JPH05184352A - ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母中での異種遺伝子の発現方法、発現ベクターおよび形質転換微生物 - Google Patents

ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母中での異種遺伝子の発現方法、発現ベクターおよび形質転換微生物

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JPH05184352A
JPH05184352A JP3014953A JP1495391A JPH05184352A JP H05184352 A JPH05184352 A JP H05184352A JP 3014953 A JP3014953 A JP 3014953A JP 1495391 A JP1495391 A JP 1495391A JP H05184352 A JPH05184352 A JP H05184352A
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Margoles Clark Emilio
マルゴレス クラーク エミリオ
Marcos Dergado Boada Giulio
マルコス デルガド ボアダ ジュリオ
Morales Grillo Juan
モラレス グリロ ジュアン
Deru Karumen Torensu Madoraso Ishisu
デル カルメン トレンス マドラソ イシス
Silva Rodrigues Arefandoro
シルバ ロドリゲス アレファンドロ
Paifer Reies Edenia
パイフェル レイエス エデニア
Verbeyre Binnellfa Gerald
フェルベイレ ビネルファ ゲラルド
Estera Sosa Espinosa Angela
エステラ ソサ エスピノーサ アンジェラ
Martinez Santana Vladimir
マルチネス サンタナ ブラディミル
Augustin Aguiar Santiago Georges
アグスチン アギアール サンチャゴ ジョルジュ
Serarena Manendes Arina
セラレナ マネンデス アリナ
Gonzales Lopes Tania
ゴンザレス ロペス タニア
Montesinos Segui Rachel
モンテシノス セグイ ラケル
Alberto Cremata Albarez Jose
アルベルト クレマタ アルバレス ホセ
Birarear Barios Aderaida
ビラレアル バリオス アデライダ
Gonzalez Badilo Beatriz
ゴンザレス バディロ ベアトリッツ
Menendez Alarson Alfredo
メネンデス アラルソン アルフレド
Elena Gonzales Martinez Maria
エレナ ゴンサレス マルチネス マリア
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ピヒア パストリス酵母中で異種遺伝子を発
現させて有用な医薬産物または酵素を産生するにあた
り、制御可能な条件下で且つ高収率で目的物を得るため
の方法、ならびにそれに用いる発現ベクターおよび形質
転換微生物を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の方法は、宿主としてピヒア パスト
リス酵母のＢＫＭ−９０株の栄養要求ｈｉｓ３変異株を
用い、またそれを形質転換させるための組換えＤＮＡと
してサッカロミセス セレビシエの機能的選択マーカ
ー、酵母自身のアルコール オキシダーゼ遺伝子（ＡＯ
Ｘ1)、Ｓ．セレビシエのグリセラルデヒド３−ホスフェ
ート デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）の転写ターミネータ
ーまたは発現されるべき異種遺伝子自身の有している転
写ターミネーター、ピヒア パストリスのゲノムに相同
であって組込みの作用を持つもう１つの配列、および
Ｓ．セレビシエのスクロース インベルターゼ遺伝子
（ＳＵＣ２）のシグナル ペプチドに結合した異種遺伝
子を含有する組込ベクターを用いる方法である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーの
分野のものであり、組換ＤＮＡ技術、特にピヒア（Ｐｉ
ｃｈｉａ）属の組換メチロトローフ酵母で異種遺伝子を
効率よく発現させる新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】この
分野において、重要な課題は、天然から大量に得ること
のできないものが非常に多いところの所望の遺伝子産物
を得るのに有用な宿主−ベクター系を開発することであ
って、事実、沢山の原核および真核発現系が報告され、
異種蛋白質を高収率で製造するのに成功している。
【０００３】これらの目的のために最も開発された細胞
質生物は大腸菌である。これは、その遺伝子調節につい
ての蓄積された知識と大規模にそれを使用することの容
易さによるところが大きい。
【０００４】然しながら、大腸菌は、異種産物の発現に
関し最適な宿主細胞ではない。特に、異種産物が医薬お
よび食物用タンパク質である場合、大腸菌は、その細胞
壁内に毒性で発熱性の成分を産生するため好ましくな
い。また、転写、翻訳および翻訳後修飾のメカニズムが
真核生物のものと異なっておるため、大腸菌内で産生し
た真核細胞由来タンパク質が野生遺伝子産物と異なり必
要な生理活性に欠けることがある。尚、上記大腸菌産物
は、通常、不溶性であり、化学修飾によってのみ可溶化
されるタンパク凝集物を形成する。その結果、得られる
産物の比活性が減少し抗原能が増加する。大腸菌宿主細
胞の別の欠点として、大腸菌は、培地中へのタンパク排
泄能に劣る〔イー．バロン（Ｅ．Ｂａｒｏｎ)、”旧友
であって新規な産業用微生物（ａｎ Ｏｌｄ Ｆｒｉｅ
ｎｄ ｂｕｔ Ｎｅｗ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｅ)”、２７−３０頁；ジェー．ダビエス（Ｊ．
Ｄａｖｉｅｓ）、”異種遺伝子発現回想録（Ｒｅｔｒｏ
ｓｐｅｃｔ ｏｎ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ)"、１７−２６頁、産業用微
生物遺伝学に関する第５回国際シンポジウム（Ｆｉｆｔ
ｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、１９８
６、エム．アラセビク（Ｍ．Ａｌａｃｅｖｉｃ）、ディ
ー．フラヌエリ（Ｄ．Ｈｒａｎｕｅｌｉ）、ゼット．ト
ーマン（Ｚ．Ｔｏｍａｎ）編参照〕。
【０００５】酵母などの真核系中で異種タンパク質を産
生することは、原核系に比較し有利である。利点の一と
して、真核系は、高濃度への成育が可能であり、培養を
連続系に適合させることができる〔米国特許第４，４１
４，３２９号、特許権者：フィリップス ペトロリュー
ム株式会社（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＰｅｔｒｏｌｅｕｍＣ
ｏ．）参照〕。別の利点として、大腸菌に比較し、酵母
では、培地中へのタンパク排泄が多量であり、酵母培養
に用いる培地は一般に大腸菌培養に用いるものより経済
的である〔ワイ．レモイン（Ｙ．Ｌｅｍｏｉｎｅ）、”
酵母中の異種発現（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ）”、第８回国際バ
イオテクノロジーシンポジウム（８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍ
ｐｏｓｉｕｍ）、パリ、７月、１７−２２、１９８８参
照〕。
【０００６】上記真核系中では、さらに、バクテリア系
中で行なわれることのない糖鎖形成など翻訳後修飾が行
なわれる〔ダブリュー．フィアース（Ｗ．Ｆｉｅｒ
ｓ）、”微生物中異種遺伝子の工学的最高率発現（Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍａｍｉｍａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ
ｉｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）”、第８回国際
バイオテクノロジーシンポジウム、パリ、７月、１７−
２２、１９８８参照〕。また、真核系は、高等生物の細
胞が用いるコドンに対し高選択率を示し、このため、哺
乳動物由来遺伝子のより効率的発現が促進される〔エ
ス．エム．キグスマン（Ｓ．Ｍ．Ｋｉｇｓｍａｎ）
ら、”サッカロミセス セレビシエ中の異種遺伝子発現
（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）”、バイオテクノロジー アンド ゼ
ネティックエンジニアリング レビューズ（Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、第３巻、ジー．イー．
ラッセル（Ｇ．Ｅ．Ｒｕｓｓｅｌｌ）編参照〕。
【０００７】近年、メチロトローフ酵母、特にピヒア
パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母が
異種遺伝子のクローニングおよび発現に好ましく用いら
れている〔オーストラリア国特許願第５８１１０７号、
出願人：フィリップス ペトロリューム株式会社（Ｐｈ
ｉｌｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏ．）参照〕。ピ
ヒア パストリスは、従来のサッカロミセス セレビシ
エに比較し多数の利点を有する魅力的な宿主細胞であ
る。利点としては、高細胞濃度への成育可能性、クロー
ニングした遺伝子の誘導基質としての利用可能性、メタ
ノールなど廃物として入手できる安価な炭素源などを挙
げることができる。また、ピヒアの遺伝子発現系は、サ
ッカロミセスにつき報告された発現系に比較し制御が容
易であり、これは、宿主に害を及ぼす産物を得る際に有
利である。
【０００８】ヨーロッパ特許願第１８３０７０号〔出願
人：フィリップス ペトロリューム株式会社（Ｐｈｉｌ
ｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏ．）〕は、ピヒア
パストリス酵母のヒスチジノール デヒドロゲナーゼ酵
素栄養要求変異株につきその形質転換法を開示してお
り、同方法では、サッカロミセス セレビシエのＨＩＳ
４遺伝子と現用ピヒア パストリス酵母のＨＩＳ４遺伝
子を選択マーカーとして用いた。上記遺伝子のため、相
異なる複製組込型の形質転換ベクターが使用された。
【０００９】
【問題を解決するための手段および作用】本発明はピヒ
ア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｂ
ＫＭ−９０株（ＢＫＭ、モスクワ、ソ連邦）の新規な栄
養要求変異株であってＭＰ−３６と命名された株を宿主
細胞として用いる異種遺伝子の発現方法に関する。本変
異株は、ヒスチジン生合成経路のイミダゾール グリセ
ロホスフェート デヒドラターゼ（ＩＰＧ デヒドラタ
ーゼ）酵素が欠失しており、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−
ニトロソ−グアニジン（ＮＴＧ）を作用させナイスタチ
ン富化を行なって突然変異を誘発させ得たものである。
【００１０】本方法の新規な特徴の一は、ピヒア属のこ
の新規な変異株中に選択マーカーとしてサッカロミセス
セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）のＨＩＳ遺伝子を用いることにある。
【００１１】上記変異株は、高安定性（復帰頻歩：１０
￣8）を有し、効率的に形質転換可能であり、本発明で
用いる組込型ベクターについて予想される結果をも凌駕
する。
【００１２】変異株ＭＰ−３６の選択のため構築するベ
クターは、図１に示すｐＨＩＳ−８５である。このベク
ターは、選択マーカーとして作用するサッカロミセス
セレビシエのＨＩＳ３遺伝子を含有し、組込を行なうピ
ヒア パストリスの染色体ＤＮＡ断片を含有する。
【００１３】上記ベクター構築の目的は、サッカロミセ
ス セレビシエのＨＩＳ３遺伝子がピヒア パストリス
のｈｉｓ￣変異と相補的かどうか、また、酵母変異株Ｍ
Ｐ−３６が上記条件下で高率的に形質転換可能かどうか
を調べることにある。
【００１４】本発明の方法の別の新規な特徴は、ピヒア
パストリス中の異種遺伝子クローニング用として図３
に示す組込ベクターｐＰＳ−７を用いることにある。こ
のベクターの特徴は、サッカロミセス セレビシエのＨ
ＩＳ３遺伝子を選択マーカーとして含有することにあ
る。このベクターは、また、ピヒア パストリス由来の
アルコール オキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ1）のプロモ
ーターと、その後に、サッカロミセス セレビシエ由来
のスクロース インベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）のシ
グナルペプチドを含有する。転写ターミネーターとし
て、上記ベクターは、サッカロミセス セレビシエ由来
のグリセラルデヒド ３−ホスフェート デヒドロゲナ
ーゼ（ＧＡＰｔ）転写ターミネーターを含有する。これ
とは別に、発現されるべき現用遺伝子の終結シグナルを
用いることができる（図２のベクターｐＰＳ−７Ａ参
照）。
【００１５】本発明は、さらに、変異株ＭＰ−３６を形
質転換して、表皮成長因子、インベルターゼ、アルファ
−アミラーゼ、ウシ レンニンおよびカビ レンニンな
どの異種タンパク質を産生するためそれぞれ使用される
発現ベクターｐＰＥＧＦ−Ｌ、ｐＰＳ−７Ａ、ｐＰＳＡ
−３、ｐＰＰＣ３１６−３およびｐＲＨ−４に関係し、
これらを提供する。
【００１６】更に詳しくは、異種遺伝子の発現のため、
合成可能なヒト表皮成長因子をコードする遺伝子（ｈＥ
ＧＦ、図６参照）を選択した。この遺伝子を組込ベクタ
ーｐＰＳ−７中のシグナルペプチドＳＵＣ２とＧＡＰｔ
間に挿入した（図４参照）。このベクターを用いて、宿
主細胞ＭＰ−３６を形質転換した。形質転換体から、本
発明の、そして、好適な条件下で培養しメタノール誘発
を行なうと２．５ｇ／ｌ倍地以上のレベルの発現が得ら
れるクローンＭＥＧＦ−５を選択した。
【００１７】本タンパク質につき得られた高レベルの発
現により、効率的な製造方法が開発され、医薬用途に適
した高純度の最終製品の製造が可能になった。
【００１８】スクロース インベルターゼの発現のた
め、ＧＡＰｔを含有しない点でｐＰＳ−７と異なる形質
転換ベクターｐＰＳ−７Ａを用いた。これを用いて、宿
主細胞ＭＰ−３６を形質転換し、本発明のクローンＭＳ
ＵＣ−２を形質転換体から選択した。到達した酵素発現
のレベルは、４ｇ／ｌを超えた。これにより、自身の転
写ターミネーターを用いた異種遺伝子発現の本方法の効
率が実証された。
【００１９】得られた組換株ＭＳＵＣ−２は、細胞周辺
腔中に酵素を保存させる特徴を有し、この特徴のため、
固定細胞系中での使用に好適である。
【００２０】アルファ−アミラーゼの場合は、ベクター
ｐＰＳＡ−３で変異株ＭＰ−３６を形質転換し、６ｇ／
ｌ倍地を超える量で熱安定性アルファ−アミラーゼを過
分泌可能なクローンＭＰＡ３６２５を得た。上記クロー
ンも本発明のものである。
【００２１】本発明は、さらに、下記組換株に関係し、
それらを提供する。 （１）ＣＬＲＢ−４、これは１−２ｇ／ｌ倍地の範囲で
ウシ キモシンを産生することができ、ベクターｐＰＰ
Ｃ３１６−３で変異株ＭＰ−３６を形質転換して得られ
る、および （２）ＣＬＲＨ−１、これは半連続培養の条件下に７ｇ
／ｌを超えるレベルでカビ キモシン（マイコレンニ
ン）を産生することができ、ベクターｐＲＨ−４で変異
株ＭＰ−３６を形質転換して得られる。
【００２１】１９９０年１０月２２日付、ブタペスト条
約の規定に従い、下記株をオランダ国、バアアルンのセ
ントラルビュロー ホール シンメルカルチャーズ（Ｃ
ｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍ
ｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）へ寄託した。寄託番号 株名 CBS454.90 ピヒア パストリス（Pichia pastoris）CLRB-4（pPPC316-3） CBS453.90 ピヒア パストリス（Pichia pastoris）CLRB-1（pRH-4） CBS452.90 ピヒア パストリス（Pichia pastoris）MSUC-2（pPS-7A） CBS451.90 ピヒア パストリス（Pichia pastoris）MPA 3625(pPSA-3) CBS449.90 ピヒア パストリス（Pichia pastoris）MEGF-5（pPEGF-L）
【００２２】
【実施例】次に本発明を実施例によって詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例により限定されるものでな
い。
【００２３】実施例１ ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）の変異を行なうために１００ｍ
ｌのＹＰＧ媒地（酵母抽出物１％，ペプトン２％，ブド
ウ糖２％）中に酵母株ＢＫＭ−９０の培養物を接種し、
３０℃で２０時間インキュベートした。５０ｍｌの培養
物を取りだし、３０００ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心分離に
かけた。細胞をｐＨ５の０．１Ｍクエン酸緩衝液（クエ
ン酸ナトリウム９．７９ｇ、クエン酸３．２ｇ、および
５００ｍｌにするために十分な水）で２度洗浄し、５０
ｍｌの上記と同じ緩衝液に再浮遊させた。この浮遊液を
１０ｍｌ取りだし、ＮＴＧ溶液で処理し、５０ｇ／ｌの
最終濃度とした。この浮遊液を変異原の存在下において
３０℃で３０分放置してインキュベートした。
【００２４】この培養物を蒸留水で２度洗浄して、浮遊
液からＮＴＧを取り除いた。細胞を５０ｍｌのＹＰＧ中
に再浮遊させ、１００ｍｌの該媒地の入ったエルレンマ
イヤーフラスコに移し、この媒地を変異株を発現させる
ために３０℃で４８時間撹拌しながらインキュベートし
た。次に、５ｍｌを抽出し、１００ｍｌの最小ＧＯ媒地
（再蒸留水１リットル中、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 １．３
２ｇ；（ＮＨ4）2ＳＯ4０．９ｇ；尿素０．５０ｇ）に
接種した。得られたものはナイスタチンによる処理に用
いた。初期光学密度（ＯＤ）が２０〜３０％に達するま
で、該培養物をインキュベートした後、該培養物を２５
ｍｌのナイスタチン溶液で処理した。処理した培養物を
３０℃で３０分撹拌せずにインキュベートした。続い
て、細胞浮遊液を蒸留水で２度洗浄してナイスタチンを
媒地から除去し、１皿当り１５０〜２００コロニーを得
るのに十分な容量中に細胞を再浮遊させた。
【００２５】栄養要求変異株を分離するために、コロニ
ーを完全媒地中で培養し、最小培地(ＧＯ)中で複製させ
た。更に、栄養要求変異株にサッカロミセス セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）のＨＩＳ３遺伝子を持つプラスミドｐＨＩＳ−８５
（図１）を用いて、栄養学的欠失という特徴を付与し
た。
【００２６】この方法を用いてピヒア パストリス（Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の変異株ＭＰ−３６を
分離したが、該変異株はヒスチジンの生合成経路、特に
イミダゾール グリセロホスフェート デヒドロターゼ
酵素（ＩＧＰ デヒドロターゼ）が欠失している。
【００２７】実施例２ 変異株ＭＰ−３６中の異種遺伝子の発現を目的としてベ
クターを作り出すために、以下の操作を行なった。
【００２８】酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩでベクター
プラスミドｐＵＣ−１８を消化し、次いでＳ．セレビシ
エの栄養要求マーカーＨＩＳ３を含有するベクターｐＰ
ＭＣのＢａｍＨＩ断片に連結し、ＡＯＸ1遺伝子及び
３’−フランキング断片を含有するところのプラスミド
ｐＣＡＯ−１０のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を次に連結
した。この三重反応の結果、プラスミドｐＨＡＸ−１を
得た（図２）。
【００２９】次いでこの得られたプラスミドを酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＳｍａＩで消化し、プラスミドｐＣＡＯ−１
０のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片に連結した。この断片
は、組換の頻度を増加するのに用いられるＡＯＸ1プロ
モーターの５’−フランキング断片である。同時に、先
にＥｃｏＲＩ端にクレノウ断片が充填されていたプラス
ミドｐＡＳ−２４のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片を連結し
た。この領域はＡＯＸ1プロモーターのＳＵＣ遺伝子の
コード領域へのリンクを含有する。この反応によってベ
クターｐＰＳ−７Ａを得た（図２)。
【００３０】酵素ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩによる消化によ
り、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧ
ＡＰオペレーターを含有するところのＧＡＰｔを有する
断片をプラスミドｐＢＧから抽出した。酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩ／ＢａｍＨＩによる消化で先にＳＵＣ２の構造遺伝
子が抽出されたところのプラスミドｐＰＳ−７Ａ中に該
断片を挿入した。粘着性５’ＨｉｎｄＩＩＩ及び３’Ｎ
ｃｏＩの末端を用いて４８−ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ドを該連結中に挿入したが（図５)、これらの末端は消
化により消失したＳＵＣ２遺伝子（ｓｐＳＵＣ２）のシ
グナルペプチド配列を復元し、また酵素ＮｃｏＩの認識
部位も復元した。こうして得られたベクタープラスミド
をｐＰＳ−７と呼び、該プラスミドはＡＯＸ1プロモー
ターを、次いでＳＵＣ２のシグナルペプチド、更にＧＡ
Ｐｔを含有し、発現を得たい異種遺伝子を挿入するため
ＧＡＰｔとＳＵＣ２との間にはＮｃｏＩ切断部位を含有
していた。続いて、Ｓ．セレビシエのＨＩＳ３遺伝子が
あり、最後に酵母中への組込のためのＡＯＸ遺伝子の
３’−端断片が存在する（図３)。
【００３１】実施例３ ヒト（ｈ）ＥＧＦのアミノ酸配列で約６．２ｋＤａの該
蛋白質をコードする遺伝子の化学合成を行った。該遺伝
子は公報（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，ＵＳｐａｔｅｎ
ｔ ４７８３４１２）の主題であり、その化学合成法も
知られている（Ｅａｒｔｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆｒｅ
ｎｃｈ ｐａｔｅｎｔ ２５６６７９９)。記載の方法
（Ｈ． Ｃｏｓｔｅｒ，Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ，Ｊ． Ｂ
ｉｅｒｎａｔ及びＪ． ＭｃＭａｎｕｓ；ＮＡＲ，ｖｏ
ｌ．１２、ｐｐ．４５３９−４５５７、１９８４）によ
り、ｈＥＧＦをコードする１７４塩基対の遺伝子（図
６）の合成を行なった。次いで制限酵素ＥｃｏＲＶで消
化し、ホスファターゼで処理したプラスミドｐＢＲ３２
２中に該遺伝子を挿入した（図４)。この連結によりプ
ラスミドｐＢＥＧＦを得、これをＥ． ｃｏｌｉ菌株Ｍ
Ｃ１０６１の形質転換により繁殖させた。ｈＥＧＦ遺伝
子に相当する断片を抽出するのに十分なプラスミド材料
を該菌株から精製した。該遺伝子を含有し、平滑な末端
を有する断片を制限酵素ＸｂａＩ，ＳＩ，及びＥｃｏＲ
Ｖによる連続消化により継続的に抽出した。
【００３２】酵母中でのその発現のために、該断片をプ
ラスミドｐＰＳ−７（この構造は前出の実施例に記載）
に導入し、このｐＰＣ−７を最初、酵素ＮｃｏＩ及びＳ
Ｉで消化し、最後にホスファターゼで処理した。この連
結により生じるプラスミドをｐＰＥＧＦ−Ｌ（図４）と
呼ぶ。そこでは、ｈＥＧＦをコードする遺伝子は、ＡＯ
Ｘ1プロモーターの制御下にＳＵＣ２シグナルペプチド
の後に位置し、またＧＡＰターミネータと結合してお
り、一方ＡＯＸの５’及び３’末端は組込用セグメント
として作用する。酵母の形質転換をこのプラスミドによ
って行なったが、その際特にピヒア パストリス（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｈｉｓ３変異株ＭＰ−３
６を宿主として用いた。
【００３３】ＭＥＧＦ−５と名づけたこの形質転換され
た菌株は１リットル当り２．５〜３グラムのＥＧＦを産
出することができる。
【００３４】実施例 ４ 蔗糖インベルターゼ遺伝子を発現するために、Ｐ． パ
ストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）株Ｍ−３６を、ベ
クターｐＰＳ−７を構築する中間過程の１つで得られる
プラスミドｐＰＳ−７Ａを用いて形質転換した。該ｐＰ
Ｓ−７Ａは、ＡＯＸ1プロモーターの制御下にＳＵＣ２
を有しており、転写ターミネーターとして実際のＳＵＣ
２遺伝子の転写ターミネーターを有している。同様な実
験を４％の総還元糖を含む蜂蜜を培養媒地（工業媒地）
として用いて行った。
【００３５】両ケースとも、系の高生産性を達成し、１
リットル培養媒地当り３．５〜４ｇの酵素を得、際立っ
た特徴として、形質転換された微生物のペリプラズム中
に該酵素の保有が認められた。
【００３６】実施例５ ウシ キモシン遺伝子をクローニングするために出発プ
ラスミドとして、Ｅ．ｃｏｌｉ用にデザインされた構成
ｐＣＢ−１２５（Ｍｏｒａｌｅｓ，１９８９，Ｒｅｖ．
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｙ Ｂｉｏｔｅｃｎ ５
（２））を用い、後続の遺伝子操作のためにＮｃｏＩ部
位をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって形成し
（Ｒ．Ｓａｉｋｉ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
０：１３５０−１３５４）、この目的のために以下のオ
リゴヌクレオチドを化学合成した。
【００３７】５’ＧＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣ
ＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴ ３’遺伝子の５’ ５’ＧＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧ
ＣＣＡＧＣ ３’遺伝子の３’ 増幅後、断片をＮｃｏＩ及びＸｂａＩによって消化し、
Ｅ． ｃｏｌｉの複製の起源を用いてベクターｐＳＡＯ
７のこれらの部位にサブクローニングし、菌株ＭＣ１０
６１をこの断片で形質転換し、得られた形質転換体を、
ＰＣＲ用にデザインした５’オリゴヌクレオチドでコロ
ニーをハイブリダイゼーションすることによって選択
し、酵素ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用い
た制限分析により陽性クローンを確認した。
【００３８】ウシ キモシン遺伝子をサブクローニング
するためにｐＰＳ７ベクターをＮｃｏＩで線状化し、パ
リンドローム末端をＳ１ヌクレアーゼの作用で平滑化
し、更に燐酸化した。プロキモシン遺伝子を持つ断片
を、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより
ベクターＲｅＰＳＡＯから得、パリンドローム末端を充
填し、クレノウ酵素の作用で平滑化した。このようにし
て、ベクターｐＰＳ７中に組み込む遺伝子を作り、そし
て組込ベクターｐＰＰＣ３１６−３を得た（図７)。こ
のｐＰＰＣ３１６−３ベクターを用いて、変異株ＭＰ−
３６の形質転換を行ない、培養物１リットル当たり１．
５ｇ以上のレベルのキモシンを産生する菌株ＣＬＲＢ−
４を得た。
【００３９】実施例６ ムコル プシラス（Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）の
菌株ＩＦＯ ４５７８＋のアスパラギン酸プロテアーゼ
をコードする遺伝子を抽出するために、該菌のゲノムの
精製を行なった。このために、文献（Ｃｒｙｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１９７５，Ｖｏｌ．ＸＩＩ，ｐｐ．３９−４
４）に記載の方法で、菌糸を小麦ふすま抽出物の中で培
養し、そして該菌のＤＮＡを抽出、精製した。
【００４０】次にＰＣＲを行なった（ＰＣＲ：ポリメラ
ーゼ連鎖反応、Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉｅｔ ａｌ．，１９
８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４）
が、この反応のために、第８図に配列が示されていると
ころの２個のオリゴヌクレオチドを用いた。Ｍ．プシラ
ス（Ｍ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ）の不活性型アスパラギン酸
プロテアーゼの遺伝子の増幅と抽出を行なった後、プラ
スミドｐＲＨ−３（図８）を得るために、最初ＢａｍＨ
Ｉリンカーにつながっていた遺伝子をブルースクリプト
（Ｇ．Ｗａｈｌ，１９８９，”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅ
ｓ，”２：１７）中でクローニングした。
【００４１】菌アスパラギン酸プロテアーゼをコードす
る遺伝子をクローニングするために、組込ベクターｐＰ
Ｓ７をＮｃｏＩによって切断し、更にＳＩヌクレアーゼ
で、次いでアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理
した（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔａｌ．，１９８２，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）。
この部位に、正確にはサッカロミセス セレビシエ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
ＳＵＣ２遺伝子の分泌シグナルとサッカロミセスそれ自
体のＧＡＰ遺伝子の転写終止シグナルとの間に、プラス
ミドｐＲＨ−３からの所望の遺伝情報を導入したが、こ
の情報はピヒア パストリスのＡＯＸ1遺伝子プロモー
ターに依然として制御されていた（図９）。この発現カ
セットは、選択マーカーとして用いられたサッカロミセ
スのＨＩＳ３遺伝子と、組込のための実際のＡＯＸ遺伝
子の５’および３’のはさむ領域とでもって完成した。
得られた発現ベクターをｐＲＨ−４と呼ぶ。
【００４２】次に発現ベクターｐＲＨ−４を用いてピヒ
ア パストリスのｈｉｓ￣変異株ＭＰ３６の形質転換を
行なった。この形質転換によって得られるＣＬＲＨ−１
と呼ばれる微生物を、半連続培養の条件下で酵素を排出
するために培養、誘発した。
【００４３】その発酵のために、アスパラギン酸プロテ
アーゼを作るピヒア属の新しい組換株を、工業媒地（３
％全還元物質を産出するところの培養媒地１リットル当
たり燐酸アンモニウム１３．２ｇ、硫酸アンモニウム９
ｇ、尿素５ｇ、糖蜜８４ｍｌ）を含む５リットルの発酵
槽中に接種した。接種原は６００ｎｍの光学密度０．５
〜１に相当する。発酵条件は、培養温度３０℃、媒地ｐ
Ｈ５．５に保持した。この系の誘発はメタノールを用い
て行ない、培養物の生長が指数増殖期に達した時および
その時点から、培養物の流出を２．５ｍｌ／ｌ／ｈで定
常的に維持した。
【００４４】この条件下で組換株ＣＬＲＨ−１は１．５
ｇ／ｌ程度の酵素排出レベルに達するが、このレベル
は、各バッチが終了するに従って、新しい媒地で順次置
換し、半連続的培養を行なうことにより、約７ｇ／ｌ
（培養物）にまで増加した。
【００４５】実施例７ バチラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＣＩＢ−２５（ＣＩＢの菌株
のコレクション）から抽出された染色体ＤＮＡをエンド
ヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に消化し、２〜４ｋｂの
大きさの断片を低融点アガロースゲル電気泳動（ＬＧ
Ｉ）によって分離した。これらの断片をＥｃｏＲＩで消
化し、アルカリ性ホスファターゼで処理したベクターｐ
ＢＲ３２２に連結した。それによって得られるプラスミ
ドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６６（Ｆ，Ｄ ｌ
ａｃＸ７４，ｈｓｒ，ｈｓｍ，ｒｐｓ １，ｇａｌＵ，
ｇａｌＫ，ｔｒｉｐ Ｃ ９０３０Ｆ，ｌｅｕＢ，ｐｙ
ｒＦ：：ｔｎ５）を形質転換した。
【００４６】クローンの同定は、０．５％可溶性デンプ
ンと１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ
媒地の中にコロニーを接種し、プレート上の活性を測定
することにより行なった。コロニーを３７℃で７２時間
放置して培養し、プレートを金属性ヨウ素蒸気で染色し
た。コロニーの周囲に鮮明な輪形（ｈａｌｏ）を示した
ものが陽性クローンである。この選択されたクローンの
一つをｐＡＢ−２４と名づけエンドヌクレアーゼ遺伝子
を用いて制限分析を行なった。アルファ−アミラーゼを
含有する３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の制限地図を図１０に
示す。３ｋｂ断片の中央部分で得た制限パターンはＳ．
Ａ．Ｏｒｔｌｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎ
ｅ ２３：２６７−２７６及びＧ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ
ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６
６：６３５−６４３の結果と符合する。
【００４７】クローンを分析し、構造領域が、報告され
ている領域と一致することを証明した後、遺伝子をコー
ドする領域を精密に分離した。この目的のため、２つの
合成オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）の実施のためにデザインした。このオリゴヌクレオ
チドは、すでに公表されているＢ．リケニフォルミス
（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｇ．Ｌ．Ｇｒａ
ｙ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１６６：６３５−６４３）のアルファ−アミラーゼ
配列に基づいてデザインした。この２つのオリゴヌクレ
オチドの配列を図１１に示す。遺伝子の５’領域に相当
するオリゴヌクレオチドはＮｃｏＩ部位を含有し、遺伝
子の３’領域に相当するものはＳａｌＩ部位を含有す
る。分離されたアルファ−アミラーゼ遺伝子の増幅を行
なうためにＲ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ ｅｔａｌ．，１９８
８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１に記載の
方法をとった。
【００４８】公表されたこのオリゴヌクレオチドの配列
とデザインによれば、ポリメラーゼ連鎖反応の産生物は
成熟蛋白質を含み、そのシグナル配列は含まない１．４
ｋｂの断片を産出することになっている。ＰＣＲ産生物
として得た断片が所望の大きさと一致するので、公表さ
れているＢ．リケニフォルミスのアルファ−アミラーゼ
遺伝子と本発明における分離された遺伝子との間には非
常に高い相同性のあることが明らかになった。この分離
された遺伝子をプラスミドＹＩＰ ５の中で半クローニ
ングするために酵素ＮｃｏＩでこれを消化し、プラスミ
ドｐＡＭＳＳを形成した（図１２）。
【００４９】エンドヌクレアーゼＮｃｏＩによる消化、
ＳＩエキソヌクレアーゼによる処理及びアルカリ性ホス
フォターゼによる末端の脱リン酸化に付すことによっ
て、該プラスミドｐＰＳ−７をクローニングベクターと
して用いた。このベクター中に、プラスミドｐＡＭＳＳ
を酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで消化し、その断片の両端
をＳＩエキソヌクレアーゼを用いて平滑化することによ
って得たアルファ−アミラーゼ遺伝子を挿入した。この
ようにしてベクターと遺伝子とを結合して最終クローニ
ングベクターｐＰＳＡ−３（図１２）とし、このクロー
ニングベクターを変異株ＭＰ−３６の形質転換に用い
た。
【００５０】得られた形質転換体を分析してそのアルフ
ァ−アミラーゼを産出する能力を調べた。この目的のた
めに１％可溶性デンプンと０．５％メタノールを含む媒
地Ｇ(Ｇａｌｚｙ及びＳｌｏｎｉｍｓｋｉ，１９５７，
（Ｐａｒｉｓ)Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２４５：
２４２３）のプレート上で形質転換体を培養した。３０
℃で３日間インキュベートした後、プレートをヨウ素蒸
気で染色すると、デンプンの加水分解により酵素を産出
するイースト菌の周りに鮮明な輪形（ｈａｌｏ）が現れ
た。
【００５１】プレート選択法によって陽性の結果を示す
ところの形質転換した酵母の一つであるＭＰＡ ３６２
５を、発酵−誘発の研究のために分離した。この酵母
は、メタノールを用いた発酵と誘発の過程で６ｇ／ｌ以
上の活性型酵素アルファ−アミラーゼを培養媒地中に分
泌することが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベクターｐＨＩＳ−８５の構造を示す説明図で
ある。
【図２】ベクターｐＰＳ−７Ａの構築を示す説明図であ
る。
【図３】ベクターｐＰＳ−７の構築を示す説明図であ
る。
【図４】ベクターｐＰＥＧＦ−Ｌの構築を示す説明図で
ある。
【図５】ＳＵＣ２のシグナルペプチドをコードする合成
オリゴの塩基配列を示す。
【図６】ヒトＥＧＦをコードする遺伝子のヌクレオチド
配列およびその合成に用いたオリゴヌクレオチドの塩基
配列を示す。
【図７】プロキモシン遺伝子含有のベクターｐＰＰＣ３
１６−３の構築を示す説明図である。
【図８】マイコレンニン遺伝子含有のベクターｐＲＨ−
３の構築を示す説明図である。
【図９】マイコレンニン遺伝子含有のベクターｐＲＨ−
４の構築を示す説明図である。
【図１０】アルファ−アミラーゼ遺伝子を含有する３ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片の制限地図を示す。
【図１１】アルファ−アミラーゼ遺伝子の塩基配列を示
す。
【図１２】アルファ−アミラーゼ遺伝子を含有するベク
ターｐＰＳＡ−３の構築を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 15/56 15/59 15/81 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/60 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (31)優先権主張番号 １４２／９０ (32)優先日 1990年８月15日 (33)優先権主張国 キューバ（ＣＵ） (72)発明者 ブラディミル ヨング ゴンツァレス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、マリアナオ、エントレ 118 イ 120、アプト ４、アベ 35、1805 (72)発明者 エミリオ マルゴレス クラーク キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、セロ、レパルト アントニオ マセ オ、エントレ ３ アー イ ブランキ タ、４ タ、10202 (72)発明者 ジュリオ マルコス デルガド ボアダ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キューバナサン、エントレ 31 イ 33、アプト 52、カッレ 184、 3112 (72)発明者 ジュアン モラレス グリロ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ハバナビエア、エントレルス イ ア コスタ、アプト １、カッレ コンポステ ラ、653 (72)発明者 イシス デル カルメン トレンス マド ラソ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラサ デ ラ レボルシオン、ベダ ード、エントレ パセオ イ エー、アプ ト １、カッレ ５、455 (72)発明者 アレファンドロ シルバ ロドリゲス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キューバナサン、エントレ 31 イ 33、アプト 46、カッレ 184、 3112 (72)発明者 エデニア パイフェル レイエス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、エントレ 36 イ 42、ア ベ 23、3611 (72)発明者 ゲラルド フェルベイレ ビネルファ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、エントロ ハバナ、エントレゲニオ イ レフギオ、アプト 10、インドゥスト リア ８ (72)発明者 アンジェラ エステラ ソサ エスピノー サ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キューバナサン、エントレ 31 イ 33、アプト 37、カッレ 184、 3112 (72)発明者 ブラディミル マルチネス サンタナ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラサ デ ラ レボルシオン、ベダ ード、エントレ 25 イ 27、アプト １、カッレ ４、603 (72)発明者 ジョルジュ アグスチン アギアール サ ンチャゴ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ビボラ、エントレ サンマリアノ イ ビスタ アレグレ、アプト １、カッレ ゴス 370 (72)発明者 アリナ セラレナ マネンデス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、ミラマール、エントレ 28 イ 30、カッレ １ アー、2803 (72)発明者 タニア ゴンザレス ロペス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、セロ、ルプト サンタ カタリナ、エ ントレ ベントエステ イ シー、アプト ６、 エディフ 14、カッレ エル−ベ ント、10013 (72)発明者 ラケル モンテシノス セグイ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キューバナサン、エントレ 31 イ 33、アプト 50、カッレ 184、 3112 (72)発明者 ホセ アルベルト クレマタ アルバレス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ボエロス、サンチアゴ デ ラスベガ ス、エントレ ７ イ ９、カッレ 10、 40302 (72)発明者 アデライダ ビラレアル バリオス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キューバナサン、エントレ 31 イ 33、アプト 70、カッレ 184、 3112 (72)発明者 ベアトリッツ ゴンザレス バディロ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、エントレ 31 イ 33、ア プト 18、カッレ 184、3112 (72)発明者 アルフレド メネンデス アラルソン キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キューバナサン、エントレ 31 イ 33、アプト 37、カッレ 184、 3112 (72)発明者 マリア エレナ ゴンサレス マルチネス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラサ デ ラ レボルシオン、ベダ ード、エントレ 25 イ 27、カッレ 26、1002

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 発現すべき異種遺伝子を含有する発現ベ
    クターを調製し、ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
    ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母宿主株を該発現ベクターで形質
    転換し、得られる形質転換体を培養して異種遺伝子発現
    産物を産生し、そして、場合により、得られる遺伝子発
    現産物を単離することを包含する異種遺伝子の発現方法
    において、ピヒア パストリスのＡＯＸ1プロモータ
    ー、発現すべき異種遺伝子を挿入するための制限部位が
    後にあり又場合によってはこの制限部位の後にサッカロ
    ミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
    ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＰ遺伝子の転写ターミネー
    ターを有しているところのサッカロミセス セレビシエ
    のＳＵＣ２のシグナルペプチド配列、およびサッカロミ
    セス セレビシエのＨＩＳ３選択マーカーを含む発現カ
    セットを含有するプラスミドを上記発現ベクターとして
    用い、その際該発現カセットはピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）
    のＡＯＸ遺伝子の５’配列および３’配列によってはさ
    まれていてピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）ゲノム中に組み込ま
    れていること、ならびに上記宿主株としてピヒア パス
    トリスのｈｉｓ￣変異株を用いることを特徴とする方
    法。
  2. 【請求項２】 イミダゾール グリセロホスフェート
    デヒドラターゼ酵素が欠失しているピヒア パストリス
    のｈｉｓ￣栄養要求変異株ＭＰ−３６を宿主株として用
    いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 上記発現ベクターが、サッカロミセス
    セレビシエのＧＡＰ遺伝子の転写ターミネーターを含む
    プラスミドｐＰＳ−７由来であることを特徴とする請求
    項１又は２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 異種遺伝子の発現産物が、ヒト表皮成長
    因子、アルファ−アミラーゼ、ウシ レンニンおよびマ
    イコレンニンよりなる群から選ばれることを特徴とする
    請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 上記発現ベクターが、サッカロミセス
    セレビシエのＧＡＰ遺伝子の転写ターミネーターを含ま
    ないプラスミドｐＰＳ−７Ａ由来であって、それから由
    来する発現ベクターが含有する異種遺伝子がそれ自身の
    転写ターミネーターを有することを特徴とする請求項１
    または２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 該異種遺伝子の発現産物がスクロース
    インベルターゼである請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐ
    ａｓｔｏｒｉｓ）酵母中での異種遺伝子の発現方法にお
    いて、異種遺伝子の発現系として、ピヒアパストリスの
    ＡＯＸ1プロモーター、サッカロミセス セレビシエ
    （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
    ｅ）のＳＵＣ２のシグナルペプチド、転写ターミネータ
    ーとしてサッカロミセス セレビシエ ＧＡＰ遺伝子の
    転写ターミネーター、および選択マーカーとしてサッカ
    ロミセス セレビシエのＨＩＳ３遺伝子を含有し、それ
    らがピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）のＡＯＸ遺伝子の５’配列
    および３’配列にはさまれた発現カセットを形成してな
    るところの酵母への組込み用ｐＰＳ−７を用い、且つ、
    宿主として、イミダゾール グリセロホスフェートデヒ
    ドラターゼ酵素に特異的であって該シグナル ペプチド
    と該転写ターミネーターの間に位置する異種遺伝子の高
    レベルの発現を達成できる栄養要求変異株ＭＰ−３６を
    用いることを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】 ＧＡＰの終止シグナルを有さない発現ベ
    クターｐＰＳ−７Ａを発現ベクターとして用い、発現す
    べく挿入された異種遺伝子自身のターミネーターを終止
    シグナルに用いることを特徴とする請求項７に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 ピヒア パストリスのＡＯＸ1遺伝子の
    プロモーター、酵母のゲノム中への組込みのためのこの
    遺伝子の５’配列および３’配列、分泌シグナルとして
    サッカロミセス セレビシエのＳＵＣ２のシグナル ペ
    プチド、および選択マーカーとしてサッカロミセス セ
    レビシエのＨＩＳ３遺伝子を包含し、発現されるべき異
    種遺伝子が該シグナル ペプチドと転写終止配列との間
    に位置するところの請求項１〜８のいずれかにおいて定
    義された発現ベクター。
  10. 【請求項１０】 異種遺伝子として、ヒト表皮成長因子
    （ｈＥＧＦ）、アルファ−アミラーゼ、ウシ レンニン
    およびマイコレンニンをコードする遺伝子をそれぞれ含
    有し、更に転写ターミネーターとしてサッカロミセス
    セレビシエのＧＡＰ遺伝子の転写ターミネーターを含有
    する請求項９に記載の発現ベクターｐＰＥＧＦ−Ｌ、ｐ
    ＰＳＡ−３、ｐＰＰＣ３１６−３およびｐＲＨ−４。
  11. 【請求項１１】 異種遺伝子としてサッカロミセス セ
    レビシエのスクロース インベルターゼ（ＳＵＣ２）を
    コードする遺伝子を含有し、転写ターミネーターとして
    該遺伝子自身の転写ターミネーターを含有する請求項９
    に記載の発現ベクターｐＰＳ−７Ａ。
  12. 【請求項１２】 異種蛋白をコードする遺伝子を含む発
    現ベクターで変異株ＭＰ−３６を形質転換することによ
    って得られ、該蛋白を高レベルで発現するところの請求
    項１〜８のいずれかにおいて定義された形質転換微生
    物。
  13. 【請求項１３】 ベクターｐＰＥＧＦ−Ｌ、ｐＰＳ−７
    Ａ、ｐＰＳＡ−３、ｐＰＰＣ３１６−３およびｐＲＨ−
    ４のそれぞれで変異株ＭＰ−３６を形質転換することに
    よって得られ、ｈＥＧＦ、ペリプラズム スクロース
    インベルターゼ、熱安定性アルファ−アミラーゼ、ウシ
    レンニンおよびマイコレンニンをそれぞれ高レベルで
    発現するところの、請求項１２に記載の形質転換微生物
    ＭＥＧＦ−５，ＭＳＵＣ−２、ＭＰＡ ３６２５、ＣＬ
    ＲＢ−４およびＣＬＲＨ−１。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれかにおいて定
    義された異種遺伝子の発現によって得られる産物。
JP3014953A 1990-01-16 1991-01-16 ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母中での異種遺伝子の発現方法、発現ベクターおよび形質転換微生物 Pending JPH05184352A (ja)

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