DE69133066T2

DE69133066T2 - Verfahren zur Expression heterologischer Gene in der Hefe Pichia Pastoris, Expressionsverfahren und transformierte Mikroorganismen

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Publication number: DE69133066T2
Application number: DE69133066T
Authority: DE
Inventors: Jorge Agustin Aguiar Santiago; Jose Alberto Cremata Alvarez; Julio Marcos Delgado Boada; Gerardo Ferbeyre Binelfa; Beatriz Gonzalez Badillo; TANIA GONZALEZ LÿPEZ; Luis Saturnino Herrera Martinez; Emilio Margollez Clark; Vladimir Martinez Santana; ALFREDO MENENDEZ ALARCÿN; Raquel Montesinos Segui; Juan Morales Grillo; Edenia Paifer Reyes; Angela Estela S Osa Espinosa; Alina Seralena Menendez; Alejandro Silva Rodriguez; Isis Del Carmen Torrens Madrazo; Adelaida Villareal Barrios; Vladimir Yong Gonzalez
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 1990-01-16
Filing date: 1991-01-16
Publication date: 2003-03-06
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: EP0438200B1; JPH05184352A; ATE220721T1; DE69133066D1; DK0438200T3; ES2180528T3; EP0438200A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie und bezieht sich auf rekombinante DNA Techniken. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein neues Verfahren zur effizienten Expression heterologer Gene in rekombinanten methylotrophen Hefen der Gattung Pichia.
Auf dem genannten Gebiet war es eine wichtige Aufgabe Wirt-Vektor Systeme zu entwickeln, die zur Herstellung von Gen-Produkten verwendet werden können, von denen die große Mehrheit aus ihren natürlichen Quellen nicht in signifikanter Menge gewonnen werden können. Es wurden zahlreiche prokariotische und eukariotische Expressionssysteme beschrieben und erfolgreich bei der Herstellung heterologer Proteine in hoher Ausbeute eingesetzt.
Der für diese Zwecke am häufigsten verwertete zelluläre Organismus ist das Bakterium E. coli. Dies ist zum größten Teil auf das Wissen zurück zu führen, das in Bezug auf seine Gen-Regulation vorhanden ist und auf die Möglichkeit das Bakterium E. coli in großer Bandbreite ein zu setzen.
Nichtsdestotrotz ist E. coli nicht der geeignetste Wirt für die Expression jeder Art von heterologen Produkten, insbesondere nicht für Proteine, die von pharmazeutischem oder diätischem Interesse sind, weil dieser Organismus in seiner Zellwand giftige und Fieber erregende Verbindungen erzeugt. Darüber hinaus unterscheidet sich der Mechanismus von Transkription, Translation und Posttranslation von demjenigen eukariotischer Organismen. Daher können sich Proteine eukariotischer Herkunft, die durch E. coli hergestellt werden, von den normalen Gen-Produkten unterscheiden und nicht die benötigte biologische Aktivität aufweisen. Andererseits sind diese Produkte üblicherweise unlöslich und bilden Protein-Aggregate, die nur durch eine chemische Modifikation solubilisiert werden können, was zu einem erheblichen Rückgang ihrer spezifischen Aktivität oder zu einer Erhöhung der antigenen Eigenschaften des erhaltenen Produkts führen kann. Ein anderer Nachteil dieses Wirts ist seine begrenzte Kapazität zur Ausscheidung der Proteine in das Kulturmedium (E. Baron, "E. coli: an Old Friend but New Industrial Microbe", Seiten 27-37; J. Davies, "Retrospect on Heterologous Gene Expression", Seiten 17-26. Fifth International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, 1986. M. Alacevic, D. Hranueli, Z. Toman, eds.).
Die Fähigkeit heterologe Proteine in eukariotischen Systemen wie Hefen her zu stellen weist im Vergleich zu Systemen des prokariotischen Typs bestimmte Vorteile auf. Von diesen Vorteilen sei die Fähigkeit des Wachstums zu hoher Dichte erwähnt. Aus diesem Grund können diese Kulturen an kontinuierliche Systeme angepasst werden (US Patent Nr. 4 414 329, Inhaber Philips Petroleum Co.). Darüber hinaus können Hefen im Vergleich zu E. coli die Proteine in bedeutend größeren Mengen in das Kulturmedium ausscheiden. Daneben sind die für die Fermentation von Hefen verwendeten Kulturmedien im allgemeinen wirtschaftlicher als die für Bakterien verwendeten Medien (Y. Lemoine, "Heterologous Expression in Yeast", 8th International Biotechnology Symposium, Paris, 17.-22. Juli 1988).
Darüber hinaus können diese Systeme posttranslatorische Modifikationen wie zum Beispiel eine Glycosilierung durchführen, die in bakteriellen Systemen fehlt (W. Fiers, "Engineering Maximal Expression of Heterologous Genes in Microorganisms", Bth International Biotechnology Symposium, Paris, 17.-22. Juli 1988). Außerdem können diese Systeme eine bestimmte Bevorzugung der von Zellen höherer Organismen verwendeten Codone zeigen, was einer besseren Expression von Säugetiergenen förderlich ist (S. M. Kigsman et al. "Heterologous Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae", Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, Vol. 3, Ed. G. E. Russell).
In den vergangenen Jahren wurden methylotrophe Hefen, und unter diesen insbesondere Pichia pastoris, erfolgreich für die Klonierung und zur Expression von heterologen Genen eingesetzt (Australische Patentanmeldung Nr. 581 107 von Philips Petroleum Co.). Dadurch wird Pichia pastoris zu einem attraktiven Wirt mit, im Vergleich zu dem herkömmlicherweise für diese Zwecke verwendeten Wirt Saccharomyces cerevisiae, einer Reihe von vorteilhaften Eigenschaften. Diese Vorteile umfassen die Fähigkeit zu sehr hohen Zelldichten anzuwachsen, und die Möglichkeit als Substrat für die Induktion geklonter Gene eine billige Kohlenstoffquelle zu verwenden, die als Abfallprodukt gewonnen wird, wie das bei Methanol der Fall ist. Auf der anderen Seite ist ein Gen- Expressionssystem von Pichia im Vergleich zu den für Saccharomyces beschriebenen Expressionssytemen viel stärker regulierbar. Dies ist ein Vorteil bei der Herstellung von Produkten, die schädliche Effekte in den Wirten, von denen sie hergestellt werden, hervorrufen.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 183 070 von Philips Petroleum wird ein Verfahren zur Transformation einer Mutante der Hefe Pichia pastoris beschrieben, welche für das Enzym Histidinoldehydrogenase auxotroph ist. In dem Verfahren wird als Selektionsmarker das HIS4 Gen von Saccharomyces cerevisiae und das HIS4 der Hefe Pichia pastoris verwendet, für die verschiedene Transformationsvektoren des replikativen und des integrativen Typs verwendet werden.
Von Tschopp et al. wird in Biotechnology 5, 1987, 1305-1308 ein Verfahren zur Expression des Sucrose Invertase SUC2 Gens von Saccharomyces cerevisiae in einer his- Mutante von Pichia pastoris beschrieben. In dem Verfahren wird ein Expressionsvektor verwendet, der den AOX&sub1; Promotor von Pichia pastoris, die Signalpeptidsequenz und die Sucrose Invertase kodierende Sequenz des SUC2 Gens von Saccharomyces cerevisiae und den HIS4 Selektionsmarker von Saccharomyces cerevisiae enthält. Tschopp et al. erhalten einen Pegel von Sucrose Invertase von bis zu 2,5 g/l und 80-90% des Enzym wurde in das Nährmedium abgeschieden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Expression von heterologen Genen in der Hefe Pichia pastoris bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte Herstellung eines Expressionsvektors, der das zu exprimierende heterologe Gen enthält, Transformation eines Pichia pastoris Wirtsstamms, Vermehrung des transformierten Wirtsstamms, welcher das Expressionsprodukt des heterologen Gens produziert und optionales Isolieren des gebildeten Expressionsprodukts, wobei der Expressionsvektor ausgewählt ist aus
(i) dem Expressionsplasmid pPS-7A (CBS 452.90), das eine Expressionskassette enthält, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des Saccharomyces cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen als ein zu exprimierendes heterologes Gen, wobei das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen seinen eigenen Transktiptionsterminator enthält, und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen, und
(ii) Expressionsplasmiden, die eine Expressionskassette enthalten, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des S. cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem zu exprimierenden heterologen Gen, dem S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen,
und worin eine auxotrophe his- Mutante von Pichia pastoris als Wirtsstamm verwendet wird, welche einen Defekt in dem Enzym Imidazol-Glyzerophosphat-Dehydratase aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Expressionsvektor zur Verwendung mit einer auxotrophen his- Mutante von Pichia pastoris zur Verfügung, wobei die auxotrophe his- Mutante von Pichia pastoris einen Defekt in dem Enzym Imidazol-Glyzerophosphat-Dehydratase aufweist.
Besagter Expressionsvektor ist ausgewählt aus
(i) dem Expressionsplasmid pPS-7A (CBS 452.90), das eine Expressionskassette enthält, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des Saccharomyces cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen als ein zu exprimierendes heterologes Gen, wobei das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen seinen eigenen Transkriptionsterminator enthält, und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen, und
(ii) Expressionsplasmiden, die eine Expressionskassette enthalten, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des S. cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem zu exprimierenden heterologen Gen, dem S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung einen Pichia pastoris Stamm bereit, der durch Transformation eines auxotrophen his- Mutanten von Pichia pastoris mit einem Expressionsvektor erhalten wird, wobei der auxotrophe his- Mutant von Pichia pastoris einen Defekt in dem Enzym Imidazol-Glyzerophosphat-Dehydratase aufweist. Besagter Expressionsvektor ist ausgewählt aus
(i) dem Expressionsplasmid pPS-7A (CBS 452.90), das eine Expressionskassette enthält, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1;, Promotors und der Signalpeptidsequenz des Saccharomyces cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen als ein zu exprimierendes heterologes Gen, wobei das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen seinen eigenen Transkriptionsterminator enthält, und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen, und
(ii) Expressionsplasmiden, die eine Expressionskassette enthalten, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des S. cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von einem zu exprimierenden heterologen Gen, dem S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Expression heterologer Gene, wobei als Wirt ein neuer auxotropher Mutantenstamm des Stamms BKM-90 von Pichia pastoris (BKM, Moskau, USSR) verwendet wird, der mit MP-36 bezeichnet wird. Die vorliegende Erfindung stellt dieses Verfahren auch zur Verfügung. Die genannte Mutante weist einen Defekt des Enzyms Imidazol-Glyzerophosphat-Dehydratase (IGP Dehydratase) im Biosyntheseweg von Histidin auf und wurde durch Mutagenese mit N-Methyl-N-nitro-nitroso-guanidin (NTG) und durch Anreicherung unter Verwendung von Nystatin erhalten.
Ein neues Merkmal dieses Verfahrens ist die Verwendung des HIS3 Gens von S. cerevisiae als Selektionsmarker in dem neuen Mutantenstamm aus der Gattung Pichia.
Es wurde gefunden, dass diese Mutante eine hohe Stabilität aufweist (Frequenz der Reversion 10&supmin;&sup8;) und zudem in der Lage ist mit einer hohen Effizienz transformiert zu werden, welche sogar die Ergebnisse übertrifft, die für Vektoren des integrativen Typs, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu erwarten sind.
Der zur Selektion des Mutanten MP-36 konstruierte Vektor ist pHIS-85 (Fig. 1). Dieser Vektor enthält das HIS3 Gen von S. cerevisiae, welches als Selektionsmarker dient, und daneben ein chromosomales DNA-Fragment von Pichia pastoris, welches der Integration dient.
Dieser Vektor ist so konstruiert, dass überprüft werden kann, ob das HIS3 Gen von S. cerevisiae eine his- Mutation von Pichia pastoris komplementieren kann, und dass die Mutante MP-36 besagter Hefe unter diesen Bedingungen auf eine hocheffiziente Weise transformiert werden kann.
Ein weiteres neues Merkmal dieses Verfahrens ist die Verwendung des integrativen Vektors pPS-7 (Fig. 3) als Klonierungsvehikel für heterologe Gene in Pichia pastoris. Eine charakteristische Eigenschaft dieses Vektors ist die Tatsache, dass er das HIS3 Gen von S. cerevisiae als Selektionsmarker enthält. Er enthält daneben den Promotor des Alkohol Oxidase Gens von Pichia pastoris (AOX&sub1;) gefolgt von dem Signalpeptid des Sucrose Invertase Gens (SUC2) von S. cerevisiae; als Transkriptionsterminator enthält er den Transkriptionsterminator von Glyzerinaldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase (GAPt) von S. cerevisiae. Alternativ kann das Terminationssignal des Gens verwendet werden, das tatsächlich für die Exprimierung gewünscht wird (Vektor pPS-7A, Fig. 2).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Expressionsvektoren pPEGF-L, pPS-7A, pPSA-3, pPPC316-3 und pRH-4, die in der Transformation der Mutante MP-36 verwendet werden um heterologe Proteine wie den epidermalen Wachstumsfaktor, Invertase, Alpha-Amylase, Rinderrennin und Pilzrennin zu erhalten. Die vorliegende Erfindung stellt die genannten Expressionsvektoren auch zur Verfügung.
Insbesondere wurde für die Expression eines heterologen Gens das den humanen epidermalen Wachstumsfaktor (hEGF) kodierende Gen ausgewählt und durch Synthese hergestellt (Fig. 6). Dieses Gen wurde in den integrativen Vektor pPS-7 zwischen das Signalpeptid von SUC2 und GAPt (Fig. 4) insertiert. Der Wirt MP-36 wurde mit diesem Vektor transformiert. Der Klon MEGF-5, auf den sich die vorliegende Erfindung ebenfalls bezieht, zeigt, nachdem er unter geeigneten Bedingungen fermentiert und mit Methanol induziert wurde, einen Expressionsgrad über 2,5 g/l Kultur. Dieser Klon wurde aus den Transformanten ausgewählt.
Die für dieses Protein erreichten hohen Expressionsgrade erlaubten es, ein effizientes Herstellungsverfahren zu entwickeln, wodurch ein Endprodukt mit hoher Reinheit erhalten wurde, welches für pharmazeutische Anwendungen geeignet ist.
Für die Expression der Sucrose Invertase wurde der Transformationsvektor pPS-7A verwendet, der sich von pPS-7 dadurch unterscheidet, dass er GAPt nicht enthält. Der Wirt MP-36 wurde mit diesem Transformationsvektor transformiert und der Klon MSUC-2, auf den sich die vorliegende Erfindung ebenfalls bezieht, wurde aus den Transformanten ausgewählt. Der erreichte Enzymexpressionsgrad lag über 4 g/l, wodurch die Effizienz dieses Verfahrens zur Expression heterologer Gene unter Verwendung ihrer eigenen Transkriptionsterminatoren verifiziert werden konnte.
Der dadurch erhaltene rekombinante Stamm MSUC-2 weist die Eigenschaft der Retention des Enzyms in dem periplasmischen Raum auf, wodurch er für den Gebrauch in immobilisierten Zellsystemen besser geeignet ist.
Im Fall der Alpha-Amylase ergab eine Transformation der Mutante MP-36 mit dem Vektor pPSA-3 den Klon MPA 3625, welcher zur Hypersekretion eines thermo-stabilen Alpha-Amylase Enzyms in Mengen über 6 g/l Kultur fähig ist. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf diesen Klon.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die folgenden rekombinanten Stämme und stellt die folgenden rekombinanten Stämme auch zur Verfügung:
- CLRB-4, der zur Herstellung von Rinderchymosin in einer Menge von 1-2 g/l Kultur fähig ist und der aus einer Transformation der Mutanten MP-36 mit dem Vektor pPPC316-3 stammt, und
- CLRH-1, der zur Herstellung von Pilzchymosin (Mycorennin) in einer Menge von mehr als 7 g/l unter den Bedingungen einer halbkontinuierlichen Kultur fähig ist und der aus einer Transformation der Mutanten MP-36 mit dem Vektor pRH-4 stammt.
Die Hinterlegung der folgenden Stämme erfolgte unter den Regeln des Budapester Abkommens bei dem Centraalbureau voor Schimmel-cultures (CBS), Baarn, Niederlande, am 22. Oktober 1990:
CBS 454.90, Pichia pastoris CLRB-4 (pPPC316-3)
CBS 453.90, Pichia pastoris CLRH-1 (pRH-4)
CBS 452.90, Pichia pastoris MSUC-2 (pPS-7A)
CBS 451.90, Pichia pastoris MPA 3625 (pPSA-3)
CBS 449.90, Pichia pastoris MEGF-5 (pPEGF-L).
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben.

BEISPIEL 1:

Um eine Mutagenese von Pichia durchführen zu können wurden Kulturen des Hefestamms BKM-90 in 100 ml YPG Medium geimpft (Hefeextrakt 1%, Pepton 2%, Glukose 2%) und bei 30ºC für 20 Stunden inkubiert. 50 ml der Kultur wurden mit 3000 U.p.m. für 5 Min. zentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal mit 0,1 M Citrat-Puffer bei pH 5 (Natriumcitrat 9,79 g, Zitronensäure 3,2 g, Rest Wasser auf 500 ml) gewaschen und in 50 ml des gleichen Puffers resuspendiert. 10 ml dieser Suspension wurden mit einer Lösung von NTG behandelt und auf eine Konzentration von 50 g/l eingestellt. Die Suspension wurde in Anwesenheit des Mutagens für 30 Min. bei 30ºC in Ruhe inkubiert.
Das NTG wurde durch zweimaliges Waschen mit destilliertem Wasser aus der Suspension entfernt. Die Zellen wurden in 50 ml YPG resuspendiert, in einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml des Mediums transferiert und bei 30ºC unter Bewegung für 48 h inkubiert. Dadurch wurde die Expression der Mutante ermöglicht. Danach wurden 5 ml abgezogen und 100 ml eines minimalen G0 Mediums geimpft (1,32 g (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;; 0,9 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 0,50 g Harnstoff in einem Liter zweifach destilliertem Wasser). Das GO Medium wurde mit Nystatin angereichert. Nachdem diese Kultur bis zum Erreichen von 20 bis 30% der anfänglichen optischen Dichte (OD) inkubiert war, wurde sie mit 25 ml einer Nystatin-Lösung behandelt. Die so behandelte Kultur wurde bei 30ºC für 30 Min. in Ruhe inkubiert. Anschließend wurde das Nystatin durch zweimaliges Waschen der Zellsuspension mit destilliertem Wasser aus dem Medium entfernt und die Zellen in einem Volumen resuspendiert, welches ausreicht zwischen 150 und 200 Kolonien pro Platte zu erhalten.
Die Kolonien wurden in einem Vollmedium vermehrt und zur Isolierung der auxotrophen Mutanten in einem Minimalmedium (G0) repliziert. Die auxotrophen Mutanten wurden im Hinblick auf ihre Ernährungsmängel unter Verwendung des Plasmids pHIS-85 charakterisiert, welches das HIS3 Gen von Saccharomyces cerevisiae trägt (Fig. 1).
Unter Anwendung dieses Verfahrens wurde eine Mutante MP-36 von Pichia pastoris isoliert, welche einen Defekt im Biosyntheseweg von Histidin aufweist und insbesondere einen Defekt in dem Enzym Imidazol-Glyzerophosphat-Dehydratase (IGP Dehydratase).

BEISPIEL 2:

Mit dem Ziel einen Vektor für die Expression heterologer Gene in der Mutante MP-36 zu erzeugen wurde wie folgt vorgegangen:
Das Vektorplasmid pUC-18 wurde mit den Enzymen BamHI und SalI verdaut und anschließend mit dem BamHI Fragment des Vektors pPMC ligiert, welcher den HIS3 Auxotrophmarker von S. cerevisiae enthält; dann wurde das BamHI/SalI Fragment des Plasmids pCAO-10, welches das AOK, Gen plus ein 3'-angrenzendes Fragment enthält, ligiert. Als Ergebnis dieser dreifachen Reaktion wurde das Plasmid pHAX-1 erhalten (Fig. 2).
Das so erhaltene Plasmid wurde mit den Enzymen EcoRI und SmaI verdaut und mit dem EcoRI/PstI Fragment des Plasmids pCAO-10 ligiert, dem 5'-angrenzenden Fragment des AOX&sub1; Promotors, der zur Erhöhung der Rekombinationsfrequenz verwendet wird. Zur gleichen Zeit wurde das EcoRI/PstI Fragment des Plasmids pAS-24 ligiert, das zuvor mit dem Klenow Fragment am EcoRI-Ende angereichert wurde; dieser Bereich enthält die Verknüpfung des AOX&sub1; Promotors mit dem kodierenden Bereich des SUC2 Gens. Durch diese Reaktion wurde der Vektor pPS-7A erhalten (Fig. 2).
Ein GAPt enthaltendes Fragment wurde durch Verdauung mit den Enzymen NcoI/BamHI aus dem Plasmid pBG3 extrahiert, welches den GAP Operator von S. cerevisiae enthält. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pPS-7A eingeschleust, aus dem zuvor das Strukturgen von SUC2 durch Verdauen mit den Enzymen HindIII/BamHI extrahiert worden war. Während dieser Ligation wurde ein 48-mer Oligonukleotid mit überlappenden 5' HindIII und 3' NcoI Enden eingeschleust (Fig. 5), die die Signalpeptidsequenz des SUC2 Gens wieder herstellten (spSUC2), welche während der Verdauung verloren gegangen war. Daneben wurde auch die Erkennungsstelle für das Enzym NcoI wieder hergestellt. Das so erhaltene Vektorplasmid wurde als pPS-7 bezeichnet. Dieses Vektorplasmid enthält den AOX&sub1; Promotor gefolgt von dem Signalpeptid von SUC2, dann folgt GAPt mit einer NcoI Teilungsstelle zwischen den beiden, um auf diese Weise die Einschleusung des heterologen Gens zu ermöglichen, das exprimiert werden soll; des weiteren ist das HIS3 Gen von S. cerevisiae vorhanden und schließlich das 3'-terminale Fragment des AOX Gens zur Integration in die Hefe (Fig. 3).

BEISPIEL 3:

Basierend auf der bekannten Aminosäuresequenz des humanen (h) EGF wurde eine chemische Synthese des Gens, das für dieses Protein mit einem Gewicht von ungefähr 6.2 kDa kodiert, durchgeführt. Sowohl dieses Gen (Chiron Corp., US Patent 4 783 412) als auch seine chemische Synthese (Earth Chemical, französisches Patent 2 566 799) wurden bereits früher publiziert. Durch Anwendung des von H. Coster, N. D. Sinha, J. Biernat und J. McManus in NAR, Vol. 12, Seiten 4539 -4557 (1984) beschriebenen Verfahrens erfolgte die Synthese eines Gens mit 174 Basenpaaren, das für hEGF kodiert (Fig. 6). Danach wurde dieses Gen in das Plasmid pBR322 eingeschleust, welches durch das Restriktionsenzym EcoRV verdaut und mit Phosphatase behandelt worden war (Fig. 4). Diese Ligation ergab das Plasmid pBEGF, das durch Transformation des E. coli Stamms MC1061 vermehrt wurde. Eine für die Extraktion des zu dem hEGF Gen korrespondierenden Fragments ausreichende Menge an Plasmidmaterial wurde aus diesem Stamm aufbereitet. Ein dieses Gen enthaltendes Fragment mit stumpfen Enden wurde durch aufeinanderfolgende Verdauung mit den Restriktionsenzymen XbaI, SI und EcoRV erfolgreich extrahiert.
Zur Expression des Fragments in Hefe wurde das Fragment in das Plasmid pPS-7 eingeschleust (der Aufbau des Fragments ist in dem vorangegangenen Beispiel beschrieben), welches zuvor mit den Enzymen NcoI, SI verdaut worden war und schließlich mit Phosphatase behandelt wurde. Das durch diese Ligation erhaltene Plasmid wurde mit pPEGF-L (Fig. 4) bezeichnet. Darin ist das hEGF kodierende Gen nach dem SUC2 Signalpeptid lokalisiert, befindet sich unter der Kontrolle des AOX&sub1; Promotors und ist mit dem GAP Terminator kombiniert, während das 5' und das 3' Ende des AOX als Segmente für die Integration dienen. Die Transformation in Hefe wurde mit diesem Plasmid durchgeführt und insbesondere wurde die Pichia pastoris his3 Mutante MP-36 als Wirt verwendet. Der transformierte Stamm, der mit MEGF-5 bezeichnet wurde, ist in der Lage zwischen 2,5 und 3 g EGF pro Liter zu produzieren.

BEISPIEL 4:

Zur Expression des Sucrose Invertase Gens wurde der P. pastoris Stamm MP-36 mit dem Plasmid pPS-7A (erhalten in einer der Zwischenstufen der Konstruktion des Vektors pPS-7, Fig. 2) transformiert, welches das SUC2 Gen unter der Kontrolle des AOX&sub1; Promotors trägt und das als Transkriptionsterminator denjenigen des tatsächlichen SUC2 Gens aufweist. Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung von Honig als Kulturmedium (industrielles Medium) durchgeführt, das 4% vollständig reduzierende Zucker enthält.
In beiden Fällen wurde eine hohe Produktivität des Systems erreicht. Es wurden zwischen 3,5 und 4 g Enzym pro Liter Kulturmedium erhalten. Die Retention dieses Enzyms in das Periplasma der transformierten Mikroorganismen stellt außerdem eine unterscheidende Eigenschaft des Systems dar.

BEISPIEL 5:

Zur Klonierung des Rinderchymosingens wurde als Quelle das Konstrukt pCB-125 verwendet, welches für E. coli entworfen worden war (Morales, 1989, Rev. Interferón y Biotecn 5(2)). Zur nachfolgenden Manipulation des Gens wurde eine NcoI Stelle durch die Technik der Polymerase Chain Reaction (PCR) gebildet (R. Saiki, 1985, Science 230: 1350-1354). Zu diesem Zweck wurden die folgenden Oligonukleotide chemisch synthetisiert:
Nach der Amplifizierung wurde das Fragment mit NcoI, XbaI verdaut und an die entsprechenden Stellen in dem Vektor pSAO7 subkloniert, der einen Origin of Replication von E. coli aufweist. Das Fragment wurde in den Stamm MC1061 transformiert und die Transformanten wurden durch Hybridisierung der Kolonien mit dem für die PCR entworfenen 5' Oligonukleotid selektiert. Die positiven Klone wurde durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzymen NcoI, XbaI und HindIII überprüft.
Zur Subklonierung des Rinderchymosingens wurde der Vektor pPS7 mit NcoI linearisiert, die palindromischen Enden wurden durch die Einwirkung der 51 Nuklease stumpf gemacht und dann phosphoryliert. Das Fragment mit dem Prochymosingen wurde durch den Vektor RePSAO durch Verdauung mit NcoI, HindIII erhalten, die palindromischen Enden wurden eingeschleust und durch Einwirkung des Klenow Enzyms stumpf gemacht. Auf diese Weise wurde es für die Einschleusung in den Vektor pPS7 vorbereitet, wodurch der Integrationsvektor pPPC316-3 gebildet wurde (Fig. 7). Mit diesem zuletzt genannten Vektor wurde die Transformation der Mutante MP-36 ausgeführt, wodurch der Stamm CLRB-4 erhalten wurde, der einen Chymosin-Pegel von mehr als 1,5 g/l Kultur produziert.

BEISPIEL 6:

Zur Extraktion des die Asparaginprotease des Stamms IFO 4578 + von Mucor pusillus kodierenden Gens wurde eine Reinigung des Genoms des genannten Pilzes durchgeführt. Dazu ließ man das Mycel im Weizenkleieextrakt wachsen und die Pilz-DNA wurde, wie in der Literatur beschrieben, extrahiert und gereinigt (Cryer et al., Methods in Cell Biology, 1975, Vol. XII, Seiten 39-44).
Danach wurde die PCR Technik angewandt (Polymerase Chain Reaction, R. K. Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1354), wozu zwei Oligonukleotide verwendet wurden, deren Sequenzen in der Fig. 8 dargestellt sind. Nach Amplifizierung und Extraktion des Gens der inaktiven Form der Asparaginprotease von M. pusillus wurde selbige in Bluescript geklont (G. Wahl, 1989, "Strategies," 2 : 17) nachdem es zuerst an einen BamHI Linker gebunden worden war. Auf diese Weise wurde das Plasmid pRH-3 erhalten (Fig. 8).
Zur Durchführung der Klonierung des Gens, welches für die Pilzasparaginprotease kodiert, wurde der integrative Vektor pPS7 mit NcoI gespalten, mit 51 Nuklease und dann mit alkalischer Phosphatase (CIP) behandelt (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, USA). Diese Stelle erlaubte die Einführung der gewünschten genetischen Information von dem Plasmid pRH-3 und zwar exakt zwischen dem Sekretionssignal des SUC2 Gens von S. cerevisiae und dem Transkriptionsterminationssignal des GAP Gens von Saccharomyces selbst, wobei diese Information unter der Kontrolle des AOK, Gen Promotors von Pichia pastoris blieb (Fig. 9). Diese Expressionskassette wurde mit dem HIS3 Gen von Saccharomyces, das als Selektionsmarker verwendet wurde, und den 5 und 3'-begrenzenden Bereichen des AOX Gens, die zur Integration verwendet wurden, vervollständigt. Der so erhaltene Expressionsvektor wurde als pRH-4 bezeichnet.
Dann wurde die Transformation der Pichia pastoris his- Mutante MP36 mit dem Expressionsvektor pRH-4 durchgeführt und die so gewonnenen Mikroorganismen, die als CLRH-1 bezeichnet wurden, wurden vermehrt und zur Abscheidung des Enzyms unter den Bedingungen einer semikontinuierlichen Kultur veranlasst.
Zur Fermentation wurde der neue, rekombinante Stamm der Gattung Pichia, der Asparaginprotease herstellt, in einen 5 Liter Fermenter gemipft, der ein industrielles Medium enthielt (13,2 g Ammoniumphosphat, 9 g Ammoniumsulfat, 5 g Harnstoff und 84 ml Melasse pro Liter Kulturmedium, welche 3% vollständig reduzierendes Material enthielt). Der Impfstoff wies eine optische Dichte von 0,5-1 bei 600 nm auf. Die Fermentationsbedingungen wurden bei einer Inkubationstemperatur von 30ºC und einem pH des Mediums von 5,5 aufrecht erhalten. Die Induktion des Systems wurde unter Verwendung von Methanol durchgeführt sobald die Kultur die frühe exponentielle Phase ihres Wachstums erreicht hatte. Von diesem Moment an wurde ein konstanter Fluss von 2,5 ml/l/h aufrecht erhalten.
Unter diesen Bedingungen erreichte der rekombinante Stamm CLRH-1 einen Abscheidungsgrad des Enzyms in der Größenordnung von 1,5 g/l Kultur, welcher durch sukzessiven Ersatz des Mediums durch frisches Medium nach Vervollständigung des jeweiligen Batches oder bei Einsatz einer semikontinuierlichen Kultur erheblich bis zu ungefähr 7 g/l Kultur anstieg.

BEISPIEL 7:

Die aus Bacillus licheniformis CIB-25 (CIGB's collection of strains) extrahierte chromosomale DNA wurde mit Hilfe der Endonuklease EcoRI vollständig verdaut und die Fragmente mit einer Größe zwischen 2 und 4 kb wurden durch Gelelektrophorese mit Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt (LGT) isoliert. Diese Fragmente wurden zu dem Vektor pBR322 ligiert, der mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Mit dem so gewonnenen Plasmid wurde der E. coli Stamm MC1066 (F, D lacX74, hsr, hsm, rps 1, gaIU, gaIK, trip C 9030F, leuB, pyrF::tn5) transformiert.
Die Identifizierung der Klone wurde durch Untersuchung ihrer Aktivität auf Platten vorgenommen. Dazu wurden Kolonien in LB Medium mit 0,5% löslicher Stärke und Tetracyclin bei 15 ug/ml angesiedelt. Die Kolonien wurden bei 37ºC für 72 Stunden vermehrt. Dann wurden die Platten mit metallischen Iod-Dämpfen gefärbt. Die positiven Klone waren diejenigen, die die Bildung eines deutlichen Rings um die Kolonie zeigten. Einer der ausgewählten Klone wurde mit pAB-24 bezeichnet. Mit diesem Klon wurde eine Restriktionsanalyse mit Endonukleasen durchgeführt. Die Restriktionskarte des 3 kb EcoRI Fragments, das das Alpha-Amylase Gen enthält, ist in Fig. 10 dargestellt. Das in dem zentralen Teil des 3 kb Fragments erhaltene Restriktionsmuster stimmt mit den Ergebnissen von S. A. Ortlepp et al., 1983, Gene 23: 267-276 und G. L. Gray et al., 1986, J. Bacteriol. 166: 635-643 überein.
Nach der Analyse der Klone und der Überprüfung, ob die strukturelle Region mit den bisher publizierten strukturellen Regionen übereinstimmt, wurde die Region, die das Gen kodiert, exakt isoliert. Zu diesem Zweck wurden zur Durchführung einer Polymerase Chain Reaction (PCR) zwei synthetische Oligonukleotide entworfen. Diese Oligonukleotide wurden auf der Basis der veröffentlichten Alpha-Amylase Sequenz von B. licheniformis (G. L. Gray et al., 1986, J. Bacteriol. 166: 635-643) entworfen. Die Sequenzen beider Oligonukleotide sind in Fig. 11 dargestellt. Das der 5' Region des Gens entsprechende Oligonukleotid enthält eine NcoI Stelle und das der 3 Region des Gens entsprechende Oligonukleotid enthält eine SalI Stelle. Zur Durchführung der Amplifizierung des isolierten Alpha-Amylase Gens wurde das von R. K. Saiki et al. (1988, Science 239: 487-491) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Entsprechend der veröffentlichten Sequenz und dem Design der Oligonukleotide sollte das Polymerase Chain Reaction Produkt ein 1,4 kb Fragment ergeben, das zwar das voll entwickelte Protein enthält, aber nicht dessen Signalsequenz. Unter der Voraussetzung, dass das als PCR Produkt erhaltene Fragment mit der gewünschten Größe übereinstimmt, steht fest, dass eine sehr starke Homologie zwischen dem aus der Literatur bekannten Alpha-Amylase Gen von B. licheniformis und dem in dieser Studie isolierten Gen besteht. Das isolierte Gen wurde mit dem Enzym NcoI verdaut, um in dem Plasmid YIP 5 subkloniert zu werden und so das Plasmid pAMSS zu bilden (Fig. 12).
Das Plasmid pPS-7 wurde als Klonierungsvektor bei der Verdauung mit der Endonuklease NcoI, bei der Behandlung mit SI Exonuklease und der Dephosphorylierung der Enden mit alkalischer Phosphatase verwendet. In diesen Vektor wurde das Alpha-Amylase Gen eingeschleust, welches von dem Plasmid pAMSS durch Verdauung mit den Enzymen NcoI und SalI gewonnen wurde. Daneben wurden beide Enden des Fragments mit SI Exonuklease stumpf gemacht. Auf diese Weise wurden sie in dem letztendlich resultierenden Klonierungsvektor pPSA-3 (Fig. 12) verknüpft, der zur Transformation der Mutante MP-36 verwendet wurde.
Die so erhaltenen Transformanten wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Herstellung von Alpha- Amylase untersucht, wozu sie auf Platten mit Medium G (Galzy und Slonimski, 1957, (Paris) C. R. Acad. Sci., 245: 2423) mit 1% löslicher Stärke und 0,5% Methanol vermehrt wurden. Nach dreitägiger Inkubation bei 30ºC wurden die Platten mit Iod Dämpfen gefärbt und ein klarer Ring wurde um denjenigen Hefen beobachtet, welche das Enzym produzieren. Der Ring wurde aufgrund der Hydrolyse der Stärke sichtbar.
Eine der transformierten Hefen, MPA 3625, welche bei der Platten-Selektionsmethode ein positives Ergebnis zeigte, wurde zur Durchführung von Fermentations-Induktions-Studien isoliert. Sie war fähig nach Fermentation und Induktion mit Methanol das Enzym Alpha-Amylase in einer aktiven Form in das Kulturmedium aus zu scheiden und zwar in Mengen größer als 6 g/l.

SEQUENZPROTOKOLL

SEQ ID NR: 1
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 29 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 2
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 28 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 3
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 48 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 4
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 48 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 5
SEQUENZART: Nukleotid mit zugehörigem Protein
SEQUENZLÄNGE: 174 Basenpaare
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: genomische DNA
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch
EXPERIMENTELLE QUELLE: Nukleotidsynthese
EIGENSCHAFTEN: humanes epidermales Wachstumsfaktorgen
SEQ ID NR: 6
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 31 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 7
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 37 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NO: 8
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 38 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 9
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 37 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 10
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 31 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 11
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 21 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 12
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 38 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 13
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 38 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 14
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 37 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 15
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 40 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 16
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 30 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 17
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 30 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 18
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 22 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA
SEQ ID NR: 19
SEQUENZART: Nukleotid
SEQUENZLÄNGE: 27 Nukleotide
MOLEKÜLART: DNA

Claims

1. Verfahren zur Expression heterologer Gene in der Hefe Pichia pastoris umfassend die Schritte Herstellung eines Expressionsvektors, der das zu exprimierende heterologe Gen enthält, Transformation eines Pichia pastoris Wirtsstamms, Vermehren einer Transformanten, die das Expressionsprodukt des heterologen Gens produziert und optionales Isolieren des gebildeten Expressionsprodukts, wobei der Expressionsvektor ausgewählt ist aus

(i) dem Expressionsplasmid pPS-7A (CBS 452.90), das eine Expressionskassette enthält, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des Saccharomyces cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen als ein zu exprimierendes heterologes Gen, wobei das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen seinen eigenen Transkriptionsterminator enthält, und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen, und

(ii) Expressionsplasmiden, die eine Expressionskassette enthalten, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des S. cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem zu exprimierenden heterologen Gen, dem S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen,

und worin eine auxotrophe his-Mutante von Pichia pastoris als Wirtsstamm verwendet wird, welche einen Defekt in dem Enzym Imidazol-Glyzerophosphat-Dehydratase aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der his- auxotrophe Pichia pastoris Wirtsstamm mit dem Expressionsplasmid pPS-7A transformiert wird, das als das zu exprimierende heterologe Gen das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen enthält, wobei das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen seinen eigenen Transkriptionsterminator enthält, so dass der Pichia pastoris Stamm MSUC-2 (CBS 452.90) erhalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der his- auxotrophe Pichia pastoris Wirtsstamm mit dem Expressionsplasmid pPEGF-L transformiert wird, das als das zu exprimierende heterologe Gen ein humanes epidermales Wachstumsfaktorgen und als Transkriptionsterminator den S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator enthält, so dass der Pichia pastoris Stamm MEGF-5 (CBS 449.90) erhalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der his- auxotrophe Pichia pastoris Wirtsstamm mit dem Expressionsplasmid pPSA-3 transformiert wird, das als das zu exprimierende heterologe Gen ein Alpha-Amylase Gen und als Transkriptionsterminator den S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator enthält, so dass der Pichia pastoris Stamm MPA 3625 (CBS 451.90) erhalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der his- auxotrophe Pichia pastoris Wirtsstamm mit dem Expressionsplasmid pPPC316-3 transformiert wird, das als das zu exprimierende heterologe Gen ein Rinderrennin Gen und als Transkriptionsterminator den S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator enthält, so dass der Pichia pastoris Stamm CLRB-4 (CBS 454.90) erhalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der his- auxotrophe Pichia pastoris Wirtsstamm mit dem Expressionsplasmid pRH-4 transformiert wird, das als das zu exprimierende heterologe Gen ein Mycorennin Gen und als Transkriptionsterminator den S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator enthält, so dass der Pichia pastoris Stamm CLRH-1 (CBS 453.90) erhalten wird.

7. Expressionsvektor zur Verwendung mit einer auxotrophen his- Mutante von Pichia pastoris, welche einen Defekt in dem Enzym Imidazol-Glyzerophosphat-Dehydratase aufweist, wobei der Expressionsvektor ausgewählt ist aus

(i) dem Expressionsplasmid pPS-7A (CBS 452.90), das eine Expressionskassette enthält, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des Saccharomyces cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen als ein zu exprimierendes heterologes Gen, wobei das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen seinen eigenen Transkriptionsterminator enthält, und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5 und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen, und

(ii) Expressionsplasmiden, die eine Expressionskassette enthalten, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des S. cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von dem zu exprimierenden heterologen Gen, dem S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen.

8. Expressionsvektor nach Anspruch 7, der pPS-7A (CBS 452.90) und als das zu exprimierende heterologe Gen das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen enthält, wobei das S. cerevisiae Sucrose Invertase SUC2 Gen seinen eigenen Transkriptionsterminator umfasst.

9. Expressionsvektor nach Anspruch 7, der pPEGF-L (CBS 449.90), pPSA-3 (CBS 451.90), pPPC316-3 (CBS 454.90) oder pRH-4 (CBS 453.90), als das zu exprimierende heterologe Gen ein humanes epidermales Wachstumsfaktorgen, ein Alpha-Amylase Gen, ein Rinderrennin Gen bzw. ein Mycorennin Gen, und als Transkriptionsterminator den S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator enthält.

10. Pichia pastoris Stamm erhalten durch Transformation einer auxotrophen his- Mutante von Pichia pastoris, welche einen Defekt in dem Enzym Imidazol-Glyzerophosphat-Dehydratase aufweist, mit einem Expressionsvektor, wobei der Expressionsvektor ausgewählt ist aus

(ii) Expressionsplasmiden, die eine Expressionskassette enthalten, welche eine Verknüpfung des Pichia pastoris AOX&sub1; Promotors und der Signalpeptidsequenz des S. cerevisiae SUC2 Gens umfasst, gefolgt von einem zu exprimierenden heterologen Gen, dem S. cerevisiae GAP Gen Transkriptionsterminator und dem S. cerevisiae HIS3 Gen als Selektionsmarker, wobei die Expressionskassette von den 5' und 3' Sequenzen des Pichia AOX Gens flankiert ist, um auf diese Weise die Integration in das Pichia Genom zu ermöglichen.

11. Pichia pastoris Stamm nach Anspruch 10, wobei es sich um einem der Stamme MEGF-5 (CBS 449.90), MSUC-2 (CBS 452.90), MPA 3625 (CBS 451.90), CLRB-4 (CBS 454.90) oder CLRH-1 (CBS 453.90) handelt, wobei der Stamm hohe Grade von hEGF, periplasmischer Sucrose Invertase, thermostabiler Alpha-Amylase, Rinderrennin bzw. Mycorennin exprimiert, wobei der Stamm aus einer Transformation einer auxotrophen his- Mutante von Pichia pastoris mit einem der Expressionsvektoren pPEGF-L, pPS-7A, pPSA-3, pPPC316-3 oder pRH-4 resultiert, wobei die auxotrophe his- Mutante von Pichia pastoris einen Defekt in dem Enzym Imidazol- Glyzerophosphat-Dehydratase aufweist.