CN103119157B - 葡糖淀粉酶的变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及亲本葡糖淀粉酶具有改变的特性的组合变体，所述变体用于减少淀粉水解过程中缩合产物的合成。因此，所述亲本葡糖淀粉酶变体适合例如在酿造和葡萄糖浆生产中使用。本发明还公开了编码所述变体的DNA构建体以及在宿主细胞中产生所述葡糖淀粉酶变体的方法。

Description

葡糖淀粉酶的变体
技术领域
本发明公开了亲本葡糖淀粉酶的组合变体，所述组合变体具有改变的特性并且适合例如在酿造和葡萄糖浆生产中使用。本发明还公开了编码所述变体的DNA构建体以及在宿主细胞中产生所述葡糖淀粉酶变体的方法。
背景技术
葡糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶，EC 3.2.1.3)是淀粉水解外切作用糖酶，其可催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原末端移除连续的葡萄糖单位。葡糖淀粉酶可水解淀粉(如直链淀粉和支链淀粉)的直链的和分支的糖苷键。
葡糖淀粉酶由多种细菌、真菌、酵母和植物的株系产生。特别引人关注的且在商业上重要的葡糖淀粉酶是例如从曲霉菌属(Aspergillus)(Svensson等人，CarlsbergRes.Commun.(《嘉士伯研究通讯》)48：529-544(1983)；Boel等人，EMBO J.(《欧洲分子生物学学会杂志》)3：1097-1102(1984)；Hayashida等人，Agric.Biol.Chem.(《农业和生物化学》)53：923-929(1989)；美国专利No.5,024,941；美国专利No.4,794,175和WO88/09795)；篮状菌属(Talaromyces)(美国专利No.4,247,637；美国专利No.6,255,084；和美国专利No.6,620,924)；根霉菌属(Rhizopus)(Ashikari等人，Agric.Biol.Chem.(《农业和生物化学》)50：957-964(1986)；Ashikari等人，App.Microbio.Biotech.(《应用微生物学和生物技术》)32：129-133(1989)和美国专利No.4,863,864)；腐质霉属(Humicola)(WO05/052148和美国专利No.4,618,579)；和毛霉属(Mucor)(Houghton-Larsen等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物学和生物技术》)62：210-217(2003))的菌株胞外产生的真菌酶。已经在酵母、真菌和/或细菌细胞中克隆和表达了许多编码这些酶的基因。
在商业上，葡糖淀粉酶是十分重要的酶并已用于需要对淀粉进行水解(例如，用于从淀粉产生葡萄糖和其他单糖)的广泛的各种应用。葡糖淀粉酶用于生产高果糖玉米甜味剂，高果糖玉米甜味剂占据超过美国50％的甜味剂市场。
通常，在淀粉水解工艺中葡糖淀粉酶可与且通常与α-淀粉酶一起使用，以将淀粉水解为糊精，然后水解为葡萄糖。然后可将葡萄糖由其他酶(如葡萄糖异构酶)转化为果糖；结晶；或用于发酵以产生多种终产物(如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸盐、抗坏血酸中间体、谷氨酸、甘油和1，3-丙二醇)。通过在含淀粉和/或纤维素的材料的发酵中使用葡糖淀粉酶而产生的乙醇可用作燃料来源或用于酒精消费。
在商业上用于高葡萄糖玉米糖浆(HGCS)和高果糖玉米糖浆(HFCS)生产的高固形物浓度下，葡糖淀粉酶通过缩合反应合成二糖、三糖和四糖。这是由于淀粉中α-(1-6)-D-葡萄糖苷键的水解缓慢以及由D-葡萄糖形成多种积聚的缩合产物(主要是异麦芽糖)而引起的。因此，许多常规工艺中葡萄糖的产率不超过理论产率的95％，全世界通过该工艺生产的糖浆量是非常大的，即使每吨淀粉的葡萄糖产率有十分小的增加在商业上都是重要的。
葡糖淀粉酶在酿造中主要用于生产低碳啤酒。与其他淀粉酶(如来自麦芽的淀粉酶)结合，葡糖淀粉酶提供对淀粉非常充分的水解，直至水解为葡萄糖单元。葡萄糖很容易由酵母转化为醇，从而使得啤酒厂有可能由发酵获得十分高的醇产率并且同时获得啤酒，这在残留的碳水化合物方面是十分低的。用水将发酵物稀释至所需的醇百分比，将最终的啤酒作为“低碳啤酒”销售。
尽管葡糖淀粉酶已成功用于商业应用许多年，但仍需要具有改变的特性(如比活性改善、缩合产物如异麦芽糖的形成减少以及热稳定性增加)的葡糖淀粉酶。
本申请中对任何文献的引用或确定并非承认所述文献可作为本发明的现有技术。
发明内容
本文考虑了葡糖淀粉酶变体以及葡糖淀粉酶变体在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途。这些葡糖淀粉酶变体在催化结构域和/或淀粉结合结构域中含有氨基酸置换。所述变体显示出改变的特性，如比活性改变、缩合产物如异麦芽糖的形成减少和/或热稳定性改变。
在一个方面，本文描述了包含如下氨基酸置换的葡糖淀粉酶变体：a)44R和539R；或b)44R、61I和539R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQID NO：1或2或亲本葡糖淀粉酶具有至少80％的序列同一性。在一另外的方面，描述了葡萄糖淀粉酶用于制备酶组合物的用途。在一另外的方面，所述酶组合物包含至少一种额外的酶，所述额外的酶选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶、植酸酶和另外的葡糖淀粉酶例如支链淀粉酶和α-淀粉酶。
在一另外的方面，本文描述了具有淀粉结合结构域和催化结构域的葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，相对于SEQ ID NO：2的氨基酸序列或等价的亲本葡糖淀粉酶，所述变体在互联环2′中，和/或在环1中，和/或在螺旋2中，和/或在环11中，和/或在螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。
在一另外的方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体相对于具有SEQ ID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQIDNO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，包含两个或更多个氨基酸置换。
在一另外的方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体相对于SEQ ID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQ ID NO：2位置52至位置68的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，包含两个或更多个氨基酸置换。
在一另外的方面，描述了葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是相对于具有SEQ ID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′，和/或具有SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1，和/或具有SEQ ID NO：2位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11，和/或具有SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12而言。
在一另外的方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体在处于其晶体形式时，具有的晶体结构的主链原子的原子坐标与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218中的表20中所定义的)在等价主链原子比对后具有小于0.13nm的均方根偏差，并且所述葡糖淀粉酶变体具有连接区、淀粉结合结构域和催化结构域，相对于亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列所述变体在淀粉结合结构域的互联环2′中，和/或在催化结构域的环1中和/或螺旋2中和/或环11中和/或螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。
在一个方面，葡糖淀粉酶变体包含两个或更多个氨基酸置换，其中一个氨基酸置换在位置539且一个氨基酸置换在位置44，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，并且所述序列与亲本葡糖淀粉酶具有至少80％的序列同一性，并且其中位置44的氨基酸置换不是44C。
本公开还涉及编码如本文所述的葡糖淀粉酶变体的多核苷酸。一个方面，是包含核酸的质粒。另一个方面，是包含所述多核苷酸或能够表达所述葡糖淀粉酶变体的载体。另一个方面，是包含(例如转化有)所述质粒或载体的宿主细胞。另一个方面，是宿主细胞，其具有稳定整合进染色体中的编码所述变体葡糖淀粉酶的核酸序列。另一个方面，是能够表达所述葡糖淀粉酶变体的细胞。另一个方面，是表达葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括获得宿主细胞或细胞并从所述细胞或宿主细胞表达所述葡糖淀粉酶变体，以及任选纯化所述葡糖淀粉酶变体。
本公开的另一个方面是包含至少一种本文所述的葡糖淀粉酶变体的酶组合物及其用途。
本公开的另一方面是将淀粉或部分水解的淀粉转化为含有葡萄糖的糖浆的方法，所述方法包括在至少一种本文所述的葡糖淀粉酶变体或酶组合物的存在下糖化液体淀粉溶液。
本公开的另一个方面是本文所述的葡糖淀粉酶变体在淀粉转化工艺(如连续淀粉转化工艺)中、在生产寡糖、麦芽糊精或葡萄糖糖浆的工艺中以及在生产高果糖玉米糖浆的工艺中的用途。
在另一个方面，提供了本文所述的葡糖淀粉酶变体在醇发酵工艺中的用途。
本公开的另一个方面是制备用于酿造的麦芽汁的方法，所述方法包括由谷粉(grist)形成醪液，并使该醪液与所述葡糖淀粉酶变体或所述酶组合物相接触。
而本公开的另一个方面是用于生产啤酒的方法，所述方法包括：a)制备醪液，b)过滤所述醪液以获得麦芽汁，并使所述麦芽汁发酵以获得啤酒，其中将所述葡糖淀粉酶变体加入：步骤(a)和/或步骤(b)和/或步骤(c)中。，
而本公开的另一方面是所述葡糖淀粉酶变体用于提高酿造工艺的淀粉糖化步骤或发酵步骤中可发酵糖的生成的用途。
而本公开的另一方面是啤酒，其中所述啤酒是通过下述步骤生产的：a)制备醪液，b)过滤所述醪液以获得麦芽汁，c)使所述麦芽汁发酵以获得啤酒，以及d)对所述啤酒进行巴氏灭菌，其中将所述葡糖淀粉酶变体加入：步骤(a)和/或步骤(b)和/或步骤(c)中。
因此，本发明的目标是在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、生产所述产品的工艺或使用所述产品的方法，使得申请人保留该权利并特此公开放弃对任何先前已知的产品、工艺和方法的权利。还应该注意，本发明无意于在本发明的范围内涵盖任何不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83款)的书面说明和可实施性要求的产品、所述产品的生产工艺或使用所述产品的方法，使得申请人保留权利并特此公开放弃对任何先前描述的产品、制备所述产品的工艺或使用所述产品的方法的权利。
应该注意，在本公开中，特别是在权利要求书和/或实施方案中，诸如“包含”等之类的术语可具有的含义是其在美国专利法中的含义；如，它们可意指“包括”等。并且诸如“基本上由...组成”之类的术语具有的含义是其在美国专利法中的含义，例如，它们允许没有被明确叙述的元素，但排除现有技术中存在的或影响本发明的基本特征或新特征的元素。
这些以及其他实施方案在下面的具体实施方式中公开或根据下面的具体实施方案显而易见并且为下面具体实施方式所涵盖。
附图说明
下面的以举例的方式给出但无意于将本发明只局限于所描述的具体实施方案的具体实施方式可结合附图得到更好地理解，其中：
图1A描绘了具有632个氨基酸(SEQ ID NO：1)的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)。信号肽加了下划线，始于氨基酸残基SVDDFI(SEQ ID NO：12)且具有453个氨基酸残基的催化区域(SEQ IDNO：3)是粗体的；连接区为斜体而淀粉结合结构域(SBD)既是斜体的也加了下划线。TrGA的成熟蛋白质(SEQ ID NO：2)包括催化结构域(SEQ ID NO：3)、连接区(SEQ ID NO：10)和淀粉结合结构域(SEQ ID NO：11)。关于TrGA葡糖淀粉酶分子的SBD编号方式，在本公开中参照：a)成熟TrGA的SEQ ID NO：2中的位置491至599，和/或b)SEQ ID NO：11中的位置1至109，其代表成熟TrGA的分离的SBD序列。关于TrGA分子的催化结构域编号方式，参照SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3。图1B描绘了编码TrGA的cDNA(SEQ IDNO：4)。图1C描绘了前体和成熟蛋白质TrGA结构域。
图2描绘了目的质粒pDONR-TrGA，其包括TrGA的cDNA(SEQ IDNO：4)。
图3描绘了质粒pTTT-Dest。
图4描绘了最终的表达载体pTTT-TrGA。
图5A和5B描绘了来自下列物种的亲本葡糖淀粉酶的催化结构域的比对比较：泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(AaGA)(SEQ ID NO：5)；黑曲霉(Aspergillus niger)(AnGA)(SEQ ID NO：6)；米曲霉(Aspergillus oryzae)(AoGA)(SEQ ID NO：7)；里氏木霉(Trichoderma reesei)(TrGA)(SEQ IDNO：3)；灰腐质霉(Humicola grisea)(HgGA)(SEQ IDNO：8)；和酒色肉座菌(Hypocrea vinosa)(HvGA)(SEQ ID NO：9)。相同的氨基酸以星号(*)指示。图5C描绘了篮状菌属葡糖淀粉酶(TeGA)的成熟蛋白质序列(SEQ IDNO：384)。图5D和5E描绘了比较来自下列物种的亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域(SBD)的比对：里氏木霉(SEQ ID NO：11)；灰腐质霉(HgGA)(SEQ ID NO：385)；疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)(ThGA)(SEQ ID NO：386)；埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(TeGA)(SEQ IDNO：387)；黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：388)；泡盛曲霉(AaGA)(SEQ IDNO：389)；和太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)(TtGA)(SEQ ID NO：390)。
图6描绘了里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO：2)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)(SEQ ID NO：5)的三维结构侧面视图的比较。参照活性位点测量了所述侧面且活性位点入口位于分子的“顶部”。
图7描绘了里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO：2)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)(SEQ ID NO：5)的三维结构俯视图的比较。
图8描绘了TrGA(SEQ ID NO：2)和AnGA(SEQ ID NO：6)的三维结构比对的侧面视图，其示出了结合位点1和2。
图9描绘了阿卡波糖与TrGA晶体结构结合的模型。
图10描绘了TLC板，其具有含有不同浓度的葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖的标准品以及含有来自与TrGA和AnGA温育的葡萄糖的反应产物的样品。
具体实施方式
葡糖淀粉酶在要求淀粉水解的广泛应用中是商业上重要的酶。申请人已发现，通过在亲本葡糖淀粉酶氨基酸序列的特定区域中的位置处引入某些改变，可降低形成α-(1-6)键的速率，和/或减少缩合产物(例如异麦芽糖)的形成。葡糖淀粉酶形成α-(1-6)键的速率相对于其裂解α-(1-4)键的速率的降低具有实际的意义。
本发明人提供了亲本葡糖淀粉酶的多种变体，与亲本葡糖淀粉酶相比，所述变体在某些实施方案中显示出减少的缩合和/或降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)。在一些实施方案中，在糖化工艺中使用本文所述的葡糖淀粉酶变体可产生具有高葡萄糖百分比的糖浆。在一些实施方案中，使用本文所述的葡糖淀粉酶变体可导致在酿造步骤的淀粉糖化步骤和/或发酵步骤中可发酵糖的生成增加。在一些实施方案中，使用本文所述的葡糖淀粉酶变体可导致实际发酵度增加。这些改变的特性是通过突变(例如置换)亲本葡糖淀粉酶中选定的位置而获得的。这将在下文中更详细地描述。
因此，在一另外的方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体相对于具有SEQ IDNO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2氨基酸序列位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，包含两个或更多个氨基酸置换。
在一另外的方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体相对于SEQ ID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQ ID NO：2位置52至位置68的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，包含两个或更多个氨基酸置换。
因此，在一另外的方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体在处于其晶体形式时，具有的晶体结构的主链原子的原子坐标与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218中的表20中所定义的)在等价主链原子比对后具有小于0.13nm的均方根偏差，并且所述葡糖淀粉酶变体具有连接区、淀粉结合结构域和催化结构域，相对于亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列所述变体在淀粉结合结构域的互联环2′中，和/或在催化结构域的环1中和/或螺旋2中和/或环11中和/或螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。在另一个方面中，与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218的表20中所定义的)的均方根偏差小于0.12nm，如小于0.11或如小于0.10。
在一个方面，本文描述了具有淀粉结合结构域和催化结构域的葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，相对于SEQ IDNO：2的氨基酸序列或等价的亲本葡糖淀粉酶，所述变体在互联环2′中，和/或在环1中，和/或在螺旋2中，和/或在环11中，和/或在螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。
在另一个方面中，描述了葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是相对于具有SEQ ID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或具有SEQ IDNO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或具有SEQ ID NO：2位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或具有SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或具有SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列而言。
在一另外的方面，描述了葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是相对于具有SEQ ID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′，和/或具有SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1，和/或具有SEQ ID NO：2位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11，和/或具有SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12而言。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个(如一个、两个或三个)氨基酸置换和环1和/或螺旋2和/或环11和/或螺旋12中的至少一个(如一个、两个、三个、四个、五个或六个)氨基酸置换。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的一个、两个、三个或四个氨基酸置换以及环1和/或螺旋2和/或环11和/或螺旋12中的一个、两个、三个或四个氨基酸置换。在另一个方面中，在互联环2′中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换。在另一个方面中，在环1中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换。在另一个方面中，在螺旋2中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换。在另一个方面中，在环11中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换。在另一个方面中，在螺旋12中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环1中的至少一个氨基酸置换。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和螺旋2中的至少一个氨基酸置换。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环11中的至少一个氨基酸置换。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和螺旋12中的至少一个氨基酸置换。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环1中的至少一个氨基酸置换以及螺旋2中的至少一个氨基酸置换。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在互联环2′位置520-543、530-543或534-543中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在环1位置30-50、35-48或40-46的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在螺旋2位置50-66、55-64或58-63的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在环11位置405-420、410-420或415-420的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ IDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在螺旋12的位置421-434、425-434或428-434的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性，例如与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性。在一个方面中，葡糖淀粉酶变体与SEQ IDNO：2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性。
在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶或葡糖淀粉酶变体具有的淀粉结合结构域与SEQ ID NO：1、2、11、385、386、387、388、389或390的淀粉结合结构域具有至少96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶或葡糖淀粉酶变体具有的催化结构域与SEQID NO：1、2、3、5、6、7、8或9的催化结构域具有至少80％、85％、90％、95％或99.5％的序列同一性。
在一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换和选自位置44、61、417和431的位置中的一个或多个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换和a)位置44的氨基酸置换和/或b)位置417和431二者的氨基酸置换，所述位置对应于SEQ IDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换和位置44的氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换和位置417和431的氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换和位置44和61的氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，葡糖淀粉酶变体在位置43具有氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，葡糖淀粉酶变体在位置61具有氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，位置539的氨基酸置换是539R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，位置44的氨基酸置换是44R，所述位置对应于SEQID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，位置417的氨基酸置换是417R/V，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，位置417的氨基酸置换是417R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，位置417的氨基酸置换是417V，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，位置431的氨基酸置换是431L，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，位置43的氨基酸置换是43R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在一个方面中，位置61的氨基酸置换是61I，所述位置对应于SEQ IDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
在一个方面中，缩合产物为异麦芽糖。在一个方面中，淀粉的水解是在酿造工艺中。在例如酿造中，异麦芽糖的形成是不希望的，因为其在发酵期间不能被转化为醇。
传统上啤酒是指源自麦芽(如源自大麦的麦芽)和任选的添加物(例如谷物)并用啤酒花调味的含酒精饮料。
啤酒可通过基本上相同的工艺从多种谷物制成。所有的谷物淀粉均为葡萄糖均聚物，其中葡萄糖残基通过α-1，4键或α-1，6键连接，前者是主要的。
制备发酵麦芽饮料的过程通常被称作酿造。制备这些饮料所使用的主要原材料为水、啤酒花和麦芽。此外，诸如以下的添加物可被用作淀粉的来源：普通粗磨玉米粉、细磨玉米粉、制啤酒用研磨酵母、稻、蜀黍、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘培的谷物、谷物片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯粉和糖浆(如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖糖浆、大麦和/或小麦糖浆)等。淀粉将最终被转化为糊精和可发酵糖。
出于数种原因，据信麦芽(其主要由所选择的大麦品种产生)对于啤酒的总体特征和品质具有最大的影响。第一，麦芽是啤酒中主要的调味剂。第二，麦芽提供可发酵糖的主要部分。第三，麦芽提供蛋白质，其将促成啤酒的主体(body)和泡沫特征。第四，麦芽提供淀粉糖化期间必需的酶活性。
啤酒花也对啤酒的品质(包括风味)有很大贡献。具体地讲，啤酒花(或啤酒花组成物)给啤酒中加入想要的苦味化物质。此外，啤酒花可起到蛋白质沉淀剂作用、建立防腐剂并帮助泡沫形成和稳定化。
制造啤酒的工艺是本领域所熟知的，但简而言之，其涉及五个步骤：(a)淀粉糖化和/或添加物的蒸煮(b)麦芽汁分离和提取(c)煮沸麦芽汁并加入啤酒花(d)冷却、发酵和储存，以及(e)成熟、加工和包装。
通常，在第一步中，将研磨或压碎的麦芽与水相混合并在受控的温度下保持一段时间以允许麦芽中存在的酶将麦芽中存在的淀粉转化为可发酵糖。
在第二步中，将醪液转移至“过滤槽”或醪液过滤器，在那里液体与谷物残余物分离。这种甜的液体被称为“麦芽汁”而剩下的谷物残余物被称作“麦糟”。通常对醪液进行提取，这包括向醪液添加水以从麦糟回收残留的可溶性提取物。
在第三步中，将麦芽汁剧烈煮沸。这使麦芽汁灭菌并帮助产生颜色、风味和气味并使酶活性失活。在煮沸过程中的某个时刻加入啤酒花。
在第四步中，将麦芽汁冷却并转移至发酵罐，所述发酵罐装有酵母或向其中加入酵母。酵母通过发酵将糖转化为醇和二氧化碳气体；在发酵的最后，使发酵罐变冷或可使发酵罐变冷以停止发酵。除去酵母絮凝物。
在最后一步中，将啤酒冷却并储存一段时间，在所述时间段中，啤酒变澄清且其产生风味，并且任何可能损害啤酒的外观、风味和货架期的物质都沉淀出来。在包装之前，对啤酒充二氧化碳气体并任选将其过滤和巴氏灭菌。
发酵之后，可获得通常含有约2重量％至约10重量％的醇。不可发酵的碳水化合物在发酵过程中不被转化并且形成最终啤酒中所溶解的固形物的大多数。
这种残余物的存留是因为麦芽淀粉酶不能够水解淀粉的α-1，6-键。不可发酵的碳水化合物贡献约50卡路里/12盎司啤酒。
关于常规酿造工艺的其它信息以及将应用于本发明的酿造技术领域中所使用的术语的定义，可在以下文献中找到：柏林酿造学院(Research andTeaching Institute ofBrewing，Berlin(VLB))的Wolfgang Kunze所著的“Technology Brewing and Malting(《酿造和制麦技术》)”，第二次修订版，1999，ISBN 3-921690-39-0或第3版(2004)：ISBN 3-921690-49-8。
最近，称为轻啤酒、卡路里减少的啤酒或低卡路里啤酒的酿造饮料被广泛普及，特别是在美国市场中。如在美国所定义的，这些啤酒与制造商的“普通”啤酒相比，具有少大约30％的卡路里。
如本文所用，术语“轻啤酒、卡路里减少的啤酒或低卡路里啤酒”是指最近广泛普及的酿造饮料，特别是在美国市场中。如在美国所定义的，这些高度减弱的啤酒与制造商的“普通”啤酒相比，具有少大约30％的卡路里。关于常规酿造工艺的其它信息可在以下文献中找到：“柏林酿造学院(Research and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB))的Wolfgang Kunze所著的“Technology Brewing and Malting(《酿造和制麦技术》)”，第三完全更新版，2004，ISBN 3-921690-49-8。”
本文所公开的是如本文所描述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，可发酵糖的生成得以提高。本文中还公开了如本文所描述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，在酿造工艺的淀粉糖化步骤中可发酵糖的生成得以提高。本文所公开的是如本文所描述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，在酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖的生成得以提高。本文所公开的是如本文所描述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述可发酵糖是葡萄糖。
可产生带有显著减少的量的副产物的葡萄糖的葡糖淀粉酶将有很大的商业意义，例如在葡萄糖糖浆的生产中或在酿造中。本文中还公开了如本文所描述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中淀粉的水解是在用于生产葡萄糖糖浆的工艺中。在一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出减少的异麦芽糖合成(IS)与淀粉水解活性(SH)之比。在一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出降低的淀粉水解活性，所述淀粉水解活性降低不超过5％、不超过10％或不超过15％。在一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出提高的实际发酵度。在一个方面中，在相当条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量低于由黑曲霉的葡糖淀粉酶(AnGA)(SEQ IDNO：6)形成的缩合产物的量。在一个方面中，相当条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量与由黑曲霉的葡糖淀粉酶(AnGA)(SEQ ID NO：6)形成的缩合产物的量基本上相同、比其高不超过5％、高不超过8％或高不超过10％。在一个方面中，基于蛋白质浓度，葡糖淀粉酶剂量是相同的。在一个方面中，基于活性测定法中的活性测量，葡糖淀粉酶的剂量是相同的。
本文中所描述的葡糖淀粉酶变体在催化结构域和/或淀粉结合结构域中含有氨基酸置换。所述变体可显示出改变的特性，例如热稳定性改善、缩合产物(例如异麦芽糖)的形成改变和/或实际发酵度增加和/或异麦芽糖合成(IS)与淀粉水解活性(SH)之比和/或比活性降低。缩合产物(如异麦芽糖)形成减少的变体可显著改善在例如酿造工业中制备所需产品的能力。
1.定义和缩写
1.1.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等人，DictionaryOf Microbiology AndMolecular Biology(《微生物学和分子生物学词典》)，第2版，纽约约翰威立父子公司(JohnWiley and Sons，New York)(1994)，以及Hale和Markham，The Harper CollinsDictionary Of Biology(《哈伯柯林斯生物学词典》)，纽约哈珀-柯林斯出版社(HarperPerennial，N.Y.)(1991)为本领域技术人员提供了本文中所使用的许多术语的一般含义。为了清楚和引用方便，在下文中定义了某些术语。
如本文所用，术语“葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)”是指催化从淀粉和相关寡糖及多糖的非还原末端释放D-葡萄糖的酶。
术语“亲本”或“亲本序列”是指宿主细胞中天然的或天然存在的序列。亲本葡糖淀粉酶包括但不限于SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8和9中所示的葡糖淀粉酶序列，以及与SEQ IDNO：2具有至少80％氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。
如本文所用，“等价位置”意指基于所考虑的亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列及所考虑的亲本葡糖淀粉酶的三维结构与TrGA参考葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)及三维结构的比对而为两个亲本序列所共有的位置。因此，可使用序列比对或结构比对来确定等价性。
术语“TrGA”是指具有SEQ ID NO：2中所示的成熟蛋白质序列的亲本里氏木霉葡糖淀粉酶序列，其包括具有SEQ ID NO：3中所示序列的催化结构域。TrGA的分离、克隆和表达描述于WO2006/060062和美国专利No.7,413,887中，二者均以引用的方式而并入本文。在一些实施方案中，亲本序列是指为用于蛋白质工程改造的起始点的葡糖淀粉酶序列。本文中的葡糖淀粉酶氨基酸的编号方式是基于葡糖淀粉酶与TrGA(SEQ ID NO：2和/或3)的序列比对。
短语“蛋白质或多肽的成熟形式”是指蛋白质或多肽的最终的功能形式。葡糖淀粉酶的成熟形式可例如缺少信号肽。为了举例说明，TrGA的成熟形式包括催化结构域、连接区和淀粉结合结构域，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
如本文所用，术语“葡糖淀粉酶变体”和“变体”用于指与亲本葡糖淀粉酶序列具有一定程度的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。变体与亲本序列相似，但是在其氨基酸序列中具有至少一个使得它们在序列上不同于亲本葡糖淀粉酶的置换、缺失或插入。在某些情况中，对变体进行操纵和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一个使得它们在序列上不同于亲本的置换、缺失或插入。另外，葡糖淀粉酶变体可保留亲本葡糖淀粉酶的功能特性，例如维持亲本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性的至少约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。如果是所选择的，其也可具有高于100％的活性。
当用于比较而进行最佳比对时，“变体”与亲本多肽序列可具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶的催化结构域可具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域可具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。可在亲本或变体序列的全长上测量序列同一性。
使用本领域中已知的标准技术(参见例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)2：482(1981)；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)48：443(1970)；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)85：2444(1988)；诸如威斯康星遗传软件包(wisconsin Genetics Software Package)(威斯康辛州麦迪逊的Genetics Computer Group公司(Genetics Computer Group，Madison，WI))中的GAP、BESTHT、FASTA和TFASTA之类的程序；以及Devereux等人，Nucleic Acid Res.(《核酸研究》)，12：387-395(1984))来确定序列同一性。
“核酸序列同一性百分比(％)”或“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中的核苷酸残基或氨基酸残基与起始序列(例如，SEQ ID NO2)的核苷酸残基或氨基酸残基相同的百分比。可在起始序列的全长上测量序列同一性。
在本申请中通过序列比对的方法确定“序列同一性”。为了本公开的目的，比对方法为Altschul等人所描述的BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215：403-410(1990)；和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)90：5873-5787(1993))。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(见Altschul等人，Meth.Enzymol.(《酶学方法》)266：460-480(1996))。WU-BLAST-2使用数个搜索参数，其中大多数被设置为默认值。可调节的参数设定为以下值：重叠跨越(overlap span)＝1，重叠分数(overlapfraction)＝0.125，字长阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态的值，并且取决于具体序列的组成和针对其对所关注序列进行检索的具体数据库的组成而由程序本身确立。然而，可调节所述值以增加灵敏度。氨基酸序列同一性百分比值是由匹配的相同残基的数目除以比对区域中“较长”序列的残基总数而确定的。所述“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(忽略由WU-Blast-2引入以使比对得分最大的空位)。
术语“最佳比对”是指给出最高同一性百分比评分的比对。
如本文所用，术语“催化结构域”是指多肽的结构区域，其含有用于底物水解的活性位点。
术语“连接区”是指通常具有3至40个氨基酸残基的短氨基酸序列，其将包含淀粉结合结构域的氨基酸序列与包含催化结构域的氨基酸序列共价结合。
术语“淀粉结合结构域”是指优先结合淀粉底物的氨基酸序列。
如本文所用，术语“突变序列”和“突变基因”可互换使用并且是指在存在于宿主细胞的亲本序列中的至少一个密码子中具有改变的多核苷酸序列。突变序列的表达产物是相对于亲本具有改变的氨基酸序列的变体蛋白质。表达产物可具有改变的功能能力(例如，提高的酶活性)。
如本文所用，在多肽的语境中，术语“特性”或其语法上的等价物是指多肽可被选择或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、KM、KCAT、KCAT/KM比、蛋白质折叠、结合底物的能力和被分泌的能力。
如本文所用，在核酸的语境中，术语“特性”或其语法上的等价物是指核酸可被选择或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于影响基因转录(例如，启动子强度或启动子识别)的特性、影响RNA加工(例如，RNA剪接和RNA稳定性)的特性、影响翻译(例如，调节mRNA与核糖体蛋白的结合)的特性。
术语“热稳定的”和“耐热的”是指在淀粉底物水解过程中的普遍条件下(例如同时暴露于改变的温度)，在暴露于温度持续给定的时间段后可保留特定量的酶活性的本公开的葡糖淀粉酶变体。
在特性(例如热稳定性)的语境中，术语“提高的稳定性”是指与另一个参考(即亲本)葡糖淀粉酶相比，随时间推移而保留的更高的淀粉水解活性。
在特性(如热稳定性)的语境中，术语“减少的稳定性”是指与另一个参考葡糖淀粉酶相比，随时间推移而保留的更低的淀粉水解活性。
术语“比活性”定义为每毫克葡糖淀粉酶蛋白的活性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶的活性通过本文所描述的乙醇测定法测定并表示为从淀粉底物产生的葡萄糖的量。在一些实施方案中，可使用本文所描述的Caliper测定法来确定蛋白质浓度。
术语“活性的”和“生物学活性的”是指与特定蛋白质相关的生物学活性。因此，给定蛋白质的生物学活性是指本领域技术人员通常归于该蛋白质的任何生物学活性。例如，与葡糖淀粉酶相关的酶活性是水解性的，因此有活性的葡糖淀粉酶具有水解活性。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的多聚形式的核苷酸，其为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
如本文所用，术语“DNA构建体”、“转化DNA”和“表达载体”可互换使用，指用于将序列引入宿主细胞或生物体中的DNA。可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其它合适的技术在体外产生所述DNA。DNA构建体、转化DNA或重组表达盒可被掺入进质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列外，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达盒部分还包括待转录的核酸序列和启动子。在一些实施方案中，表达载体具有将异源DNA片段掺入宿主细胞中并使其表达的能力。
如本文所用，术语“载体”是指多核苷酸构建体，其被设计用于将核酸引入一个或多个细胞类型中。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。
如本文所用，在将核酸序列引入细胞中的语境中，术语“引入”是指任何适于将核酸序列转移进细胞中的方法。此类用于引入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导。
如本文所用，术语“转化的”和“稳定转化的”是指具有非天然(异源)多核苷酸序列的细胞，所述多核苷酸序列被整合进其基因组中或作为被保持至少两代的附加型质粒。
如本文所用，术语“可选标记”和“选择性标记”是指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如基因)，其使得能容易地选择含有该载体的那些宿主。通常，可选标记是赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势以允许将含有外源DNA的细胞与在转化过程中未接受任何外源序列的细胞区分开。
如本文所用，术语“启动子”是指起作用以引导下游基因的转录的核酸序列。启动子以及其它转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)是表达给定基因所必需的。通常，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能性关系中时，其为“有效连接”(operablylinked)的。例如，如果编码分泌前导序列(即信号肽)的DNA表达为参与多肽的分泌的前蛋白的话，则其与该多肽的DNA有效连接。通常，“有效连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情形中，其为连续的且在阅读相中。
如本文所用，术语“基因”是指多核苷酸(例如DNA区段)，其编码多肽且包括编码区之前和之后的区域，以及单个编码区段(外显子)之间的居间序列(内含子)。
如本文所用，“直系同源物”和“直系同源基因”是指不同物种中通过物种形成而从共同的先祖基因进化而来的基因(即同源性基因)。通常，直系同源物在进化的过程中保留了相同的功能。对直系同源物的鉴别可用于可靠地预测新测序的基因组中的基因功能。
如本文所用，“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指通过基因组内的复制而相关联的基因。直系同源物在进化的过程中保留相同的功能，而旁系同源物进化出新的功能，虽然一些功能通常与原始的功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，它们都是丝氨酸蛋白酶并一起存在于相同的物种中。
如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。
如果一条核酸序列与参考核酸序列在中等至高严格性杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则该核酸序列被认为是与该参考核酸序列“可选择性杂交”。杂交条件是基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格性”通常发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm 5℃)下；“高严格性”在约低于Tm 5-10℃下；“中度严格性”在约低于探针的Tm 10-20℃下；而“低严格性”在约低于Tm 20-25℃下。功能上，最大严格性条件可用于鉴别与杂交探针有严格同一性或接近严格同一性的序列；而中度或低严格性杂交可用于鉴别或检测多核苷酸序列同源物。
中等和高严格性杂交条件是本领域所熟知的。高严格性条件的实例包括在约42℃下在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性的载体DNA中杂交，随后在室温下在2×SSC和0.5％SDS中洗涤两次并于42℃在0.1×SSC和0.5％SDS中再清洗两次。中等严格条件的实例包括在37℃下在包含20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切鲑精DNA的溶液中温育过夜，随后在约37-50°下在1×SSC中清洗过滤器。本领域技术人员知道如何按需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等之类的因素。
如本文所用，“重组的”包括指通过引入异源或同源核酸序列而被修饰的细胞或载体，或是指所述细胞源自经如此修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞可表达未在细胞的天然(非重组)形式中以相同形式存在的基因或者因人为故意干预而可表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
在本公开的实施方案中，在至少一个密码子中用位点饱和诱变产生突变的DNA序列。在另一个实施方案中，对于两个或更多个密码子进行位点饱和诱变。在另外的实施方案中，突变DNA序列与亲本序列具有高于约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约98％的同一性。在备选的实施方案中，使用任何已知的诱变程序(例如辐射、亚硝基胍等)在体内产生突变DNA。然后分离所需的DNA序列并将其用于本文所提供的方法中。
如本文所用，“异源蛋白”是指不在宿主细胞中天然存在的蛋白质或多肽。
如果酶以比其在相应野生型细胞中的表达水平更高的水平在宿主细胞中表达，则该酶在所述细胞中“过表达”。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的三字母代码遵照生物化学命名联合委员会(IUPAC-IUB Joint Commission on BiochemicalNomenclature(JCBN))的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
本公开的变体通过如下命名法描述：[初始氨基酸残基/位置/置换的氨基酸残基]。例如，用亮氨酸置换位置76的精氨酸表示为R76L。当在给定位置有不止一个氨基酸置换时，该置换表示为1)Q172C、Q172D或Q172R；2)Q172C、D或R，或者3)Q172C/D/R。当在本文中确定适合置换的位置而又没有提出具体的氨基酸时，应理解任何氨基酸残基都可置换在该位置中存在的氨基酸残基。当与其它葡糖淀粉酶相比，变体葡糖淀粉酶含有缺失时，该缺失用“*”指示。例如，位置R76处的缺失表示为R76*。两个或更多个连续氨基酸的缺失指示为例如(76-78)*。
“原序列(prosequence)”是信号序列与成熟蛋白质之间蛋白质分泌所必需的氨基酸序列。剪切原序列将产生成熟的活性蛋白质。
术语“信号序列”或“信号肽”是指可参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信号序列的这个定义是功能性定义，意在包括所有那些由该蛋白质基因的N末端部分所编码的、参与蛋白质分泌的实现的氨基酸序列。它们往往但并不普遍地结合到蛋白质的N末端部分或者结合到前体蛋白质的N末端部分。信号序列可以是内源性的或外源性的。信号序列可以是通常与蛋白质(例如葡糖淀粉酶)相关联的序列，或者可以是来自编码另一被分泌的蛋白质的基因。
术语蛋白质或肽的“前体”形式是指具有与该蛋白质的氨基或羰基末端有效连接的原序列的蛋白质的成熟形式。前体也可具有与原序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。前体还可具有涉及翻译后活性的额外的多核苷酸(例如，从其上被剪切而留下蛋白质或肽的成熟形式的多核苷酸)。
“宿主株系”或“宿主细胞”是指用于包含根据本公开的DNA的表达载体的适合宿主。
术语“源自”和“获自”不仅是指由所考虑的生物体的株系产生的或可由其产生的葡糖淀粉酶，还指由分离自此类株系的DNA序列编码并在含有这种DNA序列的宿主生物体中产生的葡糖淀粉酶。此外，该术语指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码且具有所考虑的葡糖淀粉酶的鉴别特征的葡糖淀粉酶。
在此定义范围内的“衍生物”通常以一定程度保留了在野生型、天然或亲本形式中所观察到的特征性水解活性，所述程度使得所述衍生物可用于与所述野生型、天然或亲本形式相似的目的。葡糖淀粉酶的功能性衍生物涵盖天然存在的、合成或重组产生的肽或肽片段，其具有本公开的葡糖淀粉酶的一般特征。
术语“分离的”是指从天然环境中移出的物质(如果其天然存在的话)。“纯化的”蛋白质是指被至少部分纯化至同质的蛋白质。在一些实施方案中，纯化的蛋白质是超过约10％纯的、约20％纯的或约30％纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。本公开的其它方面包括高度纯化形式的蛋白质(即超过约40％纯的、约60％纯的、约80％纯的、约90％纯的、约95％纯的、约97％纯的或约99％纯的)，如通过SDS-PAGE所测定的。
如本文所用，术语“组合诱变”是指其中产生了起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体含有一个或数个选自预定突变组的突变。此外，该方法提供了手段来引入不是预定突变组的成员的随机突变。在一些实施方案中，该方法包括美国专利No.6,582,914中所示的那些，藉此将其以引用的方式并入本文。在备选的实施方案中，组合诱变方法涵盖可商购获得的试剂盒(例如，加利福尼亚州圣地亚哥Stratagene公司(Stratagene，SanDiego，CA)的
如本文所用，术语“突变体的文库”是指其基因组的大部分是相同的但包括一个或多个基因的不同同源物的一组细胞。可将此类文库用于例如鉴别具有改善性状的基因或操纵子。
如本文所用，术语“干固形物含量(DS或ds)”是指以干重计，以％表示的浆料的总固形物。
如本文所用，术语“初始命中物”是指通过筛选组合共有诱变文库而鉴别出的变体。在一些实施方案中，与起始基因相比初始命中物具有改善的性能特征。
如本文所用，术语“改善的命中物”是指通过筛选增强的组合共有诱变文库而鉴别出的变体。
如本文所用，术语“靶特性”是指待改变的起始基因的特性。无意于将本公开限制为任何特定的靶特性。然而，在一些实施方案中，靶特性是基因产物的稳定性(例如对变性、蛋白质水解或其它降解性因素的抗性)，而在其它实施方案中，生产宿主中的生产水平得以改变。的确，所考虑的是起始基因的任何特性都将可用于本公开中。术语的其他定义可在整个本说明书中出现。
如本文所用，“制造啤酒的工艺”还可应用于任何谷粉的淀粉糖化中。
如本文所用，术语“谷粉”是指可源自任何植物和植物部分的任何含有淀粉和/或糖的植物材料，所述植物和植物部分包括根茎(例如马铃薯)、根(例如木薯[Manihotesculenta]根)、茎、叶和种子。所述谷粉可包括谷物，如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米/玉蜀黍、稻、蜀黍、粟和高粱的谷物，并且例如至少10％，或至少15％，或至少25％，或至少35％，如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(w/w)的麦芽汁的谷粉源自谷物。在一些实施方案中，所述谷粉可包含从木薯[Manihot esculenta]根获得的含淀粉和/或糖的植物材料。谷粉可包含发芽的谷物，如大麦麦芽。通常，至少10％，或至少15％，或至少25％，或至少35％，如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(w/w)的麦芽汁的谷粉来自发芽的谷物。谷粉可包含添加物，如至多10％，或至少10％，或至少15％，或至少25％，或至少35％，或至少50％、至少75％、至少90％，或甚至100％(w/w)的麦芽汁的谷粉是添加物。
术语“添加物”被理解为谷粉中不是大麦麦芽的部分。添加物可以是任何富含碳水化合物的物质。在术语“添加物”中，包括含淀粉和/或糖的植物材料，如例如在“谷粉”中所定义的。
在酿造的语境中，术语“发酵”意指麦芽汁中的糖被酿酒酵母中的酶转化为乙醇和二氧化碳，伴随其它发酵副产物的形成。
如本文所用，术语“麦芽”被理解为任何发芽的谷物，如大麦。
如本文所用，术语“麦芽饮料”包括诸如全麦啤酒、爱尔啤酒、干啤、淡啤酒、轻啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒(porter)、博克啤酒(bock beer)、烈啤酒、麦芽酒、非含醇麦芽酒等之类的成泡发酵麦芽饮料。术语“麦芽饮料”还包括无泡啤酒和备选的麦芽饮料，如水果调味的麦芽饮料，例如柑橘类水果调味的(例如柠檬调味的、橙子调味的、酸橙调味的或浆果调味的)麦芽饮料，酒调味的麦芽饮料(例如伏特加酒调味的、朗姆酒调味的或龙舌兰酒调味的麦芽酒)，或咖啡调味的麦芽饮料(例如咖啡因风味的麦芽酒等)。
术语“醪液”被理解为含水的淀粉浆料，例如包含压碎的大麦麦芽、压碎的大麦和/或其它添加物或它们的组合，稍后将其与水相混合以待分离成麦芽汁+麦糟。
如本文所用，术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化工艺中对谷粉进行提取后未发酵的液体流出物(run-off)。
如本文所用，术语“麦糟”是指当对谷粉进行了提取且将麦芽汁从醪液中分离时余留的排去了液体的固体。
术语“啤酒”中所包括的是任何发酵的麦芽汁，其通过对含淀粉的材料进行酿造和发酵而产生，主要源自谷粒，例如发芽的大麦。也可使用小麦、玉米和稻。
如本文所用，术语麦芽汁中的“提取回收率”被定义为从谷粉(麦芽和添加物)提取的可溶性物质的总和，表示为基于干物质的百分比。
如本文所用，术语“巴氏灭菌”意指在某个温度下加热(例如啤酒)持续某个时间间隔。目的是正常杀灭微生物但巴氏灭菌还可引起酶活性的失活。在酿造工艺中实施巴氏灭菌通常是通过使用闪蒸巴氏灭菌器或隧道式巴氏灭菌器。如本文所用，术语“巴氏灭菌单位或PU”是指对巴氏灭菌的定量度量。对于啤酒而言一个巴氏灭菌单位(1PU)被定义为在60摄氏度下保热一分钟。可计算如下：
PU＝t×1.393^(T-60)，其中：
t＝在巴氏灭菌器中在巴氏灭菌温度下的时间(分钟)，
T＝巴氏灭菌器中的温度(摄氏度)，
[^(T-60)表示指数(T-60)]
取决于啤酒类型、原材料和微生物污染、酿造者和对啤酒风味的感知效果，可使用不同的最小PU。通常，对于啤酒巴氏灭菌，需要14-15PU。取决于巴氏灭菌的设备，巴氏灭菌温度通常在64-72摄氏度的范围内，相应地计算巴氏灭菌时间。其它信息可在如下文献中找到：“柏林酿造学院(Research and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB))的Wolfgang Kunze所著的“Technology Brewing and Malting(《酿造和制麦技术》)”，第三完全更新版，2004，ISBN 3-921690-49-8。”
如本文所用，术语“非含醇啤酒”或“低醇啤酒”是指以体积计含有最多0.1％至3.5％或0.1％至2.5％，如0.1％至0.5％的醇的啤酒。非含醇啤酒是通过传统方法酿造的，但是在酿造工艺的最后阶段中通过利用水和醇的不同沸点通过真空蒸发而除去醇。
如本文所用，术语“低卡路里啤酒”或“具有低碳水化合物含量的啤酒”定义具有的碳水化合物含量为1.5g/100g或更低且具有的实际发酵度为至少80％的啤酒。
在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定范围中的任何规定值或中间值与该规定范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围被涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中界限中任一者、界限均不或界限二者被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开文本中，但依据该规定范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开文本中。
在更详细地描述示例性的实施方案之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。尽管与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但现在将描述示例性的方法和材料。
如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物，除非文中另外明确指出。因此，例如，提到“基因”则包括多个这种候选物质，而提到“细胞”则包括提到“一个或多个细胞”以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。
本文述及的出版物只是因为它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文中没有任何部分应被理解为承认本公开不因为在先发明而有权先于此类出版物。
1.2.缩写
GA 葡糖淀粉酶
GAU 葡糖淀粉酶单位
wt％ 重量百分比
℃ 摄氏度
rpm 每分钟转数
H2O 水
dH2O 去离子水
dIH2O 去离子水，Milli-Q过滤
aa或AA 氨基酸
bp 碱基对
kb 千碱基对
kD 千道尔顿
g或gm 克
μg 微克
mg 毫克
μl和μL 微升
ml和mL 毫升
mm 毫米
μm 微米
M 摩尔浓度
mM 毫摩尔浓度
μM 微摩尔浓度
U 单位
V 伏特
MW 分子量
MWCO 分子量截止值
sec(s)或s(s) 秒
min(s)或m(s) 分钟
hr(s)或h(s) 小时
DO 溶解氧
ABS 吸光度
EtOH 乙醇
PSS 生理盐水溶液
m/v 质量/体积
MTP 微量滴定板
N 标准浓度
DP1 单糖
DP2 多糖
DP＞3 寡糖，具有大于3的聚合度的糖
ppm 份每一百万份
SBD 淀粉结合结构域
CD 催化结构域
PCR 聚合酶链反应
WT 野生型
2.亲本葡糖淀粉酶
在一些实施方案中，本公开提供了葡糖淀粉酶变体。所述葡糖淀粉酶变体是亲本葡糖淀粉酶的变体，其可包含催化结构域和淀粉结合结构域二者。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含的催化结构域具有如SEQ IDNO：1、2、3、5、6、7、8或9中所示的氨基酸序列或具有与SEQ IDNO：1、2、3、5、6、7、8或9中所示的氨基酸序列的一者或多者显示出至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或约99.5％序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含由如下DNA序列编码的催化结构域：其在中、高或严格条件下与编码具有SEQ IDNO：1、2或3的氨基酸序列之一的葡糖淀粉酶的催化结构域的DNA杂交。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含的淀粉结合结构域具有如SEQ ID NO 1、2、11、385、386、387、388、389或390中所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO 1、2、11、385、386、387、388、389或390中所示的氨基酸序列的一者或多者显示出至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或约99.5％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含由如下DNA序列编码的淀粉结合结构域：其在中、高或严格条件下与编码具有SEQ ID NO：1、2或11的氨基酸序列之一的葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域的DNA杂交。
葡糖淀粉酶的预测结构和已知序列在真菌物种中是保守的(Coutinho等人，1994，Protein Eng.(《蛋白质工程》)，7：393-400以及Coutinho等人，1994，Protein Eng.(《蛋白质工程》)，7：749-760)。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶为丝状真菌葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是从下列物种获得的：木霉属(Trichoderma)菌株(例如里氏木霉、长枝木霉(T.longibrachiatum)、T.strictipilis、棘孢木霉(T.asperellum)、康宁木霉(T.konilangbra)和哈茨木霉(T.hazianum))、曲霉属(Aspergillus)菌株(例如黑曲霉、构巢曲霉(A.nidulans)、白曲霉(A.kawachi)、泡盛曲霉(A.awamori)和米曲霉(A.orzyae))、篮状菌属菌株(例如埃默森篮状菌(T.emersonii)、嗜热篮状菌(T.thermophilus)和T.duponti)、肉座菌属(Hypocrea)菌株(例如胶质肉座菌(H.gelatinosa)、东方肉座菌(H.orientalis)、酒色肉座菌(H.vinosa)和H.citrina)、镰刀菌属(Fusarium)菌株(例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、粉红镰刀菌(F.roseum)和F.venenatum)、链孢霉属(Neurospora)菌株(例如粗糙链孢霉(N.crassa))和腐质霉属(Humicola)菌株(例如，灰腐质霉(H.grisea)、特异腐质霉(H.insolens)和疏绵状腐质霉(H.lanuginose))、青霉属(Penicillium)菌株(例如点青霉(P.notatum)或产黄青霉(P.chrysogenum))或复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)菌株(例如扣囊复膜孢酵母(S.fibuligera))。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶可以是细菌葡糖淀粉酶。例如，多肽可从革兰氏阳性细菌菌株中获得，例如芽孢杆菌属(Bacillus)(例如嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis))或链霉菌属(Streptomyces)菌株(例如变铅青链霉菌(S.lividans))。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：3的TrGA氨基酸序列的催化结构域具有至少约80％、约85％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％序列同一性的催化结构域。
在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：5或SEQID NO：6的曲霉属亲本葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的催化结构域。
在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：8的灰腐质霉(HgGA)亲本葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％序列同一性的催化结构域。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：1、2或11的TrGA氨基酸序列的淀粉结合结构域具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约98％序列同一性的淀粉结合结构域。
在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：385的灰腐质霉(HgGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％序列同一性的淀粉结合结构域。
在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：390的太瑞斯梭孢壳霉(TtGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％序列同一性的淀粉结合结构域。
在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：386的疏棉状嗜热丝孢菌(ThGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％序列同一性的淀粉结合结构域。
在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：387的埃默森篮状菌(TeGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％序列同一性的淀粉结合结构域。
在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：388或389的曲霉属亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域具有至少约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的淀粉结合结构域。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：1或2的TrGA氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。
在其它实施方案中，将从木霉属或肉座菌属菌株获得木霉属葡糖淀粉酶同源物。一些典型的木霉属葡糖淀粉酶同源物在美国专利No.7,413,887中描述，特别参考所述参考文献中SEQ ID NO：17-22和43-47中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的TrGA，或与TrGA序列(SEQ ID NO：2)具有至少约80％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的木霉属葡糖淀粉酶同源物。
可使用标准重组DNA技术分离和/或鉴别亲本葡糖淀粉酶。可使用本领域技术人员已知的任何标准技术。例如，可使用葡糖淀粉酶的保守区域特异性的探针和/或引物来鉴别细菌或真菌细胞中的同源物(催化结构域、活性位点等)。备选地，可使用简并PCR来鉴别细菌或真菌细胞中的同源物。在一些情形中，可就与已知葡糖淀粉酶(包括SEQ ID NO：2)或已知淀粉结合结构域(包括SEQ ID NO：11)其中一者的序列和/或结构同一性分析已知的序列(例如数据库中的序列)。也可使用功能性测定法来鉴别细菌或真菌细胞中的葡糖淀粉酶活性。可分离具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质并逆向测序以分离相应的DNA序列。此类方法是本领域技术人员已知的。
3.葡糖淀粉酶结构同源性
分子生物学的中心法则是编码特定酶的基因的DNA序列决定该蛋白质的氨基酸序列，此序列继而决定酶的三维折叠。这种折叠使不同的残基聚到一起而产生催化中心和底物结合表面，并且这产生了所考虑的酶的高特异性和活性。
葡糖淀粉酶由多至三个不同结构域组成，即大约450个残基的催化结构域(其在所有的葡糖淀粉酶中在结构上是保守的)，一般接有由30至80个残基组成的连接区，其与大约100个残基的淀粉结合结构域相连。本文中以1.8埃的分辨率确定了所有三个区域均完整的里氏木霉葡糖淀粉酶的结构(见WO2009/067218(美国丹尼斯科公司(Danisco US Inc.)，杰能科分公司(Genencor Division))中第94-216页的表20，在此以引用的方式并入本文；以及WO2009/067218(美国丹尼斯科公司杰能科分公司)中第89-93页的实施例11，在此以引用的方式并入本文)。使用坐标(参见WO2009/067218(美国丹尼斯科公司杰能科分公司)中第94-216页的表20，在此以引用的方式并入本文)，将此结构与之前测定的来自泡盛曲霉菌株X100的葡糖淀粉酶的催化结构域的坐标(Aleshin，A.E.，Hoffman，C.，Firsov，L.M.和Honzatko，R.B.Refined crystal structures of glucoamylase fromAspergillusawamori var.X100(《来自泡盛曲霉变种X100的葡糖淀粉酶的精修晶体结构》).J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)238：575-591(1994))进行比对。泡盛曲霉晶体结构仅包括催化结构域。如在图6-7中所见的，催化结构域的结构很紧密地重合，并且有可能基于此结构叠合而鉴别出等价的残基。据信所有的葡糖淀粉酶均具有图6-7中所示的基本结构。
TrGA的催化结构域因此具有大约450个残基(如TrGA SEQ ID NO：2的残基1-453)并且是12个螺旋的双桶型结构域。可就具有SEQ ID NO：2的TrGA的形成螺旋和环的残基来定义催化结构域的所述螺旋和环：
螺旋1 残基2-20，
环1 残基21-51，
螺旋2 残基52-68，
环2 残基69-71，
螺旋3 残基72-90，
环3 残基91-125，
螺旋4 残基126-145，
环4 残基146，
螺旋5 残基147-169，
螺旋6 残基186-206，
环6 残基207-210，
螺旋7 残基211-227，
环7 残基211-227，
螺旋8 残基250-275，
环8 残基260-275，
螺旋9 残基276-292，
环9 残基293-321，
螺旋10 残基322-342，
环10 残基343-371，
螺旋11 残基372-395，
环11 残基396-420，
螺旋12 残基421-434，
环12 残基435-443，
螺旋13 残基444-447，
环13 残基448-453
连接结构域具有30至80个残基(如具有SEQ ID NO 2的TrGA的残基454-490)。
TrGA的淀粉结合结构域具有大约100个残基(如具有SEQ ID NO：2的TrGA的残基496-596)，其由β夹心(由两个扭转的三链片层构成)组成。可就具有SEQ ID NO：2的TrGA的形成片层、螺旋和环的残基来定义淀粉结合结构域的所述片层、螺旋和环：
片层1′ 残基496-504，
环1′ 残基505-511，
片层2′ 残基512-517，
互联环2′ 残基518-543，
片层3′ 残基544-552，
环3′ 残基553，
片层4′ 残基554-565，
环4′ 残基566-567，
片层5′ 残基568-572，
内部片层区段 残基573-577，
片层5a′ 残基578-582，
环5′ 残基583-589，
片层6′ 残基590-596，
有可能基于结构叠合而鉴别出其它葡糖淀粉酶中的等价残基，如下文中所进一步详细描述的。
图6是SEQ ID NO：2的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)与泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)的三维结构比较的侧面视图。在此视图中，可看到催化结构域和连接区以及淀粉结合结构域之间的关系。
图7是SEQ ID NO：2的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)与泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)的三维结构比较的俯视图。本文所示的葡糖淀粉酶以及实际上迄今所有已知的葡糖淀粉酶具有这种结构同源性。对于所有的葡糖淀粉酶而言，结构的保守性与活性的保守性以及保守的作用机制相关。鉴于此高同源性，由木霉属葡糖淀粉酶的位点特异性变体(其引起改变的功能)产生的改变在其它葡糖淀粉酶中也将具有相似的结构性以及功能性影响。因此，关于什么变体产生所需的益处的教导可被应用于其它葡糖淀粉酶。
对于淀粉结合结构域(SBD)，使用WO2009/067218(美国丹尼斯科公司杰能科分公司)中第94-216页的表20(在此以引用的方式并入本文)的坐标来产生进一步的晶体结构。将TrGA的SBD与黑曲霉的SBD进行比对。如图8中所示的，黑曲霉和TrGA的SBD的结构非常紧密地重合。据信虽然所有的淀粉结合结构域至少具有图8中所示的某些基本结构，但一些SBD在结构上比其它的更相似。例如，TrGA SBD可被归类为在CAZY数据库(cazy.org)内的碳水化合物结合模块20家族中。CAZY数据库描述了酶降解、修饰或产生糖苷键的结构上相关的催化模块和碳水化合物结合模块(或功能性结构域)的家族。鉴于高的结构同源性，引起功能改变的TrGA SBD的位点特异性变体对于具有与所述TrGA SBD的结构有相似结构的SBD的其它葡糖淀粉酶(特别是被归类在碳水化合物结合模块20家族中的那些)也将有相似的结构以及功能性影响。因此，关于什么变体产生所需的益处的教导可被应用于具有结构相似性的其它SBD。
因此，本文中所讨论的氨基酸位置编号是指分配给图1中所示的成熟里氏木霉葡糖淀粉酶序列(SEQ ID NO：2)的那些。然而，本公开不限于木霉属葡糖淀粉酶的变体，而是延伸至在“等价”于里氏木霉葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：2)中具体确定的残基的位置处含有氨基酸残基的葡糖淀粉酶。在本公开的一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是篮状菌属GA并且在篮状菌属葡糖淀粉酶(见例如SEQ ID NO：12)中等价的氨基酸残基位置处进行置换，如本文中所描述的那些。在其它的实施方案中，亲本葡糖淀粉酶包含SEQ ID NO：5-9(见图5A和5B)。在其它的实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是青霉属葡糖淀粉酶，如产黄青霉(见例如SEQID NO：13)。
“结构同一性”决定氨基酸残基是否是等价的。结构同一性是当将两个结构(三维和氨基酸结构)进行比对时一对一的拓扑等价。如果葡糖淀粉酶的残基(氨基酸)位置与里氏木霉葡糖淀粉酶中的特定残基或该残基的部分同源(即在一级或三级结构中在位置上相对应)或类似(具有相同或相似的功能能力以结合、反应或在化学上相互作用)，则其“等价”于里氏木霉葡糖淀粉酶的残基。
为了确立与一级结构的同一性，可将葡糖淀粉酶的氨基酸序列与里氏木霉葡糖淀粉酶的一级序列直接进行比较，特别是与在序列已知的葡糖淀粉酶中已知不变的残基组进行比较。例如，本文中的图5A和5B示出了葡糖淀粉酶之间的保守残基。图5D和5E示出了来自多种葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域的比对。在将保守残基进行比对、允许必要的插入和缺失以维持比对(即避免通过随意的缺失和插入而消除保守残基)后，可确定与里氏木霉葡糖淀粉酶一级序列中的特定氨基酸等价的残基。保守残基的比对通常应当是此类残基100％保守。然而，超过约75％或少至约50％的保守残基的比对也足以确定等价的残基。此外，可将结构同一性与序列同一性相结合而用于鉴别等价的残基。
例如，在图5A和5B中，将来自六种生物体的葡糖淀粉酶的催化结构域进行比对以提供氨基酸序列间最大量的同源性。这些序列的比较显示，每个序列中都含有许多保守残基，如用星号所指示的。因此，这些保守残基可用于在其它葡糖淀粉酶(例如来自黑曲霉的葡糖淀粉酶)中确定里氏木霉葡糖淀粉酶的相应等价氨基酸残基。类似地，图5D和5E示出了来自七种生物体的葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域，将其进行比对以鉴别出等价的残基。
结构同一性涉及鉴别两个结构之间的等价残基。对于已通过X射线晶体学确定了其三级结构的酶，可通过确定三级结构水平上的同源性(结构同一性)来定义“等价残基”。等价残基定义为这样的残基：比对后，对其而言，里氏木霉葡糖淀粉酶特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子(N对N、CA对CA、C对C以及O对O)的原子坐标在0.13nm以及任选在0.1nm之内。在一个方面中，比对之后，四个可能的主链原子中的至少2个或3个在0.1nm之内。比对是在已将最佳模型进行取向和定位以使所考虑的葡糖淀粉酶的非氢蛋白质原子与里氏木霉葡糖淀粉酶的原子坐标达到最大重叠后而实现。最佳模型是对于可获得的最高分辨率下的实验衍射数据给出最低R因子的晶体模型。
功能上类似于里氏木霉葡糖淀粉酶特定残基的等价残基被定义为该酶的这样的氨基酸：其可采取某种构象，使得它们以确定的且归因于里氏木霉葡糖淀粉酶特定残基的方式改变、修饰或促成蛋白质结构、底物结合或催化作用。此外，它们是酶(已通过X射线晶体学获得了其三级结构)的这样的残基：其以如下程度占据类似的位置，即尽管给定残基的主链原子可能不满足基于占据同源位置的等价标准，但该残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于里氏木霉葡糖淀粉酶相应侧链原子的0.13nm内。里氏木霉葡糖淀粉酶三维结构的坐标如WO2009/067218(美国丹尼斯科公司，杰能科分公司)中第94-216页的表20所示(在此以引用的方式并入本文)，并可如上文所述用于在三级结构水平上确定等价残基。
被鉴别用于置换的残基中的一些是保守残基，而其它则不是。在残基不是保守的的情形中，一个或多个氨基酸的置换局限于产生如下变体的置换：所述变体具有的氨基酸序列不对应于自然中存在的氨基酸序列。在保守残基的情形中，此类置换不应产生天然存在的序列。
4.葡糖淀粉酶变体
根据本公开的变体在亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列中包括至少一个置换、缺失或插入而使得所述变体在序列上不同于所述亲本葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，本公开的变体将具有至少约20％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约100％的如TrGA(SEQ ID NO：2)、与TrGA(SEQ ID NO：2)具有至少80％序列同一性的亲本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性。在一些实施方案中，根据本公开的变体将在亲本TrGA(SEQ ID NO：2)的至少一个氨基酸位置中或在另一亲本葡糖淀粉酶序列的等价位置中包含置换、缺失或插入，所述另一亲本葡糖淀粉酶序列与TrGA序列(SEQ ID NO：2)具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。
在其它实施方案中，根据本公开的变体将在亲本TrGA的片段(其中所述片段包含TrGA序列的催化结构域(SEQ ID NO：3))的至少一个氨基酸位置中，或者在与SEQ ID NO：3、5、6、7、8或9的含催化结构域片段具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的包含亲本葡糖淀粉酶催化结构域的片段的等价位置中包含置换、缺失或插入。在一些实施方案中，所述片段将包含TrGA催化结构域(SEQ IDNO：3)的至少约400、约425、约450或约500个氨基酸残基。
在其它实施方案中，根据本公开的变体将在亲本TrGA的片段(其中所述片段包含TrGA序列的淀粉结合结构域(SEQ ID NO：11))的至少一个氨基酸位置中，或者在与SEQ IDNO：11、385、386、387、388、389和390的含淀粉结合结构域片段具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％序列同一性的包含亲本葡糖淀粉酶淀粉结合结构域的片段的等价位置中，包含置换、缺失或插入。在一些实施方案中，所述片段将包含TrGA淀粉结合结构域(SEQ ID NO：11)的至少约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100或约109个氨基酸残基。
在一些实施方案中，当亲本葡糖淀粉酶包括催化结构域、连接区和淀粉结合结构域时，变体将在包含部分连接区的片段的至少一个氨基酸位置包含置换、缺失或插入。在一些实施方案中，变体将在TrGA序列(SEQ IDNO：2)的片段的氨基酸序列中包含置换、缺失或插入。
关于氨基酸置换的结构同一性意指置换发生在同源葡糖淀粉酶或亲本葡糖淀粉酶的等价氨基酸位置。术语等价位置意指基于所考虑的亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列及所考虑的亲本葡糖淀粉酶的三维结构与TrGA参考葡糖淀粉酶氨基酸序列及三维序列的比对而为两个亲本序列所共有的位置。例如，参照图5A，TrGA(SEQ ID NO：2或3)中的位置24是D24，对于黑曲霉(SEQ ID NO：6)的等价位置是位置D25，而对于米曲霉(SEQ ID NO：7)的等价位置是位置D26。对于三维序列的示例性比对，见图6和7。
因此，在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体在处于其晶体形式时，具有的晶体结构的主链原子的原子坐标与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218中的表20中所定义的)在等价主链原子比对后具有小于0.13nm的均方根偏差，并且所述葡糖淀粉酶变体具有连接区、淀粉结合结构域和催化结构域，相对于亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列所述变体在淀粉结合结构域的互联环2′中，和/或在催化结构域的环1中和/或螺旋2中和/或环11中和/或螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。在另一个方面中，与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218的表20中所定义的)的均方根偏差小于0.12nm，如小于0.11或如小于0.10。
在一个方面中，描述了用于在淀粉水解过程中减少缩合产物的合成的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体包含淀粉结合结构域和催化结构域，所述变体相对于SEQ IDNO：2的氨基酸序列或等价的亲本葡糖淀粉酶在互联环2′，和/或环1，和/或螺旋2，和/或环11，和/或螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。
在另一个方面中，描述了葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体相对于具有SEQID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或具有SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或具有SEQID NO：2位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或具有SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或具有SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列包含两个或更多个氨基酸置换。
在另一个方面中，描述了葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体相对于SEQ IDNO：2位置518至位置543的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或SEQ IDNO：2位置21至位置51的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或SEQ IDNO：2位置52至位置68的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或SEQ IDNO：2位置396至位置420的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，和/或SEQ IDNO：2位置421至位置434的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列包含两个或更多个氨基酸置换。
在一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换是相对于具有SEQ IDNO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′(例如在位置518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542和/或543中的一者或多者中)，和/或具有SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1(例如在位置21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和/或51的一者或多者中)，和/或具有SEQ ID NO：2位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2(例如在位置52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67和/或68的一者或多者中)，和/或具有SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11(例如在位置396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419和/或420的一者或多者中)，和/或具有SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12(例如在位置421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433和/或534的一者或多者中)而言。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环1和/或螺旋2和/或环11和/或螺旋12中的至少一个氨基酸置换。在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的1、2、3或4个氨基酸置换和环1和/或螺旋2和/或环11和/或螺旋12中的1、2、3或4个氨基酸置换。
在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环1中的至少一个氨基酸置换。在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和螺旋2中的至少一个氨基酸置换。在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环11中的至少一个氨基酸置换。在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和螺旋12中的至少一个氨基酸置换。在另一个方面中，所述两个或更多个氨基酸置换为互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环1中的至少一个氨基酸置换以及螺旋2中的至少一个氨基酸置换。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在互联环2′位置520-543、530-543或534-543中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在环1位置30-50、35-48或40-46的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在螺旋2位置50-66、55-64或58-63的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在环11位置405-420、410-420或415-420的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在螺旋12的位置421-434、425-434或428-434的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
在一个方面，葡糖淀粉酶变体包含两个或更多个氨基酸置换，其中一个氨基酸置换在位置539且一个氨基酸置换在位置44，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，并且所述序列与亲本葡糖淀粉酶具有至少80％的序列同一性，并且其中位置44的氨基酸置换不是44C。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体包含两个或更多个氨基酸置换，其中一个氨基酸置换在位置539且一个氨基酸置换是44R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在位置61包含氨基酸置换，所述位置对应于SEQ IDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在另一个方面中，位置539的氨基酸置换是539R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在另一个方面中，位置44的氨基酸置换是44R，所述位置对应于SEQ IDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。在另一个方面中，位置61的氨基酸置换是61I，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体包含如下氨基酸置换：
a)D44R和A539R；或
b)D44R、N61I和A539R，
所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体由SEQ ID NO：2组成且具有如下氨基酸置换：
a)D44R和A539R；或
b)D44R、N61I和A539R，
所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置。
在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、11、385、386、387、388、389或390的淀粉结合结构域具有至少96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的淀粉结合结构域。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9的催化结构域具有至少80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的催化结构域。
在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶为真菌葡糖淀粉酶。
在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶选自从下述物种获得的葡糖淀粉酶：木霉属物种、曲霉属物种、腐质霉属物种、青霉属物种、篮状菌属物种或裂殖酵母属(Schizosaccharmyces)物种。
在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶是从木霉属物种或曲霉属物种获得的。
在另一个方面中，已对葡糖淀粉酶进行纯化。可通过本领域中已知的多种程序(包括离心、过滤、提取、沉淀等)从培养基回收或纯化本公开的葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体将在亲本的氨基酸序列中包括至少两个置换。在其它实施方案中，所述变体可具有多于两个置换。例如，与相应的亲本葡糖淀粉酶相比，变体可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体在对应于图5A、5B、5D和5E中所示的非保守氨基酸区域的位置(例如，对应于图5A、5B、5D和5E中未标记为“*”的那些位置的氨基酸位置)的至少一个氨基酸位置中包含置换、缺失或插入(通常为置换)。
虽然变体可在成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：2)的任何位置具有置换，但在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包含两个或更多个置换：23、42、43、44、59、60、61、65、67、68、410、417、418、430、431、433、518、519、520、527、531、535、536、537或539。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包含一个或多个另外的置换：10、14、15、72、73、97、98、99、102、110、113、114、133、140、144、145、147、152、153、164、182、204、205、214、216、219、228、229、230、231、236、239、241、242、263、264、265、268、269、276、284、291、294、300、301、303、311、338、342、344、346、349、359、361、364、375、379、382、390、391、393、394、436、442、444、448、451、493、494、495、502、503、508、511、563或577。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：2具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将是木霉属葡糖淀粉酶同源物。在一些实施方案中，变体将具有改变的特性。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ IDNO：2的葡糖淀粉酶将具有结构同一性。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶(例如木霉属葡糖淀粉酶同源物)的等价位置中包含两个或更多个置换：P23、T42、I43、D44、P45、D46、F59、K60、N61、T67、E68、R408、S410、S415、L417、H418、T430、A431、R433、N518、A519、A520、T527、V531、A535、V536、N537和A539。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包含一个或多个置换：T10、L14、N15、A72、G73、S97、L98、A99、S102、K108、E110、L113、K114、R122、Q124、R125、I133、K140、N144、N145、Y147、S152、N153、N164、F175、N182、A204、T205、S214、V216、Q219、W228、V229、S230、S231、D236、I239、N240、T241、N242、G244、N263、L264、G265、A268、G269、D276、V284、S291、G294、P300、A301、A303、Y310、A311、D313、Y316、V338、T342、S344、T346、A349、V359、G361、A364、T375、N379、S382、S390、E391、A393、K394、I436、A442、N443、S444、T448、S451、T493、P494、T495、H502、E503、Q508、Q511、N563和N577。在一些实施方案中，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体将具有改变的特性。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体可仅在特定的位置有别于亲本葡糖淀粉酶。
在其它实施方案中，葡糖淀粉酶亲本的变体在SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的下列位置中包含至少两个下列置换：T42V、I43Q/R、D44R/C、N61I、T67M、E68C/M、L417K/R/V、T430A/K、A431I/L/Q、R433C/E/G/L/N/S/V/Y、A519I/K/R/Y、A520C/L/P、V531L、A535K/N/P/R、V536M或A539E/R/S，或包含亲本葡糖淀粉酶等价位置中的置换。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包含一个或多个置换：T10S、A72Y、G73F/W、S97N、S102A/M/R、K114M/Q、I133T/V、N145I、N153A/D/E/M/S/V、T205Q、Q219S、W228A/F/H/M/V、V229I/L、S230C/F/G/L/N/Q/R、S231L/V、D236R、I239V/Y、N263P、L264D/K、A268C/D/G/K、S291A/F/H/M/T、g294c、A301P/R、V338I/N/Q、T342V、S344M/P/Q/R/V、G361D/E/F/I/L/M/P/S/W/Y、A364D/E/F/G/K/L/M/R/S/T/V/W、T375N、K394S、I436H、T451K、T495K/M/S、E503A/C/V、Q508R、Q511H、N563C/E/I/K/K/Q/T/V或N577K/P/R。
在另外的实施方案中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2的相关位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包含如下置换组之一：
N61I/L417V/A431L/A539R；
I43Q/N61I/L417V/A431L/A539R；
N61I/L417V/A431L/A535R/A539R
I43Q/L417V/A431L/A535R/A539R；
I43Q/N61I/L417V/A431L/A535R/A539R；
I43Q/N61I/L417V/T430A/A431L/A535R/A539R；
I43Q/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；
N61I/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；
I43Q/N61I/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；
I43R/N61I/L417V/A431L/A539R；
I43R/N61I/L417V/T430A/A431L/A535R/A539R；
G73F/L417R/E503V/A539R/N563K；
I43R/G73F/L417R/E503V/A539R/N563K；和
I43R/G73F/E503V/Q511H/N563K。
在另外的实施方案中，葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO：2的位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包含如下置换组之一：
L417V/A431L/A539R；
I43Q/L417V/A431L/A539R；
L417V/A431L/A535R/A539R
I43R/L417V/A431L/A539R；
L417R/A431L/A539R；或
L417G/A431L/A539R；
其中葡糖淀粉酶变体相对于亲本葡糖淀粉酶不具有任何另外的置换，并且其中亲本葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9具有至少80％序列同一性的催化结构域。因此，亲本葡糖淀粉酶可以是别处所描述的那些亲本葡糖淀粉酶中的任一者。
亲本葡糖淀粉酶可包含与SEQ ID NO：1、2、11、385、386、387、388、389或390具有至少95％序列同一性的淀粉结合结构域。亲本葡糖淀粉酶可与SEQ ID NO：1或2具有至少80％序列同一性；例如其可包含SEQID NO：1或2。任选地，亲本葡糖淀粉酶可由SEQ ID NO：1或2组成。
本公开的葡糖淀粉酶变体还可包括嵌合或杂合的葡糖淀粉酶，其具有例如来自一种葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域(SBD)和来自另一种葡糖淀粉酶的催化结构域和连接区。例如，杂合葡糖淀粉酶可通过将来自AnGA(SEQID NO：6)的SBD与来自TrGA(SEQ ID NO：2)的SBD进行交换而制备，从而产生具有AnGA SBD和TrGA催化结构域及连接区的杂合体。备选地，可将来自AnGA的SBD和连接区交换为来自TrGA的SBD和连接区。
在某些方面，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体葡糖淀粉酶显示出改变的热稳定性。在一些方面，所述改变的热稳定性可以是与亲本葡糖淀粉酶相比增加的热稳定性。在一些实施方案中，所述改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比改变的比活性。在一些实施方案中，所述改变的比活性可以是与亲本葡糖淀粉酶相比增加的比活性。在一些实施方案中，改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比，在更低的温度下增加的热稳定性。在一些实施方案中，改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比增加的比活性和增加的热稳定性。
在一个实施方案中，一些变体可包括SEQ ID NO：2的下列位置或亲本葡糖淀粉酶(特别是木霉属葡糖淀粉酶同源物)的等价位置中的置换：
D44R/N61I/A539R；
D44R/A539R；
I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/L417R/E503A/A539R；
I43R/N61I/L417R/E503A/Q511H/A539R；
G73F/T430A/Q511H；
I43R/G73F/T430A；
G73F/T430A/E503V/Q511H；
D44C/G73F/N563K；
D44C/G73F/E503V/Q511H；
D44C/G73F/N563K；
D44C/G73F/L417R/N563K；
D44C/G73F/N563K；
I43R/T430A；
I43Q/T430A；
I43Q/T430A/Q511H；
D44C/L417R/N563K；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；
L417V/T430A/A431Q/Q511H/A535R/A539R/N563I；
L417V/T430A/Q511H/A535R/N563I；
L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I；
G294C/L417R/A431L；
G294C/L417V/A431Q；
G294C/L417V/A431L/Q511H；
G294C/L417R/A431Q/Q511H；
L417R/A431L/Q511H；
L417V/A431Q/Q511H；
I43Q/T430A/Q511H/N61I；
I43Q/T430A/Q511H/L417V；
I43Q/T430A/Q511H/A431L；
I43Q/T430A/Q511H/E503A；
I43Q/T430A/Q511H/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/A431L/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/A431L/E503A；
I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R/A431L；
I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R/A431L；
I43Q/Q511H/N61I；
I43Q/Q511H/L417V；
I43Q/Q511H/A431L；
I43Q/Q511H/A539R；
I43Q/Q511H/A539R/N61I；
I43Q/Q511H/A539R/E503A；
I43Q/Q511H/A539R/T430M；
I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I；
I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I/L417V；
I43R/T430A/E503V/A535R/N563K；
D44R/E503A/Q511H/N563I；
E503A/N 563I；
I43R/T430A/E503A/Q511H/N563K；
D44R/T430A/Q511H/A535R；
L417V/A431L/A539R；
L417V/A431L/A539R/I43Q；
L417V/A431L/A539R/N61I；
L417V/A431L/A539R/A535R；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I；
L417V/A431L/A539R/N61I/A535R；
L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/N61I；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I；
L417V/A431L/A539R/I43R；
L417V/A431L/A539R/I43R/N61I；
L417V/A431L/A539R/I43R/N61I/A535R/T430A；
L417R/A431L/A539R；
L417G/A431L/A539R；
G73F/E503V/N563K/L417R/A539R；
G73F/E503V/N563K/I43R/L417R/A539R；和
G73F/E503V/N563K/I43R/Q511H。
在其它实施方案中，一些变体可包括SEQ ID NO：2的下列位置或亲本葡糖淀粉酶(特别是木霉属葡糖淀粉酶同源物)的等价位置中的置换：
D44R/N61I/A539R；
D44R/A539R；
I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/L417R/E503A/A539R；
I43R/N61I/L417R/E503A/Q511H/A539R；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；
L417V/T430A/A431Q/Q511H/A535R/A539R/N563I；
L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I；
I43Q/T430A/Q511H/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/A431L/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R/A431L；
I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R/A431L；
I43Q/Q511H/A539R；
I43Q/Q511H/A539R/N61I；
I43Q/Q511H/A539R/E503A；
I43Q/Q511H/A539R/T430M；
I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I；
I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I/L417V；
L417V/A431L/A539R；
L417V/A431L/A539R/I43Q；
L417V/A431L/A539R/N61I；
L417V/A431L/A539R/A535R；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I；
L417V/A431L/A539R/N61I/A535R；
L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/N61I；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I；
L417V/A431L/A539R/I43R；
L417V/A431L/A539R/I43R/N61I；
L417V/A431L/A539R/I43R/N61I/A535R/T430A；
L417R/A431L/A539R；
L417G/A431L/A539R；
G73F/E503V/N563K/L417R/A539R；和
G73F/E503V/N563K/I43R/L417R/A539R。
在其它实施方案中，一些变体可包括SEQ ID NO：2的下列位置或亲本葡糖淀粉酶(特别是木霉属葡糖淀粉酶同源物)的等价位置中的置换：
D44R/N61I/A539R；
D44R/A539R；
I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R；
I43R/L417R/E503A/A539R；
I43R/N61I/L417R/E503A/Q511H/A539R；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I；
L417V/T430A/A431Q/Q511H/A535R/A539R/N563I；
L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I；
I43Q/T430A/Q511H/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/A431L/A539R；
I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R/A431L；
I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R/A431L；
I43Q/Q511H/A539R；
I43Q/Q511H/A539R/N61I；
I43Q/Q511H/A539R/E503A；
I43Q/Q511H/A539R/T430M；
I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I；
I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I/L417V；
L417V/A431L/A539R；
L417V/A431L/A539R/I43Q；
L417V/A431L/A539R/N61I；
L417V/A431L/A539R/A535R；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I；
L417V/A431L/A539R/N61I/A535R；
L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/N61I；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I；
L417V/A431L/A539R/I43R；
L417V/A431L/A539R/I43R/N61I；
L417V/A431L/A539R/I43R/N61I/A535R/T430A；
L417R/A431L/A539R；
L417G/A431L/A539R；
G73F/E503V/N563K/L417R/A539R；和
G73F/E503V/N563K/I43R/L417R/A539R。
在其它实施方案中，一些变体可包括SEQ ID NO：2的下列位置或亲本葡糖淀粉酶(特别是木霉属葡糖淀粉酶同源物)的等价位置中的置换：
D44R/N61I/A539R；
D44R/A539R；
L417V/A431L/A539R；
L417V/A431L/A539R/I43Q；
L417V/A431L/A539R/N61I。
在其它实施方案中，一些变体可包括SEQ ID NO：2的下列位置或亲本葡糖淀粉酶(特别是木霉属葡糖淀粉酶同源物)的等价位置中的置换：
D44R/N61I/A539R；
D44R/A539R。
在其它实施方案中，一些变体具有SEQ ID NO：2的下列置换：D44R/N61I/A539R或D44R/A539R。
在另外的实施方案中，变体包含SEQ ID NO：1098。在另外的实施方案中，变体由SEQ ID NO：1098组成。在另外的实施方案中，变体包含SEQ ID NO：1099。在另外的实施方案中，变体由SEQ ID NO：1099组成。
已将多种亲本葡糖淀粉酶与TrGA的氨基酸序列进行了比对。图5包括下列亲本葡糖淀粉酶的催化结构域：泡盛曲霉(AaGA)(SEQ ID NO：5)；黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：6)；米曲霉(AoGA)(SEQ ID NO：7)；灰腐质霉(HgGA)(SEQ ID NO：8)；和酒色肉座菌属(HvGA)(SEQID NO：9)。下面的表1中给出了催化结构域的同一性百分比。
表1：多种真菌葡糖淀粉酶之间的序列同源性
AaGA AnGA AoGA HgGA HvGA TrGA
AaGA 100 95 58 53 57 56
AnGA 100 59 53 57 56
AoGA 100 55 56 56
HgGA 100 61 63
HvGA 100 91
TrGA 100
在一些实施方案中，例如，变体葡糖淀粉酶将源自为曲霉属葡糖淀粉酶、腐质霉属葡糖淀粉酶或肉座菌属葡糖淀粉酶的亲本葡糖淀粉酶。
5.对变体葡糖淀粉酶的表征
本公开还提供与亲本葡糖淀粉酶(特别是TrGA)相比具有至少一个改变的特性(例如改善的特性)的葡糖淀粉酶变体。在一些实施方案中，至少一个改变的特性(例如改善的特性)选自：IS/SH-比率、淀粉水解活性、实际发酵度、缩合产物形成减少、酸稳定性、热稳定性以及比活性。通常，改变的特性是减少的IS/SH-比率、提高的实际发酵度、减少的缩合产物形成、增加的热稳定性和/或增加的比活性。增加的热稳定性通常是在更高的温度下。在一个实施方案中，增加的pH稳定性是在高pH下。在其它实施方案中，增加的pH稳定性是在低pH下。
与亲本葡糖淀粉酶相比，本公开的葡糖淀粉酶变体也可提供在低底物浓度下更高的淀粉水解速率。当在相同的条件下测试时，变体可具有比亲本葡糖淀粉酶更高的Vmax或更低的Km。例如，在约25℃至约70℃(例如，约25℃至约35℃；约30℃至约35℃；约40℃至约50℃；约50℃至约55℃或约55℃至约62℃)的温度范围中，变体葡糖淀粉酶可具有更高的Vmax。使用标准的已知程序可容易地测定米氏常数、Km和Vmax值。在另一方面，葡糖淀粉酶也可显示出降低的淀粉水解活性，其与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比降低不超过5％、不超过10％或不超过15％。
5.1.具有改变的热稳定性的变体葡糖淀粉酶
在某些方面，本公开涉及与亲本(野生型)相比具有改变的热稳定性的变体葡糖淀粉酶。改变的热稳定性可以是在增加的温度下或在降低的温度下。热稳定性测量为在NaAc缓冲液(pH 4.5)中64℃下温育1小时后的残余活性百分比。在这些条件下，与温育前的初始活性相比，TrGA具有约15％至44％的残余活性(由于逐日的变化)。因此，在一些实施方案中，与温育前的初始活性相比，具有增加的热稳定性的变体具有的残余活性相较于亲本多至少约1％到至少约50％(在NaAc缓冲液(pH4.5)中64℃下温育一小时之后)，包括约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％和约50％。例如，当亲本的残余活性为15％时，具有增加的热稳定性的变体可具有约16％至约75％的残余活性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶变体将具有改善的热稳定性，如在给定的时间段(如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟或约300分钟)中暴露于改变的温度后，保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的酶活性。在一些实施方案中，在约40℃至约80℃的范围内，还有在约50℃至约75℃的范围内，和在约60℃至约70℃范围内的选定温度下，且在约4.0至约6.0的pH范围下，变体与亲本葡糖淀粉酶相比具有增加的热稳定性。在一些实施方案中，如在测定法和方法中所描述的来测定热稳定性。可酌情调整所述方法来测量其它温度下的热稳定性。备选地，可如所述方法中所描述的，在64℃下测定热稳定性。在一些实施方案中，在约20℃至约50℃(包括约35℃至约45℃和约30℃至约40℃)的范围中的选定温度下，变体在更低的温度下具有相较于亲本葡糖淀粉酶增加的热稳定性。
在一些实施方案中，具有热稳定性改善的变体在SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包括一个或多个缺失、置换或插入(特别是置换)：10、42、43、44、59、61、68、72、73、97、98、99、102、114、133、140、144、152、153、182、204、205、214、216、228、229、230、231、236、241、242、263、264、265、268、269、276、284、291、294300、301、303、311、338、342、344、346、349、359、361、364、375、379、382、390、391、393、394、410、417、430、431、433、436、442、444、448、451、493、495、503、508、511、518、519、520、527、531、535、536、537、539、563或577。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将是木霉属葡糖淀粉酶同源物，而在其它实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2将具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2还将具有结构同一性。在一些实施方案中，具有增加的热稳定性的变体在SEQ ID NO：2下列位置中的至少一者中具有置换：T10S、T42V、I43Q、I43R、D44C、D44R、E68C、E68M、G73F、G73W、K114M、K114Q、I133V、N153A、N153E、N153M、N153S、N153V、W228V、V229I、V229L、S230Q、S231V、D236R、L264D、L264K、A268D、S291A、S291F、S291H、S291M、S291T、G294C、A301P、A301R、V338I、V338N、V338Q、S344M、S344P、S344Q、S344R、S344V、G361D、G361E、G361F、G361I、G361L、G361M、G361P、G361S、G361W、G361Y、A364D、A364E、A364F、A364G、A364K、A364L、A364M、A364R、A364S、A364T、A364V、A364W、T375N、L417K、L417R、R433C、R433E、R433G、R433L、R433N、R433S、R433V、I436H、T495K、T495S、E503A、E503C、E503V、Q508R、Q511H、A519K、A519R、A519Y、V531L、A535K、A535N、A535P、A535R、A539E、A539R、A539S、N563C、N563E、N563I、N563K、N563L、N563Q、N563T、N563V、N577K、N577P或N577R。
5.2.具有改变的比活性的变体葡糖淀粉酶
如本文所用，比活性是每毫克蛋白质的葡糖淀粉酶活性。活性是用乙醇测定法来测定的。筛选鉴别出与亲本TrGA的性能指数(PI)相比具有大于1.0的PI的变体。PI是由野生型(WT)和变体酶的比活性(活性/mg酶)计算的。其为“变体-比活性/WT-比活性”之商且可以是变体比活性增加的量度。约2的PI应为好于WT约2倍。在一些方面，本公开涉及与亲本或野生型葡糖淀粉酶相比具有改变的比活性的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，所述改变的比活性为增加的比活性。增加的比活性可定义为大于或等于约1的增加的性能指数，包括大于或等于约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9和约2。在一些实施方案中，增加的比活性为约1.0至约5.0，包括约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2.、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8和约4.9。在一些实施方案中，变体具有高于亲本葡糖淀粉酶至少约1.0倍的比活性，包括至少约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2.0倍、约2.2倍、约2.5倍、约2.7倍、约2.9倍、约3.0倍、约4.0倍和约5.0倍。
在一些实施方案中，具有比活性改善的变体在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包括一个或多个缺失、置换或插入：10、14、15、23、59、60、61、65、67、68、72、73、97、98、99、102、110、113、133、140、144、145、147、152、153、164、182、204、205、214、216、219、228、229、230、231、236、239、241、242、263、264、265、268、269、276、284、291、300、301、303、311、338、342、344、346、349、359、361、364、375、379、382、390、391、393、394、410、417、418、430、431、433、442、444、448、451、493、494、495、502、503、508、511、518、519、520、531、535、536、539或563。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2还将具有结构同一性。在一些实施方案中，具有改善的比活性的本公开的变体在SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包括置换：I43Q、I43R、D44C、D44R、N061I、T067M、A072Y、S097N、S102A、S102M、S102R、I133T、N145I、N153D、T205Q、Q219S、W228A、W228F、W228H、W228M、S230C、S230F、S230G、S230L、S230N、S230Q、S230R、S231L、I239V、I239Y、N263P、A268C、A268G、A268K、S291A、G294C、T342V、K394S、L417R、L417V、T430K、A431I、A431L、A431Q、R433Y、T451K、T495M、A519I、A520C、A520L、A520P、A535R、V536M、A539R、N563K或N563I。在一些实施方案中，如在测定法和方法中所描述地测定与变体相比的亲本的比活性。
5.3.具有改变的热稳定性和改变的比活性二者的变体葡糖淀粉酶
在一些方面，本公开涉及与亲本(例如野生型)相比具有改变的热稳定性和改变的比活性二者的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，改变的比活性为增加的比活性。在一些实施方案中，改变的热稳定性为在高温下(例如，在超过80℃的温度下)与亲本葡糖淀粉酶相比增加的热稳定性。
在一些实施方案中，具有增加的热稳定性和增加的比活性的变体在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的下列位置或亲本葡糖淀粉酶的等价位置中包括一个或多个缺失、置换或插入和置换：10、15、43、44、59、61、68、72、73、97、99、102、140、153、182、204、205、214、228、229、230、231、236、241、242、264、265、268、276、284、291、294、300、301、303、311、338、344、346、349、359、361、364、375、379、382、391、393、394、410、430、433、444、448、451、495、503、511、520、531、535、536、539或563。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将是木霉属葡糖淀粉酶同源物而在另外的实施方案中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ IDNO：2具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：2还将具有结构同一性。在一些实施方案中，具有增加的热稳定性和比活性的变体在SEQ ID NO：2下列位置中的至少一者中具有置换：I43Q/R、D44C/R、W228F/H/M、S230C/F/G/N/Q/R、S231L、A268C/D/G/K、S291A、G294C、R433Y、S451K、E503C、Q511H、A520C/L/P或A535N/P/R。
5.4.产生可发酵糖的变体葡糖淀粉酶
在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出可发酵糖生成提高。在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出在酿造工艺的淀粉糖化步骤中可发酵糖生成提高。在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出在酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖生成提高。在另一个方面中，所述可发酵糖为葡萄糖。本领域技术人员可通过例如HPLC技术来测定可发酵糖的生成。
5.5具有改变的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)的变体葡糖淀粉酶
在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)。在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出的淀粉水解活性降低不超过5％、不超过10％或不超过15％。
在一个方面中，提供了用于鉴别在淀粉水解过程中具有减少的缩合产物合成的葡糖淀粉酶变体的筛选方法以及通过所述方法获得的葡糖淀粉酶变体，所述方法包括下列步骤：测量葡糖淀粉酶变体的异麦芽糖合成和淀粉水解活性，以及选择与亲本葡糖淀粉酶相比淀粉水解活性降低不超过5％、不超过10％或不超过15％且与亲本葡糖淀粉酶相比具有降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)的变体。
在一些实施方案中，就与亲本葡糖淀粉酶相比具有降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)而选择葡糖淀粉酶变体。
在一些实施方案中，就下述而选择葡糖淀粉酶变体：与亲本葡糖淀粉酶相比具有相同或增加的淀粉水解活性和减少的异麦芽糖合成(与亲本葡糖淀粉酶相比减少不超过5％、不超过10％或不超过15％)并从而具有降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)。
在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出提高的实际发酵度。
5.6具有改变的缩合产物形成的变体葡糖淀粉酶
在一个方面中，在相同的条件下葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量低于由黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：6)形成的缩合产物的量。在另一个方面中，在相同的条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量与由黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：6)形成的缩合产物的量基本上相同、比其高不超过5％、高不超过8％或高不超过10％。在另一个方面中，基于蛋白质浓度葡糖淀粉酶的剂量相同。在另一个方面中，基于在活性测定法中(如本文中所描述的GAU活性测定法或如本文中所描述的淀粉水解活性测定法)对活性的测量，葡糖淀粉酶的剂量相同。
6.编码葡糖淀粉酶的多核苷酸
本公开还涉及编码变体葡糖淀粉酶的分离的多核苷酸。所述多核苷酸可通过本领域中已知的确立的技术制备。可以合成方式制备所述多核苷酸，例如通过自动化DNA合成仪。DNA序列可以是通过将片段连接在一起而制备的混合的基因组(或cDNA)和合成来源的。还可利用特异性引物，通过聚合酶链反应(PCR)来制备多核苷酸。一般而言，可参考Minshull J.等人，Methods(《方法》)32(4)：416-427(2004)。还可由许多商业公司(例如德国雷根斯堡的Geneart AG公司(Geneart AG，Regensburg，Germany))来合成DNA。
本公开还提供分离的多核苷酸，其包含(i)与SEQ ID NO：4具有至少约50％的同一性，包括至少约60％、约70％、约80％、约90％、约95％和约99％，或(ii)在中等至高严格性条件下能够与源自SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的探针杂交，或(iii)与和SEQ ID NO：4所示序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列。根据本公开可使用的探针可包括SEQ ID NO：4的至少约50、约100、约150、约200、约250、约300或更多个连续的核苷酸。在一些实施方案中，所编码的多肽还与SEQ ID NO：2具有结构同一性。
本公开还提供了编码变体葡糖淀粉酶的分离的多核苷酸，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO：2具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。此外，本公开提供了包含任何上文所提供的多核苷酸的表达载体。本公开还提供了编码本文所提供的变体葡糖淀粉酶的DNA的片段(即部分)。这些片段可用于获得部分长度的DNA片段，其能够被用于从丝状真菌细胞(例如，木霉属、曲霉属、镰刀菌属、青霉属和腐质霉属)中分离或鉴别编码本文所述的成熟葡糖淀粉酶的多核苷酸或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。在一些实施方案中，DNA片段可包含至少约50、约100、约150、约200、约250、约300或更多个连续的核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4中所提供的DNA的部分可用于从其它物种(如编码葡糖淀粉酶的丝状真菌)中获得亲本葡糖淀粉酶(特别是木霉属葡糖淀粉酶同源物)。
7.葡糖淀粉酶的产生
7.1.DNA构建体和载体
根据本公开的一个实施方案，组装包含上文所述的编码本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶且与启动子序列有效连接的多核苷酸的DNA构建体来转移到宿主细胞中。在一个方面中，提供了编码本文所公开的葡糖淀粉酶变体的多核苷酸。
可使用载体将DNA构建体引入宿主细胞中。在一个方面，提供了包含所述多核苷酸或能够表达如本文所公开的葡糖淀粉酶变体的载体。所述载体可以是在引入宿主细胞时被稳定引入的任何载体。在一些实施方案中，载体整合到宿主细胞基因组中并被复制。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。在一些实施方案中，载体为包含与葡糖淀粉酶编码序列有效连接的调控序列的表达载体。
合适的表达和/或整合载体的实例在下列文献中提供：Sambrook等人(1989)(出处同上)和Ausubel(1987)(出处同上)以及van den Hondel等人(1991)，载于Bennett和Lasure(编辑)More Gene Manipulations In Fungi(《真菌中的更多基因操纵》)，学术出版社(Academic Press)，第396-428页，以及美国专利No.5,874,276。还可参考美国真菌遗传资源中心菌株目录(Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains)(FGSC，http://www.fgsc.net)的载体列表。特别有用的载体包括从例如英杰公司(Invitrogen)和普洛麦格公司(Promega)获得的载体。
适用于细菌细胞的质粒包括允许在大肠杆菌中复制的pBR322和pUC19以及例如允许在芽孢杆菌属中复制的pE194。其它适用于大肠杆菌宿主细胞的具体载体包括例如下列载体：pFB6、pBR322、pUC18、pUC100、pDONRTM201、10pDONRTM221、pENTRTM、和
适用于真菌细胞的具体载体包括pRAX(可用于曲霉属的通用表达载体)、含有glaA启动子的pRAX，以及在肉座菌属/木霉属中包括含有cbh1启动子的pTrex3g。
在一些实施方案中，在细菌或真菌宿主细胞中显示出转录活性的启动子可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。启动子可以是突变启动子、截短启动子和/或杂合启动子。上文提及的启动子是本领域中已知的。可用于真菌细胞(特别是丝状真菌细胞，如木霉属或曲霉属细胞)中的合适启动子的实例包括诸如里氏木霉启动子cbh1、cbh2、egl1、egl2、eg5、xln1和xln2之类的示例性启动子。有用的启动子的其它实例包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因(glaA)的启动子(参见Nunberg等人，Mol.Cell Biol.(《分子细胞生物学》)4：2306-2315(1984)和Boel等人，EMBO J.(《欧洲分子生物学学会杂志》)3：1581-1585(1984))、米曲霉TAKA淀粉酶启动子、来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的TPI(磷酸丙糖异构酶)启动子、来自构巢曲霉乙酰胺酶基因和米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶基因的启动子。可用于细菌细胞的合适启动子的实例包括从下列获得的那些：大肠杆菌lac操纵子；地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因(amyS)；枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、β-内酰胺酶基因以及tac启动子。在一些实施方案中，启动子是宿主细胞的天然启动子。例如，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子。在其它实施方案中，启动子是对于真菌宿主细胞为异源性的启动子。在一些实施方案中，启动子将是亲本葡糖淀粉酶的启动子(例如，TrGA启动子)。
在一些实施方案中，DNA构建体包括编码信号序列的核酸，即与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，其引导所编码的多肽进入细胞的分泌途径。核酸序列编码序列的5′末端可天然地包括信号肽编码区域，其天然地在翻译阅读框中与编码分泌性葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶编码序列的区段相连，或者核酸序列编码序列的5′末端可包括对该编码序列是外来的信号肽。在一些实施方案中，DNA构建体包括与已从中获得了变体葡糖淀粉酶的亲本葡糖淀粉酶基因天然地相关联的信号序列。在一些实施方案中，信号序列将是SEQ ID NO：1中所示的序列或者与其具有至少约90％、约94或约98％的序列同一性的序列。有效的信号序列可包括从其它丝状真菌酶获得的信号序列，如来自木霉属(里氏木霉葡糖淀粉酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶II，或分泌的蛋白酶，如天冬氨酸蛋白酶)、腐质霉属(特异腐质酶纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶，或灰腐质霉葡糖淀粉酶)或曲霉属(黑曲霉葡糖淀粉酶和米曲霉TAKA淀粉酶)。
在另外的实施方案中，包含信号序列的DNA构建体或载体和待引入宿主细胞中的启动子序列源自相同的来源。在一些实施方案中，可使用木霉属葡糖淀粉酶同源物的天然葡糖淀粉酶信号序列，如来自肉座菌属菌株的信号序列。
在一些实施方案中，表达载体还包括终止序列。在本公开中可使用在宿主细胞中有功能的任何终止序列。在一些实施方案中，终止序列和启动子序列源自相同的来源。在另一个实施方案中，终止序列是与宿主细胞同源的。有用的终止序列包括从下列获得的终止序列：里氏木霉cbl1的基因；黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(Nunberg等人(1984)(出处同上)，以及Boel等人，(1984)(出处同上))、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、米曲霉TAKA淀粉酶或构巢曲霉trpC(Punt等人，Gene(《基因》)56：117-124(1987))。
在一些实施方案中，表达载体包括可选标记。可选标记的实例包括赋予抗微生物抗性的那些(例如，潮霉素和腐草霉素)。营养性选择性标记也可用于本公开，包括本领域称为amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)和pyrG(乳清酸核苷-5′磷酸脱羧酶)的那些标记。可用于转化木霉属的载体系统中的标记是本领域中已知的(参见例如，Finkelstein，Biotechnology Of Filamentous Fungi(《丝状真菌的生物技术》)中的第6章，Finkelstein等人(1992)编辑，麻萨诸塞州波士顿的Butterworth-Heinemann出版社(Butterworth-Heinemann，Boston，MA)；Kinghom等人(1992)Applied Molecular GeneticsOf Filamentous Fungi(《丝状真菌的应用分子遗传学》)，Blackie Academic andProfessional，Chapman and Hall，伦敦；Berges和Barreau，Curr.Genet.(《当代遗传学》)19：359-365(1991)；以及van Hartingsveldt等人，Mol.Gen.Genet.(《分子和普通遗传学》)206：71-75(1987))。在一些实施方案中，选择性标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，从而允许转化的细胞以乙酰胺作为氮源生长。使用构巢曲霉amdS基因作为选择性标记描述于：Kelley等人，EMBO J.(《欧洲分子生物学学会杂志》)4：475-479(1985)以及Penttila等人，Gene(《基因》)61：155-164(1987)。
用于连接包含编码变体葡糖淀粉酶的核酸序列、启动子、终止序列和其它序列的DNA构建体的方法，以及将它们插入合适载体中的方法是本领域所熟知的。连接通常是通过在方便的限制性位点进行连接来实现的。如果不存在此类位点，则根据常规做法使用合成的寡核苷酸接头(见Sambrook等人(1989)(出处同上)以及Bennett和Lasure，More GeneManipulations InFungi(《真菌中的更多基因操纵》)，圣地亚哥的学术出版社(AcademicPress，San Diego)(1991)第70-76页)。此外，可使用已知的重组技术(例如英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies)，Gateway技术)来构建载体。
7.2.宿主细胞和宿主细胞的转化
本公开还涉及包含编码本公开的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自细菌、真菌、植物和酵母细胞。术语宿主细胞包括用于产生根据本公开的变体葡糖淀粉酶的细胞、细胞的子代和由细胞产生的原生质体。在一个方面中，公开了包含(优选转化有)载体的宿主细胞。在另一个方面中，提供了能够表达葡糖淀粉酶变体的细胞。在另一个方面中，所述宿主细胞为蛋白酶缺陷的和/或木聚糖酶缺陷的和/或葡聚糖酶缺陷的宿主细胞。蛋白酶缺陷的和/或木聚糖酶缺陷的和/或天然葡聚糖酶缺陷的的宿主细胞可通过使编码所提及的酶的基因缺失或沉默来获得。因此，含有所述GA变体的宿主细胞不表达所提及的酶。
在一些实施方案中，宿主细胞是真菌细胞以及任选丝状真菌宿主细胞。术语“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状形式(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology(《菌物学概论》)，纽约威利出版社(Wiley，New York))。这些真菌的特征在于具有由几丁质、纤维素和其它复杂多糖构成的细胞壁的营养菌丝体。本公开的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上与酵母相区别。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长，且碳分解代谢是专性好氧的。在本公开中，丝状真菌亲本细胞可以是木霉属(例如，里氏木霉、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形态，之前被归类为长枝木霉、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉、哈茨木霉)的物种但不限于这些物种的细胞(Sheir-Neirs等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物学和生物技术》)20：46-53(1984)；ATCC No.56765和ATCC No.26921)、青霉属物种、腐质霉属物种(例如特异腐质霉、疏绵状腐质霉和灰腐质霉)、金孢子菌属(Chrysosporium)物种(例如，C.lucknowense)、粘帚霉属(Gliocladium)物种、曲霉属物种(例如，米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉和泡盛曲霉)(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物学和生物技术》)39：738-743(1993)和Goedegebuur等人，Curr.Genet.(《当代遗传学》)41：89-98(2002))、镰刀菌属物种(例如，粉红镰刀菌、禾赤镰刀菌(F.graminum)、禾谷镰刀菌(F.cerealis)、尖孢镰刀菌和F.venenatum)、链孢霉属物种(粗糙链孢霉)、肉座菌属物种、毛霉菌属(Mucor)物种(米赫毛霉(M.miehei))、根霉菌属(Rhizopus)物种，和裸胞壳属(Emericella)物种(还可参见Innis等人，Science(《科学》)228：21-26(1985))。术语“木霉属”或“木霉属的物种”或“木霉属物种”是指之前或目前被归类为木霉属的任何真菌属。
在一些实施方案中，宿主细胞将是革兰氏阳性细菌细胞。非限制性的实例包括链霉菌属(例如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌属的菌株。如本文所用，“芽孢杆菌属”包括“芽孢杆菌”属中的所有种，如本领域技术人员所知的，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经认识到，芽孢杆菌属继续经历着分类学上的重构。因此，旨在该属包括被已被重新归类的种，包括但不限于诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(其现在被命名为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillustearothermophilus))之类的生物体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为革兰氏阴性细菌菌株，如大肠杆菌或假单胞菌属(Peudomonas)物种。在其它实施方案中，宿主细胞可以是酵母细胞，如酵母菌属(Saccharomyces)物种、裂殖酵母属物种、毕赤酵母菌属(Pichia)物种或假丝酵母菌属(Candida)物种。在其它实施方案中，宿主细胞将是经遗传学工程改造的宿主细胞，其中已使天然基因失活(例如通过在细菌或真菌细胞中缺失来失活)。当希望获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞时，可使用已知的方法(例如，美国专利No.5,246,853、美国专利No.5,475,101和WO 92/06209中所公开的方法)。可通过完全或部分缺失、插入失活或通过使基因对于其所欲的目的而言无功能(从而防止该基因表达有功能的蛋白)的任何其它方式而实现基因失活。在一些实施方案中，当宿主细胞为木霉属细胞(特别是里氏木霉宿主细胞)时，将使cbh1、cbh2、egl1和egl2基因失活和/或缺失。美国专利No.5,847,276和WO05/001036中示出和描述了具有四重缺失的蛋白质的示例性里氏木霉宿主细胞。在其它实施方案中，宿主细胞为蛋白酶缺陷的或无蛋白酶的株系。
将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括例如下列技术：转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染(例如，脂转染介导的和DEAE-糊精介导的转染)、用磷酸钙DNA沉淀物温育、用涂覆有DNA的微粒高速轰击以及原生质体融合。一般的转化技术是本领域中已知的(参见例如Ausubel等人(1987)(出处同上)，第9章；以及Sambrook等人(1989)(出处同上)和Campbell等人，Curr.Genet.(《当代遗传学》)16：53-56(1989))。
用于芽孢杆菌的转化方法在许多参考文献中公开，包括Anagnostopoulos C.和J.Spizizen，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)81：741-746(1961)以及WO 02/14490。
用于曲霉属的转化方法描述于如下文献中：Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)81：1470-1474(1984)；Berka等人，(1991)，载于Applications of Enzyme Biotechnology(《酶生物技术的应用》)，Kelly和Baldwin编辑，普莱南出版社(Plenum Press)(纽约)；Cao等人，Protein Sci.(《蛋白质科学》)9：991-1001(2000)；Campbell等人，Curr.Genet.(《当代遗传学》)16：53-56(1989)和EP 238023。在木霉属中表达异源蛋白质描述于如下专利和文献：美国专利No.6,022,725；美国专利No.6,268,328；Harkki等人Enzyme Microb.Technol.(《酶和微生物技术》)13：227-233(1991)；Harkki等人，BioTechnol.(《生物技术》)7：596-603(1989)；EP 244,234；EP 215,594；以及Nevalainen等人，“TheMolecular Biology of Trichoderma and its Application tothe Expression of BothHomologous and Heterologous Genes(《木霉属的分子生物学及其表达同源和异源基因的应用》)”，载于Molecular Industrial Mycology(《分子工业真菌学》)，Leong和Berka编辑，纽约马塞尔·德克尔公司(Marcel DekkerInc.，NY)(1992)第129-148页)。对于镰刀菌属菌株的转化，还可参考W096/00787和Bajar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)88：8202-8212(1991)。
在一个具体的实施方案中，用于转化而制备木霉属物种涉及由真菌菌丝体制备原生质体(参见Campbell等人，Curr.Genet.(《当代遗传学》)16：53-56(1989)；Pentilla等人，Gene(《基因》)61：155-164(1987))。根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的对丝状真菌的转化是已知的(参见de Groot等人，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)16：839-842(1998))。对于以丝状真菌宿主进行的转化程序，还可参考美国专利No.6,022,725和美国专利No.6,268,328。
在一些实施方案中，用载体系统构建遗传上稳定的转化体，凭借所述载体系统编码变体葡糖淀粉酶的核酸被稳定整合进宿主菌株染色体中。然后通过已知的技术纯化转化体。
在一些其它实施方案中，宿主细胞为植物细胞，如来自单子叶植物(例如玉米、小麦和高粱)的细胞或来自双子叶植物(例如大豆)的细胞。用于制备可用于转化植物的DNA构建体的方法以及用于植物转化的方法是已知的。这些方法中的一些包括根癌土壤杆菌介导的基因转移、微粒轰击、PEG介导的原生质体转化、电穿孔等。可参考美国专利No.6,803,499、美国专利No.6,777,589；Fromm等人，BioTechnol.(《生物技术》)8：833-839(1990)；Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.(《分子和普通遗传学》)199：169-177(1985)。
7.3.葡糖淀粉酶的产生
本公开还涉及用于产生变体葡糖淀粉酶的方法，其包括用包含编码根据本公开的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，在适于表达和产生所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养所述宿主细胞，以及任选回收所述变体葡糖淀粉酶。在一个方面中，提供了表达根据本公开的变体葡糖淀粉酶的方法，所述方法包括获得如本文所公开的宿主细胞或细胞，并从所述细胞或宿主细胞表达所述葡糖淀粉酶变体，以及任选纯化所述葡糖淀粉酶变体。在一个方面中，将所述葡糖淀粉酶变体进行纯化。
在本公开的表达和产生方法中，使用含有生理盐和营养物的合适培养基，在合适的条件下在实验室或工业发酵罐中以摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵和补料分批发酵)来培养所述宿主细胞(参见例如Pourquie，J.等人，BiochemistryAnd Genetics Of Cellulose Degradation(《纤维素降解的生物化学和遗传学》)，Aubert，J.P.等人编辑，学术出版社(Academic Press)，第71-86页，1988以及Ilmen，M.等人，Appl.Environ.Microbiol.(《应用和环境微生物学》)63：1298-1306(1997))。普通的商业制备的培养基(例如，酵母麦芽提取物(YM)肉汤、Luria Bertani(LB)肉汤和沙氏葡萄糖(SD)肉汤)可用于本公开中。用于细菌和丝状真菌细胞的培养条件是本领域中已知的并且可在科学文献中找到和/或可从真菌来源(例如美国典型培养物保藏中心和美国真菌遗传资源中心)获得。在葡糖淀粉酶编码序列处于诱导型启动子的控制下的情形中，以可有效诱导葡糖淀粉酶表达的浓度将诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)加入培养基中。
在一些实施方案中，本公开涉及在植物宿主中产生变体葡糖淀粉酶的方法，所述方法包括用包含编码根据本公开的葡糖淀粉酶变体的多核苷酸的载体转化植物细胞以及在适于所述变体表达和产生的条件下培养所述植物细胞。
在一些实施方案中，进行测定法来评价已用编码本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸转化的细胞系对所述变体葡糖淀粉酶的表达。可在蛋白质水平、RNA水平和/或通过使用特定于葡糖淀粉酶活性和/或产生的功能性生物测定法来进行测定法。这些测定法中的一些包括RNA印迹法、斑点印迹法(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)、使用经恰当标记的探针(基于核酸编码序列)进行的原位杂交和常规的DNA印迹法以及放射自显影术。
此外，可在样品中直接测量变体葡糖淀粉酶的产生和/或表达，例如通过直接测量培养基中的还原糖(例如葡萄糖)的测定法以及通过用于测量葡糖淀粉酶活性、表达和/或产生的测定法直接测量。具体地讲，可通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)法(见Goto等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.(《生物科学-生物技术和生物化学》)58：49-54(1994))来测定葡糖淀粉酶活性。在另外的实施方案中，通过免疫学方法(如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或组织培养基的免疫测定法(例如通过蛋白质印迹或ELISA))来评价蛋白质表达。此类免疫测定法可用于定性和定量地评价葡糖淀粉酶的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的并且用于实施此类方法的许多试剂都是可商业获得的。
可通过本领域中已知的多种程序(包括离心、过滤、提取、沉淀等)从培养基回收或纯化本公开的葡糖淀粉酶。
8.组合物和用途
在一个方面中，提供了本文所述的葡糖淀粉酶变体用于制备酶组合物的用途。
本公开的变体葡糖淀粉酶可用于酶组合物中，包括但不限于淀粉水解和糖化组合物、清洁和洗涤剂组合物(例如衣物洗涤剂、盘碟清洗剂和硬表面清洁组合物)、醇发酵组合物，和动物饲料组合物。此外，变体葡糖淀粉酶可用于例如酿造、保健、纺织物、环境废物转化处理、生物制浆处理和生物质转化应用。本公开的变体葡糖淀粉酶可用于酶组合物中，包括淀粉水解组合物、糖化组合物、洗涤剂、醇发酵酶组合物和动物饲料。在一个方面中，所述组合物是淀粉水解组合物。
在一些实施方案中，包含本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶的酶组合物将任选与下列酶中的任一者或其组合相结合使用：α-淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精葡糖转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、木聚糖酶、颗粒淀粉水解酶和其它葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，包含本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶的酶组合物将任选与下列酶中的任一者或其组合相结合使用：淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶和其它葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，包含本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶的酶组合物将任选与下列酶中的任一者或其组合相结合使用：淀粉酶、支链淀粉酶和其它葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，包含本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶的酶组合物将任选与下列酶中的任一者或其组合相结合使用：淀粉酶和支链淀粉酶。在另一个方面中，所述淀粉酶为α-淀粉酶和/或异淀粉酶。在另一个方面中，葡聚糖酶是外切葡聚糖酶和/或内切葡聚糖酶。
在一些实施方案中，酶组合物将包括α-淀粉酶，如真菌α-淀粉酶(例如曲霉属物种)或细菌α-淀粉酶(例如芽孢杆菌属物种，如嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)及其变体和杂合体。在本文中，α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)可催化寡糖和多糖中的(1-＞4)-α-D-糖苷键的内水解。α-淀粉酶以随机的方式作用于淀粉、糖原及相关的多糖和寡糖；还原基团以α构型释放。在一些实施方案中，α-淀粉酶是酸稳定性α-淀粉酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶是白曲霉α-淀粉酶(AkAA)，见美国专利No.7,037,704。考虑用于本公开的组合物中的其他α-淀粉酶包括但不限于细菌α-淀粉酶例如如Gray等人(1986)(Gray GL，Mainzer SE，Rey MW，Lamsa MH，Kindle KL，Carmona C和Requadt C“Structural genesencoding the thermophilic alpha-amylases of Bacillus stearothermophilus andBacillus licheniformis(《编码嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的嗜热α-淀粉酶的结构基因》)”Journalof Bacteriology(《细菌学杂志》)(1986)166(2)第635-643页)所述的来自枯草芽孢杆菌(AmyE)和地衣芽孢杆菌(AmyL)以及嗜热脂肪地芽孢杆菌(AmyS)的那些连同上述的变体和组合(包括变体的组合)。AmyE、AmyL和AmyS的变体是众所周知的，实例描述于：美国专利申请20100015686A1(“Variant Alpha-Amylases from Bacillus subtilisand Methods of Uses，Thereof(来自枯草芽孢杆菌的变体α-淀粉酶及其使用方法)”)、美国专利申请20090314286A1(“Geobacillus stearothermophilus Alpha-Amylase(AmyS)Variants with Improved Properties(具有改善特性的嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)变体)”)、WO/2006/066594)(“Alpha-AmylaseVariants(α-淀粉酶变体)”)、US20090238923A1(“Variants Of BacillusLicheniformis Alpha-Amylase With IncreasedThermostability And/Or DecreasedCalcium Dependence(具有增加的热稳定性和/或降低的钙依赖性的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体)”)。考虑用于本公开的组合物中的市售α-淀粉酶是已知的，包括GZYME G997、 和(美国丹尼斯科公司，杰能科分公司)、知(诺维信公司(Novozymes，A/S))。
在一些实施方案中，酶组合物将包括支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)。在一个方面中，本文中使用的支链淀粉酶是来自例如热球菌属或芽孢杆菌属物种，如嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(例如FEMS Microbiol.Letters(《FEMS微生物学通讯》)115：97-106中所述的嗜酸普鲁兰芽胞杆菌)或Bacillus deramificans或长野芽孢杆菌(Bacillus naganoencis)的支链淀粉酶。在一个方面中，支链淀粉酶是如下文献中描述的嗜酸普鲁兰芽胞杆菌PulB酶：Kelly等人，FEMS Microbiology Letters(《FEMS微生物学通讯》)115(1994)97-106。支链淀粉酶还可以是来自例如芽孢杆菌属菌株的经工程改造的支链淀粉酶。优选可用于根据本发明的工艺的其他支链淀粉酶包括：Bacillus deramificans(美国专利No.5,736,375)，或支链淀粉酶可源于PCT/DK91/00219中描述的沃氏热球菌(Pyrococcus woesei)，或者支链淀粉酶可源于PCT/DK92/00079中所述的闪烁杆菌属(Fervidobacterium)物种Ven 5，或者支链淀粉酶可源于PCT/DK95/00097中所述的速生热球菌(Thermococcus celer)，或者支链淀粉酶可源于PCT/DK95/00211中所述的Pyrodictium abyssei，或者支链淀粉酶可源于PCT/DK95/00095中所述的嗜热厌氧菌闪烁杆菌(Fervidobacterium pennavorans)，或者支链淀粉酶可源于PCT/DK95/00098中所述的粘硫还原球菌(Desulforococcus mucosus)。支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)还可源自但不限于克雷白杆菌属(Klebsiella)(产气杆菌属(Aerobacter))物种(PulA)；例如植物克雷白杆菌(Klebsiella planticola)、产气克雷白杆菌(Kebsiella aerogenes)(产气杆菌(Aerobacter aerogenes))和肺炎克雷白菌(Kebsiella pneumoniae)(参见：Katsuragi等人，Journal ofBacteriology(《细菌学杂志》)(1987)169(5)第2301-2306页；Fouts等人，PLoS Genetics(《PLoS遗传学》)(2008)4(7)，E1000141)。这些支链淀粉酶以及来自例如嗜酸普鲁兰芽胞杆菌的那些是糖苷水解酶家族13的成员。在一些实施方案中，酶组合物将包括酸性真菌蛋白酶。在另外的实施方案中，所述酸性真菌蛋白酶源自木霉属物种并且可以是美国专利No.7,563,607(公开为US 2006/0154353，2006年7月13日)中所公开的蛋白酶中的任一者，将所述美国专利以引用的方式并入本文。在其它实施方案中，酶组合物将包括来自布丘氏菌属(Buttiauxiella)物种的植酸酶(例如，BP-17，还可参见PCT专利公布WO2006/043178中公开的变体)。
在其它实施方案中，本公开的变体葡糖淀粉酶可与其它葡糖淀粉酶组合。在一些实施方案中，本公开的葡糖淀粉酶将与一种或多种下列葡糖淀粉酶相组合：源自曲霉属的菌株(如米曲霉、黑曲霉、白曲霉和泡盛曲霉)的葡糖淀粉酶或其变体；源自腐质霉属菌株(特别是源自灰腐质霉)的葡糖淀粉酶或其变体，如与WO 05/052148中所公开的SEQ ID NO：3具有至少约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的葡糖淀粉酶；源自篮状菌属菌株(特别是埃默森篮状菌)的葡糖淀粉酶或其变体；源自阿太菌属(Athelia)的菌株(特别是罗耳阿太菌(A.rolfsii))的葡糖淀粉酶；源自青霉属的菌株(特别是产黄青霉)的葡糖淀粉酶。
具体地讲，变体葡糖淀粉酶可用于淀粉转化工艺，特别是可用于果糖糖浆、特种糖的葡萄糖的生产中，以及用于由含淀粉底物发酵而产生醇和其它终产物(例如有机酸、抗坏血酸和氨基酸)(G.M.A.van Beynum等人编辑(1985)Starch Conversion Technology(《淀粉转化技术》)，纽约马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker Inc.NY))。用本公开的变体葡糖淀粉酶组合物生产的糊精可导致至少80％、至少85％、至少90％和至少95％的葡萄糖产率。用本公开所涵盖的葡糖淀粉酶由淀粉底物发酵产生乙醇可包括产生燃料醇或可饮用的醇。在一些实施方案中，当在与亲本葡糖淀粉酶相同的条件下使用变体葡糖淀粉酶时，醇的生成将较多。在一些实施方案中，与亲本葡糖淀粉酶相比醇的生成将好约0.5％至2.5％，包括但不限于多约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％和约2.4％的醇。
在一些实施方案中，本公开的变体葡糖淀粉酶将可用于淀粉水解，所述淀粉来自用于醇生产的多种基于植物的底物。在一些实施方案中，所述基于植物的底物将包括玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、稻、甘蔗、马铃薯以及它们的组合。在一些实施方案中，所述基于植物的底物将为分级的植物材料，例如被分级为诸如纤维、胚、蛋白质和淀粉(胚乳)之类的组分的谷物(如玉米)(美国专利No.6,254,914和美国专利No.6,899,910)。醇发酵的方法描述于如下文献中：The Alcohol Textbook，K.A.Jacques等人编辑，2003，英国诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press，UK)。
在某些实施方案中，所述醇将为乙醇。特别地，醇发酵生产工艺表征为湿磨或干磨工艺。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶将用于湿磨发酵工艺中而在其它实施方案中，变体葡糖淀粉酶将可用于干磨工艺中。
干谷物研磨涉及多个基本步骤，其通常包括：碾磨、蒸煮、液化、糖化、发酵和将液体与固体分离以产生醇和其它副产物。对植物材料，特别是全谷物，如玉米、小麦或黑麦进行碾磨。在一些情形中，可将谷物首先分级为组成部分。可研磨经碾磨的植物材料以获得粗颗粒或细颗粒。将经碾磨的植物材料与液体(例如，水和/或酒糟水)在浆料槽中相混合。使浆料在喷射式蒸煮锅中与液化酶(例如，α-淀粉酶)一起经受高温(例如，约90℃至约105℃或更高)以将谷物中的淀粉溶解并水解为糊精。使混合物冷却并用糖化酶(例如本公开所涵盖的葡糖淀粉酶)进一步处理，以产生葡萄糖。然后，可在发酵微生物(如产乙醇微生物，特别是酵母(酵母菌属物种))的存在下，使含有葡萄糖的醪液发酵大约24至120小时。将醪液中的固体与液相分离，获得醇(如乙醇)和有用的副产物(如酒糟)。
在一些实施方案中，将糖化步骤与发酵步骤相结合，该工艺称为同时糖化和发酵或同时糖化、酵母增殖和发酵。
在其它实施方案中，变体葡糖淀粉酶用于淀粉水解工艺中，其中该工艺的温度为约30℃至约75℃，在一些实施方案中，为约40℃至约65℃。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶用于淀粉水解工艺中，其中pH为约3.0至约6.5。一些实施方案中的发酵工艺包括研磨谷物或对谷物进行分级，以及将经碾磨的谷物与液体合并以形成浆料，然后在单个容器中将浆料与根据本公开的变体葡糖淀粉酶和任选其它的酶以及酵母相混合以产生乙醇和其它副产物(见例如，美国专利No.4,514,496、WO 04/081193和WO04/080923)，所述其它的酶为例如但不限于α-淀粉酶、其它葡糖淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶或具有颗粒状淀粉水解活性的其它酶。
在一些实施方案中，本公开涉及糖化液体淀粉溶液的方法，该方法包括使用本公开的变体葡糖淀粉酶的酶促糖化步骤。可通过将淀粉溶解在水或水性缓冲液中，以及任选加热以使淀粉糊化而产生液体淀粉溶液。可应用通过淀粉酶来进一步部分降解淀粉。
本发明提供使用本发明的葡糖淀粉酶变体来从淀粉产生葡萄糖等的方法。通常，该方法包括下列步骤：在α-淀粉酶的存在下部分水解前体淀粉，然后在葡糖淀粉酶的存在下通过裂解α-(1-4)和α-(1-6)糖苷键而进一步水解，从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原末端释放D-葡萄糖。利用α-淀粉酶对前体淀粉进行部分水解可通过水解内部α-(1-4)-键而提供淀粉分子的初始降解。在商业应用中，使用α-淀粉酶的初始水解在大约105℃的温度下进行。处理非常高的淀粉浓度，通常为30％至40％的固形物。在此高温下，初始水解通常进行五分钟。然后将经部分水解的淀粉转移到第二个槽中并在85℃至90℃的温度下温育大约一小时以获得10至15的葡糖当量(D.E)。在葡糖淀粉酶的存在下进一步水解，从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原末端释放D-葡萄糖的步骤通常是在30℃至60℃的低温下在单独的槽中进行。通常，底物液体的温度降至55℃至60℃。溶液的pH从6至6.5降到3至5.5的范围。通常，溶液的pH为4至4.5。将葡糖淀粉酶加入该溶液中并使反应进行24-72小时，如36-48小时。
其中可使用本发明的葡糖淀粉酶变体的糖化工艺的实例包括JP3-224493、JP 1-191693、JP 62-272987和EP 452,238中所描述的工艺。本文所描述的葡糖淀粉酶变体可与仅水解具有至少四个葡萄糖基残基的分子中的α-(1-6)-糖苷键的酶联合使用。优选地，葡糖淀粉酶变体可与支链淀粉酶或α-淀粉酶联合使用。α-淀粉酶和支链淀粉酶用于脱支的用途、酶的分子特性和所述酶与葡糖淀粉酶的潜在应用在如下文献中示出：G.M.A.vanBeynum等人，Starch Conversion Technology(《淀粉转化技术》)，纽约马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，New York)，1985，101-142。
在一个实施方案中，提供了本文所描述的葡糖淀粉酶变体用于淀粉转化工艺(如在连续糖化步骤中)的用途。本文中所述的葡糖淀粉酶变体还可以固定化的形式使用。这适于并通常用于生产麦芽糊精或葡萄糖糖浆或特种糖浆(例如麦芽糖糖浆)并且还用于与果糖糖浆的生产相关联的寡糖残液流。
当所需的最终糖产物为例如高果糖糖浆时，葡萄糖糖浆可转化为果糖。糖化工艺之后，将pH增加至6-8范围内的值，如pH 7.5，并通过离子交换来除去钙。然后，使用例如固定化的葡萄糖异构酶(如SweetzymeTMIT)将葡萄糖糖浆转化为高果糖糖浆。
在其它实施方案中，变体葡糖淀粉酶用于啤酒酿造工艺中。酿造工艺是本领域中熟知的，通常涉及下列步骤：制麦芽、淀粉糖化和发酵。淀粉糖化是将来自经研磨的大麦麦芽和固体添加物的淀粉转化为可发酵的和不可发酵的糖以产生麦芽汁的过程。传统的淀粉糖化涉及在设定的温度和体积下，将经研磨的大麦麦芽和添加物与水混合以继续在制麦芽过程中起始的生物化学变化。在多种温度下，在一段时间中进行淀粉糖化工艺，以活化促成蛋白质和碳水化合物的降解的内源性酶。淀粉糖化后，将麦芽汁与固体(谷糟)分离。在麦芽汁分离之后，可用酿酒酵母使麦芽汁发酵以产生啤酒。可通过加入外源性酶(如特别是葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶、β-淀粉酶和支链淀粉酶)而进一步水解在淀粉糖化工艺中形成的短分支葡萄糖寡聚物。可就这样使用麦芽汁或这可将其浓缩和/或干燥。浓缩和/或干燥的麦芽汁可作为酿造提取物、作为麦芽提取物调味剂而用于非含醇麦芽饮料、麦芽醋、早餐谷物，用于糖果等。将麦芽汁发酵以产生含醇的饮料，通常是啤酒，例如，爱尔啤酒、烈性爱尔啤酒、苦啤酒、烈性啤酒、波特啤酒、拉格啤酒、出口啤酒、麦芽酒、大麦酒、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒或轻啤酒。在另一个典型实施方案中，将麦芽汁发酵以生产可饮用的乙醇。
在一些实施方案中，本公开涉及水解和糖化待用于酿造的糊化和液化(通常是液化)的谷粉淀粉的方法，其中将包含一种或多种如本文中所考虑的葡糖淀粉酶的酶组合物用于增加从淀粉获得的酿酒酵母可发酵糖的量。将酿造工艺用于生产可饮用的产品啤酒，其中通过用酿酒酵母发酵而使可发酵糖转化为乙醇和CO2。传统上可发酵糖源自谷物中的淀粉，该淀粉任选补充有诸如葡萄糖和麦芽糖糖浆以及蔗糖之类的可发酵糖源。简而言之，本领域所熟知的啤酒生产通常包括下列步骤：制麦芽、淀粉糖化和发酵。
历史上，啤酒生产的第一步是制麦芽-谷物(例如大麦)的浸渍、萌发和干燥。在制麦芽过程中，在谷物(例如大麦)去壳谷粒的萌发中产生酶并且其化学组成中有某些改变(称为修饰)，包括淀粉、蛋白质和β-葡聚糖的某些降解。
研磨发芽的谷物以提供谷粉，可将谷粉与经研磨的添加物(例如非萌发的谷物)混合以提供混合的谷粉。将该谷粉与水混合并使其经受淀粉糖化；可向醪液添加之前蒸煮(糊化和液化)过的添加物。在多种温度下在一段时间中进行淀粉糖化工艺，以水解谷物蛋白质、降解β-葡聚糖并溶解和水解淀粉。在传统的淀粉糖化中，对麦芽和添加物中谷粉淀粉的水解是由发芽大麦内源性的两种主要的酶催化的。α-淀粉酶随机裂解淀粉分子内部的α-1，4键而将其片段化为更小的糊精。β-淀粉酶从这些糊精的非还原末端顺次裂解α-1，4键，从而主要产生麦芽糖。α-和β-淀粉酶二者都不能水解α-1，6键(其形成淀粉分子中淀粉链的分支点)，这导致极限糊精在醪液中积聚。麦芽确实含有酶，即极限糊精酶，其催化α-1，6键的水解但由于其不耐热性，其在淀粉糖化温度下仅显示出弱的活性。在淀粉糖化后，将液体提取物(麦芽汁)与谷糟固体(即形成谷粉的部分的不可溶谷物和壳材料)分离。麦芽汁分离的目的包括：·获得良好的提取物回收率，·获得良好的滤过率，以及·产生澄清的麦芽汁。麦芽汁的提取回收率和过滤性在酿造工艺的经济性方面是重要的。
麦芽汁的组成取决于原材料、淀粉糖化工艺和特征以及其它变量。典型的麦芽汁包含65-80％的可发酵糖(葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖)，以及20-35％的非可发酵极限糊精(具有比麦芽三糖更高的聚合度的糖)。当以高水平的附加的未出芽谷物酿造时，可引起淀粉糖化工艺中淀粉水解酶的不足。因此需要外源性酶来源，所述外源性酶能够在淀粉糖化的过程中产生可发酵的糖。此外，也需要此类外源性酶以降低麦芽汁中非可发酵糖的水平，伴有可发酵糖的相应增加，以酿造具有低碳水化合物含量的高度稀释的啤酒。本文中公开的是用于淀粉水解的酶组合物，其包含至少一种本文中所考虑的葡糖淀粉酶，可将其加入醪液中或用于酿造工艺的淀粉糖化步骤中，以便裂解淀粉谷粉中的α-1，4键和/或α-1，6键并从而增加麦芽汁中的可发酵糖含量和减少成品啤酒中的非可发酵糖残余。此外，可干燥(通过例如喷雾干燥)或浓缩(例如煮沸和蒸发)如此制备的麦芽汁以提供糖浆或粉末。
如本文中所考虑的谷粉可包含任何含淀粉和/或糖的植物材料，所述植物材料可源自任何植物和植物部分，包括根茎、根、茎、叶和种子。通常谷粉包含谷物，如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、蜀黍、粟和高粱的谷物，并且更优选至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％，如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(w/w)的麦芽汁的谷粉源自谷物。最优选地，所述谷粉包含发芽的谷物，如大麦麦芽。优选地，至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％(如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(w/w))的麦芽汁的谷粉源自发芽的谷物。优选地，所述谷粉包含添加物，如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、蜀黍、粟和高粱的未出芽谷物，更优选地，至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％(如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(w/w))的所述麦芽汁的谷粉源自未出芽谷物或其它添加物。可在本发明的淀粉糖化工艺之前、期间或之后将包含可容易发酵的碳水化合物(如糖或糖浆)的添加物加入麦芽醪液，但优选在淀粉糖化工艺之后加入。在加入到醪液中之前，可用α-淀粉酶，和/或内切肽酶(蛋白酶)和/或内切葡聚糖酶处理添加物的一部分，和/或对其进行热处理。本文中所考虑的酶组合物可包括额外的酶，优选选自下列的酶：α-淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶(如外切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶)、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶和葡糖淀粉酶。在淀粉糖化的过程中，将从谷粉中提取的淀粉逐渐水解为可发酵糖和更小的糊精。优选地，在麦芽汁分离之前，醪液对于碘测试是淀粉阴性的。
在一个方面中，支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)酶活性以外源方式提供且存在于醪液中。可在形成醪液之前、期间或之后将支链淀粉酶添加至醪液成分，例如水和/或谷粉。
在另一个方面中，α-淀粉酶酶活性以外源方式提供且存在于醪液中。可在形成醪液之前、期间或之后将α-淀粉酶酶添加至醪液成分，例如水和/或谷粉。
在一另外的方面，支链淀粉酶和α-淀粉酶活性二者以外源方式提供且存在于醪液中。可在形成醪液之前、期间或之后将α-淀粉酶酶和支链淀粉酶添加至醪液成分，例如水和/或谷粉。
可将另外的酶添加至醪液中，所述酶选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶、植酸酶和另外的葡糖淀粉酶。
在酿造工艺的第三步(发酵)之前，通常将麦芽汁转移到酿造罐中并剧烈煮沸50-60分钟。在麦芽汁沸腾过程中发生多个重要的过程(进一步的信息可见于柏林酿造学院(Research and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB))的Wolfgang Kunze所著的“Technology Brewing and Malting(《酿造和制麦技术》)”，第三次更新版，2004，ISBN3-921690-49-8)，包括内源性麦芽酶和加入到醪液或添加物中的任何外源性酶的失活。然后冷却煮沸的麦芽汁，用酿酒酵母接种并在通常为8-16℃范围内的温度下发酵以将可发酵糖转化为乙醇。可通过用于选择性除去醇的真空蒸发过程而从最终的啤酒产生低醇啤酒。
在备选的实施方案中，本公开涉及使用包含一种或多种本文所考虑的葡糖淀粉酶(例如不耐热的葡糖淀粉酶)的酶组合物来提高麦芽汁中可发酵糖的量的方法，其中在麦芽汁煮沸后将所述酶组合物加入麦芽汁中，从而所述一种或多种葡糖淀粉酶在发酵步骤中是有活性的。可在用酿酒酵母接种麦芽汁之前、与之同时或在之后将酶组合物加入煮沸的麦芽汁中。在发酵和成熟步骤的最后，将啤酒(其可任选经受真空蒸发以产生低醇啤酒)进行巴氏灭菌。该方法的内在优势在于发酵过程的持续时间为约6-15天(取决于接种率、发酵、温度等)，与短的淀粉糖化步骤(2-4小时的持续时间)相比，这使得有更多的时间来对非可发酵糖进行酶促裂解。该方法的另外的优势在于实现所期望的非可发酵糖减少(和可发酵糖增加)所需的酶组合物的量，与实现非可发酵糖的类似减少而将需要向醪液中加入的相比，其对应于显著更低数目的酶活性单位(例如葡糖淀粉酶活性单位)。此外，其消除了当在醪液中加入高剂量率的葡糖淀粉酶时，在麦芽汁分离(特别是通过过滤)过程中通常所见的困难。
在一个方面中，本公开涉及酶组合物，该酶组合物包含至少一种选自以下的额外的酶：淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶、植酸酶和另外的葡糖淀粉酶。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，其中所述酶组合物包含至少一种额外的选自α-淀粉酶和/或支链淀粉酶的酶。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，其中所述酶组合物还包含α-淀粉酶和支链淀粉酶。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含低于1、低于0.8、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.2、低于0.125、低于0.1、低于0.05、低于0.01或低于0.005XU的木聚糖酶活性。如果需要，可通过本领域技术人员已知的不同方法减少木聚糖酶活性，例如加热处理、通过麦麸或可选择性吸附木聚糖酶活性的其他材料。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每克所述组合物包含低于400、低于200、低于50、低于20或低于2XU的木聚糖酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.1-20、0.1-10、0.1-5或0.2-3SSU的α-淀粉酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.30-10、1-8、3-10或5-9PU的支链淀粉酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.95-20SSU的α-淀粉酶活性且每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.30-10PU的支链淀粉酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.95-20SSU的α-淀粉酶活性且每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.30-10PU的支链淀粉酶活性以及每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含低于1、低于0.8、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.2、低于0.125、低于0.1、低于0.05、低于0.01或低于0.005XU的木聚糖酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.05-10、0.1-10、0.1-8、0.1-5、0.1-3、0.2-3、0.2-2PU的支链淀粉酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.1-20、1-15、2-10、3-10SSU的α-淀粉酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.05-10PU的支链淀粉酶活性且每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.1-20SSU的α-淀粉酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀-粉酶变体包含0.1-5PU的α-淀粉酶活性且每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶-变体包含1-15SSU的支链淀粉酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.2-2PU的支链淀粉酶活性且每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含2-10SSU的α-淀粉酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.05-10PU的支链淀粉酶活性且每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.1-20SSU的α-淀粉酶活性以及每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含低于1、低于0.8、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.2、低于0.125、低于0.1、低于0.05、低于0.01或低于0.005XU的木聚糖酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.1-5PU的支链淀粉酶活性且每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含1-15SSU的α-淀粉酶活性以及每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含低于1、低于0.8、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.2、低于0.125、低于0.1、低于0.05、低于0.01或低于0.005XU的木聚糖酶活性。
在一另外的方面，本公开涉及酶组合物，所述酶组合物每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含0.2-2PU的支链淀粉酶活性且每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含2-10SSU的α-淀粉酶活性以及每GAU如本文所述的葡糖淀粉酶变体包含低于1、低于0.8、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.2、低于0.125、低于0.1、低于0.05、低于0.01或低于0.005XU的木聚糖酶活性。
在一个方面中，以500-20000GAU/kg谷粉的量添加如本文所述的葡糖淀粉酶变体。在另一个方面中，以750-10000GAU/kg谷粉的量添加如本文所述的葡糖淀粉酶变体。在一另外的方面，以1000-7500GAU/kg谷粉的量添加如本文所述的葡糖淀粉酶变体。
本公开还提供动物饲料组合物或制剂，所述动物饲料组合物或制剂包含至少一种本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶。WO 03/049550(以引用的方式全文并入本文)中提供了在制备包含淀粉的饲料中使用葡糖淀粉酶的方法。简而言之，将葡糖淀粉酶变体与包含淀粉的饲料混合。所述葡糖淀粉酶能够降解抗性淀粉以用于动物使用。在一些实施例中，将如本文所述的葡糖淀粉酶变体用于产生基于淀粉原料的燃料的方法中。根据本说明书，本公开的其他目标和优势将显而易见。
根据本发明的另外的实施方案：
实施方案1.葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体相对于具有SEQ ID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ ID NO：2氨基酸序列位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQ IDNO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，包含两个或更多个氨基酸置换。
实施方案2.葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体在处于其晶体形式时，具有的晶体结构的主链原子的原子坐标与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218中的表20中所定义的)在等价主链原子比对后具有小于0.13nm的均方根偏差，并且所述葡糖淀粉酶变体具有连接区、淀粉结合结构域和催化结构域，相对于亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列所述变体在淀粉结合结构域的互联环2′中，和/或在催化结构域的环1中和/或螺旋2中和/或环11中和/或螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。
实施方案3.根据实施方案1-2中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是相对于具有SEQ ID NO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′，和/或具有SEQ ID NO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1，和/或具有SEQ IDNO：2位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11，和/或具有SEQ ID NO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12而言。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环1和/或螺旋2和/或环11和/或螺旋12中的至少一个氨基酸置换。
实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的1、2、3或4个氨基酸置换和环1和/或螺旋2和/或环11和/或螺旋12中的1、2、3或4个氨基酸置换。
实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环1中的至少一个氨基酸置换。
实施方案7.根据实施方案1-6中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的至少一个氨基酸置换和螺旋2中的至少一个氨基酸置换。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环11中的至少一个氨基酸置换。
实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的至少一个氨基酸置换和螺旋12中的至少一个氨基酸置换。
实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是互联环2′中的至少一个氨基酸置换和环1中的至少一个氨基酸置换以及螺旋2中的至少一个氨基酸置换。
实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体在互联环2′的位置520-543、530-543或534-543中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体在环1位置30-50、35-48或40-46的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体在螺旋2位置50-66、55-64或58-63的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案14.根据实施方案1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体在环11位置405-420、410-420或415-420的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案15.根据实施方案1-14中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体在螺旋12位置421-434、425-434或428-434的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案16.根据实施方案1-15中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性。
实施方案17.根据实施方案1-16中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性。
实施方案18.根据实施方案1-17中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、11、385、386、387、388、389或390的淀粉结合结构域具有至少96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的淀粉结合结构域。
实施方案19.根据实施方案1-18中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9的催化结构域具有至少80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的催化结构域。
实施方案20.根据实施方案1-19中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性。
实施方案21.根据实施方案1-20中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述缩合产物为异麦芽糖。
实施方案22.根据实施方案1-21中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述淀粉的水解是在酿造工艺中。
实施方案23.根据实施方案1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出可发酵糖的生成提高。
实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出酿造工艺的淀粉糖化步骤中可发酵糖的生成提高。
实施方案25.根据实施方案1-24中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖的生成提高。
实施方案26.根据实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述可发酵糖为葡萄糖。
实施方案27.根据实施方案1-26中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述淀粉的水解是在生产葡萄糖糖浆的工艺中。
实施方案28.根据实施方案1-27中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出减少的异麦芽糖合成(IS)与淀粉水解活性(SH)之比。
实施方案29.根据实施方案1-28中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出降低的淀粉水解活性，其降低不超过5％、不超过10％或不超过15％。
实施方案30.根据实施方案1-29中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出提高的实际发酵度。
实施方案31.根据实施方案1-30中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中在相当条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量低于黑曲霉葡糖淀粉酶(AnGA)(SEQ IDNO：6)形成的缩合产物的量。
实施方案32.根据实施方案1-31中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中在相当条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量与黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：6)形成的缩合产物的量基本上相同、比其高不超过5％、高不超过8％或高不超过10％。
实施方案33.根据实施方案31-32中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中基于蛋白质浓度，所述葡糖淀粉酶剂量是相同的。
实施方案34.根据实施方案31-33中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中基于活性测定法中的活性测量，所述葡糖淀粉酶的剂量是相同的。
实施方案35.根据实施方案1-34中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，所述葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换和选自位置44、61、417和431的位置中的一个或多个氨基酸置换，所述位置对应于SEQ IDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案36.根据实施方案1-35中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，所述葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换以及a)位置44的氨基酸置换和/或b)位置417和431二者的氨基酸置换，所述位置对应于SEQ IDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案37.根据实施方案1-36中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，所述葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换和位置44的氨基酸置换，所述位置对应于SEQ IDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案38.根据实施方案1-37中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，所述葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换以及位置417和431的氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案39.根据实施方案1-38中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，所述葡糖淀粉酶变体具有位置539的氨基酸置换以及位置44和61的氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案40.根据实施方案1-39中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，所述葡糖淀粉酶变体在位置43具有氨基酸置换，所述位置对应于SEQID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案41.根据实施方案1-40中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，所述葡糖淀粉酶变体在位置61具有氨基酸置换，所述位置对应于SEQID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案42.根据实施方案1-41中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中位置539的氨基酸置换是539R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案43.根据实施方案1-42中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中位置44的氨基酸置换是44R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案44.根据实施方案1-43中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中位置417的氨基酸置换是417R/V，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案45.根据实施方案1-44中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中位置417的氨基酸置换是417R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案46.根据实施方案1-45中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中位置417的氨基酸置换是417V，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案47.根据实施方案1-46中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中位置431的氨基酸置换是431L，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案48.根据实施方案1-47中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中位置43的氨基酸置换是43R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案49.根据实施方案1-48中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途，其中位置61的氨基酸置换是61I，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案50.实施方案1-49中任一项中所限定的葡糖淀粉酶变体。
实施方案51.一种包含两个或更多个氨基酸置换的葡糖淀粉酶变体，其中一个氨基酸置换在位置539且一个氨基酸置换在位置44，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，并且所述序列与亲本葡糖淀粉酶序列具有至少80％的序列同一性，其中位置44的氨基酸置换不是44C。
实施方案52.根据实施方案51所述的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体包含两个或更多个氨基酸置换，其中一个氨基酸置换在位置539且一个氨基酸置换为44R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案53.根据实施方案51-52中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其在位置61包含氨基酸置换，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案54.根据实施方案51-53中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性。
实施方案55.根据实施方案51-54中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9具有至少85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性。
实施方案56.根据实施方案51-55中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、95％、98％或99.5％的序列同一性。
实施方案57.根据实施方案51-56中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中位置539的氨基酸置换是539R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案58.根据实施方案51-57中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中位置44的氨基酸置换是44R，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案59.根据实施方案51-58中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中位置61的氨基酸置换是61I，所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案60.根据实施方案51-59中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含如下氨基酸置换：
a.D44R和A539R；或
b.D44R、N61I和A539R，
所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置。
实施方案61.根据实施方案51-60中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由SEQ IDNO：2组成且具有下列氨基酸置换：
a.D44R和A539R；或
b.D44R、N61I和A539R，
所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置。
实施方案62.根据实施方案51-61中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、11、385、386、387、388、389或390的淀粉结合结构域具有至少96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的淀粉结合结构域。
实施方案63.根据实施方案51-62中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9的催化结构域具有至少80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的催化结构域。
实施方案64.根据实施方案50-63中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶选自获自下列物种的葡糖淀粉酶：木霉属物种、曲霉属物种、腐质霉属物种、青霉属物种、篮状菌属物种或裂殖酵母属物种。
实施方案65.根据实施方案50-64中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶获自木霉属物种或曲霉属物种。
实施方案66.根据实施方案50-65中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出可发酵糖的生成提高。
实施方案67.根据实施方案50-66中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比所述葡糖淀粉酶显示出酿造工艺的淀粉糖化步骤中可发酵糖的生成提高。
实施方案68.根据实施方案50-67中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比所述葡糖淀粉酶显示出酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖的生成提高。
实施方案69.根据实施方案68的葡糖淀粉酶变体，其中所述可发酵糖为葡萄糖。
实施方案70.根据实施方案50-69中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)。
实施方案71.根据实施方案50-70中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出降低的淀粉水解活性，其降低不超过5％、不超过10％或不超过15％。
实施方案72.根据实施方案50-71中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶(如TrGA)相比，所述葡糖淀粉酶显示出提高的实际发酵度。
实施方案73.根据实施方案50-72中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中在相同条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量低于黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：6)形成的缩合产物的量。
实施方案74.根据实施方案50-73中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中在相同条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量与黑曲霉(AnGA)(SEQID NO：6)形成的缩合产物的量基本上相同、比高不超过5％、高不超过8％或高不超过10％。
实施方案75.根据实施方案73-74中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中基于蛋白质浓度，葡糖淀粉酶剂量相同。
实施方案76.根据实施方案73-74中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中基于在活性测定法中的活性测量，葡糖淀粉酶的剂量相同。
实施方案77.根据实施方案50-76中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶已经纯化。
实施方案78.多核苷酸，其编码根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
实施方案79.一种载体，其包含根据实施方案78所述的多核苷酸，或者能够表达根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
实施方案80.一种宿主细胞，其包含根据实施方案79所述的载体。
实施方案81.一种宿主细胞，其在染色体中稳定整合了编码根据实施方案50-80中任一项所述的变体葡糖淀粉酶的核酸。
实施方案82.一种细胞，其能够表达根据实施方案50-76中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
实施方案83.根据实施方案78-81中任一项所述的宿主细胞或根据实施方案81所述的细胞，其为细菌、真菌或酵母细胞。
实施方案84.根据实施方案83所述的宿主细胞，其为木霉属物种，如里氏木霉。
实施方案85.根据实施方案83-84中任一项所述的宿主细胞，其为蛋白酶缺陷的和/或木聚糖酶缺陷的和/或天然葡聚糖酶缺陷的宿主细胞。
实施方案86.一种表达葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括获得根据实施方案80-85中任一项所述的宿主细胞或细胞并且从所述细胞或宿主细胞表达所述葡糖淀粉酶变体，以及任选纯化所述葡糖淀粉酶变体。
实施方案87.根据实施方案86所述的方法，其包括纯化所述葡糖淀粉酶变体。
实施方案88.根据实施方案50-76中任一项所述的葡糖淀粉酶变体用于制备酶组合物的用途。
实施方案89.一种酶组合物，其包含至少一种根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
实施方案90.根据实施方案89所述的酶组合物，其包含至少一种根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述组合物选自淀粉水解组合物、糖化组合物、洗涤剂、醇发酵酶组合物和动物饲料。
实施方案91.根据实施方案90所述的酶组合物，其为淀粉水解组合物。
实施方案92.根据实施方案89-91中任一项所述的酶组合物，其包含至少一种选自下列的额外的酶：淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶和其它葡糖淀粉酶。
实施方案93.根据实施方案89-92中任一项所述的酶组合物，其中所述至少一种额外的酶选自淀粉酶、支链淀粉酶和其它的葡糖淀粉酶。
实施方案94.根据实施方案89-93中任一项所述的酶组合物，其中所述至少一种额外的酶选自淀粉酶和支链淀粉酶。
实施方案95.根据实施方案89-94中任一项所述的酶组合物，其中所述淀粉酶选自α-淀粉酶和异淀粉酶。
实施方案96.一种将淀粉或部分水解的淀粉转化为含葡萄糖的糖浆的方法，所述方法包括在至少一种根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体或根据实施方案89-95中任一项的酶组合物的存在下糖化液体淀粉溶液。
实施方案97.根据实施方案96所述的糖化液体淀粉溶液的方法，其包括利用根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体或根据实施方案89-95中任一项所述的酶组合物的酶促糖化步骤。
实施方案98.根据实施方案96-97中任一项所述的方法，还包括使所述液体淀粉溶液与至少一种额外的酶相接触。
实施方案99.根据实施方案98所述的方法，其中所述额外的酶选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶和葡糖淀粉酶。
实施方案100.根据实施方案96-99所述的方法，其中所述额外的酶为淀粉酶和支链淀粉酶。
实施方案101.根据实施方案96-100中任一实施方案所述的方法，其中所述淀粉酶选自α-淀粉酶和异淀粉酶。
实施方案102.根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体在淀粉转化工艺，例如连续淀粉转化工艺中的用途。
实施方案103.根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体在用于生产寡糖、麦芽糊精或葡萄糖糖浆的工艺中的用途。
实施方案104.根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体在用于生产高果糖玉米糖浆的工艺中的用途。
实施方案105.一种产生用于酿造的麦芽汁的方法，其包括从谷粉形成醪液，以及使所述醪液与根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体或根据实施方案89-95中任一项所述的酶组合物接触。
实施方案106.根据实施方案105所述的方法，其还包括使醪液与一种或多种额外的酶相接触。
实施方案107.根据实施方案106所述的方法，其中所述一种或多种酶选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶和葡糖淀粉酶。
实施方案108.根据实施方案107所述的方法，其中所述一种或多种酶是淀粉酶和/或支链淀粉酶。
实施方案109.根据实施方案107-108中任一实施方案所述的方法，其中所述淀粉酶是α-淀粉酶和/或异淀粉酶。
实施方案110.根据实施方案105-109中任一项所述的方法，其中所述谷粉包含一种或多种发芽的谷物、未出芽的谷物、添加物以及它们的任何组合。
实施方案111.根据实施方案105-110中任一项所述的方法，其还包括使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料。
实施方案112.根据实施方案105-111中任一项所述的方法，其还包括使所述麦芽汁发酵以获得啤酒。
实施方案113.一种用于生产啤酒的方法，其包括：
a.制备醪液，
b.过滤醪液以获得麦芽汁，以及
c.使所述麦芽汁发酵以获得啤酒，其中将根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体加入至：步骤(a)和/或步骤(b)和/或步骤(c)中。
实施方案114.根据实施方案113所述的方法，其中使所述啤酒经受巴氏灭菌步骤。
实施方案115.根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体用于提高酿造工艺的发酵步骤或淀粉糖化步骤中的可发酵糖生成的用途。
实施方案116.一种啤酒，其中所述啤酒通过下列步骤产生：
a.制备醪液，
b.过滤所述醪液以获得麦芽汁，
c.使所述麦芽汁发酵以获得啤酒，以及
d.对所述啤酒进行巴氏灭菌，其中将根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体加入至：步骤(a)和/或步骤(b)和/或步骤(c)中。
实施方案117.根据实施方案116所述的啤酒，其中经巴氏灭菌的啤酒进一步表征为：
a.基本上没有葡糖淀粉酶活性；和/或
b.低卡路里啤酒和/或低醇啤酒。
实施方案118.根据实施方案50-77中任一项所述的葡糖淀粉酶变体在醇发酵过程中的用途。
实施方案119.一种用于鉴别与亲本葡糖淀粉酶相比具有降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)的葡糖淀粉酶变体的筛选方法。
实施方案120.一种用于鉴别下列葡糖淀粉酶变体的筛选方法，所述葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶相比，具有相同或增加的淀粉水解活性和减少的异麦芽糖合成，并且具有降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)，其中所述减少的异麦芽糖合成是减少不超过5％、不超过10％或不超过15％。
实施方案121.一种用于鉴别淀粉水解过程中具有减少的缩合产物合成的葡糖淀粉酶变体的筛选方法，所述方法包括下列步骤：测量所述葡糖淀粉酶变体的异麦芽糖合成和淀粉水解活性，以及选择与亲本葡糖淀粉酶相比具有不超过5％、不超过10％或不超过15％的降低淀粉水解活性且与亲本葡糖淀粉酶相比具有降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)的变体。
实施方案122.根据实施方案119-121中任一项所述的方法获得的葡糖淀粉酶变体。
另外的实施方案也是本发明的一部分：
另外的实施方案1.一种葡糖淀粉酶变体，其包含如下氨基酸置换：
a.44R和539R；或
b.44R、61I和539R，
所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1或2或亲本葡糖淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
另外的实施方案2.根据另外的实施方案1所述的葡糖淀粉酶变体，其包含如下氨基酸置换：
a.D44R和A539R；或
b.D44R、N61I和A539R，
所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1或2或亲本葡糖淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
另外的实施方案3.根据另外的实施方案1-2中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含如下氨基酸置换：
a.D44R、N61I和A539R，
所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1或2或亲本葡糖淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
另外的实施方案4.根据另外的实施方案1-2中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含如下氨基酸置换：
a.D44R和A539R，
所述位置对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1或2或亲本葡糖淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
另外的实施方案5.根据另外的实施方案1-4中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1或2具有至少85％或90％的序列同一性。
另外的实施方案6.根据另外的实施方案5所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1或2具有至少95％的序列同一性。
另外的实施方案7.根据另外的实施方案6所述葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1或2具有至少99.5％的序列同一性。
另外的实施方案8.根据另外的实施方案1-7中任一项所述葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶包含SEQ ID NO：1或2。
另外的实施方案9.根据另外的实施方案8所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶由SEQ ID NO：1或2组成。
另外的实施方案10.根据另外的实施方案1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、11、385、386、387、388、389或390的淀粉结合结构域具有至少96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的淀粉结合结构域。
另外的实施方案11.根据另外的实施方案1-10中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9的催化结构域具有至少80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的催化结构域。
另外的实施方案12.根据另外的实施方案1-11中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶选自获自下列物种的葡糖淀粉酶：木霉属物种、曲霉属物种、腐质霉属物种、青霉属物种、篮状菌属物种或裂殖酵母属物种。
另外的实施方案13.根据另外的实施方案1-12中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶获自木霉属物种或曲霉属物种。
另外的实施方案14.根据另外的实施方案1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，与亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶显示出可发酵糖的生成提高。
另外的实施方案15.根据另外的实施方案1-14中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，与亲本葡糖淀粉酶相比所述葡糖淀粉酶显示出酿造工艺的淀粉糖化步骤中可发酵糖的生成提高。
另外的实施方案16.根据另外的实施方案1-15中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，与亲本葡糖淀粉酶相比所述葡糖淀粉酶显示出酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖的生成提高。
另外的实施方案17.根据另外的实施方案16所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述可发酵糖为葡萄糖。
另外的实施方案18.根据另外的实施方案1-17中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶显示出降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比(IS/SH比)。
另外的实施方案19.根据另外的实施方案1-18中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶显示具有不超过5％、不超过10％或不超过15％的降低的淀粉水解活性。
另外的实施方案20.根据另外的实施方案1-19中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶显示出提高的实际发酵度。
另外的实施方案21.根据实施方案1-20中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中在相同条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量低于黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：6)形成的缩合产物的量。
另外的实施方案22.根据另外的实施方案1-21中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中在相同条件下所述葡糖淀粉酶形成的缩合产物的量与黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：6)形成的缩合产物的量基本上相同、比其高不超过5％、高不超过8％或高不超过10％。
另外的实施方案23.根据另外的实施方案18-21中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中基于蛋白质浓度，葡糖淀粉酶剂量相同。
另外的实施方案24.根据另外的实施方案18-23中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中基于在活性测定法中的活性测量，葡糖淀粉酶的剂量相同。
另外的实施方案25.根据另外的实施方案1-24中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶已经纯化。
另外的实施方案26.一种多核苷酸，其编码根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
另外的实施方案27.一种载体，其包含根据另外的实施方案26所述的多核苷酸，或者能够表达根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
另外的实施方案28.一种宿主细胞，其包含根据另外的实施方案27所述的载体。
另外的实施方案29.一种宿主细胞，其在染色体中稳定整合了编码根据另外的实施方案1-25中任一项所述的变体葡糖淀粉酶的核酸。
另外的实施方案30.一种细胞，其能够表达根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
另外的实施方案31.根据另外的实施方案28-29中任一项所述的宿主细胞或根据另外的实施方案30所述的细胞，其为细菌、真菌或酵母细胞。
另外的实施方案32.根据另外的实施方案31所述的宿主细胞，其为木霉属物种，如里氏木霉。
另外的实施方案33.根据另外的实施方案28-29和31-32中任一项所述的宿主细胞，其为蛋白酶缺陷的和/或木聚糖酶缺陷的和/或葡聚糖酶缺陷的宿主细胞。
另外的实施方案34.一种表达葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括获得根据另外的实施方案28-33中任一项所述的宿主细胞或细胞并且从所述细胞或宿主细胞表达所述葡糖淀粉酶变体，以及任选纯化所述葡糖淀粉酶变体。
另外的实施方案35.根据另外的实施方案34所述的方法，其包括纯化所述葡糖淀粉酶变体。
另外的实施方案36.根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体用于制备酶组合物的用途。
另外的实施方案37.一种酶组合物，其包含至少一种根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
另外的实施方案38.一种酶组合物，其包含至少一种根据实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，所述酶组合物包含一种或多种另外的酶。
另外的实施方案39.根据另外的实施方案37-38中任一项所述的酶组合物，其包含至少一种根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述酶组合物选自淀粉水解组合物、糖化组合物、洗涤剂、醇发酵酶组合物和动物饲料。
另外的实施方案40.根据另外的实施方案36-39中任一项所述的酶组合物，其包含至少一种额外的选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶、植酸酶和另外的葡糖淀粉酶的酶。
另外的实施方案41.根据另外的实施方案36-40中任一项所述的酶组合物，其中所述酶组合物包含至少一种额外的选自α-淀粉酶和/或支链淀粉酶的酶。
另外的实施方案42.根据另外的实施方案36-41中任一项所述的酶组合物，其中所述组合物包含α-淀粉酶和支链淀粉酶。
另外的实施方案43.根据另外的实施方案36-42中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物每GAU根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体包含低于1、低于0.8、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.2、低于0.125、低于0.1、低于0.05、低于0.01或低于0.005XU的木聚糖酶活性。
另外的实施方案44.根据另外的实施方案36-43中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物每克所述组合物包含低于400、低于200、低于50、低于20或低于2XU的木聚糖酶活性。
另外的实施方案45.根据另外的实施方案36-44中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物每GAU根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体包含0.1-20、1-15、2-10或3-10SSU的α-淀粉酶活性。
另外的实施方案46.根据另外的实施方案36-45中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物每GAU根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体包含0.05-10、0.1-10、0.1-8、0.1-5、0.1-3、0.2-3或0.2-2PU的支链淀粉酶活性。
另外的实施方案47.根据另外的实施方案36-46中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物每GAU根据另外的实施方案1-25所述的葡糖淀粉酶变体包含0.05-10PU的支链淀粉酶活性以及每GAU根据另外的实施方案1-25所述的葡糖淀粉酶变体包含0.1-20SSU的α-淀粉酶活性。
另外的实施方案48.根据另外的实施方案36-47中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物每GAU根据另外的实施方案1-25所述的葡糖淀粉酶变体包含0.05-10PU的支链淀粉酶活性以及每GAU根据另外的实施方案1-25所述的葡糖淀粉酶变体包含0.1-20SSU的α-淀粉酶活性以及每GAU根据另外的实施方案1-25所述的葡糖淀粉酶变体包含低于1、低于0.8、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.2、低于0.125、低于0.1、低于0.05、低于0.01或低于0.005XU的木聚糖酶活性。
另外的实施方案49.一种产生用于酿造的麦芽汁的方法，其包括从谷粉形成醪液，以及使所述醪液与根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体或根据另外的实施方案36-48中任一项所述的酶组合物接触。
另外的实施方案50.根据另外的实施方案49所述的方法，其还包括使所述醪液与一种或多种额外的酶相接触。
另外的实施方案51.根据另外的实施方案50所述的方法，其中所述一种或多种酶选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶、植酸酶和葡糖淀粉酶.
另外的实施方案52.根据另外的实施方案51所述的方法，其中所述一种或多种酶是α-淀粉酶和/或支链淀粉酶。
另外的实施方案53.根据另外的实施方案49-52中任一项所述的方法，其中所述谷粉包含一种或多种发芽的谷物、未出芽的谷物、添加物以及它们的任何组合。
另外的实施方案54.根据另外的实施方案49-53中任一项所述的方法，其还包括使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料。
另外的实施方案55.根据实施方案49-54中任一项所述的方法，其还包括使所述麦芽汁发酵以获得啤酒。
另外的实施方案56.一种用于生产啤酒的方法，其包括：
a.制备醪液，
b.过滤醪液以获得麦芽汁，以及
c.使所述麦芽汁发酵以获得啤酒，
其中将根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体或根据另外的实施方案36-48中任一项所述的酶组合物添加至：步骤(a)和/或步骤(b)和/或步骤(c)中。
另外的实施方案57.根据另外的实施方案55所述的方法，其中使所述啤酒经受巴氏灭菌步骤。
另外的实施方案58.根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体或根据另外的实施方案36-48中任一项所述的酶组合物用于提高酿造工艺的淀粉糖化步骤或发酵步骤中发酵糖的生成的用途。
另外的实施方案59.一种啤酒，其中所述啤酒通过下列步骤产生：
a.制备醪液，
b.过滤所述醪液以获得麦芽汁，
c.使所述麦芽汁发酵以获得啤酒，以及
d.对所述啤酒进行巴氏灭菌，
e.其中将根据另外的实施方案1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体或根据另外的实施方案36-48中任一项所述的酶组合物添加至：步骤(a)和/或步骤(b)和/或步骤(c)中。
另外的实施方案60.根据另外的实施方案59所述的啤酒，其中经巴氏灭菌的啤酒进一步表征为：
a.基本上没有葡糖淀粉酶活性；和/或
b.低卡路里啤酒和/或低醇啤酒。
现在将通过如下非限制性实施例进一步描述本发明。
实旋例
测定法和方法
下列测定法和方法用于下文中所提供的实施例中。下面描述了用于提供变体的方法。然而，应该指出的是可将不同的方法用于提供亲本酶的变体且本发明不限于实施例中所使用的方法。意图是可使用任何适用于制备变体和选择变体的手段。
用于96孔微量滴定板的pNPG葡糖淀粉酶活性测定法
试剂溶液是：NaAc缓冲液：200mM醋酸钠缓冲液，pH 4.5；底物：50mM p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma N-1377)于NaAc缓冲液中的溶液(0.3g/20ml)，终止溶液(800mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH 10)。将30μl经过滤的上清液置于新鲜的96孔平底微量滴定板(MTP)中。向每个孔中添加50μl NaAc缓冲液和120μl底物并在50℃下温育(雷勃公司(Thermolabsystems)iEMS保温箱/振荡器HT)30分钟。通过加入100μl终止溶液而使反应终止。在MTP读板仪(分子仪器公司(Molecular Devices)Spectramax 384plus)中在405nm处测量吸光度并用0.011μM/cm的摩尔消光系数来计算活性。
热稳定性测定法1
以150ppm纯化的酶的母稀释液(50mM NaAcpH 4.0中)，通过将6μl加入294μl 50mMNaAc缓冲液(pH 4.5)中而制成3ppm的稀释液。将稀释样品平均分到2个MTP中。将一个MTP(初始板)在4℃下温育1小时而将另一个MTP(残余板)在64℃下温育(雷勃公司iEMS保温箱/振荡器HT)1小时。使残余板在冰上冷却10分钟。将60μl的初始板和残余板二者加入120μl4％的可溶性玉米淀粉(pH 3.7)并在2个单独的MTP中于32℃900rpm下温育(雷勃公司iEMS保温箱/振荡器HT)2小时。使用下文中描述的乙醇应用测定法，在己糖激酶活性测定法中测量两个板的活性。
如下将热稳定性计算为残余活性百分比：
己糖激酶活性测定法：
己糖激酶混合物：在使用前10-15分钟，将90ml水加入BoatIL容器葡萄糖HK R1(IL测试葡萄糖(HK)试剂盒，仪器实验室公司(InstrumentLaboratory)#182507-40)中并轻轻地混合。将100μl己糖激酶混合物加入85μl dH2O中。将15μl的样品加入混合物中并在室温下在暗处温育10分钟。10分钟后，在MTP读板仪中在340nm处读取吸光度。根据葡萄糖(0-1.6mg/ml)标准曲线计算葡萄糖浓度。
乙醇应用-从玉米淀粉释放葡萄糖
8％母液：在室温下，将8g可溶性玉米淀粉(西格玛公司(Sigma)#S4180)悬浮于40ml dH2O中。将该浆料分份加入250ml烧瓶中的50ml沸腾的dH2O中并蒸煮5分钟。伴随搅拌使淀粉溶液冷却至25℃并用剩余的10ml dH2O调节体积。
终止溶液：800mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH 10。
4％(m/v)可溶性淀粉工作溶液：用100mM醋酸钠缓冲液(pH 4.0)稀释(1∶1)母液。
在平底96孔MTP中用294μl 50mM NaAc缓冲液(pH 4.0)稀释6μl的150ppm纯化的酶。将60μl的该稀释液加入120μl 4％的可溶性玉米淀粉(pH4.0)中，并在32℃900rpm下温育(雷勃公司iEMS保温箱/振荡器HT)2小时。通过加入90μl 4℃冷终止溶液而使该反应停止。将样品置于冰上20分钟。在10℃下以1118×g将淀粉离心(西格玛公司6K15)5分钟，并将15μl上清液用于上文所述的己糖激酶活性测定法中以测定葡萄糖含量。
乙醇筛选测定法的数据分析和性能指数计算
使用微流电泳设备(美国麻萨诸塞州霍普金顿的Caliper生命科学公司(CaliperLife Sciences，Hopkinton，MA，USA))来测量蛋白质水平。根据生产商的指导HTProtein Express，P/N 760301)而制备微流芯片和蛋白质样品。制备培养物上清液并在-20℃下存储于96孔微量滴定板中直至使用，使用时通过在37℃温箱中温热30分钟而使其解冻。简短摇动后，将2μl的每种培养物样品转移到装有7μl样品缓冲液(Caliper公司)的96孔PCR板(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-Rad，Hercules，CA，USA))中，随后在恒温控制的平板加热器上将板加热至90℃5分钟。让板冷却，然后向每份样品添加40μl水。然后将板连同由生产商提供并校准的蛋白质标准品一起置于设备中。当蛋白质移动通过芯片中的焦点时，记录荧光信号并通过相对于由经校准的蛋白质标准品组产生的信号对信号进行定量而测定蛋白质浓度。
在Caliper蛋白质测定后，以下述方式处理数据。
就峰模式的正确性检查校准阶梯(calibration ladder)。如果与该运行(run)相关的校准阶梯不足的话，用相邻运行的校准阶梯替代它。对于峰的检测，使用caliper软件的全局峰寻找选择的默认设置。在75kDA+/-10％下选择所关注的峰。将结果输出到电子数据表程序中并使峰面积与乙醇筛选测定法中的相应活性(ABS340-空白测量)相关联。
以12个野生型样品的面积和活性数，使用程序Grafit第5版(英国霍利的Erithacus软件公司(Erithacus Software，Horley，UK))的“EnzymeKinetics(酶动力学)”方程结合非线性拟合函数而制得校准线。使用默认的设置来计算Km和Vmax参数。基于这两个参数，制得米氏参比线并计算每种变体的比活性。
基于所述比活性来计算性能指数(PI)。变体的PI是“变体-比活性/WT-比活性”的商。WT的PI是1.0而PI＞1.0的变体所具有的比活性大于WT的比活性。
TrGA变体的纯化
在一个步骤中，使用AKTA explorer 100FPLC系统(美国新泽西州皮斯卡特维的安玛西亚公司(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ))通过亲合色谱法来一步纯化所表达的TrGA变体的培养物上清液。将β-环糊精(荷兰兹韦恩德雷赫特的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，TheNetherlands；85.608-8))偶联至环氧活化的琼脂糖珠(比利时Diegem的通用电气医疗公司(GE Healthcare，Diegem，Belgiumn；17-0480-01))并将其用于纯化。用25mM醋酸钠缓冲液(pH 4.3)平衡柱子，随后施加浓缩的酶样品。用含有10mMα-环糊精(西格玛公司，28705)的25mM醋酸钠缓冲液(pH 4.3)从柱子上洗脱所结合的变体。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析纯化的样品。
纯化的TrGA变体的蛋白质定量
使用AKTA explorer 100FPLC系统，通过阴离子交换色谱法测定纯化的TrGA变体的蛋白质浓度。将纯化的样品注射到ResourceQ 1ml柱(通用电气医疗公司)上并施加0至500mM NaCl(25mM醋酸钠缓冲液pH 4.3中)的线性梯度以洗脱所结合的蛋白质。确定了峰面积并相对于浓度已知的TrGA标准品来计算蛋白质浓度。
液化物测定法
在6孔板中对来自于当地乙醇生产商的玉米醪液液化物确定变体的葡萄糖释放。用6g 26％DS液化物(pH 4.3)填充板的每个孔。随后，加入300ppm酶和400ppm尿素，并在于32℃温育2、4和6小时后收集250μl样品。将样品以14.000×g离心5分钟，并将50μl上清液转移到装有50μl杀灭溶液(1.1N硫酸)的埃彭道夫管中，让其静置5分钟。将250μl水添加至该管，然后用0.22μm滤板过滤，并如下文所述注射到HPX-87H柱上。
TrGA变体在乙醇发酵中的性能评价
从当地乙醇生产商获得玉米醪液液化物样品并在一些情形中使用稀酒糟水将其稀释至26％DS。使用4N硫酸将该浆料的pH调节至pH 4.3。将100g或50g的醪液等分试样放入125ml摇瓶中并将其置于32℃温箱中，让其平衡。加入100μl 400ppm尿素后，向摇瓶中加入1ml所欲浓度的纯化的变体或2种不同浓度的纯化的TrGA。最后，向每份样品添加333μl的RedStar Red酵母(15g，在45ml DI水中水合30分钟；威斯康辛州密尔沃基的乐斯福酵母公司(Lesaffre yeast Corp.Milwaukee，WI))溶液。在5、21、28、48和52小时时收集样品并用Aminex HPX-87H柱(伯乐公司)通过HPLC(安捷伦公司(Agilent)1200系列)进行分析。
乙醇和碳水化合物测定
用发酵罐啤酒填充2ml的埃彭道夫离心管并在冰上冷却10分钟。将样品以14.000×g离心3分钟，并将500μl上清液转移至装有50μl杀灭溶液(1.1N硫酸)的测试管中，让其静置5分钟。将5.0ml水添加至该测试管然后过滤到0.22μm滤板(multiscreen，荷兰阿姆斯特丹密理博公司(Millipore，Amsterdam，the Netherlands))中，并在HPLC上运行。柱温度：60℃；流动相：0.01N硫酸；流速0.6ml/min；检测器：RI；注入体积：20μl。柱子基于电荷和分子量将分子分离；DP1(单糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)；DP＞3(具有大于3的聚合度的寡糖)；琥珀酸；乳酸；甘油；甲醇；乙醇。
GAU活性的测定
底物：底物：新鲜制备p-硝基苯基-β-麦芽糖苷(4mM)，以及热稳定性β-葡糖苷酶(5U/ml)(来自测定法R-AMGR305/04；爱尔兰威克洛的美格兹密国际公司(MegazymeInternational Wicklow，Ireland))。
缓冲液：200mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)。
将酶样品用醋酸钠缓冲液在96孔板中稀释至少10倍：将20μL底物与20μL酶溶液相混合并在40℃下伴随搅拌温育10分钟。加入300μL 2％的氨基丁三醇(Trizma)碱来终止反应并显色。相对于试剂空白测量400nm处的吸光度。
通过伴随剧烈搅拌向20μL底物中加入300μL氨基丁三醇碱溶液(2％)，随后加入酶溶液(20μL)而制备空白溶液。如下计算活性：
其中：GAU＝酶活性的国际单位。一个单位是可在确定的pH和温度下每分钟从底物释放1μmol对硝基酚的酶的量。ΔA400＝吸光度(反应)-吸光度(空白)。10＝温育时间(min)。340＝最终反应体积(μL)。20＝被测定的酶的体积(μL)18.1＝2％氨基丁三醇碱(pH约8.5)中的对硝基酚在400nm处的EmM(单位：μM-1*cm-1)。0.88＝光程(cm)
淀粉水解活性(SH活性)：
缓冲液：0.1M柠檬酸缓冲液pH 5.4(由0.1M柠檬酸和0.1M柠檬酸三钠制成)
底物：缓冲液中的30％可溶性淀粉(默克公司(Merck)，v.nr1.01257.1000)(稍稍加热直至所有的淀粉都在溶液中)
酶：基于上述测定法标准化至3GAU/ml的葡糖淀粉酶。
将60μL 30％的淀粉转移至96孔PCR板中。加入60μL的酶样品或标准品并通过用移液管抽吸数次而混合。尽可能快地进行随后的步骤直至温育。
用密封带覆盖PCR板，然后运行下列PCR程序：63℃下6分钟、99℃下6分钟以及4℃下10分钟。不加热盖子。在温度循环后将PCR板离心(300rpm下大约1分钟)以在孔底收集所有的液体。在4℃下保持板直至进一步分析。根据下面的方法测量葡萄糖浓度并如下计算水解活性：
异麦芽糖水解活性
与淀粉水解活性一样，不同的是底物为2％的异麦芽糖(西格玛公司I7253)且PCR程序的第一步为63℃下10分钟而非6分钟。
葡萄糖浓度的测定
从D-葡萄糖测定法(KGLUC 04/06)进行改进并用于测定从淀粉和异麦芽糖水解反应释放的葡萄糖的量。
将瓶1的内容物[试剂缓冲液：磷酸钾缓冲液(1.0M，pH7.4)、对羟基苯甲酸(0.22M)和叠氮化钠(0.4％w/v)]用蒸馏水稀释至1L。将瓶2的内容物[试剂酶：葡萄糖氧化酶(＞12,000U)和过氧化物酶(＞650U)以及4-氨基安替比林(80mg)。冻干的粉末]在大约20mL溶液1中稀释并定量地转移至装有剩余的溶液1的瓶中。这是葡萄糖测定试剂(GOPOD试剂)。将其新鲜地使用或在暗处冷冻保存。在使用之前检查该溶液的吸光度(A510)在相对于蒸馏水读取时小于0.05。
在96孔板中，向10μL样品溶液中加入250μL的GOPOD试剂。用密封带覆盖平板并在埃彭道夫恒温混匀器中于40℃、700rpm下温育20分钟。在510nm处读取吸光度。由milli-q水中的1.4、1.2、0.8、0.4、0.2和0mg/ml葡萄糖溶液制成葡萄糖标准曲线并用于计算样品葡萄糖浓度。
通过TLC测定麦芽糖和异麦芽糖合成
底物：0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.4)中的30％葡萄糖(稍稍加热以使所有的葡萄糖进入溶液)。
酶：将葡糖淀粉酶标准化至3GAU/ml，总是运行黑曲霉葡糖淀粉酶产品(AnGA；丹麦丹尼斯科公司(Danisco，Denmark))和里氏木霉葡糖淀粉酶产品(TrGADiazyme TR8，丹麦丹尼斯科公司)作为参照。
参照：热灭活的酶样品和/或缓冲溶液(不是在所有的情形中使用)。
标准品：1)去矿物质水中的0.3％麦芽糖和0.1％异麦芽糖。2)去矿物质水中的0.2％麦芽糖和0.05％异麦芽糖。3)去矿物质水中的0.3％麦芽糖和0.1％异麦芽糖。
反应条件：将60μl底物与60μL酶溶液在PCR板的孔中混合。用密封带覆盖所述板，并运行下列温度：63℃下120分钟，99℃下6分钟，4℃下10分钟。将盖子加热至70℃。温育后，对板进行中速离心(300rpm下1分钟)，并将其保存在4℃下直至进一步分析。一式两份运行所有的样品。
麦芽糖和异麦芽糖的定量：在样品施加之前，于167℃下预热TLC板10分钟。将所有的样品和标准品在去矿物质水中稀释20倍。使用自动化的TLC取样器(ATS4，瑞士穆滕茨的卡玛公司(CAMAG，Muttenz，Switzerland))来精确地转移4μL样品至TLC板。每个板可装20个样品，所述样品被置于4mm宽的带中。在40℃下将板加热10分钟以使带干燥。在AcN、EtAc、1-丙醇、H2O(85∶20∶50∶40)中洗脱TLC板，之后于167℃将板加热5分钟以除去过量的溶剂。将板反转(即通过在接近施加样品处的边缘握住板)浸入5％H2SO4∶EtOH(95∶5)中。每日制作浸渍溶液。在167℃下将板加热3分钟以使点显现。通过在TLC扫描仪(卡玛公司扫描仪3，瑞士穆滕茨)中扫描完成对点强度的测定并通过基于所有的麦芽糖和异麦芽糖浓度对点强度绘出标准曲线而进行定量。利用点强度对浓度对于麦芽糖和异麦芽糖相等的事实，由该曲线计算出这两种化合物的浓度。
图10绘出了TLC板的实例，所述板具有含不同浓度的葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖的标准品和含有反应产物的样品，所述反应产物来自与黑曲霉葡糖淀粉酶产品(AnGA；丹麦丹尼斯科公司)和里氏木霉葡糖淀粉酶产品(TrGA Diazyme TR8，丹麦丹尼斯科公司)温育的葡萄糖。盲样(blind)是在无酶的情况下进行温育的葡萄糖。
根据下式，基于由TLC确定的异麦芽糖浓度来计算异麦芽糖合成活性(IS活性)：
热稳定性测定法2
作为对本实验中所用的条件下酶的热稳定性的度量，在将酶在15％葡萄糖、0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.4)中于63℃温育120分钟之前和之后，根据上述测定法测定GAU活性。数据示为活性丧失百分比。
通过发酵产生GA
400x痕量元素溶液：在1000ml去矿物质水中稀释：无水柠檬酸(175g)、FeSO4*7H2O(200g)、ZnSO4*7H2O(16g)、CuSO4*5H2O(3.2g)、MnSO4*H2O(1.4g)、H3BO3(0.8g)。对其进行酸化而使所有的组分进入溶液可能是有帮助的。将该溶液过滤并灭菌。
LD-培养基：向约800ml去矿物质水中添加：酪蛋白氨基酸(9g)、MgSO4*7H2O(1g)、(NH4)2SO4(5g)、KH2PO4(4.5g)、CaCl2*2H2O(1g)、哌嗪-1，4-双(丙磺酸)(PIPPS)缓冲液(33g)、400x里氏木霉痕量元素(2.5ml)，用NaOH 4N将pH调节至5.5。将终体积调节至920ml。
2xAmd S Base琼脂(1升)：混合KH2PO4(30g)、1M乙酰胺(20ml)、1M CsCl(20ml)、20％MgSO4.7H2O(6ml)、20％CaCl2.2H2O(6ml)、里氏木霉孢子元素400x(2ml)、50％葡萄糖.H2O(80ml)。用4N NaOH将pH调节至4.5，补足至1L并过滤灭菌。4℃下保存。
初始培养：在AmdS-Base琼脂板上培养菌株。为了制备琼脂板，将基本培养基琼脂煮沸，冷却到大约50℃后，用2x AmdS Base 1∶1稀释并倾倒在培养皿上。在孢子形成后(大约6-7天)，用2ml盐水0.015％Tween 80刮抹平板。将大约1ml添加至装有500-600μl 35％甘油的甘油管中并在-80℃下保存。由该孢子悬浮物直接开始进行预培养发酵。
预培养：通过向LD培养基中加入2.5％葡萄糖，随后补足至1L而制备培养基。为了制备生物质，将50μl孢子悬浮物添加至100ml培养基中(在500ml摇瓶中灭菌)。在30℃、180rpm下将摇瓶在旋转摇床上温育2天，然后将10ml悬浮物用于接种新的摇瓶，将其在类似的条件下温育1天。将该摇瓶的内容物用于接种发酵罐。
主培养：为了制备1L的培养基，将40ml葡萄糖/槐糖混合物(芬兰Jamsa的丹尼斯科公司(Danisco，Jamsa，Finland))添加至LD-培养基中并补足至1L。用预培养物接种装有4L培养基的6L发酵罐，并于34℃在pH 3.5下培养大约16小时，直到CER/OUR(二氧化碳排出率/氧气摄入率)开始下降。然后使温度降至28℃，pH升至4.0并使发酵继续进行大约80小时。
测定实际发酵度(RDF)的酿造分析
纯麦芽酿造分析
使用下列程序进行分析：以266ml水将70g经研磨的比尔森麦芽(德国巴姆贝格的维雅曼公司(Weyermann，Bamberg，Germany))制备麦芽浆。在(混合麦芽和水)中制备麦芽浆之后的温度循环为：63.9℃下140分钟，10分钟中增加至73.9℃，73.9℃下5分钟。在淀粉糖化结束时，使醪液冷却，补足至350g并过滤。在30分钟后测量滤液的体积。对过滤过的麦芽汁进行取样用于测定比重，然后在水浴中加热至99℃10分钟，以破坏任何残余的葡糖淀粉酶活性。热处理导致1.5g/200ml麦芽汁的损失。加入酵母后，在500ml锥形瓶中，使麦芽汁在18℃和100rpm下发酵至少88小时且不超过120小时。测定发酵物的比重。
麦芽-添加物酿造分析
采用了经改进的煮出糖化，将玉米谷粉用作添加物。该酿造方案由US2009014247改进而来。将40％的麦芽用含水量为12.6％的玉米谷粉(Benntag Nordic公司；德国吕贝克的北方谷物有限两合公司(NordgetreideGmBH Lübec，Germany))代替。将全部的玉米谷粉连同54％的水和5％的麦芽(良好改性的比尔森麦芽；丹麦Fuglsang)以2℃/分钟加热至100℃。在72℃和80℃下保持5分钟，在100℃下保持10分钟。此后将添加物冷却至64℃并与也处于64℃的主醪液合并。在该阶段添加酶，将64℃下的保持延长至250分钟。发酵后，测定RDF值。
根据下面的等式计算实际发酵度(RDF)值：
其中：RE＝实际提取率＝(0.1808×°P初始)+(0.8192×°P最终)，°P初始为发酵前标准化的麦芽汁的比重，而°P最终为发酵的麦芽汁的比重，以柏拉图度数表示。
在本文中，如下测定实际发酵度(RDF)：
发酵后，过滤样品并脱气。用啤酒分析仪(Beer Alcolyzer Plus)和DMA5000密度计(均购自奥地利格拉茨的安东帕公司(Anton Paar，Graz，Austria))测定发酵物的比重和醇浓度。基于这些测量，根据如下公式，通过仪器计算实际发酵度(RDF)值：
其中：E(r)为单位为柏拉图度数(°P)的实际提取率，OE为单位为°P的初始提取率。
木聚糖酶测定法
将样品在柠檬酸(0.1M)-磷酸氢二钠(0.2M)缓冲液(pH5.0)中稀释，以在本测定法中获得大约OD590＝0.7。将样品的三种不同的稀释液在40℃下预温育5分钟。在时间＝5分钟时，将1片木聚糖酶片(交联的、染色的木聚糖底物，爱尔兰布雷市的美格兹密公司(Megazyme，Bray，Ireland))加入1ml反应体积的酶溶液中。在时间＝15分钟时，加入10ml的2％TRIS/NaOH(pH 12)终止反应。使用1000μl缓冲液替代酶溶液制备空白溶液。将反应混合物离心(1500×g，10分钟，20℃)并在590nm处测量上清液的OD。一个木聚糖酶单位(XU)被定义为OD590每分钟增加0.025的木聚糖酶活性。
支链淀粉酶测定法
原理：
在将Red-Pullulan(部分解聚的支链淀粉，其用Procion Red MX-5B染色，来自爱尔兰布雷市的美格兹密公司的测定试剂盒S-RPUL)与支链淀粉酶或极限糊精酶温育时，该底物通过内切机理被解聚而产生低分子量的染色片段，该染色片段在添加乙醇至该反应混合物时保留在溶液中。通过离心除去高分子量材料，在510nm下测量上清液的颜色。通过参考标准曲线确定测定溶液中的支链淀粉酶。
底物：
将0.5g的粉末化底物溶解于25mL的0.5M氯化钾溶液中。
缓冲液：醋酸钠，200mM，pH 5.0
酶制备物：
将酶在缓冲液中稀释至少10倍。如果所得的A510读数高于1，0，则将酶进一步稀释。
测定法程序：
在试管中，将1.0mL预先平衡至40℃的酶溶液与0.5mL预先平衡至40℃的底物溶液混合。将该混合物在40℃下温育10分钟。终止反应并通过添加2.5mL乙醇(95％v/v)沉淀高分子底物。将试管平衡至室温10分钟，然后在涡旋混合器上搅拌10秒，以1,000g离心10分钟。将上清液转移至96孔板，相对于蒸馏水测量空白溶液和反应溶液在510nm处的吸光度。从样品读数减去空白读数而获得用于下式的A510。
由下式测定活性：milli-PU/mL＝360*A510+11。
通过将乙醇添加至Red-Pullulan底物然后添加酶来制备空白溶液。
一单位活性定义为在确定的条件下每分钟从硼氢化物还原的支链淀粉释放一摩尔D-葡萄糖还原糖当量所需的酶量(参见，Megazyme方法S-RPUL 10/08，爱尔兰布雷市的美格兹密公司)。
α-淀粉酶测定(SSU)方法
原理：
方法是基于通过参考标准曲线测量得到的、4％马铃薯可溶性淀粉在pH4.5和50℃下水解20分钟作为葡萄糖释放的还原基团。一可溶性淀粉单位(SSU)是每分钟释放1毫克葡萄糖当量的活性。
底物：
0.05M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)中的4％(w/v)马铃薯可溶性淀粉(西格玛公司，S2630)溶液。将马铃薯可溶性淀粉在去离子水中形成浆料，然后添加至烧瓶中剧烈沸腾的水中。伴随搅拌使该淀粉溶液沸腾三分钟，然后冷却至25℃，添加乙酸和氢氧化钠溶液以得到0.05M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)，然后补足至最终浓度。
DNS溶液：
通过向水添加如下物质制备1L DNS溶液：16g氢氧化钠，然后添加10g 3-5二硝基水杨酸，然后添加300g酒石酸钠钾，每种组分均溶解才添加下一种。定容溶液并暗处保存。
测定程序：
将0.4ml淀粉底物和0.1ml 0.5M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)添加至试管，将其盖上盖子并在设定为50℃的水浴中平衡温度。添加0.1ml的稀释酶溶液，在20分钟后通过添加0.1ml 2％(w/v)NaOH终止反应。对每个酶测定以及酶空白测定一式两份地进行。
显色：
向每个管(测定管和空白管)添加1.5ml水和2.0ml DNS溶液，混合并置于沸水浴中5分钟，然后将管在冰浴中冷却10分钟。让管室温下静置20分钟，读取543nm处的吸光度。
标准曲线：
构建对应于0.0-1.0mg葡萄糖/2.2ml水的葡萄糖标准曲线，然后添加2.0ml的DNS试剂并按所描述的继续进行。
酶活性(SSU)的计算
使用该标准曲线将样品的吸光度值(A543)转化为葡萄糖的毫克数，并计算ΔA543mg葡萄糖值[样品-空白](ΔA543必须在0.2-0.4之间)。由下式测定活性：
SSU/ml或g＝平均的(ΔA543mg葡萄糖值[样品-空白])×(1/0.1)×(1/20)×酶稀释度
实施例1：在pTTT载体中构建TrGA位点评价文库(SEL)用于在里氏木霉中表达
通过重组反应(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))将里氏木霉cDNA序列(SEQ ID NO：4)克隆进pDONRTM201中，从而得到入门载体pDONR-TrGA(图2)。该cDNA序列(SEQ ID NO：4)编码TrGA信号肽、原序列和成熟蛋白质，包括催化结构域、连接区和淀粉结合结构域(SEQ ID NO：1)。SEQ ID NO：4和SEQID NO：1在图1B和1B中示出。图1C示出了前体和成熟蛋白质TrGA的结构域。
为了在里氏木霉中表达TrGA蛋白，通过重组反应将TrGA编码序列(SEQ ID NO：4)克隆进Gateway相容性目的载体pTTT-Dest(图3)中。表达载体含有源自里氏木霉cbhI的启动子和终止子区，其使得所关注的基因进行强的诱导型表达。该载体还含有构巢曲霉amdS选择性标记，其使得转化体能在作为唯一氮源的乙酰胺上生长。该表达载体还含有里氏木霉端粒区，其允许真菌细胞中非染色体质粒的维持。在pTTT-Dest目的质粒上，cbhI启动子与终止子区被旁侧为基于噬菌体λ的特异性重组位点attR1、attR2的氯霉素抗性基因CmR和致死性大肠杆菌基因ccdB分隔开。此构造使得能直接选择通过重组反应而以正确的取向含有处于cbhI调控元件控制下的TrGA基因的重组体。最终的表达载体pTTT-TrGA在图4中示出。
使用pDONR-TrGA入门载体(图2)作为模板和表2中列出的引物来构建SEL。用于诱变实验中的所有引物都在与设计用于进行突变的TrGA序列(SEQ ID NO：1)的密码子对齐的位置处含有三联体NNS(N＝A、C、T、G，且S＝C或G)，这使得能在预先选择的位置随机掺入核苷酸。每个SEL文库的构建均以pDONR-TrGA入门载体上的两个独立的PCR扩增反应开始：一个使用Gateway F(pDONR201-FW)和特异性的诱变引物R(表2)，而另一个使用Gateway引物R(pDONR201-RV)和特异性的诱变引物F(表2)。高保真PHUSION DNA聚合酶(芬兰埃斯波的Finnzymes OY公司(Finnzymes OY，Espoo，Finland))被用于包括0.2μM引物的PCR扩增反应中。根据Finnzymes提供的方案使反应进行25个循环。将所获得的PCR片段的1μl等分试样用作模板，与Gateway FW和Gateway RV引物(英杰公司)一起用于随后的融合PCR反应。在22个循环后，该PCR扩增产生了一组在特定密码子位置被随机突变的全长线性TrGA DNA片段。所述片段在两端旁侧均为Gateway-特异性attL1、attL2重组位点。用纯化试剂盒(美国卡尔斯巴德的英杰公司)将DNA片段纯化，然后根据英杰公司提供的方案，使用LR CLONASETMII酶混合物将其与100ng的pTTT-目的载体(图3)重组。将产生的重组产物转化到大肠杆菌Max Efficiency DH5α中，如供应商(英杰公司)所描述的。通过将细菌涂布接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂板(16g/L细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、10g/L细菌用酵母提取物(Difco公司)、5g/L NaCl、16g/L细菌用琼脂(Difco公司))上来选择在所需位置具有突变的最终的表达构建体pTTT-TrGA。
将来自每个文库的96个单克隆在37℃下在装有200μL含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基的MTP中培养24小时。将培养物直接用于扩增包含在其中引入了特定突变的区域的PCR片段。使用ABI3100序列分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))对所获得的特定PCR产物进行测序。每个文库含有15至19个不同的在最终表达载体中的TrGA变体。如下文所述的，将这些变体单独转化进里氏木霉中。参照被随机突变的TrGA序列中的特定氨基酸残基而将文库从1至182进行编号。
表2：用于产生TrGA SEL的引物
实施例2：将TrGA SEL转化进里氏木霉中
使用PEG原生质体方法将SEL转化进里氏木霉中。将经序列分析证实的SEL的大肠杆菌克隆在深孔微量滴定板(格瑞纳公司(Greiner)，商品号为780271)中37℃下培养过夜，该深孔微量滴定板装有1200μl含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的2×YT培养基。使用
使转化体发酵并就多种特性测试含有所表达的变体TrGA蛋白的上清液。简而言之，用表达TrGA变体的里氏木霉转化体的孢子悬浮物接种96孔过滤板(康宁公司(Corning)，商品号为3505)(超过104个孢子/孔)，一式四份，所述96孔过滤板在每个孔中含有200μl的LD-GSM培养基(5.0g/L(NH4)2SO4、33g/L 1，4-哌嗪二(丙磺酸)(pH 5.5)、9.0g/L酪蛋白氨基Plasmid Min试剂盒(Chemagen-Biopolymer Technologie AG公司，德国贝斯韦勒(Baesweiler，Germany))从培养物中分离质粒DNA，并使用有下述修改的PEG-原生质体方法等人(1987)Gene(《基因》)61：155-164)将所述质粒DNA单独转化进源自携带四个基因缺失(Δcbh1、Δcbh2、Δegl1、Δegl2，即“四重缺失的”；见美国专利No.5,847,276、WO92/06184和WO 05/001036)的RL-P37的里氏木霉宿主菌株中。
对于原生质体制备物，在木霉属基本培养基(20g/L葡萄糖、15g/LKH2PO4(pH 4.5)、5g/L(NH4)2SO4、0.6g/L MgSO4.7H2O、0.6g/LCaCl2.2H2O、1ml的1000×里氏木霉痕量元素溶液{5g/L FeSO4.7H2O、1.4g/LZnSO4.7H2O、1.6g/L MnSO4.H2O、3.7g/L CoCl2.6H2O})中，伴随150rpm的振荡，将孢子在24℃下培养16-24小时。通过离心收获萌发的孢子并用15mg/ml的β-D-葡聚糖酶-G(Interspex-商品号为0439-1)溶液处理以裂解真菌细胞壁。通过标准方法对原生质体进行进一步制备，如等人(1987，出处同上)所述。
将转化方法按比例缩小10倍。通常，用200ml的25％PEG溶液处理总体积为25μl的含有至多600ng DNA和1-5×105个原生质体的转化混合物，用2体积的1.2M山梨醇溶液稀释，与含有乙酰胺的3％选择性顶层琼脂糖MM(与上文所述相同的基本培养基，但是用20mM乙酰胺替代(NH4)2SO4)相混合，并倾倒于24孔微量滴定板中或分为48孔的20×20cm的Q-托盘中的含有乙酰胺的2％选择性琼脂糖上。将板在28℃下温育5至8天。使用0.85％NaCl、0.015％Tween 80的溶液从板上收获来自在每个单独的孔上再生的转化体总群体的孢子。将孢子悬浮物在96孔MTP中接种发酵。在24孔MTP的情形中，引入额外的在具有选择性乙酰胺MM的新鲜24孔MTP上进行涂布接种步骤以富集孢子数。
实施例3：以MTP形式使表达TrGA变体的里氏木霉转化体发酵酸、1.0g/L KH2PO4、1.0g/L CaCl2·2H2O、1.0g/L MgSO4·7H2O、2.5ml/L1000×痕量元素、20g/L葡萄糖、10g/L槐糖)。在230rpm摇动和80％湿度下将板28℃下温育6天。通过真空过滤收获培养物上清液。将上清液用于不同的测定法中来筛选具有改善特性的变体。
实施例4：由产GA转化体制备完全发酵液样品
最初在装有30ml ProFlo培养基的250ml摇瓶中预培养产TrGA转化体。Proflo培养基含有：30g/L α-乳糖、6.5g/L(NH4)2SO4、2g/L KH2PO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.2g/LCaCl2·2H2O、1ml/L如上所述的1000×痕量元素盐溶液、2ml/L 10％Tween 80、22.5g/LProFlo棉籽粉(田纳西州孟菲斯的Traders蛋白公司(Traders protein，Memphis，TN))、0.72g/L CaCO3。在28℃和140rpm下培养两天后，将10％的Proflo培养物转移到装有30ml乳糖已知成份培养基的250ml摇瓶中。所述乳糖已知成分培养基的组成如下：5g/L(NH4)2SO4、33g/L 1，4-哌嗪二(丙磺酸)缓冲液(pH 5.5)、9g/L酪蛋白氨基酸、4.5g/L KH2PO4、1.0g/LMgSO4·7H2O、5ml/L Mazu DF60-P消泡剂(MazurChemicals，IL)、1ml/L 1000×痕量元素溶液。在灭菌之后，将40ml/L的40％(w/v)乳糖溶液添加至培养基中。将装有乳糖成分确定培养基的摇瓶在28℃、140rpm下温育4-5天。
通过离心从培养物样品中移除菌丝体并就总蛋白质含量(BCA蛋白质测定试剂盒，Pierce公司，目录编号为23225)分析上清液和GA活性，如上文在测定法和方法部分中所描述的。
通过SDS-PAGE电泳测定完全发酵液样品的蛋白质谱。将培养物上清液的样品与等体积的含有还原剂的2×上样缓冲液相混合并在含有MES SDS电泳缓冲液(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)的Novex 10％Bis-Tris凝胶上分离。在含有SIMPLYBLUE SafeStain(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)的SDS凝胶中显影多肽带。
实施例5：变体的热稳定性
根据上文的测定法“热稳定性测定2”测量热稳定性。
在所描述条件下的亲本分子具有87.2％的残余活性，表3示出了从初始筛选中选出用于大规模发酵和进一步分析的变体的残余活性。所使用的材料是来自摇瓶的粗制发酵培养液。在于含有15％葡萄糖的0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.4)中63℃下温育120分钟之前和之后，基于GAU活性计算残余活性。
表3：所选择的TrGA变体的热稳定性，显示为在于含有15％葡萄糖的0.1M柠檬酸缓 冲液(pH 5.4)中63℃下温育120分钟之前和之后的残余活性。
实施例6：异麦芽糖合成和淀粉水解及其比率的测定
根据上面的测定法“淀粉水解活性”和“通过TLC测定麦芽糖和异麦芽糖合成”来测试变体。如所描述的，由这些分析的结果计算IS/SH比。表4总结了选择用于大规模发酵和进一步分析的变体的数据。所使用的材料是来自摇瓶的粗制发酵培养液。
表4：所选择的TrGA变体的异麦芽糖合成活性(IS)、淀粉水解活性(SH)和IS/SH比
实施例7：测定实际发酵度(RDF)的酿造分析
在发酵罐中培养表3和表4中所示的所有变体并收集和纯化GA酶(如上文在“TrGA变体的纯化”中所述)。如上文的实施例6中所述就IS/SH比再次分析纯化的酶并如实施例5中所述测量热稳定性。如上文在“测定实际发酵度(RDF)的酿造分析”中所述，对于显示出最佳IS/SH比和热稳定性组合的四种变体(Brew11、Brew1、Var16和Var13)进行测定实际发酵度(RDF)的酿造分析。RDF值列在表5中。
表5.所选择的纯化TrGA-变体、纯化野生型TrGA和纯化AnGA的RDF值。
以下值是用上述“纯麦芽酿造分析”方法获得的。
实施例8：组合变体的构建和表征
基于数据，对含有单个置换的所选择变体组进行进一步表征。这些变体在下列位置具有单个置换：43、44、61、73、294、417、430、431、503、511、535、539和563。在这些位点中，43、44和294在之前于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中进行的筛选实验中被鉴定出来。见WO 08/045489，其在此以引用的方式并入本文。从大规模发酵中纯化变体，并测定热稳定性和比活性的PI。具体地讲，使用多种底物(包括DP7、玉米淀粉和液化物)来测定比活性。结果示于表6中。
表6：所选择的单位点变体组的PI，其中的每一者都是从500ml发酵获得的。
变体 P.I.DP7-FPLC P.I.玉米淀粉-FPLC P.I.热稳定性y P.I.液化物-FPLC
N61I 1.16 1.35 1.00 1.66
A431L 1.15 1.38 1.18 1.51
L417V 1.18 1.32 1.02 1.40
A431Q 1.06 1.20 0.92 1.24
G294C 1.01 0.84 0.94 1.23
N563K 1.07 1.12 1.97 1.15
Q511H 1.05 1.09 1.52 1.13
T430M 1.05 1.15 0.89 1.09
E503A 1.08 1.16 1.40 1.09
I43Q 1.11 1.24 0.94 1.08
A539R 1.15 1.37 1.43 1.08
I43R 1.03 1.07 1.41 1.07
L417R 1.23 1.27 1.51 1.04
变体 P.I.DP7-FPLC P.I.玉米淀粉-FPLC P.I.热稳定性y P.I.液化物-FPLC
T430A 1.13 1.35 1.23 1.04
G73F 1.06 1.06 1.45 1.03
D44R 0.97 1.06 1.46 0.98
N563I 1.09 1.22 2.06 0.92
D44C 0.80 0.82 0.96 0.91
E503V 1.17 1.07 1.66 0.88
A535R 1.09 1.44 1.47 0.85
此外，使用PCR方法构建了组合变体，其具有下列中的置换：43、44、61、73、294、417、430、431、503、511、535、539和563。简而言之，使用质粒pDONR-TrGA(图2)作为骨架来构建组合变体。构建组合变体的方法是基于Gateway技术(加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司)。用于产生组合变体的引物在表2和表7中示出。选择下列合成构建体方法用于构建所有的组合变体。
CTCTCT[XbaI位点][MF]GAGAGGGG[attB1][GAP组合变体][attB2位点]CCCCAGAG[MR][HindIII]AGAGAG
用限制性酶Xba-I和HindIII处理该构建体。将经消化的片段连接进Xba-I/HindIII处理过的pBC(源自pUC19的载体)中。将连接混合物转化进大肠杆菌DH10B(加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司)中并涂布接种于补充有100μg/ml氨苄青霉素的选择性琼脂上。将板在37℃下温育16小时。从该选择性平板分离菌落并将其接种到选择性液体培养基中。在37℃和250rpm下温育16小时后，使用标准质粒分离试剂盒分离质粒并与pDONR2.21(加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司)组合而产生含有特定组合变体的Gateway入门载体。将反应混合物转化进大肠杆菌Max efficiencyDH5α(加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司)中并涂布接种于选择性琼脂(补充有50μg卡那霉素/ml的2×TY)上。于37℃过夜温育之后，挑取单菌落用于序列分析(BaseClear B.V.公司，荷兰莱顿(Leiden，Netherlands))。将组合变体亚克隆进pTrexTrTel中并在里氏木霉宿主菌株中表达，如WO06/060062中所述。
表7：用于构建组合变体的引物
从大规模发酵(即100ml或500ml发酵)中纯化变体，并测定热稳定性(Ts)和比活性的PI。具体地讲，使用不同的底物测定比活性，所述底物包括DP2、DP3、DP4、DP5、DP6、DP7、玉米淀粉(CS)和液化物(Liq)。PI在表8中给出。表8中的“N/D”代表“没有进行”。
实施例9：TrGA和AaGA之间的同源性
将WO2009/067218(美国丹尼斯科公司，杰能科分公司)第89-93页的实施例11(在此以引用的方式并入本文)中鉴别的TrGA的晶体结构叠合在之前所鉴定的泡盛曲霉GA(AaGA)的晶体结构上。AaGA晶体结构从蛋白质数据库(PDB)获得并且结晶的AaGA形式是仅含有催化结构域的形式(PDB登录号：1GLM)。所有三个区完整的TrGA的结构在本文中测定至1.8埃的分辨率(见WO2009/067218(美国丹尼斯科公司，杰能科分公司)中94-216页的表20(在此以引用的方式并入本文)和WO2009/067218(美国丹尼斯科公司，杰能科分公司)第89-93页的实施例11(在此以引用的方式并入本文))。利用该坐标(见WO2009/067218(美国丹尼斯科公司，杰能科分公司)中94-216页的表20(在此以引用的方式并入本文))，将结构与之前所测定(Aleshin等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)238：575-591(1994))的泡盛曲霉菌株X100的催化结构域的坐标进行比对。如图6-7中所见，所述催化结构域的结构非常紧密地重合，使得能基于结构叠合鉴别出等价的残基。
基于该分析，鉴别出了TrGA中可被突变并产生增加的热稳定性和/或比活性的位点。这些位点包括活性位点处的108、124、175和316。还鉴别的是特定的成对变体Y47W/Y315F和Y47F/Y315W。鉴别出的其它位点是I43、D44、P45、D46、R122、R125、V181、E242、Y310、D313、V314、N317、R408和N409。因为高的结构同源性，预期在TrGA的位点处发现的有益变体在泡盛曲霉和其它同源性葡糖淀粉酶中将具有相似的效果。
TrGA连接区(残基454-490)定义为跨越两个二硫桥(一个在残基222和453之间，一个在残基491和587之间)之间的区域的区段。该连接区中的残基中的九个是脯氨酸。从晶体结构来看，该连接区以宽的弧形从分子后方伸出，随后在接近底物结合表面的表面上的赖氨酸477残基后突然扭转。连接区作为无规卷曲延伸，其通过Tyr452、Pro465、Phe470、Gln474、Pro475、Lys477、Val480以及Tyr486的侧链的相互作用而锚定至催化结构域表面上的区域。
淀粉结合结构域由两个扭转的β片层的β-夹心构成，所述β片层在一端由Cys 491与Cys 587之间的二硫桥系连，而在另一端，具有一系列环，包含通过长的环连接的淀粉结合位点。TrGA SBD的结构与通过NMR测定的AnGA SBD的平均结构(Sorimachi等人，Stucture(《结构》)5：647-661(1997))以及蜡状芽孢杆菌β淀粉酶的SBD结构(Mikami等人，Biochemistry(《生物化学》)38：7050-61(1999))十分相似。图9示出了AnGA与包括SBD的TrGA晶体结构的比对。当以这些SBD中的一者或两者进行比对时，一个环突出为高度可变的，对应于残基537-543(在黑曲霉中该环为554-560，而在蜡状芽孢杆菌中该环为462-465)。在β-环糊精的NMR结构中，淀粉类似物与AnGA的SBD相复合(Sorimachi等人(1997)(出处同上))，在与环糊精结合后，该环发生实质地移位。因此，该环被称为“柔性环”。该柔性环形成“结合位点2”的一部分(关于TrGA中的该结合位点，参见图9)。在AnGA中还鉴别了第二个结合位点(结合位点1)，其为与其它碳水化合物结合蛋白享有相似性的主要位点。总体而言，这些SBD的结合位点1中残基甚至侧构象的保守性非常高。附图显示了SBD与催化结构域之间这些结合位点中的相互作用，用于结合淀粉。
总的来看，对于连接区和SBD与催化结构域之间的相互作用，似乎存在共有的模式。该相互作用是以与相邻结构域的表面区域相互作用的锚定侧链的形式。通常，锚定残基存在于连接区区段上。在CD与SBD之间的相互作用的情形中，锚定残基可由任一结构域贡献，如就来自CD的残基Ile43和Phe 29或来自SBD的残基592而言。
实施例10：阿卡波糖与TrGA结合的模型
已测定了与抑制剂阿卡波糖形成复合物的TrGA的晶体结构。通过使预生长的天然TrGA晶体在阿卡波糖中浸泡而获得该复合物的晶体。浸泡3天后，将晶体装在密封的玻璃毛细管中并用Rigaku Raxis IV++成像板探测器以的分辨率采集x射线衍射。将坐标拟合至差值电子密度图。将该模型精修至R因子为0.154，总共41276个反射(代表在27至分辨率之间所收集的所有数据)的R-free为0.201。所得到的精修结构的模型在图9中示出。
基于SBD的存在对于不可溶淀粉的水解有影响的知识，由此得出结论SBD与较大的淀粉分子之间应存在相互作用。因此，将TrGA的结构与下列已知结构进行比较：(1)结合了阿卡波糖的AaGA的CD和(2)与β-环糊精复合的来自黑曲霉的SBD。这显示，在结合位点2结合的β-环糊精接近底物的位置，如结合至泡盛曲霉CD的阿卡波糖的位置所指示的。因此，将来自AaGA结构模型的阿卡波糖的坐标(pdb登记号为1GAI，Aleshin等人，1994(出处同上))比对到TrGA活性位点中。此外，比对了与环糊精结合的AnGA SBD结构(pdb登录号为1AC0：Sorimachi等人，1997(出处同上)。由此，制成了结合至TrGA的阿卡波糖的模型(见图9)。此模型显示，SBD将使TrGA CD定位在接近断裂的淀粉处，并且还防止水解后将产物从活性位点释放时酶从底物散开。TrGA的SBD将沿着位点1结合淀粉，并且其优选这样的定位：断裂的片段可结合至松散末端中的位点2，所述松散末端指向催化位点(催化结构域的活性侧)内。该模型显示出SBD和连接区的结构如何促成所提出的酶功能。涉及CD、连接区和SBD之间的特异性相互作用的氨基酸侧链对于里氏木霉GA是特异性的，然而，在其它葡糖淀粉酶中，互补的序列变化将使得能够产生类似的总体相互作用和结构域毗连。
基于该模型，鉴别了TrGA SBD中可进行置换以产生增加的稳定性和/或比活性的位点。因此，结合位点1的一部分的两个环很可能是用于更改以增加或降低与较大淀粉分子的结合的候选者。这些是环1(aa 560-570)和环2(aa 523-527)。因为氨基酸525和572处的两个Trp(色氨酸)残基有可能直接涉及淀粉结合，改变它们将不是有益的。然而，下面的残基(包括516-518)，以及下面的残基558-562将是有益的。残基570-578的环也是用于更改的良好候选者。残基534-541是结合位点2中与CD上的催化位点相互作用的一部分。因此，这些可能是可增加或降低比活性的更改的良好候选者。
由于TrGA SBD的高的结构同源性，预计里氏木霉GA中的位点处发现的有益变体将在泡盛曲霉和其它同源性葡糖淀粉酶中有相似的影响。因此，TrGA SBD的结构为对这种酶和相关的酶进行工程改造以与亲本葡糖淀粉酶相比具有改变的特性提供了基础。这些改变的特性对于基于淀粉原料的燃料产生中的工艺可能是有利的。
实施例11
使用的酶：
具有突变D44R和A539R的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的纯化变体。在里氏木霉中表达变体，在下文中称为BRW 1。来自黑曲霉发酵的葡糖淀粉酶产品以商品名销售。在地衣芽孢杆菌中表达的来自Bacillus deramnificans的支链淀粉酶产品以商品名销售。在里氏木霉中表达的来自白曲霉的酸性α-淀粉酶产品以商品名GC626销售。
结果：
下面的表9示出了使用上述“麦芽-添加物酿造分析”方法，以葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和α-淀粉酶的不同组合获得的RDF值。如上所述测量葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和α-淀粉酶活性。对于每个剂量一式三份地进行。列出了平均的RDF和标准偏差。对于葡糖淀粉酶，列出了每千克谷粉所添加的葡糖淀粉酶的量。另外，列出了对应的活性，单位为GAU/kg谷粉。对于α-淀粉酶和支链淀粉酶，列出了每千克谷粉所添加的酶单位数以及对应的每千克谷粉所添加的酶产品(分别是GC626和的量。也含有一些α-淀粉酶活性。该表中还列出了当量配该产品时所添加的α-淀粉酶的单位数。
从表9剂量2和3看出，在获得的RDF方面，BRW1比TrGA表现更好。这与BRW1变体具有更低水平的回复活性(reversion activity)这个事实很好地相关。当以每千克谷粉1022mg葡糖淀粉酶量配时，BRW1与表现相当(比较剂量1和3)。注意，中的葡糖淀粉酶(黑曲霉葡糖淀粉酶)和BRW1葡糖淀粉酶具有相似的回复活性水平。中存在的α-淀粉酶活性可能意味着所获得的RDF值稍高于纯黑曲霉葡糖淀粉酶将给出的RDF值。这仅强调BRW1分子如果表现不是好于黑曲霉葡糖淀粉酶的话，也是表现一样好。
当BRW1的剂量由每千克谷粉1022mg倍增至2044mg时，RDF值由83.2增加至84.8(比较剂量3和4)。通过添加辅助酶也可增加RDF值。当将BRW1与28172SSU/kg谷粉的α-淀粉酶和1961PU/kg谷粉的支链淀粉酶组合时，RDF值由83.2增加值84.1(比较剂量3和5)。在高剂量的BRW1(2044mg/kg谷粉)下，添加辅助酶也有有益效果，但不像使用低剂量的BRW1时这么明显(比较剂量3和5与剂量4和6之间的RDF差异)。
序列
如下为序列，以引用的方式将其全部并入本文。
SEQ ID NO：1：里氏木霉葡糖淀粉酶，全长；带信号肽
<210>1
<211>632
<212>PRT
<213>里氏木霉
<400>1
Met His Val Leu Ser Thr Ala Val Leu Leu Gly Ser Val Ala Val Gln
1 5 10 15
Lys Val Leu Gly Arg Pro Gly Ser Ser Gly Leu Ser Asp Val Thr Lys
20 25 30
Arg Ser Val Asp Asp Phe Ile Ser Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Asn
35 40 45
Asn Leu Leu Cys Asn Val Gly Pro Asp Gly Cys Arg Ala Phe Gly Thr
50 55 60
Ser Ala Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ile Asp Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Tyr Tyr Met Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Phe Lys Asn Leu Ile
85 90 95
Asp Arg Phe Thr Glu Thr Tyr Asp Ala Gly Leu Gln Arg Arg Ile Glu
100 105 110
Gln Tyr Ile Thr Ala Gln Val Thr Leu Gln Gly Leu Ser Asn Pro Ser
115 120 125
Gly Ser Leu Ala Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Leu
130 135 140
Thr Leu Lys Pro Phe Thr Gly Asn Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly
145 150 155 160
Pro Ala Leu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Gly Tyr Ser Lys Trp Leu Ile
165 170 175
Asn Asn Asn Tyr Gln Ser Thr Val Ser Asn Val Ile Trp Pro Ile Val
180 185 190
Arg Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Phe
195 200 205
Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Val Ala Asn
210 215 220
Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Leu Gly
225 230 235 240
Gln Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Ser Val Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe
245 250 255
Leu Gln Arg Phe Trp Val Ser Ser Gly Gly Tyr Val Asp Ser Asn Ile
260 265 270
Asn Thr Asn Glu Gly Arg Thr Gly Lys Asp Val Asn Ser Val Leu Thr
275 280 285
Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Asn Leu Gly Cys Asp Ala Gly Thr Phe
290 295 300
Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Gly Val Asn Lys Gly Ile Pro Ala Gly Ala
325 330 335
Ala Val Ala Ile Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val Tyr Tyr Asn Gly Asn
340 345 350
Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Phe Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala
355 360 365
Ile Tyr Val Trp Lys Lys Thr Gly Ser Ile Thr Val Thr Ala Thr Ser
370 375 380
Leu Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Ala Gly Thr Tyr
385 390 395 400
Ser Ser Ser Ser Ser Thr Phe Thr Asn Ile Ile Asn Ala Val Ser Thr
405 410 415
Tyr Ala Asp Gly Phe Leu Ser Glu Ala Ala Lys Tyr Val Pro Ala Asp
420 425 430
Gly Ser Leu Ala Glu Gln Phe Asp Arg Asn Ser Gly Thr Pro Leu Ser
435 440 445
Ala Leu His Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Ala
450 455 460
Arg Arg Ala Gly Ile Val Pro Pro Ser Trp Ala Asn Ser Ser Ala Ser
465 470 475 480
Thr Ile Pro Ser Thr Cys Ser Gly Ala Ser Val Val Gly Ser Tyr Ser
485 490 495
Arg Pro Thr Ala Thr Ser Phe Pro Pro Ser Gln Thr Pro Lys Pro Gly
500 505 510
Val Pro Ser Gly Thr Pro Tyr Thr Pro Leu Pro Cys Ala Thr Pro Thr
515 520 525
Ser Val Ala Val Thr Phe His Glu Leu Val Ser Thr Gln Phe Gly Gln
530 535 540
Thr Val Lys Val Ala Gly Asn Ala Ala Ala Leu Gly Asn Trp Ser Thr
545 550 555 560
Ser Ala Ala Val Ala Leu Asp Ala Val Asn Tyr Ala Asp Asn His Pro
565 570 575
Leu Trp Ile Gly Thr Val Asn Leu Glu Ala Gly Asp Val Val Glu Tyr
580 585 590
Lys Tyr Ile Asn Val Gly Gln Asp Gly Ser Val Thr Trp Glu Ser Asp
595 600 605
Pro Asn His Thr Tyr Thr Val Pro Ala Val Ala Cys Val Thr Gln Val
610 615 620
Val Lys Glu Asp Thr Trp Gln Ser
625 630
SEQ ID NO：2：里氏木霉葡糖淀粉酶，成熟蛋白质；不带信号肽
<210>2
<211>599
<212>PRT
<213>里氏木霉
<400>2
Ser Val Asp Asp Phe Ile Ser Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Asn Asn
1 5 10 15
Leu Leu Cys Asn Val Gly Pro Asp Gly Cys Arg Ala Phe Gly Thr Ser
20 25 30
Ala Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ile Asp Pro Asp Tyr Tyr
35 40 45
Tyr Met Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Phe Lys Asn Leu Ile Asp
50 55 60
Arg Phe Thr Glu Thr Tyr Asp Ala Gly Leu Gln Arg Arg Ile Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Ile Thr Ala Gln Val Thr Leu Gln Gly Leu Ser Asn Pro Ser Gly
85 90 95
Ser Leu Ala Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Leu Thr
100 105 110
Leu Lys Pro Phe Thr Gly Asn Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Gly Tyr Ser Lys Trp Leu Ile Asn
130 135 140
Asn Asn Tyr Gln Ser Thr Val Ser Asn Val Ile Trp Pro Ile Val Arg
145 150 155 160
Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Phe Asp
165 170 175
Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Val Ala Asn Gln
180 185 190
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Leu Gly Gln
195 200 205
Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Ser Val Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu
210 215 220
Gln Arg Phe Trp Val Ser Ser Gly Gly Tyr Val Asp Ser Asn Ile Asn
225 230 235 240
Thr Asn Glu Gly Arg Thr Gly Lys Asp Val Asn Ser Val Leu Thr Ser
245 250 255
Ile His Thr Phe Asp Pro Asn Leu Gly Cys Asp Ala Gly Thr Phe Gln
260 265 270
Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Val Val Asp Ser
275 280 285
Phe Arg Ser Ile Tyr Gly Val Asn Lys Gly Ile Pro Ala Gly Ala Ala
290 295 300
Val Ala Ile Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro
305 310 315 320
Trp Tyr Leu Ala Thr Phe Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Tyr Val Trp Lys Lys Thr Gly Ser Ile Thr Val Thr Ala Thr Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Ala Gly Thr Tyr Ser
355 360 365
Ser Ser Ser Ser Thr Phe Thr Asn Ile Ile Asn Ala Val Ser Thr Tyr
370 375 380
Ala Asp Gly Phe Leu Ser Glu Ala Ala Lys Tyr Val Pro Ala Asp Gly
385 390 395 400
Ser Leu Ala Glu Gln Phe Asp Arg Asn Ser Gly Thr Pro Leu Ser Ala
405 410 415
Leu His Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Ala Arg
420 425 430
Arg Ala Gly Ile Val Pro Pro Ser Trp Ala Asn Ser Ser Ala Ser Thr
435 440 445
Ile Pro Ser Thr Cys Ser Gly Ala Ser Val Val Gly Ser Tyr Ser Arg
450 455 460
Pro Thr Ala Thr Ser Phe Pro Pro Ser Gln Thr Pro Lys Pro Gly Val
465 470 475 480
Pro Ser Gly Thr Pro Tyr Thr Pro Leu Pro Cys Ala Thr Pro Thr Ser
485 490 495
Val Ala Val Thr Phe His Glu Leu Val Ser Thr Gln Phe Gly Gln Thr
500 505 510
Val Lys Val Ala Gly Asn Ala Ala Ala Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ser
515 520 525
Ala Ala Val Ala Leu Asp Ala Val Asn Tyr Ala Asp Asn His Pro Leu
530 535 540
Trp Ile Gly Thr Val Asn Leu Glu Ala Gly Asp Val Val Glu Tyr Lys
545 550 555 560
Tyr Ile Asn Val Gly Gln Asp Gly Ser Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro
565 570 575
Asn His Thr Tyr Thr Val Pro Ala Val Ala Cys Val Thr Gln Val Val
580 585 590
Lys Glu Asp Thr Trp Gln Ser
595
SEQ ID N0：3：里氏木霉葡糖淀粉酶催化结构域，成熟TrGA的1-453，CD
<210>3
<211>453
<212>PRT
<213>里氏木霉
<400>3
Ser Val Asp Asp Phe Ile Ser Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Asn Asn
1 5 10 15
Leu Leu Cys Asn Val Gly Pro Asp Gly Cys Arg Ala Phe Gly Thr Ser
20 25 30
Ala Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ile Asp Pro Asp Tyr Tyr
35 40 45
Tyr Met Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Phe Lys Asn Leu Ile Asp
50 55 60
Arg Phe Thr Glu Thr Tyr Asp Ala Gly Leu Gln Arg Arg Ile Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Ile Thr Ala Gln Val Thr Leu Gln Gly Leu Ser Asn Pro Ser Gly
85 90 95
Ser Leu Ala Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Leu Thr
100 105 110
Leu Lys Pro Phe Thr Gly Asn Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Gly Tyr Ser Lys Trp Leu Ile Asn
130 135 140
Asn Asn Tyr Gln Ser Thr Val Ser Asn Val Ile Trp Pro Ile Val Arg
145 150 155 160
Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Phe Asp
165 170 175
Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Val Ala Asn Gln
180 185 190
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Leu Gly Gln
195 200 205
Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Ser Val Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu
210 215 220
Gln Arg Phe Trp Val Ser Ser Gly Gly Tyr Val Asp Ser Asn Ile Asn
225 230 235 240
Thr Asn Glu Gly Arg Thr Gly Lys Asp Val Asn Ser Val Leu Thr Ser
245 250 255
Ile His Thr Phe Asp Pro Asn Leu Gly Cys Asp Ala Gly Thr Phe Gln
260 2652 70
Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Val Val Asp Ser
275 280 285
Phe Arg Ser Ile Tyr Gly Val Asn Lys Gly Ile Pro Ala Gly Ala Ala
290 295 300
Val Ala Ile Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro
305 310 315 320
Trp Tyr Leu Ala Thr Phe Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Tyr Val Trp Lys Lys Thr Gly Ser Ile Thr Val Thr Ala Thr Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Ala Gly Thr Tyr Ser
355 360 365
Ser Ser Ser Ser Thr Phe Thr Asn Ile Ile Asn Ala Val Ser Thr Tyr
370 375 380
Ala Asp Gly Phe Leu Ser Glu Ala Ala Lys Tyr Val Pro Ala Asp Gly
385 390 395 400
Ser Leu Ala Glu Gln Phe Asp Arg Asn Ser Gly Thr Pro Leu Ser Ala
405 410 415
Leu His Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Ala Arg
420 425 430
Arg Ala Gly Ile Val Pro Pro Ser Trp Ala Asn Ser Ser Ala Ser Thr
435 440 445
Ile Pro Ser Thr Cys
450
SEQ ID NO：4：里氏木霉葡糖淀粉酶cDNA
<210>4
<211>1899
<212>DNA
<213>里氏木霉
<400>4
atgcacgtcc tgtcgactgc ggtgctgctc ggctccgttg ccgttcaaaa ggtcctggga 60
agaccaggat caagcggtct gtccgacgtc accaagaggt ctgttgacga cttcatcagc 120
accgagacgc ctattgcact gaacaatctt ctttgcaatg ttggtcctga tggatgccgt 180
gcattcggca catcagctgg tgcggtgatt gcatctccca gcacaattga cccggactac 240
tattacatgt ggacgcgaga tagcgctctt gtcttcaaga acctcatcga ccgcttcacc 300
gaaacgtacg atgcgggcct gcagcgccgc atcgagcagt acattactgc ccaggtcact 360
ctccagggcc tctctaaccc ctcgggctcc ctcgcggacg gctctggtct cggcgagccc 420
aagtttgagt tgaccctgaa gcctttcacc ggcaactggg gtcgaccgca gcgggatggc 480
ccagctctgc gagccattgc cttgattgga tactcaaagt ggctcatcaa caacaactat 540
cagtcgactg tgtccaacgt catctggcct attgtgcgca acgacctcaa ctatgttgcc 600
cagtactgga accaaaccgg ctttgacctc tgggaagaag tcaatgggag ctcattcttt 660
actgttgcca accagcaccg agcacttgtc gagggcgcca ctcttgctgc cactcttggc 720
cagtcgggaa gcgcttattc atctgttgct ccccaggttt tgtgctttct ccaacgattc 780
tgggtgtcgt ctggtggata cgtcgactcc aacatcaaca ccaacgaggg caggactggc 840
aaggatgtca actccgtcct gacttccatc cacaccttcg atcccaacct tggctgtgac 900
gcaggcacct tccagccatg cagtgacaaa gcgctctcca acctcaaggt tgttgtcgac 960
tccttccgct ccatctacgg cgtgaacaag ggcattcctg ccggtgctgc cgtcgccatt1020
ggccggtatg cagaggatgt gtactacaac ggcaaccctt ggtatcttgc tacatttgct1080
gctgccgagc agctgtacga tgccatctac gtctggaaga agacgggctc catcacggtg1140
accgccacct ccctggcctt cttccaggag cttgttcctg gcgtgacggc cgggacctac1200
tccagcagct cttcgacctt taccaacatc atcaacgccg tctcgacata cgccgatggc1260
ttcctcagcg aggctgccaa gtacgtcccc gccgacggtt cgctggccga gcagtttgac1320
cgcaacagcg gcactccgct gtctgcgctt cacctgacgt ggtcgtacgc ctcgttcttg1380
acagccacgg cccgtcgggc tggcatcgtg cccccctcgt gggccaacag cagcgctagc1440
acgatcccct cgacgtgctc cggcgcgtcc gtggtcggat cctactcgcg tcccaccgcc1500
acgtcattcc ctccgtcgca gacgcccaag cctggcgtgc cttccggtac tccctacacg1560
cccctgccct gcgcgacccc aacctccgtg gccgtcacct tccacgagct cgtgtcgaca1620
cagtttggcc agacggtcaa ggtggcgggc aacgccgcgg ccctgggcaa ctggagcacg1680
agcgccgccg tggctctgga cgccgtcaac tatgccgata accaccccct gtggattggg1740
acggtcaacc tcgaggctgg agacgtcgtg gagtacaagt acatcaatgt gggccaagat1800
ggctccgtga cctgggagag tgatcccaac cacacttaca cggttcctgc ggtggcttgt1860
gtgacgcagg ttgtcaagga ggacacctgg cagtcgtaa 1899
SEQ ID NO：5：泡盛曲霉GA(AaGA)；CD
<210>5
<211>448
<212>PRT
<213>泡盛曲霉
<400>5
Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr
1 5 10 15
Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala
20 25 30
Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr
35 40 45
Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Gly Leu Val Ile Lys Thr Leu Val
50 55 60
Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr Asp Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Ser Gln Ala Ile Val Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly
85 90 95
Asp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu
100 105 110
Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala
115 120 125
Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Gly Phe Arg Gln Trp Leu Leu Asp Asn
130 135 140
Gly Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Glu Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn
145 150 155 160
Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu
165 170 175
Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His
180 185 190
Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser
195 200 205
Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln Ala Pro Gln Ile Leu Cys Tyr Leu Gln
210 215 220
Ser Phe Trp Thr Gly Glu Tyr Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg
225 230 235 240
Ser Gly Lys Asp Thr Asn Thr Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp
245 250 255
Pro Glu Ala Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg
260 265 270
Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr
275 280 285
Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg
290 295 300
Tyr Pro Lys Asp Ser Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr
305 310 315 320
Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys
325 330 335
Gln Gly Ser Leu Glu Ile Thr Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Gln Ala
340 345 350
Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr
355 360 365
Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val
370 375 380
Ser Ile Val Glu Thr His Ala Ala Ser Asn Gly Ser Leu Ser Glu Gln
385 390 395 400
Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Asp Glu Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp
405 410 415
Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Met
420 425 430
Pro Pro Ser Trp Gly Glu Thr Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys
435 440 445
SEQ ID NO：6：黑曲霉(AnGA)，CD
<210>6
<211>449
<212>PRT
<213>黑曲霉
<400>6
Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr
1 5 10 15
Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala
20 25 30
Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr
35 40 45
Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val
50 55 60
Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly
85 90 95
Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp
100 105 110
Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp
130 135 140
Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg
145 150 155 160
Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp
165 170 175
Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln
180 185 190
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser
195 200 205
Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser
225 230 235 240
Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe
245 250 255
Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro
260 265 270
Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile
275 280 285
Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly
290 295 300
Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys
305 310 315 320
Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp
325 330 335
Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys
340 345 350
Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser
355 360 365
Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe
370 375 380
Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu
385 390 395 400
Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr
405 410 415
Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val
420 425 430
Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr
435 440 445
Cys
SEQ ID NO：7：米曲霉(AoGA)，CD
<210>7
<211>450
<212>PRT
<213>米曲霉
<400>7
Gln Ser Asp Leu Asn Ala Phe Ile Glu Ala Gln Thr Pro Ile Ala Lys
1 5 10 15
Gln Gly Tyr Leu Asn Asn Ile Gly Ala Asp Gly Lys Leu Val Glu Gly
20 25 30
Ala Ala Ala Gly Ile Val Tyr Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asn Pro Asp
35 40 45
Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Gly Leu Thr Met Glu Glu Tyr
50 55 60
Ile Glu Gln Phe Ile Gly Gly Asp Ala Thr Leu Glu Ser Thr Ile Gln
65 70 75 80
Asn Tyr Val Asp Ser Gln Ala Asn Glu Gln Ala Val Ser Asn Pro Ser
85 90 95
Gly Gly Leu Ser Asp Gly Ser Gly Leu Ala Glu Pro Lys Phe Tyr Tyr
100 105 110
Asn Ile Ser Gln Phe Thr Asp Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly
115 120 125
Pro Ala Leu Arg Ala Ser Ala Leu Ile Ala Tyr Gly Asn Ser Leu Ile
130 135 140
Ser Ser Asp Lys Gln Ser Val Val Lys Ala Asn Ile Trp Pro Ile Tyr
145 150 155 160
Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Val Gly Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Phe
165 170 175
Asp Leu Trp Glu Glu Val Gln Gly Ser Ser Phe Phe Thr Val Ala Val
180 185 190
Gln His Lys Ala Leu Val Glu Gly Asp Ala Phe Ala Lys Ala Leu Gly
195 200 205
Glu Glu Cys Gln Ala Cys Ser Val Ala Pro Gln Ile Leu Cys His Leu
210 215 220
Gln Asp Phe Trp Asn Gly Ser Ala Val Leu Ser Asn Leu Pro Thr Asn
225 230 235 240
Gly Arg Ser Gly Leu Asp Thr Asn Ser Leu Leu Gly Ser Ile His Thr
245 250 255
Phe Asp Pro Ala Ala Ala Cys Asp Asp Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser
260 265 270
Ser Arg Ala Leu Ser Asn His Lys Leu Val Val Asp Ser Phe Arg Ser
275 280 285
Val Tyr Gly Ile Asn Asn Gly Arg Gly Ala Gly Lys Ala Ala Ala Val
290 295 300
Gly Pro Tyr Ala Glu Asp Thr Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu
305 310 315 320
Thr Thr Leu Val Ala Ala Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp
325 330 335
Asp Lys Gln Gly Gln Val Asn Val Thr Glu Thr Ser Leu Pro Phe Phe
340 345 350
Lys Asp Leu Ser Ser Asn Val Thr Thr Gly Ser Tyr Ala Lys Ser Ser
355 360 365
Ser Ala Tyr Glu Ser Leu Thr Ser Ala Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly
370 375 380
Phe Ile Ser Val Val Gln Glu Tyr Thr Pro Asp Gly Gly Ala Leu Ala
385 390 395 400
Glu Gln Tyr Ser Arg Asp Gln Gly Thr Pro Val Ser Ala Ser Asp Leu
405 410 415
Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Phe Leu Ser Ala Val Gly Arg Arg Asn Gly
420 425 430
Thr Val Pro Ala Ser Trp Gly Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val Pro Ser
435 440 445
Gln Cys
450
SEQ ID NO：8：灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)；CD
<210>8
<211>441
<212>PRT
<213>灰腐质霉
<400>8
Ala Ala Val Asp Thr Phe Ile Asn Thr Glu Lys Pro Ile Ala Trp Asn
1 5 10 15
Lys Leu Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Lys Ala Ala Pro Gly Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser Arg Thr Asp Pro Pro Tyr
35 40 45
Phe Phe Thr Trp Thr Pro Asp Ala Ala Leu Val Leu Thr Gly Ile Ile
50 55 60
Glu Ser Leu Gly His Asn Tyr Asn Thr Thr Leu Gln Gln Val Ser Asn
65 70 75 80
Pro Ser Gly Thr Phe Ala Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Ala Lys Phe
85 90 95
Asn Val Asp Leu Thr Ala Phe Thr Gly Glu Trp Gly Arg Pro Gln Arg
100 105 110
Asp Gly Pro Pro Leu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Gln Tyr Ala Lys Trp
115 120 125
Leu Ile Ala Asn Gly Tyr Lys Ser Thr Ala Lys Ser Val Val Trp Pro
130 135 140
Val Val Lys Asn Asp Leu Ala Tyr Thr Ala Gln Tyr Trp Asn Glu Thr
145 150 155 160
Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Pro Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile
165 170 175
Ala Ser Ser His Arg Ala Leu Thr Glu Gly Ala Tyr Leu Ala Ala Gln
180 185 190
Leu Asp Thr Glu Cys Pro Pro Cys Thr Thr Val Ala Pro Gln Val Leu
195 200 205
Cys Phe Gln Gln Ala Phe Trp Asn Ser Lys Gly Asn Tyr Val Val Ser
210 215 220
Thr Ser Thr Ala Gly Glu Tyr Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Ser Ile
225 230 235 240
Leu Ala Ser Ile His Asn Phe Asp Pro Glu Ala Gly Cys Asp Asn Leu
245 250 255
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Glu Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Ala Tyr
260 265 270
Val Asp Ser Phe Arg Asn Leu Tyr Ala Ile Asn Lys Gly Ile Ala Gln
275 280 285
Gly Lys Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Ser Glu Asp Val Tyr Tyr Asn
290 295 300
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Asn Phe Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr
305 310 315 320
Asp Ala Ile Tyr Val Trp Asn Lys Gln Gly Ser Ile Thr Val Thr Ser
325 330 335
Val Ser Leu Pro Phe Phe Arg Asp Leu Val Ser Ser Val Ser Thr Gly
340 345 350
Thr Tyr Ser Lys Ser Ser Ser Thr Phe Thr Asn Ile Val Asn Ala Val
355 360 365
Lys Ala Tyr Ala Asp Gly Phe Ile Glu Val Ala Ala Lys Tyr Thr Pro
370 375 380
Ser Asn Gly Ala Leu Ala Glu Gln Tyr Asp Arg Asn Thr Gly Lys Pro
385 390 395 400
Asp Ser Ala Ala Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ser Ala Phe Leu Ser Ala
405 410 415
Ile Asp Arg Arg Ala Gly Leu Val Pro Pro Ser Trp Arg Ala Ser Val
420 425 430
Ala Lys Ser Gln Leu Pro Ser Thr Cys
435 440
SEQ ID NO：9：酒色肉座菌葡糖淀粉酶(HvGA)；CD
<210>9
<211>452
<212>PRT
<213>酒色肉座菌
<400>9
Ser Val Asp Asp Phe Ile Asn Thr Gln Thr Pro Ile Ala Leu Asn Asn
1 5 10 15
Leu Leu Cys Asn Val Gly Pro Asp Gly Cys Arg Ala Phe Gly Thr Ser
20 25 30
Ala Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Asp Tyr Tyr
35 40 45
Tyr Met Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Phe Lys Asn Ile Val Asp
50 55 60
Arg Phe Thr Gln Gln Tyr Asp Ala Gly Leu Gln Arg Arg Ile Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Ala Gln Val Thr Leu Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly
85 90 95
Ser Leu Ser Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Leu Thr
100 105 110
Leu Ser Gln Phe Thr Gly Asn Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Gly Tyr Ser Lys Trp Leu Ile Asn
130 135 140
Asn Asn Tyr Gln Ser Thr Val Ser Asn Ile Ile Trp Pro Ile Val Arg
145 150 155 160
Asn Asp Leu Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Phe Asp
165 170 175
Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Val Ala Asn Gln
180 185 190
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Leu Gly Gln
195 200 205
Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Ser Val Ala Pro Gln Ile Leu Cys Phe Leu
210 215 220
Gln Arg Phe Trp Val Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Ser Asn Ile Asn Thr
225 230 235 240
Asn Glu Gly Arg Thr Gly Lys Asp Ala Asn Ser Leu Leu Ala Ser Ile
245 250 255
His Thr Phe Asp Pro Ser Leu Gly Cys Asp Ala Ser Thr Phe Gln Pro
260 265 270
Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Val Val Asp Ser Phe
275 280 285
Arg Ser Ile Tyr Gly Val Asn Lys Gly Ile Pro Ala Gly Ser Ala Val
290 295 300
Ala Ile Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Phe Asn Gly Asn Pro Trp
305 310 315 320
Tyr Leu Ala Thr Phe Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ser Val Tyr
325 330 335
Val Trp Lys Lys Thr Gly Ser Ile Thr Val Thr Ser Thr Ser Ser Ala
340 345 350
Phe Phe Gln Glu Leu Val Pro Gly Val Ala Ala Gly Thr Tyr Ser Ser
355 360 365
Ser Gln Ser Thr Phe Thr Ser Ile Ile Asn Ala Ile Ser Thr Tyr Ala
370 375 380
Asp Gly Phe Leu Ser Glu Ala Ala Lys Tyr Val Pro Ala Asp Gly Ser
385 390 395 400
Leu Ala Glu Gln Phe Asp Arg Asn Thr Gly Thr Pro Leu Ser Ala Val
405 410 415
His Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Phe Leu Thr Ala Ala Ala Arg Arg
420 425 430
Ala Gly Val Val Pro Pro Ser Trp Ala Ser Ser Gly Ala Asn Thr Val
435 440 445
Pro Ser Ser Cys
450
SEQ ID NO：10：TrGA，连接区
<210>10
<211>37
<212>PRT
<213>里氏木霉
<400>10
Ser Gly Ala Ser Val Val Gly Ser Tyr Ser Arg Pro Thr Ala Thr Ser
1 5 10 15
Phe Pro Pro Ser Gln Thr Pro Lys Pro Gly Val Pro Ser Gly Thr Pro
20 25 30
Tyr Thr Pro Leu Pro
35
SEQ ID NO：11：TrGA，SBD
<210>11
<211>109
<212>PRT
<213>里氏木霉
<400>11
Cys Ala Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe His Glu Leu Val Ser
1 5 10 15
Thr Gln Phe Gly Gln Thr Val Lys Val Ala Gly Asn Ala Ala Ala Leu
20 25 30
Gly Asn Trp Ser Thr Ser Ala Ala Val Ala Leu Asp Ala Val Asn Tyr
35 40 45
Ala Asp Asn His Pro Leu Trp Ile Gly Thr Val Asn Leu Glu Ala Gly
50 55 60
Asp Val Val Glu Tyr Lys Tyr Ile Asn Val Gly Gln Asp Gly Ser Val
65 70 75 80
Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn His Thr Tyr Thr Val Pro Ala Val Ala
85 90 95
Cys Val Thr Gln Val Val Lys Glu Asp Thr Trp Gln Ser
100 105
SEQ ID NO：12 SVDDFI：TrGA成熟蛋白质的起点
<210>12
<211>6
<212>PRT
<213>里氏木霉
<400>12
Ser Val Asp Asp Phe Ile
1 5
SEQID NO：384篮状菌属GA成熟蛋白质
<210>384
<211>588
<212>PRT
<213>篮状菌属物种
<400>384
Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln
1 5 10 15
Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala
20 25 30
Ser Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val
50 55 60
Asp Ala Phe Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Glu
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Gln Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly
85 90 95
Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu
100 105 110
Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala
115 120 125
Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn
145 150 155 160
Asp Leu Ser Tyr Val Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu
165 170 175
Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His
180 185 190
Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr
195 200 205
Cys Pro Asn Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln
210 215 220
Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala
260 265 270
Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Val
275 280 285
Tyr Ala Val Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly
290 295 300
Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala
305 310 315 320
Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Asn
325 330 335
Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Ala Phe Phe Gln
340 345 350
Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Ser
355 360 365
Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Ala Asp Gly Tyr
370 375 380
Leu Ser Ile Ile Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu
385 390 395 400
Gln Phe Ser Arg Ser Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Gly Leu Thr
405 410 415
Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ala Ala Arg Arg Gln Ser Ile
420 425 430
Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val
435 440 445
Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr
450 455 460
Ala Trp Pro Ser Ser Gly Ser Gly Pro Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro
465 470 475 480
Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser
485 490 495
Thr Thr Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu
500 505 510
Gly Asn Trp Ser Pro Ser Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr
515 520 525
Thr Ser Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Leu Asn Leu Pro Ala Gly
530 535 540
Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Lys Glu Thr Asp Gly Thr Ile
545 550 555 560
Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys
565 570 575
Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln
580 585
SEQ ID NO：385灰腐质霉GA SBD
<210>385
<211>112
<212>PRT
<213>灰腐质霉
<400>385
Cys Ala Asp Ala Ser Glu Val Tyr Val Thr Phe Asn Glu Arg Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala Trp Gly Glu Thr Ile Lys Val Val Gly Asn Val Pro Ala Leu
20 25 30
Gly Asn Trp Asp Thr Ser Lys Ala Val Thr Leu Ser Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Lys Ser Asn Asp Pro Leu Trp Ser Ile Thr Val Pro Ile Lys Ala Thr
50 55 60
Gly Ser Ala Val Gln Tyr Lys Tyr Ile Lys Val Gly Thr Asn Gly Lys
65 70 75 80
Ile Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Ile Thr Leu Gln Thr Ala
85 90 95
Ser Ser Ala Gly Lys Cys Ala Ala Gln Thr Val Asn Asp Ser Trp Arg
100 105 110
SEQ ID NO：386疏棉状嗜热丝孢菌GA SBD
<210>386
<211>109
<212>PRT
<213>疏棉状嗜热丝孢菌
<400>386
Cys Thr Pro Pro Ser Glu Val Thr Leu Thr Phe Asn Ala Leu Val Asp
1 5 10 15
Thr Ala Phe Gly Gln Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Pro Glu Leu
20 25 30
Gly Ser Trp Asp Pro Ala Asn Ala Leu Leu Met Ser Ala Lys Ser Trp
35 40 45
Thr Ser Gly Asn Pro Val Trp Thr Leu Ser Ile Ser Leu Pro Ala Gly
50 55 60
Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Arg Lys Asp Asp Gly Ser Ser Asp
65 70 75 80
Val Val Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Asn Val Pro Lys Asp
85 90 95
Cys Gly Ala Asn Thr Ala Thr Val Asn Ser Trp Trp Arg
100 105
SEQ ID NO：387埃默森篮状菌GA SBD
<210>387
<211>108
<212>PRT
<213>埃默森篮状菌
<400>387
Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Thr Ser Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu
20 25 30
Gly Asn Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr
35 40 45
Thr Asn Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly
50 55 60
Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile
65 70 75 80
Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys
85 90 95
Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln
100 105
SEQ ID NO：388黑曲霉GA SBD
<210>388
<211>108
<212>PRT
<213>黑曲霉
<400>388
Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr
1 5 10 15
Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu
20 25 30
Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr
35 40 45
Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly
50 55 60
Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val
65 70 75 80
Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys
85 90 95
Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
100 105
SEQ ID NO：389泡盛曲霉GA SBD
<210>389
<211>108
<212>PRT
<213>泡盛曲霉
<400>389
Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr
1 5 10 15
Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu
20 25 30
Gly Asp Trp Asp Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr
35 40 45
Thr Ser Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly
50 55 60
Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val
65 70 75 80
Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys
85 90 95
Gly Glu Ser Thr Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
100 105
SEQ ID NO：390太瑞斯梭孢壳霉GA SBD
<210>390
<211>108
<212>PRT
<213>太瑞斯梭孢壳霉
<400>390
Cys Ser Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asn Glu Arg Val Thr
1 5 10 15
Thr Gln Trp Gly Gln Thr Ile Lys Val Val Gly Asp Ala Ala Ala Leu
20 25 30
Gly Gly Trp Asp Thr Ser Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Ala Gly Tyr
35 40 45
Thr Ala Ser Asp Pro Leu Trp Ser Gly Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly
50 55 60
Leu Ala Val Gln Tyr Lys Tyr Ile Asn Val Ala Ala Asp Gly Gly Val
65 70 75 80
Thr Trp Glu Ala Asp Pro Asn His Ser Phe Thr Val Pro Ala Ala Cys
85 90 95
Gly Thr Thr Ala Val Thr Arg Asp Asp Thr Trp Gln
100 105
SEQ ID NO：1098里氏木霉葡糖淀粉酶变体
SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIRPDYYYMWTRDSALVFKNLIDRFTETYDAG
LQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNN
YQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQ
VLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSI
YGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAG
TYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARAGIVP
PSWANSSASTIPSTCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGQ
TVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYRDNHPLWIGTVNLEAGDVVEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPA
VACVTQVVKEDTWQS
SEQ ID NO：1099里氏木霉葡糖淀粉酶变体
SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIRPDYYYMWTRDSALVFKILIDRFTETYDAG
LQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNN
YQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQ
VLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSI
YGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAG
TYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVP
PSWANSSASTIPSTCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGQ
TVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYRDNHPLWIGTVNLEAGDVVEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPA
VACVTQVVKEDTWQS
上述专利申请，以及其中引用的或在其申请过程中引用的所有文献(“专利申请引用文献”)和专利申请引用文献中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献(“本文引用文献”)，以及本文引用文献中引用或参考的所有文献，连同本文提及的或以引用方式并入本文的任何文献中的任何产品的任何生产商使用说明、说明书、产品说明书和产品卡，均特此以引用的方式并入本文，并且用于实践本发明。
本公开的所述方法和系统的各种修改和变化将对本领域技术人员而言将是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。尽管本发明已结合具体的代表性实施方案进行了描述，但应该理解受权利要求书保护的主题不应该不当地受限于这些具体的实施方案。实际上，对本领域技术人员显而易见的对所述执行本公开的模式的各种修改，也旨在处于以下权利要求书的范围内。

Claims (13)

1.一种酶组合物，其包含a) 至少一种葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体在亲本葡糖淀粉酶的基础上被如下置换：
a. 44R和539R；或
b. 44R、61I和539R，
位置44、61和539对应于SEQ ID NO:2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述亲本葡糖淀粉酶为SEQ ID NO: 1或2，和
b) α-淀粉酶和支链淀粉酶；
所述酶组合物包含0.05–10 PU的支链淀粉酶活性/GAU所述葡糖淀粉酶变体和0.1–20SSU的α-淀粉酶活性/GAU所述葡糖淀粉酶变体。
2.根据权利要求1所述的酶组合物，其中与所述亲本葡糖淀粉酶相比所述葡糖淀粉酶变体显示出降低的异麦芽糖合成与淀粉水解活性之比。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的酶组合物，其包含SEQ ID NO: 1098或SEQ ID NO:1099的葡糖淀粉酶变体。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的酶组合物，其中所述组合物选自淀粉水解组合物、糖化组合物、洗涤剂组合物、醇发酵酶组合物和动物饲料组合物。
5.根据权利要求1 - 2中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物包含低于1XU的木聚糖酶活性/GAU根据权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，和/或所述酶组合物包含低于400XU的木聚糖酶活性/克所述组合物。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物包含1-15SSU的α-淀粉酶活性/GAU根据权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体和/或所述酶组合物包含0.1-10 PU的支链淀粉酶活性/GAU根据权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物包含0.05–10 PU的支链淀粉酶活性/GAU根据权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体以及0.1–20 SSU的α-淀粉酶活性/GAU根据权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体以及低于1XU的木聚糖酶活性/GAU根据权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
8.一种制备用于酿造的麦芽汁的方法，所述方法包括从谷粉形成醪液，以及使所述醪液与根据权利要求1-7中任一项所述的酶组合物和任选与一种或多种额外的酶接触，其中所述额外的酶选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶、植酸酶和葡糖淀粉酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述谷粉包含发芽的谷物、未出芽的谷物、添加物或它们的任何组合。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料。
11.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述麦芽汁发酵以获得啤酒。
12.一种用于产生啤酒的方法，所述方法包括：
a. 制备醪液，
b. 过滤醪液以获得麦芽汁，以及
c. 使所述麦芽汁发酵以获得啤酒，
其中将根据权利要求1-7中任一项所述的酶组合物添加至：步骤(a)和/或步骤(b)和/或步骤(c)中。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的酶组合物用于提高酿造工艺的淀粉糖化步骤或发酵步骤中发酵糖的生成的用途。
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