ES2610990T3 - Secuencias de expresión - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica un líder, que se selecciona del grupo que consiste en a) un péptido líder con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 10 o una variante funcional del mismo con una o dos mutaciones puntuales, y b) un péptido líder con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID 11, 12, 13 y 14.

Description

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longitud completa, tal como por ejemplo IgG, IgA, IgD, IgM o IgE, un scFv, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, Fab y una proteína de fusión con Fc, preferiblemente un anticuerpo de longitud completa, un scFv o un Fab.

De manera específica, la PDI comprende un residuo de aminoácido N-terminal distinto de Alanina. Por lo tanto, no hay un sitio de escisión de peptidasa señal de VSA-AP (SEQ ID 6) como se predice en la técnica anterior (documento EP2258855A1).

De manera específica, la PDI puede ser una proteína secretada, tal como una proteína madura que podría ser una forma activa de una proteína o una pro-forma.

El método según la invención proporciona preferiblemente el cultivo de la célula hospedadora en un cultivo celular, y dicha PDI o metabolito se obtiene, p.ej., a medida que se secreta la PDI, que incluye proteínas o metabolitos unidos a la membrana o solubles o extracelulares, que se purifican opcionalmente del sobrenadante del cultivo celular.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona el uso del ácido nucleico o líder de la invención, en particular el ácido nucleico que codifica un líder truncado de la invención, para la secreción de una PDI de una célula hospedadora y/o para incrementar la secreción de una PDI de una célula hospedadora, preferiblemente, en el que al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 100% de la PDI secretada comprende una secuencia de aminoácidos N-terminal nativa.

Figuras

Figura 1: secuencia promotora pG1: SEQ ID 9.

Figura 2.1: SDS-PAGE teñida con plata de los sobrenadantes reducidos de P. pastoris que secreta pTRP con EpxL-RT o MFα, respectivamente.

Figura 2.2: SDS-PAGE teñida con plata de los sobrenadantes reducidos de P. pastoris que secreta eGFP con EpxL-RT o MFα.

Figura 2.3: Transferencia de Western anti-HSA de los sobrenadantes reducidos de P. pastoris que secreta HSA con EpxL-RT o MFα, respectivamente.

Figura 3: Transferencia de Western teñida con Coomassie de los sobrenadantes de P. pastoris que secreta HSA con EpxL-RT para la secuenciación N-terminal.

Figura 4.1: SDS-PAGE teñida con plata de los sobrenadantes reducidos de P. pastoris que secreta pTRP con EpxL-RT, EpxL-KR o MFα, respectivamente.

Figura 4.2: SDS-PAGE teñida con plata de los sobrenadantes reducidos de P. pastoris que secreta eGFP con EpxL-KR o MFα, respectivamente.

Figura 4.3: Sobrenadantes de P. pastoris que secreta la cadena pesada de HyHEL o la cadena ligera de HyHEL con EpxL-KR, respectivamente. HC: Transferencia de Western mediante el uso del anticuerpo anti-cadena gamma de IgG; LC: SDS-PAGE y tinción de plata.

Figura 5.1: SDS-PAGE teñida con plata de los sobrenadantes reducidos de P. pastoris que secreta eGFP con EpxL-KR, EpxL-AA o EpxL-A, respectivamente.

Figura 5.2: SDS-PAGE teñida con plata de los sobrenadantes reducidos de P. pastoris que secreta LC con EpxL-KR, EpxL-AA o EpxL-A, respectivamente.

Figura 5.3: Transferencia de Western de los sobrenadantes no reducidos de P. pastoris que secreta el Fab de HyHEL bajo control de pG1 con EpxL-A o MFα, respectivamente.

Figura 6: Transferencia de Western de los sobrenadantes de P. pastoris que secreta la hormona del crecimiento humana (HGH), somatotropina humana, interferón alfa2a, los 3 fragmentos de anticuerpos diferentes Fab1, Fab2, Fab3, y los 2 fragmentos de anticuerpos Fv cadena simple diferentes scFv1 y scFv2, respectivamente, bajo control de pG1 con EpxL-A.

Descripción detallada de la invención

Los términos específicos usados a lo largo de la memoria descriptiva tienen el significado siguiente.

La expresión "línea celular", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un clon establecido de un tipo de célula particular que ha adquirido la capacidad de proliferar a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. La expresión "línea celular hospedadora" se refiere a una línea celular tal como se usa para expresar un gen o productos endógenos o recombinantes de una ruta metabólica para producir polipéptidos o los metabolitos celulares mediados por tales polipéptidos. Una "línea celular hospedadora de producción" o "línea celular de producción" se

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entiende habitualmente que es una línea celular lista para su uso para el cultivo en un biorreactor para obtener el producto de un proceso de producción, tal como una PDI. Las expresiones "levadura hospedadora" o "línea celular de levadura" o "célula hospedadora de levadura" o "célula hospedadora" u "hospedadores" significarán cualquier célula de levadura que se pueda cultivar para producir una PDI o un metabolito de célula hospedadora.

El término "expresión" o "sistema de expresión" o "casete de expresión" se refiere a las moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia codificante deseada de un producto de expresión tal como, p.ej., una PDI y secuencias de control tales como, p.ej., un promotor en unión operable, de forma que los hospedadores transformados o transfectados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas o los metabolitos de las células hospedadoras. Para llevar a cabo la transformación, se puede incluir el sistema de expresión en un vector; sin embargo, el ADN relevante también se puede integrar en el cromosoma hospedador. La expresión se puede referir a los productos de expresión secretados o no secretados, que incluyen polipéptidos o metabolitos. De manera específica, el término se refiere a una célula hospedadora y a un vector compatible en condiciones adecuadas, p.ej. para la expresión de una proteína codificada por un ADN exógeno portado por el vector e introducido en la célula hospedadora.

Las "construcciones de expresión" o "vectores" usados en la presente memoria se definen como secuencias de ADN que son necesarias para la transcripción de las secuencias de nucleótidos recombinantes clonadas, es decir, de los genes recombinantes y la traducción de su mARN en un organismo hospedador adecuado. Los vectores de expresión comprenden el casete de expresión y además comprenden normalmente un origen para la replicación autónoma en las células hospedadoras o un sitio de integración en el genoma, uno o más marcadores seleccionables (p.ej. un gen de síntesis de aminoácidos o un gen que confiere resistencia a antibióticos tales como zeocina, kanamicina, G418 o higromicina), varios sitios de escisión para enzimas de restricción, una secuencia promotora adecuada y un terminador de la transcripción, cuyos componentes se unen de forma operable entre sí. Los términos "plásmido" y "vector", tal como se usan en la presente memoria, incluyen secuencias de nucleótidos que se replican de manera autónoma, así como secuencias de nucleótidos de integración en el genoma.

De manera específica, el término se refiere a un vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (p.ej. un gen exógeno) en una célula hospedadora, para transformar al hospedador y estimular la expresión (p.ej. la transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los plásmidos son los vectores preferidos.

Los vectores comprenden en general el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta el ADN exógeno. Una manera habitual de insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN implica el uso de enzimas denominadas enzimas de restricción que escinden el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) denominados sitios de restricción. Un "casete" se refiere a una secuencia codificante de ADN o segmento de ADN que codifica un producto de expresión que se puede insertar en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción del casete se diseñan para asegurar la inserción del casete en el marco de lectura adecuado. En general, el ADN exógeno se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN del vector, y después es transportado por el vector a una célula hospedadora junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene ADN insertado o añadido, tal como un vector de expresión, también se puede denominar "construcción de ADN". Un tipo habitual de vector es un "plásmido", que en general es una molécula autocontenida de ADN bicatenario que puede aceptar fácilmente ADN adicional (exógeno) y que se puede introducir fácilmente en una célula hospedadora adecuada. Un vector plasmídico contiene a menudo ADN codificante y ADN promotor, y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar ADN exógeno. El ADN codificante es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos particular para un polipéptido o proteína particular tal como, p.ej., una PDI. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula, o de otra manera actúa como mediador o controla la expresión del ADN codificante. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de genes diferentes, y pueden ser del mismo organismo o de organismos diferentes. Los vectores de clonación recombinantes incluirán a menudo uno o más sistemas de replicación para la clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el hospedador, p.ej. resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión.

La expresión "variante funcional", tal como se usa en la presente memoria, p.ej. con respecto a las secuencias reguladoras según la invención, tales como el péptido señal con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 1, o con respecto a un líder con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 10, se referirá a las variantes con una o dos mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos, que tienen sustancialmente la misma señal o actividad de líder en comparación con las secuencias sin modificar. Las variantes funcionales de los ácidos nucleicos de la presente invención abarcan además las secuencias con optimización de codones, también denominadas en la presente memoria "variantes con optimización de codones", que codifican cualquiera de los péptidos señal o líder de la presente invención. Tal optimización de codones de un ácido nucleico se entiende como la alteración sistemática de los codones en el ADN recombinante para expresarlo en un sistema heterólogo para coincidir con el patrón de uso de codones en el organismo usado para la expresión. La intención es específicamente mejorar la producción de una proteína expresada.

Se entiende que las expresiones "péptido señal", "líder" o "líder truncado", tal como se usan en la presente memoria, se refieren siempre a los aminoácidos específicos de SEQ ID 1 y SEQ ID 10, respectivamente, y también a las variantes funcionales de los mismos con una o dos mutaciones puntuales.

La expresión "sustancialmente la misma actividad de señal o líder", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la actividad tal como se indica mediante sustancialmente la misma secreción de una PDI en el sobrenadante por la célula hospedadora recombinante; por ejemplo, un nivel de PDI en el sobrenadante que es al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% del nivel de PDI en el sobrenadante tal como se proporciona mediante el líder de SEQ ID 1 o SEQ ID 10, respectivamente.

Una mutación puntual se entiende como la modificación de un polinucleótido que da como resultado la expresión de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos sin modificar por la sustitución o el intercambio de uno o más aminoácidos individuales (no consecutivos) por un aminoácido diferente. Las variantes funcionales preferidas tienen una o más mutaciones puntuales en las posiciones 3 y 16 de SEQ ID 1 y SEQ ID 10, respectivamente.

Las mutaciones puntuales preferidas adicionalmente se refieren al intercambio de aminoácidos de la misma polaridad y/o carga. A este respecto, los aminoácidos se refieren a los veinte aminoácidos naturales codificados por sesenta y cuatro codones de tripletes. Estos 20 aminoácidos se pueden dividir en los que tienen cargas neutras, cargas positivas, y cargas negativas:

Los aminoácidos "neutros" se muestran a continuación junto con sus códigos respectivos de tres letras y de una letra, y la polaridad: Alanina: (Ala, A) apolar, neutro; Asparagina: (Asn, N) polar, neutro; Cisteína: (Cys, C) apolar, neutro; Glutamina: (Gln, Q) polar, neutro; Glicina: (Gly, G) apolar, neutro; Isoleucina: (He, I) apolar, neutro; Leucina: (Leu, L) apolar, neutro; Metionina: (Met, M) apolar, neutro; Fenilalanina: (Phe, F) apolar, neutro; Prolina: (Pro, P) apolar, neutro; Serina: (Ser, S) polar, neutro; Treonina: (Thr, T) polar, neutro; Triptófano: (Trp, W) apolar, neutro; Tirosina: (Tyr, Y) polar, neutro; Valina: (Val, V) apolar, neutro; y Histidina: (His, H) polar, positivo (10%) neutro (90%). Los aminoácidos cargados "positivamente" son: Arginina: (Arg, R) polar, positivo; y Lisina: (Lys, K) polar, positivo. Los aminoácidos cargados "negativamente" son: Ácido aspártico: (Asp, D) polar, negativo; y

Ácido glutámico: (Glu, E) polar, negativo. El término "aislado" o "aislamiento", tal como se usa en la presente memoria con respecto a un ácido nucleico, una PDI u otro compuesto, se referirá a un compuesto que se ha separado lo suficientemente del medio con el que estaría asociado de manera natural, como para que exista en una forma "sustancialmente pura". "Aislado" no significa necesariamente la exclusión de mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o materiales, o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad fundamental, y que pueden estar presentes, por ejemplo, debido a una purificación incompleta. En particular, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente

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invención también pretenden incluir las sintetizadas químicamente. Con referencia a los ácidos nucleicos de la invención, a veces se usa la expresión "ácido nucleico aislado". Esta expresión, cuando se aplica al ADN, se refiere a una molécula de ADN que se separa de las secuencias con las que está inmediatamente contigua en el genoma natural del organismo del que se originó. Por ejemplo, un "ácido nucleico aislado" puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, tal como un plásmido o vector viral, o integrada en el ADN genómico de una célula procariótica o eucariótica u organismo hospedador. De manera específica, la expresión "ácido nucleico aislado" según la invención excluye que el ácido nucleico que codifica la proteína EPX1 esté unido a un ácido nucleico que codifica el líder según la presente invención. Cuando se aplica al ARN, la expresión "ácido nucleico aislado" se refiere principalmente a una molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada como se definió anteriormente. De manera alternativa, la expresión se puede referir a una molécula de ARN que se ha separado suficientemente de otros ácidos nucleicos con los que estaría asociada en su estado natural (es decir, en las células

o tejidos). Un "ácido nucleico aislado" (ADN o ARN) puede representar además una molécula producida directamente mediante medios biológicos o sintéticos, y separada de los otros componentes presentes durante su producción.

El término "líder", tal como se usa en la presente memoria, se entiende de la siguiente la manera. Las regiones codificantes de polinucleótidos y de ácido nucleico en el casete de expresión de la invención pueden estar asociadas con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o péptidos señal, que dirigen la secreción de una PDI. Las proteínas destinadas a la ruta secretora tienen una secuencia líder N-terminal que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína naciente a través del retículo endoplásmico rugoso. Un líder induce que la proteína expresada se transporte hacia o fuera de la membrana plasmática, y de ese modo facilita separar y purificar la proteína expresada. En general, una proteína de membrana

o una proteína secretora que se transporta al espacio periplasmático, a la membrana celular o fuera de la célula comprende tal secuencia N-terminal. Normalmente, los líderes se escinden de la proteína mediante peptidasas celulares especializadas después de transportar las proteínas.

Las proteínas secretadas por las células eucarióticas tienen en general una secuencia líder fusionada en el extremo N-terminal de la proteína, que se escinde de la proteína completa o "de longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" de la proteína.

Los ejemplos específicos de un líder son un líder que consiste en un péptido señal o un líder que consiste en un péptido señal y una prosecuencia, tal como el líder truncado descrito en la presente memoria. El líder que consiste en el péptido señal de SEQ ID 1 o el líder truncado de SEQ ID 10 se denominan también en la presente memoria secuencias reguladoras.

El término, tal como se usa en la presente memoria, se refiere en particular a una secuencia de control para la posible modificación de la expresión de una PDI. El líder, también denominado péptido líder, se une al extremo Nterminal de una secuencia de aminoácidos de PDI. El ácido nucleico que codifica el líder está en posición 5', y unido de forma operable al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica la PDI. Se puede usar cualquier secuencia líder según la invención que sea funcional en la célula hospedadora de elección.

La expresión "residuo de aminoácido N-terminal nativo" o "secuencia de aminoácidos N-terminal nativa" se entiende que se refiere a uno o más aminoácido(s) de la secuencia N-terminal, p.ej. el residuo de aminoácido N-terminal de una PDI enumerada, cuyo residuo de aminoácido se considera el correcto en comparación con la secuencia de una PDI enumerada a expresar. El residuo de aminoácido N-terminal nativo, así, proporciona un extremo N-terminal o región N-terminal nativa de una PDI, lo cual es un prerrequisito para obtener una secuencia de aminoácidos correcta, completa, para obtener un compuesto funcional sin ningún residuo(s) de aminoácido(s) N-terminal(es) adicional(es) (superfluo(s)) exógeno(s) para la PDI. En general, se entiende que cualquier proteína de tipo natural tiene un residuo de aminoácido N-terminal nativo. Además, una proteína recombinante también puede tener un residuo de aminoácido N-terminal nativo, que está predefinido y exhibe propiedades deseables de la proteína.

De manera específica, cuando el péptido señal o líder truncado de la presente invención se une directamente al residuo de aminoácido N-terminal nativo de una PDI, la proteína liberada contendrá un residuo de aminoácido Nterminal natural al menos en cierto grado, y en general no comprende una prolongación N-terminal de longitud variable. La composición preferida de una PDI se caracteriza por un residuo de aminoácido N-terminal nativo que comprende un extremo N-terminal correcto, al menos en cierto grado, que es preferiblemente la mayoría de las moléculas de PDI, o al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 100% (p/p) de las moléculas de PDI, sin residuos de aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal, tal como los que se originan de un péptido señal o pro-secuencia, o un fragmento de la misma.

El término "pro-secuencia", tal como se usa en la presente memoria, se referirá a una secuencia de aminoácidos precursora unida de forma operable al extremo N-terminal de una PDI. La pro-secuencia puede tener además una secuencia señal unida de forma operable al extremo N-terminal de la pro-secuencia. En general, la pro-secuencia se escinde de la PDI para proporcionar la forma madura de la PDI.

Un ejemplo específico de una pro-secuencia es parte del líder truncado, y tiene la secuencia de aminoácidos de

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SEQ ID 7: APVAPAEEAANHLHKR

es decir, la pro-secuencia truncada: los aminoácidos 21-36 de la secuencia líder truncada de SEQ ID 10.

La expresión "unido de forma operable", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la asociación de secuencias de nucleótidos en una única molécula de ácido nucleico, p.ej. un vector, de manera que la función de una o más secuencias de nucleótidos se ve afectada por al menos otra secuencia de nucleótidos presente en dicha molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido de forma operable con una secuencia codificante de un gen recombinante cuando es capaz de causar un efecto sobre la expresión de esa secuencia codificante. Como ejemplo adicional, un ácido nucleico que codifica un péptido señal está unido de forma operable a una secuencia de ácido nucleico que codifica una PDI cuando es capaz de expresar una proteína en la forma secretada, tal como una preforma de una proteína madura o la proteína madura. De manera específica, tales ácidos nucleicos unidos de forma operable entre sí se pueden unir inmediatamente, es decir, sin elementos adicionales o secuencias de ácido nucleico entre el ácido nucleico que codifica el péptido señal y la secuencia de ácido nucleico que codifica una PDI.

"Promotor", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. La actividad del promotor se puede estudiar por su eficacia transcripcional. Esto se puede determinar directamente midiendo la cantidad de transcripción de mARN del promotor, p.ej. mediante transferencia de Northern, o indirectamente midiendo la cantidad de producto del gen expresado por el promotor.

La expresión "proteína de interés (PDI)", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido o una proteína que se produce por medio de la tecnología recombinante en una célula hospedadora, también se denomina PDI recombinante o PDI producida por la célula hospedadora recombinante. De manera más específica, la PDI recombinante puede no ser natural en la célula hospedadora, es decir, una proteína heteróloga, o de otra manera puede ser nativa respecto de la célula hospedadora, es decir, una proteína homóloga respecto de la célula hospedadora, pero se produce, por ejemplo, mediante transformación con un vector auto-replicante que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la PDI, o tras la integración mediante técnicas recombinantes de una o más copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica la PDI en el genoma de la célula hospedadora, o mediante modificación recombinante de una o más secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen que codifica la PDI, p.ej. del promotor o la secuencia señal. En casos específicos, la PDI recombinante, la PDI heteróloga u homóloga, se sobreexpresa mediante la célula hospedadora recombinante para obtener un rendimiento elevado de un producto. En ciertos casos, la PDI de expresión, tal como se usa en la presente memoria, también se refiere a cualquier producto de metabolito de la célula hospedadora mediado por la proteína expresada de manera recombinante.

El término "secreción", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la translocación de un polipéptido o proteína, específicamente una PDI, a través de la membrana plasmática y la pared celular de una célula vegetal hospedadora. La PDI secretada puede ser parte de la membrana celular en forma de una proteína unida a la membrana que está anclada dentro de la pared celular, o se puede liberar en forma de una proteína soluble en el sobrenadante celular.

Se entiende que el término "secreción", tal como se usa en la presente memoria con referencia a una PDI, abarca específicamente la expresión de una PDI en forma madura (que incluye las proformas de proteínas activas o las proteínas activas), en forma de una PDI unida a la membrana o en forma de una PDI extracelular.

El término "recombinante", tal como se usa en la presente memoria, significará "preparado mediante o el resultado de ingeniería genética". Así, un "microorganismo recombinante" comprende al menos un "ácido nucleico recombinante". Un microorganismo recombinante comprende específicamente un vector de expresión o un vector de clonación, o se ha modificado genéticamente para que contenga una secuencia de ácido nucleico recombinante. Una "proteína recombinante" se produce expresando un ácido nucleico recombinante respectivo en un hospedador.

Las moléculas de ácido nucleico o péptidos/polipéptidos/proteínas de la presente invención son preferiblemente recombinantes, para proporcionar fusiones de un líder con una PDI. Tal como se usa en la presente memoria, "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencias de otra manera separados, p.ej., mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos con técnicas de ingeniería genética. "Recombinante" también incluye la referencia a una célula o casete de expresión que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una célula derivada de una célula así modificada, pero no abarca la alteración de la célula o vector mediante sucesos que se dan de manera natural (p.ej., mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural), tales como los que se dan sin intervención humana deliberada.

La expresión "secuencia señal", tal como se usa en la presente memoria, se referirá a un ácido nucleico que codifica un péptido señal, que normalmente es una cadena peptídica corta (3-60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte de una proteína. Los péptidos señal también se pueden denominar señales de transporte, péptidos de tránsito, o señales de localización. Un péptido señal induce de manera específica que una proteína expresada se

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elementos reguladores o secuencias convencionales, empleados de manera natural o usados en general en los sistemas de expresión recombinante, p.ej. para proporcionar construcciones para la producción de proteínas recombinantes con un rendimiento elevado. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores, y potenciadores, sitios de unión ribosómica, y secuencias que controlan el inicio y la terminación de la transcripción y de la traducción.

Para demostrar la función de las secuencias relevantes se pueden construir casetes o vectores de expresión para controlar la expresión de una PDI, y el rendimiento expresado y/o secretado se compara respecto de las construcciones con elementos reguladores convencionales. Se puede hallar una descripción detallada del procedimiento experimental más adelante en los ejemplos.

Las secuencias identificadas se amplificaron mediante PCR de P. pastoris con el uso de cebadores nucleotídicos específicos, se clonaron en un vector de expresión de levadura unido de manera funcional al extremo N-terminal de la PDI, o en posición 5' de la secuencia de la PDI, y se transformaron en una línea de células hospedadoras de levadura, p.ej. P. pastoris, para la producción a nivel elevado de diversas PDI diferentes en forma secretada. Para estimar el efecto de las secuencias reguladoras, tales como la secuencia señal y el líder truncado según la invención, sobre el rendimiento de PDI, la línea de células hospedadoras de levadura obtenida según la invención se puede cultivar en experimentos con matraces agitados y fermentaciones semicontinuas o en quimiostato en comparación con las cepas que comprenden elementos reguladores convencionales.

Por medio de las secuencias reguladoras inventivas, en particular las secuencias que codifican el péptido señal o líder truncado y el vector de expresión, el método según la invención preferiblemente no solamente proporciona una producción incrementada mediante una secreción mejorada, sino que también proporciona una mayor calidad de la PDI en una célula hospedadora de levadura, y en particular en una célula hospedadora de P. pastoris. Un incremento de la secreción de la PDI se determina basándose en una comparación de su rendimiento de secreción en presencia de la secuencia reguladora, en particular la secuencia señal o el líder truncado, que incrementa la secreción de proteína en comparación con los elementos de la técnica anterior.

La PDI puede ser cualquier polipéptido eucariótico, procariótico o sintético. Se puede secretar como una proteína madura, como una proteína unida a la membrana o como una proteína expresada de manera extracelular. La presente invención también proporciona la producción recombinante de variantes funcionalmente equivalentes, derivados y fragmentos biológicamente activos de proteínas que se dan de manera natural. Las variantes funcionalmente equivalentes preferiblemente tienen sustancialmente las mismas características funcionales o actividad.

Una PDI mencionada en la presente memoria puede ser un producto homólogo para la célula hospedadora eucariótica o heterólogo, preferiblemente para uso terapéutico, profiláctico, diagnóstico, analítico o industrial.

La PDI es preferiblemente un polipéptido o proteína recombinante heterólogo, producido en una célula de levadura.

De manera específica, la PDI es una proteína eucariótica, preferiblemente una proteína de mamífero.

Una PDI producida según la invención puede ser una proteína multimérica, preferiblemente un dímero o tetrámero.

Según un aspecto de la invención, la PDI es una proteína recombinante o heteróloga, preferiblemente seleccionada de proteínas terapéuticas, que incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos, enzimas y péptidos, antibióticos proteicos, proteínas de fusión con toxinas, conjugados carbohidrato -proteína, proteínas estructurales, proteínas reguladoras, vacunas y proteínas o partículas similares a vacunas, enzimas de procesamiento, factores de crecimiento, hormonas y citocinas, o un metabolito de una PDI.

Una PDI específica es una molécula de unión a un antígeno tal como un anticuerpo, o un fragmento del mismo. Entre las PDIs específicas están los anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales (mAbs), inmunoglobulina (Ig)

o la clase de inmunoglobulina G (IgG), anticuerpos de cadena pesada (HcAbs), o fragmentos de los mismos tales como el fragmento de unión al antígeno (Fab), Fd, fragmento variable de cadena simple (scFv), o las variantes modificadas de los mismos tales como, por ejemplo, dímeros de Fv (diacuerpos), trímeros de Fv (triacuerpos), tetrámeros de Fv, o minicuerpos y anticuerpos de dominio simple similares a VH o VHH o V-NAR.

Las PDIs específicas adicionales son aprotinina, inhibidor de la ruta del factor tisular u otros inhibidores de proteasas, e insulina o precursores de insulina, análogos de insulina, hormonas del crecimiento, interleucinas, activador de plasminógeno tisular, factor de crecimiento transformante a o b, glucagón, péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), péptido similar a glucagón 2 (GLP-2), GRPP, Factor VII, Factor VIII, Factor XIII, factor de crecimiento derivado de plaquetas 1, albúmina de suero, enzimas, tales como lipasas o proteasas, o un homólogo funcional, variante equivalente funcional, derivado y fragmento biológicamente activo con una función similar a la de la proteína nativa. La PDI puede ser similar estructuralmente a la proteína nativa, y se puede obtener a partir de la proteína nativa mediante la adición de uno o más aminoácidos en uno o ambos extremos C-y N-terminales o en la cadena lateral de la proteína nativa, mediante la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o varios sitios diferentes de la secuencia de aminoácidos nativa, mediante la deleción de uno o más aminoácidos en uno o ambos extremos de la proteína nativa o en uno o varios sitios de la secuencia de aminoácidos, o mediante la inserción de uno o más

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incluir, pero sin limitación, los promotores obtenidos de genes que codifican enzimas metabólicas que se sabe que están presentes a una concentración elevada en la célula, p.ej. enzimas glucolíticas similares a triosafosfato isomerasa (TPI), fosfoglicerato quinasa (PGK), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), alcohol oxidasa (AOX), lactasa (LAC) y galactosidasa (GAL).

Los ejemplos preferidos de promotores adecuados son los promotores de levaduras, que contienen una secuencia de ADN que funciona como un promotor para la transcripción génica en las células de levadura. Los ejemplos preferidos son los promotores de Mal, TPI, CUP, ADH o PGK de S. cerevisiae, o el promotor de glucosa-6-fosfato isomerasa de P. pastoris (PPGI), el promotor de 3-fosfoglicerato quinasa (PPGK) o el promotor de glicerol aldehído fosfato deshidrogenasa PGAP, el promotor de alcohol oxidasa (PAOX), el promotor de formaldehído deshidrogenasa (PFLD), el promotor de isocitrato liasa (PICL), el promotor del factor de elongación de la traducción (PTEF), y los promotores de enolasa 1 de P. pastoris (PENO1), triosa fosfato isomerasa (PTPI), alfa-cetoisocaproato descarboxilasa (PTHI), proteínas de las subunidades ribosómicas (PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1), miembros de la familia de proteínas de choque térmico (PSSA1, PHSP90, PKAR2), 6-fosfogluconato deshidrogenasa (PGND1), fosfoglicerato mutasa (PGPM1), transcetolasa (PTKL1), fosfatidilinositol sintasa (PPIS1), ferro-O2-oxidorreductasa (PFET3), permeasa de alta afinidad para hierro (PFTR1), fosfatasa alcalina reprimible (PPHO8), N-miristoil transferasa (PNMT1), factor de transcripción de respuesta a feromonas (PMCM1), ubiquitina (PUBI4), endonucleasa de ADN monocatenario (PRAD2) y el promotor del transportador de ADP/ATP principal de la membrana interna mitocondrial (PPET9).

Si la PDI es una proteína homóloga respecto de la célula hospedadora, es decir, una proteína que se da de manera natural en la célula hospedadora, la expresión de la PDI en la célula hospedadora se puede modular mediante el intercambio de su secuencia promotora nativa con una secuencia promotora heteróloga respecto de la célula hospedadora o con una secuencia promotora homóloga respecto de la célula hospedadora, pero diferente a la secuencia promotora nativa de dicha PDI.

Este propósito de introducir un nuevo promotor se puede conseguir, p.ej., mediante la transformación de una célula hospedadora con una molécula de ADN recombinante que comprende secuencias homólogas del gen de interés para permitir la recombinación específica de sitio, la secuencia promotora y un marcador selectivo adecuado para la célula hospedadora. La recombinación específica de sitio tendrá lugar para unir de manera operable la secuencia promotora a la secuencia de nucleótidos que codifica la PDI. Esto da como resultado la expresión de la PDI a partir de la secuencia promotora heteróloga en vez de a partir de la secuencia promotora nativa.

En una realización específicamente preferida, la secuencia promotora tiene una actividad promotora incrementada respecto de la secuencia promotora nativa de la PDI.

También es posible proporcionar un vector o casete de expresión comodín según la invención, que comprende una secuencia señal o líder truncado según la invención. Tal vector o casete de expresión comodín está preparado para incorporar un gen de interés que codifica una PDI. La línea celular comodín es, así, una línea celular hospedadora preformada, que se caracteriza por su capacidad de expresión. Esto sigue una estrategia de una plataforma "comodín" innovadora para la generación de líneas celulares productoras, para la producción de una PDI, p.ej., mediante el uso de la integración de un casete específico de sitio o del intercambio de casetes mediado por una recombinasa específica de sitio. Tal célula hospedadora nueva facilita la clonación de un gen de interés (GDI), p.ej. en sitios predeterminados de expresión genómica para conseguir líneas celulares de producción sumamente eficaces y reproducibles.

Según una realización preferida, el vector de expresión es un plásmido adecuado para la integración en el genoma de la célula hospedadora, en una única copia o en copias múltiples por célula. La secuencia de nucleótidos recombinante que codifica una PDI se puede proporcionar también en un plásmido con replicación autónoma en una única copia o en copias múltiples por célula. El plásmido preferido es un vector de expresión eucariótica, preferiblemente un vector de expresión en levadura.

Los vectores de expresión pueden incluir, pero sin limitación, vectores de clonación, vectores de clonación modificados y plásmidos diseñados de manera específica. El vector de expresión preferido, tal como se usa en la invención, puede ser cualquier vector de expresión adecuado para la expresión de un gen recombinante en una célula hospedadora, y se selecciona dependiendo del organismo hospedador. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector que es capaz de replicarse o integrarse en el genoma de los organismos hospedadores, también denominado vector hospedador, tal como un vector de levadura, que porta una construcción de ADN según la invención. Un vector de expresión en levadura preferido es adecuado para la expresión en una levadura seleccionada del grupo que consiste en levaduras metilotróficas representadas por el género Hansenula, Ogatea, Pichia, Candida y Torulopsis.

En la presente invención, se prefiere usar plásmidos derivados de pPICZ, pGAPZ, pPIC9, pPICZalfa, pGAPZalfa, pPIC9K, pGAPHis o pPUZZLE como vector.

Según una realización preferida, se obtiene una construcción recombinante ligando los genes relevantes en un vector. Estos genes se pueden integrar de manera estable en el genoma de la célula hospedadora transformando la

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de proteínas a escala industrial.

La presente invención se describe con más detalle en los ejemplos siguientes, que no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención tal como se reivindica.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de una línea de células hospedadoras de P. pastoris para la expresión de proteínas recombinantes mediante el uso del líder nativo de Epx1 de P. pastoris (SEQ ID 8) para la secreción

1a): Construcción de un vector de expresión que contiene el líder nativo de Epx1 de P. pastoris (secuencia señal y pro-secuencia; SEQ ID 8, EpxL-RT, la "secuencia precursora")

La identificación de la proteína secretada de manera nativa Epx1 en P. pastoris y la identificación de la supuesta secuencia líder de secreción EpxL-RT (que consiste en la secuencia señal de Epx1 y la pro-secuencia hasta el extremo N-terminal determinado experimentalmente de la proteína Epx1 madura) se describió en el documento EP2258855. Como los últimos aminoácidos que precedían al extremo N-terminal verificados de manera experimental de Epx1 madura fueron Arg-Thr (RT), la supuesta secuencia líder de secreción se denominó EpxL-RT.

Para generar un vector de expresión mediante el uso de la secuencia líder de secreción de la proteína Epx1 de P. pastoris para la secreción de una PDI, se clonó la secuencia respectiva (SEQ ID 8) en el marco de lectura con el promotor PGAP (promotor de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) del vector de expresión pPM2_pGAP. El vector de expresión pPM2_pGAP es un derivado del esqueleto del vector pPuzzle_zeoR_AOXTT descrito en el documento WO2008/128701A2, que consiste en el origen de replicación bacteriano de pUC19, el promotor de gliceraldehído fosfato deshidrogenasa de P. pastoris, el terminador de la transcripción de CYC1 de S. cerevisiae, y el casete de resistencia al antibiótico zeocina.

La secuencia líder de secreción de Epx1 se amplificó mediante PCR a partir del ADN genómico de P. pastoris mediante el uso de los cebadores de oligonucleótidos (Tabla 1).

Tabla 1: Cebador de oligonucleótidos para la amplificación mediante PCR de la secuencia precursora de la proteína Epx1 de P. pastoris EpxL-RT (los sitios de restricción están subrayados)

EpxL dir.

SbfI SEQ ID 22 TATACCTGCAGGATGAAGTTCTCTACCAATTTGATC

EpxL inv.

NsiI SEQ ID 23 GAAGATGCATCGTACGGTAGACAGTGACAAC

Posteriormente, el producto de PCR (189 pb) se digirió mediante las enzimas de restricción SbfI y NsiI; y se ligó en un vector pPM2_pGAP que se había linealizado mediante SbfI y se había tratado con fosfatasa de intestino de ternero (CIP). Como NsiI y SbfI producen extremos solapantes, la construcción resultante pPM2_pGAPxLRT tiene un único sitio SbfI directamente antes del codón de inicio de la secuencia EpxL-RT. Se verificó la integración correcta mediante digestión de los plásmidos resultantes con SbfI y AscI.

1b) Construcción de una cepa de P. pastoris que secreta tripsinógeno porcino recombinante mediante el uso del vector pPM2_pGAPxLRT.

Para la expresión de tripsinógeno porcino recombinante (rpTRP) se sintetizó un gen artificial con optimización de codones (Geneart, Alemania). Se añadieron sitios para las enzimas de restricción Pfl23II y SfiI flanqueando el marco de lectura abierto durante la amplificación mediante PCR con el uso del plásmido administrado como molde, y los cebadores se muestran en la Tabla 2.1. El producto de PCR se digirió con Pfl23II y SfiI, y se clonó en un plásmido pPM2_pGAPxLRT tratado con Pfl23II, SfiI y CIP (Ejemplo 1a). El plásmido ligado se transformó en E. coli TOP 10 (Invitrogen) y se colocó en placas con LB-agar que contenía Zeocina. Se llevó a cabo un análisis con endonucleasas de restricción para confirmar la identidad correcta del plásmido pPM2_pGAPxLRT_rpTRP.

Tabla 2.1: Cebador de oligonucleótidos para la amplificación mediante PCR del gen de tripsinógeno porcino

EpxL-RT-pTRP dir.

Pfl23II (BsiWI) SEQ ID 24 ATACCGTACGACTGACGACGACGACAAG

pTRP inv.

SfiI SEQ ID 25 TTTTGGCCGAGGCGGCCTTTCAGTTAGCAGCGATAGTTTG

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1c) Construcción de una cepa de P. pastoris que sobreexpresa albúmina de suero humano recombinante o proteína fluorescente verde mejorada con el vector pPM2_pGAPxLRT.

Los genes que codifican la albúmina de suero humano (HSA) o la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) se amplificaron mediante PCR de los vectores descritos en Stadlmayr et al. (2010, J Biotechnol. 150: 519-529) mediante el uso de los cebadores mostrados en la Tabla 2.2. Los productos de PCR se digirieron con AccI y SfiI, y se clonaron en el plásmido pPM2_pGAPxLRT tratado con AccI y SfiI (Ejemplo 1a). El plásmido ligado se transformó en E. coli TOP10 (Invitrogen) y se colocó en placas con LB-agar que contenía Zeocina. Tras la verificación de la secuencia, los vectores pPM2_pGAPxLRT-HSA y pPM2_pGAPxLRT-eGFP se linealizaron en la región del promotor y se transformaron en P. pastoris. Para HSA, se usó como referencia la construcción que usó el líder de HSA nativo descrito en Stadlmayr et al. 2010, mientras eGFP se clonó tras el líder de MFα de S. cerevisiae como control.

Tabla 2.2: Cebadores de oligonucleótidos para la amplificación mediante PCR de HSA y eGFP fusionadas a EpxL-RT y eGFP fusionada al líder de MFα de S. cerevisiae

EpxL-RT-HSA dir.

AccI SEQ ID 26 AGGCGTCTACCGAACTGATGCACACAAGAGTGAGGTT

HSA inv.

SfiI SEQ ID 27 GAGTGGCCGAGGCGGCCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGA

EpxL-RT-eGFP dir.

AccI SEQ ID 28 ATTTGTCTACCGAACTGTGAGCAAGGGCGAGGAGC

eGFP inv.

SfiI SEQ ID 29 CGTTGGCCGAGGCGGCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG

Ejemplo 2: Cultivo de una línea celular hospedadora de P. pastoris para la expresión de proteínas secretoras recombinantes y análisis del producto

Todos los plásmidos se linealizaron en su región promotora respectiva o en la región de integración AOX-TT antes de la electrotransformación en P. pastoris. Los transformantes positivos se seleccionaron en placas de agar YPD que contenían extracto de levadura (10 g/L), peptona (20 g/L), glucosa (20 g/L) y Zeocina.

2a) Cultivo de cepas de P. pastoris transformadas que expresan proteínas secretoras recombinantes en cultivos a pequeña escala

Se inocularon 5 mL de medio YP (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona) que contenían 10 g/L de glicerol con una única colonia de cepas de P. pastoris de los Ejemplos 1b, 5, 7, o 9 y se cultivaron durante la noche a 28 °C. Se transfirieron alícuotas de estos cultivos (que correspondían a una DO600 final de 0,1) a 10 mL de medio de cultivo de expresión (la composición de los medios se proporciona más adelante para cada proteína recombinante) complementado con 20 g/L de glucosa y se incubó durante 48 h a 28 °C a 170 rpm en matraces Erlenmeyer de 100 mL. De manera alternativa, se usaron 2 mL de medio de cultivo de expresión para el cultivo en placas de 24 pocillos profundos. Se añadió glucosa (10 g/L) repetidamente cada 12 h, antes de recoger las células mediante centrifugación a 2500xg durante 10 min a temperatura ambiente, y se prepararon para el análisis. Para la expresión controlada por pG1, se alcanzaron las condiciones de crecimiento limitante con glucosa mediante el uso de esferas de suministro de glucosa (Kuhner, CH), que liberan lentamente glucosa a lo largo del tiempo según la ecuación (Glucosa)=1,63*t0,74 [mg/Disco], en vez de la complementación con glucosa. Para 10 mL de cultivo principal, se usaron 2 esferas de suministro. Se determinó la biomasa midiendo el peso de las células tras la centrifugación de 1 mL de suspensión celular, mientras la determinación de la proteína secretada recombinante en el sobrenadante se describe en los siguientes Ejemplos 2b-2e.

Los medios de cultivo de expresión fueron como sigue:

Para tripsinógeno porcino: por litro: 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona de guisante, 10,2 g de (NH4)2PO4, 1,24 g de KCl, 0,1 g de CaCl2, pH 5,0 ajustado con HCl.

Para HSA: por litro: 22 g de ácido cítrico, 3,15 g de (NH4)2HPO4, 0,027 g de CaCl2*2H2O, 0,9 g de KCl, 0,5 g de MgSO4*7H2O, 2 ml de biotina 500 x y 1,47 mL de disolución de reserva de sales traza [por litro: 6 g de CuSO4*5H2O, 0,08 g de NaI, 3 g de MnSO4*H2O, 0,2 g de Na2MoO4*2H2O, 0,02 g de H3BO3, 0,5 g de CoCl2, 20 g de ZnCl2, 5 g de FeSO4*7H2O y 5 mL de H2SO4]; pH ajustado a 6 con KOH 5 M; esterilizado mediante filtración.

Para eGFP y para los fragmentos de anticuerpo (p.ej. Fab): por litro: 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, tampón de fosfato potásico 100 mM de pH 6,0, 13,4 g de base de nitrógeno de levadura con sulfato amónico, 0,4 mg de biotina.

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2b) Cuantificación de tripsina

El sobrenadante de cultivo de P. pastoris se desaló mediante el uso de columnas de cromatografía de exclusión por tamaño pre-empaquetadas pequeñas (Columnas de Desalación PD-10 Desechables 17-0851-01; GEHealthcare). Se aplicaron 2,5 ml de sobrenadante a la columna y se eluyó con 3,5 ml de tampón de elución (HCl 1 mM). Tras la elución, se añadieron 70 μl de disolución de CaCl2 2 M.

Para convertir el tripsinógeno inactivo en la tripsina activa, se mezclaron 300 μl del sobrenadante desalado (+CaCl2) con 690 μl de tampón de activación (TRIS/HCl 50 mM pH 8,6; CaCl2 40 mM y 0,15 g/L de enteroquinasa, Sigma; E0632) y se incubó durante dos horas a 37 °C.

Se mezclaron 165 μl de la mezcla de activación con 1000 μl de disolución TAME, que contenía 446 mg/L de hidrocloruro de éster metílico de Nα-p-Tosil-L-arginina (TAME; Sigma; T4626) disuelto en tampón de dilución (TRIS/HCl 50 mM de pH 8,1; CaCl2 40 mM), y se midió la cinética de absorción a 247 nm en un espectrofotómetro a lo largo de un periodo de tiempo de 5 min a 30 °C. Si fue necesario, se diluyó la disolución de tripsina activada con tampón de dilución para alcanzar el intervalo lineal (ΔA247/min < 0,3) de este método. Una concentración de tripsina de 1 g/L corresponde a ΔA247/min= 0,101.

2c) Cuantificación de HSA mediante ELISA

Para la cuantificación de HSA en sobrenadantes de P. pastoris, se usó el Kit de Cuantificación mediante ELISA de Albúmina Humana (Nº Cat. E80-129, Bethyl Laboratories, TX, EE.UU.). Se usó el patrón de HSA con una concentración de partida de 400 ng/mL. Las muestras de sobrenadante se diluyeron en consecuencia.

2d) Análisis mediante SDS-PAGE y Transferencia de Western

Para el análisis en geles de proteínas se usó el sistema NuPAGE® Novex® Bis-Tris, mediante el uso de geles de un 12 % de Bis-Tris o 4-12 % de Bis-Tris y tampón de análisis MOPS (todos de Invitrogen). Después de la electroforesis, las proteínas se visualizaron mediante tinción de plata o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa para el análisis mediante transferencia de Western. Por lo tanto, las proteínas se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante el uso del Módulo de Transferencia XCell II™ para la transferencia húmeda (en tanque) (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Después del bloqueo, las transferencias de Western se sondearon con los anticuerpos siguientes: Para HSA: conjugado anti-albúmina de suero humanoperoxidasa de rábano (HRP), Bethyl A80-129P (1:50.000); Para la cadena ligera de IgG: anticuerpo conjugado anticadenas ligeras kappa humanas (unidas y libres) -fosfatasa alcalina (AP), Sigma A3813 (1:5.000); Para la cadena pesada de IgG: anticuerpo anti-IgG humana (específico de cadena γ) producido en cabra, Sigma I3382 (1:5.000) y conjugado anti-cabra AP (1:20.000).

La detección se llevó a cabo con el kit de detección colorimétrica de AP (BioRad) basado en el sistema NBT/BCIP para conjugados con AP, y el Sustrato Quimioluminiscente Super Signal West (Thermo Scientific) para conjugados con HRP.

2e) Cuantificación de Fab mediante ELISA

La cuantificación de Fab intacto se realizó mediante ELISA con el uso de un anticuerpo anti-IgG humana (Abcam ab7497) como anticuerpo de revestimiento (1:1.000), y un anticuerpo conjugado anti-Cadenas Ligeras Kappa Humanas (Unidas y Libres) de cabra -fosfatasa alcalina (Sigma A3813) como anticuerpo de detección (1:1.000). Se usó un fragmento de IgG, Fab/Kappa humano (Bethyl P80-115), como patrón con una concentración de partida de 50 ng/mL. Las muestras de sobrenadante se diluyeron en consecuencia. La detección se realizó con el sustrato pNPP (Sigma S0942). Los tampones de revestimiento, dilución y lavado se basaron en PBS (KH2PO4 2 mM, Na2HPO4.2H2O 10 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 8 mM, pH 7,4) y se completaron con BSA (1% (p/v)) y/o Tween20 (0,1% (v/v)) en consecuencia.

Ejemplo 3: Expresión de proteínas recombinantes mediante una línea de células hospedadoras de P. pastoris mediante el uso de la secuencia precursora de Epx1 de P. pastoris (EpxL-RT, SEQ ID 8) para la secreción

3a) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa tripsinógeno porcino recombinante mediante el uso de EpxL-RT para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba pTRP mediante el uso de la secuencia EpxL-RT para la secreción como se describió en el Ejemplo 2a, y se analizó mediante el uso del ensayo de actividad de tripsina como se describió en el Ejemplo 2b y SDS-PAGE como se describió en el Ejemplo 2d. Se usó P. pastoris que expresaba pTRP mediante el uso de MFα para la secreción como referencia.

De manera inesperada, la expresión de pTRP mediante el uso del líder de secreción EpxL-RT condujo a una mancha de proteínas de aproximadamente 30 kDa (Figura 2.1, lado izquierdo), mientras MFα condujo a una pTRP secretada del tamaño correcto (25 kDa; Figura 2.1, lado derecho). Partes del pTRP secretado con EpxL-RT también condujeron a un pTRP del tamaño correcto, aunque en menor grado. Las cantidades de pTRP secretadas con EpxL

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RT fueron menores del 50% de la cantidad secretada mediante el uso de MFα (Tabla 3, medida mediante el ensayo de actividad de tripsina como se describió en el Ejemplo 2b). La banda extendida probablemente representa una proteína de fusión EpxL-RT-pTRP, que parece debida a un procesamiento incorrecto (escisión) de la secuencia EpxL-RT.

Tabla 3: Niveles relativos de secreción de pTRP normalizados respecto de alfaMF

Líder

Secreción de pTRP media relativa ± EEM

EpxL-RT

0,48 ± 0,02

MFα

1,00 ± 0,05

3b) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa eGFP recombinante mediante el uso de EpxL-RT para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba eGFP mediante el uso de la secuencia EpxL-RT para la secreción como se describió en el Ejemplo 2a y se analizó mediante el uso de SDS-PAGE y transferencia de Western (Ejemplo 2d). Aparentemente, el EpxL-RT nativo no fue capaz de secretar eGFP completamente (Figura 2.2, parte izquierda), en contraste con MFα (Figura 2.2, parte derecha). De manera intracelular, se pudo observar eGFP todavía unida a partes de la secuencia EpxL-RT, lo que descarta los defectos en la expresión de la proteína (no mostrado).

3c) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa albúmina de suero humano recombinante mediante el uso de EpxL-RT para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba HSA mediante el uso de la secuencia EpxL-RT para la secreción como se describió en el Ejemplo 2a y se analizó mediante el uso de ELISA de HSA (Ejemplo 2c) y transferencia de Western (Ejemplo 2d). Se usó P. pastoris que expresaba HSA mediante el uso del líder de HSA nativo para la secreción como referencia (Kobayashi. 2006. Biologicals. 34(1):55-9.).

Se analizaron 12 clones individuales de cada construcción por su comportamiento de secreción después de 48 h de cultivo en matraz agitado en medio de cribado sintético. El sobrenadante se examinó de manera cualitativa mediante SDS-PAGE reductora y transferencia de Western posterior, con el uso del anticuerpo anti-HSA para la detección de HSA. Fue visible un patrón de bandas dobles diferentes para la HSA secretada mediante EpxL-RT (Figura 2.3, lado izquierdo). En comparación con la HSA secretada mediante su líder nativo (Figura 2.3, lado derecho) y la HSA purificada (no mostrada), la banda inferior fue la HSA procesada correctamente. La banda superior fue inesperada, pero debido a su peso molecular ligeramente mayor, puede representar una proteína de fusión EpxL-RT-HSA debida a un EpxL-RT procesado de manera incorrecta. Basándose en la intensidad de las bandas (tal como se analiza mediante ImageJ), hubo presente un 40-60% de la HSA secretada total en la forma de peso molecular incorrecto mayor.

Resumen: Cuando se usa la secuencia EpxL-RT para la secreción, es visible una mancha o patrón de bandas dobles para la proteína recombinante secretada, que es indicativo de un procesamiento incorrecto o de la ausencia de procesamiento del líder largo EpxL-RT. Esta característica hace que EpxL-RT que corresponde a la secuencia líder de Epx1 de longitud completa del documento EP2258855A1 sea inadecuada e inútil para la secreción de proteínas recombinantes.

Ejemplo 4: Identificación del extremo N-terminal de la banda de peso molecular mayor de cultivos de expresión de HSA

Se analizó adicionalmente el extremo N-terminal de la HSA expresada como se describió en el Ejemplo 3c anterior mediante el uso de EpxL-RT mediante secuenciación N-terminal.

Por lo tanto, se cargaron 500 μl del sobrenadante respectivo en un filtro centrífugo para concentrar la proteína (filtro centrífugo de 10 kDa 0,5 ml Amicon Ultra, Millipore, UFC5010), se centrifugó durante 5 min y se recuperaron 15 μl de muestra mediante centrifugación inversa.

A continuación, las muestras se separaron mediante un gel del 4-12 % de Bis-Tris NuPAGE y una transferencia de Western con tampón borato (por litro: 3,09 g de Borato [50 mM], 100 ml de MeOH a pH 9 ajustado con NaOH 1 M) llevado a cabo durante 2 h a 25 V mediante el uso de una membrana de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)). Antes de la transferencia, el gel se incubó en tampón borato durante 10 min, mientras la membrana se sumergió en metanol durante 30 seg, seguido de 3 min en tampón borato.

Después de la transferencia, la membrana se tiñó durante 3 min con Coomassie (0,1 % [p/v] de R250, MeOH [40 % v/v], ácido acético [10 % v/v]), seguido de decoloración (MeOH [40 % v/v], ácido acético [10 % v/v]). La membrana se lavó con ddH2O y las bandas superiores e inferiores (Figura 3) se cortaron y se enviaron para la secuenciación de EDMAN N-terminal. Para la banda inferior, se determinó D como el aminoácido N-terminal, de manera concluyente con el primer aminoácido de HSA (extremo N-terminal de HSA, SEQ ID 30: DAHKSEV), mientras para la banda

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superior se determinó AYYT (SEQ ID 31) como extremo N-terminal de la proteína secretada. Estos aminoácidos son parte de la secuencia EpxL-RT (SEQ ID 8), que deja un saliente indeseado de 21 aminoácidos en HSA. La secuencia de EpxL-RT que precede a AYYT (SEQ ID 23) es KR, que podría ser parte de un motivo de escisión para peptidasa Lys-Arg dibásico. El procesamiento de los motivos Lys-Arg dibásicos mediante proteasas tales como Kex2 depende no solamente del motivo propiamente dicho, sino también de la estructura tridimensional y del medio de los aminoácidos circundantes (Bader et al. 2008, BMC Microbiol. 8: 116.). El análisis mediante BLAST y la alineación de secuencias de EpxL-RT con las secuencias de homólogos de Epx1 de otras levaduras (p.ej. Saccharomyces cerevisiae, género Candida) reveló que el motivo KR de la secuencia líder no está conservado. Por lo tanto, el procesamiento del motivo KR mediante proteasas tales como Kex2 no se pudo dar por hecho a priori basándose en el análisis de las secuencias.

Ejemplo 5: Construcción de una línea celular hospedadora de P. pastoris para la expresión de proteínas recombinantes mediante el uso de la secuencia EpxL-KR de P. pastoris (líder truncado, SEQ ID 10, en el que X en la posición 3 es F, y X en la posición 16 es A (SEQ ID 12)) para la secreción

Para ensayar si la secuencia KR de EpxL-RT es realmente un sitio de escisión de proteasas, se construyeron vectores para la expresión de proteínas recombinantes mediante el uso de la secuencia EpxL-KR para la secreción.

5a) Construcción de una cepa de P. pastoris que sobreexpresa HSA mediante el uso de la secuencia EpxL-KR para la secreción.

Se amplificó HSA mediante el uso de los cebadores de la Tabla 4.1, y se ligó en el vector pPM2_pGAPxLRT digerido con BglI y SbfII. Tras la verificación de la secuencia, se linealizó el vector pPM2_pGAPxLKR-HSA en la región del promotor y se transformó en P. pastoris.

Tabla 4.1: Cebadores de oligonucleótidos para la amplificación mediante PCR de HSA fusionada a EpxL-KR (los sitios de restricción están subrayados, la secuencia EpxL está en cursiva)

EpxL-KR_HSA dir.

BglI SEQ ID 32 ATTCGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCG TGATGCACACAAGAGTGAGGTT

HSA inv.

SfiI SEQ ID 33 GAGTGGCCGAGGCGGCCTTATAAGCCTAAGGCAGCT TGA

5b) Construcción de una cepa de P. pastoris que sobreexpresa tripsinógeno porcino o eGFP mediante el uso de la secuencia EpxL-KR para la secreción.

Se amplificó pTRP mediante el uso de los cebadores de la Tabla 4.2, y se ligó en el vector pPM2_pGAPxLRT digerido con PvuII y SbfII. Se generó el vector de expresión pPM2_pGAPxLKR-eGFP de la misma manera. Tras la verificación de la secuencia, los vectores pPM2_pGAPxLKR-pTRP y pPM2_pGAPxLKR-eGFP se linealizaron en la región del promotor y se transformaron en P. pastoris.

Tabla 4.2: Cebadores de oligonucleótidos para la amplificación mediante PCR de pTRP o eGFP fusionada a EpxL-KR (los sitios de restricción están subrayados, la secuencia EpxL está en cursiva)

EpxL-KR-pTRP dir.

PvuII SEQ ID 34 ATACCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCA AACCACTTGCACAAGCGTACTGACGACGACGACAAG

pTRP inv.

SfiI SEQ ID 35 TTTTGGCCGAGGCGGCCTTTCAGTTAGCAGCGATAGTTT G

EpxL-KR-eGFP dir.

PvuII SEQ ID 36 ATACCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCA AACCACTTGCACAAGCGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGC

eGFP inv.

SfiI SEQ ID 37 CGTTGGCCGAGGCGGCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG

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6b) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa albúmina de suero humano recombinante mediante el uso de EpxL-KR para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba HSA mediante el uso de la secuencia EpxL-KR para la secreción (Ejemplo 5a) como se describió en el Ejemplo 2a y se analizó mediante el uso de transferencia de Western (Ejemplo 2d).

Al contrario que el patrón de bandas dobles observado al usar EpxL-RT para la secreción (Figura 2.3, parte izquierda), la secreción de HSA mediante el uso de EpxL-KR produjo una banda simple del tamaño correcto (no mostrado). Así, EpxL-KR fue capaz de secretar una HSA procesada correctamente.

6c) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa eGFP mediante el uso de EpxL-KR para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba eGFP mediante el uso de la secuencia EpxL-KR para la secreción (Ejemplo 5b) como se describió en el Ejemplo 2a, y se analizó como en el Ejemplo 3b.

Solamente el líder EpxL-KR condujo a una eGFP de tamaño correcto (Figura 4.2, lado izquierdo), mientras los restos del líder de MFα condujeron a una eGFP de peso molecular mayor (Figura 4.2, lado derecho). El análisis mediante LC-MS (descrito en el Ejemplo 6a) verificó el extremo N-terminal correcto de la eGFP secretada mediante EpxL-KR, que califica el producto secretado con el contenido de moléculas con el extremo N-terminal correcto de al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98%, aún más preferiblemente al menos un 99% o alrededor de un 100% (p/p). En contraste, el uso de MFα provocó que quedaran los aminoácidos EAEA como secuencia de aminoácidos adicional en el extremo N-terminal debido al procesamiento incorrecto del péptido líder mediante la aminopeptidasa Ste13. Según los tamaños de las bandas en la SDS-PAGE, la mayoría de eGFP secretada mediante MFα posee los salientes de aminoácidos incorrectos EAEA en el extremo N-terminal, mientras no se pueden observar bandas de tamaño incorrecto para la eGFP secretada mediante EpxL-KR. Como para pTRP (Ejemplo 6a), los niveles de secreción de eGFP mediante el uso de EpxL-KR fueron más de un 20% mayores en comparación con el uso de MFα (Tabla 6).

Tabla 6: Niveles relativos de secreción de eGFP normalizados respecto de MFα (cuantificados a partir de las intensidades de las bandas con el programa informático ImageJ)

Líder

Secreción de eGFP media relativa ± EEM

EpxL-KR

1,23 ± 0,05

MFα

1,00 ± 0,08

6d) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa una cadena ligera de anticuerpo o una cadena pesada de anticuerpo mediante el uso de EpxL-KR para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba LC de HyHEL o HC de HyHEL mediante el uso de la secuencia EpxL-KR para la secreción (Ejemplo 5c) como se describió en el Ejemplo 2a y se analizó como en el Ejemplo 2d.

Ambas cadenas de anticuerpo se pudieron secretar mediante el uso de la secuencia EpxL-KR (Figura 4.3), lo que confirma EpxL-KR como líder de secreción valioso para la producción de anticuerpos en P. pastoris. El extremo Nterminal correcto del LC de HyHEL secretado mediante EpxL-KR se verificó mediante análisis de LC-MS como se describió en el Ejemplo 6a.

Ejemplo 7: Construcción de una línea celular hospedadora de P. pastoris para la expresión de proteínas recombinantes mediante el uso de la secuencia EpxL-AA (SEQ ID 21) para la secreción

Los documentos WO2010/135678 y US20110021378 describen la secuencia de aminoácidos de MKLSTNLILAIAAASAVVSAA (SEQ ID 21), es decir, los aminoácidos 1-21 de SEQ ID 8, que corresponden a los primeros 21 aminoácidos del líder de Epx1 de longitud completa. Sin embargo, no se proporcionan datos experimentales en los documentos WO2010/135678 y US20110021378, que muestran que esta secuencia sería adecuada realmente para la secreción de proteínas recombinantes. Para ensayar si este fragmento, denominado a continuación EpxL-AA, es suficiente para permitir la secreción de proteínas recombinantes correctamente procesadas, se construyeron vectores para la expresión de proteínas recombinantes mediante el uso de la secuencia EpxL-AA para la secreción.

La cadena ligera LC de anticuerpo, pTRP, y eGFP se amplificaron mediante el uso de los cebadores de la Tabla 7, y se ligaron en el vector pPM2_pGAPxLRT digerido con BglI y SfiI. Tras la verificación de la secuencia, los vectores pPM2_pGAPxLAA-LC, pPM2_pGAPxLAA-pTRP y pPM2_pGAPxLAA-eGFP se linealizaron en la región del promotor y se transformaron en P. pastoris, respectivamente.

Tabla 7: Cebadores de oligonucleótidos para la amplificación mediante PCR de pTRP, eGFP y LC de HyHEL fusionados a EpxL-AA (los sitios de restricción están subrayados, la secuencia EpxL está en cursiva)

EpxL-AA-LC dir.

SbfI SEQ ID 42 ATCACCTGCAGGATGAAGTTCTCCACCAATTTGATTCTAG CTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTGACAT CGTTTTGACTCAATCCCC

LC inv.

SfiI SEQ ID 43 CTATGGCCGAGGCGGCCCTATTAACACTCACCTCTGTTG

EpxL-AA-pTRP dir.

PvuII SEQ ID 44 ATACCAGCTGCTACTGACGACGACGACAAG

pTRP inv.

SfiI SEQ ID 45 TTTTGGCCGAGGCGGCCTTTCAGTTAGCAGCGATAGTTTG

EpxL-AA-eGFP dir.

PvuII SEQ ID 46 GTACCAGCTGCTGTGAGCAAGGGCGAGGAGC

eGFP inv.

SfiI SEQ ID 47 CGTTGGCCGAGGCGGCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG

Ejemplo 8: Expresión de proteínas recombinantes mediante una línea celular hospedadora de P. pastoris con el uso de EpxL-AA (SEQ ID 21) para la secreción

8a) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa eGFP mediante el uso de EpxL-AA para la secreción

5 Se cultivó P. pastoris que expresaba eGFP mediante el uso de la secuencia EpxL-AA para la secreción (Ejemplo 7) como se describió en el Ejemplo 2a, y se analizó como en el Ejemplo 3b.

En la SDS-PAGE, el tamaño de las bandas con EpxL-AA es ligeramente mayor que con EpxL-KR (Figura 5.1), lo que indica que queda al menos un residuo de Ala en el extremo N-terminal de eGFP, y de ese modo representa un extremo N-terminal no nativo de la proteína secretora recombinante.

10 8b) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa tripsinógeno porcino recombinante mediante el uso de EpxL-AA para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba pTRP mediante el uso de la secuencia EpxL-AA para la secreción (Ejemplo 7) como se describió en el Ejemplo 2a, y se analizó como en el Ejemplo 3a.

Se secretó pTRP mediante el uso de la secuencia EpxL-AA, sin embargo, los niveles de secreción fueron inferiores

15 que con la secuencia EpxL-KR (Tabla 8). En la SDS-PAGE, el tamaño de las bandas con EpxL-AA es ligeramente mayor que con EpxL-KR (Figura 5.1), lo que indica que queda al menos un residuo de Ala en el extremo N-terminal de pTRP.

De hecho, la secuenciación N-terminal del pTRP secretado mediante EpxL-AA reveló que el extremo N-terminal de la proteína secretora recombinante contuvo un aminoácido adicional, Ala, que quedó de la secuencia EpxL-AA, y de 20 ese modo representa un extremo N-terminal no nativo de la proteína secretora recombinante.

Tabla 8: Niveles relativos de secreción de pTRP normalizados respecto de EpxL-KR

Líder

Secreción de pTRP media relativa ± EEM

EpxL-KR

1,00 ± 0,12

EPxL-AA

0,79 ± 0,04

8c) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa LC mediante el uso de EpxL-AA para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba LC de HyHEL mediante el uso de la secuencia EpxL-AA para la secreción

25 (Ejemplo 7) como se describió en el Ejemplo 2a, y se analizó como en el Ejemplo 2d. Para LC, los niveles de secreción con EpxL-AA fueron inferiores en comparación con EpxL-KR o MFα (Figura 5.2). Como para pTRP, la secuenciación N-terminal de la LC secretada mediante EpxL-AA mostró que el extremo N-terminal de la proteína secretora recombinante contuvo un aminoácido adicional, Ala, que quedó de la secuencia EpxL-AA.

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confocal -datos no mostrados). Ambas cepas exhiben una distribución de eGFP intracelular representativa de las proteínas presentes en la ruta secretora (tinción principalmente del retículo endoplásmico); por lo tanto, el péptido señal EpxL-A y el líder truncado EpxL-KR parecen ser muy adecuados para la secreción de proteínas recombinantes, ya que exhiben un "fenotipo secretor".

10b) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa LC mediante el uso de EpxL-A para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba LC de HyHEL mediante el uso de la secuencia EpxL-A para la secreción (Ejemplo 9) como se describió en el Ejemplo 2a, y se analizó como en el Ejemplo 6d.

El uso de EpxL-A para la secreción de la cadena ligera del anticuerpo condujo a una proteína de tamaño correcto (Figura 5.2), por lo cual la secreción fue tan eficaz como con EpxL-KR y más de 8 veces mayor que con EpxL-AA (Tabla 10). Los niveles de secreción se compararon mediante la cuantificación de las intensidades de las bandas del gel mostrado en la Figura 5.2 con el uso del programa informático ImageJ.

Tabla 10: Niveles relativos de secreción de LC de HyHEL normalizados respecto de EpxL-AA.

Líder

Secreción de LC media relativa ± EEM

EpxL-KR

8,82 ± 0,53

EPxL-AA

1,00 ± 0,55

EPxL-A

9,53 ± 0,87

Se verificó que el extremo N-terminal de LC secretado con EpxL-A mediante LC-MS fue el extremo N-terminal correcto DIVLTQSP (Asp-lle-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro, SEQ ID 54).

Por lo tanto, el péptido señal de Epx1, EpxL-A, es suficiente y adecuado para secretar proteínas recombinantes con el extremo N-terminal correcto, al contrario que la secuencia más larga EpxL-AA.

Además de la expresión bajo control del promotor constitutivo pGAP, también se ensayó la secreción de LC con EpxL-A bajo control del promotor inducible pG1 (SEQ ID 9). La construcción de la cepa se describió en el Ejemplo 9. Se generaron condiciones limitantes de glucosa en los cultivos de cribado mediante el uso de esferas de suministro de glucosa como se describió en el Ejemplo 2a. En tales condiciones de inducción, se observó la secreción de la cadena ligera.

10c) Análisis de P. pastoris que sobreexpresa un fragmento Fab de anticuerpo mediante el uso de EpxL-A para la secreción

Se cultivó P. pastoris que expresaba el fragmento Fab del anticuerpo HyHEL (que consiste en el fragmento de la cadena ligera (vL y cL) y de la cadena pesada (vH y cH1)) mediante el uso de la secuencia EpxL-A para la secreción de ambas cadenas (cepa descrita en el Ejemplo 9) como se describió en el Ejemplo 2a, y se analizó como en los Ejemplos 2d y 2e.

Sorprendentemente, mediante el uso de la secuencia EpxL-A para la secreción de LC y HC del Fab de HyHEL, los niveles del Fab secretado intacto fueron hasta diez veces mayores que con el prepro-líder de MFα (determinado mediante ELISA como se describió en el Ejemplo 2e). El rendimiento de Fab por biomasa fue 0,15-0,35 mg de Fab/DO al usar EpxL-A, en comparación con 0,03-0,13 mg de Fab/DO al usar MFα para la secreción. Además, los sobrenadantes de P. pastoris que secretaba Fab de HyHEL bajo control de pG1 con EpxL-A no contienen niveles elevados de LC libre o agregados de mayor peso molecular de la proteína recombinante (Figura 5.3).

Ejemplo 11: Expresión de proteínas recombinantes mediante una línea celular hospedadora de P. pastoris con el uso de EpxL-A (secuencia del péptido señal, SEQ ID 1, en el que X en la posición 3 es F, y X en la posición 16 es A, SEQ ID 3) para la secreción

Se ensayó la secreción de ocho proteínas a partir de P. pastoris mediante el uso de EpxL-A (SEQ ID 3): Hormona del Crecimiento Humana (HGH), Somatotropina, Interferón alfa2a (IFN-α 2a), los dos scFvs diferentes marcados con his (scFvs1 y scFvs2) y los 3 Fabs diferentes Fab1, Fab2 y Fab3.

Los genes se sometieron a optimización de codones para P. pastoris y se sintetizaron mediante GeneArt (Alemania). Los vectores obtenidos se digirieron con SbfI y SfiI, y se ligaron los genes en el vector pPM2aZ30_pG1. En el caso de los Fabs, los casetes de expresión para ambas cadenas se combinaron en un vector mediante el uso de las enzimas de restricción compatibles MreI y AgeI. Tras la verificación de la secuencia, los vectores se linealizaron en la región del terminador AOX y se transformaron en P. pastoris.

Se cultivaron cepas de P. pastoris que expresaban las proteínas recombinantes Hormona del Crecimiento Humana,

Somatotropina, Interferón alfa2a, los dos scFvs marcados con his scFv1 y scFv2 y los tres Fabs Fab1, Fab2 y Fab3 (Fabs que consisten en la cadena ligera (vL y cL) y el fragmento de la cadena pesada (vH y cH1)) mediante el uso de la secuencia EpxL-A (SEQ ID 3) para la secreción en un medio que contenía por litro: 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, tampón de fosfato potásico 100 mM de pH 6,0, 13,4 g de base de nitrógeno de levadura con sulfato

5 amónico y 0,4 mg de biotina. Se llevaron a cabo cribados a pequeña escala en placas de 24 pocillos con dos esferas de suministro (Kuhner, diámetro de 6 mm).

Se analizaron los sobrenadantes como en el Ejemplo 2d. Se detectaron PDIs en las transferencias de Western mediante el uso de anticuerpos específicos: Para Somatotropina y Hormona del Crecimiento Humana: Anticuerpo policlonal GH1; Proteintech 17867-1AP (1:5.000) y anticuerpo Anti-IgG de Conejo (molécula completa)-Fosfatasa

10 Alcalina, Sigma A3687 (1:12.000). Para Interferón-alfa 2a: Interferón, anticuerpo alfa 2a; Antibodies-Online ABIN573795 (1:1.500) y anticuerpo Anti-IgG de Conejo (molécula completa)-Fosfatasa Alcalina, Sigma A3687 (1:12.000). Para los scFvs marcados con His: Conjugado Penta-His HRP; QIAGEN 10149928 (1:1.500).

Todas las proteínas ensayadas se secretaron con éxito en el medio de cultivo al usar la secuencia EpxL-A (SEQ ID 3) (Figura 6).

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Claims (1)

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