen betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Variante einer Eltern-Glucoamylase, wobei die Variante eine relativ zu den Eltern erhöhte Wärmestabilität aufweist, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Durchführen einer statistischen Mutagenese mit einer DNA-Sequenz, die die Eltern-Glucoamylase codiert,
(b) Expression der in Schritt (a) erhaltenen mutierten DNA-Sequenz in einer Wirtszelle und
(c) Screening auf Wirtszellen, die eine Glucoamylasevariante exprimieren, die eine veränderte Eigenschaft (d. h. Wärmestabilität) relativ zu der Eltern-Glucoamylase aufweist.

Schritt (a) des obigen erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise unter Verwendung dotierter Primer, wie in den Arbeitsbeispielen hier (siehe infra) beschrieben, durchgeführt.
Beispielsweise kann die statistische Mutagenese durch die Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenisierungsmittels durch die Verwendung eines geeigneten Oligonucleotids oder durch die Durchführung von PCR generierter Mutagenese mit der DNA-Sequenz durchgeführt werden. Weiterhin kann die statistische Mutagenese durch die Verwendung jeder Kombination dieser Mutagenisierungsmittel durchgeführt werden. Das Mutagenisierungsmittel kann z. B. eine sein, das Transitionen, Tranversionen, Inversionen, Scrambling, Deletionen und/oder Insertionen induziert.
Beispiele für ein physikalisches oder chemisches Mutagenisierungsmittel, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, umfassen Ultraviolett(UV)-Bestrahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, Salpetersäure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nucleotidanaloge. Wenn solche Mittel verwendet werden, wird die Mutagenese typischerweise durch Inkubieren der DNA-Sequenz, die das zu mutagenisierende Elternenzym codiert, in Gegenwart des Mutagenisierungsmittel der Wahl unter geeigneten Bedingungen, dass die Mutagenese stattfindet, und Selektion auf mutierte DNA mit den gewünschten Eigenschaften durchgeführt.
Wenn die Mutagenese durch die Verwendung eines Oligonucleotids durchgeführt wird, kann das Oligonucleotid während der Synthese des Oligonucleotids an den Positionen, die geändert werden sollen, mit den drei Nicht-Eltern-Nucleotiden dotiert oder durch Spiken behandelt werden. Das Dotieren oder Spiken kann so erfolgen, dass Codons für unerwünschte Aminosäuren vermieden werden. Das dotierte oder durch Spiken behandelte Oligonucleotid kann in die DNA, die das Glucoamylaseenzym codiert, durch jede veröffentlichte Technik, unter Verwendung z. B. von PCR, LCR oder von einer DNA-Polymerase und Ligase, wie es angemessen scheint, eingebracht werden.
Vorzugsweise wird das Dotieren unter Verwendung von ”konstantem statistischen Dotieren” durchgeführt, wobei der Prozentsatz an Wildtyp und Mutation in jeder Position zuvor definiert wird. Weiterhin kann das Dotieren auf eine Präferenz für das Einbringen von bestimmten Nucleotiden ausgerichtet sein und dadurch auf eine Präferenz für das Einbringen von einem oder mehreren speziellen Aminosäureresten ausgerichtet sein. Das Dotieren kann zum Beispiel so erfolgen, dass das Einbringen von 90% Wildtyp und 10% Mutationen in jeder Position möglich ist. Eine zusätzliche Überlegung bei der Wahl eines Dotierungsschemas beruht auf genetischen sowie proteinstrukturellen Vorgaben. Das Dotierungsschema kann unter Verwendung des DOPE-Programms erstellt werden, das inter alia sicherstellt, dass das Einbringen von Stopp-Codons vermieden wird.
Wenn die PCR-generierte Mutagenese verwendet wird, wird entweder ein chemisch behandeltes oder nicht behandeltes Gen, das eine Eltern-Glucoamylase codiert, einer PCR unter Bedingungen unterzogen, welche das Fehleinbringen von Nucleotiden verstärkt (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Bd. 1, 1989, S. 11–15).
Ein Mutatorstamm von E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, S. 179–191), S. cereviseae oder von jedem anderen mikrobiellen Organismus kann für die statistische Mutagenese der DNA verwendet werden, die die Glucoamylase codiert, beispielsweise z. B. durch Transformieren eines Plasmids, das die Eltern-Glycosylase enthält, in den Mutatorstamm, wachsen lassen des Mutatorstamms mit dem Plasmid und Isolieren des mutierten Plasmids aus dem Mutatorstamm. Das mutierte Plasmid kann anschließend in den Expressionsorganismus transformiert werden.
Die zu mutagenisierende DNA-Sequenz kann zweckmäßigerweise in einer genomischen oder cDNA-Bibliothek vorhanden sein, die aus einem Organismus hergestellt wurde, der die Eltern-Glucoamylase exprimiert. Alternativ kann die DNA-Sequenz auf einem geeigneten Vektor, wie einem Plasmid oder einem Bakteriophage, vorhanden sein, welcher als solcher mit dem mutagenisierenden Mittel inkubiert oder anderweitig ihm ausgesetzt werden kann. Die zu mutagenisierte DNA kann auch in einer Wirtszelle vorhanden sein, entweder dadurch, dass sie in das Genom der besagten Zelle integriert ist oder dadurch, dass sie auf einem Vektor, den die Zelle beherbergt, vorhanden ist. Schließlich kann die zu mutagenisierende DNA in isolierter Form vorliegen. Es ist selbstverständlich, dass die DNA-Sequenz, mit der die statistische Mutagenese durchgeführt werden soll, vorzugsweise eine cDNA- oder eine genomische DNA-Sequenz ist.
In einigen Fällen kann es zweckmäßig sein, die mutierte DNA-Sequenz vor der Durchführung des Expressionsschrittes b) oder des Screeningschrittes c) zu amplifizieren. Eine solche Amplifikation kann nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden, wobei das derzeit bevorzugte Verfahren die PCR-generierte Amplifikation unter Verwendung von Oligonucleotidprimern ist, die auf der Grundlage der DNA- oder Aminosäuresequenz des Elternenzyms hergestellt werden.
Im Anschluss an die Inkubation mit oder die Exposition gegenüber dem mutagenisierenden Mittel wird die mutierte DNA durch Kultivieren einer geeigneten Wirtszelle, die die DNA-Sequenz trägt, unter Bedingungen, die das Stattfinden der Expression ermöglichen, exprimiert. Die für diesen Zweck verwendete Wirtszelle kann eine Wirtszelle sein, die mit der mutierten DNA-Sequenz transformiert worden ist, die gegebenenfalls auf einem Vektor vorhanden ist oder eine sein, die die DNA-Sequenz, die das Elternenzym codiert, während der Mutagenesebehandlung trug. Beispiele für geeignete Wirtszellen sind die folgenden: grampositive Bakterien wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus; und gramnegative Bakterien wie E. coli.
Die mutierte DNA-Sequenz kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die Funktionen codiert, die die Expression der mutierten DNA-Sequenz erlauben.
Lokalisierte statistische Mutagenese
Die statistische Mutagenese kann zweckmäßigerweise auf einem Teil der in Frage kommenden Eltern-Glucoamylase lokalisiert sein. Dies kann z. B. zweckmäßig sein, wenn bestimmte Regionen des Enzyms identifiziert worden sind, die von besonderer Bedeutung für eine gegebene Eigenschaft des Enzyms sind und von denen erwartet wird, dass sie, wenn sie modifiziert werden, eine Variante mit verbesserten Eigenschaften ergeben. Solche Regionen können normalerweise identifiziert werden, wenn die Tertiärstruktur des Elternenzyms aufgeklärt wurde und mit der Funktion des Enzyms in Zusammenhang gebracht wurde.
Die lokalisierte oder regionspezifische statistische Mutagenese wird zweckmäßiger durch die Verwendung von PCR-generierten Mutagenesetechniken, wie vorstehend beschrieben, oder durch jede andere geeignete auf dem Fachgebiet bekannte Technik durchgeführt. Alternativ kann die DNA-Sequenz, die den Teil der zu modifizierenden DNA-Sequenz codiert, isoliert werden, z. B. durch Insertion in einem geeigneten Vektor, und mit dem besagten Teil kann anschließend eine Mutagenese durch die Verwendung von einem der oben besprochenen Mutageneseverfahren durchgeführt werden.
Alternative Verfahren zur Bereitstellung von Varianten der Erfindung umfassen „Genshuffling”, z. B. wie in WO 95/22625 (von Affymax Technologies N. V.) oder in WO 96/00343 (von Novo Nordisk A/S) beschrieben.
Expression von Glucoamylasevarianten
Erfindungsgemäß kann eine DNA-Sequenz, die die Variante, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren oder durch alle alternativen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt wurde, codiert, in Enzymform unter Verwendung eines Expressionsvektors exprimiert werden, der typischerweise Kontrollsequenzen, die einen Promotor, Operator, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsinitiationssignal codiert und gegebenenfalls ein Repressorgen oder verschiedene Aktivatorgene einschließt.
Expressionsvektor
Der rekombinante Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz trägt, die eine erfindungsgemäße Glucoamylasevariante codiert, kann jeder Vektor sein, der zweckmäßigerweise DNA-Rekombinationsverfahren unterzogen wird, und die Wahl des Vektors hängt oft von der Wirtszelle ab, in die er eingeführt werden soll. Der Vektor kann ein Vektor sein, der bei Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert wird und zusammen mit dem (den) Chromosom(en) repliziert wird, in die er integriert worden ist. Beispiele für geeignete Expressionsvektoren umfassen pMT838.
Promotor
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz operabel mit einer geeigneten Promotorsequenz verknüpft sein. Der Promoter kann jede DNA-Sequenz sein, die in der Wirtszelle der Wahl die transkriptionale Aktivität zeigt und kann sich von Genen ableiten, die Proteine codieren, die zu der Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Ausrichtung der Transkription der DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße Glucoamylasevariante codiert, insbesondere in einem bakteriellen Wirt, sind der Promotor des lac Operons von E. coli, die Streptomyces coelicolor-Agarosegen dagA-Promotoren, die Promotoren des Bacillus licheniformis α-Amylasegens (amyL), die Promotoren des Bacillus stearothermophilus maltogenen Amylasegens (amyM), die Promotoren der Bacillus amyloliquefaciens α-Amylase (amyQ), die Promotoren der Bacillus subtilis xylA- und xylB-Gene, usw.. Zur Transkription in einem Pilzwirt sind Beispiele für geeignete Promotoren diejenigen, die sich von dem Gen ableiten, das A. oryzae TAKA-Amylase codiert, der TPI(Triosephosphatisomerase)-Promotor aus S. cerevisiae (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, S. 419–434, die Rhizomucor miehei-Asparaginproteinase, die A niger-neutrale α-Amylase, die A. niger-säurestabile α-Amylase, die A. niger-Glucoamylase, Rhizomucor miehei-Lipase, A. oryzae-alkalische Protease, A. oryzae-Triosephosphatisomerase oder A. nidulans-Acetamidase.
Expressionsvektor
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator und in Eukaryoten Polyadenlierungssequenzen umfassen, die mit der DNA-Sequenz operabel verknüpft sind, die die erfindungsgemäße α-Amylasevariante codiert. Terminations- und Polyadenylierungssequenzen können zweckmäßigerweise von den gleichen Quellen wie der Promotor stammen.
Der Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die dem Vektor die Replikation in der in Frage kommenden Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für solche Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide puC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, wie die dal-Gene von B. subtilis oder b. licheniformis oder ein Marker sein, der Antibiotikaresistenz überträgt, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz. Weiterhin kann der Vektor Aspergillus-Selektionsmarker einschließen, wie amdS, argB, niaD und sC, einen Marker, der Hygromycinresistenz entstehen lässt, oder die Selektion kann durch Co-Transformation durchgeführt werden, z. B. wie in WO 91/17243 beschrieben.
Die Verfahrensweisen, die zur Ligation des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts, das eine Glucoamylasevariante, den Promotor, Terminator bzw. andere Elemente codiert und die zur Insertion dieser Elemente in geeignete Vektoren verwendet werden, die die Information enthalten, die zur Replikation notwendig sind, sind den Fachleuten gut bekannt (cf. beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor, 1989).
Wirtszellen
Die erfindungsgemäße Zelle, die entweder ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie vorstehend definiert, umfasst, wird zweckmäßigerweise als eine Wirtszelle bei der rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Glucoamylasevariante verwendet. Die Zelle kann mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt transformiert werden, das die Variante codiert, zweckmäßigerweise durch Integration des DNA-Konstrukts (in eine oder mehrere Kopien) in das Wirtschromosom. Diese Integration wird im Allgemeinen als ein Vorteil betrachtet, da die DNA-Sequenz wahrscheinlich stabiler in der Zelle gehalten wird. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination. Alternativ kann die Zelle mit einem Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, im Zusammenhang mit den verschiedenen Typen von Wirtszellen, transformiert werden.
Die erfindungsgemäße Zelle kann eine Zelle eines höheren Organismus sein, wie eines Säugers oder eines Insekts, jedoch ist sie bevorzugt eine mikrobielle Zelle, z. B. eine Bakterienzelle oder eine Pilzzelle (einschließlich Hefe).
Beispiele für geeignete Bakterien sind grampositive Bakterien, wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus oder gramnegative Bakterien, wie E. coli. Die Transformation der Bakterien kann beispielsweise durch Protoplastentransformation oder unter Verwendung kompetenter Zellen auf eine per se bekannte Weise durchgeführt werden.
Der Hefeorganismus kann günstigerweise aus einer Spezies von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae, gewählt werden.
Die Wirtszelle kann auch ein filamentöser Pilz sein, z. B. ein Stamm, der einer Spezies von Aspergillus angehört, am stärksten bevorzugt Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, oder ein Stamm von Fusarium, wie ein Stamm von Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (in dem perfekten Zustand als Gibberella zeae, zuvor Sphaeria zeae, synonym mit Gibberella roseum und Gibberella roseum f. sp. cerealis) oder Fusarium sulphureum (in dem perfekten Zustand als Gibberella puricaris, synonym mit Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum und Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (synonym mit Fusarium crokkwellnse) oder Fusarium venenatum sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle ein Proteasemangel- oder Proteaseminusstamm.
Dies kann beispielsweise der Proteasemangelstamm Aspergillus oryzae JaL 125 sein, bei dem das alkalische Proteasegen, das als ”alp” bezeichnet wird, deletiert ist. Dieser Stamm ist in WO 97/35956 (Novo Nordisk) beschrieben.
Filamentöse Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung und -transformation der Protoplasten und die anschließende Regenerierung der Zellwand auf eine per se bekannte Weise umfasst. Die Verwendung von Aspergillus als Wirtsmikroorganismus ist in EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben.
Verfahren zur Herstellung einer Glucoamylasevariante
Bei wieder einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Glucoamylasevariante, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die der Produktion der Variante förderlich sind und das Gewinnen der Variante aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium umfasst.
Das zur Kultivierung der Zellen verwendete Medium, kann jedes herkömmliche Medium sein, das zum Züchten der in Frage kommenden Wirtszelle und zum Erhalt der Expression der erfindungsgemäßen Glucoamylasevariante geeignet ist. Geeignete Medien stehen von kommerziellen Anbietern zur Verfügung oder können nach veröffentlichten Rezepturen (z. B. wie in den Katalogen der American Type Culture Collection beschrieben) hergestellt werden.
Die aus den Wirtszellen sezernierte Glucoamylasevariante kann zweckmäßigerweise aus dem Kulturmedium durch wohlbekannte Verfahrensweisen gewonnen werden, die das Abtrennen der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration und das Präzipitieren proteinartiger Komponenten des Mediums mittels eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, und die anschließende Verwendung von chromatographischen Verfahren, wie Ionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen umfassen.
Stärkekonversion
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Glucose und dergleichen aus Stärke unter Verwendung von erfindungsgemäßen Glucoamylasevarianten bereit. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren die Schritte der partiellen Hydrolyse von Vorläuferstärke in Gegenwart von α-Amylase und anschließend das weitere Hydrolysieren der Freisetzung von D-Glucose aus den nicht reduzierenden Enden der Stärke oder verwandter Oligo- und Polysaccharidmoleküle in Gegenwart von Glucoamylase durch Spaltung von α-(1⌫4) und α-(1⌫6)-glucosidischen Bindungen.
Die partielle Hydrolyse der Vorläuferstärke unter Verwendung von α-Amylase stellt einen initialen Abbau der Stärkemoleküle durch Hydrolyse interner α-(1⌫4)-Verknüpfungen bereit. Bei kommerziellen Anwendungen wird die initiale Hydrolyse unter Verwendung von α-Amylase bei einer Temperatur von ungefähr 105°C geführt. Eine sehr hohe Stärkekonzentration wird prozessiert, im Allgemeinen 30 bis 40% Feststoffe. Die initiale Hydrolyse wird in der Regel vier bis fünf Minuten lang bei dieser erhöhten Temperatur durchgeführt. Die teilweise hydrolysierte Stärke kann dann in einem zweiten Tank übergeführt und ungefähr 1–2 Stunden bei einer Temperatur von 85 bis 98°C inkubiert werden, um ein Dextroseäquivalent (D. E.) von 10 bis 15 abzuleiten.
Der Schritt der weiteren Hydrolyse der Freisetzung von D-Glucose aus den nicht reduzierenden Enden der Stärke oder verwandter Oligo- und Polysaccharidmoleküle in Gegenwart von Glucoamylase wird normalerweise in einem separaten Tank bei einer reduzierten Temperatur zwischen 30 und 62°C durchgeführt. Vorzugsweise wird die Temperatur der Substratflüssigkeit auf zwischen 55 und 60°C abgesenkt. Der pH der Lösung wird von etwa 5,5 bis 6,5 auf einen Bereich zwischen 3 und 5,5 abgesenkt. Vorzugsweise beträgt der pH der Lösung 4 bis 4,5. Die Glucoamylase wird der Lösung zugesetzt, und die Reaktion wird 24–72 Stunden, vorzugsweise 36–48 Stunden, durchgeführt.
Unter Verwendung einer erfindungsgemäßen wärmestabilen Glucoamylasevariante können Saccharifizierungsverfahren bei einer höheren Temperatur als bei den traditionellen chargenweisen Saccharifizierungsverfahren durchgeführt werden. Erfindungsgemäß kann die Saccharifizierung bei Temperaturen im Bereich von über 60–80°C, vorzugsweise 63–75°C, durchgerührt werden. Dies trifft sowohl für traditionelle Batchverfahren (vorstehend beschrieben) als auch für kontinuierliche Saccharifizierungsverfahren zu.
Derzeit müssen kontinuierliche Saccharifizierungsverfahren einschließlich von einem oder mehreren Membrantrennschritten, d. h. Filtrationsschritten, bei Temperaturen von über 60°C durchgeführt werden, um in der Lage zu sein, einen einigermaßen hohen Fluss über die Membran aufrecht zu erhalten oder um die mikrobielle Verunreinigung zu minimieren. Darum stellen die wärmestabilen erfindungsgemäßen Varianten die Möglichkeit der Durchführung kontinuierlicher Saccharifizierungsverfahren in großem Maßstab zu einem vernünftigen Preis und/oder bei einer niedrigeren Enzymproteindosierung innerhalb eines Zeitraums bereit, der für industrielle Saccharifizierungsverfahren annehmbar ist. Erfindungsgemäß wird sogar die Saccharifizierungsdauer verkürzt.
Die Aktivität der Glucoamylasevariante (z. B. AMG-Variante) der Erfindung ist im Allgemeinen wesentlich höher bei Temperaturen zwischen 60–80°C als bei der traditionell verwendeten Temperatur zwischen 30–60°C. Vorzugsweise kann durch Erhöhen der Temperatur, bei der die Glucoamylase arbeitet, das Saccharifizierungsverfahren innerhalb einer kürzeren Zeitdauer durchgeführt werden.
Außerdem wird durch Verbesserung der Wärmestabilität die T_1/2 (Halbwertszeit, wie in dem Abschnitt ”Materialien und Methoden” definiert) verbessert. Wenn die Wärmestabilität der erfindungsgemäßen Glucoamylasevariante verbessert wird, muss eine kleinere Menge an Glucoamylase zugesetzt werden, um die Glucoamylase, die während des Saccharifizierungsverfahrens aktiviert wird, zu ersetzen. Mehr Glucoamylase wird während des erfindungsgemäßen Saccharifizierungsverfahrens aktiv gehalten. Außerdem wird auch das Risiko einer mikrobiellen Verunreinigung reduziert, wenn das Saccharifizierungsverfahren bei einer Temperatur über 63°C durchgeführt wird.
Die Glucoseausbeute aus einem typischen Saccharifizierungsversuch mit Glucoamylase, saurer Amylase und Pullulanase beträgt 95,5–96,5%. Die restlichen Kohlehydrate bestehen typischerweise aus 1% Maltose, 1,5–2% Isomaltose und 1–1,5% höheren Oligosacchariden. Die Disaccharide werden hergestellt, da die Glucoamylase bei hohen Konzentrationen an Glucose und hohen Spiegeln an Trockenmasse eine Tendenz zur Bildung von Reversionsprodukten besitzt.
Eine Glucoamylase mit einer erhöhten spezifischen Aktivität gegenüber Sacchariden, die in der Lösung nach Verflüssigung vorhanden sind und Sacchariden, die während der Saccharifizierung gebildet werden, wäre ein Vorteil, da eine verminderte Enzymproteindosierung oder eine kürzere Prozessdauer dann eingesetzt werden könnten. Im Allgemeinen weist die Glucoamylase eine Präferenz für Substrate auf, die aus längeren Sacchariden im Vergleich zu kurzkettigen Sacchariden bestehen und darum ist die spezifische Aktivität gegenüber z. B. Maltoheptaose 6-mal so hoch wie gegenüber Maltose. Eine erhöhte spezifische Aktivität gegenüber kurzkettigen Sacchariden, wie Maltose (ohne Reduzieren der Aktivität gegenüber Oligosacchariden) würde darum auch die Verwendung einer niedrigeren Enzymdosierung und/oder einer kürzeren Prozessdauer erlauben.
Außerdem kann eine höhere Glucoseausbeute mit einer Glucoamylasevariante mit einer erhöhten alpha-1,4-hydrolytischen Aktivität erhalten werden (wenn die alpha-1,6-Aktivität unverändert ist oder auch herabgesetzt ist), da eine reduzierte Menge an Enzymprotein verwendet wird, und die alpha-1,6-Reversionsproduktbildung darum herabgesetzt ist (weniger Isomaltose).
Die spezifische Aktivität kann unter Verwendung des in dem Abschnitt ”Materialien und Methoden” beschriebenen Verfahrens bei 37°C oder 60°C gemessen werden.
Beispiele für das Saccharifizierungsverfahren, wobei die erfindungsgemäßen Glucoamylasevarianten verwendet werden können, umfassen die Verfahren, die in JP 3-224493 ; JP 1-191693 ; JP 62-272987 ; EP 452 238 und WO 99/27124 beschrieben sind.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Saccharifizierung einer verflüssigten Stärkelösung, das die Schritte umfasst,

(i) einen Saccharifizierungsschritt, während dessen ein oder mehrere enzymatische Saccharifizierungsstadien stattfinden, und den anschließenden Schritt von
(ii) einen oder mehreren Hochtemperatur-Membrantrennschritten, wobei die enzymatische Saccharifizierung unter Verwendung einer erfindungsgemäßen wärmestabilen Glucoamylasevariante durchgeführt wird.

Die erfindungsgemäße(n) Glucoamylasevariante(n) kann bei dem vorliegenden erfinderischen Verfahren in Kombination mit einem Enzym eingesetzt werden, das nur α-(1⌫6)-glucosidische Bindungen in Molekülen mit mindestens vier Glucosylresten hydrolysiert. Vorzugsweise kann die erfindungsgemäße Glucoamylasevariante in Kombination mit Pullulanase oder Isoamylase verwendet werden. Die Verwendung von Isoamylase und Pullulanase zum „Debranching”, die molekularen Eigenschaften der Enzyme, und die potenzielle Verwendung der Enzyme mit Glucoamylase ist bei G. M. A. van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101–142, ausgeführt.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Glucoamylasevariante bei einem Stärkekonversionsverfahren.
Weiterhin kann die erfindungsgemäße Glucoamylasevariante bei einem kontinuierlichen Stärkekonversionsverfahren verwendet werden, das einen kontinuierlichen Saccharifizierungsschritt einschließt.
Die erfindungsgemäßen Glucoamylasevarianten können auch in immobilisierter Form verwendet werden. Diese wird zweckmäßigerweise und oft zur Herstellung von Spezialsirupen verwendet, wie Maltosesirupe, und weiterhin für den Raffinatstrom von Oligosacchariden in Verbindung mit der Herstellung von Fructosesirupen.
Die erfindungsgemäße Glucoamylase kann auch bei einem Verfahren zur Herstellung von Ethanol für Kraftstoff oder Getränke verwendet werden oder kann bei einem Fermentationsverfahren zur Herstellung organischer Verbindungen, wie Citronensäure, Ascorbinsäure, Lysin, Glutaminsäure, verwendet werden.
Materialien und Methoden
Materialien:
Enzyme:

AMG G1: Aspergillus niger-Glucoamylase G1 offenbart bei Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), 1 097–1 102, und SEQ ID NO: 13, erhältlich von Novo Nordisk.
AMG G2: Verkürzte Aspergillus niger-Glucoamylase G1, gezeigt in SEQ ID NO: 2, erhältlich von Novo Nordisk.

Lösungen:

Puffer: 0,05 M Natriumacetat (6,8 g in 1 l Milli-Q-Wasser), pH 4,5
Stopplösung: 0,4 M NaOH
OGD-perid, 124036, Boehringer Mannheim

Substrat:

Maltose: 29 mM (1 g Maltose in 100 ml 50 mM Natriumacetat, pH 4,5) (Sigma)
Maltopheptaose: 10 mM, 115 mg/10 ml (Sigma)

Wirtszelle:

A. oryzae JaL 125: Aspergillus oryzae IFO 4177, erhältlich vom Institut for Fermentation, Osaka; 17–25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku, Osaka, Japan, wobei das alkalische Proteasegen als ”alp” bezeichnet ist (beschrieben von Murakami K et al., (1991), Agric. Biol. Chem. 55, S. 2 807–2 811), deletiert durch ein einstufiges Genersatzverfahren (beschrieben von G. May in ”Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi” (1992), S. 1–25. Hrsg. J. R. Kinghorn und G. Turner; Blackie Academic and Professional), unter Verwendung des A. oryzae pyrG-Gens als Marker. Der Stamm JaL 125 ist weiterhin in WO 97/35956 (Novo Nordisk) offenbart.

Mikroorganismen:

Stamm: Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATαleu2-Δ2 ura3-52 his4-539 pep4-Δ1 (cir+)

Plasmide:

pCAMG91: siehe 1. Plasmid, das die Aspergillus niger G1-Glucoamylase (AMG G1) umfasst. Die Konstruktion von pCAMG91 ist bei Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (7), S. 1 581–1 585, beschrieben.
pMT838: Plasmid, das die verkürzte Aspergillus niger-Glucoamylase G2 (SEG ID NO: 2) codiert.
pJSO026 (S. cerevisiae-Expressionsplasmid) (J. S. Okkels, (1996) ”A URA3-promotor deletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, Bd. 782 of the Annals of the New York Academy of Sciences). Insbesondere leitet sich das Expressionsplasmid pJSO37 von pYES 2.0 durch Ersatz des induzierbaren GAL1-Promotors von pYES 2.0 durch den konstitutiv exprimierten TPI(Triosephosphatisomerase)-Promotor aus Saceharomyces cerevisiae (Albert und Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl. Genet., 1, 419–434), und Deletieren eines Teils des URA3-Promotors ab.

Verfahren:
Transformation von Saccharomyces cerevisiae YNG318
Die DNA-Fragmente und die geöffneten Vektoren werden gemischt und in die Hefe Saccharomyces cerevisiae YNG318 durch Standardverfahren transformiert.
Die Bestimmung der spezifischen Aktivität A_s k_cat (sec.^–1)
750 μl Substrat (1% Maltose, 50 mM Natriumacetat, pH 4,3) wird 5 Minuten bei der gewählten Temperatur, wie 37°C oder 60°C, inkubiert.
50 μl Enzym, verdünnt in Natriumacetat, wird zugesetzt.
Aliquote von 100 μl werden nach 0, 3, 6, 9 und 12 Minuten entfernt und auf 100 μl 0,4 M Natriumhydroxid übergeführt, um die Reaktion zu stoppen. Eine Blindprobe ist eingeschlossen.
20 μl wird auf eine Mikrotiterplatte übergeführt, und 200 μl GOD-Perid-Lösung werden zugesetzt. Die Extinktion wird nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur bei 650 nm gemessen.
Glucose wird als Standard verwendet, und die spezifische Aktivität wird als k_cat (sec.^–1) berechnet.
Bestimmung der AGU-Aktivität und As AGU/mg
Eine Novo-Amylogllucosidaseeinheit (AGU) ist als die Menge an Enzym definiert, die 1 Mikromol Maltose pro Minute bei 37°C und pH 4,3 hydrolysiert. Eine ausführliche Beschreibung des analytischen Verfahrens (AEL-SM-0131) steht auf Nachfrage von Novo Nordisk zur Verfügung.
Die Aktivität wird als AGU/ml durch ein nach (AEL-SM-0131) modifiziertes Verfahren unter Verwendung des Glucose-GOD-Perid-Testsatzes von Boehringer Mannheim, 124036, bestimmt. Standard: AMG-Standard, Charge 7–1195, 195 AGU/ml.
375 μl Substrat (1% Maltose in 50 mM Natriumacetat, pH 4,3) wird 5 Minuten bei 37°C inkubiert. 25 μl Enzym, verdünnt in Natriumacetat, wird zugesetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten durch Zugabe von 100 μl 0,25 M NaOH gestoppt. 20 μl wird in eine 96-Well Mikrotiterplatte übergeführt und 200 μl GOD-Perid-Lösung wird zugesetzt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird die Extinktion bei 650 nm gemessen und die Aktivität in AGU/ml aus dem AMG-Standard berechnet.
Die spezifische Aktivität in AGU/mg wird anschließend aus der Aktivität (AGU/ml) dividiert durch die Proteinkonzentration (mg/ml) berechnet.
Transformation von Aspergillus oryzae (allgemeine Verfahrensweise)
100 ml YPD (Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) werden mit Sporen von A. oryzae beimpft und unter Schütteln für etwa 24 Stunden inkubiert. Das Mycel wird durch Filtration über Miracloth geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO₄ gewaschen. Das Mycel wird in 15 ml 1,2 M MgSO₄, 10 mM NaH₂PO₄, pH 5,8, suspendiert. Die Suspension wird auf Eis gekühlt und 1 ml Puffer, enthaltend 120 mg Novozyme^TM 234, wird zugesetzt. Nach 5 min wird 1 ml 12 mg/ml BSA (Sigma-Typ H25) zugesetzt, und die Inkubation wird unter sanftem Rühren 1,5–2,5 h bei 37°C fortgesetzt, bis eine große Anzahl von Protoplasten in der Probe, die unter einem Mikroskop untersucht wird, sichtbar ist.
Die Suspension wird über Miracloth filtriert, das Filtrat in ein Sterilröhrchen übergeführt und mit 5 ml 0,6 M Sorbit, 100 mM Tris-HCl, pH 7,0, überschichtet. Die Zentrifugation wird 15 min bei 1 000 g durchgeführt, und die Protoplasten werden aus dem Überstand des MgSO₄-Kissens gesammelt. 2 Volumina STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂) werden der Protoplastensuspension zugesetzt, und das Gemisch wird 5 min bei 1 000 g zentrifugiert. Das Protoplastenpellet wird in 3 ml STC resuspendiert und repelletisiert. Dieses wird wiederholt. Schließlich werden die Protoblasten in 0,2–1 ml STC resuspendiert.
100 μl Protoplastensuspension werden mit 5–25 μg p3SR2 (ein A. nidulan amdS-Gen, das bei Hynes et al., Mol. and Cel. Biol., Bd. 3, Nr. 8, 1 430–1 439, Aug. 1983 beschriebene Plasmid trägt) in 10 μl STC gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 25 min stehen gelassen. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, werden zugesetzt und sorgfältig (zweimal) vermischt, und schließlich werden 0,85 ml der gleichen Lösung zugesetzt und sorgfältig vermischt. Das Gemisch wird 25 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, bei 2 500 g 15 min zentrifugiert, und das Pellet wird in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer erneuten Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimalplatten ausgestrichen (Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51–56), die 1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl enthalten, um das Hintergrundwachstum zu hemmen. Nach 4–7 Tagen Inkubation bei 37°C werden die Sporen ausselektiert, in sterilem Wasser suspendiert und auf einzelne Kolonien ausgestrichen. Diese Vorgehensweise wird wiederholt, und die Sporen einer einzelnen Kolonie werden nach der zweiten Reisolierung als eine definierte Transformante aufbewahrt.
Fed-Batch-Fermentation
Die Fed-Batch-Fermentation wird in einem Medium durchgeführt, das Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt einschließt. Die Fed-Batch-Fermentation wird durch Überimpfen einer Schüttelkolbenkultur von in Frage kommenden A. oryzae-Wirtszellen in ein Medium, umfassend 3,5% der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle, durchgeführt. Nach 24 Stunden Kultivieren bei pH 5,0 und 34°C wird die kontinuierliche Zufuhr von zusätzlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen gestartet. Die Kohlenstoffquelle wird als der limitierende Faktor gehalten, und es wird sichergestellt, dass Sauerstoff in Überschuss vorhanden ist. Die Fed-Batch-Kultivierung wird 4 Tage fortgesetzt, wonach die Enzyme durch Zentrifugation, Ultrafiltration, Klarfiltration und Keimfiltration gewonnen werden können.
Reinigung
Die Kulturlösung wird filtriert und es wird Ammoniumsulfat (AMS) bis auf eine Konzentration von 1,7 M AMS zugesetzt, und der pH wird auf pH 5 eingestellt. Das präzipitierte Material wird durch Zentrifugation entfernt, und die Lösung, die Glucoamylaseaktivität enthält, wird auf eine Toyo-Pearl-Butylsäule aufgetragen, die zuvor in 1,7 M AMS, 20 mM Natriumacetat, pH 5, äquilibriert wurde. Ungebundenes Material wird mit dem Äquilibrierungspuffer ausgewaschen. Gebundene Proteine werden mit 10 mM Natriumacetat, pH 4,5, unter Verwendung eines linearen Gradienten von 1,7–0 M AMS über 10 Säulenvolumina eluiert. Glucoamylase enthaltende Fraktionen werden gesammelt und gegen 20 mM Natriumacetat, pH 4,5, dialysiert. Anschließend wurde die Lösung auf eine Q-Sepharosensäule aufgebracht, die zuvor in 10 mM Piperazin, Sigma, pH 5,5, äquilibiriert wurde. Ungebundenes Material wird mit dem Äquilibrierungspuffer ausgewaschen. Gebundene Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 0–0,3 M Natriumchlorid in 10 mM Piperazin, pH 5,5 über 10 Säulenvolumina eluiert. Glucoamylase enthaltende Fraktionen werden gesammelt, und die Reinheit wurde durch SPS-PAGE bestätigt.
T_1/2 (Halbwertszeit) Verfahren I
Die Wärmestabilität der Varianten wird als T_1/2 unter Verwendung des folgenden Verfahrens bestimmt: 950 Mikroliter 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,3) (NaOAc) werden 5 min bei 68°C oder 70°C inkubiert. 50 Mikroliter Enzym in Puffer (4 AGU/ml) werden zugesetzt. 2 × 40 Mikroliter Proben werden bei 0, 5, 10, 20, 30 und 40 Minuten entnommen und auf Eis gekühlt. Die Aktivität (AGU/ml), die vor Inkubation (0 min) gemessen wird, wird als Referenz (100%) verwendet. Der Abfall in der Stabilität (in Prozent) wird als Funktion der Inkubationsdauer berechnet. Die prozentuale Glucoamylaserestaktivität wird zu verschiedenen Zeiten bestimmt. T_1/2 ist die Zeitdauer, bis zu der die prozentuale relative Aktivität auf 50% abgenommen hat.
T_1/2 (Halbwertszeit) (Verfahren II)
Die T_1/2 wird durch Inkubieren des in Frage kommenden Enzyms (ca. 0,2 AGU/ml) in 30% Glucose, 50 mM Natriumacetat bei pH 4,5 bei der in Frage kommenden Temperatur (z. B. 70°C) gemessen. Die Proben werden zu den eingestellten Zeitintervallen entnommen und auf Eis gekühlt, und die Enzymrestaktivität wird durch das pNPG-Verfahren (wie nachstehend beschrieben) gemessen.
Die prozentuale Glucoamylaserestaktivität wird zu verschiedenen Zeiten bestimmt. T_1/2 ist die Zeitdauer, bis zu der die prozentuale relative Aktivität auf 50% abgenommen hat.
Enzymrestaktivität (pNPG-Verfahren)
pNPG-Reagens:
0,2 g pNPG (p-Nitrophenylglucopyranosid) werden in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,3) gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.
Boratlösung:
3,8 g Na₂B₄O₇·10 H₂O werden in Milli-Q-Wasser gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.
25 Mikroliter Proben werden 50 μl Substrat zugesetzt und 2 h bei 50°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 150 μl Boratlösung gestoppt. Die optische Dichte wird bei 405 nm gemessen und die Restaktivität berechnet.
Konstruktion von pAMGY
Der pAMGY-Vektor wurde wie folgt konstruiert: Das Lipasegen in pJSO026 wurde durch das AMG-Gen ersetzt, das mit dem Vorwärts-Primer FG2: 5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3' und dem Rückwärts-Primer: RG2: 5'-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT-3' unter Verwendung des Template-Plasmids pLAC103, das das AMG-Gen enthält, PCR-amplifiziert war. Das pJSO026-Plasmid wurde mit XbaI und SmaI bei 37°C 2 h verdaut, und das PCR-Amplikon wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments abgestumpft und dann mit XbaI verdaut. Das Vektorfragment und das PCR-Amplikon wurden ligiert und in E. coli durch Elektrotransformation transformiert. Der resultierende Vektor wird als pAMGY bezeichnet.
Konstruktion von pLaC103
Der A. niger AMGII-cDNA-Klon (Boel et al., (1984), supra) wird als Quelle für die Konstruktion von pLaC103 eingesetzt, das auf die S. cerevisiae-Expression der GII-Form von AMG abzielt.
Die Konstruktion erfolgt in mehreren Schritten, die nachstehend ausgeführt sind:
pT7-212 ( EP37856 / US-Patentschrift Nr. 5162498 ) wird mit XbaI gespaltet mit Klenow-DNA-Polymerase und dNTP abgestumpft. Nach Spaltung mit EcoRI wird das resultierende Vektorfragment aus einer Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit dem 2,05 kB-EcoR1-EcoRV-Fragment von pBoe153 ligiert, wodurch die XbaI-Stelle in dem EcoRV-Ende des AMC codierenden Fragments in dem resultierenden Plasmid pG2x rekreiert wird.
Um DNA stromaufwärts von dem AMG cds zu entfernen und die AMG codierende DNA mit einer entsprechenden Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle auszustatten, wurde das folgende Konstrukt hergestellt:
Das 930 bp EcoRI-PstI-Fragment von p53 wurde isoliert und einer AluI-Spaltung unterzogen, das resultierende 771 bp Alu-PstI-Fragment wurde in pBR322 mit abgestumpfter EcoRI-Stelle (siehe oben) ligiert und mit PstI in dem resultierenden Plasmid pBR-AMG' gespalten, die EcoRI-Schnittstelle wurde unmittelbar 34 bp von dem Initiationscodon der AMG cds rekreiert.
Aus pBR-AMG' wurde das 775 bp EcoRI-PstI-Fragment isoliert und mit dem 1 151 bp PstI-XbaI-Fragment aus pG2x in einer Ligationsreaktion, die das XbaI-EcoRI-Vektorfragment von pT7-212 einschloss, verknüpft.
Das resultierende Plasmid pT7GII wurde einer BamHI-Spaltung in Gegenwart von alkalischer Phosphatase und einer einschließenden partiellen SphI-Spaltung nach Inaktivierung der Phosphatase unterzogen. Aus dieser Reaktion stammt das 2 489 bp SphI-BamHI-Fragment, das den S. c. TPI-Promotor in Verknüpfung mit der AMGII cds umfasst.
Das obige Fragment zusammen mit dem 1 052 bp BamHI-Fragment von pT7GII wurde mit dem alkalische Phosphatase behandelten Vektorfragment von pMT743 ( EP37856 / US 5162498 ) ligiert, der aus dem SphI-BamHI-Verdau resultierte. Das resultierende Plasmid ist pLaC103.
Screening auf wärmestabile AMG-Varianten
Die Bibliotheken werden in dem wärmestabilen Filterassay, der nachstehend beschrieben ist, gescreent.
Filterassay auf Wärmestabilität
Hefebibliotheken werden auf einem Sandwich von Celluloseacetat (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) und Nitrocellulosefilter (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) auf SCFura-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin bei 30°C für mindestens 72 h ausplattiert. Die Kolonien werden zweifach auf PVDF-Filter (Immobilon-P, Millipore, Bedford), die 1 min mit Methanol aktiviert wurden, oder alternativ auf Protran-Filter (keine Aktivierung) ausplattiert und anschließend in 0,1 M NaAc gewaschen und sodann bei Raumtemperatur 2 h inkubiert. Die Kolonien werden von den PVDF/Protran-Filtern mit Leitungswasser abgewaschen. Die Filtersandwiches und die PVDF/Protran-Filter werden vor der Inkubation jeweils speziell mit einer Nadel markiert, um in der Lage zu sein, nach dem Screening die positiven Varianten auf den Filtern zu lokalisieren. Die PVDF-Filter mit gebundenen Varianten werden in einem Behälter mit 0,1 M NaAc, pH 4,5 übergeführt und bei 47°C oder alternativ bei 67–69°C im Falle von Protran-Filter 15 min inkubiert. Der Sandwich von Celluloseacetat und Nitrocellulosefilter auf SC Ura-Agar-Platten wird bis zur Verwendung bei Raumtemperatur aufbewahrt. Nach der Inkubation werden die Restaktivitäten auf den Platten, die 5% Maltose, 1% Agarose, 50 mM NaAc, pH 4,5, enthalten, nachgewiesen. Die Assay-Platten mit PVDF-Filter werden auf die gleiche Weise wie die Filtersandwiches markiert und 2 h bei 50°C inkubiert. Nach Entfernung der PVDF-Filter werden die Assayplatten mit Glucose GOD-Perid (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) angefärbt. Varianten mit Restaktivität werden auf den Assayplatten als dunkelgrüne Flecken auf weißem Hintergrund nachgewiesen. Die verbesserten Varianten werden auf haltbaren Platten angeordnet. Die verbesserten Varianten werden zwei Mal unter den gleichen Bedingungen wie der erste Screen erneut gescreent.
Allgemeine Verfahren zur statistischen Mutagenese unter Verwendung des DOPE-Programms
Die statistische Mutagenese kann durch die folgenden Schritte durchgeführt werden:

1. Auswahl von Regionen von Interesse zur Modifikation in dem Elternenzym.
2. Entscheiden über Mutationsstellen und Nicht-Mutationsstellen in der gewählten Region.
3. Entscheiden darüber, welche Art von Mutationen durchgeführt werden sollten, z. B. bezüglich der gewünschten Stabilität und/oder Leistung der zu konstruierenden Variante,
4. Selektion strukturell annehmbarer Mutationen,
5. Einstellen der durch Schritt 3 gewählten Reste bezüglich Schritt 4.
6. Analyse durch die Verwendung eines geeigneten DOPE-Algorithmus der Nucleotidverteilung.
7. Sofern notwendig, Einstellen der gewünschten Reste auf genetischem Code-Realismus, z. B. unter Berücksichtigung von Vorgaben, die aus dem genetischen Code hervorgehen, z. B. um das Einbringen von Stopp-Codons zu vermeiden; der Fachmann weiß, dass einige Codon-Kombinationen in der Praxis nicht verwendet werden können und dass sie angepasst werden müssen.
8. Herstellung von Primern.
9. Durchführung von statistischer Mutagenese unter Verwendung der Primer.
10. Auswahl resultierender Glucoamylasevarianten durch Screening auf die gewünschten verbesserten Eigenschaften.

DOPE-Algorithmus
Geeignete DOPE-Algorithmen zur Verwendung in Schritt 6 sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt. Ein solcher Algorithmus ist von Tomandl, D. et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11: 29–38, beschrieben. Ein weiterer Algorithmus ist DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, und Kretzschmar, T (1989), Nucleic Acids Research 26: 697–702).
Verfahren zur Extraktion zur Temperaturaktivität wichtiger Regionen unter Verwendung molekularer Simulation
Die Röntgenstruktur und/oder die im Modell nachgebaute Struktur des Enzyms von Interesse, hier AMG, werden Moleküldynamiksimulationen unterzogen. Die Moleküldynamiksimulation erfolgt unter Verwendung des CHARMM(von Molecular simulations (MSI))-Programms oder anderer geeigneter Programme, z. B. DISCOVER (von MSI). Die Dynamik erfolgt im Vakuum oder einschließlich von Kristallwässern oder mit dem in Frage kommenden Enzym, das in ein geeignetes Wasser, z. B. eine Kugel oder einen Behälter, eingebettet ist. Die Simulation wird 300 Pikosekunden (PS) oder mehr, z. B. 300–1 200 PS, laufen gelassen. Die Isotropenfluktuationen werden für die CA-Kohlenstoffe der Strukturen extrahiert und ein Vergleich zwischen den Strukturen wird vorgenommen. Weitere Einzelheiten darüber, wie die Isotropenfluktuationen erhalten werden können, können in dem CHARMM-Handbuch (von MSI erhältlich) vorgefunden werden.
Die Moleküldynamiksimulation kann unter Verwendung von Standardladungen auf den ladbaren Aminosäuren durchgeführt werden. Beispielsweise sind Asp und Glu negativ geladen, und Lys und Arg sind positiv geladen. Dieser Zustand entspricht dem pH-Medium von ungefähr 7,0. Um einen niedrigeren pH zu analysieren, kann die Titration des Moleküls vorgenommen werden, um die veränderten pKa's der normalen titrierfähigen Reste innerhalb pH 2–10 zu erhalten; Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr und His. Auch Ser, Thr und Cys sind titrierfähig, jedoch werden sie hier nicht berücksichtigt. Hier wurden die veränderten Ladungen aufgrund des pH-Wertes bereits als all Arg beschrieben, Lys negativ bei hohem pH und all Asp, Glu sind ungeladen. Dies stellt einen pH um 4 bis 5 nach, wo die Titration von Asp und Glu normalerweise stattfindet.
Der Modellaufbau des Enzyms von Interesse kann durch das „HOMOLOGY”-Modell in dem MSI-Programmpaket erhalten werden. Die Kristallstruktur der Aspergillus awamori-Variante X100 kann z. B. in 3GLY und 1DOG in der Brookhaven-Datenbasis vorgefunden werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Konstruktion von AMG G2-Varianten
Ortsgerichtete Mutagenese:
Zur Konstruktion von Varianten von AMG G2 (SEQ ID NO: 2) wurde der handelsübliche Testsatz „Chamäleon”, ein doppelsträngiger ortsgerichteter Mutagenese-Testsatz, nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Das Gen, das das in Frage kommende AMG G2-Enzym codiert, ist auf pMT838 lokalisiert, hergestellt durch Deletion der DNA zwischen G2 nt. 1362 und G2 nt. 1530 in dem Plasmid pCAMG91 (siehe 1), das die AMG G1-Form einschließt.
Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde die ScaI-Stelle des Ampicillin-Gens von pMT838 zu einer Mlu1-Stelle unter Verwendung der folgenden Primer verändert:
(Somit wurde die ScaI-Stelle, die in den Ampicillin-Resistenzgen gefunden wird, geändert und als eine MluI-Schnittstelle eingesetzt.) Der pMT838-Vektor, der das in Frage kommende AMG-Gen einschließt, wurde anschließend als ein Template für die DNA-Polymerase und Oligo 7258 (SEQ ID NO: 3) und 21401 (SEQ ID NO: 4) verwendet.
Primer Nr. 21401 (SEQ ID NO: 4) wurde als der Selektionsprimer verwendet.
(Veränderungen der ScaI-Stelle, die in dem AMG-Gen gefunden werden ohne Änderung der Aminosäuresequenz.)
Die gewünschte Mutation (z. B. das Einbringen eines Cysteinrestes) wird in das in Frage kommende AMG-Gen durch Addition von geeigneten Oligonucleotiden, die die gewünschte Mutation einschließen, eingebracht.
Der Primer 107581 wurde zum Einbringen von T12P verwendet.
Die Mutationen werden durch Sequenzieren des ganzen Gens verifiziert. Das Plasmid wurde unter Verwendung des vorstehend im Abschnitt ”Materials & Methods” beschriebenen Verfahrens in A. oryzae transformiert. Die Variante wurde fermentiert und, wie vorstehend in dem Abschnitt ”Materialien und Methoden” beschrieben, gereinigt.
Beispiel 2
Konstruktion durch lokalisierte, statistische, dotierte Mutagenese von A. niger-AMG-Varianten mit verbesserter Wärmestabilität im Vergleich zu dem Elternenzym
Um die Wärmestabilität der A. niger-AMG zu verbessern, wurde eine statistische Mutagenese in einer vorgewählten Region durchgeführt.
Region: L19-G35
Region: A353-V374
Die DOPE-Software (siehe Materialien und Methoden) wurde zur Bestimmung von durch Spiken behandelte Codons für jede vorgeschlagene Änderung in den obigen Regionen verwendet, die die Menge an Stopp-Codons (siehe Tabelle 1) minimieren. Die genaue Verteilung der Nucleotide wurde in den drei Positionen des Codons berechnet, um die vorgeschlagene Population von Aminosäureänderungen zu ergeben. Die dotierten Regionen wurden speziell in den angegebenen Positionen dotiert, um eine hohe Wahrscheinlich dafür zu haben, dass die gewünschten Reste erhalten werden, aber immer noch andere Möglichkeiten gewährt sind.

Die erste Spalte ist die zu mutierende Aminosäure, die zweite Spalte ist der Prozentsatz von Wildtyp und die dritte Spalte definierte die neue Aminosäure(n). Tabelle 1 Dotieren in L19-G35

L19	90%	N
N20	95%	T
N21	konstant
I22	konstant
G23	95%	A
A24	90%	S, T
D25	93%	S, T, R
G26	95%	A
A27	90%	S, T
W28	< 80%	R, Y
Y29	konstant
S30	93%	T, N
G31	95%	A
A32	95%	V
D33	80%	R, K, H
S34	90%	N
G 35	konstant

Der resultierende dotierte Oligonucleotidstrang ist in Tabelle 2 als Sense-Strang gezeigt: mit der Primersequenz, der Wildtyp-Nucleotidsequenz, der Elternaminosäuresequenz und der Verteilung von Nucleotiden für jede dotierte Position.
Tabelle 2
Verteilung der Nucleotide für jede dotierte Position.

1: A10, C90
2: A6, T94
3: A95, C5
4: G95, C5
5: G91, A3, T3, C3
6: G95, A3, C2
7: G3, A95, C2
8: G92, A4, T4
9: A3, T97
10: G95, T5
11: G3, A97
12: G95, A2, C3
13: T5, C95
14: G88, A8, C4
15: G7, A93
16: G4, C96
17: G4, A96
18: G95, A2, C3

Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 6):
Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 7):

Tabelle 3 Dotieren in Regionen A353-V374:

A353	< 80%	D, E, Q, N, Y
L354	90%	Q, E
Y355	90%	N, Q
S356	90%	T, D, N
G357	80%	P, A, S, T
A358	93%	S
A359	90%	S, T, N
T360	90%	R, K
G361	85%	A, S, T
T362	90%	S
Y363	konstant
S364	93%	D
S365	93%	N, Q, K
S366	93%	P, D
S367	konstant
S368	93%	D, N, T
T369	93%	Q, E
Y370	konstant
S371	93%	N
S372	93%	N, T
I373	konstant
V374	93%	N, Y, H

Der resultierende dotierte Oligonucleotidstrang ist in Tabelle 4 als Sendestrang gezeigt: Mit der Primersequenz, der Wildtyp-Nucleotidsequenz, der Elternaminosäuresequenz und der Verteilung von Nucleotiden für jede dotierte Position.
Tabelle 4:
Verteilung der Nucleotide für jede dotierte Position.

1: G91, A3, T3, C3
2: A13, C87
3: A40, T60
4: G3, A3, C94
5: A6, T94
6: G4, A4, T92
7: G2, A96, C2
8: G93, A3.5, C3.5
9: G87, A8, C5
10: A84, C16
11: G93, T7
12: G92, A5, T3
13: A3, C97
14: G3, A97
15: G2, A2, T4, C92
16: G93, A7
17: G93, C7
18: A90, T10

Primer: FAMGIV (SEQ ID NO: 8):

19: G4, A96
20: G95, A5
21: G96, A4
22: G3, C97
23: G2, A1, T95, C2
24: A3, C97
25: G95, A3, C2
26: G2, A96, C2
27: A5, C95
28: A95, T5
29: G2, A98
30: G94, A4, C2
31: G94, A3, T1, C2
32: A4, T96
33: A20, C80

Primer: FAMGIV (SEQ ID NO: 8)
Primer RAMGVI (SEQ ID NO: 9)
Statistische Mutagenese
Die aus Tabelle 2 und 3 hervorgehenden durch Spiken behandelten Oligonucleotide (was mit einem allgemeinen Begriff als FAMG bezeichnet wird) und die Rückwärts-Primer RAMG für die L19-G35-Region und spezifische SEQ ID NO: 2-Primer, die den N-Terminus abdecken (FG2: 5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3' (SEQ ID NO: 10) und C-Terminus (RG2: 5-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT (SEQ ID NO: 11) werden zur Erzeugung von PCR-Bibliothek-Fragmenten durch das „overlap extension”-Verfahren (Horton et al., Gene, 77 (1989), S. 61–68) mit einer Überlappung von 21 Basenpaaren verwendet. Das Plasmid pAMGY ist das Template für die Polymerasekettenreaktion. Die PCR-Fragmente werden durch homologe Rekombination in den E. coli/Hefe-Shuttle-Vektor pAMGY (siehe Materialien und Methoden) kloniert.
Screening
Die Bibliothek wurde in den Wärmestabilitätsfilterassays unter Verwendung eines Protran-Filters und Inkubieren bei 67–69°C, wie im Abschnitt ”Materialien & Methoden” vorstehend beschrieben, gescreent.
Beispiel 3
Konstruktion durch PCR-Shuffling von A. niger-AMG-Varianten, mit durch Spiken behandelten DNA-Oligonucleotiden, mit verbesserter Wärmestabilität im Vergleich zu dem Elternenzym
Das Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahren wurde verwendet, um DNA-Fragmente herzustellen, die das AMG-Gen und flankierende Regionen tragen. Ungefähr 10 μg DNA wurde mit Dnase verdaut und auf einem 2% Agarosegel laufen gelassen. Fragmente von 50–150 bp wurden aus dem Gel gereinigt. Ungefähr 1 μg gereinigte Fragmente wurden mit einem 5–15-fachen molaren Überschuss von Oligonucleotiden gemischt, die die gewünschten Mutationen tragen. Die Oligonucleotide waren von der folgenden Art (zur Konstruktion von Hklib1, Hklib2, Hklib3 etc.):
Zu dem Gemisch von Dnase behandelter DNA und Oligonucleotiden wurden Nucleotide, PCR-Puffer und Taq/Pwo-Polymerase zugesetzt. Eine PCR-Assembly-Reaktion wurde durchgeführt, wobei zunächst 94°C für 2 min, anschließend 35–40 Cyclen mit den folgenden Inkubationszeiten verwendet wurden: 94°C, 30 s; 45°C, 30 s; 72°C, 60 s; anschließend zuletzt 72°C für 5 min. Eine PCR-Amplifikationsreaktion wurde mit 1 μl der Assembly-Reaktion als Template und unter Zugabe der Primer, die an Regionen binden, die das AMG-Gen flankieren, durchgeführt. Parameter: zuerst 94°C für 2 min, anschließend 35–40 Cyclen mit den folgenden Inkubationszeiten: 94°C, 30 s; 55°C, 30 s; 72°C, 90 s; anschließend zuletzt 72°C für 10 min.
Das resultierende PCR-Produkt wurde aus einem 1% Agarosegel gereinigt, mit linearisiertem Vektor gemischt und in kompetente Hefezellen transformiert, wie vorstehend beschrieben.
Beispiel 4 (Referentiell)
Spezifische Aktivität

AMG G2-Varianten wurden, wie vorstehend beschrieben, in Beispiel 1 konstruiert. Die spezifische Aktivität als k_cat wurde an gereinigten Proben bei pH 4,3, 37°C, unter Verwendung von Maltose und Maltohepatose als Substrat gemessen, wie im Abschnitt ”Materialen & Methoden” vorstehend beschrieben. Die spezifische Aktivität als AGU/mg wurde ebenfalls bei pH 4,3, 37°C, unter Verwendung von Maltose als Substrat, wie im Abschnitt ”Materialien & Methoden” vorstehend beschrieben, gemessen.

	Kcat (sec.–1)
Variant	Maltose	Maltoheptaose
AMG G2 (wt)	6.0	38
N110T	9.7	27.8
V111P	12.0	43.2
S119P	6.2	44.0
G127A	21.0	40.0
G207N	30.5	36.3

Variante	AGU/mg
AMG G2 (Wild Typ)	1.6
N110T	3.5
V111P	3.1
S119P	2.1
G127A	5.8
G207N	5.7
L3N	2.3
S56A	2.6
A102*	2.5
D403S	2.2
I18V + T51S + S56A + V59T + L60A	3.3
S119P + Y402F	2.7
S119P + I189T + Y223F + F227Y + Y402F	3.0

Beispiel 5 (Referentiell)
Wärmestabilität bei 70°C
Eine AMG G2 S119P-Variante wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Ansatzes konstruiert.
Die Wärmestabilität wurde als T_1/2 unter Verwendung von Verfahren I und als % Restaktivität nach Inkubation für 30 min in 50 mM NaOAc, pH 4,5, 70°C, 0,2 AGU/ml, wie im Abschnitt ”Materialien & Methoden” vorstehend beschrieben, bestimmt. Das Ergebnis der Tests ist in der Tabelle nachstehend aufgeführt und wird mit der Wildtyp A. niger AMG G2 verglichen.

A. niger AMG (Enzym) Restaktivität % T_1/2 (min.)

S119P-Variante 22 17

Wildtyp (SEQ ID NO: 2) 13 8
Beispiel 6
Wärmestabilität bei 68°C
AMG G2-Varianten wurden unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Ansatzes konstruiert, mit der Ausnahme der Varianten Nr. 1 und 2 in der Tabelle nachstehend, die durch Shuffling, wie in WO 95/22625 (von Affymax Technologies N. V.) beschrieben, hergestellt wurden.

Die Wärmestabilität wurde als T_1/2 unter Verwendung von Verfahren I bei 68°C bestimmt, wie im Abschnitt ”Materialien & Methoden” beschrieben, und mit der Wildtyp A. niger AMG G2 unter den gleichen Bedingungen verglichen. Die Bewertung von Varianten wurde in Kulturlösung nach Filtration der Überstände durchgeführt.

	Variante	T½ (min)	T½ A. niger AMG G2 (Wildtyp) (min)
1*	A246T + T72I	11.3	8.5
2*	G447S + S119P	11.4	7.9
3*	E408R + A425T + S465P + T494A	8.6	8.1
4	E408A + S386N	12.6	8.9
5*	T2P	9.3	8.5
6	T2Q + A11P + S394R	10.7	8.5
7*	T2H	9.5	8.9
8	A11E + E408R	12.7	9.3
9	T2M + N9A + T390R + D406N + L410R	10.7	8.5
10	A393R	17.7	8.4
11	2R + S386R + A393A	14.1	8.4
12	A393R + L410R	14.7	7.9
13	A1V + L66R + Y402F + N427S + S486G	11.7	8.5
14*	T2K + S30P + N427M + S444G + V470M	11.4	8.4

* keine Variante der Erfindung Wärmstabilität bei 70°C an gereinigten Proben

	Enzym	T½ (min)
15	AMG G2	7.4
16	T2E + T379A + S386K + A393R	11.6
17	E408R + S386N	10.2
18	T2Q + A11P + S394R	9.8
19	A1V + L66R + Y402F + N427S + S486G	14.1
20	A393R	14.6
21	T2R + S386R + A393R	14.1
22	A393R + L410R	12.9
23	Y402F	10.1

Beispiel 7
Wärmestabilität bei 68°C
AMG G2-Varianten wurden durch Shuffling unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Ansatzes und anschließendes Shuffling positiver Varianten konstruiert.
Die Wärmestabilität wurde als T_1/2 unter Verwendung von Verfahren I bei 68°C bestimmt, wie im Abschnitt ”Materialien & Methoden” beschrieben, und mit der Wildtyp A. niger AMG G2 unter den gleichen Bedingungen verglichen. Die Bewertung von Varianten wurde in Kulturlösung nach Filtration der Überstände durchgeführt.

Variante T½ (min) T½ A. niger AMG G2 (Wildtyp) (min)

24 PLASDⁱ + V59A + A393R + T490A 27.2 6.8

i = N-terminale Extension
Beispiel 8 (Referentiell)
Wärmestabilität bei 68°C
AMG G2-Varianten wurden unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Ansatzes konstruiert. Die Wärmestabilität wurde als T_1/2 unter Verwendung von Verfahren I bei 68°C bestimmt, wie im Abschnitt ”Materialien & Methoden” beschrieben, und mit der Wildtyp A. niger AMG G2 unter den gleichen Bedingungen verglichen. Die Bewertung von Varianten wurde in Kulturlösung nach Filtration der Überstände durchgeführt.

Variante T½ (min) T½ A. niger AMG G2 (Wildtyp) (min)

25 D357S + T360V + S371H 6.6 5.9

26 N313G + F318Y 8.9 5.9

27 S356P + S366T 7.3 5.8

28 S340G + D357S + T360V + S386P 7.2 5.8
Beispiel 9
Wärmestabilität bei 70°C
Eine AMG G2-Variante wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Ansatzes konstruiert und als halb gereinigte Proben bewertet (Filtration von Kulturlösung und anschließendes Entsalzen auf einer G-25-Säule).
Die Wärmestabilität wurde als % Restaktivität unter Verwendung von Verfahren I in 50 mM NaOAc, pH 4,5, 70°C, wie im Abschnitt ”Materialien & Methoden” vorstehend beschrieben, bestimmt. Das Ergebnis des Tests in der Tabelle nachstehend aufgeführt und mit der Wildtyp A. niger AMG G2 verglichen.

Enzym T½ (min)

29 AMG G2 (Wildtyp) 7

30 Y402F + S411V 60

31 S119P + Y402F + S411V 115

32 S119P + Y312Q + Y402F + T416H 50
Beispiel 10
Wärmestabilität bei 70°C in Gegenwart von 30% Glucose
AMG G2-Varianten wurden unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Ansatzes konstruiert.
Die Wärmestabilität wurde als T_1/2 unter Verwendung von Verfahren II bei 70°C, wie im Abschnitt ”Materialien & Methoden” beschrieben, bestimmt und mit der Wildtyp A. niger AMG G2 unter den gleichen Bedingungen verglichen.

Enzym T½ (hr)

33 AMG G2 (Wildtyp) 1.5

34 Y402F 2.5

35 A393R 4.0

36 T2R + S386R + A393R 2.0

37 PLASD (N–terminal) + V59A + A393R + T490A 16.0
Beispiel 11
Saccharifizierungsleistung der AMG-Varianten S119P + Y420F + S411V und PLASD (N-terminal) + V59A + A393R + T490A
Die Saccharifizierungsleistung der AMG-Varianten S119P + Y420F + S411V bzw. PLASD (N-terminal) + V59A + A393R + T490A, beide mit verbesserter Wärmestabilität, werden wie nachstehend beschrieben, bei 70°C getestet.
Das Referenzenzym ist das Wildtyp A. niger AMG G2. Die Saccharifizierung wird unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

Substrat 10 DE Maltodextrin, ca. 30% DS (Gew./Gew.)

Temperatur 70°C

Anfangs-pH 4,3 (bei 70°C)

Enzymdosis 0,24 AGU/g DS
Saccharifizierung
Das Substrat zur Saccharifizierung wird durch Auflösen von Maltodextrin (hergestellt aus gewöhnlichem Mais) in siedendem Milli-Q-Wasser und Einstellen der Trockensubstanz auf ungefähr 30% (Gew./Gew.) hergestellt. Der pH wird auf 4,3 eingestellt. Aliquote des Substrats, entsprechend 15 g trockene Feststoffe, werden auf 50 ml blaue Glasflaschen mit blauer Kappe übergeführt und in ein Wasserbad unter Rühren verbracht. Die Enzyme werden zugesetzt und der pH, sofern notwendig, erneut eingestellt. Das Experiment wird zwei Mal durchgeführt. Proben werden periodisch entnommen und mit HPLC zur Bestimmung der Kohlehydratzusammensetzung analysiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Variante einer Eltern-Glucoamylase mit Glucoamylaseaktivität und verbesserter Wärmestabilität gegenüber der Eltern-Glucoamylase, wobei die Variante die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat und eine oder mehrere Mutation(en) in den folgenden Position(en) in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst: E408R + S386N, T2Q + A11P + S394R, A11E + E408R, T2M + N9A + T390R + D406N + L410R, T2R + S386R + A393R, A393R + L410R, A1V + L66R + Y402F + N427S + S486G, T2E + T379A + S386K + A393R, V59A + A393R + T490A, und eine aus PLASD bestehende N-terminale Erweiterung, Y402F + S411V, S119P + Y402F + S411V, S119P + Y312Q + Y402F + T416H, oder die Variante, die die eine oder mehrere Mutation(en) aufweist, in einer entsprechenden Position in einer homologen Glucoamylase, die einen Identitätsgrad von mindestens 60% mit den in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist.
Variante einer Eltern-Glucoamylase mit Glucoamylaseaktivität und verbesserter Wärmestabilität gegenüber der Eltern-Glucoamylase, wobei die Variante die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat und die Mutation A393R umfasst, oder die Variante, die die Mutation in einer entsprechenden Position in einer homologen Glucoamylase die einen Identitätsgrad von mindestens 70% mit den in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist.
Variante einer Eltern-Glucoamylase mit Glucoamylaseaktivität und verbesserter Wärmestabilität gegenüber der Eltern-Glucoamylase, wobei die Variante die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat und die Mutation Y402 umfasst, oder die Variante, die die Mutation in einer entsprechenden Position in einer homologen Glucoamylase die einen Identitätsgrad von mindestens 95% mit den in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist.
Variante nach einem beliebigen der Ansprüche 1–3, wobei die homologe Eltern-Glucoamylase die Aspergillus niger-G1-Glucoamylase ist.
Variante nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die Glucoamylase eine verkürzte Glucoamylase, insbesondere am C-Terminus, ist.
DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die eine Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 codiert.
Rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 6 trägt.
Zelle, die mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 6 oder mit einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert ist.
Zelle nach Anspruch 8, die ein Mikroorganismus, wie ein Bakterium oder ein Pilz, ist.
Zelle nach Anspruch 9, die eine Protease-Mangel-Aspergillus oryzae-Zelle oder eine Protease-Mangel-Aspergillus niger-Zelle ist.
Verfahren zur Umwandlung von Stärke oder teilweise hydrolysierter Stärke zu einem Sirup, der Dextrose enthält, wobei das Verfahren den Schritt der Saccharifizierung von Stärkehydrolysat in Gegenwart einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 einschließt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Dosis an Glucoamylase im Bereich von 0,05 bis 0,5 AGU pro g Trockenmasse vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, umfassend die Saccharifizierung eines Stärkehydrolysats von mindestens 30 Gewichtsprozent Trockenmasse.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11–13, wobei die Saccharifizierung in Gegenwart eines Verzweigungs-abbauenden Enzyms („debranching enzyme”) durchgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe von Pullulanase und Isoamylase, vorzugsweise einer Pullulanase, die aus Bacillus acidopullulyticus oder Bacillus deramificans stammt, oder aus einer Isoamylase, die aus Pseudomonas amyloderamosa stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11–14, wobei die Saccharifizierung bei einem pH von 3 bis 5,5 und bei einer Temperatur von 60–80°C, vorzugsweise von 63–75°C, für 24 bis 72 h, vorzugsweise für mindestens 36–48 h bei einem pH von 4 bis 4,5 durchgeführt wird.
Verfahren zur Saccharifizierung einer verflüssigten Stärkelösung, wobei das Verfahren umfasst (i) einen Saccharifizierungsschritt, während dem eine oder mehrere enzymatische Saccharifizierungsstadien stattfinden, und den anschließenden Schritt von (ii) einem oder mehreren Hochtemperatur-Membrantrennschritten, wobei die enzymatische Saccharifizierung unter Verwendung einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 durchgeführt wird.
Verwendung einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 in einem Stärkeumwandlungsverfahren.
Verwendung einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 in einem kontinuierlichen Stärkeumwandlungsverfahren.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das kontinuierliche Stärkeumwandlungsverfahren ein kontinuierliches Saccharifizierungsverfahren nach Anspruch 16 umfasst.
Verwendung einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 in einem Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden.
Verwendung einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 in einem Verfahren zur Herstellung von Spezialsirupen.
Verwendung einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 in einem Verfahren zur Herstellung von Ethanol für Kraftstoff.
Verwendung einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 in einem Verfahren zur Herstellung eines Getränks.
Verwendung einer Glucoamylasevariante nach einem der Ansprüche 1–5 in einem Fermentationsverfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen, wie Citronensäure, Ascorbinsäure, Lysin, Glutaminsäure.
Verfahren zur Verbesserung der Wärmestabilität einer Eltern-Glucoamylase, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 hat, durch Vornehmen einer Mutation in einer oder mehreren der folgenden Position(en) in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz: E408R + S386N, T2Q + A11P + S394R, A11E + E408R, T2M + N9A + T390R + D406N + L410R, A393R, T2R + S386R + A393R, A393R + L410R, A1V + L66R + Y402F + N427S + S486G, T2E + T379A + S386K + A393R, Y402F, V59A + A393R + T490A, und eine aus PLASD bestehende N-terminale Erweiterung, Y402F + S411V, S119P + Y402F + S411V, S119P + Y312Q + Y402F + T416H, oder zur Verbesserung der Wärmestabilität einer Eltern-Glucoamylase, die einen Identitätsgrad von mindestens 60% mit den in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist, durch Vornehmen einer Mutation in einer oder mehreren der folgenden Position(en) in einer entsprechenden Position in der homologen Glucoamylase.