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Die vorliegende Erfindung betrifft
heterologe Polypeptide, welche durch Fadenpilze exprimiert und sezerniert
werden und Vektoren und Verfahren zum Exprimieren und Sezernieren
derartiger Polypeptide. Im spezielleren offenbart die Erfindung
Transformationsvektoren und insbesondere Verfahren unter Verwendung
derselben zum Exprimieren und Sezernieren von biologisch aktivem
Rinderchymosin und heterologer Glucoamylase durch einen Fadenpilz.
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Die Expression von heterologe Polypeptide
exprimierenden DNA-Sequenzen
(d.h. Polypeptide, welche normalerweise nicht durch einen Wirtsorganismus
exprimiert und sezerniert werden) hat sich bis zu einem beachtlichen
Entwicklungsstadium entwickelt. Zum Beispiel wurde berichtet, daß verschiedene
DNA-Sequenzen, welche pharmakologisch wünschenswerte Polypeptide codieren
(z.B. menschliches Wachstumshormon (1), menschlichen Gewebeplasminogenaktivator
(2), verschiedene menschliche Interferone (6),
Urokinase (5), Faktor VIII (4) und menschliches
Serumalbumin (3)) und industriell wichtige Enzyme (z.B.
Chymosin (7), Alpha-Amylasen (8) und alkalische
Proteasen (9)) in einer Anzahl von verschiedenen Expressionswirten
geklont und exprimiert wurden. Eine derartige Expression wurde erreicht
durch Transformieren prokaryontischer Organismen [z.B. E.coli (10)
oder B.subtilis (11)] oder eukaryontischer Organismen [z.B.
Saccharomyces cerevisiae (7), Kluyveromyces lactis (12)
oder China-Hamster-Ovarzellen
(2) mit DNA-Sequenzen, welche das heterologe Polypeptid
codieren.
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Einige Polypeptide haben, wenn sie
in heterologen Wirten exprimiert werden, nicht den gleichen Grad an
biologischer Aktivität
wie ihre natürlich
erzeugten Gegenstücke,
wenn sie in verschiedenen Wirtsorganismen exprimiert werden. Zum
Beispiel hat Rinderchymosin eine sehr niedrige biologische Aktivität, wenn
es in E.coli (13) oder S.cerevisiae (7) exprimiert
wird. Diese verringerte biologische Aktivität in E.coli besteht nicht aufgrund
der Natur-gegebenen Unfähigkeit
von E.coli das Polypeptid zu glykosylieren, da Chymosin normalerweise
nicht glykosyliert wird (14). Eine derartige relative Inaktivität sowohl
in E.coli und S.cerevisiae scheint jedoch primär durch ungenaues Falten der
Polypeptidkette bedingt zu sein, wie es durch die partielle Aktivierung
nach der Expression derartiger exprimierter Polypeptide durch verschiedene
Verfahren bewirkt wird. In derartigen Verfahren kann exprimiertes
Chymosin sequentiell auf vielzählige
Arten denaturiert und renaturiert werden, um biologische Aktivität zu erhöhen: z.B.
Behandlung mit Harnstoff (13), Aussetzen denaturierendem/renaturierendem
pH (13) und Denaturieren und Spaltung von Disulfidbindungen,
gefolgt von einer Renaturierung und Regenerierung kovalenter Schwefelbindungen
(15). Derartige Denaturierungs/Renaturierungsverfahren
sind jedoch nicht sehr effizient [z.B. 30% oder weniger Rückgewinnung
von biologischer Aktivität
für Rennin
(13)] und führen
zu beachtlichem zusätzlichem
Zeitaufwand und Kosten beim Herstellen eines biologisch aktiven
Polypeptids.
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Andere heterologe Polypeptide werden
vorzugsweise in höheren
eukaryontischen Wirten exprimiert (z.B. Säugerzellen). Derartige Polypeptide
sind üblicherweise
Glykopolypeptide, welche einen Expressionswirt erfordern, welcher
bestimmte Aminosäuresequenzen
in dem heterologen Polypeptid erkennen und glykosylieren kann. Derartige
Säugerzellkultursysteme
sezernieren jedoch häufig
keine großen
Mengen heterologer Polypeptide, verglichen mit mikrobiellen Systemen.
Darüber
hinaus sind derartige Systeme technisch schwierig aufrechtzuhalten
und sind folglich teuer zu betreiben.
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Transformation und Expression in
einem Fadenpilz, umfassend Komplementation von aroD-Mutanten von
N.crassa, welchen biosynthetische Dehydrogenase fehlt, wurde beschrieben
(16). Seitdem wurde eine Transformation basierend auf Komplementation
von Glutamatdehydrogenase defizienten N.crassa Mutanten ebenfalls
entwickelt (17). In jedem Fall wurden die Dehydrogenase-
(ga2) und Glutamatdehydrogenase- (am) Gene, welche für die Komplementation
verwendet wurden, aus N.crassa erhalten und umfaßten daher eine homologe Expression.
Andere Beispiele homologer Expression in Fadenpilzen umfassen die
Komplementation von den auxotrophen Markern trpC (18) und
argB (19) in A.nidulans und die Transformation von A.nidulans für eine Acetamid-
oder Acrylamidverwertung durch Expression des Acetamidase (20)
codierenden Gens von A.nidulans.
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Expression von heterologen Polypeptiden
in Fadenpilzen wurde auf die Transformation und Expression von Pilz-
und Bakterienpolypeptiden begrenzt. Zum Beispiel wurde A.nidulans,
welcher Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase
defizient ist, mit einem Plasmid transformiert, welches aus N.crassa
(21, 32) stammende, das pyr4-Gen codierende DNA-Sequenzen
enthält.
A.niger wurde ebenfalls transformiert, um Acetamid und Acrylamid
durch Expression des aus A.nidulans (22) stammenden Acetamidase
codierenden Gens zu verwerten.
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Beispiele heterologer Expression
bakterieller Polypeptide in Fadenpilzen umfassen die Expression
einer bakteriellen Phosphotransferase in N.crassa (23)
Dictyostelium discoideum (24) und Cephalosporium acremonium
(25).
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In jedem dieser Beispiele homologer
und heterologer Expression in Pilzen wurden die Polypeptide intrazellulär im Fadenpilz
gehalten.
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Demgemäß ist ein Gegenstand der vorliegenden
Erfindung die Expression und Sekretion von heterologen Palypeptiden
bereitzustellen durch und aus Fadenpilzen, umfassend Vektoren zum
Transformieren derartiger Pilze und Verfahren zum Exprimieren und
Sezernieren derartiger heterologer Polypeptide.
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Die Erfindung ist ausführlicher
in den anhängigen
Ansprüchen
definiert.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine Restriktionskarte der Aspergillus niger Glucomylase Insertionen
in pGal und pGa5.
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2 zeigt
die Konstruktion von pDJB-gam-1.
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3 zeigt
die Konstruktion von mp19GAPR.
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4, 5, 6 und 7 zeigen
die Konstruktion von pGRG1, pGRG2, pGRG3 und pGRG4.
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8 zeigt
die zum Konstruieren von mp19 GAPR⌂C1–⌂C4 aus mp19 GAPR verwendete Strategie.
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9 zeigt
die Konstruktion von pCR160.
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10 ist
eine Partialrestriktionskarte des Mucor miehei Carboxylproteasegens,
umfassend 5'- und 3'flankierende Sequenzen.
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11A, 11B und 11C sind die DNA-Sequenz von Mucor miehei,
Carboxylprotease, einschließlich
der gesamten codierenden Sequenz und 5'- und 3'-flankierender Sequenzen.
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12 zeigt
die Konstruktion von pMeJBl-7.
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13A und 13B sind eine Partial-Nukleotid-
und eine Restriktionskarte von ANS-1.
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14 zeigt
die Konstruktion von pDJB-3.
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15 zeigt
die Konstruktion von Plasmid pCJ:GRG1 bis pCJ:GRG4.
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16 zeigt
eine Restriktionsendonuklease-Spaltkarte des 3,7Kb BamHI-Fragments
von pRSH1.
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17 zeigt
die Konstruktion von pCJ:RSH1 und pCJ:RSH2.
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18 zeigt
die Expression von H. grisea Glucoamylase aus A. nidulans.
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Ausführliche
Beschreibung
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Die Erfinder haben gezeigt, daß heterologe
Polypeptide von stark divergierenden Quellen durch Fadenpilze exprimiert
und sezerniert werden können.
Im speziellen wurden Rinderchymosin, Glucoamylase von Aspergillus
niger und Humicola grisea und die Carboxylprotease von Mucor miehei
in A. nidulans exprimiert und aus A. nidulans sezerniert. Zusätzlich wurde Rinderchymosin
exprimiert und sezerniert aus A.awamori und Trichoderma reesei.
Biologisch aktives Chymosin wurde in dem Kulturmedium ohne weitere
Behandlung nachgewiesen. Das Ergebnis war darin überraschend, daß die zum
Transformieren von A. nidulans verwendeten Vektoren konstruiert
waren, um Prochymosin zu sezernieren, welches ein Aussetzen an eine
sauere Umgebung erfordert (ungefähr
pH 2), um biologisch aktives Chymosin zu erzeugen.
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Im allgemeinen ist ein Vektor, welcher
funktionelle Promotor und Terminatorsequenzen codierende DNA-Sequenzen
enthält
(einschließlich
Polyadenylierungssequenzen) operabel mit DNA-Sequenzen verbunden, welche verschiedene
Signalsequenzen und heterologe Polypeptide codieren. Die derartig
konstruierten Vektoren werden verwendet, um einen Fadenpilz zu transformieren.
Lebensfähige
Transformanten können hiernach
identifiziert werden durch Screenen auf die Expression und Sekretion
der heterologen Polypeptide.
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Alternativ kann ein exprimierbares
Selektionsmerkmal verwendet werden, um Transformanten zu isolieren
durch Einführung
von DNA-Sequenzen, welche das Selektionsmerkmal codieren, in den
Transformationsvektor. Beispiele derartiger Selektionsmerkmale umfassen
Resistenz gegen verschiedene Antibiotika (z.B. Aminoglykoside, Benomyl
etc.) und Sequenzen, welche Gene codieren, die einen auxotrophen
Defekt komplementieren (z.B. pyr4 Komplementation von pyr4 defizienten
A.nidulans, A. awamori oder Trichoderma reesei oder ArgB Komplementation
von ArgB defizienten A.nidulans oder A.awamori) oder Sequenzen,
die Gene codieren, welche einen Ernährungs- (z.B. Acetamidase)
oder morphologischen Marker im Expressionswirt vermitteln.
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In den bevorzugten offenbarten Ausführungsformen
ist eine, die aus A.nidulans stammende ANS-1 Sequenz codierende
DNA-Sequenz in der Konstruktion des Transformationsvektors der vorliegenden
Erfindung eingeschlossen. Diese Sequenz erhöht die Transformationseffizienz
des Vektors. Derartige Sequenzen werden jedoch nicht als unbedingt
notwendig angesehen, um die Erfindung durchzuführen.
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Zusätzlich bilden bestimmte, aus
dem Bakterienplasmid pBR325 stammende DNA-Sequenzen einen Teil der
offenbarten Transformationsvektoren. Es wird ebenfalls angenommen,
daß diese
Sequenzen nicht notwendig sind zum Transformieren von Fadenpilzen.
Stattdessen sorgen diese Sequenzen für bakterielle Replikation der
Vektoren während
der Vektorkonstruktion. Andere Plasmidsequenzen, welche ebenfalls
durch die Vektorkonstruktion verwendet werden können, umfassen pBR322 (ATCC
37017), RK-2 (ATCC 37125), pMB9 (ATCC 37019) und pSC101 (ATCC 37032).
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Die offenbarten bevorzugten Ausführungsformen
sind als Beispiele dargestellt und sollen nicht den Bereich der
Erfindung begrenzen.
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Definitionen
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"Exprimieren
von Polypeptiden" bedeutet
die Expression von Polypeptid codierenden DNA-Sequenzen.
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"Polypeptide" sind Polymere von α-Aminosäuren, welche
kovalent durch Peptidbindungen verbunden sind. Polypeptide umfassen
Polymere mit niedrigem Molekulargewicht als auch Polymere mit hohem
Molekulargewicht, welche herkömmlichererweise
als Proteine bezeichnet werden. Zusätzlich kann ein Polypeptid
ein Phosphopolypeptid, Glycopolypeptid oder Metallopolypeptid sein.
Darüber
hinaus können
eine oder mehrere Polymerketten kombiniert werden, um ein Polypeptid
zu bilden.
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"Heterologes
Polypeptid" bedeutet,
wie es hier verwendet wird, ein Polypeptid, welches normalerweise von
dem Fadenpilz, der verwendet wird, um das spezielle Polypeptid zu
exprimieren, nicht exprimiert und sezerniert wird. Heterologe Polypeptide
umfassen aus prokaryontischen Quellen stammende Polypeptide (z.B. α-Amylase
von Bacillus species, alkalische Protease aus Bacillus species und
verschiedene hydrolytische Enzyme von Pseudomonas, etc.), aus eukoryontischen
Quellen stammende Polypeptide (z.B. Rinderchymosin, Gewebeplasminogenaktivator
aus Mensch, Wachstumshormon aus Mensch, Interferon aus Mensch, Urokinase,
Serumalbumin aus Mensch, Faktor VIII etc.) und aus anderen Pilzquellen
als dem Expressionswirt stammende Polypeptide (z.B. Glucoamylase
aus A. niger und Humicola grisea, exprimiert in A. nidulans, die
Carboxylprotease aus Mucor miehei, exprimiert in A.nidulans, etc.).
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Heterologe Polypeptide umfassen auch
Hybridpolypeptide, welche eine Kombination von partiellen oder vollständigen Polypeptidsequenzen
umfassen, welche aus mindestens zwei verschiedenen Polypeptiden stammen
von welchen jedes homolog oder heterolog im Hinblick auf den Pilzexpressionswirt
sein kann. Beispiele derartiger Hybridpolypeptide umfassen:
DNA-Sequenzen,
welche
Pilzglucoamylase oder eine Pilzcarboxyprotease, Gewebeplasminogenaktivator
aus Mensch oder Wachstumshormon aus Mensch codieren, welche an DNA-Sequenzen
fusioniert sind, die
die funktionelle Signalsequenz codieren,
alleine oder in Verbindung mit verschiedenen Mengen Amino-terminaler
Propeptidcodons oder reifer Codons, welche mit dem funktionellen
Signal verbunden sind.
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Darüber hinaus umfassen die heterologen
Polypeptide der vorliegenden Erfindung weiterhin: 1) natürlich auftretende
allelische Variationen, welche bestehen oder auftreten können in
der Polypeptidsequenz, welche aus den vorstehenden prokaryontischen,
eukaryontischen und Pilzquellen stammt, als auch als diejenigen,
welche verwendet werden, um die vorstehenden Hybridpolypeptide zu
bilden und 2) entwickelte Variationen der vorstehenden heterologen
Polypeptide, welche hervorgebracht wurden z.B. durch stellenspezifische Mutagenese,
worin verschiedene Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von
einer oder mehreren der Aminosäuren
in den heterologen Polypeptiden erzeugt werden.
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Ein "biochemisch aktives heterologes Polypeptid" ist ein heterologes
Polypeptid, welches in aktiver Form sezerniert wird, wie es durch
seine Fähigkeit
zum Vermitteln gezeigt wird von: 1) der, durch sein natürlich auftretendes
Gegenstück
vermittelten biochemischen Aktivität oder 2) im Fall von Hybridpolypeptiden,
die biochemische Aktivität,
welche durch mindestens eines der natürlich auftretenden Gegenstücke, umfassend
die Hybridpolypeptide, vermittelt wird.
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Jedes der vorstehend definierten
heterologen Polypeptide wird durch eine heterologe DNA-Sequenz codiert,
welche ein Stop-Signal
enthält,
welches durch den Fadenpilz erkannt wird, in welchem Expression
und Sekretion auftritt. Wenn es vom Wirt erkannt wird, terminiert
das Stop-Signal die Translation der, das heterologe Polypeptid codierenden
mRNA.
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Die "Fadenpilze" der vorliegenden Erfindung sind eukaryontische
Mikroorganismen und umfassen alle filamentären Formen des Unterstammes
Eumycotina (26). Diese Pilze sind gekennzeichnet durch
ein vegetatives Mycel, welches zusammengesetzt ist aus Chitin, Cellulose
und anderen komplexen Polysacchariden. Die Fadenpilze der vorliegenden
Erfindung sind morphologisch, physiologisch und genetisch von Hefen
verschieden. Vegetatives Wachstum von Fadenpilzen erfolgt durch
hyphale Elongation und Kohlenstoffmetabolismus ist obligatorisch
aerob. Im Gegensatz hierzu erfolgt vegetatives Wachstum bei Hefen,
wie etwa S.cerevisiae durch Budding
eines einzelligen Thallus und Kohlenstoffkatabolismus kann fermentativ
sein. S.cerevisiae hat eine vorwiegende, sehr stabile diploide Phase,
während
Diploide nur kurz vor der Meiose in Fadenpilzen, wie etwa Aspergilli
und Neurospora existieren. S.cerivisiae hat 17 Chromosomen, im Gegensatz
zu 8 und 7 für
A. nidulans bzw. N.crassa. Neuere Darstellungen von Unterschieden
zwischen S.cerivisiae und Fadenpilzen umfassen die Unfähigkeit
von S.cerivisiae, Aspergillus und Trichoderma Introns zu verarbeiten
und die Unfähigkeit
viele transkriptorische Regulatoren von Fadenpilzen (27)
zu erkennen.
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Verschiedene Spezies von Fadenpilzen
können
als Expressionswirte verwendet werden, einschließlich die folgenden Gattungen:
Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia Mucor,
Cochiobolus und Pyricularia. Spezifische Expressionswirte umfassen
A. nidulans (18, 19, 20, 21, 61),
A. niger (22), A.awamori, z.B. NRRL 3112, ATCC 22342 (NRRL
3112), ATCC 44733, ATCC 14331 und den Stamm UVK 143f. A. oryzae,
z.B. ATCC 11490, N.crassa (16, 17, 23),
Trichoderma reesei, z.B. NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466,
56767 und Trichoderma viride, z.B. ATCC 32098 und 32086.
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Eine "Promotorsequenz" bedeutet, wie hier verwendet, eine
DNA-Sequenz, welche
von dem speziellen Fadenpilz für
Expressionszwecke erkannt wird. Sie ist operabel mit einer DNA-Sequenz
verbunden, welche die vorstehend definierten Polypeptide codiert.
Eine derartige Verbindung umfaßt
ein Positionieren des Promotors bezüglich des Initiationscodons
der DNA-Sequenz, welche die Signalsequenz des offenbarten Transformationsvektors
codiert. Die Promotorsequenz enthält Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, welche
die Expression der Signalsequenz und des heterologen Polypeptids
vermitteln. Beispiele umfassen den Promotor von A. niger Glukoamylase
(39, 48) der hier genannte Mucor miehei Carboxylprotease
und A. niger α-Glucosidase
(28), Trichoderma reesei Cellobiohydrolase I (29),
A. nidulans trpC (18) und höhere eukaryontische Promotoren,
wie etwa den SV40early Promotor (24).
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Gleichermaßen ist eine "Terminatorsequenz" eine DNA-Sequenz,
welche von dem Expressionswirt erkannt wird, um die Transkription
zu terminieren. Sie ist operabel mit dem 3'-Ende der, das zu exprimierende heterologe
Polypeptid codierenden DNA gebunden. Beispiele umfassen den Terminator
von A. nidulans trpC (18), A. niger Glucoamylase (39, 48),
A. niger α-Glucosidase
(28) und die hier genannte Mucor miehei Carboxylprotease,
obwohl jeder aus Pilz stammende Terminator aller Wahrscheinlichkeit
nach in der vorliegenden Erfindung funktionell ist.
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Eine "Polyadenylierungssequenz" ist eine DNA-Sequenz,
welche wenn sie transkripiert wird, durch den Expressionswirt erkannt
wird, um Polyadenosinreste an transkripierte mRNA anzufügen. Sie
ist operabel mit dem 3'-Ende
der DNA verbunden, welche das zu exprimierende heterologe Polypeptid
codiert. Beispiele umfassen Polyadenylierungssequenzen von A. nidulans
trpC (18), A. niger Glucoamylase (39, 48),
A. niger α-Glucosidase
(28) und die hier genannte Mucor miehei Carboxylprotease.
Jede Pilzpolyadenylierungssequenz ist jedoch aller Wahrscheinlichkeit
nach in der vorliegenden Erfindung funktionell.
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Eine "Signalsequenz" ist eine Aminosäuresequenz, welche, wenn sie
operabel mit dem Aminoterminus von einem heterologen Polypeptid
verbunden ist, die Sekretion eines derartigen heterologen Polypeptids von
dem Wirtsfadenpilz erlaubt.
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Derartige Signalsequenzen können die
Signalsequenz sein, welche normalerweise mit dem heterologen (Säuger) Polypeptid
verbunden ist (d.h. eine native Signalsequenz) oder welche die Signalsequenz
von Rinder-Präprochymosin
(15) oder Mucor miehei-Präcarboxyprotease
umfasst. Signalsequenzen sind operabel mit einem heterologen verbunden,
entweder durch Verwendung einer nativen Signalsequenz oder durch
Verbinden einer DNA-Sequenz, welche eine fremde Signalsequenz codiert,
mit einer DNA-Sequenz, welche das heterologe Polypeptid in dem richtigen
Leserahmen codiert, um eine Translation der Signalsequenz und des heterologen
Polypeptids zu erlauben.
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Ein "Propeptid" oder eine "Pro-Sequenz" ist eine Aminosäuresequenz, welche am Aminoterminus
eines reifen biologisch aktiven Polypeptids angeordnet ist. Wenn
sie derartig angeordnet ist, wird das resultierende Polypeptid ein
Zymogen genannt. Zymogene sind im allgemeinen biologisch inaktiv
und können
zu reifen aktiven Polypeptiden umgewandelt werden durch katalytische
oder auto-katalytische Abspaltung des Propeptids von dem Zymogen.
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In einer Ausführungsform der Erfindung ist
ein "Transformationsvektor" eine DNA-Sequenz,
welche ein heterologes Polypeptid codiert und eine DNA-Sequenz,
welche eine heterologe oder homologe Signalsequenz codiert, die
operabel daran gebunden ist. Zusätzlich
kann ein Transformationsvektor DNA-Sequenzen umfassen, welche funktionelle
Promotor- und Polyadenylierungssequenzen codieren. Jeder der vorstehenden Transformationsvektoren
kann ebenfalls Sequenzen umfassen, welche ein exprimierbares Selektionsmerkmal codieren
als auch Sequenzen, welche die Effizienz von Pilztransformation
erhöhen.
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"Transformation" ist ein Verfahren,
worin ein Transformationsvektor in einen Fadenpilz eingeführt wird. Die
Transformationsverfahren der vorliegenden Erfindung haben zu der
stabilen Integration des gesamten oder eines Teils des Transformationsvektors
in das Genom des Fadenpilzes geführt.
Jedoch ist auch eine Transformation umfaßt, welche in dem Erhalt eines
selbstrepliziernden extrachromosomalen Transformationsvektors resultiert.
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Allgemeine
Verfahren
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"Verdau" von DNA betrifft
katalytisches Spalten der DNA mit einem Enzym, welches nur an bestimmten
Stellen in der DNA wirkt. Derartige Enzyme werden Restriktionsenzyme
genannt und die Stellen für
welche jedes spezifisch ist, werden eine Restriktionsstelle genannt. "Partieller" Verdau betrifft
einen unvollständigen Verdau
durch ein Restriktionsenzym, d.h. die Bedingungen werden derart
gewählt,
daß sie
zu einer Spaltung von einigen, aber nicht allen Stellen für eine gegebene
Restriktionsendonuklease in einem DNA-Substrat führen. Die verschiedenen hier
verwendeten Restriktionsenzyme sind kommerziell erhältlich und
ihre Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren
und andere Anforderungen, wie sie von den Enzymbereitstellern herausgegeben werden,
wurden verwendet. Im allgemeinen wird etwa 1 Mikrogramm Plasmid
oder DNA-Fragment verwendet mit etwa einer Einheit Enzym und etwa
20 Mikroliter Pufferlösung.
Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme
sind vom Hersteller spezifiziert. Inkubationszeiten von etwa einer
Stunde bei 37°C
werden normalerweise verwendet, aber können gemäß den Instruktionen der Bereitsteller
variieren. Nach Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol
und Chloroform entfernt und die verdaute Nukleinsäure wird
aus der wäßrigen Fraktion
durch Präzipitation
mit Ethanol gewonnen. Verdau mit einem Restriktionsenzym kann gefolgt
sein von bakterieller alkalischer Phosphatasehydrolyse der terminalen
5'-Phosphate, um
zu verhindern, daß die
beiden Enden eines DNA-Fragments eine geschlossene Schleife bilden,
welche Insertion von einem anderen DNA-Fragment an der Restriktionsstelle
bei Ligierung verhindern würde.
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"Gewinnung" oder "Isolierung" eines gegebenen
DNA-Fragments von einem Restriktionsverdau bedeutet Auftrennung
des Verdaus durch eine Polyacrylamidgelelektrophorese, Identifizierung
des interessierenden Fragments, Entfernung des, das erwünschte Fragment
enthaltenden Gelbereichs und Abtrennung der DNA von dem Gel, im
allgemeinen durch Elektroelution (30).
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"Ligation" betrifft das Verfahren
zum Herstellen von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nukleinsäurefragmenten
(30). Wenn es nicht anders angegeben ist, wurde Ligation
verwirklicht unter Verwendung bekannter Puffer, bei Bedingungen
mit einer Einheit T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 Mikrogramm von etwa gleichen
molaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente.
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"Oligonukleotide
sind einzel- oder doppelsträngige
Polydeoxynukleotide mit kurzer Länge,
welche chemisch synthetisiert wurden durch das Verfahren von Crea
et al., (31) und welche dann auf Polyacrylamidgelen gereinigt
wurden.
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"Transformation" bedeutet Einführen von
DNA in einen Organismus, so daß die
DNA erhalten bleibt, entweder als ein extrachromosomales Element
oder als chromosomaler Bestandteil. Wenn es nicht anders angegeben
ist, war das hier zur Transformation von E.coli verwendete Verfahren
das CaCl2-Verfahren (30).
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A. nidulans Strang G191 (University
of Glasgow culture collection) wurde durch Inkubieren von A. nidulans
Sphäroplasten
mit dem Transformationsvektor transformiert. Der Genotyp von Strang
G191 ist pabaA1 (benötigt
p-Aminobenzoesäure), fwA1
(ein Farbmarker), mauA2 (kein Monoamin verwendend) und pyrG89 (Orotidinphosphatdecarboxylasedefizienz).
Sphäroplasten
wurden hergestellt durch das Cellophanverfahren von Ballance et
al. (21) mit den folgenden Modifikationen. Um A. nidulans
Zellwände
aufzuschließen
wurde zuerst Novozyme 234 (Novo Industries, Dänemark) partiell gereinigt.
Eine 100 bis 500 mg Probe von Novozyme 234 wurde in 2,5 ml 0,6M
KCl gelöst.
Das 2,5 ml Aliquot wurde auf eine PD10-Säule (Pharmacia-Upsalla, Schweden)
aufgebracht, äquilibriert
mit 0,6M KCl. Die Enzyme wurden mit 3,5 ml des gleichen Puffers
eluiert.
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Cellophanscheiben wurden in Novozyme
234 (5 mg/ml) für
2 Stunden inkubiert, dann mit 0,6M KCl gewaschen. Der Aufschluß und die
Waschlösungen
wurden kombiniert, durch Miracloth filtriert (Calbiochem-Behring
Corp., La Jolla, CA) und wie beschrieben gewaschen (21).
Zentrifugationen wurden in konischen 50 oder 15 ml Röhrchen bei
ca. 1000 × g
für 10
min durchgeführt.
Nachfolgend auf eine Inkubation auf Eis für 20 min wurden 2 ml der Polyethylenglykol-4000-Lösung (250
mg/ml) zugegeben, bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert, gefolgt
von der Zugabe von 4 ml 0,6M KCl, 50 mM CaCl2. Tranformierte Protoplasten
wurden zentrifugiert, in 0,6M KCl, 50 mM CaCl2 resuspendiert und
wie beschrieben (21) plattiert. Leer-Kontrollen umfaßten Protoplasten, welche mit
20 μl 20
mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA, pH 7,4, ohne Plasmid-DNA inkubiert waren. Positive Kontrollen
umfaßten
Transformation mit 5 μm
pDJB3, welches wie hier zuvor beschrieben konstruiert war. Regenerationsfrequenzen
wurden bestimmt durch Plattierungsverdünnungen auf Minimalmedien, welche
mit 5 bis 10 ppm paba und 500 ppm Uridin supplementiert waren. Die
Regeneration lag im Bereich von 0,5 bis 5%.
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Wegen der niedrigen, mit pDJB1 verbundenen
Transformationsfrequenzen wurde erwartet, daß das, das Mucor Säureproteasegen
(pMeJB1-7) enthaltende Derivat eine extrem niedrige Transformationsfrequenz ergibt.
Folglich wurde Co- Transformation
verwendet, um pmeJB11-7 Transformanten von A. nidulans zu erhalten.
Dies wurde ausgeführt,
indem zuerst ein nicht selektierbarer Vektor, welcher ANS-1 enthielt,
konstruiert wurde und dann Transformieren von Sphäroplasten
mit einem Gemisch von pmeJB1-7 und dem nicht selektierbaren Vektor,
welcher das ANS-1 Fragment enthält.
Der Grund für
diesen Ansatz war, daß der
ANS-1 tragende Vektor in mehreren Kopien integrieren würde und
homologe Regionen für
eine pMeJB1-7 Integration schaffen würde. Der ANS-1 Vektor wurde
hergestellt durch Subklonieren des PstI-PvuII Fragments von ANS-1 (12A und 13B) aus pDJB-3 in pUC18 (33).
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Die zwei Plasmide (pMeJB1-7 und der
ANS-1 enthaltende Vektor) wurden gemischt (2,5 μg von jedem) und der vorstehend
genannten Transformationsanleitung gefolgt.
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Mit den Vektoren PGRG1–pGRG4 und
pDJB-gam erhaltene Transformanten wurden nach 3 oder 4 Tagen Inkubation
bei 37°C
transferiert. Minimalemediumagarplatten, welche mit 5 ppm p-Aminonbenzoesäure supplementiert
waren, wurden im Zentrum mit Myceltransfers (mycel transfers) von
Transformanten inokuliert. Drei bis fünf Tage nach Inokulation von
Minimalmediumplatten wurden Sporensuspensionen hergestellt durch Vortexen
eines Mycelfragments in 1 ml destilliertem H2O,
0,02% Tween-80. Ungefähr
5 × 104 Sporen wurden in 250 ml Anzucht-Flaschen
mit 50 ml des folgenden Mediums inokuliert: (g/l) Maltodextrin M-040
(Grain Processing Corp., Muscatine, Iowa) 50 g, NaNO3 6
g, MgSO4·7H2O
0,5 g, KCl 0,52 g, KH2PO4,
68 g, 1 ml Spurenelementlösung
(34), 1 ml MAZU DF-60P Antischaummittel (Mazer Chemicals,
Inc., Gurnee, IL), 10 ppm p-Aminobenzoesäure und 50 ppm Streptomycinsulfat.
Alternativen zu MAZU, wie etwa Rinderserumalbumin oder andere geeignete
oberflächenaktive
Mittel können
verwendet werden. Mucorsäureproteasesekretion
wurde getestet in Aspergillus Vollmedium (20 g Dextrose, 1 g Pepton,
20 g Malzextrakt pro Liter). Kohlenstoffquellenregulierung von Chymosinsekretion durch
Aspergillus, nidulans Transformanten wurde abgeschätzt durch Messen
der Sekretion in dem vorstehend genannten Stärkemedium relativ zum gleichen
Medium, welches mit 1 Fructose, Sucrose oder Dextrose anstelle von
5% Stärke
supplementiert war. In allen Fällen
wurden die Medien bei 37°C
auf einem Kreisschüttler
(150 UPM) inkubiert. Ein aus pDJB3 stammender Transformant wurde als
eine Kontrolle eingeschlossen.
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Western-Blots der verschiedenen sezernierten
Chymosine und Mucor miehei Carboxylprotease wurden gemäß Towbin,
et al., (35) durchgeführt.
Aufgrund der hohen Salzkonzentration in Chymosinkulturnährlösungen und
dem Effekt, welchen dieses Salz auf eine Gelelektrophorese hat,
war ein Entsalzungsschritt erforderlich. Vorgegossene G-25 Säulen (Pharmacia,
PD10) wurden mit 50 mM Na2HPO4,
pH 6,0 äquilibriert.
Ein 2,5 ml Aliquot von Kulturmedium wurde auf die Säule aufgebracht.
Das Protein wurde mit 3,5 ml des gleichen Puffers eluiert. Die in
den Blots vorhandenden heterologen Polypeptide wurden nachgewiesen,
indem die Nitrocelluloseblots zuerst mit Anti-Chymosin aus Hase (36) oder
Anti-Mucor miehei Carboxyproteaseserum aus Hase (36) kontaktiert
wurden. Die Blots wurden danach mit Anti-Hase-Serum aus Ziege, welches
mit Meerrettich-Peroxidase (Bio-Rad, Richmond, CA) konjugiert war,
kontaktiert und entwickelt. Vor dem Beladen auf die Gele wurden
50 μl Medium
(entsalzt im Falle von Chymosin) mit 25 μl SDS-Probenpuffer gemischt. β-Mercaptoethanol
wurde auf eine Endkonzentration von 1% zugegeben. Die Probe wurde
in einem 95°C
Bad für
5 Minuten erhitzt, wonach 40 bis 50 μl Probe auf das Gel gegeben
wurden. Jedes Gel wurde jeweils mit 20 μl eines 650, 65 und 6,5 μg/ml Chymosinstandards
und Molekulargewichtsmarkern beladen. Western-Blots von pmeDJ1-7
Transformanten wurden ähnlich
analysiert, mit der Ausnahme, daß Gelpermeation nicht durchgeführt wurde.
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Proteaseaktivität wurde nachgewiesen wie von
Sokol, et al., (37) beschrieben. Luria-Nährlösung wurde
mit 1 bis 1,5 Magermilch (Difco) supplementiert und 30 bis 35 ml
wurden in eine 150 mm Petrischale gegossen. Ein Aliquot von 2 bis
5 μl Kulturmedium
wurde auf die Platte getüpfelt.
Die Platte wurde über
Nacht bei 37°C
in einer Feuchtekammer inkubiert. Die Aktivität wurde bestimmt, basierend
auf der Menge an auftretendem Milch-koagulieren auf der Platte,
gemessen in mm. Die Platten wurden zudem mit Verdünnungen
von 100 CHU/ml oder 16,6 CHU/ml Rennin (CHU-Chr Hansen Unit, Chr
Hansen's Laboratorium,
A./S., Kopenhagen) betüpfelt.
Die Beziehung zwischen dem Durchmesser der Koagulationszone (mm)
und der Enzymkonzentration ist logarithmisch.
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Um zwischen den Proteasetypen zu
unterscheiden, wurde Pepstatin, ein Inhibitor des Chymosintyps von
Carboxylprotease, verwendet, um auf Chymosin zurückführbare Proteaseaktivität zu inhibieren.
Proben von Chymosin-Mutanten und Kontrollnährlösungen wurden präinkubiert
mit einer 1:100 Verdünnung
von 10 mM Pepstatin in DMSO für
5 Minuten vor dem Analysieren von Proteaseaktivität.
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Glucoamylasesekretion durch pDJB-gam-1
Transformanten in 5%-igen
Stärkemedien
wurde eingeschätzt
unter Verwendung eines Testverfahrens, welches auf der Fähigkeit
von Glucoamylase zum Katalysieren der Umwandlung von p-Nitrophenol-α-Glucopyranosid
(PNPAG) (38) zu freier Glucose und p-Nitrophenoxid basierte.
Das Substrat, PNPAG, wurde in DMSO mit 150 mg/ml gelöst und 3
bis 15 μl
Aliquote wurden mit 0,2 M Natriumacetat, 1 mM Calciumchlorid bei
pH 4,3 auf 200 μl
verdünnt.
Eine 25 μl
Probe wurde in einer Mikrotiterplattengrube angeordnet. Ein gleiches
Volumen von Standards im Bereich von 0 bis 10 Sigma A. niger Einheiten/ml
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde in separaten Gruben angeordnet.
Zu jeder Grube wurden 200 μl
PNPAG-Lösung
mit 2,25 bis 11,25 mg/ml gegeben. Man ließ die Reaktion bei 60°C für 0,5 bis 1
Stunde ablaufen. Die Zeit hing von der Enzymkonzentration ab. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl 2 M Trizmabase beendet. Die
Platte wurde bei 405 nm gelesen. Die Enzymkonzentration wurde aus
einer Standardkurve berechnet.
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Wenn es nicht anders angegeben ist,
wurde chromosomale DNA aus Fadenpilzen extrahiert durch das folgende
Verfahren. Der Fadenpilz wurde in einem geeigneten Nährmedium
für 3 bis
4 Tage gezüchtet.
Mycelia wurden geerntet durch Filtern der Kultur durch feine Gaze.
Die Mycelia wurden sorgfältig
in einen Puffer von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA gespült. Überschüssige Flüssigkeit
wurde durch Drücken
der Mycelia in der Gaze entfernt. Etwa 3 bis 5 Gramm feuchter Mycelia
wurden mit einer äquivalenten
Menge sterilem, säuregewaschenem
Sand in einem Mörser
mit Pistil kombiniert. Das Gemisch wurde fünf Minuten zerrieben, um einen
feinen Brei zu erhalten. Das Gemisch wurde für weitere 5 Minuten zerrieben
nach Zugabe von 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA. Die Aufschlämmung wurde
in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen
mit Deckel gegossen und mit 25 ml Phenol-Chloroform (äquilibriert
mit einem gleichen Volumen 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA) extrahiert.
Die Phasen wurden durch Niedergeschwindigkeitszentrifugation getrennt.
Die wäßrige Phase
wurde zurückbehalten
und dreimal nachextrahiert. Die wäßrigen Phasen wurden kombiniert
(etwa 20 ml Gesamtvolumen) und mit 2 ml 3 M Natriumacetat, pH 5,4,
in sterilen Zentrifugenröhrchen
gemischt. Eiskaltes Isopropanol (25 ml) wurde zugegeben und die
Röhrchen
wurden bei –20°C für eine Stunde
belassen. Die Röhrchen
wurden dann bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Nukleinsäuren zu
pelletieren und das überstehende
Fluid wurde verworfen. Man ließ die
Pellets an Luft für
30 Minuten trocknen bevor sie in 400 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1
mM EDTA (TE-Puffer) resuspendiert wurden. Pankreas-Ribonuklease
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde auf eine Endkonzentration
von 10 μg
pro Milliliter zugegeben und die Röhrchen wurden für 30 Minuten
bei Raumtemperatur (30) inkubiert. Ribonuklease wurde dann
durch Extraktion mit Phenol-Chloroform entfernt. Die wäßrige Schicht
wurde vorsichtig entfernt und in ein Röhrchen gegeben, welches 40 μl 3 M Natriumacetat,
pH 5,4, enthielt. Eiskaltes Ethanol wurde in die Lösung geschichtet.
An der Grenzfläche
präzipitierte
DNA und wurde auf einen Glasstab gespult. Diese DNA wurde getrocknet
und in einem kleinen Volumen (100 bis 200 μl) TE-Puffer resuspendiert.
Die DNA-Konzentration
wurde spektrophotometrisch bei 260 nm (30) bestimmt.
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Um die chromosomale Integration von
Chymosin DNA-Sequenzen in ausgewählten
Transformanten zu bestätigen,
wurden Southern-Hybridisierungen
durchgeführt
(30). Sporensuspensionen von Transformanten wurden in Aspergillus
Vollmedium inokuliert und bei 37°C
auf einem Kreisschüttler
für 24
bis 48 Stunden inkubiert. Das Medium war dahingehend nicht selektiv,
da es mit 5 ppm p-Aminobenzoesäure
supplementiert war und für
das Wachstum des auxotrophen Stammes ausreichend Uracil enthielt.
Tatsächlich
wurden diese Southerns auch auf die Stabilität der Transformanten getestet.
Das Mycelium wurde filtriert, in Sand zerrieben und die DNA wie
vorstehend beschrieben gereinigt. DNA von Transformanten wurde dann
mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und Fragmente durch
Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Spuren umfaßten verdaute
DNA aus pDJB3 Transformanten und unverdaute DNA. Gele wurden mit
Ethidiumbromid gefärbt, photographiert,
auf Nitrocellulose oder Nytran (Schleicher und Schuell, Keen, NH)
geblottet und mit radiomarkierten Plasmiden oder spezifischen Fragmenten
getestet.
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Einige der folgenden Beispiele veranschaulichen
die beanspruchte Erfindung; andere liefern einen zweckmäßigen Hintergrund.
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BEISPIEL 1
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Expression und Sekretion
von Aspergillus niger Glucoamylase durch Aspergillus nidulans
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A. Konstruktion von pGA1
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Aspergillus niger (Kultur #7, Culture
Collection Genencor, Inc., South San Francisco, CA.) wurde in Kartoffel-Dextrose-Nährmedium (Difco, Detroit, MI)
bei 30°C
für 3 Tage
unter kräftiger
Belüftung
gezüchtet. Chromosomale
DNA wurde wie vorstehend extrahiert.
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Ein synthetisches Oligonukleotid
wurde als eine Hybridisierungssonde verwendet, um das Glucoamylasegen
von Aspergillus niger nachzuweisen. Das Oligonukleotid war 28 Basen
lang (28mer) und entsprach den ersten 9 1/3 Codons der veröffentlichten
codierenden Glucoamylasesequenz (39):
Das Oligonukleotid
wurde auf einem automatisierten Biosearch DNA-Synthesizer synthetisiert
(Biosearch, San Rafael, CA), unter Verwendung der vom Hersteller
angegebenen Reagentien und Verfahrensvorschriften.
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Genomische DNA von Aspergillus niger
wurde auf das Vorhandensein von Glucoamylasesequenzen durch das
Verfahren von Southern (30) analysiert. Kurz gesagt wurden
10 μg von
Aspergillus niger DNA mit EcoR1 Restriktionsendonuklease verdaut.
Die verdaute DNA wurde einer Elektrophorese auf einem 1 %-igen Agarosegel
gemäß Standardverfahren
(30) unterworfen. DNA wurde aus dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran
(Schleicher & Schuell,
Inc., Keene, NH) übertragen
durch Blotten in 10 × SSC
(1,5 M NaCl, 0,15 M Trinatriumcitrat) (30). DNA wurde an
der Nitrocellulose fixiert durch Backen in einem 80°C Vakuumofen,
gefolgt von Hybridisierung bei niedriger Stringens (2,40) mit einer
radioaktiv markierten Oligonukleotidsonde. Das radioaktive Markieren
des synthetischen Oligonukleotids wurde bei 37°C in einer 50 μl Reaktion
durchgeführt,
welche 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM Dithiotreitol,
30 pMol synthetisches Oligonukleotid, 20 pMol Gamma-[32P]ATP (Amersham,
Chicago, Il, spezifische Aktivität
5000 Ci/mmol) und 5 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (New England
Biolabs) enthielt. Nach Hybridisierung wurden die Filter 15 Minuten
in 2 × SSC,
0,1 Natriumdodecylsulfat (SDS) und zweimal in 2 × SSC bei 37°C gewaschen.
Die Filter wurden luftgetrocknet, in Seranwrap (Dow Chemical) verpackt
und auf einen Kodak XOmat-AR Röntgenfilm
bei –70°C angelegt,
um ein autoradiographisches Bild zu erhalten. Nach dem Entwickeln
des Autoradiogramms war eine Hybridisierungsbande klar sichtbar,
welche einem 3,5 Kilobasenpaar EcoR1 Fragment entsprach.
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Genomische DNA von Aspergillus niger
wurde mit EcoR1 verdaut und durch Polyacrylgelelektrophorese gemäß Standardverfahren
(30) nach der Größe fraktioniert.
DNA-Fragmente mit den Größen 3 bis
4 kb wurden ausgeschnitten und von dem Gel eluiert (30).
Diese DNA-Fraktion wurde verwendet, um eine Genbank in dem Escherichia
coli Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017) zu generieren. Der Klonierungsvektor
wurde mit EcoR1 gespalten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase
(Bethesda Research Labs) dephosphoryliert. Eine typische Dephosphorylierungsreaktion
bestand aus 1 μg
verdauter Vektor-DNA
und 1 Einheit alkalischer Phosphatase in 50 μl 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl. Die Reaktion
wurde bei 65°C
inkubiert für 1
Stunde. Die Phosphatase wurde durch Extraktion mit Phenol-Chloroform
entfernt. EcoR1 größenselektionierte
Aspergillus niger DNA wurde dann mit EcoR1 gespaltenen und dephosphorylierten
pBR322 ligiert. Eine typische Ligierungsreaktion enthielt das folgende:
jeweils 100 ng Vektor- und Insert-DNA, 1 Einheit T4 DNA-Ligase (Bethesda
Research Labs), 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiotreitol
und 1 mM ATP in 10 μl
Volumen. Ligationsreaktionen wurden bei 16°C für 18 bis 24 Stunden inkubiert.
Die ligierte DNA wurde verwendet, um kompetente E.coli 294 Zellen
(ATCC 31446), hergestellt nach dem Verfahren von Morrison (41),
zu transformieren. Transformanten wurden auf LB-Agarplatten (30)
selektiert, welche Carbenecillin mit einer Endkonzentration von
50 μg pro
ml enthielten. Transformanten, welche Glucoamylasegensequenzen enthielten
wurden durch Kolonie-Hybridisierungsverfahren (30), unter
Verwendung des Glucoamylase-spezifischen 28 mers als eine Sonde,
identifiziert. Hybridisierende Kolonien wurden gereinigt und Plasmid-DNA
wurde von jeder durch das alkalische SDS-Miniscreen-Verfahren (30)
isoliert.
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Alle auf diese Art und Weise ausgewählten Plasmide
enthielten ein 3,5 kb EcoR1-Fragment, welches mit der synthetischen
Glycoamylasesonde hybridisierte. Ein derartiges Plasmid, bezeichnet
als pGal, wurde für
weitere die Analytik ausgewählt.
Ein 1,1 kb EcoR1-Ba1II-Fragment aus dem Insert in pGal wurde in
M13 mp9 (42) subkloniert und durch das Dideoxykettenterminationsverfahren
(43) partiell sequenziert, um sicherzustellen, daß die klonierte
DNA das Glucoamylasegen codiert. Eine Restriktionsendonuklease-Spaltkarte
des 3,5 kb EcoR1-Fragments, welches in pGal enthalten ist, ist in 1 dargestellt. Sie wurde
entwickelt durch Einzel- und Doppelrestriktionsverdaue, gefolgt
von einer Orientierung der DNA-Fragmente hinsichtlich bekannter
Restriktionsstellen in pBR322 (44) .
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B. Konstruktion von pGA5
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Die Nukleotidsequenz und die Restriktionskarte
von pGal zeigte an, daß pGal
den vollständigen
Glucoamylase codierenden Bereich und 221 Nukleotide 5'-flankierende DNA
enthielt. Die Sequenzen in dieser 5'-Region waren erstaunlich ähnlich typischen
eukaryontischen Promotorsequenzen mit stromaufwärts des ATG-Startcodons (48)
gelegenen TATAAAT und CAAT Boxen.
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Jedoch, um sicherzustellen, daß mögliche stromaufwärts gelegene
Aktivierungsstellen des Aspergillus niger Glucoamylasegens in dem
Endtransformationsvektor eingeschlossen waren, wurde ein größeres genomisches
Fragment cloniert, welches mindestens 1000 bp 5'-flankierende DNA enthielt. Southern-Blot
Experimente, ähnlich
den bereits beschriebenen, identifizierten ein 6,5 kb ClaI-Fragment,
welches mit einem radioaktiv markierten EcoR1-Glucoamylasefragment von pGal hybridisierte.
Das EcoR1-Fragment
wurde radioaktiv markiert durch Nick-Translation (30) mit
alpha-[32P]dCTP (Amersham, spezifische Aktivität 3000 Ci/mmol). Ein Nick-Translationskit
(Bethesda Research Labs) wurde für
die Markierungsreaktion verwendet unter Befolgung der vom Hersteller
bereitgestellten Anleitungen. Filter wurden hybridisiert und unter
stringenten Bedingungen gewaschen.
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Das durch Hybridisierung identifizierte
6,5 kb ClaI-Fragment wurde auf eine ähnliche Art und Weise wie vorstehend
beschrieben kloniert. Aspergillus niger DNA wurde mit ClaI verdaut
und durch Polyacrylamidgelelektrophorese nach Größe fraktioniert. Wandernde
DNA-Fragmente zwischen 5,5 und 8 kb wurden herausgeschnitten und
von dem Gel eluiert. Diese Fraktion wurde mit ClaI gespaltenem und
dephosphoryliertem pBR325 (45) ligiert. Das Ligierungsgemisch
wurde verwendet, um kompetente E.coli 294 Zellen zu transformieren.
Transformanten wurden auf LB-Agarplatten, welche Carbenicillin (50 μg/ml) enthielten,
selektiert. Glucoamylasegensequenzen enthaltende Kolonien wurden
durch Koloniehybridisierung (30) identifiziert. Von hybridisierenden
Kolonien extrahierte Plasmid-DNA enthielt ein 6,5 kb ClaI-Fragment,
welches das zuvor in pGal klonierte 3,5 kb EcoR1-Fragment enthielt.
Diese rekombinanten Plasmide codierten das Aspergillus niger Glucoamylasegen,
wie bestätigt
durch Supercoil-DNA-Sequenzieren
(46) mit dem synthetischen Oligonukleotid (28 mer) als
Sequenzierprimer. Eine Restriktionsendonuklease-Spaltkarte des 6,5 kb ClaI-Fragments
wurde konstruiert unter Verwendung von Einzel- und Doppelverdauen
der in pBR325 klonierten DNA. Restriktionsstellen in der Vektor-DNA
wurden als Referenzpunkte verwendet, um das Fragment zu orientieren.
Diese Restriktionskarte ist in 1 gezeigt.
Die Lage des Glucoamylasegens wurde deduziert durch Vergleichen
von Restriktionsstellen von pGa5 mit denjenigen der früher veröffentlichten
Glucoamylasegene (39, 47, 48). Aus den
Kartierungsdaten wurde geschätzt,
daß etwa
3,3 kb der 5'-flankierenden DNA
und etwa 1 kb 3'-flankierender
DNA in dem klonierten Fragment enthalten waren.
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Plasmid pGa5 wurde bei der ATCC hinterlegt
am 28. August 1985 in E.coli 294 und wurde mit der Nummer 53249
zugeordnet.
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C. Vektor zur Expression
und Sekretion von Aspergillus niger Glucoamylase
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Das 6,5 kb ClaI-Fragment von pGa5,
welches das Glucoamylasegen enthält,
wurde wie in 2 dargestellt
in dem E.coli – Aspergillus
nidulans Shuttlevektor pDJB3 kloniert. Der pDJB3 Shuttlevektor besitzt
ein selektierbares Beta-Lactamasegen und den Replikationsursprung
von E.coli Plamsid pBR325, das pyr4 Gen von Neuospora crassa, welches
die auxotrophe Anforderung für
Uridin im Aspergillus nidulans Strang G191 aufhebt, eine Sequenz,
welche als ANS1 von Aspergillus nidulans bekannt ist, welche eine
hohe Frequenz stabiler integrierender Transformanten in Aspergillus
nidulans fördert,
singuläre
EcoR1 und ClaI Restriktionsstellen zum Klonieren.
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pDJB ist konstruiert wie in 14 dargestellt. Plasmid
pFB6 (32) wird vollständig
verdaut mit BglII und partiell verdaut mit HindIII. Das pyr4 Gen
(ca. 2 kb) enthaltende Fragment B wird durch Gelelektrophorese gereinigt
und in mit HindIII/Bam HI verdautem pBR325 ligiert (Fragment A),
was zu Plasmid pDJB1 führt.
Die ANS-1 Sequenz wird durch Ligieren von EcoRI verdauter A. nidulans
genomischer DNA (Strang G191 oder andere von FGSC#4 stammende Stränge) in
EcoR1 gespaltenen pFB6 kloniert. Der resultierende Pool von EcoRI-Fragmenten
in pFB6 wird verwendet, um eine ura3-S.cerevisiae (E.G. ETACC 44769,
44770 usw.) zu transformieren. Ein autonom replizierendes Plasmid,
pIntA, wird aus dem S.cerivisiae Transformanten gereinigt. pIntA
wird mit EcoRI verdaut, das ANS-1-Fragment durch Gelelektrophorese
gereinigt und in EcoRI aufgeschlossenem pDJB1 ligiert, was zu Plasmid
pDJB2 führt.
pDJB2 wird partiell mit EcoRI verdaut, mit DNA-Polymerase I (Klenow)
behandelt und wieder ligiert, um Plasmid pDJB3 zu ergeben. Die partielle
Nukleotidsequenz und die Restriktionskarte des ANS-1-Fragments ist
in 13A und 13B gezeigt.
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Plasmid pGa5 wurde mit ClaI verdaut
und das große
Fragment (Fragment A) wurde von dem Vektor durch Agarosegelelektrophorese
abgetrennt. Dieses Fragment wurde ligiert mit pDJB3, welcher mit
ClaI gespalten und dephosphoryliert worden war (Fragment B). Das
Ligationsgemisch wurde verwendet, um kompetente E.coli 294 Zellen
zu transformieren. Transformanten wurden selektiertt auf LB-Agar,
welcher mit Carbenicillin (50 μg/ml)
supplementiert war. Analyse von Plasmid-DNA aus diesen Transformanten
zeigte, daß das Glucoamylasefragment
wie erwartet insertiert worden war. Beide Orientierungen des Glucoamylasefragments wurden
erhalten durch Screenen verschiedener Transformanten. Ein, als pDJBgam1
bezeichnetes Plasmid wurde willkürlich
zur Transformation von Aspergillus nidulans Protoplasten ausgewählt.
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D. Expression und Sekretion
von Glucoamylase
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Aspergillus nidulans Stamm G191 wurde
wie vorstehend beschrieben mit pDJB-gam-1 transformiert. Fünf, als
pDJB-gam-1-4, 9, 10, 11 & 13
bezeichnete Transformanten wurden auf Glucoamylseaktivität wie vorstehend
beschrieben analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt.
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Tabelle I
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Wie gesehen werden kann, erzeugte
jeder pDJB-gam-1 Transformant mehr Glucoamylaseaktivität als die
Kontrolle, was anzeigt, daß biologisch
aktive Glucoamylase aus dem transformierten Pilz exprimiert und sezerniert
wurde.
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BEISPIEL 2
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Expression und Sekretion
von Rinderchymosin aus Aspergillus nidulans
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Es wurden Expressionsvektoren konstruiert,
welche entweder eine neutrale Vorstufe von Rinderchymosin (Präprochymosin)
oder eine Fusionsvorstufe, in welcher DNA-Sequenzen für Aspergillus
niger Glucoamylase und Prochymosin exakt verbunden waren, codieren.
Die Strategie zur Konstruktion dieser Vektoren umfaßte die
folgenden Schritte. Zuerst wurde eine DNA-Sequenz, welche einen
Teil des Glucoamylasepromotors und einen Teil des Glucoamylase 5'-codierenden Bereichs
enthielt stromaufwärts
von einer DNA-Sequenz cloniert, welche dem Amino-terminalen Teil
von Präprochymosin
entsprach. Anschließend
wurden Nukleotide zwischen den DNA-Fragmenten durch M13 Stellen-spezifische
Mutagenese (40) deletiert unter Verwendung spezifischer
Primersequenzen. Schließlich
wurde ein DNA-Segment, welches die verbundenen Sequenzen enthielt
mit dem verbleibenden Teil der Prochymosinsequenz in einen Expressionsvektor
eingeführt,
welcher die 5'-
und 3'-Regulationssequenzen
des Aspergillus niger Glucoamylasegens verwendete. Diese Schritte
sind in 3 bis 7 dargestellt.
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A. Konstruktion von mp19
gApr
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Plasmid pGA5 wird verwendet um ein
337 bp EcoR1-RsaI-DNA-Fragment
(Fragment A) zu erhalten, welches einen Teil des Glucoamylasepromotors
und ein Amino-terminales Segment des codierenden Bereichs trägt. Fragment
A wurde mit EcoR1- und SmaI verdauter M13MP19RF-DNA (Fragment B)
ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet um E.coli JM101 (ATCC
33876) zu transformieren. Durchscheinende Plaques wurden auf das
Vorliegen von Fragment A durch Restriktionsanalyse der entsprechenden
RF-DNA analysiert. Ein Isolat, welches Fragment A enthält, bezeichnet
als mp19R-Rsa wurde mit PstI und XbaI verdaut und das große Fragment
(Fragment C) wurde isoliert. Eine kleine XbaI-PstI Sequenz (Fragment
D), welche von pR3 (49) erhalten wurde, welches 5'-Preprochymosin-Sequenzen
enthielt, wurde durch Elektorphorese gereinigt und an Fragment C
ligiert, um das Phagentemplate mp1gGAPR, wie in 3 gezeigt, zu erzeugen.
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B. Stellenspezifische
Deletionsmutagenese
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Wie in 8 gezeigt
wurde mp19GAPR⌂Cl erhalten aus mp19GAPR durch Deletion
der Nukleotide zwischen den Glucoamylasesignalpeptidcodons und den
Codons für
Prochymosin durch stellenspezifische Mutagenese. Somit sind in mp19GAPR⌂Cl
die Glucoamylasesignalpeptidcodons exakt an das erste Codon von
Prochymosin gebunden. Stellenspezifische Mutagense wurde wie vorstehend
beschrieben (40) durchgeführt, ausgenommen, daß nur ein
Oligonukleotid verwendet wurde um die Synthese des zweiten Strangs
auf der einsträngigen
M13-Matrize (4) (40)
zu starten. Das zum Erhalten von mp19GAPR⌂Cl (Primer 1)
verwendete Oligonukleotid war 5'-GCTCGGGGTTGGCAGCTGAGATCACCAG
3'. Die erwünschte Deletion
enthaltende Plaques wurden identifiziert durch Hybridisieren mit
dem wie vorstehend beschrieben radiomarkierten Primer.
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In mp19GAPR⌂C3 wurden die
Nukleotide zwischen denjenigen, welche unmittelbar dem Initiationscodon
von Glucoamylase und dem ATG-Startcodon von Präprochymosin vorangehen verbunden
durch stellenspezifische Mutagenese, unter Verwendung des synthetischen
Oligonukleotids (Primer 3)
5' ACTCCCCCACCGCAATGAGGTGTCTCGT 3'.
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Die resultierende Mutation verknüpfte die
Glucoamylasepromotorregion exakt mit dem Initiationscodon von Präprochymosin
wie in 8 dargestellt.
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C. Konstruktion von Vektoren
für die
Expression und Sekretion von Rinderchymosin
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Wie weiterhin in 4 gezeigt, war jede der Fusionen zwischen
den Glucoamylasesequenzen und den 5'-Prochymosinsequenzen
(mp19GAPR⌂CI und mp19GAPR⌂C3) kombiniert mit den
3'-Prochymosinsequenzen
und dem Saccharomyces cerevisiae Phosphoglyceratkinase-(PGK)-Terminator
in dem Aspergillis nidulans Transformationsvektor pDJB3. Die replikative
Form von mp19GAPR⌂Cl und mp19GAPR⌂C3 wurde mit EcoR1
und PstI verdaut. Das kleinere Fragment (Fragment 1) wurde isoliert.
Plasmid pBR322 wurde ebenfalls mit EcoR1 und PstI verdaut und das
größere Vektorfragment
(Fragment 2) wurde isoliert. Die Fragmente 1 und 2 wurden durch
Ligation verbunden und verwendet, um E.coli 294 zu transformieren.
Eine Tetracyclin-resistente Kolonie, welche entweder Plasmid pBR322GAPR⌂Cl
oder pBR322GAPR⌂C3 enthielt wurde isoliert. Fragment 2
wurde ebenfalls mit E.coli Polymerase I (Klenow-Fragment) behandelt. Das resultierende
Fragment mit glatten Enden wurde durch Ligation zirkularisiert und
verwendet, um E.coli 294 zu transformieren. Eine Tetracyclin-resistente
Kolonie, welche Plasmid pBR322⌂RP enthielt, wurde isoliert
und dann mit HindIII und SalI verdaut. Das größere Vektorfragment (Fragment
3) wurde isoliert. Das Plasmid pCR160 wurde mit HindIII und PstI
verdaut und Fragment 5 (welches den an 3' Prochymosincodons fusionierten Hefe-PGK-Terminator
enthielt) wurde isoliert. Die Fragmente 3, 4 und 5 wurden durch
Ligation verbunden und verwendet, um E.coli 294 zu transformieren.
Ein Tetracyclin-resistenter Transformant, welcher Plasmid pBR322GAPR⌂Cl
oder pBR322GAPR⌂C3 enthielt, wurde isoliert.
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Plasmid pCR160 enthält den 2 μm Replikationsursprung,
um sein Erhalt als Plasmid in Hefe zu erlauben, das Hefe TRP-1 Gen
als einen Hefeselektionsmarker, einen E.coli Replikationsursprung und
ein Ampicillinresistenzgen von dem Plasmid pBR322 und eine Prorenninexpressionseinheit.
Die Prorenninexpressionseinheit enthält den Promotor des Hefe-PGK-Gens,
den Prorennin codierenden Bereich und den Terminator von dem PGK-Gen.
Die Konstruktion dieses Plasmids wurde wie in 9 gezeigt auf die folgende Art und Weise ausgeführt: Plasmid
YEpIPT (50) wurde partiell mit HindIII verdaut, gefolgt
von einem vollständigen
EcoR1 Verdau und das Vektorfragment A wurde isoliert. Ein zweites
Plasmid pPGK-1600 (51) wurde partiell sowohl mit EcoR1
als auch HindIII verdaut und das PGK-Promotorfragment B wurde isoliert. Die
Fragmente A und B wurden ligiert, um das intermediäre pIntl
zu ergeben, welches mit EcoR1 und dem HindIII wieder partiell verdaut wurde
und das Vektorfragment C wurde isoliert. Das PGK-Terminatorfragment D wurde nach einem
HindIII- und Sau3A-Verdau des Plasmids pB1 (52) isoliert.
Das Prorenninfragment E wurde isoliert durch Spaltung von pR1 (49)
DNA mit EcoR1 und BclI. Die Fragmente C, D und E wurden dann ligiert,
um das Hefeexpressionsplasmid pCR160 zu erzeugen. Die Nukleotidsequenz
des PGK-Protomotors, des Strukturgens und des Terminators wurden
beschrieben (53).
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Die Plasmide pBR322GAPR⌂Cl
und pBR322GAPR⌂C3 enthalten eine vollständige Transkriptionseinheit
für jede
der Prochymosinformen. Diese Transkriptionseinheit enthält eine
Prochymosinvorläufer
codierende Sequenz, den Glucoamylasepromotor und den Hefe-PGK-Terminator.
Jedoch erzeugten nachfolgend beschriebene Derivate dieser Plasmide
und Plasmide pBR322GAPR⌂C2 und pBR322GAPR⌂4 [bezeichnet
als pIntl (1–4) 5] kein nachweisbares Chymosin
wenn sie verwendet wurden, um A. nidulans G191 zu transformieren.
Es ist nicht bekannt, warum diese Plasmidderivate Chymosin nicht
exprimieren und sezernieren konnten. Jedoch im Hinblick auf die
nachfolgenden Ergebnisse erscheint es, daß der Hefe-PGK-Terminator und/oder
die kurze Glucoamylasepromotorsequenz in diesen Plasmiden nicht
von A. nidulans G191 erkannt wird.
-
Basierend auf diesen Ergebnissen
wurden die pBR322GAPR⌂C Plasmide weiter modifiziert.
-
In den folgenden Schritten wurde
die Transkriptionseinheit in den Aspergillus nidulans Transformationsvektor
pDJB3 versetzt. Zusätzliche
Glucoamylase 5' flankierende
Sequenzen wurden genau 5' von
dem Promotor eingeführt,
um das Vorliegen von möglichen
stromaufwärts
gelegenen Aktivierungsstellen sicherzustellen, welche in die Expressionsregulierung
einbezogen werden könnten.
Weiterhin wurde der PGK-Terminator durch den A. niger Glucoamylaseterminator
von pGa5 ersetzt. Im speziellen wurde in 5 jedes Plasmid (pBR322GAPR⌂Cl
oder pBR322GAPR⌂C2) mit ClaI verdaut und Fragment 6 wurde
isoliert. Plasmid pDJB3 wurde ebenfalls mit ClaI verdaut und mit
alkalischer Bakterienphosphatase behandelt, um Selbstligation zu
minimieren. Dieses verdaute Plasmid (Fragment 7) wurde mit Fragment
6 verbunden und eine Ampicillin-resistende Kolonie, welche Plasmid
pINTI-1 oder pIntI-3 enthielt, wurde isoliert. Diese Plasmide wurden
mit XhoI und NsiI verdaut und das größere Vektorfragment (Fragment
8) wurde isoliert. Plasmid pGa5, welches das vollständige Glucoamylasegen
als auch ausgedehnte 5'-
und 3'-flankierende
Sequenzen enthält,
wurde mit XhoI und NsiI verdaut und das kleinere Fragment (Fragment
9) welches ungefähr
1700 bp dieser 5'-Sequenzen
enthält,
wurde isoliert. Fragmente 8 und 9 wurden durch Ligation verbunden
und verwendet um E.coli 294 zu transformieren. Es wurde eine Ampicillin-resistente
Kolonie isoliert, welche Plasmid pInt2-1 oder pInt2-3 enthielt.
Diese Plasmide unterscheiden sich am deutlichsten von den Endvektoren
(siehe 7) darin, daß sie anstelle
des Glucoamylaseterminators den Hefe-PGK-Terminator enthalten.
-
Zusätzliche Schritte bei der Konstruktion
von Chymosinexpressionsvektoren sind in 6 dargestellt. Plasmid pR1 (49)
wurde verwendet, um ein kleines BclI-Asp718 DNA Fragment (Fragment
A) zu isolieren, welches das 3'-Ende von
Prochymosin cDNA umfaßte.
Fragment A wurde nachfolgend in pUC18 (33) kloniert, welcher mit
Asp718 und BamHI (Fragment B) verdaut worden war. Ähnlich wurde
ein 1,2 kb ClaI-Asp718 DNA-Fragment
(Fragment D) aus Plasmid pGA5 isoliert und in mit AccI und Asp718
verdautem pUC18 (Fragment C) kloniert. Die resultierenden intermediären Plasmide
pUC-int1 und pUC-int2 wurden mit SalI und HindIII verdaut und Fragmente
E und F wurden isoliert. Diese Fragmente wurden dann ligiert, um
pUCint3 zu erzeugen, welches das 3'-Ende von Prochymosin enthielt, gefolgt
von den Glucoamylaseterminatorsequenzen auf einem HindIII-Asp718
Fragment (Fragment H).
-
Ein neuer Klonierungsvektor, bezeichnet
als pBR-Link, wurde erzeugt durch Insertieren eines synthetischen
Oligonukleotidlinkers (welcher XhoI und ClaI Stellen) enthielt,
in die einzige BamHI Stelle von pBR322. Dieser Linker umfaßte die
folgende Sequenz:
5'-GATCCATCGATCTCGAGATCGATC
3'
3' GTAGCTAGAGCTCTAGCTACCTAG
5'.
-
Das größere HindIII-XhoI Fragment
dieses Vektors (Fragment G) wurde durch Elektrophorese gereinigt. Ähnlich wurden
die XhoI-Asp718
Restriktionsfragmente (Fragmente I) von den Plasmiden pInt2-1 und pInt2-3
elektrophoretisch isoliert. Die Fragmente G und H wurden mit jedem
der verschiedenen I-Fragmente in einer Serie von Dreifach-Ligationen
ligiert, um die Intermediate pInt3-1 und pInt3-3 zu erzeugen. Diese Schlüsselintermediate
enthielten die Glucoamylasepromotorregionen, verschiedene Signal-
und Propeptidfusionen an die Prochymosin- (oder Präprochymosin)
Sequenzen, gefolgt von der Glucoamylaseterminatorregion, alles innerhalb
günstiger
ClaI Restriktionsstellen. Da bestimmte ClaI-Stellen, wie etwa diejenigen
in dem Linker von pBR-Link durch E.coli DNA-Methylierung inhibiert
werden, wurden die Plasmide pInt3-1 bis pInt3-4 in einem dam-Strang
von E.coli transformiert, bezeichnet als GM48, (ATCC 39099) aus
welchem die Plasmide wieder isoliert wurden. Die unmethylierte DNA
wurde mit ClaI verdaut und Fragment J wurde durch Elektrophorese
gereinigt. Fragment J aus jeder der Glucoamylase-prochymosinfusionen
wurde nachfolgend in die einzige ClaI Stelle von pDJB3 (Fragment
K) kloniert, um die fertigen Expressionsvektoren pGRGl und pGRG3 zu
erzeugen.
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D. Expression und Sekretion
von Rinderchymosin
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Aspergillus nidulans G191 wurde mit
pGRGl und pGRG3 wie vorstehend beschrieben transformiert.
-
Fünf
pGRGl und fünf
pGRG3 Transformanten wurden analysiert. Western-Analysen (nicht
gezeigt) zeigten an, daß jeder
Transformant ein Protein sezernierte, welches mit Anti-Chymosin reagierte
und welches beim gleichen oder etwas höheren Molekulargewicht von
Rinderchymosin wanderte. Die Spezies mit höherem Molekulargewicht kann
zurückzuführen sein
auf eine ungenaue Prozessierung, Mediumeffekte oder Glycosylierung.
Integration wurde sichergestellt für einen Transformanten von
pGRG3 durch Southern Hybridisierung (Ergebnisse nicht gezeigt).
Jeder Transformant wurde ebenfalls auf Chymosinaktivität untersucht.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle II gezeigt.
-
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl
pGRGl als auch pGRG3 mit unterschiedlichen Konzentrationen, welche über der
pDJB3 Kontrolle liegen, eine Protease sezernieren. Zuweilen wurde
proteolytische Hintergrundsaktivität in den pDJB3 Kontrollnährmedien
nachgewiesen. Wie hier nachfolgend gezeigt wird, ist diese Proteaseaktivität von Transformanten
mit der Asparginsäurefamilie
von Carboxylproteasen, von welcher Chymosin ein Mitglied ist, verbunden.
-
BEISPIEL 3
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Expression und Sekretion
von Fusionspolypeptiden aus Aspergillus nidulans
-
Zwei Fusionspolypeptide wurden konstruiert
zur Expression und Sekretion aus A. nidulans. Ein Fusionspolypeptid
enthielt einen Amino-terminalen Anteil, welcher aus der Pro-Sequenz
bestand und den ersten zehrt Aminosäuren von Aspergillus niger
Glucoamylase und einem Carboxyl-terminalen Anteil, welcher aus Rinder-Prochymosin
bestand. Das zweite Fusionspolypeptid enthielt einen Amino-terminalen
Anteil, welcher nur aus der Pro-Sequenzaus Aspergillus niger Glucoamylase
bestand und einen Carboxyl-terminalen Anteil, welcher aus Rinderprochymosin
bestand.
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A. Vektoren zum Exprimieren
und Sezernieren von Fusionspolypeptiden
-
Die vorstehenden Fusionspolypeptide
codierenden Vektoren wurden konstruiert durch Deletieren spezifischer
Sequenzen aus mp19GAPR, gefolgt von den gleichen Manipulationen
wie vorstehend zur Konstruktion von pGRGl und pGRG3 beschrieben.
Wie in 8 gezeigt wurden
in mp19GAPR⌂C2 die Nukleotide zwischen den Glucoamylasepropeptidcodons
und die Codons von Prochymosin deletiert unter Verwendung des stellenspezifischen vorstehend
beschriebenen Mutageneseverfahrens. Die Sequenz des für diese
Mutagenese (Primer 2) synthetisierten Oligonukleotids war
5'-TGATTTCCAAGCGCGCTGAGATCACCAG
3'.
-
Diese Mutation sollte den Glucoamylasepromotor,
das Signalpeptid und Propeptidcodons an den ersten Codon von Prochymosin
binden. In mp19GAPR⌂C4 wurden die Nukleotidsequenzen zwischen
dem zehnten Codon von reifer Glucoamylase und den Codons von Prochymosin
deletiert durch M13 stellenspezifische Mutagenese mit dem synthetischen
Oligonukleotid (Primer 4).
5'-TGAGCAACGAAGCGGCTGAGATCACCAG 3'.
-
Diese Deletion verband den Glucoamylasepromotorbereich,
die Signalpeptidsequenz, die Propeptidsequenz und zehn Codons der
reifen Glucoamylase mit den Codons von Prochyomosin wie in 8 gezeigt. Diese als pGRG2
und pGRG4 bezeichneten Expressions- und Sekretionsvektoren wurden
verwendet, um A. nidulans zu transformieren.
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B. Expression und Sekretion
von Chymosin von mit PGRG2 und PGRG4 transformiertem Aspergillus
nidulans
-
pGRG2 und pGRG4 Transformanten wurden
wie vorstehend beschrieben kultiviert. Das Kulturmedium wurde auf
Chymosinaktivät
durch Wester-Blots untersucht und ergab ähnliche Ergebnisse wie sie
für pGRG1
und pGRG3 erhalten wurden. Die Integration von einem pGRG2 Transformanten
wurde durch Southern Analyse (Ergebnisse nicht gezeigt) sichergestellt.
Die Ergebnisse des Chymosinversuchs sind in Tabelle III dargestellt.
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-
Wieder zeigte jeder der Transformanten
eine Proteaseaktivität über derjenigen
der pDJB3 Kontrolle, was anzeigte, daß eine Protease von den Transformanten
exprimiert und sezerniert wird. Wie bei pGRG1 und pGRG3 gehören diese
Proteasen zu der Asperaginsäurefamilie
von Carboxylproteasen, wie es durch die Pepstatininhibition bewiesen
wird. Im speziellen zeigen diese Ergebnisse, daß Hybridpolypeptide in einem
Fadenpilz exprimiert wurden.
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BEISPIEL 4
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Pepstatininhibitionsuntersuchung
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Drei der vorstehenden Vektoren, welche
die verschiedenen Chymosin umfassenden Konstruktionen enthielten,
wurden in dem wie vorstehend beschriebenen Pepstatininhibitionstest
analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gegeben.
-
-
Die mit Pepstatin präinkubierten
Proben zeigen einen deutlichen Abfall der Aktivität, was anzeigt,
daß die
durch die Transformanten erzeugte Protease aus der Asparaginsäurefamilie
von Säureproteasen
ist, von welcher Chymosin ein Mitglied ist. Diese Daten zeigen zusammen
mit den Ergebnissen aus den Western-Analysen, daß biologisch aktives Chymosin
von, mit pGRGl, pGRG2, pGRG3 und pGRG4 transformiertem A. nidulans
G191 exprimiert und sezerniert wird.
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Die Variation im Ausmaß der für verschiedene
Vektorkonstruktionen in Beispiel II und Beispiel III nachgewiesenen
Chymosinaktivität
kann Unterschiede im Erkennen der in jedem Transformationsvektor
eingeführten
verschiedenen Signale wiederspiegeln. Innerhalb einer speziellen
Konstruktion kann die Variation in der Chymosinaktivät mit der
Kopienanzahl des in das Pilzgen eingebrachten Vektors und/oder der
Lage einer derartigen Integration zusammenhängen.
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BEISPIEL 5
-
Kohlenstoffquellenstudien
-
Ein Vektor, pGRG4, wurde verwendet,
um A. nidulans G191 zu transformieren, welcher hiernach auf den
verschiedenen vorstehend beschriebenen Kohlenstoffquellen gezüchtet wurde.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle V gezeigt.
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Tabelle
V
Ausmaß der
auf verschiedenen Kohlenstoffquellen (μg/ml) erzeugten Chymosinaktivität
Diese Ergebnisse zeigen klar, daß Chymosin,
ungeachtet der Kohlenstoffquelle, sezerniert wird. Dies legt nahe,
daß die
Transkriptionsregulierung des Glucoamylasepromotors verschieden
ist von der in A. niger, d.h. nicht stark durch Stärke induzierbar
ist.
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BEISPIEL 6
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Expression und Sekretion
von Mucor meihei Carboxylprotease
-
A. Carboxylproteasegensonde
-
Die primäre Teilstruktur von Mucor meihei
Säureprotease
(54) wurde für
den Bereich niedrigster genetischer Redundanz untersucht. Die Reste
187 bis 191 (unter Verwendung des Schweine Pepsin-Numerierungssystems),
try-tyr-phe-trp-asp wurden ausgewählt. Zur Codierungssequenz,
welche dieser Aminosäuresequenz
entsprach komplementäre
Oligonukleotide
5'-GC(G/A)TCCCA(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TA-3'
wurden synthetisiert
(31) und unter Verwendung von Gamma-32P-ATP und T4 Polynukleotidkinase (30)
markiert.
-
B. Klonierung von Mucor
meihei Carboxylprotease
-
Genomische DNA von Mucor meihei (Centraal
Bureau Voor Schimmelcultures, Holland 370.75) wurde wie folgt hergestellt.
In YMB-Medium gezüchtete
Zellen (3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Malzextrakt, 5 g/l Pepton, 10 g/l
Glucose) wurden durch Zentrifugation gesammelt, zweimal mit 0,5
M NaCl gewaschen und lyophilisiert. Die Zellwände wurden dann durch Zugabe
von Sand zu den Zellen und Reiben des Gemischs mit einem Mörser und
einem Pestil aufgebrochen. Das resultierende Pulver wurde in einer
Lösung
(15 ml pro Gramm Trockengewicht) suspendiert, welche 25% Sucrose,
50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 10 mM EDTA enthielt. SDS wurde bis zu
einer Endkonzentration von 0,1 zugegeben und die Suspension wurde
einmal mit einem halben Volumen Phenol und dreimal mit halben Volumina
Chloroform extrahiert. Die schließlich erhaltene wäßrige Phase wurde
ausgiebig gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 1 mM EDTA dialysiert.
Die DNA wurde dann durch Zugabe von Natriumacetat, pH 5,5, auf eine
Konzentration von 0,3 M, gefolgt von der Zugabe von 2,5 Volumina kaltem
Ethanol präzipitiert.
Aliquote dieser DNA wurden mit einer Vielzahl von Restriktionsendonukleasen
gemäß den Anweisungen
der Hersteller verdaut und dann auf, zu den Sequenzen der vorstehend
beschriebenen Sonden komplementäre
Sequenzen untersucht, unter Verwendung des Verfahrens von Southern.
Eine positive Hybridisierungsbande von etwa 2,5 kb (Kilobasen) wurde
in der HindIII verdauten DNA identifiziert. HindIII verdaute genomische
DNA wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und ein
Gelfragment, welches DNA mit 2,0 bis 3,0 kb enthielt wurde elektroeluiert,
wie vorstehend beschrieben. Die elektroeluierte DNA, von welcher
angenommen wurde, daß sie
angereichert war mit dem Mucor miehei Säureproteasegen entsprechenden
Sequenzen, wurde mit Ethanol präzipitiert.
Der Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017) wurde mit HindIII verdaut
und unter Verwendung von bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
In einer typischen 10 μl
Reaktion wurden 100 ng Vektor und 100 mg von der größenangereicherten
DNA in der Gegenwart von ATP und T4 DNA Ligase verbunden. Die Reaktion
wurde verwendet, um E.coli 294 (ATCC 31446) durch das Calciumschockverfahren
(30) zu transformieren. Etwa 2,0 × 104 Ampicillin-resistente
Klone wurden erhalten. Ungefähr
98% von diesen enthielten klonierte Inserts wie durch ihre Unfähigkeit
auf Tetracyclin enthaltendem Medium zu wachsen gezeigt wurde. Diese
Kolonien wurden durch ein Standard-Kolonie-Hybridisierungsverfahren
auf das Vorliegen von zu den DNA-Sonden komplementären Sequenzen
getestet. Es wurde gefunden, daß eine
positiv hybridisierende Kolonie, welche das pMe5'muc Plasmid enthielt einen HindIII Insert
der erwarteten 2,5 kb Größe enthielt.
Die Termini dieses Fragments wurden in M13 Sequenzierungsvektoren
(33) subkloniert und ihre Sequenzen durch das Dideoxykettenterminationsverfahren
bestimmt. Ein Terminus enthielt Sequenzen, welche der bekannten
Amino-terminalen Aminosäuresequenz
des Säure-Proteasegens
entsprach. Der benachbarte 3'-Bereich
wurde sequenziert, um mehr C-terminale codierende Sequenzen zu erhalten.
Die Sequenzierungsstrategie ist in 10 gezeigt.
Auf diesem Weg wurde die vollständige codierende
Sequenz für
die reife Form des Proteins erhalten. Es wurde gefunden, daß das 5' Ende des Fragments
112 bp (Basenpaare) stromaufwärts
von dem, dem reifen Aminoterminus entsprechenden Codon lag. Da dieser
Stromaufwärts-Bereich
keine Initiationscodons im Leserahmen enthielt, wurde angenommen,
daß er
Teil eines Propeptids ist.
-
Um DNA zu erhalten, welche den Initiationscodon
als auch nicht translatierte 5' Sequenzen
enthielt, wurde ein Klon, der weiter 5' liegende Sequenzen enthielt, wie folgt
isoliert. Ein HindIII-ClaI 813 bP 5' Subfragment des pMe5'Cla HindIII Inserts
wurde isoliert und durch das Nick-Translationsverfahren (30) markiert.
Dieses markierte Fragment wurde verwendet, um ClaI verdaute Mucor
miehei genomische DNA durch das Verfahren von Southern zu untersuchen.
Dieser Versuch zeigte eine einzelne Hybridisierungsbande, entsprechend
einem Molekulargewicht von ungefähr
1300 bp. Nach der Größe angereicherte
DNA dieser Größe wurde
isoliert und kloniert in ClaI verdauten und dephosphorylierten pBR322,
wie vorstehend beschrieben.
-
Ungefähr 9000 Ampecillin-resistente
Kolonien wurden erhalten. Etwa 90% von diesen enthielten klonierte
Inserts, wie durch ihre Unfähigkeit
auf Tetracyclin enthaltendem Medium zu wachsen, gezeigt wurde. Diese
Kolonien wurden durch ein Standard-Kolonie-Hybridisierungsverfahren
auf das Vorliegen von Sequenzen getestet, welche komplementär zu denen
der Nicktranslatierten Sonde sind. Es wurde gefunden, daß eine positiv
hybridisierende, Plasmid pMe2 enthaltende Kolonie ein ClaI Insert
der erwarteten 1,3 kb Größe enthält. Sequenzieren
der Enden dieses Fragments zeigte, daß ein Terminus Sequenzen nahe
der ClaI Stelle des HindIII Fragments in pMe5'Cla entsprach und erlaubte somit die
Orientierung des Fragments, welche in 10 gezeigt
ist. Weiteres Sequenzieren des Cla2-Fragments offenbarte den Initiationscodon
und nicht translatierte 5' Sequenzen.
Die vollständige
Codierungssequenz und die 5'-
und 3'-flankierenden
Sequenzen sind in 10 gezeigt.
Vergleich der deduzierten primären
Struktur mit der durch direktes Aminosäuresequenzieren Bestimmten
zeigt, daß das
Mucor Protein als eine Vorstufe mit einer Amino-terminalen Extension
von 69 Resten hergestellt wird. Basierend auf den im allgemeinen
in den Leaderpeptiden vorliegenden strukturellen Merkmalen ist es
wahrscheinlich, daß die
Reste –21
bis –1
ein Leaderpeptid umfassen und daß die Reste 21 bis 69 ein,
zu dem in den zymogenen Formen anderer sauren Proteasen, einschließlich Chymosin
und Pepsin (55) gefundene analoge Propeptide umfassen.
-
C. Mucor meihei Carboxylprotease
Expressions- und Sekretionsvektor
-
Ein Vektor zum Exprimieren und Sezernieren
von Mucor meihei Carboxyprotease umfaßt die vollständige native
Mucor meihei saure Protease-Transkriptions-Einheit, umfassend die
codierende Sequenz, 5'-flankierende
Sequenzen (Protomor) und 3'-flankierende
Sequenzen (Terminator und Polyadenylierungsstelle).
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Die Gesamtstrategie zum Herstellen
dieses Vektors ist in 12 dargestellt.
Der Aspergillus nidulans Transformationsvektor pDJB1 wurde mit ClaI
und EcoR1 verdaut und das größere Vektorfragment
(Fragment 1) wurde isoliert. Das Plasmid pMe5'Cla wurde mit EcoR1 und ClaI verdaut
und Fragment 2 wurde isoliert. Dieses Fragment enthält die 5' Codons der sauren
Protease zusammen mit etwa 500 bp 5' flankierender Sequenzen. Die Fragmente
1 und 2 wurden durch Ligation verknüpft und verwendet, um E.coli
294 zu transformieren. Eine Plasmid pMeJBint enthaltende Ampicillin-resistente
Kolonie wurde isoliert. Dieses Plasmid wurde mit ClaI verdaut und
mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, um Selbstligation
zu verringern und wird als Fragment 3 bezeichnet. Plasmid pMe2 wurde
mit ClaI verdaut und das kleinere Fragment (Fragment 4) wurde isoliert.
Dieses Fragment enthält
die 3' Codons von
Mucor miehei saurer Protease und etwa 1800 bp von 3' flankierenden Sequenzen.
Die Fragmente 3 und 4 wurden durch Ligation verknüpft und
verwendet, um E.coli 294 zu transformieren. Eine, Plasmid pMeJB1-7
enthaltende, Ampicillin-resistente Kolonie wurde isoliert. Dieser
Vektor wurde verwendet, um Aspergillus nidulans zu transformieren.
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D. Expression und Sekretion
von Mucor miehei Carboxylprotease durch Aspergillus nidulans
-
Southern-Blot-Analysen von sechs
Transformanten zeigten das Vorliegen des vollständigen Gens für saure
Protease aus Mucor miehie im Aspergillus nidulans Genom (Ergebnisse
nicht gezeigt). Zusätzlich
wurde jeder der Transformanten durch Western-Blots (Ergebnisse nicht
gezeigt) und auf saure Proteaseaktivität analysiert. Die Ergebnisse
der Proteaseuntersuchung sind in Tabelle VI gezeigt.
-
-
Diese Versuche zeigen die Expression
und Sekretion eines Proteins, welches mit spezifischem Antikörper gegen
Mucor miehei Carboxylprotease reagiert und welches Milchflockungsaktivität aufweist.
Das Protein hat gemäß elektrophoretischer
Analyse ein anscheinendes Molekulargewicht, welches etwas höher als dasjenige
des authentischen (von Mucor miehei stammenden) Proteins hat. Dies
kann anzeigen, daß Aspergillus
nidulans dieses Glycoprotein zu einem von Mucor miehei verschiedenen
Ausmaß glykosyliert.
Da die aus Aspergillus nidulans stammende saure Protease aus Mucor
meihei anscheinend die gleiche spezifische Aktivität aufweist
wie das authentische Material, erscheint es, daß sie zu der reifen Form (durch
die Zelle oder autokatalytisch) prozessiert wurde. Die unprozessierten
Formen anderer saurer Proteasen, wie etwa Chymosin und Pepsin sind
zymogene, welche eine Prozessierung (autokatalytisch) erfordern,
bevor Aktivität
erreicht wird.
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Die unterschiedlichen Expressionsgrade
in den verschiedenen Transformanten können die Position oder Kopieanzahl
des Proteasegens in dem Aspergillus nidulans Genom wiederspiegeln.
Jedoch zeigt die Expression und Sekretion von biologisch aktiver
Carboxylprotease an, daß der
A. nidulans die Promotor-Signal- und
Terminatorsignale von Mucor miehei Carboxylprotease erkennt.
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BEISPIEL 7
-
Expression und Sekretion
von durch pGRG1-4 codiertem Chymosin aus A. Awamori und Trichoderma
reesei pyrG auxotrophen Mutanten
-
Die Plasmide pGRGl bis pGRG4 (pGRG1-4)
wurden ebenfalls verwendet, um Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase (OMPCase) defiziente
Mutanten von A.awamori und Trichoderma reesei zu transformieren.
Das durch das pGRG1-4 Plasmid codierte pyr4 Gen von N.crassa komplementiert
diese OMPCase Mutanten in der Abwesenheit von Uridin, um die Isolierung
von erfolgreichen Transformanten zu erlauben. Die so transformierten
Mutanten von A.awamori und T.reesei sezernierten nachweisbare Mengen
von biochemisch aktivem Chymosin in das Kulturmedium.
-
A. Herstellung von pyrG
Auxotrophen
-
Das zum Erhalten von pyrG auxotrophen
Mutanten von A.awamori und T.reesei verwendete Verfahren umfaßte eine
Selektion auf der Pyrimidin-analogen 5'-Fluor-orotsäure (FOA) (56). Der
Mechanismus, nach welchem FOA Wildtypzellen zerstört ist unklar.
Jedoch ist es im Hinblick auf die Resistenz von OMPCase defizienten
Mutanten gegen FOA wahrscheinlich, daß die Toxizität durch
die Umwandlung von FOA zu 5-Fluor-UMP auftritt. Ob der Zelltod durch
ein fluoriertes Ribonukleotid oder Deoxyribonukleotid verursacht
wird, ist unklar.
-
Die folgenden Verfahren beschreiben
die Isolierung von OMPCase-defizienten (FOA-resistenten) Mutanten
von T.reesei und A.awamori:
-
1. Trichoderma
reesei
-
Eine frische Sporensuspension von
T.reesei Stamm P37 (NRRL 15709) wurde dreimal in sterilem destilliertem
Wasser, welches 0,01% Tween-80 enthielt, gewaschen. Fünfzehn Milliliter
dieser Sporensuspension (1 × 107 Sporen pro ml) wurden in eine sterile Petrischale
(100 × 20
mm) mit einem sterilen Magnetrührstab eingebracht.
Der Deckel wurde entfernt und die Sporen wurden ultraviolett (UV)
Licht bei 254 nm (7000 uW pro cm2) im Dunkeln
ausgesetzt, bei einer Entfernung von 25 cm von der UV-Lichtquelle.
Die Sporen wurden konstant gerührt.
Das UV-Aussetzen wurde für
drei Minuten (ausreichend um 70 getötete Sporen zu ergeben) fortgesetzt.
Die bestrahlte Sporensuspension wurde in einem 50 ml Zentrifugenrohr
gesammelt und im Dunkeln für
eine Stunde gelagert, um Photoreaktivierung zu verhindern. Die Sporen
wurden durch Zentrifugation pelletiert und das Pellet wurde in 200 μl sterilem
Wasser, welches 0,01% Tween-80 enthielt, resuspendiert.
-
Die Suspension wurde verdünnt und
auf YNB Agarmedium (0,7 Hefestickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 2%
Glucose, 10 mM Uridin, 2% Agar) (56) plattiert, welches
0,15% FOA (SCM Specialty Chemicals, Gainsville, Florida) enthielt.
Nach 4 Tagen Inkubation bei 30°C
wurden 75 Kolonien in frischem YNB Altar, welcher FOA enthielt,
gespickt. 62 der 75 Kolonien wuchsen und wurden mit Zahnstochern
auf Minimalagar (6 g/l NaNO3, 0,52 g/l KCl,
1,52 g/l KH2PO4),
1 ml/l Spurenelementelösung,
1% Glucose, 0,1% MgSO4, 20 g/l Agar) und
auf Minimalagar plus 1 mg/ml Uridin gepickt, um Uridinanforderungen
zu bestimmen. Alle 62 Isolate wuchsen auf Minimalagar mit Uridin,
aber 9 Isolate waren nicht in der Lage auf Minimalagar alleine zu
wachsen. Diese 9 Stämme
wurden wieder auf Minimalagar und Minimalagar mit Uridin gespickt.
Zwei der Stämme
wuchsen nur auf Minimalagar, welcher zusätzlich Uridin enthält. Einer
dieser als T.reesei pyrG29 bezeichnete, wuchs gut auf Minimalmedium
mit Uridin ohne Hintergrundwachstum auf Minimalmedium alleine.
-
2. Aspergillus awamori
-
(i) Herstellung von A.awamori
Stamm UVK 143f- ein Hyperproducer von Glucoamylase
-
Sporen von A.awamori Stamm NRRL 3112
wurden nach 5 bis 7 Tagen Wachstum auf Kartoffeldextroseagar (PDA,
Difco Co.) bei 30°C
erhalten. Die Sporen wurden geerntet durch Waschen der Oberfläche der Platte
mit sterilem 0,1 %-igem Tween-80 in destilliertem Wasser und vorsichtigem
Abschaben der Sporen. Die Sporen wurden durch Zentrifugation gewaschen
und im selben Puffer resuspendiert, um eine Endkonzentration von
zwischen 1 × 107 bis 2 × 108 Sporen/ml zu ergeben. Die Präparationen
wurden bei 4°C
gelagert.
-
Zwei ml Sporen wurden in eine sterile
Petrischale gegeben. Der obere Teil der Schale wurde entfernt und
die Sporen wurden einer Ultraviolett-(UV)-Lampe (15 Watt, keimtötend) ausgesetzt.
Bedingungen der Aussetzzeit und des Abstandes von der Lampe wurden
derartig eingestellt, daß 90
bis 99,9% der Sporen getötet wurden. Überlebende
Sporen wurden auf PDA-Medium
plattiert und gezüchtet,
um einzelne unabhängige Kolonien
zu bilden.
-
Sporen von einzelnen mutagenisierten
Kolonien wurden in 50 ml Screeningmedium inokuliert, welches aus
5% Maismehl, 0,5 Hefeextrakt, 2% Maistränkflüssigkeit, eingestellt auf pH
4,5 enthielt, vor der Sterilisation in 250 ml Kolben. Jedoch wurde
erwartet, daß ein
beliebiges Medium, welches Mais oder Maisstärke als Kohlenstoffquelle enthält die gleichen
Ergebnisse liefern würde.
Die Kulturen wurden für
4 bis 5 Tage bei 30 bis 35°C
unter konstantem Schütteln
gezüchtet.
Proben wurden entweder täglich
oder am Ende des Laufs für
Untersuchungen genommen.
-
Es wurden Abschätzungen der Glucoamylaseaktivität vorgenommen
durch Messen des Freisetzens einer farberzeugenden Gruppe (Para-nitrophenol)
aus einem farblosen Substrat (p-Nitrophenyl-alpha-glucosid, PNPAG).
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Die folgende Vorschrift wurde verwendet:
Substrat – 180 mg
PNPAG wurden in 250 ml 0,1 M NaAcetatpuffer, pH 4,7, gelöst. Bei
4°C gelagert.
-
Untersuchung – 1 ml Substrat wurde bei 40°C in einem
Wasserbad äquilibriert.
0,2 ml Probe (oder verdünnte
Probe) wurden zugegeben und für
30 Minuten bei 40°C
inkubiert. 9 ml 0,1 M Na2CO3 wurden
zugegeben, wobei das Gemisch bei Raumtemperatur für 15 Minuten
zur Farbentwicklung gehalten wurde. Das Gemisch wurde durch ein
Wattman 42-Filterpapier filtriert und die Absorption bei 420 nm
wurde in einem geeigneten Spektralphotometer abgelesen. Die PNPAG-Gehalte
aller Mutanten wurden mit der Standardmenge verglichen, welche durch
den Ursprungsstamm erzeugt wurde und wurden als Prozent PNPAG-Hydrolyse
des Ursprungsstamms angegeben.
-
Ein als UVK 143f bezeichneter Glucoamylasehyperproduzierender Stamm
wurde für
auxotrophe Mutagenese ausgewählt.
-
(ii) Auxotrophe Mutagenese
-
Die Herstellung von Sporen aus A.awamori
Stamm UVK143f, UV-Mutagenese
und Mutantenanalyse war wie für
T.reesei beschrieben, mit den folgenden Modifikationen:
- a. 2,5 Minuten waren erforderlich um 70% Tötung mit UV-Licht zu ergeben.
- b. Anstelle von YNB-Agar wurde Minimalmedium verwendet.
- c. Die FOA-Konzentration war 0,1%.
-
Fünfzehn
pyrG Mutanten wurden gefunden. Drei dieser Isolate, als pyr4-5,
pyr4-7 und pyr4-8 bezeichnet, wurden für Transformationsexperimente
ausgewählt.
-
B. Transformation von
A.awamori und T.reesei pyr Auxotrophen
-
A.awamori und T.reesei Auxotrophe
wurde durch eine Modifikation des vorstehend beschriebenen Verfahrens
für A.
nidulans transformiert. Ungefähr
1 × 108 Sporen wurden in Hefeextraktglucose (YEG)
Medium, welches aus 2% Glucose, 0,5 Hefeextrakt und zusätzlich 1
mg/ml Uridin besteht, inokuliert. Die Kulturen wurden auf einem
37°C-Schüttler (200
rpm) für
12 bis 15 Stunden inkubiert [T.reesei wurde bei 30°C inkubiert]. Keime
wurden durch Zentrifugation geerntet, einmal mit sterilem YEG-Medium
gewaschen, dann bei 30°C
in 50% YEG-Medium,
welches 0,6 M KCl, 0,5% Novozyme 234 (Novo Industries, Dänemark),
0,5% MgSO4·7H2O,
0,05 Rinderserumalbumin enthielt, in einer sterilen 200 ml Kunststoffflasche
(Corning Corp., Corning, N.Y.) inkubert. Nach 30 Minuten Schütteln bei
150 UPM wurde die Protoplastensuspension fünfmal mit einer 10 ml Pipette
kräftig
auf und nieder pipettiert, um die Klumpen zu dispergieren. Die Protoplastensuspension
wurde weiter wie zuvor für
eine Stunde inkubiert und dann durch steriles Miracloth (Calbiochem-Behring Corp., LaJolla,
Californien) filtriert, welches mit 0,6 M KCl angefeuchtet war.
Die filtrierten Protoplasten wurden zentrifugiert, gewaschen und
mit jedem der pGRG1-4 Plasmide wie vorstehend beschrieben transformiert.
-
Die folgenden Modifikationen wurden
für die
A.awamori Transformation vorgenommen:
- 1. 0,7
M KCl wurde anstelle von 0,6 M KCl verwendet.
- 2. 1,2 M Sorbitol wurde anstelle von 0,6 M KCl verwendet, um
das Transformations- und Regenerationsmedium osmotisch zu stabilisieren.
-
C. Analyse von A.awamori
und T.reesei Transformanten
-
Sowohl A.awamori als auch T.reesei
Transformanten sezernierten Chymosinpolypeptide in das Kulturmedium.
Dieses wurde bestimmt durch Analyse von Kulturfiltraten (Ergebnisse
nicht gezeigt) sowohl für
enzymatisch aktives Chymosin (Milchflockungsversuch) und Chymosinpolypeptide,
welche mit spezifischen Chymosinantikörpern reagierten (Enzymimmunoassay
und Western-Immunblottingtechniken).
-
BEISPIEL 8
-
Expression und Sekretion
von heterologen Polypeptiden von argB auxotrophen Mutanten aus Aspergillus
Species
-
Die Expression und Sekretion von
heterologen Polypeptiden von argB Auxotrophen aus Aspergillus Spezies
wurde ebenfalls erreicht.
-
Dieses Beispiel beschreibt die komplementäre Transformation
von A.nidulans und A.awamori argB Auxotrophen mit Vektoren, welche
das argB Gen von A.nidulans und DNA-Sequenzen enthalten, welche
die heterologen Polypeptide der Plasmide pGRG1-4 codieren. Das argB
Gen codiert Ornithintranscarbamylase (OTC).
-
Der A.nidulans argB Auxotrophe, der
die genetischen, hier verwendeten Marker biA1, argB2, metG1 enthält, wurde
erhalten von Dr. P. Weglenski, Department of Genetics, Warschauer
Universität,
Al. Ujazdowskie 4,00–478
Warschau. Polen. Der A. awamori argB Mutant wurde wie folgt erhalten.
-
A. Isolierung von Aspergillus
awamori argB auxotrophen Mutanten
-
Eine frische Suspension von A.awamori
Stamm UVK 143k Sporen wurde hergestellt und UV-Mutagenese wurde
durchgeführt,
wie vorstehend beschrieben, ausgenommen, daß die Aussetzzeit ausreichend
war, um 95% der Sporen zu töten.
Die Sporen wurden dann zentrifugiert, mit sterilem Wasser gewaschen
und in 25 ml sterilem Minimalmedium resuspendiert. Diese Suspensionen
wurden in einem 37°C
Schüttler
unter kräftiger Belüftung inkubiert.
Unter diesen Bedingungen werden Wildtypsporen keimen und in vegetativen
Mycelia wachsen, aber auxotrophe Mutanten werden dies nicht tun.
Diese Kultur wurde aseptisch alle 6 bis 8 Stunden für 3 Tage
durch steriles Miracloth filtriert. Dieser Schritt entfernt die
meisten der Wildtyp-Mycelia, während
die nicht gekeimten Auxotrophen durch das Miraclothfilter passieren
(d.h. Filtrationsanreicherung). Bei jedem Filtrationsschritt wurden
die filtrierten Sporen zentrifugiert und in frischem Minimalmedium
resuspendiert. Nach drei Anreicherungstagen wurden die Sporen verdünnt und auf
Minimalagar, welcher zusätzlich
50 mM Citrullin enthielt plattiert. Die Platten wurden bei 37°C für 2 bis
3 Tage inkubiert. Einzelne Kolonien aus diesen Platten wurden mit
Zahnstochern auf zwei Screening-Platten gespickt – eine Platte
welche Minimalagar plus 10 mM Ornithin enthielt und eine Platte,
welche Minimalagar plus 50 mM Citrullin enthielt. Der Grund zum
Picken der Kolonien auf diese Screening-Platten ist wie folgt. OTC
(das argB Genprodukt) katalysiert die Umwandlung von Ornithin zu
Citrullin im biosynthetischen Argininweg. Daher werden argB Mutanten
(Defizient an OTC) auf Minimalmedium plus Citrullin wachsen, aber
nicht auf Minimalmedium mit Ornithin. Das Screening von ungefähr 4000
Kolonien mit diesem Verfahren führte
zu 15 möglichen
argB Mutanten. Eine dieser Stämme,
bezeichnet als A.awamori argB3 ergab kein Hintergrundwachstum auf
Minimalmedium und wuchs sehr gut auf Minimalmedium, welches zusätzlich entweder
Arginin oder Citrullin enthielt. Untersuchungen zum Bestimmen des
Gehalts von OTC-Aktivität
(57) zeigten an, daß der
argB3 Mutant mindestens 30-mal weniger OTC-Aktivität erzeugte,
als der Wildtyp. Auf der Basis dieser Daten wurde der A.awamori
argB3 Stamm für
Transformationsversuche ausgewählt.
-
B. Konstruktion von auf
argB basierenden Prochymosin Expressionsvektoren zur Transformation
von Aspergillus Species
-
Bei dieser Konstruktion (siehe 15) war der erste Schritt
die transformationserhöhende
Sequenz ANS-1 und das selektierbare argB Gen auf demselben Plasmid
zu kombinieren. Um dies zu erreichen wurde Plasmid pBB116 (59),
welches das argB Gen von A.nidulans enthält mit PstI und BamHI verdaut
und das angezeigte Fragment A, welches das argB Strukturgen enthält, wurde
isoliert. Plasmid pDJB2 (59) wurde mit EcoR1 und PstI verdaut
und das angezeigte Fragment B, welches die ANS-1 Sequenz enthält, wurde
isoliert. In einer dreiteiligen Ligation wurden die Fragmente A
und B mit Fragment C verbunden, welches das große EcoR1-BamHI Fragment von
dem Plasmidvektor pUC18 (33) enthält, um das Plasmid pARG-DJB
zu ergeben.
-
In dem zweiten Schritt dieser Konstruktion
wurde ein synthetischer DNA-Polylinker, welcher ClaI Stellen enthält, in pARG-DJB
insertiert, um die Insertion von ClaI Fragmenten, welche verschiedene
Prochymosinexpressionseinheiten enthalten, zu erlauben. Plasmid
pARG-DJB wurde mit BamHI verdaut und dann mit bakterieller, alkalischer
Phosphatase dephosphoryliert. Der angegebene synthetische DNA-Polylinker
wurde mit T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert und dann mit den
gespaltenen pARG-DJB ligiert, um pCJ16L zu ergeben. Da gefunden
wurde, daß dieses
Plasmid gegen Verdau mit ClaI resistent ist, wurde es zuerst verwendet,
um den E.coli dam Mutantenstamm
GM48 zu transformieren, um Methylierung der ClaI Stellen zu verhindern.
Nach Isolierung des Plasmids von GM48 Transformanten wurde es mit
Erfolg mit ClaI gespalten und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert.
-
Im letzten Schritt dieser Konstruktion
von ClaI gespaltenem pCJ16L wurde ein Vektor mit jeden der ClaI
Prochymosinexpressionsfragmente von den Plasmiden pGRGl bis pGRG4
verbunden. Die resultierenden vier Plasmide, pCJ::GRG1 bis pCJ::GRG4
wurden verwendet, um die argB Mutanten von A.nidulans und A.awamori
zu Prototrophie zu transformieren. Resultierende Transformanten
wurden auf Expression von Prochymosinpolypeptiden analysiert.
-
C. Analyse von A.nidulans
und A.awamori Transformanten
-
Sezernierte Chymosinpolypeptide von
A.awamori und A.nidulans, welche mit pCJ::GRG1 bis pCJ::GRG4 transformiert
sind, wurden durch die Milchflockungsuntersuchung nachgewiesen und
durch Enzymimmunoassays und Western- Immunblottingtechniken. In jedem Fall
(Ergebnisse nicht gezeigt) sezernierten die transformierten Pilze
biochemisch aktives Chymosin in das Kulturmedium.
-
Obwohl sich das vorgehende auf speziell
bevorzugte Ausführungsformen
bezieht, wird es so verstanden, daß die vorliegende Erfindung
nicht derartig begrenzt ist. Es wird für den Fachmann deutlich, daß verschiedene
Modifikationen zu den offenbarten Ausführungsformen gemacht werden
können
und, daß derartige Modifikationen
im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen sollen.
-
Die in der folgenden Bibliographie
zusammengefaßten
Literaturstellen und entsprechend anhand von Nummern in Klammern
im vorgehenden Text zitierte, werden hiermit durch ihre Nennung
eingeführt.
-
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-
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